Die vorliegende Erfindung betrifft Steroid-Verbindungen mit einem zusätzlichen Ring E, der mit dem Ring D des Steroidskeletts verbunden ist, die östrogene Aktivität aufweisen.

Es besteht weiterhin ein Interesse an neuen Verbindungen mit einer Affinität für den Östrogen-Rezeptor. Dies rührt von der Entdeckung von zwei distinkten Untertypen von Rezeptoren, die als ER&agr; und ER&bgr; bezeichnet werden (siehe sowohl Mosselman et al., FEBS Letters 392 (1996) 49–53 als auch EP-A-O 798 378). Verbindungen, die für solche Untertypen von Rezeptoren selektiv sind, ermöglichen es, ein selektivere Östrogen-Rezeptor bezogene Behandlung anzugeben. Vorteile können beispielsweise durch die unterschiedliche Verteilung von Rezeptor-Untertypen in menschlichem Gewebe erhalten werden. Dies ermöglicht Behandlungen mit einer geringeren Last an Östrogen-bezogenen Nebenwirkungen. Beispiele von Östrogen-bezogenen medizinischen Behandlungen, die aus selektiven Verbindungen Vorteile ziehen können, sind diejenigen für die Empfängnisverhütung, für die Therapie von menopausalen Beschwerden, Osteoporose, und Östrogen abhängiger Tumorkontrolle.

In der EP 0 869 132 sind östrogene Steroid-Verbindungen beschrieben, die die Formel (I) besitzen:

• wobei:
• – gestrichelte Bindungen optionale Doppelbindungen darstellen;
• – R₆ H, =CH₂, oder -CH₃, oder -CH₂-CH₃ ist;
• – R₇ H, C_1-4-Alkyl, C_2-5-Alkenyl oder C_2-5-Alkynyl ist, wobei die Alkyl-, Alkenyl- oder Alkynylgruppe mit 1 bis 3 Halogenatomen substituiert werden kann, die unabhängig aus der Gruppe aus Fluor- oder Chlor-Atomen gewählt werden können;
• – R₁₁ H, C_1-4-Alkyl, C_2-4-Alkenyl, C_2-4-Alkynyl oder C_1-4-Alkyliden ist, wobei die Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl- oder Alkyliden-Gruppe mit 1 bis 3 Halogenatomen substituiert werden kann, die unabhängig aus der Gruppe aus Fluor- oder Chlor-Atomen gewählt werden können;
• – E zusammen mit Kohlenstoffatomen 16 und 17 des Steroidskeletts einen vier- bis sieben-gliedrigen Ring darstellt, wobei der besagte Ring &agr; in cis-Konfiguration in Bezug auf das Steroidskelett ist, optional umfassend eine oder zwei endozyklische Bindungen und mit R_E substituiert, was verschiedene Bedeutungen haben kann.

Es ist weiterhin in EP 0 869 132 beschrieben, dass jegliche Alkyl-, Alkenyl-, Alkynyl- und Alkyliden-Gruppe in der Steroid-Verbindung mit der Formel (I) verzweigt oder unverzweigt sein kann. Falls R₆ oder R₁₁ mit dem Steroidskelett über eine Einzelbindung verbunden ist, umfasst das substituierte Kohlenstoffatom des Steroidskeletts entweder ein Wasserstoffatom oder ist in einer doppelten Kohlenstoff-Kohlenstoffbindung involviert. Verbindungen können unterschiedliche Chiralitätszentren enthalten und können als Enantiomere und Diastereomere bestehen. Hydroxy-Gruppen können mit Acyl- oder Alkyl-Substituenten gedeckelt sein, was zu Prodrugs einer Verbindung gemäss Formel I führt.

Es ist nun gefunden worden, dass eine Steroid-Verbindung, die die Formel I aufweist und deren Symbole und Terme die oben beschriebenen Bedeutungen aufweisen und die dadurch gekennzeichnet ist, dass R_E eine &bgr;-Hydroxy-Gruppe oder ein Prodrug davon ist, unerwarteterweise, eine konsistent bessere Selektivität für den Östrogen-Rezeptor &agr; kombiniert mit einer hohen Östrogen &agr; Potenz aufweist. Solch eine Verbindung, im Nachhinein als eine Verbindung gemäss der Erfindung bezeichnet, ist nicht nur sehr schwach aktiv auf dem Östrogen-Rezeptor &bgr;, sondern in der Tat im allgemeinen ein Antagonist zu dem Östrogen-Rezeptor &bgr;, was zu der sehr hohen Selektivität für den Östrogen-Rezeptor &agr; beiträgt und weiterhin eine selektive Behandlung basierend auf der Blockade des Östrogen-Rezeptors &bgr; gestattet. Die Verbindungen gemäss dieser Erfindung umfassen bereichsmässig die oben genannten Enantiomere und Diastereomere und jedes der individuellen (R) und (S) Enantiomere, im wesentlichen frei, das heisst verbunden mit weniger als 5%, vorzugsweise weniger als 2%, insbesondere weniger als 1% von dem anderen Enantiomer und Mischungen von solchen Enantiomeren in jeglichen Proportionen umfassend razemische Mischungen, die im wesentlichen gleiche Mengen der zwei Enantiomere umfassen.

Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung ist eine Steroid-Verbindung wie oben definiert und weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass R₆ H ist, R₇ ein verzweigter oder unverzweigter C_1-3-Alkyl ist, der Ring E ein fünf- oder sechsgliedriger Ring ohne Doppelbindungen ist, der ein Wasserstoff an der Position 22 in S-Stereokonfiguration aufweist, welche Konfiguration in anderen Worten &bgr; ist in Bezug auf das Steroidskelett gemäss der üblichen Bedeutung in der Steroid-Stereochemie-Nomenklatur.

Am meisten bevorzugt ist die Verbindung gemäss Formel II, was (7&agr;, 16&bgr;, 17&agr;, 22S)-7-Propyl-16,24-cyclo-19,21-dinorchola-1,3,5(10)-trien-3,17,22-triol ist, welche den Codenamen Org 41621 trägt:

Verbindungen gemäss der Erfindung vermögen daher eine direktere, mit anderen Worten selektive Modifikation der Aktivität von Östrogen &agr; oder &bgr; Rezeptoren in einem Organismus zu bewirken.

Ein Prodrug ist definiert als eine Verbindung, die in den Körper eines Rezipienten in eine Verbindung nach Formel I übergeht, wobei R_E eine &bgr;-Hydroxy-Gruppe ist. Um Prodrugs der Verbindungen gemäss der vorliegenden Erfindung herzustellen, werden die Hydroxy-Gruppen an der Position 3, 17 und auf dem Ring E gewandelt in Äther (alkyl*oxy) oder Ester wie acyl*oxy, Phosphat, Sulfat, Sulfonat oder aromatisches Carboxylat, wobei die Kohlenstoffkettenlänge von den Gruppen, die mit einem Asterisk (*) bezeichnet sind, nicht als scharf begrenzt anzusehen ist. Eine Acyl-Gruppe wird abgeleitet von einem linearen oder verzweigten Alkan* und ein aromatisches Carboxylat wird im allgemeinen ein Phenyl, Pyridinyl oder Pyrimidyl umfassen. Die Länge der Alkyl- und Acyl-Gruppen wird in Abhängigkeit von den erwünschten Eigenschaften der Prodrugs ausgewählt, wobei die längerkettigen Prodrugs mit beispielsweise Lauryl- oder Caproyl-Ketten für fortgesetzte Abgabe und Depotpräparationen geeigneter sind. Es ist bekannt, dass solche Substituenten spontan hydrolysieren oder enzymatisch hydrolysieren bis zu den freien Hydroxy-Substituenten auf dem Skelett der Verbindung. Solche Prodrugs werden eine biologische Aktivität entfalten vergleichbar zu den Verbindungen, in die sie in dem Körper der Rezipienten gewandelt werden. Die aktive Verbindung, zu der ein Prodrug gewandelt wird, wird die Eltern-Verbindung genannt. Das Einsetzen der Aktion und Dauer der Aktion als auch die Verteilung in dem Körper von einer Prodrug kann sich von solchen Eigenschaften der Eltern-Verbindung unterscheiden.

Sowohl für medizinische Therapien als auch für physiologische, medizinische und pharmakologische Experimente werden solche selektive Verbindungen, wie sie nun gefunden worden sind, verzweifelt benötigt. Es ist ein Aspekt der Erfindung, dass eine Verbindung der Erfindung für die Therapie durch Verabreichung der Verbindung an einen Rezipienten eingesetzt werden kann, welcher ein Mensch oder ein Tier sein kann, vorzugsweise ein Säugetier. Die unterschiedliche Verteilung von &agr; und &bgr; Rezeptoren über unterschiedliche Gewebe eines Organismus liefert Ziele für eine selektivere Interferenz mit der Funktion der unterschiedlichen Gewebe. Es ist bekannt, dass Spezies-abhängig, Östrogen-Rezeptoren &agr; predominant in vaginalen Gewebe und Leberegewebe exprimiert werden, wohingegen &bgr; Rezeptoren predominant in Prostatagewebe, Epithel-Zellschichten von Rattenblasen, vaskulären endothelialen weiche Muskelzellen und gewissen Gehirnregionen, wie dem basalen Vorderhirn, dem Neokortex und dem Hippocampus exprimiert werden. Gewebe, bei dem beide Rezeptoren vorhanden sind, beispielsweise die Hypophyse, der Hypothalamus, der Thymus, der Uterus, die Eierstöcke und die Knochen.

Das Östrogen-Rezeptor-Affinitäts-Profil von den Verbindungen der vorliegenden Erfindung macht sie geeignet als verbesserte Östrogene oder Anti-Östrogene unter verminderten Östrogenbezogenen Nebenwirkungen. So beschreibt die Erfindung ein Verfahren für die selektive Modifikation der Aktivität von Östrogen-Rezeptoren durch das Einbringen einer Verbindung der Erfindung in Kontakt mit Östrogen-Rezeptoren. Solch ein Verfahren kann eine Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers sein, aber es kann auch ein nicht-medizinisches Verfahren sein. Das letztere Verfahren kann ein experimentelles Verfahren sein, wie ein Assay für selektive Verbindungen oder ein in vitro Laboratorium-Verfahren, um Information über Östrogen-Rezeptoren oder mit diesen wechselwirkenden Verbindungen zu erhalten. Vorzugsweise können diese Verbindungen für selektive Östrogen-Rezeptor &agr; oder &bgr; bezogene Verhütungsmittel, experimentelle oder medizinische Behandlungen eingesetzt werden, wie solche für die Behandlung oder Vermeidung von Östrogen-Rezeptor bezogenen Störungen, durch die Menopause begründete Beschwerden, Osteoporose, kardiovaskuläre Störungen, Modulation der Hypophyse-Hormon-Steuerung, gutmütige Prostata-Hypertrophie, Östrogen-abhängige Tumorkontrolle, Darmkrebs, Endometriose oder zentrale Nervensystem-Störungen. Ein wesentliches gemeinsames Merkmal von diesen selektiven Verfahren und Behandlungen ist die, dass diese das Einbringen von einer Verbindung der Erfindung in Kontakt mit Östrogen-Rezeptoren umfassen.

Die Erfindung bezieht sich auch auf den Einsatz einer Verbindung gemäss der Erfindung für die Herstellung eines Medikamentes für eine selektive Östrogen-Rezeptor bezogene Behandlung und von einem Medikament für die Behandlung von Östrogen-Rezeptor &agr; bezogenen Störungen, umfassend die Verabreichung von einer Verbindung gemäss der Erfindung (in einer geeigneten pharmazeutischen Dosisform) en einen Patienten. Angesichts der antagonistischen Wirkung von einer Verbindung gemäss der Erfindung auf den Östrogen-Rezeptor &bgr; liefert die Erfindung auch die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Östrogen-Rezeptor &bgr; bezogenen Störungen, umfassend die Verabreichung an einen Patienten einer Verbindung gemäss der Erfindung (in einer geeigneten pharmazeutischen Dosisform).

Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf den Einsatz einer Verbindung gemäss der Erfindung in der Herstellung von einem Medikament mit verhütender Aktivität. Somit bezieht sich die Erfindung auch auf die medizinische Indikation der Verhütung, das heisst ein Verfahren der Verhütung mit der Verabreichung an ein Subjekt, welches eine Frau oder ein weibliches Tier ist, von einem Progestogen und einem Östrogen, wie es auf diesem Gebiet üblich ist, wobei das Östrogen eine Verbindung gemäss dieser Erfindung ist (in einer geeigneten pharmazeutischen Dosisform).

Schliesslich bezieht sich die Erfindung auf den Einsatz einer Verbindung gemäss der Erfindung für die Herstellung eines Medikamentes mit einer selektiven östrogenen Aktivität, wobei solch ein Medikament im allgemeinen für den Bereich der HRT (Hormonersatztherapie; HRT für hormone replacement therapy) geeignet ist, wobei es mit der Menopause verbundene Beschwerden lindert, insbesondere eine Anti-Osteoporose Aktivität aufweist.

Die Dosierungsmengen der vorliegenden Verbindungen wird die der üblichen Höhe bei Östrogen-bezogenen Verbindungen sein, beispielsweise in der Grössenordnung von 0.01 bis 100 Milligramm je Verabreichung.

Zu diesem Zweck können Dosiseinheiten mit Mengen einer Verbindung gemäss der Erfindung in derselben Grössenordnung wie die oben erwähnte Behandlungsdosen hergestellt werden. Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer Verbindung der Erfindung gemischt mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen.

Die Verbindungen gemäss der Erfindung können durch verschiedene im Stand der Technik bekannte Verfahren der organischen Chemie ganz allgemein hergestellt werden, und speziell in der Kunst der Chemie der Steroide. Siehe beispielsweise: Fried, J. und Edwards, J. A., „Organic Reactions in Steroid Chemistry", Bände I und II, Van Nostrand Reinhold Company, New York, 1972; und C. Djerassi, „Steroid Reactions", Holden-Day, Inc., San Francisco, 1963.

Für die Synthese einer Verbindung gemäss der Erfindung sind Steroide mit einem zusätzlichen 16,17 anellierten Ring zu synthetisieren. Verfahren, um dies durchzuführen, sind in EP 0 869 132 beschrieben worden. Für die Verbindungen dieser Erfindung muss eine zusätzlichen Hydroxy-Funktion auf dem anellierten Ring eingeführt werden. Zu diesem Zweck ist es geeignet, die Anellierungs-Reaktion in solch einer Weise durchzuführen, dass geeignet angeordnete Doppelbindungen aus der Synthese-Prozedur hervorgehen, beispielsweise durch den Einsatz einer gut bekannten Olefin-Metathese-Prozedur, wobei Übergangsmetallkatalysatoren eingesetzt werden, die beispielsweise von Ruthenium, Molybdän oder Wolfram abgeleitet werden, um einen 16&agr;, 17&agr;-bis ungesättigtes Fragment in einen ungesättigtem anellierten 5- oder 6-gliedrigen Ring zu schliessen. Der so synthetisierte Olefinring ist zuerst stereoselektiv epoxidiert worden. Dies kann durchgeführt werden mit Agentien wie Persäuren (vorzugsweise in einem gepufferten Medium) oder katalytischen Systemen unter Einsatz von Metallkomplexen in Gegenwart von oxidierenden Agentien (wie Wasserstoffperoxid oder t-Butylhydroperoxid). In den vorliegenden Fällen ergibt Perbenzoesäure mit Natriumbikarbonatpuffer im allgemeinen gute Ergebnisse. Die Epoxide können fast regionenselektiv reduktiv mit Hydridreagentien zu den erforderlichen Beta-Alkoholen geöffnet werden. Hydroxy-Gruppen können auch in einfacher Weise durch Anwendung von einer Hydroborierung/Oxidierungs-Prozedur synthetisiert werden. In Fällen, in denen die &agr;-Hydroxy-Verbindungen erhalten werden, kann eine Mitsunobu Inversion in einfacher Weise zu den &bgr;-Alkoholen führen, die die erwünschten sind. Die Hydroxy-Verbindungen können in Prodrugs gewandelt werden, solche wie Alkylether, Acylester, Karbonate, Sulphonate oder Phosphate, durch Reaktion mit dem geeigneten Alkylhalid oder Säurechlorid, je nach Wunsch.

Eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einer oder mehreren Verbindungen gemäss der Erfindung kann mit oder ohne Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen hergestellt werden, solche wie sie in dem Standardwerk Gennaro et al., Remmington's Pharmaceutical Sciences, (18te Ausgabe, Mack Publishing Company, 1990, siehe insbesondere Teil 8: „Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture") erläutert werden. Eine Mischung von einer oder mehreren Verbindungen gemäss der Erfindung und einer oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen kann in feste Dosiseinheiten gepresst werden, wie Pillen oder Tabletten, oder können in Kapseln oder Zäpfchen verarbeitet werden. Durch das Mittel von pharmazeutisch geeigneten Flüssigkeiten können die Verbindungen auch als ein Injektions-Präparat in Gestalt einer Lösung, Suspension, Emulsion, oder als ein Spray vorgesehen sein, beispielsweise ein Nasenspray. Die Verbindungen gemäss der Erfindung können auch in einem Implantat, einem Vaginalring, einem Patch, einem Gel, und jeder anderen Präparation für fortdauernde Abgabe eingebunden werden. Für die Herstellung von Dosiseinheiten, beispielsweise Tabletten, wird der Einsatz von konventionellen Additiven wie Füllstoffe oder Trägern, Farbstoffen, polymerischen Bindern und ähnlichem betrachtet. Im Allgemeinen können alle pharmazeutisch verträglichen Additive, die nicht in die Funktion der aktiven Verbindungen oder Wirkstoffe eingreifen, eingesetzt werden. Geeignete Träger, mit denen die Kompositionen verabreicht werden können, umfassen Lactose, Stärke, Zellulosederivate und ähnliches, oder Mischungen davon in geeigneten Mengen.

Die in den Beispielen gewählten Synthesewege sind in den folgenden Schemata I und II dargestellt. Die benutzten Nummern, um die Verbindungen zu identifizieren, sind durch die Strukturformeln nach diesen Schemata vorgegeben.

Zu einer Lösung von 5.65 Milliliter von Vinyltributyltin in 50 Milliliter von trockenem THF ist bei –50° Celsius tropfenweise 12 Milliliter von 1.6 M BuLi in Hexan hinzugefügt worden. Nach dem Umrühren für eine zusätzliche halbe Stunde ist eine Lösung von 6.2 Gramm von 16&agr;-Allyl, 7&agr;-Ethylestron-3-O-Methylether (1) in 20 Milliliter von trockenem THF bei –50° Celsius hinzugefügt worden. Nach Umrühren für eine zusätzliche halbe Stunde ist die Mischung in sat.NH4Cl gegossen und mit Ethylacetat ausgezogen worden. Konzentrierung der organischen Phase gefolgt von Silicagel-Chromatographie ergaben 4.2 Gramm von „2" als ein Öl, R_f 0.47 (Toluen/Ethylacetat 95/5), für „1" R_f 0.65. NMR (CDCl₃) &dgr; 5.80 (m, 1, CH allyl), 6.07 (m, 1, CH vinyl) 0.98 (s, CH3), 0.93 (t, 3, ethyl), 3.78 (s, 3, CH₃).

Zu einer Lösung von 4.2 Gramm von „2" in 80 Milliliter von Methylenchlorid sind 0.32 Gramm Benzylidenetriscyclohexylphosphinoruthenium-Dichlorid (Grubbs Metathese Katalysator) hinzugefügt worden. Nach dem Umrühren für 1 Stunde ist ein zusätzlicher Anteil von 0.3 Gramm Katalysator hinzugefügt worden. Nach Vervollständigung der Reaktion (2 Stunden) ist die Mischung konzentriert und das Residuum durch Säulenchromatographie gereinigt worden, um 3.5 Gramm von „3" zu liefern, R_f 0.29 (Heptan/Ethylacetat 8/2, für „2" R_f 0.55). NMR (CDCl₃) &dgr; 5.72 (m, CH=) 6.02 (m, 1, C=) 0.99 (s, 3, CH₃), 0.89 (t, 3, CH₃) 3.77 (OCH₃) 0.92 (m, 3, CH₃).

Eine Mischung von 0.4 Gramm von Steroid „3" und 0.5 Gramm von NaHCO₃ in 12 Milliliter von Methylenchlorid ist mit 0.34 Gramm von m-Cl-Perbenzoesäure behandelt worden. Nach dem Umrühren für mehrere Stunden bei Umgebungstemperatur ist das Reaktionsprodukt mit Wasser verdünnt, und mit Natriumthiosulfat-Lösung behandelt worden, um das residuelle Peroxid zu zerstören. Die organischen Materialien sind in Ethylacetat ausgezogen und schliesslich durch Chromatographie gereinigt worden, um 110 Milligramm des gewünschten &bgr;-Epoxid „4" zu liefern; R_f 0.50 (Toluen-Aceton 9/1); NMR (CDCl₃) &dgr; 0.98 (t, 3, CH₃), 0.92 (t, 3, CH₃), 3.65+3.70 (2*m, Epoxid CH's).

Eine Lösung von 80 Milligramm von Steroid „4" in 3 Milliliter von THF ist mit 10 Milligramm von LiAlH₄ refluxiert worden. Nach 2 Stunden war das Startmaterial verschwunden. Die Mischung ist unter Hinzufügung von 30 Mikroliter von sat. Na₂SO₄ Lösung und 0.20 Gramm von Na₂SO₄ gequencht, für 15 Minuten umgerührt und über Celite gefiltert worden. Das Filtrat ist konzentriert und das Residuum über eine kurze Silicasäule passiert worden, um 55 Milligramm von „5" zu ergeben; R_f 0.24 (Toluen-Aceton 9/1); NMR (CDCl₃) &dgr; 4.04 (m, 1, CHOH), 3.78 (s, 3, OCH₃) 2.85 (m, 2, CH₂ bei C6), 0.92 (s, 3, CH₃).

Zu einer Lösung von Natriumethanethiolat (hergestellt aus 0.7 Milliliter Ethanethiol und 0.27 Gramm von einer 60% NaH-Dispersion) in 9 Milliliter von DMF sind 120 Milligramm von Steroid „5" hinzugefügt worden. Die Mischung ist für 3 Stunden refluxiert worden. Dann ist das Reaktionsprodukt in Wasser gegossen und mit Ethylacetat ausgezogen worden. Chromatographie des organischen Materials ergaben 80 Milligramm von „6", Mp 224-226; R_f 0.30 (Toluen-Aceton 8/2); NMR(CDCl₃) &dgr; 4.00 (m, 1, CHOH), 7.12 (ar H1), 6.20 (ar H2), 6.54 (ar H4).

Zu einer Lösung von 2.7 Gramm von Steroid „3" in 20 Milliliter Methylenchlorid und 3 Milliliter Pyridin, sind bei 0° Celsius 1.9 Milliliter von Trimethylsilylchlorid hinzugefügt worden. Nach dem Umrühren für eine halbe Stunde ist das Reaktionsprodukt in Wasser gegossen und mit Ethylacetat ausgezogen worden, um 3.3 Gramm von im wesentlichen reinen Silyloxy-Derivat „7" zu ergeben, R_f 0.8 (Heptan-Aceton 8/2); NMR(CDCl₃) &dgr; 0.03 (s, 9, TMS), 5.68, 5.91 (2*S, CH olefin).

Eine Lösung von 3.2 Gramm von „7" in 25 Milliliter von trockenem THF ist bei 0° Celsius mit einer Lösung von 2.2 Milliliter Boran-Dimethylsulfid-Komplex in 20 Milliliter von THF behandelt worden. Das Reaktionsprodukt ist anschliessend für 2 Stunden bei 45° Celsius umgerührt worden. Überschussreagenz ist durch sorgfältige Hinzufügung von 4.5 Milliliter von abs. Ethanol, gefolgt von 11 Milliliter von 2N NaOH und 7.7 Milliliter von 30% Wasserstoffperoxid zerstört worden. Das Reaktionsprodukt ist über nacht umgerührt, mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat ausgezogen worden. Das so erhaltene Rohprodukt ist durch Säulenchromatographie gereinigt worden und ergab 1.7 Gramm von dem gewünschten &agr;-Alkohol „8". R_f 0.36 (Heptan-Aceton 8/2); NMR(CDCl₃) &dgr; 4.42 (m, 1, CHOH), 0.12 (s, 9, TMS), 0.79 (s, 3, CH₃).

Eine Lösung von 1.6 Gramm von „8" und 1.3 Gramm von Triphenylphosphin in 60 Milliliter Toluen sind mit 0.84 Gramm von p-Nitrobenzoesäure und 0.8 Milliliter Diethylazodicarboxylat bei 0° Celsius behandelt worden. Nach dem Umrühren für 1 Stunde war die Reaktion vollständig abgelaufen. Die Mischung ist auf sat.aq. NaHCO₃ Lösung gegossen und mit Ethylacetat ausgezogen worden. Chromatographische Reinigung ergaben 2.9 Gramm &bgr;-Nitrobenzoat, R_f 0.64 (Heptan-Aceton 8/2); NMR(CDCl₃) &dgr; 5.34 (m, 1, CHOC(O)Ar), 0.91 (s, 3, CH₃), 0.95 (t, 3, CH₃), 3.80 (s, 3, OCH₃). Dieses Material ist in einer Mischung von 40 Milliliter von THF-Methanol (1/1 v/v) gelöst und mit 4 Milliliter von 2N NaOH Lösung behandelt worden. Nach dem Umrühren für 15 Minuten ist das Reaktionsprodukt in Wasser gegossen und das Produkt in Ethylacetat ausgezogen worden. Nach dem Passieren durch eine kurze Silicasäule sind 1.3 Gramm von &bgr;-Alkohol „9" erhalten worden; R_f 0.64 (Heptan-Aceton 8/2); NMR(CDCl₃) &dgr; 4.31 (m, 1, CHOH).

Eine Lösung von 1.3 Gramm von „9" in 30 Milliliter Aceton ist mit 2 Milliliter von 2N HCl behandelt worden. Nach 1 Stunde ist die Mischung durch Hinzufügung von gesättigtem NaHCO₃ neutralisiert und konzentriert worden. Das Residuum ist mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert worden, um 1.0 Gramm von „10" zu ergeben, R_f 0.10 (Heptan-Aceton 8/2); NMR(CDCl₃) &dgr; 0.90 (t, 3, CH₃) 0.95 (s, 3, CH₃), 4.48 (m, 1, CHOH).

Zu einer Lösung von Natriummethanethiolat (hergestellt aus 0.7 Milliliter Ethanethiol und 0.3 Gramm einer 60% NaH Dispersion) in 9 Milliliter von DMF sind 120 Milligramm des Steroid „10" hinzugefügt worden. Die Mischung ist für 3 h refluxiert worden. Dann ist die Reaktion in Wasser gegossen und mit Ethylacetat ausgezogen worden. Die Chromatographie des organischen Materials ergab 80 Milligramm von „11", Mp 143–145° Celsius (Äthanol-Wasser); R_f 0.41 (Toluen-Aceton 7/3); NMR(CDCl₃) &dgr; 4.45 (m, 1, CHOH), 0.93 (s, 3, CH₃) 0.90 (t, 3, CH₃), 6.62+7.10 (AB, 2, H1, 2), 6.53 (d, 1, H4).

Zu einer Lösung von 29 Milliliter von 1M Allylmagnesiumbromid in Äther sind 80 Milliliter von trockenem THF hinzugefügt worden. Bei –50° Celsius sind 10 Gramm von 7&agr;-Propyl, 16&agr;-Allylestron-3-O-Benzylether „12" in 40 Milliliter von THF hinzugefügt worden. Nach dem Umrühren für eine halbe Stunde ist es der Mischung erlaubt worden, Raumtemperatur zu erreichen und ist in 300 Milliliter von sat aq NH₄Cl gegossen worden. Das Produkt ist mit Ethylacetat ausgezogen und durch Chromatographie über Silicagel gereinigt worden, um Stereoisomere zu entfernen, um 7.2 Gramm des gewünschten 16&agr;,17&agr;-Diallyl-Derivats „13" zu erhalten. R_f 0.26 (Heptan-Ethylacetat 9/1); 17&bgr;-allyl Isomer R_f 0.45. NMR(CDCl₃) &dgr; 0.88 (t, 3, CH₃), 0.96 (s, 3, CH₃), 6.08 (m, 1, CH Allyl), 5.80 (m, 1, CH Allyl), 4.95–5.20 (m, 4, 2* CH₂ Allyl) 5.02 (CH₂OBz).

Ein Anteil von 40 Milligramm von Benzylidenetriscyclohexylphosphinoruthenium Dichlorid (Grubbs Metathese Katalysator) ist eine Lösung von 450 Milligramm von „13" in 10 Milliliter Methylenchlorid hinzugefügt worden. Nach dem Umrühren für 1 Stunde sind zusätzliche 400 Milligramm Katalysator hinzugefügt worden. Nach 2 Stunden ist das Lösungsmittel entfernt und durch 20 Milliliter Toluen ersetzt worden und die Mischung ist mit 5 Gramm Alumina-Basic bei 60° Celsius umgerührt worden, um den Katalysator zu absorbieren. Nach Filtrierung über Celite und Waschen mit Toluen und Ethylacetat sind 400 Milligramm von fast reinem „14" erhalten worden; R_f 0.34 (Heptan-Ethylacetat 8/2); R_f „13" 0.45. NMR(CDCl₃) &dgr; 0.02 (s, 2, CH₂O), 5.97 (s, 2, CH=CH), 0.97 (s, 3, CH₃)

Zu einer Lösung von 340 Milligramm von „14" in 0.5 Milliliter Methylenchlorid sind 8 Mikroliter von Pyridin hinzugefügt worden, 0.14 Milliliter von 30% aq H₂O₂, gefolgt von 2 Milligramm Methyltrioxorhenium. Nach dem Umrühren für 1 Stunde war die Epoxidation vervollständigt, im wesentlichen führend sowohl zu dem gewünschten &bgr;-Epoxid als auch zu einigem &agr;-Isomer. Die Mischung ist in Wasser und sat. Na₂S₂O₃ gegossen und mit Ethylacetat ausgezogen worden. Die Chromatographie ergab 230 Milligramm von „15" und 80 Milligramm des unerwünschten &agr;-Epoxids. R_f 0.36 (Toluen-Ethylacetat 95/5; für die Referenz: R_f Verbindung „14": 0.39). NMR(CDCl₃) &dgr; 3.31, 3.38 (m, 2, CH(O)CH).

Eine Mischung von 4.2 Gramm von „15" und 350 Milligramm von LiAlH₄ in 20 Milliliter von trockenem THF ist für 2 Stunden refluxiert worden. Dann ist die Mischung abgekühlt und nachfolgend mit 1 Milliliter von sat aq. Na₂SO₄, 28 Milliliter von Ethylacetat und 8 Gramm von Na₂SO₄ behandelt worden. Nach dem Umrühren für eine halbe Stunde bei Umgebungstemperatur ist das Reaktionsprodukt über Celite gefiltert worden und das Filtrat ist konzentriert und chromatographiert worden, um 3,4 Gramm von „16" zu ergeben, Mp 147–148 Celsius, R_f 0.20 (Toluen-Ethylacetat 8/2; R_f „23" 0.55). NMR(CDCl₃) &dgr; 4.25 (breites s, 1, CHOH), 0.90 (s, 3, CH₃), 0.86 (t, 3, CH₃), 5.02 (s, 2, OCH₂Ar).

Eine Lösung von 3.3 Gramm von „16" in 200 Milliliter von Ethanol ist in Gegenwart von 300 Milligramm von 5% Pd/C hydrogeniert worden. Nach Vervollständigung der Reaktion ist der Katalysator über Celite gefiltert, und das Lösungsmittel konzentriert worden. Das Residuum ist mit Ether, und dann mit Wasser trituriert worden, um 1.7 Gramm von „17" zu ergeben; Mp 146–147° Celsius, R_f 0.53 (Toluen-Ethylacetat 1/1; R_f „16" 0.60). NMR(CDCl₃) &dgr; 4.26 (breites s, 1, CHOH) 7.14, 6.62 AB, 2, H1, H2), 6.54 (d, H4).

Die Verbindungen sind für ihre Östrogen-Rezeptor-Aktivität in einem Binding Assay und in einem Transaktivations-Assay unter Einsatz von menschlichem Östrogen-Rezeptor &agr; oder &bgr; getestet worden.

Competitive Bindung zu cytoplasmischen menschlichen Östrogen-Rezeptor &agr; oder &bgr; aus rekombinanten „Chinese Hamster Eierstock" (CHO) Zellen sind eingesetzt worden, um die relative Bindungsaffinität (=RBA) (Potenzverhältnis) von einer Testverbindung im Vergleich zu (17&bgr;)-Estradiol (E2) für Östrogen-Rezeptoren &agr; oder &bgr; zu bestimmen „ die in dem Zytosol von rekombinanten CHO Zellen vorliegen, stabil transfektiert mit dem menschlichen Östrogen-Rezeptor &agr; (hER&agr;) oder &bgr; Rezeptor (hER&bgr;).

Die östrogene und anti-östrogene Aktivität von Verbindungen sind in einem in vitro Bioassay mit rekombinanten „Chinese Hamster Eierstock" (CHO) Zellen bestimmt worden, stabil co-transfektiert mit dem menschlichen Östrogen-Rezeptor &agr; (hER&agr;) oder &bgr; (hER&bgr;), dem Ratten Oxytocin Promoter (RO) und dem Luciferase Reporter Gen (LUC). Die östrogene agonistische Transaktivierung (Potenzverhältnis) von einer Testverbindung, um die Transaktivierung von der Enzymluciferase zu stimulieren, die durch die Östrogen-Rezeptoren hER&agr; oder hER&bgr; vermittelt wird, wird mit dem Standard Östrogen Estradiol verglichen. Die antiöstrogene Aktivität (Potenzverhältnis) einer Testverbindung, um die Transaktivierung der Enzymluciferase, die durch die Östrogen-Rezeptoren hER&agr; oder hER&bgr; vermittelt werden, durch das (17&bgr;)-Estradiol zu verhindern, wird mit dem Standard ICI 164.384 (=(7&agr;,17&bgr;)-N-Butyl-3,17-dihydroxy-N-methylestra-1,3,5(10)-trien-7-undecanamid) verglichen.

Verbindung „17" hat in den Antagonist-Assays ein Selektivitätsverhältnis Er&agr;/Er&bgr; von <0.1/67.

Eine Verbindung des Standes der Technik gemäss Formel III, aber ohne 22-Hydroxy und mit R₇ &agr;-Propyl, R₁₁ Wasserstoff und 6-gliedrigem Ring E, die benannt wird (7&agr;, 16&bgr;, 17&agr;)-7-Propyl-16,24-cyclo-19,21-dinorchola-1,3,5(10)-trien-3,17-diol, hat ein ER&agr;/ER&bgr; Verhältnis in dem Bindungsassay von 15/7 und in dem Antagonist-Transaktivations-Assay 0.3/<0.1.

Ovariektomie von Ratten induziert Knochenverluste, die auf die Östrogendefizienz zurückgehen. Die Verabreichung von Östrogen-Verbindungen verhindert diese Wirkung. Der Test wird eingesetzt, um eine Verbindung für anti-osteoporotische Aktivität in ovariektomisierten (OVX) Ratten zu evaluieren. Die Wirkung auf die Knochenmasse kann durch periphere quantitativ berechnete Tomographie (pQCT) evaluiert werden, oder durch quantitative Analyse von Röntgenbildern. Plasma-Osteocalcin und urinäres Deoxypyridinolin, Kalzium und Phosphat ergeben Information über den Knochenmetabolismus. Das Ansteigen vom Uterusgewicht und die Abnahme von Körper- und Thymus-Gewicht reflektieren die östrogene Wirkung.

Reife jungfräuliche 225–250 Gramm schwere weibliche Wistarratten. Stamm: Hsd/Cpd:Wu, SPF-gezüchtet durch Harlan, CPB, Zeist, Die Niederlande.

Am ersten Tag des Experimentes sind die Ratten gewogen und über die Käfige in Abhängigkeit ihres Körpergewichts verteilt worden, wobei die Ratte mit dem geringsten Körpergewicht in den ersten Käfig und die schwerste Ratte in den letzten Käfig gesetzt worden war. Behandlungen werden über die Ratten zufallsverteilt.

Sham-Operation und Ovariektomie werden unter Äther-Anästhesie durchgeführt. Nach Aufwachen aus der Anästhesie, innerhalb von 24 Stunden, sind die Vehikel, die Referenz-Verbindung oder die Test-Verbindung einmal oder zweimal täglich für 4 Wochen verabreicht werden. Während dieser Zeitdauer werden die Ratten wöchentlich gewogen. Nach 4 Wochen ist eine Autopsie durchgeführt worden. Bei der Autopsie sind die Ratten mit Äther betäubt worden und Blut ist aus der abdominalen Aorta abgenommen worden. Beide Femur, die Wirbel L1L2L3L4 (optional), der Uterus, der Tymus, die Leber, die Nieren, die Nebennieren, die Schilddrüse, und die Hypophse sind herausgeschnitten worden. Die Messung von Knochenmineraldichte und -geometrie aus dem rechten Femur ist durch pQCT an dem Tag der Autopsie auf frischem Gewebe durchgeführt worden. Trabekuläre Knochenmineraldichte des metaphysealen Anteils des Femurs (FBMDDIS mg/cm) wird mit einer pQCT (Gerät zur peripheren quantitativen Computertomographie; XCT 960A, Stratec, Birkenfeld, Deutschland) durchgeführt.

Die Ovariektomie bewirkt eine statistisch wesentliche Abnahme in der distalen Knochendichte und dem trabekulärren Knochenvolumen des Femurs und eine statistisch signifikante Erhöhung im Plasma-Osteocalcin und urinärem Deoxypyridinolin Niveau (P<=0.05, 2 weg ANOVA).

Testverbindungen sind als aktiv betrachtet worden, wenn die mittleren Knochendichtewerte des distalen Femurs im Vergleich zu den ovariektomisierten Kontroll-Gruppen signifikant erhöht waren. Wirkungen von Verbindungen auf das urinäre Deoxypyridinolin Niveau reflektiert eine Wirkung auf die Knochenresorption, Wirkungen auf das Plasma-Osteocalcin Niveau reflektiert eine Wirkung auf den Knochenübergang, und dies kann helfen, den Mechanismus der Aktion zu verstehen.

Die minimale aktive Dosis (kurz MAD genannt) ist die Dosis, bei der eine mittlere proportionale Differenz in der trabekulären Knochenmineral zwischen 40 und 60% erreicht werden kann.

• – Wronski T. J. und Yen C. F.: "The ovariectomised rat as an animal model for postmenopausal bone loss"; Cells and Materials, Supp. 1 (1991): 69–76.
• – Yamazald I. und Yamaguchi H.: "Characteristics of an ovariectomised osteopenic rat model"; J. Bone Min. Res. 4 (1989): 12–22.
• – Ederveen A. G. H. und Kloosterboer H. J.: "Tibolone, a Steroid with a tissue-specific hormonal profile, completely prevents ovariectomy-induced bone loss in sexually mature rats"; J. Bone & Mineral Research Vol 14, pp 1963–1970, 1999.

Verbindung „17" (Org 41621): Osteoporose Test oral 30 Mikrogramm/Kilogramm. Verbindung des Standes der Technik (7&agr;, 16&bgr;, 17&agr;)-7-Propyl-16,24-cyclo-19,21-dinorchola-1,3,5(10)-trien-3,17-diol: 190 Mikrogramm/Kilogramm per oral.

In vivo östrogene Aktivität ist durch das Mittel des Allen Doisy Tests bestimmt worden, beschrieben in F. Allen, L. A. Doisy, J. Amer. Med. Assoc., 81,819–821 (1923)

Verbindung „17" (Org 41621): Allen Doisy sc 5 Mikrogramm/Kilogramm, oral 30 Mikrogramm/Kilogramm. Verbindung des Standes der Technik (7&agr;, 16&bgr;, 17&agr;)-7-Propyl-16,24-cyclo-19,21-dinorchola-1,3,5(10)-trien-3,17-diol: Allen Doisy sc 24 Mikrogramm/Kilogramm, oral 125 Mikrogramm/Kilogramm.