Warning: fopen(111data/log202003301229.log): failed to open stream: No space left on device in /home/pde321/public_html/header.php on line 107

Warning: flock() expects parameter 1 to be resource, boolean given in /home/pde321/public_html/header.php on line 108

Warning: fclose() expects parameter 1 to be resource, boolean given in /home/pde321/public_html/header.php on line 113
VERFAHREN ZUR PRÜFUNG VON IMMUNOKOMPETENZ - Dokument DE69533200T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69533200T2 29.09.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000788595
Titel VERFAHREN ZUR PRÜFUNG VON IMMUNOKOMPETENZ
Anmelder Optigenex, Inc., New York, N.Y., US
Erfinder PERO, W., Ronald, S-222 23 Lund, SE
Vertreter Anwaltskanzlei Gulde Hengelhaupt Ziebig & Schneider, 10179 Berlin
DE-Aktenzeichen 69533200
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 18.10.1995
EP-Aktenzeichen 959360553
WO-Anmeldetag 18.10.1995
PCT-Aktenzeichen PCT/IB95/01019
WO-Veröffentlichungsnummer 0096014565
WO-Veröffentlichungsdatum 17.05.1996
EP-Offenlegungsdatum 13.08.1997
EP date of grant 23.06.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.09.2005
IPC-Hauptklasse G01N 21/00
IPC-Nebenklasse G01N 33/86   C12Q 1/48   

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Prüfung menschlicher Individuen auf beeinträchtigte Immunfunktion, die das Vorhandensein von oder eine Prädisposition für Erkrankungen in Verbindung mit geschädigter Immunkompetenz indiziert. Solche Prüfungen können beispielswese diagnostisch, prognostisch sowie als Richtschnur zur Feststellung der Notwendigkeit einer vorbeugenden oder therapeutischen Behandlung für so indizierte Erkrankungen oder Zustände verwendet werden.

Insbesondere wird bei der Erfindung ein Ersatzmaß für die DNA-Reparaturaktivität auf der Grundlage des Serum/Plasma-Thiolstatus als Biomarker der menschlichen Gesundheit herangezogen. So werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren chemisch reaktive Thiole gemessen, die in natürlich vorkommenden Aminosäuren, Polypeptiden und Proteinen vorhanden sind, die in menschlichem Serum oder Plasma angetroffen werden. Mit der Konzentration dieser Thiole läßt sich die DNA-Reparaturfähigkeit und die Reaktionsbereitschaft der Immunzellen vorhersagen, und sie sind daher hilfreiche Indikatoren für das Fortschreiten von Erkrankungen, bei denen beeinträchtigte Immunfunktion eine wesentliche Komponente der Krankheit ist. HIV-Infektion, AIDS, Krebs und Autoimmunstörungen sind Beispiele für Krankheiten, bei denen immunologische Komponenten vorliegen.

Das europäische Patent Nr. 0 229 674 sowie mehrere kürzlich veröffentlichte Schriften (Pero et al., Carcinogenesis 6, 1055–58, 1985; Pero et al., Mutation Res. 142, 69–73, 1985; Pero et al., Carcinogenesis 10, 693–97, 1989; Pero et al., Carcinogenesis 10, 1657–64, 1989) offenbaren, daß die DNA-Reparatur im allgemeinen und insbesondere die quantitative Bestimmung von Adenosindiphosphatribosyltransferase (ADPRT) ein brauchbarer Endpunkt zur Abschätzung von Gesundheitsrisiken beim Nachweisen, Verhüten und Behandeln von chronischen altersbedingten Erkrankungen wie etwa Krebs, für Krebs prädisponierende Zustände und Autoimmunkrankheiten ist. In einem weiteren Aspekt wurde gezeigt, daß die zelluläre ADPRT-Aktivität mit der Reaktionsbereitschaft der Immunzellen in Zusammenhang steht (Scouvassi et al., Carcinogenesis 8, 1295–1300, 1987; Pero et al., J. Neurosurg. 77, 601–06, 1992; Johnstone und Williams, Nature 300, 368–79, 1982; Johnson et al., Int. J. Biochem. 22, 67–73, 1990), und von diesen beiden Parametern wurde gezeigt, daß sie durch das zelluläre Reduktions-/Oxidations-Gleichgewicht (Redoxgleichgewicht) moduliert werden, von dem angenommen wird, daß es seinerseits durch das Thiol-haltige Peptid Glutathion vermittelt wird (Pero et al., Cancer Det. Prevent. 14, 555–61, 1990; Pero et al., Cancer Res. 50, 4619–25, 1990; Fidelius et al., Exp. Cell Res. 170, 269–75, 1987; Fidelius und Tsan, Immunology 61, 503–08, 1987; Fischman et al., J. Immunol. 127, 2257–62, 1981; Hamilos und Wedner, J. Immunol. 135, 2740–47, 1985).

Glutathion ist im millimolaren Bereich in den Zellen vorhanden (Kosower, Int. Rev. Cytol. 54, 109–60, 1978; Meister, Science 220, 472, 1983) und wird als solches als das primäre zelluläre Reduktionsmittel angesehen, das die Zellen vor oxidativer zellulärer Verletzung schützt. Die Glutathion-Spiegel in menschlichem Serum/Plasma (d. h., 2 bis 27 &mgr;mol/Liter bei Buhl et al., The Lancet, 1294–98, 2. Dezember 1989; Ayers et al., Anal. Biochem. 154, 186–93, 1986) stellen nur den kleineren Teil der gesamten vorhandenen reaktiven Thiol-Gruppen dar, da die Proteine im Serum/Plasma die Hauptlieferanten für reaktive Thiol-Gruppen bilden (d. h., 113–133 &mgr;mol/Liter bei Ellman, Arch. Biochem. Biophys. 82, 70–77, 1959; und Ayers et al., Anal. Biochem. 154, 186 93, 1986). Das Fachwissen lehrt daher, daß es wenigstens zwei unterschiedliche Klassen von Thiolen im Serum/Plasma und in anderen biologischen Geweben gibt, nämlich Proteinthiole und Nichtproteinthiole. Eine Durchsicht der Literatur belegt, daß herkömmliche Verfahren zur Analyse von Serum/Plasma-Thiolen in Verbindung mit Folgen für die menschliche Gesundheit auf der Analyse von Nichtproteinthiol-Quellen wie etwa Glutathion oder Cystein beruhen, wobei die Proteinthiole durch das Analysenverfahren von der Analyse ausgeschlossen oder durch Ausfällen mit Agenzien wie etwa Trichloressigsäure, Metaphosphorsäure, Sulfosalicylsäure oder Perchlorsäure abgetrennt werden, ehe eine Analyse der Nichtproteinthiole vorgenommen wird (Beutler und Gelbert, J. Lab. Clin. Med. 105, 581–04, 1985; Buhl et al., The Lancet, 1294–98, 2. Dezember 1989; Eck et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 370, 101–81, 1989; Burgunder et al., Eur. J. Clin. Invest. 18, 420–24, 1988; Burgunder und Lauterburg, Eur. J. Clin. Invest. 17, 408–14, 1987; Mimi☐-Oka et al., Biochem. Med. Met. Biol. 39, 48–54, 1988; Mårtensson, Metabolismus 35, 118–21, 1986,. Vendemiale et al., J. Hepatology 9, 359–65, 1989). Die Nichtproteinthiol-Analyse biologischer Proben hat sich als Standardanalysenverfahren hauptsächlich aufgrund der starken wissenschaftlichen Überzeugung entwickelt, daß Glutathion, ein Nichtproteinthiol, das primäre zelluläre Reduktionsmittel ist, das die Zellen gegen die gesundheitsschädlichen Auswirkungen von Verletzungen durch Oxidantien schützt (Meister, Science 220, 472, 1983).

Es wurde postuliert, daß die oxidative zelluläre Schädigung ein wichtiger Faktor ist bei (i) der Alterung (Harmon, Age 7, 111–31, 1984), (ii) Diabetes (Wilson et al., Diabetologia 27, 587–91, 1984), (iii) der Arzneimittelresistenz (Spitz et al., J. Cell Physiol. 156, 72–9, 1993), HIV+/AIDS (Baruchel und Wainberg, J. Leuk. Biol. 52, 111–14, 1992), (iv) der Auslösung und Förderung von Krebs (Marnett, Carcinogenesis 8, 1345–73, 1987; Cerutti, Science 227, 375–81, 1985), (v) der Ätiologie von kardiovaskulären und Autoimmunkrankheiten (Cross et al., Ann. Int. Med. 107, 526–45, 1987) und (vi) der Modulation der Immunfunktion (Carson et al., J. Exp. Med. 163, 746–51, 1986). Die meisten dieser Beweise stammen aus der Auswertung des oxidativen Streß durch Vergleichen von Zellen mit Glutathion-Mangel und solchen mit genügend Glutathion. Beispielsweise wurde gezeigt, daß Mangel an Glutathion (oder Cystein, dessen synthetischer Vorläufer) (i) Zellen zu erhöhter Empfindlichkeit gegenüber Schädigung der DNA prädisponiert (Edgren et al., Int. J. Rad. Biol. 40, 355–63, 1985; Valis, The Lancet 337, 918–19, 1991), (ii) die DNA-Reparatur hemmt (Pero et al., Cancer Res. 50, 4619–25, 1990; Edgren und Revesz, Int. J. Rad. Biol. 48, 207–12, 1985), oder (iii) zu Defekten bei der Immunantwort von Zellen führt (Harmlos und Wedner, J. Immunol. 135, 2740–47, 1985; Fischman et al., J. Immunol. 127, 2257–62, 1981; MacDermott et al., Immunology 57, 521–26, 1986; Droege et al., Immunobiology 172, 151–56, 1986; Stacey und Craig, Experienta 45, 180–81, 1989). Mit anderen Worten: das Fachwissen lehrt, daß die Nichtproteinthiol-Komponente der wichtige Faktor ist, der die oxidative Zellschädigung mit der Entwicklung einer Erkrankung am Menschen in Verbindung bringt, und die Proteinthiol-Komponente, die in biologischen Proben mengenmäßig dominiert, keine direkte oder regulatorische Bedeutung für die gesundheitlichen Folgen eines Redox-Ungleichgewichts hat, und sofern sie überhaupt irgend etwas indiziert, ist es eine indirekte und unspezifische Abschätzung gegenüber der größeren regulatorischen Rolle der Nichtproteinthiol-Komponente.

Weitere Beweise für diese Interpretation sind der medizinischen Literatur zu entnehmen, wo Serum/Plasma-Thiole zur Überwachung von Gesundheitsstörungen eingesetzt werden. Bösartige Erkrankungen (Beutler und Gelbert, J. Lab. Clin. Med. 105, 581–84, 1985), chronische Niereninsuffizienz (Mimi☐-Oka et al., Biochem. Med. Met. Biol. 39, 48–54, 1988), Glucose-vermittelte Insulin-Sekretion (Ammon et al., Diabetologia 32, 797–800, 1989), Aufnahme von Ethanol (Burgunder et al., Eur. J. Clin. Invest. 18, 420–24, 1988; Vendemiale et al., J. Hepatology 9, 359–65, 1989), Fasten (Mårtensson, Metabolism 35, 118–21, 1986), HIV-Infektion (Buhl et al., The Lancet, 1294–98, 2. Dezember 1989), AIDS (Eck et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 370, 101–08, 1989) und Zirrhose (Burgunder und Lauterburg, Eur. J. Clin. Invest. 17, 408–14, 1987) stehen für nahezu alle medizinischen Zustände, bei denen Serum/Plasma-Thiole erfolgreich zur Überwachung von Gesundheitsstörungen eingesetzt werden. In allen Fällen wurden Serum/Plasma-Nichtproteinthiole wie etwa Glutathion oder Cystein abgeschätzt, und es wurde große Sorgfalt darauf verwandt, die Proteinthiole vom Analysenverfahren auszuschließen. Diese Daten zeigen klar, daß es für einen Fachmann nicht offensichtlich war, Serum/Plasma-Proteinthiole in die Analysen miteinzubeziehen, oder daß sie genausogute oder gar bessere Indikatoren für gesundheitliche Folgen von oxidativem Streß sein könnten wie bzw. als Nichtproteinthiole.

Kongestive Herzinsuffizienz (Belch et al., Br. Heart J. 65, 245–48, 1991) und Rheumatoidarthritis (Pullar et al., Br. J. Rheumat. 26, 202–06, 1987) sind die einzigen in der wissenschaftlichen Literatur anzutreffenden Ausnahmen, wo sowohl Serum/Plasma-Protein- als auch Nichtproteinthiole in die Endanalysen miteinbezogen werden. Aus der Logik hinter diesen Ausnahmen ergab sich jedoch kein Hinweis darauf, daß die gesamten Serum/Plasma-Protein- und Nichtproteinthiole ein besserer Indikator für die gesundheitlichen Folgen einer oxidativen zellulären Schädigung waren als die Serum/Plasma-Nichtproteinthiole. Hingegen wurde in diesen Studien postuliert, daß aufgrund dessen, daß Serum/Plasma-Albumin ein wichtiger Faktor bei diesen Erkrankungen sei und Albumin die Protein-Hauptkomponente von Serum/Plasma ist und zahlreiche Thiol-Funktionen enthält, folgen würde, daß die Bestimmung der gesamten Serum/Plasma-Protein- und Nichtproteinthiole ein effektives Ersatzmaß für den Oxidationszustand von Album sei. Die Einbeziehung von Nichtproteinen wie Glutathion oder Cystein und anderen Proteinen als Albumin in die Serum/Plasma-Thiolanalyse ergab keinen weiteren merklichen methodologischen Vorteil, auch wenn sie in die Endanalysen einbezogen wurden und die Bestimmung der Albumin-Thiole verunreinigten.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung befaßt sich allgemein mit der Bereitstellung eines Verfahrens zur Prüfung der Immunkompetenz eines Individuums, umfassend die Schritte: Gewinnung einer Blutprobe eines zu prüfenden Individuums; Bestimmung eines Werts für die gesamten Plasma/Serum-Thiole aus dieser Probe, darunter sowohl die Proteinthiole als auch Nichtproteinthiole, für das Individuum; und Vergleichen des so bestimmten Werts mit einem Bezugswert für die gesamten Plasma/Serum-Thiole, um zu ermitteln, ob der so bestimmte Wert höher oder niedriger als der Bezugswert ist, wobei mit einem Bestimmungswert, der niedriger als der Bezugswert ist, bei dem Individuum das Vorliegen einer beeinträchtigten Immunfunktion identifiziert wird, die für die Erkennung, Verhütung oder Behandlung von gesundheitlichen Störungen bedeutsam ist.

Die Erfindung umfaßt die unerwartete Entdeckung, daß bei Einbeziehung der quantitativen Analyse der Proteinthiole in das Serum/Plasma-Analysenverfahren eine hochsignifikante Beziehung zur Funktion der zellulären DNA-Reparatur, bestimmt als ADPRT-Aktivität, bei immunkompetenten einkernigen Leukozyten besteht. Da mit der DNA-Reparatur und insbesondere der ADPRT-Aktivität die Zellfunktionen als Reaktion auf eine oxidative Zellschädigung bestimmt werden, mit denen sich das Risiko von Immundysfunktionen und altersbedingten Krankheiten vorhersagen lassen, wie bereits in den vorstehend erörterten Veröffentlichungen dokumentiert wurde, belegt diese Entdeckung, daß die gesamten (d. h., Protein- und Nichtprotein-) Serum/Plasma-Thiole als quantitative Ersatzanalyse für die Bestimmung von DNA-Reparatur, Immunfunktion und Gesundheitsrisiko bei der Erkennung, Verhütung und Therapie von Erkrankungen am Menschen dienen. Daher haben Analysen des gesamten Serum/Plasma-Sulfhydryls verbesserte Empfindlichkeit und biologische Relevanz gegenüber Analysenverfahren, bei denen nur die Serum/Plasma-Nichtproteinthiole wie etwa Glutathion bestimmt werden.

Bei der Erfindung wird in Betracht gezogen, den gesamten Anteil der Serum/Plasma-Thiolgruppen, die in den Protein- und Nichtprotein-Komponenten vorhanden sind, zu messen und den Thiol-Anteil mit der DNA-Reparatur, Immunfunktion und mit der Erkennung, Verhütung und Behandlung von Erkrankungen am Menschen wie etwa Krebs, AIDS, Autoimmun- und kardiovaskulären Störungen in Zusammenhang zu stellen. Zwar ist die Erfindung in ihren allgemeineren Aspekten nicht auf spezielle Verfahren zur Bestimmung der gesamten Serum/Plasma-Thiole beschränkt, doch können in beispielhaften Ausführungsformen der Erfindung die gesamten Serum/Plasma-Thiole in einfacher Weise bestimmt werden mit Hilfe von spektrophotometrischen oder fluorimetrischen Verfahren unter Entwicklung von Chromophoren nach Reaktion mit Thiolen unter Verwendung von aromatischen Disulfiden wie DTNB (5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure), organischen oder anorganischen Oxidationsmitteln wie etwa Iodosobenzoesäure, Diphenylpicrylphenylhydrazin, Benzofuroxan, 4,4'-Dimethylaminodiphenylcarbinol, Chinone, Trinitrobenzolsulfonsäure, Nitroprussid, Cyanoferrat(III), Kupfer(II), Permanganat, Iod, Quecksilber-Verbindungen, salpetrige Säure, Maleinimide, Halogenide, Platinsalze, Palladium-Ionen, Fluorbenzoxadiazol-Derivate, oder einer Papainthiol-empfindlichen p-Nitranilid-Reaktion (Jocelyn, Methods in Enzymology 143, 44–67, 1987; Imai, Methods in Enzymology 143, 6775, 1987; Ayers et al., Anal. Biochem. 154, 186–93, 1986; Singh et al., Anal. Biochem. 213, 49–56, 1993). Die Konzentration des des chromophoren Agens, der pH, die Inkubationszeit der Reaktionsmischung und der Denaturierungszustand der Proteinstruktur mit Agenzien wie etwa Natriumdodecylsulfat, Harnstoff oder Guanidiniumchlorid sind bekannte Variablen, die die Quantifizierung der Thiole beeinflussen, und sollten als solche für das jeweilige chromophore Agens optimal gesteuert werden und nicht als Grundlage für die Einschränkung des Umfangs dieser Erfindung dienen.

In einem weiteren Aspekt dieser Erfindung wird vorgeschlagen, die ADPRT-Aktivität mit dem Serum/Plasma-Thiolgehalt in Beziehung zu setzen. Dies wird logisch und theoretisch umgesetzt, indem man sich die Tatsachen zunutze macht, daß ADPRT ein Thiol-haltiges Protein ist und wenigstens einige der Thiole in der Zink-bindenden Domäne des Enzyms anzutreffen sind, die wiederum dessen Beteiligung an der DNA-Reparatur steuert (Mazen et al., Nucleic Acids Res. 17, 4689–98, 1989).

Daher wird die ADPRT-Aktivität durch das zelluläre Reduktions-/Oxidations-Gleichgewicht sehr stark hoch- und herunterreguliert, das wiederum durch den Thiol-Status reguliert und überwacht wird (Pero et al., Cancer Res. 50, 4619–25, 1990). Weiterhin zeigt sich, daß es eine natürliche Produktion von ADPRT-Hemmern über normale metabolische zelluläre Prozesse gibt, die die DNA-Reparatur und die Immunzellenfunktion hemmen können. Diese Substanzen wurden als HOCl und N-Chloramine identifiziert, die bekannte Oxidationsmittel für Thiol sind (Schraufstatter et al., J. Clin. Invest. 85, 554–62, 1990). Es zeigt sich auch, daß die meisten der gesamten Serum/Plasma-Thiole mit N-Chloraminen chemisch reagieren, und dieser Parameter kann als solcher als Ersatzindikator für die endogene zelluläre Produktion von HOCl/N-Chloraminen herangezogen werden. Da die als Nebenprodukte des zellulären Metabolismus produzierten HOCl/N-Chloramine auch die DNA-Reparatur (Van Rensberg et al., Free Radic. Biol. Med. 11, 285–91, 1991) und Immunfunktion hemmen, werden mit den Serum/Plasma-Thiolen, die mit HOCl/N-Chloraminen reagieren, ebenfalls die funktionellen gesundheitlichen Folgen bei oxidativ gestreßten Zellen gemessen, die bei Störungen am Menschen wie etwa Altern, Autoimmunität, kardiovaskuläre Erkrankungen, Diabetes, Arzneimittelresistenz und HIV-Infektion auftreten können.

Es gibt bekannte unterschiedliche Klassen der ADPRT-Aktivität, nämlich konstitutive, induzierte und aktivierte ADPRT-Aktivität. Schädigung der DNA ist ein notwendiger Cofaktor, der die enzymatische Aktivität von ADPRT antreibt (Satoh und Lindahl, Nature 356, 356–58, 1992). Der konstitutive ADPRT-Anteil ist Ausdruck der eigenen bzw. der enzymatischen Aktivität im Gleichgewichtszustand als Reaktion auf endogene zelluläre Auslöseranteile einer DNA-Schädigung. Allerdings läßt sich die ADPRT-Aktivität durch exogene Zufuhr DNA-schädigender Agenzien auf maximales Niveau der ADPRT-Aktivität aktivieren, etwa indem Zellen oxidativ gestreßt werden durch Einwirkung reaktiver Sauerstoff-Spezies, die durch. Phagozyten oder chemische Agenzien gebildet werden (Pero et al., Cancer Det. Prevent. 14, 555–61, 1990). Folglich läßt sich die induzierte ADPRT-Aktivität, (z. B. als Reaktion auf oxidativen Streß) durch Subtrahieren der konstitutiven ADPRT-Aktivität von der aktivierten ADPRT-Aktivität errechnen. Diese Erfindung umfaßt auch die Entdeckung, daß, wenn die ADPRT-Aktivität durch DNA-Schädigung aktiviert und entweder als aktivierter oder induzierter ADPRT-Anteil gemessen wird, die Plasmathiol-Spiegel bei paralleler Bestimmung mit den gleichen Blutproben, die zur Gewinnung der Plasmaproben verwendet werden, eine signifikante Abschätzung der enzymatischen Aktivität der ADPRT von einkernigen Leukozyten ergeben.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der nachstehend gegebenen ausführlichen Beschreibung zusammen mit den begleitenden Zeichnungen deutlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 ist eine graphische Darstellung, in der die PMA-induzierte ADPRT in 1·106 HML und die zelluläre Produktion von HOCl gegen die Inkubation mit Neutrophilen aufgetragen ist;

2 ist eine graphische Darstellung in zwei Teilen, in der die PMA-induzierte ADPRT-Aktivität in HML gegen &mgr;M Chloramin T bzw. HOCl aufgetragen ist;

3 ist eine dreiteilige graphische Darstellung, in der die Extinktionseinheiten bei 412 nm gegen die H2O2-aktivierte ADPRT für die gesamten Plasma-Thiolgruppen, N-Chloramin-unempfindliche Plasma-Thiolgruppen und N-Chloramin-empfindliche Plasma-Thiolgruppen aufgetragen sind;

4 ist eine weitere graphische Darstellung ähnlich 3; und

5 ist eine graphische Darstellung, die einen Serumthiolersatz-ADPRT-Test für HIV-positive und HIV-negative Patientengruppen veranschaulicht.

Ausführliche Beschreibung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Prüfung der Immunkompetenz eines menschlichen Individuums umfaßt die Schritte: Gewinnung einer Blutprobe eines zu prüfenden Individuums; Analysieren der Probe zur Bestimmung eines Werts für die gesamten Serum/Plasma-Thiole (Protein + Nichtprotein) für das Individuum; und Vergleichen des so bestimmten Werts mit einem Bezugswert, um zu ermitteln, ob der so bestimmte Wert höher oder niedriger als der Bezugswert ist, wobei ein Bestimmungswert, der niedriger als der Bezugswert ist, angibt, daß die Immunfunktion des Individuums beeinträchtigt ist.

Das Verfahren umfaßt typischerweise zunächst die Gewinnung einer Serum- oder Plasmaprobe aus der erhaltenen Blutprobe und die Bestimmung eines Werts für die Gesamtthiole (d. h., sowohl Proteinthiole als auch Nichtproteinthiole) in der Serum- oder Plasmaprobe mit Hilfe eines spektrophotometrischen oder fluorimetrischen Verfahrens unter Entwicklung von Chromophoren nach Reaktion mit Thiolen unter Verwendung eines geeigneten chromophoren Agens, wie vorstehend erörtert. Solche Verfahren sind an sich in der Fachwelt wohlbekannt, liefern eine Messung oder Ablesung, z. B. in Extinktionseinheiten bei 412 nm, die einen Bestimmungswert für die gesamten Plasma/Serum-Thiole des Individuum darstellt.

Der Bestimmungswert wird dann mit einem Bezugswert verglichen, um anzuzeigen, ob das zu prüfende Individuum je nachdem, ob der Bestimmungswert der gesamten Serum/Plasma-Thiole des Individuums unter oder über dem Bezugswert liegt, eine beeinträchtigte Immunfunktion aufweist oder nicht. Gemäß vorliegender Erfindung wurde nun also gefunden, daß es bei jedem Verfahren zur Analyse der gesamten Serum/Plasma-Thiole (Protein + Nichtprotein) eines Individuums einen Bezugswert gibt, wobei ein Bestimmungswert für die gesamten Serum/Plasma-Thiole eines Individuums unter diesem Bezugswert angibt, daß die Immunfunktion des Individuums beeinträchtigt ist.

Die Ermittlung eines geeigneten Bezugswerts, der als Indikator für beeinträchtigte Immunfunktion dienen soll, wird dem Fachmann aus der obigen Beschreibung ohne weiteres klar sein. Beispielsweise kann der Bezugswert ermittelt werden durch Prüfung einer Anzahl von Individuen mit bekannter Immunkompetenz (beeinträchtigt und nicht beeinträchtigt), um einen Bereich von werten für die gesamten Serum/Plasma-Thiole dieser Individuen zu bestimmen, und Identifizieren der Untergrenze dieses Bereichs (oder Auswählen eines damit in Zusammenhang stehenden Punktes, um ein gewünschtes Konfidenzniveau bei der Bestimmung der beeinträchtigten und nicht beeinträchtigten Immunfunktion zu ergebe) als Bezugswert. Ein solcher Bezugswert ist in dem nachstehend beschriebenen Beispiel 5 als Untergrenze der gesamten Serum-Thiole einer Patientengruppe HIV– (normale Immunkompetenz) dargestellt. 5, worin die in Beispiel 5 erhaltenen Daten dargestellt sind, zeigt, daß einige der getesteten HIV+ Patienten Bestimmungswerte der gesamten Serum-Thiole über diesem Bezugswert und andere Bestimmungswerte der gesamten Serum-Thiole unter dem Bezugswert aufwiesen. Innerhalb des Untersuchungszeitraums traten nur in der letzteren Gruppe der HIV(+)-Patienten (unter dem Bezugswert) Todesfälle auf, nicht aber in der ersteren Gruppe der HIV(+)-Patienten (über dem Bezugswert), was die Korrelation zwischen beeinträchtigter Immunfunktion und Bestimmungswerten der gesamten Serum-Thiole unter dem Bezugswert unterstreicht.

Eine beispielhafte Anwendung für das vorliegende Verfahren ist die als Leitlinie für eine Entscheidung, ob ein bestimmter Patient auf die so festgestellten Zustände oder Folgen der beeinträchtigten Immunfunktion zu behandeln ist. Zum Beispiel im Falle der anhand Beispiel 5 dargestellten HIV(+)-Patienten könnten diejenigen mit Bestimmungswerten der gesamten Serum-Thiole unter dem Bezugswert (verkörpert durch etwa 0,25 Extinktionseinheiten bei 412 nm) sofort einer solchen Behandlung unterzogen werden, während diejenigen mit Werten der gesamten Serum-Thiole über dem Bezugswert – ein Indiz für noch nicht beeinträchtigte Immunkompetenz – noch keiner Behandlung bedürften.

In einem besonderen Aspekt kann das erfindungsgemäße Verfahren als Ersatzmaß für induzierte ADPRT-Aktivität herangezogen werden, die selbst ein Indikator für das Vorhandensein oder eine Prädisposition für DNA-assoziierte Erkrankungen ist, wie zum Beispiel im europäischem Patent Nr. 0 229 674 beschrieben.

Die Erfindung soll anhand der nachstehend ausgeführten Beispiele näher beschrieben werden, wobei die folgenden speziellen Verfahren angewandt wurden:

Vorbereitung der Blutkomponenten

Proben peripheren Blutes (n = 225) von augenscheinlich gesunden Freiwilligen, Patienten mit Prädisposition für Krebs und Krebspatienten wurden durch Veneneinstich erhalten und in heparinisierten Vakuumbehältern (143 USP-Einheiten/10 ml Röhrchen) gesammelt. Die Blutproben wurden zunächst 10 min bei 100 × g zentrifugiert, und das plättchenreiche Plasma wurde mit einer Pasteur-Pipette abgezogen. Das plättchenarme Plasma, das bei diesen Experimenten verwendet werden sollte, wurde durch 25minütiges Zentrifugieren des plättchenreichen Plasmas bei 400 × g präpariert, um die Plättchen zu pelletisieren. Als nächstes wurde das ursprüngliche Volumen der Blutproben durch Zugabe physiologischer Salzlösung wiedergeherstellt, und dann wurden sie vorsichtig auf ein handelsübliches Dichtepolster geschichtet (1,077 g/ml, Organon Teknika), ehe 25 min bei 400 × g geschleudert wurde. Die humanen mononukleären Leukozyten (HML) wurden aus der Interphasenzone des Dichtegradienten isoliert, durch Zentrifugieren mit RPMI 1640-Medium gewaschen, und die Zelldichte wurde in der üblichen Weise für die Kultivierung in vitro eingestellt. Wurden sowohl HML als auch Neutrophile benötigt, so wurden die Zellfraktionen gleichzeitig isoliert, indem die Blutprobe auf Neutrophil-Isolierungsmedium (Cardinal Associates) geschichtet wurde und alle Schritte in der Dichtegradientenisolierung mit Krebs-Ringer-Phosphatpuffer mit Glucose (KRPG, pH = 7,4) nach dem Verfahren von Nathan durchgeführt wurden (J. Clin. Invest. 80, 1550–60, 1987).

Zytotoxizität

Ungeachtet der für die Blutzellenfraktionierung angewandten Isolierungsmethode wurden die HML stets in mit RPMI 1640-Medium ergänztem 10–20% Serum oder Plasma resuspendiert, pelletisiert und dann nochmals entweder in physiologischer Salzlösung oder KRPG-Puffer für die Behandlung entweder mit HOCl oder Chloramin T (Sigma) resuspendiert. Die HOCl-Konzentration wurde aus der e235 = 100 M–1cm–1 bestimmt. Die Zytotoxizität wurde überwacht durch zellulären Ausschluß von Trypanblau (0,2% isotonische Lösung + 5% Serum) nach 15 min Inkubation mit dem Farbstoff bei 37°C. Die Zytotoxizität von HOCl und N-Chloraminen ist wohlbekannt (Schraufstatter et al., J. Clin. Invest. 85, 554–62, 1990). Es war also wichtig, zu bestimmen, daß etwaige, durch diese Agenzien induzierten biochemischen Auswirkungen auf die ADPRT-Aktivität nicht mit akuter Zytotoxizität in Verbindung standen. Die experimentellen Bedingungen, die vorstehend umrissen und zur Gewinnung der hierin berichteten Daten angewandt wurden, waren nicht akut zytotoxisch.

HOCl-Messung

Gemischte Kulturen aus HML + Neutrophilen wurden auf Produktion von HOCl im extrazellulären konditionierten Medium analysiert durch Entfernen der Zellen mittels Zentrifugation nach der Inkubationszeit und sofortiges Abfangen des gebildeten HOCl mit Taurin (20 mM). Das Taurinchloramin wurde dann mit Hilfe der Umwandlung von I in I2 spektrophotometrisch quantifiziert (E = 2,29·104 M–1cm–1). Die Einzelheiten dieses Verfahrens sind beschrieben von Weiss et al. (J. Clin. Invest. 70, 598–607, 1982).

ADPRT-Assay

Das Verfahren war eine Anpassung der Technik der permeabilisierten Zellen von Berger (Methods Cell Biol. 20, 325–340, 1988) mit den vorstehend beschriebenen Abwandlungen (Pero et al., Carcinogenesis 10, 1657–64, 1989). Doppelproben von 1·106 HML wurden in Gegenwart von 0 bis 4·106 Neutrophilen in 1 ml KRPG-Puffer 30 min bei 37°C in Gegenwart von PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat, 25 ng/ml) kultiviert. Nach dieser gemeinsamen Inkubation wurden die Mischungen der HML + Neutrophile durch Zentrifugation geerntet, permeabilisiert, und die ADPRT-Aktivität wurde mittels radiometrischer Verfahren bestimmt wie anderswo im einzelnen beschrieben (Pero et al., Carcinogenesis 10, 1657–64, 1989). Bei anderen Experimenten wurden HML-Doppelproben von 1·106 pro ml KRPG-Puffer direkt mit 0–100 &mgr;M-Dosisbereichen HOCl oder Chloramin T 30 min bei 37°C behandelt, woran sich unmittelbar eine Behandlung mit einer standardisierten Dosis PMA (25 ng/ml) über weitere 30 min anschloß, ehe die ADPRT-Aktivität wie vorstehend erwähnt analysiert wurde.

Bestimmung von Plasma/Serum-Thiol

Plasmaproben wurden aus den gleichen heparinisierten Blutproben entnommen, die zur Bestimmung der Poly-ADPRT-Aktivität einkerniger Leukozyten verwendet worden waren. Die Proben wurden bis zur Analyse unter flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Jede Plasmaprobe wurde aufgetaut und bei 2000 × g zentrifugiert, um etwaiges ausgefälltes Fibrin zu sedimentieren. 2 ml 20% Plasma in Wasser (d. h., 4 : 1-Verdünnung von Plasma mit Wasser) wurden vorbereitet, und es wurden 30 &mgr;l 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure) (DTNB) zugesetzt als 9,5 mg/ml-Lösung, gelöst in 0,1 M K2HPO4, 17,5 mM EDTA, pH 7,5. Die Mischung wurde 1 h bei Raumtemperatur reagieren lassen, und zu diesem Zeitpunkt wurden die Extinktionseinheiten bei 412 nm (A412) gemessen. In Wasser gelöstes Chloramin T (Sigma) wurde dann auf eine Endkonzentration von 40 &mgr;M zugesetzt und die A412 nach 30 min erneut abgelesen. Die gesamten Plasma-Thiole sowie die N-Chloramin-empfindlichen und nichtempfindlichen Plasma-Thiole wurden errechnet durch Subtraktion der Reagensblindwerte von den gesamten DTNB-reaktiven und N-Chloramin-reaktiven Thiolen. Bei der Studie mit HIV+ (n = 15) und HIV– (n = 13) Patienten, die im Mai 1993 begonnen worden war, wurde das gleiche Verfahren angewandt, außer daß Serumproben statt Plasmaproben analysiert wurden. Die Serumproben wurden von Benutzern intravenöser Drogen gespendet, die das Aaron Diamond Research Center wegen AIDS aufsuchten. Die Seren wurden über einen Zeitraum von Jahren präpariert und bis zur Verwendung bei dieser Studie bei –80°C biologisch konserviert.

Beispiel 1

Dieses Beispiel belegt, daß menschliche Phagozyten (d. h., Neutrophile) physiologische relevante Konzentrationen endogener ADPRT-Hemmer produzieren. Unter Bedingungen, die die Kultivierung lebensfähiger Zellen erlauben, wurde eine standardisierte Menge HML (humane mononukleäre Leukozyten, 1·106) zusammen mit steigenden Mengen an Neutrophilen von 0 bis 4·106 je Kultur inkubiert. Die Neutrophile reagieren nicht auf die Induktion der DNA-Schädigung durch Aktivierung der ADP-Ribosylierung, und so tragen diese Zellen bei der Bestimmung der ADP-Ribosylierung in diesem Experiment nichts bei (Ikai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 3682–85, 1980). Als nächstes wurde auf diese kombinierten Kulturen PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) einwirken lassen, um die ADP-Ribosylierung in HML zu aktivieren und die Produktion reaktiver Sauerstoff-Zwischenprodukte durch Neutrophile zu induzieren. Die häufigen reaktiven Sauerstoff-Zwischenprodukte Hydroxyl-Radikal, Superoxid-Anion und Wasserstoffperoxid sind bekannte Induktoren der ADP-Ribosylierung (Pero et al., Cancer Det. Prevent. 14, 555–61, 1990). Die Daten in 1 zeigen, daß, wenn die HML + Neutrophil-Verhältnisse 1 : 2 (·106 Zellen/ml) erreichten, was mit dem Anteil und der Konzentration in Blut vergleichbar ist, starke Hemmung der HML-ADP-Ribosylierung einsetzte. Der durch die PMA-Einwirkung auf die Neutrophilen induzierte respiratorische Aktivitätsschub wurde anhand der HOCl-Produktion überwacht. Daraus wurde geschlossen, daß entweder die Gegenwart von Neutrophilen oder die Produktion von etwa 80 &mgr;M HOCl oder N-Chloramin ausreichte, um eine Hemmung der HML-ADP-Ribosylierung hervorzurufen.

Beispiel 2

Die Wirkung verschiedener Dosierungshöhen an Chloramin T und HOCl auf die PMA-induzierte ADPRT-Aktivität bei HML wurde unter Anwendung der für solche Prüfungen vorstehend beschriebenen Verfahren untersucht, wobei die PMA-induzierte ADPRT-Aktivität für die den verschiedenen Dosierungen ausgesetzten HML gemessen wurde und die erhaltenen Werte mit gemessenen Kontrollwerten der PMA-induzierten ADPRT-Aktivität bei HML von der gleichen Quelle, jedoch mit Nulldosierungen an Chloramin T und HOCl verglichen wurden. Die Ergebnisse, dargestellt in 2, bestätigen, daß HOCl und N-Chloramin starke, natürlich vorkommende ADPRT-Hemmer sind, da sie > 80% Hemmung der ADPRT-Aktivität von HML (humane mononukleäre Leukozyten) bei Dosen von 80 &mgr;M hervorrufen können, und dies sind Werte, die in peripherem Blut unter Kulturbedingungen, die vernachlässigbare Zytotoxizität ergeben, ohne weiteres erreichbar sind. Dieses Beispiel, zusammen mit Beispiel 1, zeigt klar, daß ADPRT-Hemmer natürlicherweise als Nebenprodukte des respiratorischen Aktivitätsschubs von Phagozyten produziert werden, und dies ist eine normale Funktion dieser Art von Zellen, die infektiöse Erreger abtöten sollen.

Beispiel 3

Mit den vorstehend beschriebenen Verfahren wurden die Werte für die H2O2-aktivierte ADPRT-Aktivität bei HML und für die gesamten Plasma-Thiole, N-Chloramin-unempfindlichen Plasma-Thiole und N-Chloramin-empfindlichen Plasma-Thiole bestimmt, die von den gleichen Blutproben (n = 225) stammen. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Dieses Beispiel zeigt, daß sich mit Plasma-Thiolen in signifikanter Weise die Höhe der an HML (humane mononukleäre Leukozyten) bestimmten Wasserstoffperoxid-aktivierten ADPRT-Aktivität vorhersagen läßt, die von den gleichen Blutproben stammen. Des weiteren zeigt dieses Beispiel, daß die N-Chloramin-empfindlichen Plasma-Thiole eine bessere Korrelation zur HML-ADPRT-Aktivität ergeben als die N-Chloramin-unempfindlichen Plasma-Thiole und daß die meisten der N-Chloramin-empfindlichen Plasma-Thiole Plasmaproteinthiole und nicht nur Nichtproteinplasma-Thiole sind. Die beste Ersatzangabe für die ADPRT-Aktivität waren daher die gesamten Proteinplus Nichtproteinplasma-Thiole. HOCl und N-Chloramine sind wirksame Oxidationsmittel für Thiole und könnten als solche ersatzweise die ADPRT-Aktivität anzeigen. Die Logik bei der Verknüpfung der ADPRT-Aktivität mit Plasma-Thiolen beruht auf den Tatsachen, daß (1) die ADPRT durch reduziertes und oxidiertes Glutathion dosisabhängig nach oben bzw. unten reguliert werden kann (Pero et al., Cancer Res. 50, 4619–25, 1990) und (2) die ADPRT Thiol-Aminosäure-Bestandteile in der DNA-bindenden Domäne des Enzyms aufweist, die wiederum dessen Beteiligung an der DNA-Reparatur steuert (Mazen et al., Nucleic Acid Res. 17, 4689–98, 1989).

Beispiel 4

Wiederum in Anlehnung an das vorstehend beschriebene Verfahren wurden Tests durchgeführt, um die Werte der H2O2-induzierten ADPRT bei HML mit den Werten der gesamten Plasma-Thiole, N-Chloramin-unempfindlichen Plasma-Thiole und N-Chloramin-empfindlichen Plasma-Thiole aus den gleichen Blutproben zu vergleichen. Beispiel 4 erweitert das in Beispiel 3 offenbarte Wissen und zeigt, daß sich mit Plasma-Thiolen auch die Wasserstoffperoxid-induzierte ADPRT-Aktivität bei HML (humane mononukleare Leukozyten) vorhersagen läßt (4). Die Beispiele 3 und 4 lehren auch, daß, weil die Anteile aktivierter und induzierter ADPRT im allgemeinen direkt mit der DNA-Reparatur in Beziehung stehen, die Plasma-Thiole dann auch für eine Ersatzbestimmung von DNA-Reparaturreaktionen bei HML herangezogen werden können.

Beispiel 5

Zur Bestimmung der Werte der gesamten Serum-Thiole wurden die obigen Serumproben der HIV(+)- und HIV(–)-Individuen mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Plasma/Serum-Thiol-Bestimmungsverfahrens analysiert. Die Ergebnisse sind in der graphischen Darstellung von 5 gezeigt.

Beispiel 5 bestätigt, daß die Bestimmung der N-Chloramin-empfindlichen Plasma-Thiole insofern klinisch nutzbar ist, als erniedrigte Spiegel einen ADPRT-Mangel bei den HML (humane mononukleare Leukozyten) anzeigen, der zu einer Häufung von DNA-Schädigungen und zu einer Hemmung von Immunfunktionen führt, die beim Fortschreiten von HIV(+)-Infektionen zu AIDS und Tod von Bedeutung sind. Die halb ausgefüllten Quadrate stehen für die einzigen Todesfälle, die nach dem Stand von August 1993 aufgetreten sind. Die Studie wurde Mai 1993 durchgeführt.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Prüfung der Immunkompetenz eines Individuums, die Schritte umfassend:

    a) in einer Blutprobe eines zu prüfenden Individuums einen Messwert für Gesamtplasma- oder -serumthiole einschliesslich sowohl der Proteinthiole als auch der Nichtproteinthiole für dieses Individuum zu bestimmen, um einen Ersatzmesswert zur Verfügung zu stellen, der die DNA-Reparaturaktivität in diesem Individuum abschätzt, und

    b) den so bestimmten Wert mit einem Bezugswert zu vergleichen, um zu ermitteln, ob dieser so bestimmte Wert höher oder niedriger als dieser Bezugswert ist, wobei ein Bestimmungswert, der niedriger als dieser Bezugswert ist, das Individuum als im Besitz einer DNA-Reparaturaktivität befindlich identifiziert, die eine beeinträchtigte Immun-funktion anzeigt, die für eine Erkennung, Verhütung oder Behandlung von gesundheitlichen Störungen bedeutsam ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Bestimmungsschritt umfasst, von der Blutprobe eine Serum- oder Plasmaprobe abzuleiten und die Serum- oder Plasmaprobe einer Prüfung auf Gesamtthiole einschliesslich sowohl der Proteinthiole als auch der Nichtproteinthiole zu unterwerfen.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Prüfung eine spektrophotometrische oder fluorimetrische Prozedur umfasst, die die Entwicklung von Chromophoren nach einer Reaktion mit Thiolen unter Verwendung eines chromophoren Agens beinhaltet.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Individuum HIV+ ist und der Bezugswert durch die Bestimmung von. Werten für Piasma/Serum-Gesamtthiole für HIV-Individuen so festgelegt wird, dass ein Bestimmungswert, der niedriger als dieser Bezugswert ist, dieses Individuum als im Besitz einer beeinträchtigten Immunfunktion identifiziert.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Ersatzmessung eine aktivierte oder induzierte Aktivität von Adenosindiphosphat-Ribosyltransferase (ADPRT) anzeigt und der Bezugswert der Plasma/Serum-Gesamtthiole einem Bezugsniveau der ADPRT-Aktivität entspricht, bei dem das Vorhandensein einer mit DNA-Schädigung verbundenen Krankheit oder die Prädisposition dafür angezeigt ist, wenn der so bestimmte Wert niedriger als dieser Bezugswert ist.
Es folgen 5 Blatt Zeichnungen






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com