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Dokumentenidentifikation DE102004020762A1 24.11.2005
Titel Onkolytische Viren und Verfahren zu ihrer Herstellung
Anmelder Thaller, Arno, 91801 Markt Berolzheim, DE;
Noss, Gerhard, Dr., 76316 Malsch, DE
Erfinder Thaller, Arno, 91801 Markt Berolzheim, DE;
Noss, Gerhard, Dr., 76316 Malsch, DE
Vertreter Meissner, Bolte & Partner, 81679 München
DE-Anmeldedatum 27.04.2004
DE-Aktenzeichen 102004020762
Offenlegungstag 24.11.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 24.11.2005
IPC-Hauptklasse C12N 7/02
Zusammenfassung Beschrieben wird ein Verfahren zum Herstellen von onkolytischen Virussuspensionen mit den Schritten a) Kultivieren einer Tumorzelllinie; b) Inokulieren der kultivierten Zelllinie mit Viren; c) Selektion von Viren aus dem Überstand aus Schritt b) nach ihrer Fähigkeit zur Induktion von Syncytien und Onkolyse; d) Gewinnen der selektierten Viren. Darüber hinaus werden auch die nach einem solchen Verfahren gewonnenen Viren beschrieben.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von onkolytischen Virussuspensionen sowie nach dem Verfahren gewonnene Viren. Ferner betrifft die Erfindung das Virus zur Verwendung als Medikament, insbesondere zur Behandlung von Krebs.

Krebserkrankungen gehören zu den häufigsten Todesursachen in den Industriestaaten. Daher sind viele Therapieverfahren entwickelt worden, wobei neben der chirurgischen Entfernung insbesondere die Chemotherapie zur Krebsbekämpfung eingesetzt wird. In einem relativ neuen Ansatz zur Therapie von Krebserkrankungen wird versucht, die onkolytischen Eigenschaften bestimmter Viren zur Behandlung zu nutzen.

Bei solchen Therapieansätzen sind verschiedene Viren eingesetzt worden. Besonders vielversprechende Ergebnisse wurden zunächst mit dem Newcastle-Disease-Virus erzielt. Zur Übersicht siehe Robert M. Lorence und Mitarbeiter in: „Replication-competent, oncolytic Newcastle Disease Virus for Cancer Therapy (Monogr. Virol. Basel, Karger, 2001 Vol 22, pp 160–182 (Hernaiz Driever P., Rabkin SD (eds.)", die hierin als Referenz einbezogen wird.

Wie andere RNA-Viren sind Newcastle-Disease-Viren (NDV) streng wirtadaptiert, d.h. eine maximale Virusausbeute wird nur in Zellen der natürlichen Wirtsspecies – im Fall von NDV in Geflügelzellen – erreicht. Tatsächlich werden im Hühnerembryo pro ml Ernteflüssigkeit 1 Milliarde infektiöse Viruspartikel neu gebildet. Dagegen sind Zellen anderer Wirtsspecies – darunter humane, nicht transformierte Zellen – nicht permissiv für die Replikation dieser Viren. Ein pathogenes Potential für diese Zellen wurde bisher in vitro und in vivo nicht beschrieben. Anders verhalten sich transformierte, von Krebszellen abgeleitete Kulturen verschiedener Wirtsspecies, darunter auch menschliche Krebszellen. Hier wird regelmäßig eine Vermehrung von NDV beobachtet – allerdings liegt die Ausbeute infektiöser Einheiten aus Zellkulturen etwa um 2–3 Zehnerpotenzen unter der im Hühnerei oder in Geflügelzellen maximal erreichten. Aus diesen experimentellen Daten wurden Schlussfolgerungen in der Richtung gezogen, dass man versuchte, mit hochtitrigen Virussuspensionen, gewonnen aus Hühnerembryonen, Tumoren bei Mensch und Tier onkolytisch zur Regression zu bringen. Dabei kamen unterschiedliche Applikationswege (direkt intratumoral, intraperitoneal, intravenöse, intrathekal und/oder durch Inhalation) zur Anwendung.

Beim Menschen gelang selten auf dem Wege der viralen Onkolyse eine irreversible Tumorzerstörung. Immer wieder traten Rezidive auf, dadurch bedingt, dass nicht alle Tumorzellen infiziert und ausgeschaltet wurden. Bei wiederholten Virusgaben verhinderte die stattfindende Immunisierung des Tumorwirtes die Ausbreitung der Viren auf überlebende Tumorzellen.

Vor diesem Hintergrund lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung einer onkolytischen Virussuspension bereitzustellen, die die oben beschriebenen Nachteile nicht aufweist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Herstellen von onkolytischen Virussuspensionen mit den Schritten a) Kultivieren einer Tumorzelllinie, b) Inokulieren der kultivierten Zelllinie mit Viren, c) Selektion von Viren aus dem Überstand aus Schritt b) nach ihrer Fähigkeit zur Induktion von Syncytien und Onkolyse, d) Gewinnen der selektierten Viren.

Ein wichtiges Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Selektion der Viren nach ihrer Fähigkeit zur Induktion von Syncytien und Onkolyse. Unter Syncytien sollen im Sinne der Erfindung Zellverbände verstanden werden, die durch Verschmelzung von Einzelzellen entstanden sind und keine Zellgrenzen mehr aufweisen.

Unter Onkolyse soll im Sinne der Erfindung das Abtöten von Tumorzellen verstanden werden.

Es hat sich überraschend gezeigt, dass durch die Selektion der Viren nach ihrer Fähigkeit zur Induktion von Syncytien einerseits und nach ihrer Fähigkeit zur Onkolyse andererseits Viruspopulationen erhalten werden können, die in vivo hervorragende onkolytische Eigenschaften aufweisen.

Dabei wird eine schnelle Virusausbreitung, die den Abwehrmechanismen des Tumors möglichst zuvorkommen sollte, durch die in-vitro-Adaptation von onkolytischen, Syncytien induzierenden Viren an autologen oder homologen Tumorzellen erreicht.

Besonders gute Ergebnisse werden erzielt, wenn die durch das Verfahren erhaltenen Viren einmal oder mehrmals erneut den Schritten a) bis d) unterworfen werden.

Günstige Voraussetzungen für eine Adaptation onkolytischer Viren, insbesondere von NDV, ist die Etablierung permanenter Zelllinien aus Tumorgewebe eines Krebspatienten. Durch fortlaufende Passagierung der Viren gelingt deren immer bessere Anpassung an die Wirtszelle, d.h. die Dauer des Infektionszyklus bis zur vollständigen Zerstörung der Tumorzellkultur wird auf ein Minimum verkürzt sowie die Ausbeute infektiöser Einheiten auf ein Maximum erhöht.

Die Fähigkeit bestimmter onkolytischer Viren, z.B. NDV, zur Induktion von Synzytien in den infizierten Kulturen, beschleunigt die Ausbreitung dieser Viren und damit die zytopathogene Zerstörung der infizierten Zellen erheblich, da eine Ausbreitung von Zelle zu Zelle im Vergleich zur Ausbreitung über das umgebende Kulturmedium wesentlich effektiver ist.

Wird das auf die beschriebene Weise optimiert Erntevirus in vivo verabreicht, findet auch im Tumorgewebe des Krebspatienten eine schnelle Virusvermehrung mit hoher Virusausbeute statt, so dass vor Wirksamwerden immunologischer Abwehrmechanismen der größte Teil – wenn nicht alle Tumorzellen – infiziert und onkolytisch zerstört werden.

Wenn autologe Tumorzellen nicht gezüchtet werden können, stehen kommerziell erhältliche Tumorzelllinien möglichst von der gleichen Organprovenienz wie der autologe Tumor als Substrat für die in-vitro-Adaptation onkolytischer Viren zur Verfügung. Ein Indikator für eine optimale Adaptation an den autologen Tumor ist der Nachweis infektiöser Viren im Tumor selbst oder im Urin des Tumorpatienten bzw. auch der Nachweis von Viren mit molekularbiologischen Methoden (z.B. PCR).

Beispiele für homologe Tumorzelllinien, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, sind HeLa, Hep-2 und/oder permanente Glioblastomzellen. Es können aber auch heterologe Tumorzelllinien verwendet werden, wie z.B. BKV-transformierte embryonale Rattenzellen.

Besonders vorteilhaft für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Verwendung des Newcastle-Disease-Virus. Die Erfindung ist aber geeignet, die onkolytische Potenz eines jeden Virus festzustellen und zu quantifizieren.

Das von Natur aus beste onkolytische Virus kann dann in mehreren Passagen an den Tumor adaptiert werden, um seine onkolytische Potenz weiter zu steigern.

Bevorzugt umfasst der Schritt c) der Selektion von Viren nach ihrer Fähigkeit zur Induktion von Syncytien und Onkolyse folgende Unterschritte: c1) Kultivieren einer Tumorzelllinie in einer Vielzahl von abgetrennten Ansätzen; c2) Inokulieren der Ansätze mit Virussuspensionen; c3) Bestimmen nach definierten Inkubationszeiten der Zahl der noch vitalen Zellen; c4) Bestimmen nach definierten Inkubationszeiten des Vorhandenseins und Anteils von Syncytien; c5) fakultativ Bestimmen des Anteils der Zellen, die spezifische Virusantigene enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Virus, das nach dem oben beschriebenen Verfahren gewonnen wurde sowie dessen Verwendung als Medikament, insbesondere zur Behandlung von Krebs.

Die Erfindung wird im Folgenden durch die Angabe von Beispielen weiter erläutert.

Beispiel 1: Verfahren zur Herstellung hochtitriger Virussuspensionen in Säugetier- und Humanzellkulturen von Viren mit Fähigkeit zur Induktion von Syncytien und Onkolyse
  • 1. Permanente Tumorzellkulturen sowie autologe Tumorkulturen von Tumorpatienten werden in Standardmedien (z.B. Minimal essential medium, Dulbeccos MEM mit oder ohne Glucosezusatz) sowie Zusatz von fötalem Kälberserum und niedrigen Konzentrationen von Antibiotika (z.B. Penicillin < 40 I.E./ml, Streptomycin < 10 &mgr;g/ml) bis zur Konfluenz kultiviert.
  • 2. Zwecks Inokulation mit Viren werden die Kulturen wiederholt mit physiologischen Salz-Lösungen (z.B. Phosphatpufferlösung pH 7,2–7,4) gewaschen.
  • 3. Nach Dekantieren der letzten Waschlösung werden definierte Verdünnungen onkolytischer Viren (z.B. NDV, Aujetzkyvirus etc.) mit Fähigkeit zur Induktion von Syncytien in den infizierten Zellen den Kulturen zugegeben und die Kulturen mindestens zwei Stunden bei 37°C inkubiert.
  • 4. Danach werden die inokulierten Kulturen wiederholt mit physiologischen Salzlösungen wie unter 2) gewaschen.
  • 5. Nach Dekantieren der letzten Waschlösung wird Impfmedium mit Zusatz von Serumersatzlösungen (z.B. SES A + B, 1:1000 der Fa. BIOCHROM, Berlin) den Kulturen zugegeben.
  • 6. Nach vollständiger Syncytienbildung innerhalb von 12 Stunden erfolgt ein Mediumwechsel, wobei das alte Medium gepoolt und bei 2–8°C aufbewahrt wird. Dann wird die gleiche Menge neues Medium wie unter 5) zugegeben und weitere 12 h bei 37°C inkubiert.
  • 7. Erneuter Mediumwechsel wie unter 6), bis alle Zellen abgestorben und auf Grund der zytopathogenen Wirkung der eingesetzten Viren von der Unterlage abgelöst sind.
  • 8. Gewinnung der abgelösten Zellen durch Zentrifugation (3000 Umdrehungen/min. bei 4°C, 20 Minuten) als Sediment;
  • 9. Behandlung der sedimentierten Zellen mittels drei Gefriertauzyklen (direkt nacheinander Abkühlung bei –193°C in Flüssigstickstoff und schnelles Auftauen bei 70°C = 1 Gefriertauzyklus);
  • 10. Zentrifugation der Proben unter 9) wie unter 8);
  • 11. Abtrennung des zentrifugierten Überstandes mittels steriler Pipetten und Lagerung bei 2–8°C als konzentrierte Virussuspensionen (mindestens 100 Millionen infektiöse Einheiten/ml = 108 TCID 50/ml);
  • 12. weitere Erhöhung der Viruskonzentration durch Erhöhung des Verhältnisses der Zahl infizierter Zellen zum Volumen der Impfmedien (s. Punkt 5);
  • 13. Bestimmung der genauen Konzentration infektiöser Viren durch Titration auf Objektträgerkulturen als höchste Verdünnung der Virussuspension, bei der 50% aller beimpften Kulturen einen mikroskopisch feststellbaren zytopathogenen Effekt sowie fluoreszenzserologisch nachweisbare, virusspezifische Antigene enthalten.
Beispiel 2: Kinetik syncytieninduzierender onkolytischer Viren in vitro (Virogramm)
  • 1. Auf teflonbeschichteten Objektträgern werden in abgetrennten Feldern Suspensionen von permanenten Tumorzelllinien* oder autologen Tumorzelllinien patienteneigener Tumoren aufgetragen. Nach Konfluenz wird eine Zelldichte von ca. 20.000–40.000 Zellen pro Objektträgerfeld erreicht. Die Kulturen werden in stabil gepuffertem Wachstumsmedium (z.B. Zusatz von HEPES), Zusatz von fötalem Kälberserum (5–10%) sowie niedrigen Konzentrationen von Antibiotika (z.B. < 20 IE Penicillin/ml + < 20 &mgr;g Streptomycin/ml) bei 37°C inkubiert.
  • 2. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Kulturen wiederholt mit physiologischen Salzlösungen gewaschen.
  • 3. Nach Verwerfung der letzten Waschlösung werden abgestufte Verdünnungen onkolytischer Viren zugegeben (z.B. 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 und 1:80, z.B. eine Multiplizität der Infektion (= M.O.I.) von 5 bis 0,01 infektiösen Viruspartikeln/Zelle.
  • 4. Absorption der Viren 2 Stunden bei 37°C;
  • 5. Verwerfung der Impfflüssigkeit und wiederholtes Waschen der beimpften Kulturen mit Waschlösungen (siehe Punkt 2);
  • 6. Zugabe von Impfmedium (Medium wie unter 1), aber mit niedriger Konzentration fötalen Kälberserums (1–2%);
  • 7. Bestimmung der definierten Inkubationszeiten (12 Stunden, 24 h, 36 h und 48 h) der Zahl der noch auf dem Objektträger zurückgebliebenen vitalen Zellen (zu definierten Inkubationszeiten) (Zellzählung in einer Neubauerkammer, Vitalfärbung mit Trypanblau);
  • 8. wie unter 7): Bestimmung des Vorhandenseins und Anteils von Syncytien;
  • 9. wie unter 7): Bestimmung des Anteils der Zellen, die spezifische Virusantigene enthalten (Methode: indirekte Immunfluoreszenz);
  • 10. Ergebnis des Virogramms: Es erfolgt die Auswahl geeigneter Virussuspensionen für die onkolytische Therapie in vivo nach folgenden Kriterien:

    a) vollständige Syncytienbildung in vitro 12–14 Stunden nach Infektion;

    b) Infektionstiter mindestens 200 Millionen infektiöse Einheiten = TCID 50)/ml;

    c) 24 Stunden nach Infektion: alle Zellen einer infizierten Kultur sind abgestorben und/oder enthalten virusspezifische Antigene.

Anspruch[de]
  1. Verfahren zum Herstellen von onkolytischen Virussuspensionen mit den Schritten

    a) Kultivieren einer Tumorzelllinie;

    b) Inokulieren der kultivierten Zelllinie mit Viren;

    c) Selektion von Viren aus dem Überstand aus Schritt b) nach ihrer Fähigkeit zur Induktion von Syncytien und Onkolyse;

    d) Gewinnen der selektierten Viren.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt d) gewonnenen Viren einmal oder mehrmals erneut den Schritten a) bis d) unterworfen werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als kultivierte Tumorzelllinie eine aus autologem Tumorgewebe gewonnene Zelllinie verwendet wird.
  4. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Tumorzelllinie um eine homologe Tumorzelllinie handelt.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der homologen Tumorzelllinie um HeLa, Hep-2 und/oder permanente Glioblastomzellen, oder jede andere Zelllinie mit dem Ziel organspezifisch adaptierte Viren zu gewinnen, handelt.
  6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Tumorzelllinie um eine heterologe Tumorzelllinien handelt.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der heterologen Tumorzelllinie um BKV-transformierte embryonale Rattenzellen handelt.
  8. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Virus New Castle Disease Virus verwendet wird.
  9. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der Selektion von Viren nach ihrer Fähigkeit zur Induktion von Syncytien und Onkolyse folgende Unterschritte umfasst:

    c1) Kultivieren einer Tumorzelllinie in einer Vielzahl von abgetrennten Ansätzen;

    c2) Inokulieren der Ansätze mit Virussuspensionen;

    c3) Bestimmen nach definierten Inkubationszeiten der Zahl der noch vitalen Zellen;

    c4) Bestimmen nach definierten Inkubationszeiten des Vorhandenseins und Anteils von Syncytien;

    c5) fakultativ Bestimmen des Anteils der Zellen, die spezifische Virusantigene enthalten.
  10. Virus, gewonnen nach einem Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 9.
  11. Virus nach Anspruch 10 zur Verwendung als Medikament.
  12. Verwendung des Virus nach Anspruch 10 zur Behandlung von Krebs.
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