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Dokumentenidentifikation DE69919287T2 08.09.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000987027
Titel Ethylacetatextrakt der Indigo Pflanze
Anmelder Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo, Okayama, JP
Erfinder Aga, Hajime, Okayama-shi, Okayama, JP;
Arai, Shigeyuki, Okayama-shi, Okayama, JP;
Fukuda, Shigeharu, Okayama-shi, Okayama, JP;
Kunikata, Toshio, Okayama-shi, Okayama, JP;
Kurimoto, Masashi, Okayama-shi, Okayama, JP
Vertreter Keil & Schaafhausen Patentanwälte, 60322 Frankfurt
DE-Aktenzeichen 69919287
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 29.06.1999
EP-Aktenzeichen 993051150
EP-Offenlegungsdatum 22.03.2000
EP date of grant 11.08.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.09.2005
IPC-Hauptklasse A61K 35/78
IPC-Nebenklasse A61P 31/00   A61P 31/12   A61P 35/00   A61P 39/06   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen neuen physiologisch aktiven Extrakt aus einer Pflanze und insbesondere auf einen physiologisch aktiven Extrakt enthaltend einen ethylacetatlöslichen Bestandteil aus einer rohen Indigo-Pflanze, dessen Verfahren und Verwendungen.

Die Indigo-Pflanze Polygonum tinctorium Lour ist eine einjährige Pflanze der Familie Polygonum klassifiziert zu einer zweikeimblättrigen (dicotyledonen) Pflanze und ihr Ursprungsplatz ist Süd-Vietnam. Es wird berichtet, dass die Pflanze vor dem 7. Jahrhundert als eine Pflanze zum Tiefblau-Färben zusammen mit der Färbetechnik aus China nach Japan gebracht wurde und diese wird derzeit in Japan in und um die Tokushima-Präfektur herum kultiviert. Früher glaubten die Leute, dass die Blätter und Samen der Indigo-Pflanze nützliche physiologisch aktive Bestandteile enthielten und diese wurden nach Trocknung unter der Sonne zu trockenen Indigoblättern und -samen als ein Roharzneimittel eingesetzt. Wie auf den Seiten 5 bis 7 von "Nippon-Yakuso-Zensho" (Encyclopedia of Japanese Medicinal Plants), herausgegeben von Mizuo Mizuno, veröffentlicht am 22. Februar 1995 durch Shin-Nihon-Hoki-Shuppan Publisher, Tokio, Japan beschrieben, war die Indigo-Pflanze lediglich für deren entzündungshemmenden, lindernden und entgiftenden Wirkungen bekannt; solche physiologischen Wirkungen können nur erwartet werden, wenn in der Form einer durch Einweichen der Indigoblätter und -samen in heißem Wasser hergestellten Infusion eingesetzt.

Das Patent GB 2 330 305 beschreibt die Verwendung von Indigo-Extrakten zum Behandeln von Ulcus pepticum.

Das Patent JP 04 124 137 beschreibt die Extraktion einer Vielzahl von Pflanzen (einschließlich Polygonum tinctorium) durch Lösungsmittel, um blutdrucksenkende Medikamente bereitzustellen.

Die zur Zeit im Wesentlichen von Unannehmlichkeiten bezüglich Kleidung, Lebensmitteln und Eigenheimen befreiten Menschen einschließlich denen jüngeren Alters richten eine bemerkenswerte Aufmerksamkeit auf ihre Gesundheit, insbesondere auf Roharzneimittel, welche leicht ohne ärztliche Verschreibung täglich eingesetzt werden können. Dies kann aus der Tatsache gesehen werden, dass Literatur über Roharzneimittel veröffentlicht ist und Lebensmittelgeschäfte und Apotheken mit unterschiedlichen Arten an Gesundheitslebensmitteln und ergänzenden Gesundheitslebensmitteln überschwemmt sind. Im Allgemeinen haben Roharzneimittel eine milde Wirkung und weniger Nebeneffekte als vorteilhafte Merkmale, aber diese weisen eine unterschiedliche Sensitivität auf Individuen als Minus auf; die Schaffung eines neuen Roharzneimittels mit veränderten physiologischen Aktivitäten wird außerordentlich benötigt, um Anwenderanforderungen nachzukommen.

Im Hinblick auf das Vorgenannte zielt die vorliegende Erfindung darauf ab, einen neuen, physiologisch aktiven Extrakt aus einer Pflanze bereitzustellen, welcher veränderte physiologische Wirkungen aufweist.

Die vorliegende Erfindung zielt ferner darauf ab, ein Verfahren zum Herstellen des physiologisch aktiven Extraktes bereitzustellen.

Die vorliegende Erfindung zielt ebenfalls darauf ab, eine physiologisch aktive Zusammensetzung enthaltend den physiologisch aktiven Extrakt bereitzustellen.

Die vorliegenden Erfinder haben energisch studiert, um zu zeigen, dass ein neuer physiologisch aktiver Extrakt aus Indigo-Pflanzen oder ein Extrakt erhältlich durch Einweichen einer rohen Indigo-Pflanze in einem organischen Lösungsmittel, um ethylacetatlösliche Bestandteile zu extrahieren, in Säugetieren und Menschen veränderte physiologische Wirkungen einschließlich antiseptischer, antiviraler, antitumoraler, radikalfangender, Apoptose kontrollierender und zytokinproduktionskontrollierender und zytokinproduktionsinhibierender Wirkung sowie expressionsinhibierende Wirkung auf synthetische Stickstoffmonoxid-Enzyme aufweist. Diese haben ebenfalls herausgefunden, dass der Extrakt bei Säugetieren und Menschen im Wesentlichen keine Nebenwirkungen zeigt, und dass er in Lebensmitteln, Kosmetika und Pharmazeutika für Menschen sicher eingesetzt werden kann.

Die vorliegende Erfindung stellt einen physiologisch aktiven Extrakt enthaltend einen ethylacetatlöslichen Bestandteil aus einer rohen Indigo-Pflanze bereit.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Herstellen eines physiologisch aktiven Extraktes enthaltend den ethylacetatlöslichen Bestandteil aus einer rohen Indigo-Pflanze bereit, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte des Einweichens der Indigo-Pflanze in einem organischen Lösungsmittel, um den ethylacetatlöslichen Bestandteil aus der Pflanze zu extrahieren, sowie Sammeln des Extraktes umfasst.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine physiologisch aktive Zusammensetzung enthaltend den ethylacetatlöslichen Bestandteil bereit.

Wie schon beschrieben ist es bestens bekannt, dass die wasserextrahierten Blätter und Samen von Indigo-Pflanzen, welche unter der Sonne getrocknete Indigo-Pflanzen-Produkte sind, entzündungshemmende, lindernde und entgiftende Wirkungen aufweisen; es ist eine unerwartete Erkenntnis, dass ethylacetatlösliche Bestandteile erhalten durch direktes Behandeln einer rohen Indigo-Pflanze mit einem organischen Lösungsmittel die zuvor genannten veränderten physiologischen Wirkungen aufweist. Die vorliegende Erfindung wurde basierend auf dieser Erkenntnis gemacht.

Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele und begleitenden Zeichnungen, lediglich exemplarisch, in weiterem Detail beschrieben, wobei:

1: ein Infrarotabsorptionsspektrum von 3,5,4'-Trihydroxy-6,7-methylendioxyflavon, d.h. Verbindung 2, ist;

2: ein Infrarotabsorptionsspektrum von Kaempferol, d. h. Verbindung 3, ist;

3: ein Infrarotabsorptionsspektrum von 3,5,7,4'-Tetrahydroxy-6-methoxyflavon, d. h. Verbindung 4, ist;

4: ein Infrarotabsorptionsspektrum von Kaffeesäure, d. h. Verbindung 6, ist; und

5: ein Infrarotabsorptionsspektrum von 3-(1,3-Dihydro-3-oxo-2H-indol-2-yliden)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on, d. h. Verbindung 7, ist.

Nun die bevorzugten Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung erläuternd bezieht sich die Erfindung auf eine Indigo-Pflanze, eine einjährige Pflanze der zu einer zweikeimblättrige (dicotyledone) Pflanze klassifizierten Pflanze der Familie Polygonum mit dem botanischen Namen Polygonum tinctorium. Die in der vorliegenden Erfindung in Bezug genommene Formulierung "eine rohe Indigo-Pflanze" bezeichnet eine lebende, rohe Indigo-Pflanze, welche nicht wesentlich getrocknet und verdorben ist. Solange in solchen Bedingungen befindlich kann in der vorliegenden Erfindung jede Indigo-Pflanze unabhängig von deren Arten und Formen, wie bspw. die ganzen Pflanzenkörper sowie spezifische Teile von deren Blättern, Stielen und Samen, eingesetzt werden. Am meisten bevorzugt werden frische Lufteile der Indigo-Pflanze, insbesondere solche aus der Pflanze vor dem Reifen erhaltenen, eingesetzt.

Der vorliegende physiologisch aktive Extrakt wird durch Einweichen einer rohen Indigo-Pflanze in einem organischen Lösungsmittel, um einen ethylacetatlöslichen Bestandteil aus der Pflanze zu extrahieren, und Sammeln des Extraktes hergestellt; ein Teil oder das Ganze der rohen Indigo-Pflanze wird mit Wasser gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und ggf. weiter geschnitten, pulverisiert und/oder gepresst, und dann in einem geeigneten organischen Lösungsmittel normalerweise in einer Menge des 1 – 100-fachen Volumen der rohen Indigo-Pflanze für 0,1 – 100 Stunden unter optionalen Wärmebedingungen eingeweicht. Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten organischen Lösungsmittel schließen Ethylacetat ein.

Der so erhaltene physiologisch aktive Extrakt kann intakt eingesetzt werden und dieser wird üblicherweise weiterbehandelt, um Verunreinigungen mit Filtration, Abtrennung, abtrennender Sedimentation, Dekantierung und/oder Zentrifugation zu entfernen, und dann behandelt, um organische Lösungsmittel abhängig von den Arten der eingesetzten organischen Lösungsmittel und der endgültigen Anwendung des Extraktes zu entfernen. Abhängig von den Arten an organischen Lösungsmitteln kann der vorliegende physiologisch aktive Extrakt als ethylacetatlösliche Bestandteile 6,12-Dihydro-6,12-dioxoindolo[2,1-b]quinazolin; 3,5,4'-Trihydroxy-6,7-methylendioxyflavon; Kaempferol; 3,5,7,4'-Tetrahydroxy-6-methoxyflavon; Gallussäure; Kaffeesäure; 3-(1,3-Dihydro-3-oxo-2H-indol-2-yliden)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on; [3S-(3&agr;, 4&bgr;, 21&bgr;)]9-Ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-2-phorbinpropansäure) und/oder [3S-(3&agr;, 4&bgr;, 21&bgr;)]9-Ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropansäuremethylester in einer Menge von wenigstens 0,01%, auf einer trockenen Feststoffbasis (d.s.b.), enthalten. Diese Bestandteile weisen eine effektive entzündungshemmende, antivirale, antitumorale, radikalfangende, Apoptose kontrollierende und/oder zytokinproduktionskontrollierende oder -inhibierende Wirkung in Säugetieren und Menschen auf. Wenn bspw. in Pharmazeutika eingesetzt, was den vorliegenden physiologisch aktiven Extrakt in einer relativ hochaufgereinigten Form erfordert, sollten die ethylacetatlöslichen Bestandteile zuvor aus dem Extrakt durch die allgemein zum Reinigen von Indolderivaten und Flavonverbindungen eingesetzten Verfahren abgetrennt werden. Beispiele für diese Aufreinigungsmethoden sind Aussalzen, Dialyse, Filtration, Konzentration, Flüssigkeitsabtrennung, abtrennende Sedimentation, Dekantierung, Flüssigkeitschromatographie, Gaschromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (high-performance-liquid chromatography) und Kristallisation. Diese Verfahren können ggf. in einer geeigneten Kombination angewandt werden. Die ethylacetatlöslichen Bestandteile haben jeweils unterschiedliche Grade an physiologischen Wirkungen und Wirkungsspektren; diese sollten vorzugsweise intakt zu den gewünschten Produkten in den selben Verhältnissen, in denen sie in den Extrakten vorliegen, eingearbeitet werden, wenn in den Gebieten einschließlich Lebensmitteln eingesetzt, was die Verwendung der Bestandteile ohne Trennung in jeden Bestandteil erlaubt. Die physiologisch aktiven Bestandteile haben den Vorzug, dass diese veränderte physiologische Wirkungen aufweisen, wenn in solchen Formen eingesetzt. Zum Einarbeiten der Bestandteile in Pharmazeutika, wie bspw. Injektionen, können abhängig von den für die Bestandteile empfänglichen Krankheiten willkürlich ein oder mehrere der Bestandteile nach Abtrennung oder ohne Abtrennung eingesetzt werden. Die zuvor beschriebenen Verfahren sind lediglich bevorzugte Beispiele zum Herstellen des vorliegenden physiologischen Extraktes.

Der vorliegende physiologisch aktive Extrakt enthaltend ethylacetatlösliche Bestandteile hat wenigstens ein oder mehrere der nachfolgenden Eigenschaften und weist veränderte physiologische Wirkungen auf Säugetiere und Menschen auf:

  • (1) Inhibieren des Wachstums von gram-positiven und gramnegativen Mikroorganismen einschließlich Heliobacter pylori, bekannt als Mikroorganismen, welche Gastritis, Magengeschwüre, duodenale Geschwüre und Magenkrebs hervorrufen;
  • (2) Inhibieren des Wachstums von pathogenen Viren einschließlich Grippevirus, vesikuläres Stomatitis-Virus, Herpes simplex-Virus, Vakzine-Virus und Zytomegalo-Virus;
  • (3) Inhibieren des Wachstums von Tumorzellen von unheilbaren Tumoren einschließlich Leukämie-, Magenkrebs- und Lungenkrebszellen;
  • (4) Einfangen von aus aktivem Sauerstoff und Lipoperoxid abgeleiteten Radikalen, welche bösartige Tumoren, Myokardinfarkt, zerebrale Apoplexie, Rheumatismus, lebensstilbezogene Krankheiten einschließlich geriatrische Krankheiten, Nierenstörungen, Stress und Altern, induzieren;
  • (5) Einwirken auf normale und abnormale B-Zellen, T-Zellen, Nervenzellen, Epithelzellen des Verdauungstraktes, Stammzellen des Verdauungstraktes, vaskuläre Endothelzellen, Hautzellen etc., um die Apoptose der zuvor genannten Zellen innerhalb normaler Bedingungen zu regulieren, und, um Krankheiten der Verdauungsorgane, Kreislauforgane, Auge, Ohr, Nase, Rachen, Haut, Nerven und Knochen zu
  • (6) Herstellung von Zytokinen einschließlich Interferon-&ggr; und Interleukin-10 durch immunokompetente Zellen, welche sich auf die Bestimmung des in vivo-Gleichgewichts zwischen Typ 1 T-Helfer-Zellen (Th1) und Typ 2 T-Helfer-Zellen (Th2) beziehen, um das Gleichgewicht innerhalb der normalen Bedingungen zu kontrollieren und, um die Krankheiten, wie Autoimmunkrankheiten und hepatische Störungen, Nierenstörungen, Pankreasstörungen und auf Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion bezogene Krankheiten zu behandeln/verhindern; und
  • (7) Inhibieren der durch Zytokine und Endotoxine induzierten Expression von synthetischen Stickstoffmonoxid-Enzymen durch Zellen in vivo und Inhibieren der Bildung von Stickstoffmonoxid, um Krankheiten, wie bspw. Autoimmunkrankheiten, allergische Krankheiten, Entzündungskrankheiten, bösartige Tumore, Nierenstörungen und Lungenstörungen zu behandeln/verhindern.

Der vorliegende physiologisch aktive Extrakt kann angiogenetisch inhibierende Verbindungen enthalten, welche sich tief auf die Tumorwucherung in vivo beziehen. Die vorgenannten physiologischen Wirkungen (1) bis (6) können durch die Verfahren der später beschriebenen Versuche bestätigt werden. Bspw. kann die expressionsinhibierende Wirkung auf synthetische Stickstoffmonoxid-Enzyme durch Testen des Einflusses der Zugabe des vorliegenden physiologisch aktiven Extraktes auf die Expression der Enzyme, welche im Allgemeinen "synthetische Stickstoffmonoxid-Enzyme vom Induktionstyp" oder "INOS" genannt werden, mit herkömmlichen Methoden unter Verwendung von Antikörpern gegen die Enzyme in peritonealen Maus-Makrophagen oder Zelllinien aus den Makrophagen, induziert, wenn in der Gegenwart von Interveron-&ggr; oder Lipopolysaccariden kultiviert, bestätigt werden. Herkömmliche Studien, wie die Griess-Methode, über den Spiegel an Stickstoffmonoxid in dem obigen Kultursystem wird den inhibierenden Effekt auf die Stickstoffmonoxid-Bildung durch die Expressionsinhibierung des Enzyms zeigen. Der vorliegende physiologisch aktive Extrakt kann weiter eine Wirkung der Inhibierung von Angiogenese, welche sich tief auf die Wucherung von Tumoren in vivo bezieht, aufweisen. Der vorliegende Extrakt kann ebenfalls einwirken auf die in vivo-Gewebestörungen, welche die durch gram-positive, gram-negative und Pilz-Mikroorganismen und Viren induzierte Entzündung begleitet; den Einfall von oder Kontakt mit Proteinen, organischen Verbindungen und Metallen für lebende Körper; und durch das Auftreten von Tumoren, um die in vivo-Funktionen in einer solchen Weise zu kontrollieren, dass der vorliegende physiologisch aktive Extrakt die Entzündung durch Inhibieren der Produktion von entzündenden Zytokinen einschließlich Interferon-&ggr; und Interleukin-1 inhibiert. Aufgrund dieser abwechslungsreichen physiologischen Wirkungen hat der vorliegende physiologisch aktive Extrakt auch die Eigenschaft des Verbesserns von durch das Vorkommen von Krankheiten verursachten Schlafstörungen. Folglich kann der vorliegende physiologisch aktive Extrakt willkürlich in Lebensmittel-, kosmetischen und pharmazeutischen Industrien als ein Roharzneimittel eingesetzt werden, welches milde antiseptische, antivirale, antitumorale, radikalfangende, Apoptose kontrollierende, zytokinproduktionskontrollierende, zytokinproduktionsinhibierende, angiogenetisch inhibierende, schlafstörungsverbessernde, in vivo-funktionskontrollierende Wirkungen und/oder die Wirkung zum Inhibieren der Expression von synthetischem Stickstoffmonoxid-Enzym aufweist.

Mit diesen Eigenschaften kann der vorliegende physiologische Extrakt willkürlich in den Gebieten von Lebensmitteln, Kosmetika und Pharmazeutika als ein Roharzneimittel, dass moderate antiseptische, antivirale, antitumorale, radikalfangende und/oder Apoptose kontrollierende Wirkungen sowohl in gesunden als auch kranken oder verletzten Individuen aufweist, eingesetzt werden.

Nunmehr die Verwendungen in jedem der vorgenannten Felder erläuternd kann der vorliegende physiologisch aktive Extrakt auf dem Gebiet von Lebensmitteln in Kombination mit einem oder mehreren im Allgemeinen in Lebensmittelprodukten zum Erleichtern der Aufnahme des Extraktes eingesetzten Materialien und/oder Bestandteilen, wie Wasser, Alkoholen, stärkehaltigen Verbindungen, Proteinen, Fasern, Sacchariden, Lipiden, Fettsäuren, Vitaminen, Mineralien, Aromen, Farben, Süßmitteln, Würzmitteln, Gewürzen und Antiseptika, eingesetzt werden. Die resultierenden Mischungen können abhängig von der tatsächlichen Verwendung der Lebensmittel in die gewünschten Gestaltungen und Formen, wie bspw. Flüssigkeiten, Suspensionen, Cremes, Pasten, Gelees, Pulver, Körnchen und anderen gewünschte Formen, formuliert werden. Für den Einsatz in solchen Lebensmitteln wird der vorliegende physiologisch aktive Extrakt im Allgemeinen in einer Menge von wenigstens 0,01 Gew.-% und vorzugsweise 0,1 Gew.-% eingesetzt.

Die Lebensmittelprodukte, für welche die vorliegende Erfindung willkürlich angewendet wird, sind bspw. Würzmittel, wie eine Sojasoße, pulverförmige Sojasoße, "miso", "funmatsu-miso" (ein pulverförmiges miso), "moromi" (ein verfeinertes Sake), "hishio" (eine verfeinerte Sojasoße), "furikake" (ein gewürztes Fischgericht), Majonäse, Dressing, Essig, "sanbai-zu" (eine Soße aus Zucker, Sojasoße und Essig), "funmatsusushi-su" (pulverförmiger Essig für Sushi), "tentsuyu" (eine Soße für frittierte japanische Speisen), "mentsuyu" (eine Soße für japanische Glasnudeln), Soße, Ketchup, "yakiniku-no-tare" (eine Soße für japanisches Grillfleisch), Currymehlschwitze, "chuka-no-moto" (eine Fertigmischung für chinesische Gerichte), Fertigeintopfmischung, Fertigsuppenmischung, "dashi-no-moto" (eine Fertigmischung für Brühe), Würzmischung, "mirin" (ein süßer Sake), "shin-mirin" (ein synthetischer mirin), Tafelzucker und Zucker für Kaffee, "wagashi" (japanische Kuchen), wie "senbei" (ein Reiscracker), "arare " (ein Reiskuchen), "okoshi" (ein Kuchen aus Hirse und Reis), frittierter Hefeteigkuchen, "gyuhi" (Stärkepaste), "mochi" (ein Reisbrei), "manju" (ein Brötchen mit Bohnenkonfitüre), "uiro" (ein süßer Reisgelee), "an" (eine Bohnenkonfitüre), "yokan" (ein süßer Gelee aus Bohnen), "mizu-yokan" (ein weicher Adzuki-Bohnen-Gelee), "kingyoku" (eine Art von yokan), Gelee, Pao de Castella und "amedama" (ein japanisches Toffee); Konditorwaren, wie Biskuit, Cracker, Keks, Torte, Windbeutel, Waffel, Biskuitkuchen, Doughnut, Schokolade, Kaugummi, Karamell, Bonbon und Gummigelee; gefrorene Desserts, wie Eiscreme, Eissüßware und Sorbet; Sirupe, wie "korimitsu" (ein Zuckersirup für geschabtes Eis); Brotaufstriche und Pasten, wie Buttercreme, Mehlpaste, Erdnusspaste und Fruchtpaste; verarbeitete Früchte und Gemüse, wie Konfitüre, Marmelade, "syrup-zuke" (eingemachte Frucht) und "toka" (Eingemachtes); verarbeitete Getreidenahrung, wie Brötchen, Nudel, gekochter Reis und künstliches Fleisch; Öl- und Fettprodukte, wie Salatöl und Margarine; Pickles und eingemachte Produkte, wie "fukujin-zuke" (eingelegte rote Rettiche), "bettara-zuke" (eine Art von eingelegtem frischen ganzen Rettich), "senmai-zuke" (eine Art von eingelegtem frischen geschnittenen Rettich) und "rakkyo-zuke" (eingemachte Schalotten); Vormischungen für Pickles und eingemachte Produkte, wie "takuan-zuke-no-moto" (eine Vormischung für eingelegten Rettich) und "hakusai-zuke-no-moto" (eine Vormischung für eingelegten frischen weißen Raps); Fleischprodukte, wie Schinken und Wurst; Produkte aus Fischfleisch, wie Fischschinken, Fischwurst; "kamaboko" (eine gedünstete Fischpaste), "chikuwa" (eine Art von Fischpaste) und kamaboko vom getriebenen Typ (eine japanische friteusenfrittierte Fischpaste); "chinmi" (Hors d' Oeuve), wie bspw. "uni-no-shiokara" (gesalzene Seeigelinnereien), "ika-no-shiokara" (gesalzene Tintenfischinneren), "su-konbu" (verarbeiteter Tang), "saki-surume" (getrocknete Tintenfischstreifen) und "fugu-no-mirin-boshi" (getrockneter mirin gewürzter Kugelfisch); gekochte Speisen, wie solche gekocht mit landwirtschaftlichen Produkten, Vieh und Fischereien; Tagesgerichte, wie gekochte Lebensmittel, gegrillte Lebensmittel, Braten, frittierte Lebensmittel, gedunstete Lebensmittel und mit Soße angemachte Gerichte; gefrorene Produkte, wie Krabben zum Einfrieren, Kroketten, shao-mai, "gyoza" (gebratene oder gedünstete Knödel gefüllt mit zerhacktem Schweinefleisch), "harumaki" (eine Art von chinesischem Gericht), Hamburger-Steak, Fleischball, Fischhamburger und Fischball; Retortennahrung, wie Hamburger, Fleischball, Reis gekocht zusammen mit roten Bohnen, Resi gekocht zusammen mit Rindfleisch oder Huhn, Schleimsuppe aus unpoliertem Reis, Curry, Fleischsoße, braune Grundsoße (Demiglace), Kartoffelsuppe, Kraftbrühe, Stew, japanisches Allerlei, "happosai" (eine Art von chinesischem Gemüse), gekochte Bohnen, gegrilltes Huhn, topfgedünstetes Allerlei, gekochte Marone und in Wasser gekochtes Gemüse; Ei- und Milchprodukte, wie bspw. "kinshi-tamago" (eine abgezogene Frühlingsrolle), Milchgetränke, Butter und Käse; eingedoste und in Flaschen abgefüllte Produkte, wie bspw. solche aus Fleisch, Fischfleisch, Früchten und Gemüse; Spirituosen, wie bspw. künstlicher Sake, Sake, Wein und Likör; alkoholfreie Getränke, wie bspw. Kaffee, Kakao, Saft, grünerTee, Tee, Oolong-Tee, Mineralgetränke, kohlensäureversetzte Getränke, Sauermilchgetränke und Getränke enthaltend Milchsäurebakterien; sowie Fertiglebensmittelprodukte, wie bspw. eine Fertigpuddingmischung, Fertigmischung für heißen Kuchen, Fertigsaft, "sokuseki-shiruco" (eine Fertigmischung von Adzuki-Bohnen-Suppe mit Reiskuchen) und Fertigsuppenmischung. Der vorliegende physiologisch aktive Extrakt hat die Eigenschaft, in vivo gebildete Radikale einzufangen, so dass er vorteilhaft in auf die Vorbeugung von Lebensstil bezogenen Krankheiten oder geriatrischen Krankheiten, Karzinogenese und Alterung gerichteten Lebensmittelprodukten und ergänzenden Lebensmittelprodukten eingesetzt werden kann. Zusätzlich zu Lebensmitteln für Menschen kann der vorliegende Extrakt ebenfalls in Futtermitteln und Haustierfutter für Tiere, wie bspw. Haustiere, Geflügel, Honigbienen, Seidenraupen und Fische, eingesetzt werden.

Auf dem Gebiet der Kosmetika kann der vorliegende physiologisch aktive Extrakt in Kombination mit den folgenden Bestandteilen, welche die Verabreichung des Extraktes erleichtern, bspw. öligen Basen, wassermischbaren Basen, Aromen, Farben, Farbstoffen, Kühlmitteln, Anfeuchtern, Weichmachern, Emulgatoren, Gelatinierungsmitteln, Viskositätsverbesserern, Weichmachern, Solubilisierungsmitteln, Tensiden, Schaumstabilisatoren, Klärungsmitteln, Antioxidantien, Mitteln gegen Fettleibigkeit, Fäulniserregern, beschichtungsbildenden Mitteln und Sprühmitteln, eingesetzt werden. Der vorliegende Extrakt kann ebenfalls eingesetzt werden durch Vermischen mit einem oder mehreren Medikamenten, wie bspw. Vitaminen, Aminosäuren, Peptiden, Hormonen, Extrakten, Vasodilatoren, blutzirkulationsverstärkenden Mitteln, zellaktivierenden Mitteln, keimtötenden Mitteln, entzündungshemmenden Arzneimitteln, nesselbildungsvorbeugenden Mitteln, Adstringentien, hautfunktionsfördernden Mitteln und keratolytischen Mitteln. Die resultierenden Mischungen können zu Produkten in der Form einer Lösung, Emulsion, Creme, Paste, Pulver, Körnchen oder einem Feststoff mit einer anderen gewünschten Form weiter verarbeitet werden. Abhängig von deren Verwendung enthalten die vorliegenden physiologisch aktiven Zusammensetzungen als Kosmetika normalerweise wenigstens 0,005 Gew.-% und vorzugsweise wenigstens 0,05 Gew.-% des vorliegenden physiologisch aktiven Extraktes.

Beispiele der Kosmetika, für welche der vorliegende physiologisch aktive Extrakt willkürlich eingesetzt werden kann, sind solche für Haare, bspw. Haarwuchsmittel und haarwachstumsfördernde Mittel, Pomaden, Haarstäbchen, Haaröl, Haarcremes, Haarfeststoffe, Haartlüssigkeiten, Haarsatzlotionen, Haarstylinggele, Haarwasserfett, Haarmittel zum Versprühen, Haarspray, Haarflüssigkeiten für permanente Wellen und Haarfärbemittel; solche zum Waschen, wie bspw. Shampoos für Haar und Körper, Haarspülungen, Haarwaschseifen, kosmetische Seifen und knitterfestigende Schäume; solche für Haut, wie bspw. kosmetische Wasser, Cremes, Milchlotionen, Lotionen, Packungen, Grundierungen, Lippenstifte, Rouges, Eyeliner, Wimperntusche, Lidschatten, Augenbrauenstifte, Maniküren und Pulver; solche für orale Anwendungen, wie bspw. Zahnpulver, befeuchtete Zahnpasten, Zahnpasten, Zahnwäschen, medizinische Zahnpasten, Cachous und Gurgelwasser; sowie andere Kosmetika, wie Sonnencremes, Rasierkosmetika, Badkosmetika, Parfums, Kölnisch Wasser, Unterarmdeodorants, Babypuder, Augenlotionen und Bleichcremes. In dem Fall von Kosmetika für Haut und Haare kann die Einarbeitung von ungefähr 0,001 Gew.-% bis ungefähr 10 Gew.-% eines &agr;-Glucosylbioflavonoids, wie bspw. &agr;-Glucosylrutin, &agr;-Glucosylhesperidin und &agr;-Glucosylnaringin, in den vorliegenden physiologisch aktiven Extrakt in der Haut Nahrung ergänzen und den Metabolismus in lebenden Körpern fördern resultierend in einer leichten Ausübung der Wirkungen des vorliegenden physiologisch aktiven Extraktes. Einarbeiten von Anfeuchtern, Sacchariden oder Zuckeralkoholen mit einer feuchtigkeitsverleihenden Wirkung, wie bspw. Maltose, Trehalose und Maltitol, in einer angemessenen Menge, vorzugsweise nicht mehr als einem Gew.-%, befeuchtet die Haut, Kopfhaut und/oder Haare angemessen und ermöglicht dem vorliegenden physiologisch aktiven Extrakt, seine Wirkungen leicht auszuüben.

Auf dem Gebiet der Pharmazeutika kann der vorliegende physiologisch aktive Extrakt willkürlich eingesetzt werden, um alle diejenigen Krankheiten, welche für den vorliegenden ethylacetatlöslichen Bestandteil empfänglich sind, zu behandeln und/oder vorzubeugen einschließlich bakteriellen Krankheiten, durch Pilze hervorgerufenen Krankheiten, viralen Krankheiten, bösartigen Tumoren, Hyperlipämien und ischämischen Herzkrankheiten; bspw. Verdauungstraktkrankheiten, Kreislauforgankrankheiten, Krankheiten der urinalen/genitalen Organe, Immunkrankheiten, kranialen Nervenkrankheiten, Augenkrankheiten, Hautkrankheiten sowie Krankheiten der Nase, Ohren und Hals. Beispiele solcher für den vorliegenden physiologisch aktiven Extrakt empfänglicher Krankheiten sind bakterielle Krankheiten, wie bspw. bakterielles Hornhautgeschwür, bakterielle Konjunktivitis, bakterielle Lebensmittelvergiffung, septischer Schock, Endotoxin-Schock, bakterielle Endokarditis, bakterielle Meningitis, bakterielle Pneumonia, bakterielle Aneurysma sowie bakterielle zerebrale Aneurysma; virale Krankheiten, wie bspw. durch Pilze hervorgerufene Meningitis, durch Pilze hervorgerufenes Hornhautgeschwür, durch Pilze hervorgerufene Hautkrankheiten, Candidiase sowie Tinea; virale Krankheiten, wie bspw. Gastroenterokolitis, virale Hepatitis, vitale Bronchitis, virale Dickdarmentzündung, virale Myokarditis, virale Meningitis, vitale Enterokolitis, vitale Enzephalitis, vitale Pneumonia sowie AIDS; massive bösartige Tumore, wie bspw. Nierenzellkarzinoma, Mykosis fungoides sowie chronisches Granulom; bösartige Bluttumore, wie bspw. Dickdarmkrebs, Rektumkrebs, Karzinome des Kolons und Rektums, Magenkrebs, Schilddrüsenkrebs, Zungenkrebs, Blasenkarzinome, Wimperkarzinome, Hepatome, Prostatakrebs, Uteruskrebs, Pharynxkrebs, Lungenkrebs, Brustkrebs, bösartige Melanome, Kaposi-Sarkom, Hirnkrebs, Neuroblastome, Ovarialtumore, Testikeltumor, Bauchspeichelkrebs, Nierenkrebs, Hypernephrom, Hemangioendotheliom, erwachsene T-Zell-Leukämie (ATL), chronische myelogene Leukämie (CML) sowie bösartige Lymphoma; autoimmune, allergische und virale Krankheiten, wie bspw. aktive chronische Hepatitis, atrophische Gastritis, autoimmune hämolytische Anämie, Basedow-Krankheit, Behcet-Syndrom, Crohn-Krankheit, CRST-Syndrom, kalte durch Agglutinine ausgelöste hämolytische Anämie, idiopathische ulcerative Kolitis, Goodpasture' Syndrom, Hyperthyreoid, chronische Thyreoiditis, Entzündung der pulmonaren Alveolen, Glomerulonephritis, idiopathische thrombopenische Purpura, juvenile Diabetes mellitus, insulinabhängige Diabetes mellitus, Leukopenie, multiple Sklerose, Myasthenia gravis, kalte proxysmale Hämoglobinurie, perniziöse Anämie, Polyarteritis, Polymyositis, primäre biliäre Zirrhose, rheumatisches Fiber, rheumatoide Arthritis, Sjögren' Syndrom, sympathische Ophthalmia, progressive systemische Sklerose, Wegener Granulomatosis, Asthma, atopische Dermatitis, Bronchialasthma, Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion bezogene Krankheit, allergische Rhinitis, Pollinosis und Allergie gegen Bienengift; hepatische Krankheiten, wie alkoholische Hepatitis, toxische Hepatitis, virale Zirrhose, alkoholische Zirrhose, toxische Zirrhose, biliare Zirrhose, Fettleber, hepatischer Tumor und hepatische vaskuläre Störung; Gallenblasen/Biliärtrakt-Krankheiten, wie bspw. Cholangiolitis, Cholezystitis, primäre sklerose Cholangiolitis, Gallenblasentumor und Krebs der Gallengänge; Pankreas-Krankheiten, wie bspw. akute Pankreatitis, chronische Pankreatitis, Pankreas-Insuffizienz, Pankreas-Tumor und Pankreas-Zysten; Kreislauforgankrankheiten, wie bspw. Ischämie, ischämische Herzkrankheit, zerebrale Ischämie, Basilararterienmigräne, abnormales Gefäßnetz an der Gehirnbasis, zerebrale Apoplexie, Aneurysma der Gehirnbasis, Arteriosklerose, vaskuläre Endothelstörung, nichtinsulinabhängige Diabetes mellitus, Okklusion der Mesenterialgefäße und oberes Mesenterialarterien-Syndrom (superior mesenteric artery syndrom); Nervenkrankheiten, wie bspw. Parkinson' Krankheit, spinale Atrophie, amyotrophe Lateralsklerose, Alzheimer Krankheit, Demenz, zerebrovaskulare Demenz, cerebrovaskuläre Demenz, AIDS-Demenz und Meningitis; Verdauungstraktstörungen, wie bspw. Ulcus pepticum, peptisches Geschwür, Darmpolyp, Darmadhäsion, intestinale Rigidität und Magengeschwür; durch das Vorkommen mentaler Störungen, zentraler Nervensystem-Beruhigungsmittel, notorischen Alkohol und durch Störung des Atmungssystems verursachte Schlafstörungen; sowie andere durch die Verabreichung von Hypnotika begleitende Nebeneffekte verursachte Krankheiten.

Auf dem Gebiet der Pharmazeutika kann der vorliegende physiologisch aktive Extrakt in einer effektiven Menge zusammen mit den nachfolgenden, in solch einem Gebiet herkömmlich verwendeten Agentien eingesetzt werden: Anästhetika, hypnotischen Sedativa, Antiangst-Mittel, Anti-Epileptika, antipyretischen Anti-Phlogistika, Stimulantien, Wachaminen (wake amines), Anti-Parkinson Arzneimitteln, Agentien für Psychoneurosen, Agentien für das zentrale Nervensystem, skeletalen Muskelrelaxantien, Agentien für das autonome Nervensystem, antispastischne Agentien, Arzneimitteln für Nase und Ohr, antivertiginösen Arzneimittel, Kardiotonika, antiarrhythmisch aktiven Arzneimitteln, Diuretika, druckreduzierenden Arzneimitteln, Vasokonstriktoren, koronaren Vasodilatoren, peripheren vasodilatorischen Arzneimitteln, Hyperlipämie-Arzneimitteln, Atemstimulantien, Hustenmittel und schleimlösenden Arzneimitteln, Bronchodilatoren, Arzneimitteln gegen Allergien, Arzneimitteln gegen Diarrhoe, Arzneimitteln gegen intestinale Krankheiten, Arzneimitteln gegen Ulcus pepticum, Magenmitteln, Verdauungsmitteln, Magensäuremitteln, Cholagoga, Hypophysenhormon-Arzneimitteln, Speicheldrüsenhormonen, Schilddrüsenhormon-Arzneitmitteln, Antithyreoid-Arzneimitteln, anabolen Steroiden, Corticosteroiden, androgenen Arzneitmitteln, estrogenen Arzneimitteln, Corpus luteum-Hormon Arzneimitteln, vermischten Hormonen, Urinal-/Genitalhormon-Arzneimitteln, Anus-Arzneimitteln, chirurgischen Sterilisationsmitteln/Antiseptika, Wundenschutzmitteln, Arzneimitteln für eitrige Krankheiten zur äußeren Anwendung, Analgetika, schmerzlindernden Mittenl, anti-pruriginösen Mitteln, Adstringentien, Anti-Phlogistika, Arzneimitteln für parasitäre Hautkrankheiten zur äußeren Anwendung, hautweichenden Arzneimitteln, kaustischen Mitteln, dentalen/oralen Arzneimitteln, Vitaminen, anorganischen Präparationen, ergänzenden Flüssigkeiten, Hämostatika, Arzneimitteln zur Antikoagulation, Arzneimitteln für Leberkrankheiten, Gegenmitteln, Arzneimitteln gegen gewohnheitsmäßige Intoxikation, Arzneimitteln zur Behandlung von Gicht, Enzympräparationen, diabetischen Arzneimittel, antionkotischen Mitteln, Antihistaminika, Arzneimitteln zur Stimulationsbehandlung, Antibiotika, Chemotherapeutika, biologischen Präparationen, Anthelminthika, Anti-Protozoika, Arzneimitteln für Präparationen, Röntgenkontrastmedien und diagnostischen Arzneimitteln. Des weiteren ein oder mehrere Extrakte, Elixiere, Kapseln, Granulate, Pillen, Augensalben, Suspensionen, Emulsionen, Gips, Suppositorien, Pulver, Ethanolpräparationen, Tabletten, Sirupe, Infusionen, Dekokte, Injektionen, Tinkturen, ophthalmische Lösungen, Trochäus, Saiben, Kataplasmen, aromatische Wasser, Einreibmittel, Limonaden, Fluidextrakten, Lotionen, Nasentropfen, Nasennebel, Inhalate für die unteren Atemwege, Augenarzneimittel mit verzögerter Wirkstofffreigabe, orale mukosale Pflaster (oral mucosal patches) und Einläufe. Abhängig von der Anwendung und der Route sowie Häufigkeit der Verabreichung wird die Dosis des vorliegenden physiologisch aktiven Extrakts gewöhnlich zwischen 0,01 und 100 mg pro Erwachsenem pro Tag gewählt.

Der physiologisch aktive Extrakt gemäß der vorliegenden Erfindung wird vor Beendigung dessen Prozessierung in einer vorgeschriebenen Menge durch Einsatz von Verfahren, wie bspw. Mischen, Kneten, Auflösen, Einweichen, Berieseln, Auftragen, Sprühen und Injizieren, in die gewünschten Zusammensetzungen eingearbeitet. Die Verbindungen 6,12-Dihydro-6,12-Dioxoindolo[2,1-b]quinazolin; 3,5,4'-Trihydroxy-6,7-methylendioxyflavon, Kaempferol; 3,5,7,4'-Tetrahydroxy-6-methoxyflavon; Gallussäure, Kaffeesäure; 3-(1,3-Dihydro-3-oxo-2H-indol-2-yliden)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on; [3S-(3&agr;,4&bgr;, 21&bgr;)]9-Ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropansäure und/oder [3S-(3&agr;,4&bgr;,21&bgr;)]9-Ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl]-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropansäuremethylester, welche in dem vorliegenden physiologisch aktiven Extrakt enthalten sind, sind bekannte Verbindungen und deren Syntheseverfahren sind ebenfalls bekannt. Wenn der Gehalt an ethylacetatlöslichen Bestandteilen in dem physiologisch aktiven Extrakt unterhalb eines gewünschten Pegels liegt, können die separat präparierten die Bestandteile ergänzen.

Wie oben beschrieben hat der vorliegende physiologisch aktive Extrakt die zuvor genannten befriedigenden Wirkungen; dieser wird nicht nur effektiv in den oben bezeichneten Gebieten, sondern auf anderen Gebieten als Antiseptikum, antivirales Agenz, antitumorales Agenz, radikaleinfangenes Agenz, apoptosekontrollierendes Agenz, Agenz zum Kontrollieren der Produktion von Zytokinen sowie Agenz zum Inhibieren der Expression von synthetischen Stickstoffmonoxid-Enzymen eingesetzt. Zum Beispiel in dem Fall der Verwendung als ein Antiseptikum kann der physiologisch aktive Extrakt willkürlich in den obigen Gebieten eingesetzt und ebenfalls effektiv zum Pasteurisieren von antibakteriellen Zusammensetzungen für tägliche Produkte im Allgemeinen eingesetzt werden. Gegebenenfalls kann der vorliegende physiologisch aktive Extrakt in diesen Zusammensetzungen in Kombination mit anderen Antiseptika, wie bspw. Propolis, &egr;-Polylysin, Benzoesäure, Paraoxybutylbenzoat, Natriumbenzoat, Glycin, Kaliumsorbat, Myconazol, Ketokonazol sowie Ethanol; Aromen, Farben, Tensiden, Puffern, Metallen sowie Metallsalzen nach Lösen derselben in geeigneten Lösungsmitteln oder Verdünnern, eingesetzt werden. Diese pasteurisierenden antibakteriellen Zusammensetzungen können in Produkten, wie bspw. Büroinstrumenten, Kleidungsstücken, Möbeln, Spielzeugen, elektrischen Produkten, Bettwäsche und stationären Produkten, entweder durch Auflegen, Berieseln oder Versprühen oder durch Mixen, Kneten, Auflösen, Injizieren oder Einweichen vor Komplettierung der gewünschten Produkte eingesetzt werden. Der vorliegende physiologisch aktive Extrakt übt die gewünschte antiseptische Wirkung in jedem Produkt effektiv aus.

Die nachfolgenden Versuche beschreiben die physiologische Wirkung des vorliegenden physiologischen Extraktes:

Versuch 1 Herstellung von physiologisch aktivem Extrakt

Dreißig Kilogramm eines Luftteils einer in Aki-City, Shimane-Präfektur, Japan gewachsenen rohen Indigo-Pflanze wurden im Juli gesammelt, pulverisiert und 3 mal wiederholt mit 30 – 60 l Ethylacetat für jede Extraktion bei Umgebungstemperatur extrahiert. Die resultierenden Extrakte wurden vereinigt und mit einem Filterpapier filtriert und das Filtrat wurde gesammelt, einer Verdampfung zum Entfernen von Ethylacetat ausgesetzt sowie zu einem 168 g-Extrakt enthaltend ethylacetatlösliche Bestandteile aus der Indigo-Pflanze getrocknet.

Versuch 2 Isolierung von ethylacetatlöslichem Bestandteil

Ein durch das Verfahren in Versuch 1 erhaltener Extrakt wurde in 50 Vol.-% wässriger Methanollösung suspendiert und die resultierende Lösung wurde zu 8 Portionen aufgeteilt, welche dann jeweils auf eine mit 1.700 ml "FS-1830", einem von Japan Organo Co., Ltd., Tokio, Japan, kommerziell vertriebenen Gel für Adsorptionschromatographie, gepackte Säule geladen und von der Säule durch sukzessives Zuführen von 60 Vol.-%, 70 Vol.-%, 80 Vol.-% und 90 Vol.-% wässrigen Methanollösungen, Methanol und Ethylacetat als Elutionsmittel in demselben Volumen wie dem Gel als Elutionsmittel eluiert. Die früheren und letzteren, Fraktion 2 bzw. Fraktion 1 genannten Fraktionen eluierten von der Säule mit 80 Vol.-% wässriger Methanollösung; die letztere Fraktion, Fraktion 3, eluierte von der Säule mit 60 Vol.-% wässriger Methanollösung; die letztere Fraktion, Fraktion 4, eluierte von der Säule mit 90 Vol.-% wässriger Methanollösung; und die früheren und letzteren, Fraktion 5 bzw. Fraktion 6 genannten Fraktionen eluierten von der Säule mit Methanol und wurden jeweils einer Verdampfung unterworfen, um die Lösungsmittel zu entfernen, und zu Feststoffprodukten getrocknet.

2.6 g von 5,2 g des aus Fraktion 1 erhaltenem Feststoffprodukts wurden in 30 ml Methanol suspendiert, unter Saugen filtriert und in eine lösliche Fraktion und eine unlösliche Fraktion (876 g) aufgetrennt. Die lösliche Fraktion wurde auf eine mit 1.350 ml Silicagel gepackte Säule gegeben, von der Säule mit einem linearen, sich schrittweise von einer Methanolkonzentration von 5 Vol.-% auf 100 Vol.-% erhöhenden Gradienten eines Lösungsmittelsystems aus Chloroform und Methanol unter Sammeln des Eluats in 450 ml-Fraktionen eluiert. Die vierte Fraktion wurde einer Verdampfung unterzogen, um Lösungsmittel bis zu einem Festprodukt zu entfernen, gefolgt vom Suspendieren desselben in zwei Millilitern Methanol sowie Filtrieren der Suspension während des Waschens unter Saugkraft zu einem 19,4 mg Kristall von Verbindung 1. Die obige unlösliche Fraktion wurde in einer geeigneten Menge Methanol gelöst und dieser erlaubt, bei Umgebungstemperaturen stehen zu bleiben, um 278 mg eines gelben nadelförmigen Kristalls der Verbindung 2 zu erhalten.

10,7 g des aus Fraktion 2 erhaltenen Festproduktes wurden in 40 ml Methanol suspendiert und die Lösung wurde auf eine mit 1.520 ml "SEPHADEX LH-20", einem von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden kommerziell vertriebenen Gel für Adsorptionschromatographie, gepackte Säule aufgegeben und von der Säule mit Methanol unter Sammeln von 190 ml-Teilmengen des Eluats eluiert. Für jede der 15. und 18. Fraktionen wurden die Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt und diese zu festen Produkten getrocknet. Vierhundert Milligramm des festen Produktes aus der 18. Fraktion wurde komplett in ungefähr 210 ml eines Lösungsmittelsystems aus Methanol und Wasser (= 5:2 pro Volumen) gelöst. Die Lösung wurde mit einem 0,22 &mgr;m Membranfilter filtriert und dem Filtrat wurde erlaubt, bei Umgebungstempertur für 3 Tage stehen zu bleiben, um einen Kristall zu finden. Die resultierende Mischung wurde unter Verwendung eines konventionellen Filterpapiers filtriert, um einen 89,3 mg Kristall der Verbindung 3 zu sammeln. Fünfhundert Milligramm des aus der 15. Fraktion erhaltenen festen Produktes wurden in 10 ml Methanol suspendiert und filtriert, um unlösliche Substanzen zu sammeln, welche dann mit 250 ml Methanol vermischt und komplett darin gelöst wurden. Die Lösung wurde mit einem 0,22 &mgr;m Membranfilter filtriert, dieser erlaubt, bei Umgebungstemperatur für 7 Tage stehen zu bleiben, um einen Kristall zu finden, sowie unter Verwendung eines gewöhnlich eingesetzten Filterpapiers einer Filtration unterworfen, um einen 252,3 mg Kristall der Verbindung 4 zu sammeln.

11,8 g des aus Fraktion 3 erhaltenen festen Produktes wurden in 40 ml Methanol suspendiert und die Lösung wurde auf eine mit 1.680 ml "SEPHADEX LH-20", einem von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden kommerziell vertriebenen Adsorptionschromatographiegel, gepackte Säule aufgegeben und von der Säule mit Methanol unter Sammeln des Eluats in 560-ml-Fraktionen eluiert. Die vierte Fraktion wurde einer Verdampfung unterzogen, um das Lösungsmittel zu entfernen, und zu einem festen Produkt getrocknet. Das feste Produkt wurde in 10 ml Methanol gelöst und die Lösung wurde auf eine mit 480 ml "FS-1830", einem von Japan Organo Co., Ltd., Tokio, Japan kommerziell vertriebenem Gel für Adsorptionschromatographie, gepackten Säule aufgegeben, durch sukzessive Aufgabe auf die Säule von 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 und 70 Vol.-% wässrigen Methanollösungen in einem entsprechenden Volumen von 480 ml eluiert und weiter mit 960 ml Methanol eluiert. Das Eluat wurde in 240 ml-Fraktionen fraktioniert und die 5. Fraktion wurde einer Verdampfung ausgesetzt, um das Lösungsmittel zu entfernen, und zu 150 mg eines festen Produktes getrocknet. Das so erhaltene Produkt wurde in 300 ml Ethylacetat gelöst und die Lösung wurde mit einem 0,22 &mgr;m Membranfilter filtriert. Dem Filtrat wurde erlaubt, bei Umgebungstemperatur für 7 Tage stehen zu bleiben, um einen Kristall zu finden, und die Mischung wurde mit einem gewöhnlich eingesetzten Filterpapier filtriert, um einen 18,7 mg Kristall der Verbindung 5 zu sammeln. Die 9. von der Säule mit "FES-1830" eluierte Fraktion wurde verdampft, um das Lösungsmittel zu entfernen, und zu 500 mg eines festen Produktes getrocknet. Das feste Produkt wurde dann in 0,5 ml Ethylacetat gelöst, auf eine mit 40 ml "SILICAGEL 60K650", einem von Katayama Chemical Industries Co., Ltd., Tokio, Japan kommerziell vertriebenen Gel für Adsorptionschromatographie, gepackte Säule aufgegeben, gefolgt vom Aufgeben von 40 ml Teilmengen der entsprechenden Mischungen von Ethylacetat und Chloroform (= 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 und 9:1 pro Volumen), Chloroform und Methanol, in dieser Reihenfolge, auf die Säule. Das Eluat von der Säule wurde zu 10 ml fraktioniert und die 17. und 21. Fraktion wurden vereinigt und einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von "SILICAGEL", einer von Merck & Co., Inc., NJ, USA kommerziell vertriebenen trennenden Dünnschicht, sowie einer Lösungsmischung von Toluol, Ethylacetat und Essigsäure (= 5:5:1 pro Volumen) als ein Entwickler unterworfen. Nach der Entwicklung wurde ein Teil des Silicagels an der Position mit einem Rf von ungefähr 0,6 abgekratzt und mit einer angemessenen Menge Methanol extrahiert, um eine entwickelte Substanz zu erhalten. Der Extrakt wurde verdampft, um das Lösungsmittel zu entfernen, und zu einem 15,4 mg Kristall der Verbindung 6 getrocknet.

Vier Gramm von 4,6 g des aus Fraktion 4 erhaltenen festen Produktes wurden mit 40 ml Methanol zwecks Auflösen vermischt, wurde aber teilweise nicht gelöst, um ein Sediment zu bilden. Das Sediment wurde gesammelt, mit 800 ml Methanol vermischt und darin ausreichend gelöst und diesem erlaubt, bei Umgebungstemperatur für zwei Tage stehen zu bleiben, um einen roten Rohkristall zu beobachten. Der Rohkristall wurde gesammelt und dem Überstand wurde erlaubt, unter denselben Bedingungen wie zuvor stehen zu bleiben, um einen anderen roten Rohkristall zu beobachten. Der neu gebildete Kristall wurde gesammelt und mit dem zuvor erhaltenen Kristall vereinigt und die Mischung wurde mit einer angemessenen Menge Methanol gewaschen und in einer ausreichenden Menge Methanol gelöst. Die resultierende Lösung wurde in einer gewöhnlichen Weise filtriert und das Filtrat wurde verdampft, um das Lösungsmittel zu entfernen, und zu einem 44,5 mg Kristall der Verbindung 7 getrocknet.

Obwohl die konkreten Daten nicht gezeigt sind, wurde Fraktion 5 mit "FS-1830"- und "SILICAGEL 60K650"-Säulen gleichermaßen wie für Fraktion 3 angewandt, behandelt und in Methanol kristallisiert, um einen Kristall, nämlich Verbindung 8, zu erhalten; und Fraktion 6 wurde mit einer "FES-1830"-Säule gleichermaßen wie für Fraktion 3 angewandt, behandelt und in Acetonitril kristallisiert, um einen Kristall, nämlich Verbindung 9, zu erhalten.

Versuch 3 Identifikation der Verbindung 1 Versuch 3-1 Massenspektrum

Die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 1 ergab beim Vermessen bezüglich Massenspektrum bei schnell atomarer Bombardment Massenspektrometrie (fast atomic bombardment mass spectrometry) (nachfolgend als "FAB-MS" abgekürzt) einen Peak bei m/z 249 ([M+H]+) und ergab beim Vermessen mit hochauflösender Massenspekrometrie einen Peak bei m/z 249,0694 ([M+H]+).

Versuch 3-2 Magnetisches Resonanzspektrum

Für die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 1 wurde ein magnetisches Resonanzabsorptionsspektrum mit dem 1H-nuklearen magnetischen resonanzspektroskopischen Verfahren (1H-nuclear magnetic resonance spectroscopic method) und dem 13C-nuklearen magnetischen resonanzspektroskopischen Verfahren (13C-nuclear magnetic resonance spectroscopic method) (im Nachfolgenden als 1H-NMR bzw. 13C-NMR abgekürzt) gemessen.

Die in jedem Spektrum beobachteten chemischen Verschiebungen und die Zuordnungen der Wasserstoff- und Kohlenstoffatome sind in Tabelle 1 tabellarisch angeordnet.

Tabelle 1
Tabelle 1 (fortgesetzt)

Basierend auf den experimentellen Daten wurden Verbindung 1 als der ethyllösliche Bestandteil aus der Indigo-Pflanze als 6,12-Dihydro-6,12-dioxoindolo[2,1-b]quinazolin (Tryptanthrin, C15H8N2O2, MW = 248) identifiziert. Die chemische Struktur der Verbindung 1 ist wie folgt:

Chemische Formel 1:

Versuch 4 Identifizierung der Verbindung 2 Versuch 4-1 Schmelzpunkt

Für die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 2 wurde in gewöhnlicher Weise der Schmelzpunkt gemessen und gezeigt, dass diese einen Schmelzpunkt von 298°C hat.

Versuch 4-2 Schmelzpunkt Ultraviolett-Absorptionsspektrum

Für die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 2 wurde ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel in einer gewöhnlichen Weise gemessen und gezeigt, dass diese maximale Absorptionsspektren bei Wellenlängen von 206, 240, 273 und 353 nm hatte.

Versuch 4-3 Infrarot-Absorptionsspektrum

1 ist ein durch das Druck-Tabletten-Verfahren unter Verwendung von pulverförmigem Kaliumbromid gemessene Infrarot-Absorptionsspektrum von Verbindung 2.

Versuch 4-4 Massenspektrum

Für die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 2 wurde ein Massenspektrum mit FAB-MS gemessen, um einen Peak bei m/z 314 (M+) zu finden.

Versuch 4-5 Nukleares magnetisches Resonanzabsorptionsspektrum

Für die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 2 wurde ein nukleares magnetisches Resonanzabsorptionsspektrum mit 1H-NMR und 13C-NMR gemessen. Die chemischen Verschiebungen und Wasserstoff- sowie Kohlenstoffatome der in jedem Spektrum beobachteten Signale sind in Tabelle 2 tabellarisch angeordnet.

Tabelle 2
Versuch 4-6 Elementaranalyse

Herkömmliche Elementaranalyse der durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltenen Verbindung 2 resultierte in C = 59,2 %, H = 3,4 %, O = 37,4 % und N < 0,3 % und zeigte, dass Verbindung 2 eine experimentelle Formel von C15H10O7·3/5 H2O hat.

Basierend auf den Daten wurde Verbindung 2 als ein ethylacetatlöslicher Bestandteil der Indigo-Pflanze als 3,5,4'-Trihydroxy-6,7-methylendioxyflavon identifiziert. Die chemische Formel der Verbindung 2 ist in der chemischen Formel 2 gezeigt:

Chemische Formel 2:

Versuch 5 Identifizierung von Verbindung 3 Versuch 5-1 Dünnschichtchromatographie

Die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 3, Chlorogensäure, Quercetin, Kaempferol, Ferulasäure, Zimtsäure, Cumarinsäure, Galangin sowie Pinocembrin, welche alle von Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo, USA gekauft wurden, wurden einer konventionellen Dünnschichtchromatographie unterworfen. Als Dünnschichtplatte wurde das von Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo, USA kommerziell vertriebene "KIESELGEL 60F254" eingesetzt und eine Lösungsmischung von Toluol, Ethylacetat und Essigsäure (= 8:1:1 pro Volumen) wurde als Entwicklerlösungsmittelsystem eingesetzt. Nach der Entwicklung wurden die Proben auf der Platte durch Ultraviolettstrahlung bei einer Wellenlänge von 254 mm gefärbt. Als ein Ergebnis stimmte der Rf der Verbindung 3 gut mit dem von Kaempferol als Flavonoid überein.

Versuch 5-2 Schmelzpunkt

Für die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 3 wurde der Schmelzpunkt in einer gewöhnlichen Weise gemessen und gezeigt, dass diese einen Schmelzpunkt von 277°C hatte.

Versuch 5-3 Ultraviolett-Absorptionsspektrum

Für die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 3 wurde ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum unter Verwendung von Methanol als ein Lösungsmittel in einer gewöhnlichen Weise gemessen und gezeigt, dass dieses schulterartige Absorptionsspektrum Maxima bei Wellenlängen von 265, 365 und 320 nm zeigte.

Versuch 5-4 Infrarot-Absorptionsspektrum

2 ist ein durch das Druck-Tabletten-Verfahren unter Verwendung von pulverförmigem Kaliumbromid gemessene Infrarot-Absorptionsspektrum von Verbindung 3.

Basierend auf den Daten wurde Verbindung 3 als ein ethylacetatlöslicher Bestandteil aus der Indigo-Pflanze als Kaempferol mit einer chemischen Formel von C15H10O6 und einem Molekulargewicht von 286 identifiziert. Die chemische Formel der Verbindung 3 ist in der chemischen Formel 3 gezeigt.

Chemische Formel 3:
Versuch 6 Identifizierung der Verbindung 4 Versuch 6-1 Schmelzpunkt

Eine konventionelle Analyse bezüglich des Schmelzpunktes der durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltenen Verbindung 4 zeigte, dass die Verbindung einen Schmelzpunkt von 272°C aufwies.

Versuch 6-2 Ultraviolett-Absorptionsspektrum

Gemäß einer üblichen Weise wurde die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 4 bezüglich ihres Ultraviolett-Absorptionsspektrums unter Verwendung von Methanol als Lösungsmittel 1, Methanol enthaltend Natriummethylat als Lösungsmittel 2, Methanol enthaltend wasserfreies Aluminiumchlorid als Lösungsmittel 3 oder Methanol enthaltend wasserfreies Aluminiumchlorid und Salzsäure als Lösungsmittel 4 als Lösungsmittel vermessen. Die Maxima der Absorptionsspektren mit jedem Lösungsmittelsystem sind in Tabelle 3 tabellarisch angeordnet.

Tabelle 3

Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, dass Verbindung 4 eine zu Flavonol mit Hydroxy-Gruppen an C-3, C-7 und C-4' oder an C-3, C-5, C-7 und C-4' gehörende Verbindung ist.

Versuch 6-3 Nukleares magnetisches Resonanzabsorptionsspektrum

Die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 4 wurde bezüglich ihres nuklearen magnetischen Resonanzabsorptionsspektrums mit 1H-NMR und 13C-NMR vermessen. Die in jedem Spektrum beobachteten chemischen Verschiebungen und die Zuordnungen der Wasserstoff- und Kohlenstoffatome sind in Tabelle 4 tabellarisch angeordnet.

Tabelle 4
Versuch 6-4 Massenspektrum

Für die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 4 wurde in gewöhnlicher Weise ein Massenspektrum mit Elektronen-Ionisations-Massenspektrometrie (electron ionization mass spectrometry (EI-MS)) gemessen, um einen Peak bei m/z 316 (M+) zu zeigen, und ergab einen Peak bei m/z 316,0486 (M+) bei hoch auflösender Massenspektrometrie.

Versuch 6-5 Infrarot-Absorptionsspektrum

3 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum der Verbindung 4, gemessen nach dem Druck-Tabletten-Verfahren unter Verwendung von pulverförmigem Kaliumbromid.

Basierend auf den Daten wurde Verbindung 4 als ein ethylacetatlöslicher Bestandteil aus der Indigo-Pflanze als 3,5,7,4'-Tetrahydroxy-6-methoxyflavon mit einer chemischen Formel von C16H12O7 und einem Molekulargewicht von 316 identifiziert. Die chemische Formel von Verbindung 4 ist in der chemischen Formel 4 gezeigt.

Chemische Formel 4:
Versuch 7 Identifizierung der Verbindung 5 Massenspektrum

Für die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 5 wurde in gewöhnlicher Weise ein Massenspektrum mit Elektronen-Ionisations-Massenspektrometrie (EI-MS) gemessen, um einen Peak bei m/z 170 (M+) zu zeigen.

Versuch 7-2 Nukleares magnetisches Resonanzabsorptionsspektrum

Die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 5 wurde mit 1H-NMR und 13C-NMR bezüglich ihres nuklearen magnetischen Resonanzabsorptionsspektrums vermessen. Die in jedem Spektrum beobachteten chemischen Verschiebungen und die Zuordnungen der Wasserstoff- und Kohlenstoffatome sind in Tabelle 5 tabellarisch angeordnet.

Tabelle 5

Basierend auf den Daten wurde Verbindung 5 als ein ethylacetatlöslicher Bestandteil aus der Indigo-Pflanze als Gallussäure mit einer chemischen Formel von C7H6O5 und einem Molekulargewicht von 170 identifiziert. Die chemische Formel der Verbindung 5 ist in der chemischen Formel 5 wiedergegeben.

Chemische Formel 5:
Versuch 8 Identifizierung der Verbindung 6 Versuch 8-1 Massenspektrum

Die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 6 wurde in einer gewöhnlichen Weise mit Elektronen-Ionisations-Massenspektrometrie (EI-MS) bezüglich Massenspektrum vermessen, um einen Peak bei m/z 180 (M+) zu zeigen.

Versuch 8-2 Infrarot-Absorptionsspektrum

4 ist ein nach dem Druck-Tabletten-Verfahren unter Verwendung von pulverförmigem Kaliumbromid gemessenes Infrarot-Absorptionsspektrum der Verbindung 6. Vergleichend mit dem Infrarot-Absorptionsspektrum bekannter Verbindungen stimmte das Spektrum der Verbindung 6 gut mit dem von Kaffeesäure überein.

Versuch 8-3 Nukleares magnetisches Resonanzabsorptionsspektrum

Für die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 6 wurde mit 1N-NMR und 13C-NMR ein nukleares magnetisches Resonanzabsorptionsspektrum gemessen. Die in jedem Spektrum beobachteten chemischen Verschiebungen und die Zuordnungen von Wasserstoff- und Kohlenstoffatomen sind in der Tabelle 6 tabellarisch angeordnet.

Tabelle 6

Basierend auf den Daten wurde Verbindung 6 als ein ethylacetatlöslicher Bestandteil aus der Indigo-Pflanze als Kaffeesäure mit einer chemischen Formel von C9H8O4 und einem Molekulargewicht von 180 identifiziert. Die chemische Formel der Verbindung 6 ist in der chemischen Formel 6 gezeigt.

Chemische Formel 6:
Versuch 9 Identifizierung von Verbindung 7 Versuch 9-1 Massenspektrum

Die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 7 wurde in einer gewöhnlichen Weise mit Elektronen-Ionisations-Massenspektrometrie (EI-MS) bezüglich Massenspektrums vermessen, um einen Peak bei m/z 262 (M+) zu zeigen.

Versuch 9-2 Infrarot-Absorptionsspektrum

5 ist ein nach dem Druck-Tabletten-Verfahren unter Verwendung von pulverförmigem Kaliumbromid vermessenes Infrarot-Absorptionsspektrum von Verbindung 7. Vergleichend mit dem Infrarot-Absorptionsspektrum der bekannten Verbindung stimmte das Spektrum der Verbindung 7 gut mit dem von 3-(1,3-Dihydro-3-oxo-2H-Indol-2-yliden)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on überein.

Versuch 9-3 Nukleares magnetisches Resonanzabsorptionsspektrum

Für die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 7 wurde mit 1H-NMR und 13C-NMR ein nukleares magnetisches Resonanzabsorptionsspektrum gemessen. Die in jedem Spektrum beobachteten chemischen Verschiebungen und die Zuordnungen der Wasserstoff- und Kohlenstoffatome sind in Tabelle 7 tabellarisch angeordnet.

Tabelle 7

Basierend auf den Daten wurde Verbindung 7 als ein ethylacetatlöslicher Bestandteil aus der Indigo-Pflanze als 3-(1,3-Dihydro-3-oxo-2H-indol-2-yliden)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on, d. h. Indirubin, mit einer chemischen Formel von C16H10N2O2 und einem Molekulargewicht von 262, identifiziert. Die chemische Formel der Verbindung 7 ist in der chemischen Formel 7 gezeigt.

Chemische Formel 7:

Die Verbindung 8 wurde gleichermaßen wie bei der Identifizierung der Verbindungen 1 bis 7 identifiziert, zeigend, dass diese [3S-(3&agr;,4&bgr;,21&bgr;)]9-Ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropansäure), d. h. Pheophorbid a mit einer chemischen Formel von C35H36N4O5 Und einem Molekulargewicht von 592,69, war; und Verbindung 9 wurde identifiziert, zeigend, dass es [3S-(3&agr;,4&bgr;,21&bgr;)]9-Ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropansäuremethylester, d. h. Methylpheophorbid a, C36H38N4O5, MW 606, war. Die chemischen Formeln der Verbindung 8 als Pheophorbid a bzw. Verbindung 9 als Methylpheophorbid sind in den chemischen Formeln 8 und 9 gezeigt:

Chemische Formel 8:
Chemische Formel 9:

Versuch 10 Antiseptische Wirkung

Die durch die Verfahren in den Versuchen 1 und 2 erhaltenen physiologisch aktiven Extrakte wurden, wie in der nachfolgenden Tabelle 8 gezeigt, bezüglich deren minimalen inhibitorischen Konzentration (MIC) mit Bezug auf die Bakterien in Tabelle 8 durch das Agar-Platten-Verdünnungs-Verfahren unter Verwendung eines Streifenverteilers untersucht. Brucella broth (BBL) enthaltend 1,5 Gew.-% Agar, 0,1 Gew.-% Glucose und 7 Vol.-% keimfreies, entfibriniertes Pferdeblut wurde als ein Nährkulturmedium für Heliobacter pylori (NCTC 11638) eingesetzt. Für die anderen Bakterien wurde ein konventionelles Medium für Sensitivitätsplatten eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt.

Tabelle 8

Die Symbole "A", "B", "C", "D" und "E" repräsentieren den physiologisch aktiven Extrakt von Versuch 1, Verbindung 1 von Versuch 2, Verbindung 2 von Versuch 2, Verbindung 3 von Versuch 2 bzw. Verbindung 4 von Versuch 2.

Die Ergebnisse in Tabelle 8 zeigen, dass der vorliegende physiologisch aktive Extrakt das Wachstum von gram-positiven und gram-negativen Bakterien inhibierte. Unter diesen Extrakten und Verbindungen inhibierten insbesondere die Verbindungen 1, 3 und 4 das Wachstum von Heliobacter pylori als einem pathogenen Bakterium für Gastritis, Magengeschwür, Zweifingerdarmgeschwür und Magenkrebs nachhaltig.

Versuch 11 Antivirale Wirkung

Gemäß einer herkömmlichen Weise wurden FL-Zellen (ATCC CCL62), eine etablierte Zelllinie aus einem normalen menschlichen Amnion-Gewebe, auf einer Mikroplatte einer Einschichtkultur unterworfen. Der Kulturüberstand wurde aus der Mikroplatte entfernt und vesikulärer Stomatitis-Virus (VSV) wurde auf den Einschichtzellen in einem Verhältnis von 0,1 Plaque bildenden Einheiten (PFU) pro Zelle adsorbiert, gefolgt von der Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen von den durch die Verfahren in den Versuchen 1 und 2 erhaltenen physiologisch aktiven Extrakten gemäß der nachfolgenden Tabelle 9 und gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO) zu den Zellen, Inkubieren der Zellen bei 37°C für 24 Stunden, Zertrümmern der FL-Zellen in der Mikroplatte durch Wiederholen von Einfrieren und Auftauen sowie Zentrifugieren der Mikroplatte, um einen Kulturüberstand enthaltend VSV zu erhalten.

Daraufhin wurden die Testproben unter Verwendung von aus einem Maus-Fibroplasten als eine Zielzelle abgeleiten L929-Zellen (RCB0081) durch ein herkömmliches Verfahren bezüglich deren antiviralen Aktivität unter Verwendung des zytopathischen Effektes (CPE) pro Virus als ein Index untersucht. Es wurde die 50 % wachstumsinhibierende Konzentration jedes physiologisch aktiven Extraktes berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 wiedergegeben.

Tabelle 9

Wie in Tabelle 9 gezeigt wurde bestätigt, dass der vorliegende physiologisch aktive Extrakt eine antivirale Wirkung auf ein pathogenes Virus ausübt. FL-Zellen wurden unter virusfreien Bedingungen in einer gewöhnlichen Weise in der Gegenwart von oder in der Abwesenheit von jedem physiologisch aktiven Extrakt unter deren oben bestimmten 50 % wachstumsinhibierenden Konzentrationen kultiviert. Als ein Ergebnis wurde kein signifikanter Unterschied sowohl in dem Wachstum als auch der Wucherung der Zellen unter jeder Bedingung gefunden. Unter Verwendung der Methode mit einem Index des obigen CPE oder eines konventionellen Verfahrens mit einem Index der Plaque-Bildung wurde der vorliegende physiologisch aktive Extrakt bezüglich dessen antiviraler Wirkung auf den Herpes simplex-Virus (HSV 1), Grippevirus, Vakzine-Virus (VV) und Maus-Zytomegalo-Virus (MCMV) untersucht. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass der vorliegende physiologisch aktive Extrakt wenigsten denselben Grad an antiviraler Wirkung, wie für VSV gefunden, auf diese pathogenen Viren aufweist.

Diese Daten indizieren, dass der vorliegende physiologisch aktive Extrakt eine starke antivirale Wirkung auf tierische und menschliche pathogene Viren ausübt.

Versuch 12 Antitumorale Wirkung

Wie in der nachfolgenden Tabelle 10 gezeigt wurde jeder der durch die Verfahren in den Versuchen 1 und 2 erhaltenen physiologisch aktiven Extrakte als Testprobe in DMSO gelöst, um eine Konzentration von 10 mg/ml zu ergeben, 50 mal mit RPMI 1640-Medium (pH 7,2) ergänzt mit 10 Vol.-% fötalem Kälberserum verdünnt und in eine 96-Schacht-Mikroplatte in einem Volumen von 100 &mgr;l/Schacht verteilt. Lösungen in jedem Schacht wurden seriell mit einer frischen Präparation desselben, wie zuvor eingesetzten RPMI 1640-Mediums (pH 7,2) verdünnt.

Aus einem Patienten mit akuter Promyelozytenleukämie abgeleitete HL-60 Zellen (ATCC CCL-240), aus einem Patienten mit Magenkrebs abgeleitete HGC-27-Zellen (RCB0500) und aus einem Patienten mit Lungenadenokarzinom abgeleitete HLC-1 Zellen (RCB0083) wurden jeweils in frischen Präparationen desselben, wie zuvor eingesetzten RPM11640-Mediums (pH 7,2) suspendiert, um entsprechende Zellkonzentrationen von 4 × 105 Zellen/ml, 4 × 105 Zellen/ml und 2 × 106 Zellen/ml zu ergeben. Jede Zellsuspension wurde auf eine Mikroplatte in einem Volumen von 50 &mgr;l/Schacht verteilt und bei 37°C für 48 Stunden in einem 5 Vol.-% CO2-Inkubator inkubiert. Zu jeder Mikroplatte wurde eine 25 vol.-%-ige wässrige Glutaraldehydlösung in einem Volumen von 20 &mgr;l/Schacht zugegeben und der Mikroplatte wurde erlaubt, für 15 Minuten stehen zu bleiben, um die Zellen zu fixieren. Dann wurden die an den Schächten anhaftenden Zellen mit Wasser gewaschen, mit einer 0,05 gew.-%-igen wässrigen Methylenblau-Lösung in einem Volumen von 100 &mgr;l/Schacht vermischt und diesen weiter erlaubt, für 15 Minuten stehen zu bleiben, um die Zellen zu färben. Daran anschließend wurde die überschüssige Menge der Färbelösung aus den Schächten durch Waschen mit Wasser entfernt und die Zellen wurden getrocknet, mit 300 &mgr;l/Schacht 0,33 N Salzsäure vermischt, ausreichend gerührt und bei einer Wellenlänge von 620 nm bezüglich Absorption vermessen. Parallel dazu wurde als eine Kontrolle ein von einer Testprobe freies System bereitgestellt und gleichermaßen wie in den Testproben behandelt. Die 50 % wachstumsinhibierende Konzentration (IC50) für jede Testprobe wurde als ein Index der antitumoralen Wirkung verwendet und die Proben wurden bezüglich deren IC50 unter Berücksichtigung des Zellwachstums der Kontrolle als 100 % berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 wiedergegeben.

Tabelle 10

Die Ergebnisse in Tabelle 10 zeigen, dass der vorliegende physiologisch aktive Extrakt das Wachstum der Tumorzellen von Leukämie, Magenkrebs und Lungenkrebs, bekannt als hartnäckige, bösartige Tumore, effektiv inhibiert. Insbesondere Verbindung 1 zeigte eine 10-fach oder höhere antitumorale Wirkung als Verbindung 2. Diese Daten zeigen, dass der vorliegende physiologisch aktive Extrakt einen therapeutischen, prophylaktischen Effekt auf bösartige Tumoren von Säugetieren und Menschen aufweist.

Versuch 13 Radikalfangende Wirkung

Wie in der Tabelle 11 gezeigt wurde die radikalfangende Wirkung des durch die Verfahren in den Versuchen 1 und 2 erhaltenen physiologisch aktiven Extrakts gemäß dem von Toshio IMANARI in Igaku-no-Ayumi (Development of Medical Science), Bd. 101, S. 496 – 497 (1977) beschriebenen Nitroblau-Tetrazolium-Verfahren (NBT) evaluiert; die Testproben wurden sowohl in einem gekoppelten Reaktionssystem, umfassend eine Reaktion, bei der Xanthinoxidase auf Xantin einwirkt, um Superoxide zu bilden, als auch einem Reaktionssystem, bei dem das gebildete Superoxid durch die Oxidationskraft NTB zu Formazan konvertiert, koexistiert. Dann wurde das gebildete Formazan durch spektrochemische Analyse quantifiziert. Jeder der vorliegenden physiologisch aktiven Extrakte wurde in aufgereinigtem Wasser gelöst, um eine angemessene Konzentration zu ergeben, und die Lösungen wurden als Testproben eingesetzt. Durch Ersetzen der Testproben mit gereinigtem Wasser wurde eine Kontrolle bereitgestellt. Die 50 % inhibitorische Aktivität für die Bildung von Formazan in der Kontrolle wurde als eine Einheit Aktivität der radikalfangenden Wirkung definiert. Basierend auf der Definition wurde die radikalfangende Aktivität eines Gramms jeder Testprobe bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 wiedergegeben.

Tabelle 11

Wie in der Tabelle 11 gezeigt übt der vorliegende physiologisch aktive Extrakt eine starke radikalfangende Wirkung aus. Insbesondere die radikalfangende Wirkung der physiologisch aktiven Verbindung aus Versuch 1 und der Verbindungen 5 und 6 aus Versuch 2 war bemerkenswert. Dies indiziert, dass die vorliegenden physiologisch aktiven Extrakte die Eigenschaft haben, Radikale aus aktivem Sauerstoff und Lipoperoxid in vivo effektiv einzufangen, und einen therapeutischen/prophylaktischen Effekt auf mit in vivo-Radikalen in Beziehung stehenden Krankheiten, wie bspw. bösartige Tumore, Myokardialinfarkt, zerebrale Apoplexie, Rheumatismus, auf mit dem Lebensstil verbundene Krankheiten oder geriatrische Krankheiten, Stress und Alterung, ausübt. Verbindung 1 hat eine unzureichende Wasserlöslichkeit; die Evaluierung der radikalfangenden Wirkung durch das Verfahren in Versuch 13 war unmöglich.

Versuch 14 Apoptosekontrollierende Wirkung

Die durch das Verfahren in Versuch 2 erhaltene Verbindung 1 wurde in DMSO gelöst, um eine Konzentration von 0,8 mg/ml zu ergeben, und mit RPMI1640-Medium (pH 7,2) ergänzt mit 10 Vol.-% fötalem Kälberserum zu einer 20 &mgr;g/ml-Lösung verdünnt. Die Lösung wurde in eine Mikroplatte zu einem Milliliter pro Schacht verteilt und die Lösung in jedem Schacht wurde in Serie mit einer frischen Präparation desselben wie zuvor eingesetzten Mediums verdünnt.

Aus einem Patienten mit akuter Promyelozytenleukämie abgeleitete HL-60 Zellen, ATCC CCL-240; aus einem Patienten mit humanen histiozytischen Lymphom abgeleitete U-937 Zellen, ATCC CRL-1593.2; aus einem Patienten mit Magenkrebs abgeleitete HGC-27 Zellen, RCB0500; aus einem Patienten mit einem Lungenadenokarzinom abgeleitete HLC-1 Zellen, RCB0083; und aus einem gelialen Rattentumor abgeleitete C6-Zellen, ATCC CCL-107 wurden jeweils in RMPI1640-Medium (pH 7,2) suspendiert, um eine Zelldichte von 1 × 106 Zellen/ml oder 2 × 105 Zellen/ml zu ergeben. Zu der Mikroplatte enthaltend eine ein Milliliter Verdünnung von 20, 10 oder 5,0 &mgr;g/ml der Verbindung 1 wurde ein Milliliter pro Schacht von jeder der obigen Zellsuspensionen zugegeben und diese als Testsysteme verwendet. Alle Testsysteme wurden doppelt durchgeführt und jeweils einer 24 bzw. 48 stündigen Inkubation in einem 5 Vol.-% CO2-Inkubator bei 37°C unterworfen. Ein an Verbindung 1 freies System wurde bereitgestellt und gleichermaßen wie zuvor behandelt und als Kontrolle verwendet.

Gemäß dem Verfahren von I. Nicoletti et al. in Journal of Immunological Methods, Bd. 139, S. 271 – 279 (1991) wurden die apoptoseinduzierenden Zellen in den Testsystemen und der Kontrolle durch Propidiumiodid gefärbt und bezüglich deren Prozentsatz an gefärbten Zellen zu den gesamten Zellen in einer Weise bestimmt, dass jede der Kulturen in Polypropylengefäße transferiert, die Gefäße zentrifugiert, die resultierenden Überstände entfernt, die Zell-Sedimente mit phosphatgepufferter Salzlösung enthaltend 0,3 Vol.-% Kälberserumalbumin gewaschen und die gewaschenen Zellen des weiteren zentrifugiert, um Überstände zu entfernen, wurden. Die neu gebildeten Sedimente wurden jeweils mit 50 &mgr;g/ml, von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA kommerziell vertriebenem Propidiumiodid, 0,1 Gew.-% Natriumcitrat und 0,1 Gew.-% "TRITON X-100", einem vom Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, USA kommerziell vertriebenen Tensid, in Volumen von jeweils 1,5 ml vermischt, um die Zellen durch Propidiumiodid zu färben. Die gefärbten Zellen wurden bei 4°C über Nacht im Dunkeln gelagert. Die gefärbten Zellen jedes Testsystems wurden auf "EPICS PROFILE II", einer von Beckman Coulter, Inc., CA, USA kommerziell vertriebenen Flusszytometrie, analysiert. Basierend auf den Daten wurde der Prozentsatz der gefärbten Zellen zu den gesamten Zellen in jedem Testsystem bezüglich Apoptosehäufigkeit gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 wiedergegeben.

Tabelle 12

Wie in Tabelle 12 gezeigt steigt die Apoptosehäufigkeit in jeder Zelllinie abhängig von der Dosis des vorliegenden biologisch aktiven Extraktes an. Insbesondere der Unterschied zwischen jeder der Testproben und der Kontrolle zeigten einen maximalen Pegel bei einer Dosis von 10 &mgr;g/ml bei jedem Extrakt. Der vorliegende biologisch aktive Extrakt förderte die Apoptoseinduktion von aus Lymphomen abgeleiteten U-937 Zellen und aus glialem Tumor abgeleiteten C6-Zellen unter den Zelllinien höchst bemerkenswert. Die Tumorigenese der Zellen soll auftreten, weil die Apoptose nicht durch einige Faktoren induziert wird. In diesem Versuch indiziert die Tatsache, dass eine bemerkenswerte Apoptose in den Zellen, welche in der Gegenwart des vorliegenden physiologisch aktiven Extraktes kultiviert wurden, beobachtet wird, dass der Extrakt eine die Apoptose der lebenden Zellen bei den normalen Bedingungen kontrollierende Wirkung aufweist. Obwohl die Daten nicht gezeigt sind, werden dieselben Daten gleichermaßen wie für Verbindung 1 erhalten, wenn die durch die Verfahren in den Versuchen 1 und 2, ausgenommen Verbindung 1, erhaltenen physiologisch aktiven Extrakte gemäß dem obigen Verfahren getestet werden.

Versuch 15 Die Produktion von Zytokinen kontrollierende Wirkung

Verbindung 7 aus Versuch 2 wurde in DMSO gelöst, um eine Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter zu ergeben, mit RPMI1640-Medium (pH 7,2) ergänzt mit 10 Vol.-% fötalem Kälberserum (nachfolgend in Versuch 15 als "Serummedium" bezeichnet) verdünnt, um eine Konzentration von 50 ng/ml zu ergeben und weiter in Serie mit dem Serummedium verdünnt.

HBL-38 Zellen als immunokompetente Zellen wurden bis zu einer vorgeschriebenen Zelldichte proliferiert, kultiviert. Nach dem Kultivieren wurden die gewucherten HBL-38 Zellen drei mal mit RPMI1640-Medium (pH 7,2) (nachfolgend in Versuch 15 als "serumfreies Medium" bezeichnet) durch Zentrifugation gewaschen und eingestellt, um eine Zelldichte von 1 × 108 Zellen/ml unter Verwendung des serumfreien Mediums zu ergeben. Zu einem Milliliter der Zellsuspension wurden 4,5 ml des serumfreien Mediums und 0,5 ml einer durch Auflösen von durch Godo Shusei, Co., Ltd., Tokio, Japan kommerziell vertriebenen Dispase in physiologischer Salzlösung, um eine Konzentration von 10.000 Einheiten/ml zu ergeben, präparierten dispersen Lösung zugegeben und die Mischung wurde bei 37°C für 90 Minuten unter schüttelnden Bedingungen inkubiert. Daran anschließend wurden die HBL-38 Zellen drei mal mit dem Serummedium durch Zentrifugation gewaschen und mit dem Serummedium zu einer Zellsuspension mit einer Zelldichte von 1 × 106 Zellen/ml vermischt.

Fünfzig Mikromilliliter von jeder der obigen Verdünnungen der Verbindung 7, 150 &mgr;l der obigen Zellsuspension von HBL-38 Zellen behandelt mit Disperse sowie 50 &mgr;l an serumfreiem Medium enthaltend 5 &mgr;g/ml Lipopolysaccharid (LPS) wurden zu jedem Schacht einer Mikroplatte zugefügt und die Zellen wurden bei 37°C für 24 Stunden in einem 5 Vol.-% CO2-Inkubator inkubiert und als Testgruppe eingesetzt. Parallel dazu wurde als eine Negativkontrolle ein System mit einem serumfreien Medium anstelle des serumfreien Mediums enthaltend LPS in der Testgruppe sowie als eine positive Gruppe ein System mit einem Serummedium anstelle der Verdünnungen der Verbindung 7 in der Testgruppe bereitgestellt und gleichermaßen wie in der Testgruppe behandelt. Nach 24-Stunden-Inkubation wurden 50 &mgr;l-Teilmengen des Überstandes aus jedem Schacht gesammelt. Die gesammelten Überstände wurden jeweils einem herkömmlichen Enzym-Immunoassay unter Verwendung von Gg23-901-530, erhalten von dem National Institute of Health, Bethesda, MD, USA, als einem Standard für humanes Interferon-&ggr; unterworfen und bezüglich der Interferon-&ggr;-Produktion in jedem System quantifiziert. Die Zellen in jedem Schacht, aus denen die Überstände entfernt wurden, wurden mit 50 &mgr;l-Teilmengen 3N-Thymidinlösung einer Strahlungsintensität von 5 &mgr;Ci/ml in Serummedium vermischt und bei 37°C für 8 Stunden in einem 5 Vol.-% CO2-Inkubator inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen in jedem Schacht der Mikroplatte mit einem Glasfilter gesammelt, bezüglich deren Strahlungsintensität durch den von Packard Instruments Co., CT, USA kommerziell vertriebenen &bgr;-Strahlendetektor "DIRECT &bgr;-COUNTER MATRIX 96" vermessen und bezüglich der 3N-Thymidin-Aufnahme durch die Zellen in jedem Schacht untersucht. Die Resultate sind in Tabelle 13 wiedergegeben. In Tabelle 13 ist der Grad an 3H-Thymidin-Aufnahme mit einem relativen Wert (%) zu der positiven Kontrolle ausgedrückt.

Tabelle 13

Wie in Tabelle 13 gezeigt induzierte LPS die Interferon-&ggr;-Produktion durch HBL-38 Zellen und Verbindung 7 als der vorliegende physiologisch aktive Extrakt inhibierte die Interferon-&ggr;-Produktion dosisabhängig. Unter der Konzentration von wenigstens 1,25 ng/ml der Verbindung 7 inhibierte diese die Interferon-&ggr;-Produktion zu demselben oder einem geringeren Wert als demjenigen der an LPS freien Negativkontrolle. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Kontroll- und Testgruppen bezüglich des Grades an 3H-Thymidin-Aufnahme durch HBL-38 Zellen gefunden. Die Ergebnisse indizieren, dass der vorliegende physiologisch aktive Extrakt die Wucherung der immunokompetenten Zellen nicht beeinflusst und die Interferon-&ggr;-Produktion durch die durch Fremdsubstanzen für lebende Körper, wie bspw. LPS, induzierten Zellen stark inhibiert. Anstelle der HBL-38 Zellen wurden Maus-Milz-Zellen aus immunokompetenten Zellen auf gewöhnliche Weise hergestellt und gleichermaßen wie zuvor behandelt, um die Produktion an Interleukin-10 zusätzlich zu der Interferon-&ggr;-Produktion zu untersuchen. Als ein Ergebnis wurde beobachtet, dass der vorliegende physiologisch aktive Extrakt die Interferon-&ggr;-Produktion inhibiert und die Interleukin-10-Produktion verstärkt.

Es wird gesagt, dass T-Helferzellen in dem in vivo Immunsystem aus einer Zellgruppe umfassend Th1 und Th2 zusammengesetzt sind, und die Balance zwischen Th1 und Th2 die Expression an immunen Funktionen stark beeinflusst. Beispielsweise Krankheiten, wie Immunkrankheiten einschließlich Autoimmun- und Entzündungskrankheiten, können induziert werden, wenn die Balance außerhalb der normalen Bedingungen für jeden lebenden Körper unter Verursachung von Th1-vorherrschenden Bedingungen in dem Körper ist. Wie oben untersucht ist von Interferon-&ggr; und Interleukin-10 bekannt, dass das erstgenannte Zytokin die Balance zu den Th1-vorherrschenden Bedingungen kontrolliert, während das letztgenannte Zytokin die Balance inhibiert, um nicht zu den Th1-vorherrschenden Bedingungen zu neigen. Diese experimentellen Daten indizieren, dass der vorliegende physiologisch aktive Extrakt eine die Produktion von Zytokinen durch immunokompetente Zellen kontrollierende Wirkung aufweist, um die in vivo Balance zu den normalen Bedingen zu kontrollieren, und durch die Abnormalität in der Balance induzierte Krankheiten effektiv behandelt/vorbeugt. Da Interferon-&ggr; als ein entzündendes Enzym bekannt ist, indizieren die obigen Daten ebenfalls, dass der vorliegende physiologisch aktive Extrakt als ein Inhibitor für die Produktion solcher Zytokine geeignet sein kann. Obgleich die Daten nicht gezeigt sind, wurde bestätigt, dass die vorliegenden physiologisch aktiven Extrakte in den Versuchen 1 und 2 eine ähnliche Wirkung wie Verbindung 7 ausüben, obwohl die Aktivitäten sich unterschieden.

Die Ergebnisse in den Versuchen 1 bis 15 zeigen, dass die vorliegenden physiologisch aktiven Extrakte als die ethylacetatlöslichen Bestandteile erhalten durch das Verfahren in Versuch 1, d.h. 6,12-Dihydro-6,12-dioxoindolo[2,1-b]quinazolin; 3,5,4'-Trihydroxy-6,7-methylendioxyflavon; Kaempferol; 3,5,7,4'-Tetrahydroxy-6-methoxyflavon; Gallussäure; Kaffeesäure; 3-(1,3-Dihydro-3-oxo-2H-indol-2-yliden)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on; [3S-(3&agr;,4&bgr;,21&bgr;)]9-ethyl-14-Ehyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropansäure und [3S-(3&agr;,4&bgr;,21&bgr;)]9-Ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropansäuremethylester, eine Vielzahl an physiologischen Wirkungen einschließlich antiviralen, antitumoralen, radikalfangenden und apoptosekontrollierenden Wirkungen sowie zytokinproduktionskontrollierenden oder -inhibierenden Wirkungen ausüben.

Versuch 16 Akuter Toxizitätstest

Gemäß einer üblichen Weise resultierten die oralen, intravenösen und intraperitonealen Verabreichungen der durch die Verfahren in den Versuchen 1 und 2 erhaltenen physiologisch aktiven Extrakte in 5 Wochen alten ddy-Mäusen in einem LD50 von über einem g/kg Körpergewicht unabhängig von deren Darreichungsrouten. Die Daten zeigen, dass die vorliegenden physiologisch aktiven Extrakte mit geringeren Nebeneffekten sicher an Säugetiere und Menschen verabreichbar sind.

Die bevorzugten Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung werden unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele beschrieben:

Beispiel 1 Physiologisch aktiver Rohextrakt

Dreißig Kilogramm eines Luftteils einer in Aki-City, Shimane-Präfektur, Japan gewachsenen Indigo-Pflanze wurden im Juli gesammelt, pulverisiert und 3 mal wiederholt bei Umgebungstemperatur mit 30 – 60 l Ethylacetat für jede Extraktion extrahiert. Die resultierenden Extrakte wurden vereinigt und mit einem Filterpapier filtriert und das Filtrat wurde gesammelt, einer Verdampfung zum Entfernen von Ethylacetat unterworfen und zu 168 g Extrakt enthaltend ethylacetatlösliche Bestandteile aus der Indigo-Pflanze getrocknet.

Der Extrakt mit einer Vielzahl an physiologischen Wirkungen ist als ein in Kosmetika und Pharmazeutika einsetzbares Roharzneimittel nützlich.

Beispiel 2 Aufgereinigter physiologisch aktiver Extrakt

Ein durch das Verfahren in Beispiel 1 erhaltener Extrakt wurde in 50 Vol.-% wässriger Methanollösung suspendiert und zu 8 Teilmengen aufgeteilt, welche dann getrennt auf eine mit 1.700 ml "FS-1830", einem von Japan Organo Co., Ltd., Tokio, Japan kommerziell vertriebenen Gel für Adsorptionschromatographie, gepackte Säule aufgegeben und dieser sukzessive 60, 70, 80 und 90 Vol.-% wässrige Methanollösungen, Methanol und Ethylacetat in einer gleichen Menge zu dem Gelvolumen zugegeben. Das Eluat wurde nach jedem, bezogen auf das Gelvolumen, halben Volumen fraktioniert. Die von der Säule mit 80 Vol.-% wässriger Methanollösung eluierten früheren und späteren Fraktionen, Fraktion 2 bzw. Fraktion 1; die von der Säule mit 60 Vol.-% wässriger Methanollösung eluierte spätere Fraktion, Fraktion 3, sowie die letztere mit 90 Vol.-% wässriger Methanollösung von der Säule eluierte Fraktion, Fraktion 4, wurden separat gesammelt, verdampft, um Lösungsmittel zu entfernen, sowie zu festen Produkten getrocknet.

2,6 g der 5,2 g des festen Produktes aus Fraktion 1 wurden in 30 ml Methanol suspendiert und durch Saugkraft filtriert, um in einen löslichen Teil und einen unlöslichen Teil (876 mg) getrennt zu werden. Die Lösung des löslichen Teils wurde auf eine mit 1.350 ml Silicagel gepackte Säule aufgegeben und dieser ein linearer Gradient einer, sich schrittweise von 5 Vol.-% auf 100 Vol.-% Methanol erhöhenden Lösungsmischung aus Chloroform und Methanol aufgegeben, gefolgt vom Sammeln des Eluates in 450 ml Fraktionen. Fraktion 4 wurde verdampft, um Lösungsmittel zu entfernen, und das resultierende feste Produkt wurde in 2 ml Methanol suspendiert und durch Filtrieren unter saugenden Bedingungen gewaschen, um ein 19,4 mg Kristall von 6,12-Dihydro-6,12-dioxoindolo[2,1-b]quinazolin zu erhalten. Die unlösliche Fraktion wurde in einer angemessenen Menge Methanol gelöst und dieser erlaubt, bei Umgebungstemperaturen stehen zu bleiben, um einen 278 mg gelben, nadelartigen Kristall von 3,5,4'-Trihydroxy-6,7-methylendioxyflavon zu erhalten.

10,7 g des festen Produktes aus Fraktion 2 wurde in 40 ml Methanol gelöst und die Lösung wurde auf eine mit 1.520 ml "SEPHADEX LH-20", einem von Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden kommerziell vertriebenen Gel für Adsorptionschromatographie, gepackte Säule aufgegeben, gefolgt vom Sammeln des Eluats in 190 ml Fraktionen. Die 15. bzw. 18. Fraktion wurden verdampft, um Lösungsmittel zu entfernen, und zu festen Produkten getrocknet. Vierhundert Milligramm der aus der 18. Fraktion erhaltenen festen Zusammensetzung wurden mit ungefähr 210 ml einer Lösungsmischung aus Methanol und Wasser (= 5 : 2 pro Volumen) vermischt und komplett darin gelöst. Die Lösung wurde mit einem 0,22 &mgr;m Membranfilter filtriert und dieser erlaubt, bei Umgebungstemperatur für 3 Tage stehen zu bleiben, um die Bildung eines Kristalls zu finden. Unter Verwendung von konventionellem Filterpapier wurde der Kristall gesammelt, um ein 89,3 mg Kaempferol-Kristall zu erhalten. Fünfhundert Milligramm des festen Produktes aus der 15. Fraktion wurden in 10 ml Methanol suspendiert und filtriert, um unlösliche Substanzen zu sammeln. Dann wurden die unlöslichen Substanzen mit 250 ml Methanol vermischt und komplett darin gelöst. Die Lösung wurde mit einem 0,22 &mgr;m Membranfilter filtriert und dieser erlaubt, bei Umgebungstemperatur für 7 Tage stehen zu bleiben, um einen Kristall zu finden. Das Kristall wurde mit einem konventionellen Filterpapier gesammelt, um einen 252,3 mg Kristall von 3,5,7,4'-Tetrahydroxy-6-methoxyflavon zu erhalten.

11,8 g des festen Produktes aus Fraktion 3 wurde in 40 ml Methanol gelöst und die Lösung wurde auf eine mit 1.680 ml "SEPHADEX LH-20", einem vom Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Schweden kommerziell vertriebenen Gel für Adsorptionschromatographie, gepackte Säule aufgegeben, gefolgt vom Sammeln des Eluats in 560 ml Fraktionen. Die 4. Fraktion wurde verdampft, um das Lösungsmittel zu entfernen, und zu einem festen Produkt getrocknet. Dann wurde das feste Produkt in ungefähr 10 ml Methanol gelöst und die Lösung wurde auf eine mit 480 ml "FS-1830", einem von Japan Organo Co., Ltd., Tokio, Japan kommerziell vertriebenen Gel für Adsorptionschromatographie, gepackte Säule aufgegeben, auf diese sukzessive 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 und 70 vol.-%-ige wässrige Methanollösungen in entsprechenden Volumen von 480 ml aufgegeben und weiter 960 ml Methanol aufgegeben. Das Eluat wurde zu 240 ml Fraktionen fraktioniert und die 5. Fraktion wurde verdampft, um das Lösungsmittel zu entfernen, und zu 150 mg festem Produkt getrocknet. Dann wurde das feste Produkt in 300 ml Ethylacetat gelöst und die Lösung wurde mit einem 0,22 &mgr;m Membranfilter filtriert und dieser erlaubt, bei Umgebungstemperatur für 7 Tage stehen zu bleiben, um die Bildung eines Kristalls zu finden. Der Kristall wurde unter Verwendung eines konventionellen Filterpapiers gesammelt, um einen 18,7 mg Gallussäure-Kristall zu erhalten. Die von der Säule mit "FS-1830" eluierte 9. Fraktion wurde verdampft, um das Lösungsmittel zu entfernen, und zu 500 mg festem Produkt getrocknet. Das feste Produkt wurde in 0,5 ml Ethylacetat gelöst und die Lösung wurde auf eine mit 40 ml "SILICALGEL 60K650", einem von Katayama Chemical Industries Co., Ltd., Tokio, Japan kommerziell vertriebenen Gel für Adsorptionschromatographie, gepackte Säule aufgegeben und dieser sukzessive 40 ml Teilmengen der Lösungsmischungen von Ethylacetat und Chloroform (= 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 und 9:1 pro Volumen), Chloroform und Ethanol zugegeben. Das Eluat von der Säule wurde in 10 ml Fraktionen fraktioniert und die 17. und 21. Fraktion wurden vereinigt und einer Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von "SILICAGEL 60F254 (Produkt Nr. 5717)", einer von Merck & Co., Inc., NJ, USA kommerziell vertriebenen trennenden Dünnschicht, als eine Dünnschichtplatte unterworfen, und eine Lösungsmischung von Toluol, Ethylacetat und Essigsäure (= 5:5:1 pro Volumen) als ein Entwicklersystem zugegeben. Nach der Entwicklung wurde ein Teil des Silicagels an der Position mit einem Rf-Wert von ungefähr 0,6 abgekratzt und mit einer angemessenen Menge Methanol extrahiert, um eine entwickelte Verbindung zu erhalten. Das Lösungsmittel wurde durch einen Verdampfer aus dem Extrakt entfernt und dieser zu einem 15,4 mg Kaffeesäure- Kristall getrocknet.

Vier Gramm der 4,6 g des festen Produktes aus Fraktion 4 wurden mit 40 ml Methanol vermischt und diesem erlaubt, darin zu lösen, aber das feste Produkt sedimentierte teilweise ohne zu lösen. Das Sediment wurde gesammelt, ausreichend in 800 ml Methanol gelöst und diesem erlaubt, bei Umgebungstemperatur für 2 Tage stehen zu bleiben, um einen kristallisierten, roten Rohkristall zu finden. Der Rohkristall wurde gesammelt und dem verbleibenden Überstand wurde erlaubt, gleichermaßen wie zuvor stehen zu bleiben, um erneut einen kristallisierten roten Rohkristall zu finden. Der so erhaltene Rohkristall wurde gesammelt und mit dem zuvor erhaltenen roten Rohkristall vereinigt und die Mischung wurde mit einer angemessenen Menge Methanol gewaschen und in einer ausreichenden Menge Methanol gelöst. Die resultierende Lösung wurde membranfiltriert und das Filtrat wurde verdampft, um das Lösungsmittel zu entfernen, und zu einem 44,5 mg Kristall von 3-(1,3-Dihydro-3-oxo-2H-indol-2-yliden)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on getrocknet.

Diese Verbindungen mit einer Vielzahl an physiologischen Wirkungen sind als Roharzneimittel für Kosmetika und Pharmazeutika, welche einen relativ hochreinen Bestandteil benötigen, geeignet.

Beispiel 3 Physiologisch aktiver Rohextrakt

Fünfzehn Kilogramm eines Luftteils einer in Aki-City, Shimane-Präfektur, Japan, gewachsenen Indigo-Pflanze wurden im Juli gesammelt, pulverisiert und drei mal wiederholt bei Raumtemperatur mit 30 l Ethanol für jede Extraktion extrahiert. Die resultierenden Extrakte wurden vereinigt und mit einem Filterpapier filtriert und das Filtrat wurde gesammelt, einer Verdampfung zum Entfernen von Ethanol unterworfen und zu 560 g Extrakt enthaltend ethylacetatlösliche Bestandteile aus der Indigo-Pflanze getrocknet. Unter Verwendung der durch das Verfahren in Beispiel 2 erhaltenen Verbindung als eine Standardprobe wurde der obige physiologisch aktive Extrakt mit konventioneller Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder Gaschromatographie analysiert und gezeigt, dass der Extrakt als ethylacetatlösliche Bestandteile 6,12-Dihydro-6,1,2-dioxoindolo[2,1-b]quinazolin; 3,5,4'-Trihydroxy-6,7-methylendioxyflavon; Kaempferol; 3,5,7,4'-Tetrahydroxy-6-methoxyflavon; Gallussäure, Kaffeesäure, 3-(1,3-Dihydro-3-oxo-2H-indol-2-yliden)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on, [3S-(3&agr;,4&bgr;, 21&bgr;)]9-Ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropansäure und [3S-(3&agr;,4&bgr;,21&bgr;)]9-Ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropansäuremethylester in entsprechenden Mengen von 65, 780, 354, 988, 250, 230, 75, 52 und 63 mg enthielt.

Das Produkt mit einer Vielzahl an physiologischen Wirkungen ist als ein in Lebensmitteln, Kosmetika und Pharmazeutika eingesetztes Roharzneimittel geeignet.

Beispiel 4 Erfrischung

Gemäß einer üblichen Art wurden Kartoffeln, deren reduzierende Zucker durch Lagerung bei 20°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 85 % für zwei Wochen selbst assimiliert wurden, mit Wasser gewaschen, geschält, klassifiziert und mit einer zentrifugalen Schneidemaschine in ungefähr 1,5 mm dicke Scheiben geschnitten. Die Scheiben wurden mit Wasser gewaschen, um Stärke auf deren Oberfläche zu entfernen, entwässert, für ungefähr 5 Minuten bei 170°C in Öl gebraten und von überschüssigem Öl befreit. Unter Verwendung eines Salzsieders wurden die gebratenen Scheiben mit einem pulverförmigen Würzmittel enthaltend 6 Gewichtsteile Salz, 3 Gewichtsteile "TREHAOSE®", einem als Lebensmittel eingestuften Trehalosepulver mit einer Trehalosereinheit von wenigstens 98 %, kommerziell vertrieben von Hayashibara Shoji, Inc., Okayama, Japan, ein Gewichtsteil eines durch das Verfahren in Beispiel 3 erhaltenen physiologisch aktiven Extrakts und einer angemessenen Menge an Gewürzen, homogen besprüht. Die resultierenden Scheiben wurden zu einer Wiegemaschine transferiert, injiziert und zu einer Erfrischung verpackt.

Das Produkt mit einem befriedigenden Aroma und Geschmack kann willkürlich als ein Gesundheitslebensmittel zum Aufrechterhalten/Fördern der Gesundheit eingesetzt werden.

Beispiel 5 Teebeutel

Neun Gewichtsteile eines gefriergetrockneten Teeextraktes wurden in einer angemessenen Menge Wasser gelöst und die Lösung wurde mit einem Gewichtsteil eines physiologisch aktiven Extraktes, welcher durch das Verfahren in Beispiel 3 erhalten wurde, vermischt und in Ethanol gelöst. Die Mischung wurde über 90 Gewichtsteile Teeblätter, welche in gewöhnlicher Weise fermentiert und getrocknet wurden, gesprüht. Daran anschließend wurden die Blätter gesiebt, geschnitten, zum Fertigstellen getrocknet, diesen erlaubt, durch einen Separator Verunreinigungen abzutrennen, und mit einem japanischen Papier mit zwei Gramm pro Portion in einen Teebeutel gepackt.

Zum Trinken wird das Produkt in 180 ml kaltem Wasser für ungefähr 10 Minuten oder in 180 ml auf 90 – 100°C erhitztem heißem Wasser für ungefähr 2 Minuten eingeweicht. Das Produkt mit einem befriedigenden Aroma und Geschmack kann willkürlich als Lebensmittelprodukt zur Aufrechterhaltung/Förderung der Gesundheit eingesetzt werden.

Beispiel 6 Ergänzendes Gesundheitslebensmittel

Zweiundfünfzig Gewichtsteile "TREHAOSE°", ein als Lebensmittel eingestuftes Trehalosepulver mit einer Trehalosereinheit von wenigsten 98 %, kommerziell vertrieben von Hayashibara Shoji, Inc., Okayama, Japan, 40 Gewichtsteile Maisstärke, 3,5 Gewichtsteile eines durch das Verfahren in Beispiel 3 erhaltenen physiologisch aktiven Extraktes sowie 2,5 Gewichtsteile eines Zellulosekristalls wurden vermischt. Die Mischung wurde in einer gewöhnlichen Weise mit Wasser durch Auftropfen von Wasser darauf geknetet, einem Wirbelschicht-Granulationsverfahren unterzogen, pulverisiert und nach Größe sortiert, um ein Pulver zum Tablettieren zu erhalten. Das Pulver wurde bis zur Homogenität mit 2 Gewichtsteilen Sucrosefettsäureester vermischt und die Mischung wurde mit einer Tablettiermaschine mit einem Senkdorn mit 11 mm Durchmesser zu jeweils 300 mg Tabletten tablettiert.

Das Produkt ist leicht schluckbar und zerfällt befriedigend in den Trakte und kann willkürlich als ein Gesundheitslebensmittel zum Aufrechterhalten/Fördern der Gesundheit eingesetzt werden.

Beispiel 7 Haarspüler

Ein Gewichtsteil "TREHAOSE®", ein als Lebensmittel eingestuftes Trehalosepulver mit einer Trehalosereinheit von wenigstens 98 %, kommerziell vertrieben von Hayashibara Shoji, Inc., Okayama, Japan, zwei Gewichtsteile eines durch das Verfahren in Beispiel 1 erhaltenen physiologisch aktiven Extraktes, zwei Gewichtsteile "&agr;G RUTIN", ein von Toyo Sugar Refining Co., Ltd., Tokio, Japan kommerziell vertriebenes &agr;-Glucosylrutin, zwei Gewichtsteile Distearylmethylammoniumchlorid, zwei Gewichtsteile Cetanol, zwei Gewichtsteile Silikonöl, ein Gewichtsteil Polyoxyethylenoleylalkoholether und eine angemessene Menge eines Aromas wurden durch Erhitzen gelöst. Die Lösung wurde unter rührenden Bedingungen mit einer Mischung von 3 Gewichtsteilen 1,3-Butylenglykol, 85 Gewichtsteilen aufgereinigtem Wasser und einer ausreichenden Menge Antiseptikum vermischt, gefolgt vom Kühlen der Mischung zu einer Haarspülung.

Das Produkt mit einer befriedigenden Stabilität und einer geringeren Stimulation der Kopfhaut kann willkürlich als ein Kosmetikum zum Aufrechterhalten/Fördern der Gesundheitsbedingungen der Kopfhaut und des Haares eingesetzt werden.

Beispiel 8 Milchlotion

0,5 Gewichtsteile Polyoxyethylenbehenylether, ein Gewichtsteil Polyoxyethylsorbitoltetraoleat, ein Gewichtsteil öllösliches Glycerinmonostearat, 0,5 Gewichtsteile Brenztraubensäure, 0,3 Gewichtsteile Behenylalkohol, 0,3 Gewichtsteile Maltitol, ein Gewichtsteil Avokadoöl, ein Gewichtsteil eines durch das Verfahren in Beispiel 1 erhaltenen physiologisch aktiven Extraktes sowie ausreichende Mengen an Vitamin E und ein Antiseptikum wurden in gewöhnlicher Weise durch Erhitzen gelöst. Die Lösung wurde mit einem Gewichtsteil Natrium-L-lactat, sieben Gewichtsteilen 1,3-Butylenglykol, 0,1 Gewichtsteilen Carboxyvinylpolymer und 86,3 Gewichtsteilen aufgereinigtem Wasser vermischt und die Mischung wurde mit einem Homogenisator zu einer Milchlotion emulgiert.

Das Produkt ist weniger klebrig und befriedigend ausdehnbar und kann willkürlich als ein Kosmetikum zum Aufrechterhalten/Fördern der Gesundheitsbedingungen der Haut eingesetzt werden.

Beispiel 9 Zahnpasta

Eine Zahnpasta wurde erhalten durch Vermischen von 45 Gewichtsteilen sekundärem Calciumphosphat, 2,9 Gewichtsteilen Pullulan, 1,5 Gewichtsteilen Natriumlaurylsulfat, 20 Gewichtsteilen Glycerin, 0,5 Gewichtsteilen Polyoxyethylensorbitanlaurat, 10 Gewichtsteilen Sorbitol, 7 Gewichtsteilen Maltitol, 13 Gewichtsteilen aufgereinigtem Wasser und 0,1 Gewichtsteilen eines durch das Verfahren in Beispiel 1 erhaltenen physiologisch aktiven Extraktes.

Das Produkt kann willkürlich als ein Kosmetikum zum Aufrechterhalten/Fördern der Gesundheitsbedingungen in der oralen Höhle eingesetzt werden.

Beispiel 10 Salbe

Ein Gewichtsteil Natriumacetat, Trihydrat, 4 Gewichtsteile DL-Calciumlactat, 10 Gewichtsteile Glycerin, 0,5 Gewichtsteile Pfefferminzöl, 49 Gewichtsteile Petrolatum, 10 Gewichtsteile japanisches Wachs, 10 Gewichtsteile Lanolin, 14,5 Gewichtsteile Sesamöl und 2 Gewichtsteile einer die, basierend auf den Prozentzahlen des Extraktes in Beispiel 1, 7 Arten der durch das Verfahren in Beispiel 2 erhaltenen Verbindungen 1 bis 7 als physiologisch aktive Extrakte enthaltenden Zusammensetzung wurden bis zur Homogenität zu einer Salbe vermischt.

Das Produkt mit einer befriedigenden Permeabilität und Ausdehnbarkeit kann willkürlich als ein Medikament zum Aufrechterhalten/Fördern der Gesundheitsbedingungen der Haut eingesetzt werden.

[Effekt der Erfindung]

Wie oben beschrieben wurde die vorliegende Erfindung basierend auf der Erkenntnis, dass ethylacetatlösliche Bestandteile aus einer rohen Indigo-Pflanze eine Vielzahl an physiologischen Wirkungen auf Säugetiere und Menschen ausüben, gemacht. Wenn Säugetieren und Menschen verabreicht, üben die obigen Bestandteile physiologische Wirkungen einschließlich antiseptische, antivirale, antitumorale, radikalfangende, apoptosekontrollierende, zytokinproduktionkontrollierende, zytokinproduktionsinhibierende und die Expression von synthetischen Stickstoffmonoxid-Enzymen inhibierende Wirkungen aus. Folglich kann der vorliegende physiologisch aktive Extrakt enthaltend die ethylacetatlöslichen Bestandteile breit auf den Gebieten der Lebensmittel, Kosmetika und Pharmazeutika eingesetzt werden.

Herkömmliche, durch Trocknen unter der Sonne hergestellte Blätter und Samen von Indigo-Pflanzen werden nach Extraktion mit heißem Wasser eingesetzt; substantiell eingesetzt werden die wasserlöslichen Bestandteile der Indigo-Pflanzen. Unter diesen Bestandteil sind Indol-Verbindungen chemischen Veränderungen, wie bspw. Hydrolyse und Luftoxidation während des Trocknens unter der Sonne, gegenüber empfänglich und können möglicherweise verschlechtert werden. Die physiologisch aktive Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Einsatz von ethylacetatlöslichen Bestandteilen aus rohen Indigo-Pflanzen ohne Trocknen der Pflanze unter der Sonne präpariert werden; die vorliegende Erfindung ermöglicht den Einsatz der intakten, physiologisch effektiven Bestandteile in einer lebenden Indigo-Pflanze zu jeder Zeit und an jedem Ort, d. h. selbst dann, wenn diese Orte weit von den die Indigo-Pflanzen produzierenden Distrikten entfernt sind. Der vorliegende physiologisch aktive Extrakt mit einer solchen Nützlichkeit kann in einer gewünschten Menge durch das vorliegende Verfahren unter Einsatz einer rohen Indigo-Pflanzen als ein Material hergestellt werden.

Die vorliegende Erfindung mit diesen nützlichen Effekten ist eine bedeutsame Erfindung, welche zu diesem Feld stark beitragen wird.


Anspruch[de]
  1. Ein physiologisch aktiver Extrakt, enthaltend als aktiven Bestandteil mehr als einen ethylacetatlöslichen Bestandteil extrahiert aus einer rohen Indigo-Pflanze mit Ethylacetat, wobei der Bestandteil aus der aus 6,12-Dihydro-6,12-dioxoindolo[2,1-b]chinazolin, 3,5,4'-Trihydroxy-6,7-methylendioxyflavon; Kaempferol, 3,5,7,4'-Tetrahydroxy-6-methoxyflavon, Gallussäure, Kaffeesäure, 3-(1,3-Dihydro-3-oxo-2H-indol-2-yliden)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on, [3S-(3&agr;, 4&bgr;, 21&bgr;)]9-ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropionsäure und [3S-(3&agr;, 4&bgr;, 21&bgr;)]9-ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropionsäuremethylester bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und wobei der Extrakt den ethylacetatlöslichen Bestandteil in einer Menge von wenigstens 0,01 %, bezogen auf die trockene Feststoffbasis, enthält.
  2. Extrakt nach Anspruch 1, wobei die Indigo-Pflanze ein Teil oder das Ganze eines frischen Luftteils der Indigo-Pflanze ist.
  3. Verfahren zur Herstellung eines Extrakts nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, umfassend die Schritte des Einweichens einer rohen Indigo-Pflanze in Ethylacetat, um ethylacetatlösliche Bestandteile der Indigo-Pflanze ausgewählt aus der 6,12-Dihydro-6,12-dioxoindolo[2,1-b]chinazolin, 3,5,4'-Trihydroxy-6,7-methylendioxyflavon; Kaempferol, 3,5,7,4'-Tetrahydroxy-6-methoxyflavon, Gallussäure, Kaffeesäure, 3-(1,3-Dihydro-3-oxo-2H-indol-2-yliden)-1,3-dihydro-2H-indol-2-on, [3S-(3&agr;, 4&bgr;, 21&bgr;)]9-ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropionsäure und [3S-(3&agr;, 4&bgr;, 21&bgr;)]9-ethyl-14-ethyl-21-(methoxycarbonyl)-4,8,13,18-tetramethyl-20-oxo-3-phorbinpropionsäuremethylester bestehenden Gruppe zu extrahieren, sowie Sammeln des Extrakts.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Indigo-Pflanze ein Teil oder das Ganze eines frischen Luftteils der Indigo-Pflanze ist.
  5. Physiologisch aktive Zusammensetzung umfassend einen Extrakt nach Anspruch 1 oder Anspruch 2.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5 des weiteren enthaltend einen anderen Bestandteil zur leichten Aufnahme des Extrakts.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, welche den ethylacetatlöslichen Bestandteil in einer Menge von wenigstens 0,005 %, bezogen auf die trockene Feststoffbasis, enthält.
  8. Verwendung eines Extrakts gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 oder einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 für ein Nahrungsmittelprodukt oder Kosmetik.
  9. Extrakt gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 oder eine Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Verwendung in der Medizin.
  10. Verwendung eines Extrakts gemäß Anspruch 1 oder 2 oder einer Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels aktiv als Antiseptikum, antivirales Agens, Cytostatikum, radikalfangendes Agens, Apoptose kontrollierendes Agens, Agens zum Kontrollieren oder Inhibieren der Produktion von Zytokinen, Agens zum Inhibieren der Expression von synthetischen Stickstoffmonoxid-Enzymen, Agens für neovaskuläre Inhibition oder Agens zum Verbessern von Schlafstörungen.
Es folgen 3 Blatt Zeichnungen






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