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Dokumentenidentifikation DE102004020081A1 24.11.2005
Titel Pharmazeutische Formulierungen enthaltend Pflanzeninhaltsstoffe
Anmelder Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V., 07745 Jena, DE;
kreActiv GmbH, 07745 Jena, DE
Erfinder Hertel, Waltraud, Dr.rer.nat., 07751 Jena, DE;
Härtl, Albert, Dr.rer.nat., 07749 Jena, DE;
Müller, Peter-Jürgen, Dr.rer.nat., 07745 Jena, DE;
Carl, Roswitha, Dr., 07747 Jena, DE;
Hofmann, Detlef, Dr., 99869 Grabsleben, DE
DE-Anmeldedatum 22.04.2004
DE-Aktenzeichen 102004020081
Offenlegungstag 24.11.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 24.11.2005
IPC-Hauptklasse A61K 35/78
IPC-Nebenklasse A61P 39/00   A23L 1/30   A21D 13/00   
Zusammenfassung Neue Wirksubstanzen aus Pflanzen (Phytowirkstoffe) für den Einsatz in pharmazeutischen Formulierungen sind von zunehmendem Interesse.
In diesem Zusammenhang wurde gefunden, dass Bestandteile der Pflanzen Diodia scandens und/oder Byrsocarpus coccineus beide Isoformen (COX-1 und COX-2) der Cyclooxygenasen (EC 1.14.99.1) inhibieren und gleichzeitig kräftige antioxydative Wirkung aufweisen. Der Einsatz der Pflanzenbestandteile bzw. der Inhaltsstoffe in pharmazeutischen Formulierungen wird vorgeschlagen.

Beschreibung[de]

Die Erfindung kann überall dort angewendet werden, wo durch die Anwendung von Hemmern bzw. Inhibitoren der Cyclooxygenase (COX) und von Substanzen mit antioxydativer Wirkung (Antioxydantien) die Gesundheit von Mensch und Tier gefördert wird. Wirksubstanzen aus Pflanzen (Phytowirkstoffe) werden bereits in steigendem Maß als Nahrungsergänzer mit die Gesundheit fördernden Eigenschaften sowie in der Kosmetik und als Phytoarzneimittel extrakorporal und intrakorporal eingesetzt. Die Wirkungsmechanismen der Phytowirkstoffe sind jedoch nicht klar definiert. Die vorliegende Erfindung beschreibt Pflanzeninhaltsstoffe für den pharmazeutischen/kosmetischen/nutritiven Einsatz, die eine spezifische Wirkung als Cyclooxygenase (COX) – Inhibitoren und als Antioxidantien aufweisen.

Cyclooxygenase-Inhibitoren inhibieren die Cyclooxygenasen (EC 1.14.99.1), die in zwei Isoformen (COX-1 und COX-2) vorkommen. Die zu dieser Enzymgruppe gehörenden Enzyme katalysieren als Schlüsselenzyme den ersten Schritt der Biosynthese von Prostaglandinvorstufen, den Prostaglandinen (PG) wie Endoperoxide, Thromboxane und Prostazyklinen aus Arachidonsäure. Sie werden auch als Prostaglandin-H-Synthetasen bezeichnet. Die Prostaglandine bewirken bereits in geringster Konzentration sehr wirksame aber unterschiedliche physiologische und pathophysiologische Funktionen wie beispielsweise Schmerz Fieber und Entzündungen in Geweben und Organen. Darüberhinaus werden angiogene Aktivitäten beeinflusst.

Der Nachweis der inhibitorischen Wirkung der COX-Inhibitoren beruht darauf, dass bei Anwesenheit von COX-Aktivität und einer eine Häm-katalysierte Hydroperoxidase in Gegenwart von Arachidonsäure und Luminol entsteht.

Nichtsteroidale Antirheumatika (NSAR, englisch: NSAIDs) bzw. Antiinflammatorika unterdrücken die PG-Synthese durch Hemmung der COX-Aktivität. Die NSAIDs wirken antiinflammatorisch, analgetisch und antipyretisch. Die Isoform COX-1 produziert PGs mit homöostatischen Funktionen, wie dem Schutz der gastrointestinalen Mukosa, der Aufrechterhaltung der Thrombozytenaggregation und der Nierenfunktion. COX-1 kommt in fast allen Geweben vor.

COX-2, die induzierte Isoform, ist verantwortlich für die deutlich gesteigerte Synthese verschiedener PGs als die Ursache für die inflammatorischen Symptome, wie Cytokinfreisetzung, Gewebsödeme und Hyperalgesie. Sie wird z. B. in Makrophagen und Synovialzellen durch Entzündungen oder Mitogenstimulation induziert. Acetylsalizylsäure (Aspirin) als auch die anderen COX-1-Hemmer rufen jedoch Geschwüre des Gastrointestinaltraktes, Nierenstörungen, Bronchokonstriktionen (Analgetika-Asthma) und eine Verlängerung der Blutungszeit durch Hemmung der Thrombozytenaggregation hervor COX-1-Hemmer wie Aspirin und beispielsweise Indomethacin und Piroxicam besitzen wegen der Hemmung der Thrombozytenaggregation auch eine schützende Wirkung vor Herzinfarkt. Die magenverträglichen COX-2-Inhibitoren dagegen mindern ebenfalls entzündliche Krankheiten, schützen aber nicht vor Infarkt. Eine selektive Verminderung der PGG2-Synthese durch Inhibition der COX-2 stellt einen wirkungsvollen Ansatz zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen, darunter auch der Bildung von bösartigen Tumoren dar. Auf dem Markt befinden sich beispielsweise das synthetisch hergestellte Rofecoxib (Merck) und das Celebrex (Pfizer und Monsanto).

U.S. 5,192,753 stellt fest, dass Demenz des Menschen mit nicht steroidalen antiinflammativen Cyclooxygenase-Inhibitoren, den so genannten "non-steroid anti-inflammatory drugs (NSAIDs)" positiv beeinflusst werden kann (U.S. 5,192,753). Es handelt sich um Cyclooxygenaseinhibitoren des Typs COX-1 wie Acetylsalicylsäure und Indomethacin, welche zur Behandlung der Alzheimer-Erkrankung vorgeschlagen werden (P. L. McGeer: Cyclo-Oxygenase-2 Inhibitors Drugs & Aging 2000, 17, 1–11) und möglicherweise auch bei Parkinson (Teismann, P. und Ferger, F.: Inhibition of Cyclooxygenase isoenzymes COX-1 und COX-2 provide neuroprotection in the MPTP-mouse model in Parkinson's disease) eingesetzt werden können. COX-Hemmer können irreversibel die Cyclooxygenase hemmen, wie das Aspirin. Andere wie Ibuprofen, Piroxicam oder Mefenaminsäure wirken reversibel kompetetiv und Flurbiprofen und Indomethacin weisen eine zeitabhängige reversible Hemmwirkung auf (Dannhardt, D. und Hahn, L.: COX-2-Inhibitoren: Aktueller Stand und Ausblick. Pharmazie in unserer Zeit, 2000, 29, 100–106).

Die NSAIDs weisen unterschiedliche Spezifität auf. Z. B. beträgt die relative Spezifität bzw. das Verhältnis der Hemmwirkung COX-2/COX-1 bei Aspirin 0,006, bei Ibuprofen 0,067–1,5 und bei Rofecoxib 1000. COX-Inhibitoren aus Pflanzen wie Ambigol (Falch, B. S. et al., Planta Med., 1995, 321), aus einer Blaualge, Belacandaquinion A aus Belacanda chinensis (Fukuyama, Y. et. al., Tet. Lett., 1993, 34, 7633, 7637), Casegravol aus Casearia graveolens (Quader et al., Phytochemistry 1992, 31, 3083), Atractylochromen aus Atractylodes lancea (Resch, M. et al., J. nat. Prod., 1998, 61 347) und 8, 10, 12-Octadectriynoic acid und ihre Derivate aus Heistera acuminata (Kraus, C. M. et al., J. Nat. Prod., 1998, 61, 422), Curcumin und Boswellsäure aus Curcuma longa und Boswellia serrat (Ammon, H. P. et al., Ethnopharmacol., 1993, 38, 113) und andere aktive Inhaltsstoffe aus Boswellia carterii (Jing, Y. et al., Chin. Med. Sci. J. 1992, 7, 12) wurden beschrieben. Die Wirkstoffe aus Achillea-, Echinacea- und Anacyclus-Arten, darunter die Wirkstoffe des Zahnwurz (Pyrethri radix) und des Sonnenhuts enthalten COX-Hemmer. Aus Parthenium interifollum wurde ein Phytoextrakt mit COX-Inhibitorwirkung gewonnen (WO 9817292). DE 10200490 A1 beschreibt die intensive COX-2-Wirkung Wirkung von Teilen und Extrakten der Früchte des des Leberwurstbaumes Kigelia africana.

Der zu den Connaraceae gehörende Strauch Byrsocarpus coccineus (neuerdings Rourea coccinea) kommt im tropischen Afrika vor. Samen und Rinde werden als Einzelbestandteile komplexer Pfeilgifte in Kamerun, Togo und Liberia benutzt. Die Volksmedizin setzt Extrakte aus Wurzelrinde, Blättern und Zweigen zur Wundbehandlung, bei Muskelschmerzen, Rheuma, Rachenentzündungen, Bluthochdruck, Gelbsucht, Sterilität, Impotenz, Gonorrhöe ein. Die Stammrinde enthält Tannine und Saponine (Bonquett, A. und Debray, M., 1974: Plantes medicinales de la Cote d'Ivoire. Traveaux et Documents de I' O.R.S.T.O.M., Paris). Aus den Blättern wurden 4-Hydroxycumarin und Dicumarol isoliert (Vickery, M. L., Vickery, B., 1980: Cumarins and related compounds in members of the Connaraceae. Toxicology Letters 5, 115–118). Beide Stoffe hemmen die Blutgerinnung und werden in der Medizin als Antikoagulantien gegen Thrombosen eingesetzt. Diodia scandens ist ein schnellwachsendes, kriechendes oder kletterndes Kraut, das im tropischen Afrika weit verbreitet ist. Die Blätter enthalten Alkaloide, Saponine, Tannine und Flavonoide. Die traditionelle Medizin benutzt Extrakte aus Blättern und der Gesamtpflanze als Mundspülung bei Stomatitis, gegen Pocken, bei gastrointestinalen Beschwerden, Kolik, Magengeschwüren, Dysenterie und Bauchweh. Langason et al. wies nach, dass die intraperitonale Zufuhr eines Blätterextraktes Indomethacin- und Stress-induzierte Geschwüre in Ratten reduzierten und die Histamin-induzierten Zwölffingerdarmgeschwüre bei Meerscheinchen hemmten. Der Extrakt erniedrigt auch das Volumen und die Säurestärke der gastrischen Sekretion. 0,5 mg/ml des Extrakts blockieren vollständig die spontanen und Oxytoxin-induzierten Kontraktionen des isolierten Ratten-Uterus (Langason, R. B. F.; Akunyili, D. N.; Akubue, P. I., 1994: A preliminary study of the gastrointestinal effects of some Nigerian medicinal plants. Fitoterapia, LXV, 235–240). Die Blätter werden als Heilmittel bei Schlangenbissen angewendet. Onuaguluchi bestätigte den Gift-Hemmeffekt der Pflanze. 1,5 mg/kg Körpergewicht injizierter Extrakt schützt Mäuse vor dem tödlichen Effekt des Bisses der Schlange Echis carinatus (Onuaguluchi, G., 1989: Preliminary study of an extract from Diodia scandens on some toxic effects of Echis carinatus venom. J. Ethnopharmacology, 26, 189–196).

Die Entzündung ist eine vitale Reaktion von Zellen und Geweben. Zellfreie Testsysteme zum Nachweis entzündungshemmender (antiinflammatorisch, antiphlogistisch) Wirkungen sind deshalb als problematisch anzusehen. Dennoch wurden solche Test-Systeme für Screening-Zwecke etabliert. Die Cayman Chemical Company, USA, entwickelte "COX Inhibitor Screening Kits", die zum in vitro Nachweis der Hemmung der Enzymfamilie "Cyclooxygenasen (COX)" geeignet sind. Die Initiierung des Entzündungsprozesses erfolgt über den COX-Stoffwechselweg der Arachidonsäure, wobei die Prostaglandin (PG)-Endoperoxide PGG2 und PGH2 als Primärprodukte entstehen.

Das Testprinzip des Kits beruht darauf, dass eine Häm-katalysierte Hydroperoxidase von COX in Gegenwart von Arachidonsäure und Luminol Chemilumineszenz erzeugt, die mit einem Chemilumineszenz-Messgerät quantitativ nachweisbar ist. Arachidonsäure wird dabei über PGG2 in PGH2 umgesetzt. Es werden zwei COX-Isoenzyme identifiziert: COX-1, die konstitutive Isoform produziert PG mit homöostatischen Funktionen, wie dem Schutz der gastrointestinalen Mukosa, der Aufrechterhaltung der Thrombozytenaggregation und der Nierenfunktion; COX-2, die induzierbare Isoform, ist verantwortlich für die deutlich gesteigerte Synthese verschiedener PG, insbesondere PGE2 aus PGH2, die Ursache für die inflammatorischen Symptome, wie Cytokinfreisetzung, Gewebsödeme und Hyperalgesie ist. Eine selektive Hemmung der PGE2-Synthese, also der COX-2-Expression, stellt einen wirkungsvollen Ansatz zur Behandlung akuter und chronisch entzündlicher Erkrankungen dar.

Es ist Ziel der Erfindung, Formulierungen vorzuschlagen, die bisher nicht genutzte und auch noch nicht beschriebene pflanzliche Wirkstoffe mit COX-1 und COX-2 hemmenden Wirkung bei gleichzeitiger hoher antioxydativen Aktivität enthalten. Es wird erwartet, dass die Kombination beider Aktivitäten einen besonders günstigen Einfluss auf die gesundheitsfördernden Eigenschaften aufweist. Das Pflanzenmaterial soll in ausreichender Menge verfügbar und die Gewinnung aktiver Fraktionen soll auf einfachen Weg möglich sein. Es wurde überraschend gefunden, dass die Pflanzen Byrsocarpus coccineus und Diodia scandens ein oder mehrere Phytowirkstoffe enthalten, die als Hemmer der Cyclooxygenase-1 und Cyclooxygenase-2 bei gleichzeitig hoher antioxydativer Aktivität wirken. Diese spezielle Eigenschaft ist bisher nicht bekannt geworden. Die erfindungsgemäßen Formulierungen besitzen auch die angestrebte hohe antioxidative Wirkung. Es war überraschend und nicht voraussehbar, dass COX-inhibitorische Wirkungen und antioxydative Wirkungen gemeinsam auftreten. Beide Wirkungen sind in einem in vitro-Messsystem, wie es für den Nachweis der beiden Einzelaktivitäten verwendet wurde, vollständig unabhängig voneinander gefunden wurden.

Erfindungsgemäß werden Formulierungen für kosmetische Anwendung, als Nahrungsergänzer bzw. für nutritive Anwendungen oder als Heilmittel bei Mensch und Tier vorgeschlagen, die Bestandteile oder Inhaltsstoffe der Pflanzen Byrsocarpus coccineus und/oder Diodia scandens enthalten.

Die Verwendung der Formulierungen erfolgt überall dort, wo durch die Anwendung von Hemmern der Cyclooxygenase-1 und Cyclooxygenase-2 eine die Gesundheit und/oder das allgemeine Wohlbefinden fördernde und/oder verjüngende und/oder pflegende Wirkung erzielt werden soll. Die Wirkung bezieht sich bevorzugt auf positive Einflußnahme gegenüber Entzündungen und Schmerzen. Die für die Gesundererhaltung günstigen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Formulierungen zeigt sich auch an der antioxydative Wirkung der Formulierungen.

Die Hemmwirkung der Extrakte und der aus ihnen hergestellten Formulierungen bezogen auf die Einwaage der Festsubstanz aus den Extrakten von Byrsocarpus coccineus und Diodia scandens auf die Cyclooxygenasen, insbesondere auf COX-2, ist beispielsweise bis zu 200-fach stärker als die von Indomethacin.

Die kosmetische Wirkung von Extrakten aus Byrsocarpus coccineus und aus Diodia scandens wurde nachgewiesen. Der Einsatz der erfindungsgemäßen Pflanzenteile oder Inhaltsstoffe in Kosmetika war bisher nicht bekannt.

Die erfindungsgemäße Verwendung der Formulierungen kann als antiinflammatorisches Arzneimittel bei Beschwerden bzw. Erkrankungen des rheumatischen Formkreises erfolgen. Weitere Einsatzmöglichkeiten sind bei Alzheimer-Erkrankungen, Parkinson-Erkrankungen, autoimmune Hepatitis, Leberzirrhose, Diabetes (Typ 1), Bindegewebserkrankungen, Dermatitis u. a. Die genannten Erkrankungen sind potentielle Anwendungsgebiete für COX-Inhibitoren.

Die verwendeten Formulierungen können übliche Hilfsstoffe, z. B. von Stoffen mit Nahrungscharakter oder übliche Konservierungsstoffe enthalten. Hilfsstoffe sind beispielsweise Tenside, Verdicker, Stabilisatoren, Antioxidantien, Füllstoffe, Geruchs- und Geschmacksstoffe u. a. Eine bevorzugte Ausführung enthält Hyaluronsäure, deren Salze und Derivate oder die ungesättigten Uronide der Hyaluronsäure. Ein bevorzugter Hilfsstoff ist Glycerol.

Die Konsistenz der verwendeten Formulierungen kann flüssig, halbfest, salbenförmig, gelförmig oder fest sein. Sie können in fester Form als Tabletten, Granulat, in Gelantinekapseln oder als Pulver vorliegen. Erfindungsgemäß können zerkleinerte Pflanzenteile in Form eines Mehls, eines Breies oder einer Paste verwendet werden. Extrakte können aus den Pflanzenteilen mit einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt mit Ethanol, mit Lösungsmittelmischungen, darunter auch mit Wasser bei Temperaturen zwischen 1 °C und 50 °C oder mit überkritischem Kohlendioxid hergestellt werden.

Eine Möglichkeit, ein gut handhabbares Pulver zu erzeugen, ist die Gefriertrocknung des wasserhaltigen Rückstandes nach Entfernen des organischen Lösungsmittels.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Teile der Pflanzen Byrsocarpus coccineus und Diodia scandens (Blätter, Zweige, Äste) werden grob gemahlen. 3 g Trockenmasse werden in 25 ml 96 %igem Ethanol und 7 ml Wasser suspendiert und bei Raumtemperatur 3 h intensiv gerührt. Nach Filtration erhält man einen braungefärbten Extrakt. Anschließend wird Ethanol im Vakuum-Rotationsverdampfer entfernt. Die Extrakte werden gefriergetrocknet oder flüssig, einzeln oder in Mischungen verwendet oder in den Wirkungsassays eingesetzt.

Beispiel 2 Horse-radish peroxidase-assay (Enzymhemm- oder Scavengertest im zellfreien System) 2.1 Testprinzip, Testziel oder Testaussage

Wasserstoffperoxid (H2O2) wird durch Horseradish-Peroxidase unter Freisetzung von OH-Radikalen zu H2O abgebaut. Die Hydroxyl-Radikale oxidieren Luminol, das RLU's (relative Lichteinheiten) freisetzt, die mit der Chemilumineszenztechnik detektiert werden.

Der Screening-Test prüft die Extrakt-Lösungen oder Standards auf Peroxidase-hemmende oder Scavenger-Eigenschaft in einem zellfreien Testsystem. Der Test läuft im Mikrotiterplatten-Format. Als Standardsubstanz wird N-Acetylcystein eingesetzt, dessen Scavengereigenschaft literaturbekannt ist.

Der Test erlaubt spekulativ zwischen Enzymhemmung und Scavengereigenschaft zu unterscheiden. Wenn die Chemilumineszenz während der gesamten Testzeit verringert ist und eine anfängliche lag-Phase fehlt, dann handelt es sich um Enzymhemmung. Tritt im Anfangsteil der Testung eine lag-Phase auf, ist die Chemilumineszenz-Hemmung auf eine Scavengereigenschaft der Prüfsubstanz zurückzuführen.

2.2 Methode 2.2.1 Chemikalien, Reagenzien und Prüfsubstanzen
  • – PBS-Puffer, pH 7,4
  • – Aqua dest.
  • – Luminol (SIGMA CHEMICAL CO.)
  • – N-Acetylcystein (MERCK)
  • – Peroxidase [Donor: hydrogen-peroxidase oxidoreductase EC 1.11.1.7 Type VI-A, aus (Horseradish) Meerrettich(SIGMA CHEMICAL CO.)]
  • – H2O2 (30 %) 34,01 g/mol (MERCK)
2.2.2 Herstellung der Arbeitslösungen Luminol: 4 mg + 100 &mgr;l DMSO/10 ml PBS-Puffer entspricht

0,4 mg/ml
Herstellung der Enzymlösungen: Peroxidase: Stammlösung: 1 mg/10 ml Aqua dest., portionieren a 10 &mgr;l und bei –20°C lagern

Gebrauchslösung: 10 &mgr;l/10 ml PBS-Puffer, entspricht 0,066 U/ml
Substrat (H2O2) Stammlösung: 30 &mgr;l Original/1 ml PBS-Puffer

Gebrauchslösung: 60 &mgr;l/10 ml PBS-Puffer, 352 &mgr;M
2.2.3 Mikrotiterplattenbelegung Gesamtvolumen/VT: 250 &mgr;l Luminol/VT: 50 &mgr;l Peroxidase/VT: 50 &mgr;l Prüfsubstanz oder Standard/VT: 50 &mgr;l = 10 &mgr;g, 1 &mgr;g oder 0,1 &mgr;g PBS-Pufferlösung/VT: Auffüllmenge bis 250 &mgr;l H2O2/VT: 50 &mgr;l = 0,08 &mgr;mol
2.2.4 Messgerät
  • Labsystems Luminoskan RS, computergesteuert
  • Software: SeroCalc für Windows, Version 4.00
  • Mikrotiterplatten: 96 Vertiefungen (VT), White Combiplate 8 (Radius Edge, Polystyrene, Cat.No. 95029510, Lot.No. 144500, [Labsystems Finnland])
2.2.5 Messablauf
  • Per Hand werden Luminol, Peroxidase, Prüfsubstanzen oder N-Acetylcystein und PBS-Lösung in die VT pipettiert. Nach ca. 1 Minute Wartezeit und Inkubation bei 37,0°C wird 1x gemessen. Anschließend wird mit der Mehrkanalpipette das Substrat (H2O2) in die VT pipettiert.
  • Es folgen sofort 19 Messungen mit je 1 sec Meßzeit pro VT.
2.3 Auswertung
  • Per PC können RLU's als Einzelwerte, Mittelwerte, Maximalwerte und graphische Kurvenverläufe ausgewertet werden.
  • Der RLU-Mittelwert ohne Substanzzugabe wird gleich 100 % gesetzt (Luminol, Peroxidase, H2O2 und PBS-Puffer),

    und die RLU-Mittelwerte der Ansätze mit den unterschiedlichen N-Acetylcystein- oder den Prüfsubstanz-Konzentrationen werden auf den 100 %-Wert relativiert.
  • Die Bewertung der Scavengeraktivität oder HRP-Hemmaktivität in Kategorien (Tabelle 1) erfolgt in Abhängigkeit von der N-Acetylcystein-Wirkung, dessen IC50-Wert im Konzentrationsbereich von 25 &mgr;M liegt. Eine vergleichbare Hemmwirkung einer Prüfsubsztanz wird in die Kategorie 2, eine stärkere in die Kategorie 3 eingestuft.
Beispiel 3 Einfluß von Prüfsubstanzen auf den Lucigenin-verstärkte Chemilumineszenz im zellfreien Xanthinoxidase-Assay 3.1 Testprinzip, Testziel oder Testaussage

Xanthin-Oxidase katalysiert die Umwandlung von Purinen (Hypoxanthin) in Harnsäure unter Freisetzung von Superoxidanion. Die Superoxidanion-Radikale (ROS) reduzieren Lucigenin, wonach Chemilumineszenz freigesetzt wird, die sich mit der Chemilumineszenz-Messtechnik als relative Lichteinheiten (RLU) quantifizieren lässt.

Bei einem Purinüberangebot im Körper überschreitet infolge erhöhter Katalyse die Harnsäurekonzentration ihr Löslichkeitsprodukt in den Körperflüssigkeiten, und es kommt zum Uratausfall, was zur Gicht oder Hyperurikämie führt. Allopurinol (Test-Standard) hemmt die Xanthin-Oxidase-Aktivität und wird als Therapeutikum gegen Gicht eingesetzt (Nachweis von urikosurischer Wirkung bzw. Metabolisierungshemmung).

Xanthin-Oxidase katalysiert den Abbau von Azothioprin, das als Immunsuppressivum nach Organtransplantationen eingesetzt wird. Eine Allopurinol-Comedikation zielt auf eine Hemmung der Abbaugeschwindigkeit von Azothioprin (Metabolisierungshemmung).

Im Verlauf der Reperfusion nach Ischämie erfolgt eine Umwandlung von Xanthin-Dehydrogenase (XDH) in die freie-Radikale-bildende Xanthin-Oxidase (XOD), die unter Verbrauch von O2 Superoxidanionen bildet. Diese werden durch Peroxidasen in Hydroxylradikale umgewandelt. Letztere werden als reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bezeichnet und spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese lebensverkürzender Erkrankungen, wie Bluthochdruck, Infarkte oder Tumorerkrankungen. Der Xanthinoxidase-Test wird genutzt, um Radikalfängereigenschaften von Substanzen nachzuweisen. Besitzt eine Substanz derartige Eigenschaften, wird durch die Neutralisierung der Superoxidanionen-Radikale die Lucigenin-Chemilumineszenz verringert oder gelöscht (Nachweis von Scavenger-Eigenschaften).

3.2 Methode 3.2.1 Chemikalien, Reagenzien und Prüfsubstanzen
  • – HBSS (10x) (Hank's Lösung, ohne Ca und Mg; GIBCO BRL)
  • – Aqua dest.
  • – DMSO (SIGMA CHEMICAL CO.)
  • – Ethanol (96 %iger EtOH; DAB, Merck)
  • – Lucigenin (SIGMA CHEMICAL CO.)
  • – Allopurinol (SIGMA CHEMICAL CO.)
  • – Hypoxanthin (SIGMA CHEMICAL CO.)
  • – Xanthine-Oxidase (SIGMA CHEMICAL CO.)
  • – Prüfsubstanzen
3.2.2 Herstellung der Arbeitslösungen HBSS-Pufferlösung: 10 ml HBSS (10x)-Puffer

90 ml Aqua dest., Einstellung auf pH 7,4
Lucigenin: 5,1 mg/20 ml HBSS-Pufferlösung Hypoxanthin: 100 mg/10 ml HBSS-Pufferlösung Xanthin-Oxidase: 27,78 U/ml, portioniert zu 35 &mgr;l (0,972 U),

bei –20°C gelagert

35 &mgr;l/4,8 ml HBSS-Pufferlösung (0,203 U/ml)
Allopurinol (Standard): 1 mg/25 ml HBSS-Pufferlösung (Kühlschrank: 6–10°C

Verdünnungen entsprechend der Konzentrationen: 100 ng/50 &mgr;l,)

200 ng/50 &mgr;l und 400 ng/50 &mgr;l entspricht 14,7 &mgr;M, 29,4 &mgr;M und 58.8 &mgr;M
Prüfsubstanzen: Stammlösung: 10 mg/ml

Verdünnungen vergleichbar mit Standard
Leerwert: HBSS-Puffer
3.3 Testablauf 3.3.1 Mikrotiterplatten-Belegung: Gesamtvolumen/Vertiefung (VT): 250 &mgr;l Lucigenin/VT: 100 &mgr;l HBSS-Puffer, Prüf- oder Allopurinol-Lösung/VT: 50 &mgr;l Xanthin-Oxidase/VT: 50 &mgr;l Hypoxanthin/VT: 50 &mgr;l Template vom Standard
3.3.2 Messgerät:
  • Labsystems Luminoskan RS, computergesteuert
  • Software: SeroCalc für Windows, Version 4.00
  • Mikrotiterplatten: 96 VT; White Combiplate 8 (Radius Edge, Polystyrene, Cat.No. 95029510, Lot.No. 144500, Labsystems Finnland)
  • Die Chemilumineszenz wird als "Relative Lichteinheit" (RLU) gemessen.
3.3.3 Sequenzeinstellung: Grundeinstellung: Inkubation 37°C, ohne Mixer, Vorwahl der VT, Wartezeiten, Messzeit (1 sec.), Synchronzeit (1 sec) Pipettieren mit 8-Kanalpipette: 100 &mgr;l/VT Lucigenin

50 &mgr;l/VT Xanthin-Oxidase
Pipettieren: Prüf-und Allopurinol-Lösungen und HBSS-Puffer Wartezeit: 15 min Leermessungen: 3 × 3, je im Abstand von 5 min Dispensieren mit Pumpe 1: 50 &mgr;l/VT Hypoxanthin Messungen: 4 × 3, je im Abstand von 5 min
3.3.4 Lösungsmittel-Toleranz:
  • Für DMSO oder Ethanol kleiner 1
3.4 Auswertung

Aus der Summe der Einzelmessungen 10 bis 21 für Leerwert, die Prüflösungen oder Allopurinol-Lösungen werden Mittelwerte errechnet. Der Mittelwert des Leerwertes (HBSS-Puffer) wird gleich 100% gesetzt.

Die Mittelwerte der Prüf- oder Allopurinol-Lösungen werden auf diesen 100 %-Wert relativiert. Die Bewertung der Xanthin-Oxidase-Hemmung der Prüfsubstanzen erfolgt an der Xanthin-Oxidase-Hemmwirkung des Allopurinols. Der IC50-Wert liegt im Konzentrationsbereich um 10 &mgr;M. Eine vergleichbare Hemmwirkung einer Prüfsubstanz wird in die Kategorie 2 eingestuft, eine stärkere in die Kategorie 3.

3.6 Literatur
  • L.A. Pierce, W.O. Tarnow-Mordi and LA.Cree (1995): Antibiotics effects on phagocyte chemiluminescence in vitro. In J Clin Lab Res 25, 93–98
Beispiel 4 4.1 Testprinzip, Testziel oder Testaussage

Das Testprinzip des Kits beruht darauf, dass eine Häm-katalysierte Hydroperoxidase von COX in Gegenwart von Arachidonsäure und Luminol Chemilumineszenz erzeugt, die mit einem Chemilumineszenz-Messgerät quantitativ nachweisbar ist. Arachidonsäure wird dabei über PGG2 in PGH2 umgesetzt. Der Testkit ist auf der 96er Mikrotiterplatte adaptiert. Geprüft wird der Hemmeffekt von Naturstoffen oder Extrakten auf die COX-1- und COX-2-Aktivität. Eine COX-Hemmaktivität wird vorgetäuscht, wenn die Prüfsubstanzen Scavenger-Eigenschaften besitzen. Scavenger haben Radikalneutralisierende Wirkung und zeigen durch verminderte Chemilumineszenz eine COX-Hemmaktivität an, die jedoch nicht auf einer Enzymhemmung beruht. Zum Ausschluss solcher Scavenger-Wirkungen werden Prüfsubstanzen vor dem COX-Test im Horseradish peroxidase-Test geprüft.

4.2 Methode 4.2.1 Chemikalien, Reagenzien und Prüfsubstanzen
  • Chemiluminescent COX (ovine) Inhibitor Screening Assay, Catalog No. 760101; Cayman Chemical Company, bestehend aus Assay Puffer (10x), Heme, COX-1 (ovine), COX-2 (ovine), Arachidonsäure, KOH und Luminol
4.2.2 Herstellung der Arbeitslösungen Assay Puffer: 3 ml Pufferkonzentrat werden mit 27 ml Aqua dest. (HPLC-Qualität) verdünnt (0.1 M Tris-HCl). Heme: 58 &mgr;l Heme (gelöst in DMSO) werden mit 942 &mgr;l Assay Puffer verdünnt. COX-1: 100 &mgr;l COX-2 werden mit 500 &mgr;l Assay Puffer verdünnt. COX-2: 100 &mgr;l COX-1 werden mit 500 &mgr;l Assay Puffer verdünnt. Arachidonsäure: 100 &mgr;l einer ethanolischen Arachidonsäure-Lösung werden mit 100 &mgr;l KOH und mit 9,8 ml Assay Puffer verdünnt. Finalkonzentration:

20 &mgr;M
KOH: 0,1 M KOH, gebrauchsfertig Luminol: Luminollösung ist gebrauchsfertig Prüfsubstanz oder Standard: 1 mg/100 &mgr;l Ethanol Indomethacin: 1 mg/1 ml Ethanol
4.3 Mikrotiterplattenbelegung Gesamtvolumen/VT: 290 &mgr;l Assay Puffer/VT: 200 &mgr;l Luminol/VT: 10 &mgr;l COX-1 oder -2/VT: 10 &mgr;l Arachidonsäure/VT 50 &mgr;l Heme/VT 10 &mgr;l Prüfsubstanz oder Standard/VT: 10 &mgr;l
4.4 Messgerät
  • Labsystems Luminoskan RS, computergesteuert
  • Software: SeroCalc für Windows, Version 4.00
  • Mikrotiterplatten: 96 Vertiefungen (VT), White Combiplate 8 (Radius Edge, Polystyrene, Cat.No. 95029510, Lot.No. 144500, [Labsystems Finnland])
4.5 Messablauf
  • Per Hand werden Enzym, Luminol, Heme, Prüfsubstanzen, Standard oder Assay Puffer in die VT in die VT pipettiert. Unmittelbar nach Zugabe der Arachidonsäure (Substrat) wird bei 25,0 °C jede VT 3x gemessen. Die Messzeit pro VT beträgt 0,1 sec.
4.6 Auswertung
  • Per PC können RLU's als Einzelwerte, Mittelwerte, Maximalwerte und graphische Kurvenverläufe ausgewertet werden.
  • Der RLU-Mittelwert ohne Inhibitorzugabe wird gleich 100 % gesetzt (Luminol, Enzym, Heme, Arachidonsäure und Assay Puffer),

    und die RLU-Mittelwerte der Ansätze mit den unterschiedlichen Indomethacin- oder den Prüfsubstanz-Konzentrationen werden auf den 100 %-Wert relativiert.
  • Die Bewertung der COX-Hemmaktivität erfolgt in Abhängigkeit von der Indomethacin-Wirkung, dessen IC50-Werte für COX-1 im Konzentrationsbereich von 1 &mgr;g/ml und für COX-2 von 32 &mgr;g/ml liegt.
  • Es wurden Trockensubstanzen aus Byrsocarpus coccineus und Diodia scandens, hergestellt aus Extrakten mit anschließender Gefriertrocknung nach Ausführungsbeispiel 1, in Ethanol gelöst und die Extrakte auf Ihre COX-Hemmaktivität getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 1: Antiinflammatorische und antioxidative Wirkung der Pflanzenextrakte
Tabelle 2: COX-1 und COX-2 Hemmwirkung der Pflanzenextrakte
Bewertungskategorien:
  • 0
    keine Aktivität
    1
    schwache Aktivität
    2
    Aktivität entsprechend Standard
    3
    Aktivität besser als Standard
Beispiel 6

Die im Beispiel 1 hergestellten Extrakte werden als Einzelextrakte, als Mischextrakte untereinander oder mit einem Zusatz von Traubenkernextrakten in kosmetische Formulierungen entsprechend Rahmenrezepturen gemischt und z. B. Gesichtscreme, Körperlotion, Handcreme, Fußcreme, Lippenstift, Haarwasser u. a. hergestellt. Diese Produkte verbessern nach dreiwöchiger Anwendung ersichtlich die Hautstruktur und sind hautstraffend im Vergleich zu unbehandelten äquivalenten Hautstellen.

Die Neigung zu Entzündungen der Haut bei Einwirkung von intensiven Sonnenbestrahlung war nach vierstündiger Sonnen-Einwirkung wesentlich geringer, erkennbar an einer sichtbar geringeren Hautrötung der behandelten Hautflächen im Vergleich zu nichtbehandelten äquivalenten Hautstellen.

Beispiel 7

10 g der unter Beispiel 1 hergestellten Extrakte werden in 20 g einer viskosen Lösung, bestehend aus 1 g Hyaluronsäure, 80 ml Glyzerol und 20 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wird topisch/dermal gegen Entzündungsprozesse der Haut angewandt. In einer weiteren Anwendung wird die Suspension zur Linderung von rheumatischen Muskelschmerzen eingesetzt.

Beispiel 8

Die im Beispiel 4 hergestellte Suspension wird in eine kosmetische Formulierung entsprechend Rahmenrezeptur für Gesichts- und Körpercreme verwendet. Diese Formulierungen besitzen fühlbare feuchtigkeitsregulierende und feuchtigkeitsspeichernde Eigenschaften.

Beispiel 9

Getrocknete Blätter der Pflanzen werden zerkleinert und im Gewichtsverhältnis 1 : 10 mit getrockneten Pflanzenteilen der Pfefferminze gemischt. Die Mischung wird mit heißem Wasser aufgegossen und als Tee angewendet.

Beispiel 10

Aus den unter Beispiel 1 hergestellten ethanolischen Extrakten wird Ethanol durch Verdampfen entfernt. 1 g des Rückstandes wird mit 10 ml einer isotonischen Wasser/Kochsalz-Lösung aufgenommen. Schwerlösliche Bestandteile werden abfiltriert. Die verdünnte Lösung wird steril in Ampullen gefüllt und parenteral angewandt.

Beispiel 11

1 g des nach Beispiel 1 gefriergetrockneten Extrakts wird mit 50 g Maisstärke gemischt und die Mischung in Gelkapseln bzw. als Pulver als Nahrungsergänzer verwendet.


Anspruch[de]
  1. Formulierungen mit Cyclooxygenase COX-1 – und COX-2 – Aktivität für den Einsatz bei Mensch und Tier, gekennzeichnet dadurch, dass sie Bestandteile oder Inhaltsstoffe eines oder der beiden Pflanzenarten Byrsocarpus coccineus und Diodia scandens in beliebigem Bestandsteilverhältnis enthalten.
  2. Formulierungen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch Anwendung als Antioxydantien.
  3. Formulierungen gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Anwendung als antiinflammatorische Mittel.
  4. Formulierungen gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch topisch/dermale, intrakorporale oder intraartikuläre Anwendung.
  5. Formulierungen gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Anwendung als Nahrungsmittel oder Nahrungsergänzer.
  6. Formulierungen gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet durch Anwendung in kosmetischen Mitteln.
  7. Formulierungen gemäß Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass sie andere Pflanzenwirkstoffe, insbesondere Traubenkerne oder deren Extrakte enthalten.
  8. Formulierungen gemäß Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass sie Bestandteile oder Extrakte der Pflanze Kigelia africana enthalten.
  9. Formulierungen gemäß Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass sie antimikrobielle Konservierungsmittel enthalten.
  10. Formulierungen gemäß Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass sie eine flüssige, halbfeste, salbenförmige, gelförmige oder feste Konsistenz aufweisen.
  11. Formulierungen gemäß Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass sie als Hilfsstoff Hyaluronsäure oder ungesättigte Uronide der Hyaluronsäure bzw. deren Salze enthalten.
  12. Formulierungen gemäß Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass sie die zerkleinerten Bestandteile in Form eines Mehls, eines Breies oder eines gebackenen Teiges enthalten.
  13. Formulierungen gemäß Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass die Extrakte in gefriergetrockneter Form vorliegen.
  14. Formulierungen gemäß Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, dass als Extraktionsmittel organische Lösungsmittel mit Wasser oder überkritisches Kohlendioxid eingesetzt werden.
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