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Dokumentenidentifikation DE69919778T2 22.09.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000959077
Titel Optisch aktive DNS-Sonde mit Phosphonsäurediester-Bindung
Anmelder Tosoh Corp., Shinnanyo, Yamaguchi, JP
Erfinder Horie, Ryuichi, Zama-shi, Kanagawa-ken 228-0001, JP;
Ishiguro, Takahiko, Yokohama-shi, Kanagawa-ken 222-0034, JP
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69919778
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 06.05.1999
EP-Aktenzeichen 993035526
EP-Offenlegungsdatum 24.11.1999
EP date of grant 01.09.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.09.2005
IPC-Hauptklasse C07H 21/00
IPC-Nebenklasse C12Q 1/68   G01N 33/533   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Dinucleotids. Das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene Dinucleotid kann bei der Herstellung eines Oligonucleotids, das bei der Identifizierung, Extraktion und Expressionskontrolle eines Ziel-Gens in Gebieten wie z. B. Gentechnik, klinischer Diagnose und medizinischer Behandlung nützlich ist, als Vorläufer verwendet werden.

Beim Nachweis und der Mengenbestimmung einer Ziel-Nucleinsäure wird die Fähigkeit der Ziel-Nucleinsäure, mit einer Nucleinsäure-Sonde, die eine zu einer speziellen Nucleotidsequenz in der Ziel-Nucleinsäure komplementäre Basensequenz aufweist, zu hybridisieren, verwendet.

Andererseits ist von Interkalationsfarbstoffen wie Oxazolgelb, Thiazolorange und Ethidiumbromid bekannt, dass ihre Fluoreszenz beim Binden an eine doppelsträngige Nucleinsäure außergewöhnlich zunimmt.

Unter Verwendung dieser Eigenschaft haben die Erfinder ein Verfahren zum Untersuchen einer Nucleinsäure, die eine spezielle Nucleinsäuresequenz enthält (eine Ziel-Nucleinsäure), durch Nachweisen der speziellen Nucleinsäuresequenz erfunden, wobei das Verfahren einen Schritt des Zugebens eines einzelsträngigen Oliogonucleotids, das eine zu der speziellen Nucleinsäuresequenz in der Ziel-Nucleinsäure komplementäre Nucleinsäuresequenz enthält, als Sonde zu einer Probe, und Hybridbildung der Sonde mit der Ziel-Nucleinsäure umfasst; wobei es sich bei der Sonde um ein einzelsträngiges Oligonucleotid handelt, das mit einem fluoreszierenden Interkalationsfarbstoff, der in das Hybrid der Ziel-Nucleinsäure und dem einzelsträngigen Oligonucleotid interkaliert, markiert ist (JP-A-8-211050, USP 5,814,447 und EP 714986).

Die vorstehend erwähnte Erfindung stellte eine markierte Nucleinsäure-Sonde zum homogenen und einfachen Einstufen-Nachweis einer Nucleinsäure, die eine spezielle Nucleinsäuresequenz enthält, bereit, die den Nachweis von Hybridbildung oder Mengenbestimmung des entstehenden Hybrids ohne die Notwendigkeit eines Schritts des Abtrennen des unhybridisierten Sondenüberschusses beim Nachweis einer Ziel-Nucleinsäure ermöglichte.

Als eine interkalierende Markierung in der Mitte einer Nucleinsäure-Sonde über einen Aminoalkylphosphonat-Linker, der keinen Einfluss auf die Hybridbildung mit der Ziel-Nucleinsäure hat, befestigt wurde, war es möglich, bereits die Substitution nur einer Base in einer Ziel-Nucleinsäure nachzuweisen, wenn auch das Verfahren des Markierens der Nucleinsäure-Sonde nicht darauf beschränkt ist.

Eine phosphonische Diesterkopplung als Internucleotidkopplung weist ein chirales Zentrum an ihrem Phosphoratom auf. Daher weist eine DNS-Sonde, die durch Einführen von Phosphonsäure in die Mitte eines Oligonucleotids erhalten wird, zwei Stereoisomere mit absoluter R- bzw. S-Konfiguration auf.

Von Methylphosphorsäure-enthaltender Gegensinn-DNS, die als genetisches Arzneimittel ausführlich erforscht wird, ist bekannt, dass sie in der Stabilität ihrer Hybridbildung mit einem Komplementärstrang (Tm), in der Konformation und in der Reaktivität mit Nucleasen in Abhängigkeit der absoluten Konfiguration der Methylphosphonsäure variiert.

WO 97/09340 offenbart ein Zweistufen-Verfahren zur Synthese von optisch reinen Organophosphor-Dinucleotiden aus optisch aufgelösten Nucleotidmonomeren.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Dinucleotids der Formel (1) bereit,

wobei das Verfahren Umsetzen eines phosphonischen Nucleotids der Formel (2)
mit einem Nucleosid der Formel (3)
um ein Dinucleotid der Formel (4)
zu ergeben, und optisches Trennen des Dinucleotids umfasst,

wobei P* ein optisch aktives Phosphoratom ist, B eine beliebige Base ist, R1 eine Trifluoracetylgruppe ist, R2 eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist und R3 eine t-Butyldimethylsilylgruppe ist.

Das optisch aktive phosphonische Dinucleotid ist als Vorläufer bei der Herstellung einer optisch aktiven DNS-Sonde nützlich. Die Erfinder haben gefunden, dass ein phosphonisches Dinucleotid, das in Form eines Racemats erhalten wird, einen Unterschied im Rf-Wert seiner Stereoisomere in Abhängigkeit der Art der getragenen Schutzgruppe aufweisen kann. Auf der Grundlage dieser Entdeckung haben sie die Stereoisomere unschwer aufgetrennt und ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven phosphonischen Dinucleotids geschaffen.

Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail beschrieben. Es wird auf die begleitenden Zeichnungen verwiesen:

1 veranschaulicht das Verfahren von Beispiel 1.

2 veranschaulicht das Verfahren von Beispiel 2.

3 ist das NMR-Diagramm von Verbindung 5.

4 sind die NMR-Diagramme von Verbindungen 5S und 5R.

5 sind die NMR-Diagramme von Verbindungen 5S und 5R.

6 veranschaulicht die Einzelheiten von Verbindungen 5S/5R (B1 = T, B2 = CBZ, R31 = MZ, R32 = Ac) und 5S/R(B1 = T, B2 = CBZ, R31 = TFA, R32 = TBDMS).

7 veranschaulicht das Verfahren von Beispiel 3.

8 veranschaulicht das Verfahren von Beispiel 3.

9 veranschaulicht das Verfahren von Beispiel 4.

10 veranschaulicht das Verfahren von Beispiel 5.

11 veranschaulicht die in Beispiel 8 erhaltene DNS-Sonde.

12 ist das HPLC-Diagramm der in Beispiel 8 erhaltenen DNS-Sonde.

13 veranschaulicht die in Beispiel 9 erhaltene DNS-Sonde.

14 ist das HPLC-Diagamm der in Beispiel 9 erhaltenen DNS-Sonde.

15 veranschaulicht das Verfahren von Beispielen 10 und 11.

16 veranschaulicht die in Beispiel 14 erhaltene DNS-Sonde.

17 ist das HPLC-Diagamm der in Beispiel 14 erhaltenen DNS-Sonde.

18 veranschaulicht die in Beispiel 15 erhaltene DNS-Sonde.

19 ist das HPLC-Diagamm der in Beispiel 15 erhaltenen DNS-Sonde.

20(A) zeigt das Fluoreszenzspektrum einer wässrigen Lösung, die die in Beispiel 8 erhaltene DNS-Sonde YO-A13S und das Ziel-Nucleotid Oligo-dT (30-mer) enthält, gemessen unter hybridbildungsfähigen Bedingungen (I), das Fluoreszenzspektrum einer wässrigen Lösung, die die in Beispiel 9 erhaltene DNS-Sonde YO-A13R und das Ziel-Nucleotid Oligo-dT (30-mer) enthält, gemessen unter hybridbildungsfähigen Bedingungen (II), das Fluoreszenzspektrum von YO-A13R in einer wässrigen Lösung (III) und das Fluoreszenzspektrum von YO-A13S in einer wässrigen Lösung (IV).

20(B) zeigt die Fluoreszenzspektren von wässrigen Lösungen, die die in Beispielen 8 oder 9 erhaltenen DNS-Sonden YO-A13S bzw. YO-A13R und Oligo-dA (30-mer) enthalten.

20(C) zeigt die Fluoreszenzspektren von wässrigen Lösungen, die die in Beispielen 8 oder 9 erhaltenen DNS-Sonden YO-A13S bzw. YO-A13R und eine rekombinante HCV-RNS enthalten.

21(A) zeigt das Fluoreszenzspektrum einer wässrigen Lösung, die die in Beispiel 14 erhaltene DNS-Sonde YO-271S und die Ziel-Nucleinsäure Temp271 enthält, gemessen unter hybridbildungsfähigen Bedingungen (Temp271), und das Fluoreszenzspektrum von YO-271S in wässriger Lösung (keines).

21(B) zeigt das Fluoreszenzspektrum einer wässrigen Lösung, die die in Beispiel 15 erhaltene DNS-Sonde YO-271R und die Ziel-Nucleinsäure Temp271 enthält, gemessen unter hybridbildungsfähigen Bedingungen (Temp271), und das Fluoreszenzspektrum von YO-271R in wässriger Lösung (keines).

22 ist das NMR-Diagramm von Verbindung 5S.

23 ist das NMR-Diagramm von Verbindung 5R.

24 veranschaulicht die Substrate und die Reaktionsprodukte der Umsetzungen in Beispielen 20 bis 22.

Ein Nucleosid der Formel (5) kann in der vorliegenden Erfindung als Ausgangsmaterial verwendet werden, und diejenigen, bei denen R2 eine DMTr-Gruppe (4,4'-Dimethoxytrityl) bedeutet, können mit dem in der Literatur offenbarten Verfahren (J. Am. Chem. Soc., Vol. 84, 430 (1962)) erhalten werden. Andere solche Verbindungen, die auf dem Markt sind, können ebenfalls verwendet werden.

Ferner kann eine Verbindung der Formel (6), die durch Schützen von im Handel erhältlicher 2-Aminoethylphosphonsäure mit einer geeigneten Aminoschutzgruppe erhalten werden kann, verwendet werden. Bei der Aminoschutzgruppe handelt es sich um TFA (Trifluoracetyl).

Dehydratisierungskondensation einer Verbindung der Formel (5) mit einer Verbindung der Formel (6) ergibt eine Verbindung der Formel (2). Obwohl das für die Kondensation verwendete Kondensationsmittel nicht beschränkt ist, ist es üblicherweise ein Mittel, das zum Bilden eines Phosphoresters fähig ist, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, Alkylbenzolsulfonsäurederivate und Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid. Als Lösungsmittel kann ein polares Lösungsmittel, das das Reaktionsprodukt löst, wie z. B. Acetonitril und Pyridin verwendet werden. Die Reaktionstemperatur ist ebenfalls nicht besonders beschränkt, sie liegt aber zwischen dem Schmelzpunkt und dem Siedepunkt des Lösungsmittels, vorzugsweise von –10°C bis 60°C.

Die entstehende Verbindung der Strukturformel (2) wird mit einem Nucleosid der Formel (3), das eine ungeschützte Hydroxylgruppe an der 5'-Position aufweist, kondensiert, um ein phosphonisches Dinucleotid der Formel (4) zu ergeben. Als Schutzgruppe an der 3'-Position der Verbindung der Strukturformel (3) wird TBDMS (tert-Butyldimethylsilyl) verwendet.

Obwohl das für die Kondensation verwendete Kondensationsmittel nicht beschränkt ist, ist es üblicherweise ein Mittel, das zum Bilden eines Phosphoresters fähig ist, wie z. B. Dicyclohexylcarbodiimid, Alkylbenzolsulfonsäurederivate und Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid. Als Lösungsmittel kann ein polares Lösungsmittel, das das Reaktionsprodukt löst, wie z. B. Acetonitril und Pyridin verwendet werden. Die Reaktionstemperatur ist ebenfalls nicht besonders beschränkt, sie liegt aber zwischen dem Schmelzpunkt und dem Siedepunkt des Lösungsmittels, vorzugsweise von –10°C bis 60°C.

Diese Verbindung weist ein chirales Zentrum am Phosphoratom auf und wird als Mischung der beiden Stereoisomere, die R- bzw. S-Konfiguration aufweisen, erhalten. Die Stereoisomere können mit gebräuchlichen Verfahren zur reinigenden Trennung von Verbindungen, wie z. B. Silicagel-Säulenchromatographie und Umkehrphasen-Säulenchromatographie, optisch aufgetrennt werden.

In einem Versuch, die Stereoisomere zu trennen, haben die Erfinder gefunden, dass es einen Unterschied der Rf-Werte der beiden Stereoisomere gibt, der von der Art der Schutzgruppen an der 3'-Position des phosphonischen Dinucleotids abhängt. Wenn die Aminoschutzgruppe eine MZ-Gruppe ist und die Schutzgruppe an der 3'-Position Ac ist, haben die beiden Stereoisomere den gleichen Rf-Wert und sind schwer zu trennen. Wenn jedoch die Aminoschutzgruppe eine TFA-Gruppe ist und die Schutzgruppe an der 3'-Position eine TBDMS-Gruppe ist, ist der Unterschied der Rf-Werte der beiden Stereoisomere groß genug, um ihre Trennung zu ermöglichen. Die absoluten Konfigurationen der aufgetrennten Stereoisomere werden durch analytische Verfahren wie z. B. 1H-NMR und 31P-NMR bestimmt.

Dann kann das aufgetrennte optisch aktive Phosphonat-Dinucleotid einer Schutzgruppenentfernung an der 3'-Position unterworfen werden. Die Schutzgruppenentfernung wird vorzugsweise unter Bedingungen durchgeführt, bei denen keine anderen Schutzgruppen der Verbindung entfernt werden. Eine TBDMS-Gruppe, die, wie vorstehend beschrieben, die Schutzgruppe an der 3'-Position ist, ist als Schutzgruppe einer alkoholischen Hydroxylgruppe ausgezeichnet, und ihr größter Vorteil ist, dass sie unter Verwendung von Fluoridanionen (Tetrabutylammoniumfluorid, n-Bu4NF) unter neutralen Bedingungen entfernt werden kann. Wenn das Substrat eine funktionelle Gruppe, die gegen Basizität empfindlich ist, aufweist, kann sich das Substrat unter solchen Bedingungen zersetzen. In solch einem Fall ergibt, wie bekannt ist, Zugabe von Essigsäure zum Reaktionssystem durch Mäßigen der Basizität von Tetrabutylammoniumfluorid eine selektivere Entfernung des Silylethers (K. K. Ogilvie und S. L. Beaucage, Tetrahedron Lett. (1976) 1255-1256). Dieses herkömmliche Verfahren kann in der vorliegenden Erfindung zur Schutzgruppenentfernung an der 3'-Position eingesetzt werden. Wenn jedoch das Substrat eine funktionelle Gruppe, die sowohl gegen Acidität als auch gegen Basizität instabil ist, aufweist, wird bevorzugt, wie nachstehend beschrieben vorzugehen, um die TBDMS-Gruppe ohne Säure oder Base genauer und selektiver zu entfernen.

Wenn ein Trialkylsilylether als Schutzgruppe in einer Verbindung mit einer funktionellen Gruppe, die sowohl gegen Acidität als auch gegen Basizität instabil ist, unter Verwendung von Tetrabutylammoniumfluorid entfernt wird, kann nämlich Zugabe von sowohl Essigsäure als auch einem Amin sowohl die Acidität als auch die Basizität mäßigen. Das zuzugebende Amin ist nicht besonders beschränkt, aber es ist vorzugsweise ein Amin, das nach der Umsetzung durch Destillation oder dergleichen entfernt werden kann, wie z. B. Triethylamin. Mit Bezug auf das Verfahren ihrer Zugabe können Essigsäure und ein Amin als solche zugegeben werden, oder als eine wässrige Lösung wie z. B. als ein Triethylamin-Acetat-Puffer. In beiden Fällen unterbricht das Zugeben von Essigsäure und einem Amin die Umsetzung zum Entfernen der Trialkylsilylether-Kopplung nicht. Es wird bevorzugt, eine Mischung von Essigsäure und Triethylamin mit einer Tetrabutylammoniumfluorid-Lösung zu der Substratlösung zuzugeben, anstatt eine Tetrabutylammoniumfluorid-Lösung zu einer Mischung von Essigsäure und Triethylamin mit der Substratlösung zuzugeben. Das liegt daran, dass die Acidität und Basizität von Tetrabutylammoniumfluorid wirksamer gemäßigt werden kann.

Obwohl es keine Beschränkung der zuzugebenden Mengen von Tetrabutylammoniumfluorid, Essigsäure und Triethylamin gibt, ist die zu verwendende Menge von Tetrabutylammoniumfluorid beispielsweise von 1 bis 10-mal, vorzugsweise von 1,5 bis 3-mal größer als die des Substrats. Bei der TBDMS-entfernenden Umsetzung von Tetrabutylammoniumfluorid verzögert die Zugabe von Essigsäure und Triethylamin das Verschwinden des Ausgangsmaterials, aber die Umsetzung ist in etwa einer oder zwei Stunden beendet, wenn das molare Verhältnis von Tetrabutylammoniumfluorid : Essigsäure : Triethylamin 2:1:1 beträgt.

Das vorstehend erwähnte Verfahren zum Entfernen eines Trialkylsilylethers als Schutzgruppe ist zum Entfernen der TBDMS-Gruppe, die als Schutzgruppe an der 3'-Position der vorstehend erwähnten Verbindung verwendet wird, besonders wirksam. Gemäß einem Bericht dieser Erfinder ergab herkömmliche Behandlung einer Verbindung der nachstehenden Strukturformel (7) mit Tetrabutylammoniumfluorid allein in THF das beabsichtigte Produkt der nachstehenden Strukturformel (8) in einer Ausbeute von etwa 37% nach Isolation. Eine TLC-Analyse der Reaktionslösung zeigte Verschwinden des Ausgangsmaterials, wies aber auch Zersetzungsprodukte wie z. B. DMTr-Gruppen zusätzlich zum beabsichtigten Produkt nach. Als andererseits Essigsäure und Triethylamin als ein Triethylamin-Acetat-Puffer zu einer THF-Lösung des Ausgangsmaterials zugegeben wurden, erhöhte sich wegen der Abnahme von Zersetzungsprodukten die Ausbeute des beabsichtigten Produkts nach Isolation. Die Ergebnisse wurden unabhängig von den Basenarten der Nucleinsäuren bestätigt.

Die so gebildete 3'-Hydroxylgruppe kann einer Phosphorylierung oder einer Phosphoramidierung unterworfen werden, und dann an das 5'-Ende eines getrennt hergestellten DNS-Oligiomers angefügt werden. Ferner kann das DNS-Oligomer mit dem am 5'-Ende angefügten Phosphonsäure-Dinucleotid verlängert werden, um ein Oligomer mit einer beabsichtigten Sequenz zu ergeben. Das DNS-Oligomer kann mit herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von DNS-Oligomeren, wie z. B. einem Flüssigphasen-Verfahren oder einem Verfahren in fester Phase, erhalten werden. Phosphoramidierung eines phosphonischen Dinucleotids ermöglicht es, das phosphonische Dinucleotid in der gleichen Weise wie im Handel erhältliche Reagenzien für DNS-Synthetisiergeräte handzuhaben. DNS-Synthese mit einem DNS-Synthesegerät unter Verwendung eines phosphoramidierten phosphonischen Dinucleotids liefert ein DNS-Oligomer mit einem phosphonischen Diester an einer beliebigen Stelle der DNS-Sequenz.

Schließlich wird das so erhaltene phosphonische Oligomer der Schutzgruppenentfernung unterworfen und ein interkalierender Farbstoff wird an die ungeschützte Aminogruppe des Aminoethylphosphonats gebunden, um eine optisch aktive DNS-Sonde zu ergeben.

Die Verwendung eines Interkalationsfarbstoffs mit einer funktionellen Gruppe, die direkt an eine Aminogruppe binden kann, erleichtert das Anbinden eines Interkalationsfarbstoffs an die Aminogruppe. Wenn ein bifunktionelles Reagens mit funktionellen Gruppen an beiden Enden, wie z. B. N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP) und N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat (EMCS) an die Aminogruppe des Aminoethylphosphonats gebunden wird, und ein Interkalationsfarbstoff über das bifunktionale Reagens angebunden wird, ist es möglich, die funktionelle Gruppe des Interkalationsfarbstoffs beliebig zu wählen.

Jede Verbindung, von der bekannt ist, dass sie bei Interkalation in eine doppelsträngige Nucleinsäure die Fluoreszenz bemerkenswert ändert, kann als der Interkalationsfarbstoff verwendet werden, wie z. B. Oxazolgelb, Thiazolorange und Ethidiumbromid. Insbesondere sind jene, die die Fluoreszenzintensität bemerkenswert verstärken, bevorzugt. Als Beispiele solcher Interkalationsfarbstoffe können Thiazolorange und Oxazolgelb erwähnt werden.

Die vorliegende Erfindung wird nun mit Bezug auf Beispiele detaillierter beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch in keiner Weise auf diese speziellen Beispiele beschränkt.

Die nachfolgenden Abkürzungen werden in den Beispielen verwendet.

T:
Thymin
ABz:
N-Benzoyladenin
CBz:
N-Benzoylcytosin
GiBu:
N-Isobutyrylguanin
MZ:
4-Methoxybenzyloxycarbonyl
TFA:
Trifluoracetyl
Ac:
Acetyl
TBDMS:
tert-Butyldimethylsilyl

Beispiel 1

Wie in 1 gezeigt, wurden Verbindung 1 und Verbindung 2 in den in Tabelle 1 gezeigten Verhältnissen gemischt und in Pyridin gelöst, und Triisopropylbenzolsulfonylchlorid (TPS-Cl) und Tetrazol in Pyridin wurden tropfenweise zugegeben. Die Reaktionslösung wurde 4 Stunden bei 40°C gerührt. Dann wurde 50 %-iges wässriges Pyridin zugegeben und der pH-Wert wurde mit gesättigtem wässrigem Natriumbicarbonat auf etwa 7,0 eingestellt. Die Reaktionslösung wurde zwischen Ethylacetat und gesättigtem wässrigem Natriumchlorid aufgetrennt und die organische Schicht wurde getrocknet und im Vakuum konzentriert. Reinigung des Konzentrats durch Silicagel-Säulenchromatographie ergab Verbindung 3 in den in Tabelle 1 gezeigten Mengen und Ausbeuten.

Tabelle 1
Beispiel 2

Wie in 2 gezeigt, wurden Verbindung 3 und Verbindung 4 in den in Tabelle 2 gezeigten Verhältnissen gemischt und in Pyridin gelöst. Ein Kondensationsmittel (Triisopropylbenzolsulfonylchlorid (TPS-Cl), Triisopropylbenzolsulfonyl-3-nitrotriazol (TPS-NTriazol) oder Bis(2-oxo-3-oxazolidinyl)phosphinchlorid (BOP-Cl)) wurde zugegeben und die Umsetzung wurde bei 40°C durchgeführt. Nach den in Tabelle 2 gezeigten Reaktionszeiten wurde 50%-iges wässriges Pyridin zugegeben und der pH-Wert wurde auf etwa 7,0 eingestellt. Die Reaktionslösung wurde zwischen Ethylacetat und gesättigtem wässrigem Natriumchlorid aufgetrennt und die organische Schicht wurde getrocknet und im Vakuum konzentriert. Reinigung des Konzentrats durch Silicagel-Säulenchromatographie ergab Verbindung 5S und Verbindung 5R in den in Tabelle 2 gezeigten Mengen und Ausbeuten.

Beim Vergleich der Protonen-NMR Spektren der beiden Stereosiomere wurde dasjenige, in dem das P-CH2-Signal (P-1-Position) zu höherer magnetischer Feldstärke verschoben war, als 5S gekennzeichnet, und dasjenige, in dem das entsprechende Signal zu einer niedrigeren magnetischen Feldstärke verschoben war, wurde als 5R gekennzeichnet.

Das NMR (CDCl3)-Diagramm von Verbindung 5(R + S)(B1 = T, B2 = CBz, R31 = MZ, R32 = Ac) bei 500 MHz ist in 3 gezeigt.

Die NMR (CDCl3)-Diagramme von Verbindung 5S (B1 = T, B2 = CBz, R31 = TFA, R32 = TBDMS) und Verbindung 5R (B1 = T, B2 = CBz, R31 = TFA, R32 = TBDMS) bei 500 MHz sind in 4 gezeigt.

Die NMR (CDCl3)-Diagramme von Verbindung 5S (B1 = ABz, B2 = ABz, R31 = TFA, R32 = TBDMS) und Verbindung 5R (B1 = ABz, B2 = ABz, R31 = TFA, R32 = TBDMS) bei 500 MHz sind in 5 gezeigt.

Das NMR (CDCl3)-Diagramm von Verbindung 5S (B1 = CBz, B2 = GiBu, R31 = TFA, R32 = TBDMS) bei 500 MHz ist in 22 gezeigt.

Das NMR (CDCl3)-Diagramm von Verbindung 5R (B1 = CBz, B2 = GiBu, R31 = TFA, R32 = TBDMS) bei 500 MHz ist in 23 gezeigt.

Detaillierte Strukturen von Verbindungen 5S/5R (B1 = T, B2 = CBz, R31 = MZ, R32 = Ac) und 5S/5R (B1 = T, B2 = CBz, R31 = TFA, R32 = TBDMS) sind in 6 gezeigt. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, hängt der Unterschied der Wanderungsgeschwindigkeit (Rf) in der Dünnschichtchromatographie (TLC) zwischen den R- und S-Stereoisomeren von Verbindung 5 von der Art der Hydroxyl- und Aminoschutzgruppen (R31 und R32) ab, und wenn R31 gleich TFA und R32 gleich TBDMS ist, ist die Trennung der beiden Stereoisomere leicht. Für die TLC wurden ein handelsübliches Gerät (Merck Silicagel 60 F254 HPTLC-Platte) und eine 95:5 Mischung von Chloroform und Methanol als Entwicklungslösung verwendet.

Beispiel 3

Wie in 7 und 8 gezeigt, wurde 0,1 M Tetrabutylammoniumfluorid in THF tropfenweise zu Verbindung 5R oder 5S in THF zugegeben. Nach 2 Stunden Rühren wurde die entstandene Reaktionslösung im Vakuum zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wurde zwischen Chloroform und gesättigtem wässrigem Natriumchlorid aufgetrennt, und die organische Schicht wurde getrocknet und zur Trockne konzentriert. Reinigung des Rückstands mit Silicagel-Säulenchromatographie ergab Verbindung 6S oder Verbindung 6R.

Tabelle 3
Beispiel 4

Wie in 9 gezeigt, wurde Verbindung 7 gemäß dem in Nucleic Acid Research, Vol. 14, 7391 offenbarten Verfahren phosphoramidiert, um Verbindung 8 zu ergeben, die nachfolgend ohne Isolierung zur Synthese eines DNS-Oligomers mit einem DNS-Synthesegerät verwendet wurde.

Beispiel 5

Wie in 10 gezeigt, wurde Verbindung 9 in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 phosphoramidiert, um Verbindung 10 zu ergeben, die nachfolgend ohne Isolierung zur Synthese eines DNS-Oligomers mit einem DNS-Synthesegerät verwendet wurde.

Beispiel 6

Ein DNS-Oligomer A-13S mit der folgenden Basensequenz wurde unter Verwendung von Verbindung 8 und Adenosin-3'-phosphoramidit als Ausgangsmaterialien mit einem DNS-Synthesegerät (Applied Biosystems Model 380B DNA Synthesizer, hergestellt von Perkin-Elmer) synthetisiert.

A-13S: (5')AAAAA*AAAAAAAA(3')

wobei "*" die Lage des der Verbindung 8 eigenen zugeschriebenen Diesters anzeigt.

Beispiel 7

Ein DNS-Oligomer A-13R mit der nachstehenden Basensequenz wurde unter Verwendung von Verbindung 10 und Adenosin-3'-phosphoramidit als Ausgangsmaterialien mit einem DNS-Synthesegerät (Applied Biosystems Model 380B DNA Synthesizer, hergestellt von Perkin-Elmer) synthetisiert.

A-13R: (5')AAAAA*AAAAAAAA(3')

wobei "*" die Lage des der Verbindung 10 zugeschriebenen phosphonischen Diesters anzeigt.

Beispiel 8

Eine DNS-Sonde YOA-13S, die in 11 gezeigt ist, wurde unter Verwendung von DNS-Oligomer A-13S als Ausgangsmaterial gemäß dem in der USP 5,814,447 oder in der EP 714986 offenbarten Verfahren erhalten.

Das HPLC-Diagramm von gereinigtem YOA-13S ist in 12 gezeigt.

Beispiel 9

Eine DNS-Sonde YOA-13R, die in 13 gezeigt ist, wurde unter Verwendung von DNS-Oligomer A-13R als Ausgangsmaterial gemäß dem in der USP 5,814,447 oder in der EP 714986 offenbarten Verfahren erhalten.

Das HPLC-Diagramm von gereinigtem YOA-13R ist in 14 gezeigt.

Beispiel 10

Wie in 15 gezeigt, wurde die in Beispiel 3 hergestellte Verbindung 6S (in der B1 = CBz, B2 = GiBu) in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 behandelt, um Verbindung 11 S zu ergeben, die nachfolgend ohne Isolierung zur Synthese eines DNS-Oligomers verwendet wurde.

Beispiel 11

Wie in 15 gezeigt, wurde die in Beispiel 3 hergestellte Verbindung 6R (in der B1 = CBz, B2 = GiBu) in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 behandelt, um Verbindung 11R zu ergeben, die nachfolgend ohne Isolierung zur Synthese eines DNS-Oligomers verwendet wurde.

Beispiel 12

Ein DNS-Oligomer 271 S mit der folgenden Basensequenz (wobei "*" die Lage des der Verbindung 11 S zugeschriebenen phosphonischen Diesters anzeigt) wurde unter Verwendung der in Beispiel 10 hergestellten Verbindung 11 S und G-, C- und T-Phosphoramiditen als Ausgangsmaterialien in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 synthetisiert.

271S: (5')CTCGC*GGGGGCTG(3')

Beispiel 13

Ein DNS-Oligomer 271 R mit der folgenden Basensequenz (wobei "*" die Lage des der Verbindung 11R zugeschriebenen phosphonischen Diesters anzeigt) wurde unter Verwendung der in Beispiel 11 hergestellten Verbindung 11R und G-, C- und T-Thosphoramiditen als Ausgangsmaterialien in der gleichen Weise wie in Beispiel 6 synthetisiert.

271R: (5')CTCGC*GGGGGCTG(3')

Beispiel 14

Eine DNS-Sonde YO-271 S, die in 16 gezeigt ist, wurde unter Verwendung von DNS-Oligomer 271 S als Ausgangsmaterial in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten. Das HPLC-Diagramm von gereinigtem YO271S ist in 17 gezeigt.

Beispiel 15

Eine DNS-Sonde YO-271R, die in 18 gezeigt ist, wurde unter Verwendung von DNS-Oligomer 271R als Ausgangsmaterial in der gleichen Weise wie in Beispiel 8 erhalten. Das HPLC-Diagramm von gereinigtem YO271S ist in 19 gezeigt.

Beispiel 16

Eine Ziel-Nucleinsäure wurde mit den in Beispielen 8 und 9 hergestellten DNS-Sonden (YO-A13R bzw. YO-A13S) wie folgt nachgewiesen.

Verfahren
  • ➀ Zu einem Hybridbildungspuffer (1 × SSC, 1 mM EDTA), der eine Sonde enthielt (YO-A13R oder YO-A13S; Endkonzentration 10 nM), wurde Ziel-DNS (Oligo-dT (30-mer), Oligo-dA (30-mer) oder eine rekombinante HCV-RNS; Endkonzentration jeweils 10 nM) zugegeben und die entstandene Reaktionslösung wurde in eine Fluorimeterküvette pipettiert.
  • ➁ Das Fluoreszenzspektrum der Reaktionslösung wurde mit einem Fluoreszenzspektrometer FP-777 (JASCO Corporation) (Anregungswellenlänge 490 nm/HW 5 nm) gemessen.
Ergebnisse

Die so erhaltenen Fluoreszenzspektren sind in 20 gezeigt.

  • (A) I YO-A13S (10 nM) und Oligo-dT (30-mer) (10 nM)

    II YO-A13R (10 nM) und Oligo-dT (30-mer) (10 nM)

    III YO-A13R (10 nM) allein

    IV YO-A13S (10 nM) alllein
  • (B) (––––– ) YO-A13S (10 nM) und Oligo-dA (30-mer) (10 nM)

    (-----) YO-A13R (10 nM) und Oligo-dA (30-mer) (10 nM)
  • (C) (––––– ) YO-A13S (10 nM) und rekombinante HCV-RNS (10 nM)

    (-----) YO-A13R (10 nM) und rekombinante HCV-RNS (10 nM).

Sowohl YO-A13R als auch YO-A13S wiesen in Gegenwart des komplementären Oligo-dT (30-mer) außergewöhnliche Fluoreszenzverstärkung auf (20(A)). Im Gegensatz dazu war die Fluoreszentintensität in Gegenwart von nichtkomplementären Nucleinsäuren, Oligo-dA (30-mer) und rHCV-RNS, mit jener im Fall der Sonde allein vergleichbar.

Beispiel 17

Die Schmelzpunkte der in Beispielen 8 und 9 hergestellten DNS-Sonden (YO-A13R bzw. YO-A13S) wurden wie folgt gemessen.

Verfahren
  • ➀ Eine DNS-Sonde (YO-A13R oder YO-A13S) oder dA (13-mer) (Endkonzentration jeweils 1,5 &mgr;M) wurde zu einem Hybridbildungspuffer (1 × SSC, 1mM EDTA), der eine Ziel-Nucleinsäure, dT (30-mer), enthielt, zugegeben.
  • ➁ Die Reaktionslösung wurde allmählich von 90°C auf 25°C abgekühlt, wobei die Temperatur aufgezeichnet wurde, während die UV-Absorption bei 260 nm gemessen wurde.
Ergebnisse
  • Schmelzpunkte (engl: Tm-values)
  • YO-A13R: 47°C
  • YO-A13S: 47°C
  • Oligo-dA (13-mer): 37°C

Die Schmelzpunkte der beiden Sonden waren um 10°C höher als der von Oligo-dA (13-mer), das nicht mit YO modifiziert war, was Stabilisierung von doppelsträngiger DNS, die von den Sonden bei der Interkalation des YO-Moleküls gebildet wird, anzeigt. Die in Beispiel 16 beobachtete Fluoreszenzverstärkung kann vermutlich der Interkalation zugeordnet werden.

Beispiel 18

Eine Ziel-Nucleinsäure wurde mit den in Beispielen 14 und 15 hergestellten DNS-Sonden (YO-271 R bzw. YO-271 S) wie folgt nachgewiesen.

Verfahren
  • ➀ Zu einem Hybridbildungspuffer (1 × SSC, 1 mM EDTA), der eine Sonde enthielt (YO-271R oder YO-271S; Endkonzentration 25 nM), wurde eine Ziel-DNS, Temp271 (Endkonzentration 25 nM), zugegeben und die entstandene Reaktionslösung wurde in eine Fluorimeterküvette pipettiert.
  • ➁ Das Fluoreszenzspektrum der Reaktionslösung wurde mit einem Fluoreszenzspektrometer FP-777 (JASCO Corporation) (Anregungswellenlänge 490 nm/HW 5 nm, Temperatur: 37°C) gemessen.
Ergebnisse

Die so erhaltenen Fluoreszenzspektren sind in 21 gezeigt.

  • (A) Temp271: YO-271 S (25 nM) und Temp271 (25 nM) keines: YO-271 S allein
  • (B) Temp271: YO-271R (25 nM) und Temp271 (25 nM) keines: YO-271R allein

YO-271 S zeigte in Gegenwart von komplementärem Temp271 außergewöhnliche Fluoreszenzverstärkung, während die Fluoreszenzintensität von YO-271 R in Gegenwart von komplementärem Temp271 mit jener im Fall der Sonde allein vergleichbar war.

Beispiel 19

Die Schmelzpunkte der in Beispielen 14 und 15 hergestellten DNS-Sonden (YO-271R bzw. YO-271 S) wurden wie folgt gemessen.

Verfahren
  • DNA271: (5')CTCGCGGGGGCTG(3')

    Temp271: (5')GTGCCCCCGCGAG(3')
  • ➀ Eine DNS-Sonde (YO-271R oder YO-271S) oder ein synthetisches Oligomer DNA271 (Endkonzentration jeweils 1,0 &mgr;M) wurde zu einem Hybridbildungspuffer (1 × SSC, 1mM EDTA), der eine Ziel-Nucleinsäure, Temp271, enthielt, zugegeben.
  • ➁ Die Reaktionslösung wurde allmählich von 90°C auf 25°C abgekühlt, wobei die Temperatur aufgezeichnet wurde, während die UV-Absorption bei 260 nm gemessen wurde.
Ergebnisse
  • Schmelzpunkte
  • YO-271R: 62°C
  • YO-271 S: 66°C
  • DNA271: 59°C

Der Schmelzpunkt der Sonde YO-271S, die in Beispiel 18 Fluoreszenzverstärkung zeigte, war höher als der von DNA271, die nicht mit YO modifiziert war. Andererseits war der Schmelzpunkt von YO-271R, das keine Fluoreszenzverstärkung zeigte, nicht sehr von dem von DNA271 verschieden. Diese Ergebnisse zeigen Stabilisierung von doppelsträngiger DNS, die von der Sonde YO-271S bei der Interkalation des YO-Moleküls gebildet wird. Die nur für YO-271 S beobachtete außergewöhnliche Fluoreszenzverstärkung kann vermutlich der Interkalation zugeordnet werden.

Beispiel 20

Zu Verbindung 12 von 24 (15 mg, 12,8 &mgr;mol) in 2,3 ml THF wurde 2M Triethylamin-Acetat-Puffer (6,4 &mgr;l, pH 7,0) tropfenweise zugegeben, und dann wurde 0,1 M Bu4NF in THF (0,255 ml) tropfenweise zugegeben. Nach 2 Stunden wurde die Reaktionslösung mit gesättigtem wässrigem Natriumchlorid verdünnt und mit 10 ml Chloroform dreimal extrahiert. Die organischen Schichten wurden zusammengenommen und über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Reinigung des Rückstands durch Silicagel-Säulenchromatographie ergab 7 mg der Verbindung 14 von 24 in einer Ausbeute von 52%. Zum Vergleich wurde zu Verbindung 12 von 24 (9 mg, 7,7 &mgr;mol) in 1,0 ml THF, 0,1 M Bu4NF in THF (23 &mgr;l) tropfenweise zugegeben. Nach 6 Stunden wurde die Reaktionslösung mit gesättigtem wässrigem Natriumchlorid verdünnt und mit 10 ml Chloroform dreimal extrahiert. Die organischen Schichten wurden zusammengenommen und über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Reinigung des Rückstands durch Silicagel-Säulenchromatographie ergab 3 mg der Verbindung 14 von 24 in einer Ausbeute von 37%. Für einen weiteren Vergleich wurde zu Verbindung 12 von 24 (3 mg, 2,6 &mgr;mol) in 0,05 ml THF, 0,1 M Bu4NF in THF (50 &mgr;l) tropfenweise zugegeben. Nach 3,5 Stunden wurde die Reaktionslösung mit gesättigtem wässrigem Natriumchlorid verdünnt und mit 10 ml Chloroform dreimal extrahiert. Die organischen Schichten wurden zusammengenommen und über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Reinigung des Rückstands durch Silicagel-Säulenchromatographie ergab 1 mg der Verbindung 14 von 24 in einer Ausbeute von 37%.

Beispiel 21

Zu Verbindung 13 von 24 (73 mg, 55,6 &mgr;mol) in 4,5 ml THF wurde 2M Triethylamin-Acetat-Puffer (27,8 &mgr;l, pH 7,0) tropfenweise zugegeben, und dann wurde 0,1 M Bu4NF in THF (1,11 ml) tropfenweise zugegeben. Nach 1 Stunde wurde die Reaktionslösung mit gesättigtem wässrigem Natriumchlorid verdünnt und mit 10 ml Chloroform dreimal extrahiert. Die organischen Schichten wurden zusammengenommen und über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Reinigung des Rückstands durch Silicagel-Säulenchromatographie ergab 32 mg der Verbindung 15 von 24 in einer Ausbeute von 48%.

Beispiel 22

Zu Verbindung 13 von 24 (68 mg, 51,8 &mgr;mol) in 4,1 ml THF wurde THF (1,08 ml), das 0,1 M Bu4NF und 0,05 M Triethylamin-Acetat-Puffer enthielt, tropfenweise zugegeben. Nach 2 Stunden Rühren wurde die Reaktionslösung mit gesättigtem wässrigem Natriumchlorid verdünnt und mit 10 ml Chloroform dreimal extrahiert. Die organischen Schichten wurden zusammengenommen und über Magnesiumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Reinigung des Rückstands durch Silicagel-Säulenchromatographie ergab 36 mg der Verbindung 15 von 24 in einer Ausbeute von 58%.

Die Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Beispiele 20 bis 22 werden in Tabelle 4 gezeigt. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich ist, verbessert die Zugabe von Essigsäure und Triethylamin zum Zeitpunkt der TBDMS-Entfernungsreaktion mit Tetrabutylammoniumfluorid die Ausbeute um beinahe 20%, vermutlich weil Essigsäure und Triethylamin die Acidität und Basizität des Reagens Tetrabutylammoniumfluorid moderierte und dadurch die Entstehung von Zersetzungsprodukten unterdrückte.

Tabelle 4

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, eine Nucleinsäure-Sonde mit einem in der Mitte der Nucleinsäuresequenz über einen Aminoalkylphosphonat-Linker als Markierung befestigten Interkalator zu erhalten. Insbesondere wird erstmals berichtet, dass es möglich ist, eine Nucleinsäure-Sonde mit einem in der Konfiguration verschiedenen Phosphoratom durch Verwendung der Unterschiede der Rf-Werte zu erhalten.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven Dinucleotids der Formel (1)
    wobei das Verfahren Umsetzen eines phosphonischen Nucleotids der Formel (2)
    mit einem Nucleosid der Formel (3)
    um ein Dinucleotid der Formel (4)
    zu ergeben, und optisches Trennen des Dinucleotids umfasst,

    wobei P* ein optisch aktives Phosphoratom ist, B eine beliebige Base ist, R1 eine Trifluoracetylgruppe ist, R2 eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist und R3 eine t-Butyldimethylsilylgruppe ist.
Es folgen 18 Blatt Zeichnungen






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