Stimulierung der Synthese und der Aktivität einer Isoform der Lysyloxidase-ähnlichen LOXL zum Stimulieren der Bildung von elastischen Fasern

Dokumentenidentifikation	DE102004028302B4 24.11.2005
Titel	Stimulierung der Synthese und der Aktivität einer Isoform der Lysyloxidase-ähnlichen LOXL zum Stimulieren der Bildung von elastischen Fasern
Anmelder	COLETICA Ltd. Co., Lyon, FR; Centre National de la Recherche Scientifique Public Establishment of Scientifical & Technical Nature, Paris, FR
Erfinder	Cenizo, Valérie, Vaulx-Milieu, FR; Bouez, Charbel, Lyon, FR; Sommer, Pascal, Saint-Genis Laval, FR; Damour, Odile, Saint-Genis Laval, FR; Gleyzal, Claudine, Lyon, FR; Andre, Valérie, Ampuis, FR; Reymermier, Corinne, Charly, FR; Perrier, Eric, Les Cotes d'Arey, FR
Vertreter	Bosch, Graf von Stosch, Jehle Patentanwaltsgesellschaft mbH, 80639 München
DE-Anmeldedatum	11.06.2004
DE-Aktenzeichen	102004028302
Offenlegungstag	24.03.2005
Veröffentlichungstag der Patenterteilung	24.11.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt	24.11.2005
IPC-Hauptklasse	C12Q 1/26
IPC-Nebenklasse	A61K 38/43 A61P 17/00 A23L 1/48 A61K 7/48

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Stimulierung der Aktivität einer Isoform der Lysyloxidase und insbesondere der Isoform von LOXL (Lysyloxidase-like).

Die Eigenschaften Resistenz und Elastizität von Haut und Schleimhäuten werden im Wesentlichen durch die Kollagenfasern und die Elastinfasern der Dermis bestimmt. Elastin ist ein Protein, welches die elastischen Fasern bildet, indem es sich mit anderen Molekülen wie Fibrillinen und MAGPs (Mikrofibrillär assozierte Glycoproteine) verbindet.

Die elastischen Fasern werden aus Elastin gebildet, welches auf den Mikrofibrillen aufgelagert ist. Elastin wird in Form von löslichem Tropoelastin synthetisiert, welches seine physikalischchemischen Eigenschaften (Unlöslichkeit, Elastizität) nach seiner intra- und intermolekularen Quervernetzung durch eine Lysyloxidase und seiner Auflagerung auf den Mikrofibrillen erwirkt. Die elastischen Fasern sind für die elastischen Eigenschaften der Organe, die sie enthalten (Blutgefäße, Lungenparenchym, elastische Knorpel, Haut ...) verantwortlich. Die elastischen Fasern sind hauptsächlich aus Elastin aufgebaut, welches auf den Mikrofibrillen aufgelagert ist. Der Name „Elastin" steht für das Protein, das den amorphen Anteil der elastischen Fasern bildet, und das ihnen ihre Elastizität verleiht.

Kürzlich wurden die Bestandteile dieser elastischen Fasern in der Epidermis gezeigt.

Die Kollagenfibrillen werden durch die trimere Anordnung von Kollagenketten gebildet. Diese Kollagenfasern werden ebenfalls durch eine Lysyloxidase quervernetzt.

Das Altern von Häuten und Schleimhäuten ist mit einer Modifikation dieses fibrillären Netzwerkes, insbesondere dem der elastischen Fasern, die degradieren und die nicht korrekt neu formiert (rückgebidet) werden, assoziiert. Auf ähnliche Weise wird in Narben das Netzwerk der elastischen Fasern nicht korrekt neu formiert (rückgebidet). Es existieren fünf bekannte Isoformen in der Familie der Lysyloxidasen (LO) : LOX, LOXL, LOXL2, LOXL3, LOXL4 (Csiszar, Lysyl oxidases: A novel multifunctional amine oxidase family, Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 2001, Bd. 70, S. 2-28). LOX ist eindeutig an der Quervernetzung der Kollagenfasern beteiligt (Seve et al., Expression analysis of recombinant Lysyloxidase (LOX) in myofibroblast-like cells, Connective Tissue Research, 2002, 43 : 613-619).

Funktionelle elastische Fasern (die hauptsächlich in der Haut, den Blutgefäßen, der Macula der Retina und den Bandscheiben zu finden sind) werden während der pränatalen Entwicklung und unmittelbar nach der Geburt gebildet. In der Haut werden diese elastischen Fasern von Fibroblasten der Dermis gebildet, es wurden allerdings einige Komponenten, die für die Bildung der elastischen Fasern erforderlich sind, ebenfalls in den Zellen der Epidermis gefunden. Die Kollagenfasern werden in den Bindegeweben das ganze Leben hindurch synthetisiert.

Die Rate, mit der die elastischen Fasern ersetzt werden, ist im adulten Leben sehr gering, obwohl der Gesamtlevel an Elastin in der Haut ansteigen kann (Ashcroft et al., Age-related changes in the temporal and spatial distributions of fibrillin and elastin mRNAs and proteins in acute cutaneous wounds of healthy humans, J. Pathol., 1997, 183 : 80-89). Bei Neugeborenen sind die Mikrofibrillen nicht alle vollständig mit Elastin bedeckt, dies erfolgt mit der Pubertät. Mit 40 Jahren erscheinen Einschlüsse auf den Fasern, häufiger bei Frauen, gefolgt von der Fragmentation der elastischen Fasern und ihrem Verschwinden unter der dermalepidermalen Verbindungsstelle („jonction dermo-épidermique", JDE) („dermal epidermal junction", DEJ). Dieses Fraktionieren und/oder Verschwinden unter der JDE manifestiert sich in einem Verlust der Elastizität der Haut und der Bildung von Falten. Die Synthese von nicht-funktionellen elastischen Fasern wird während der Fotoalterung („photo-viellissement") beobachtet, jedoch wird dieser Anstieg durch einen beschleunigten Verlust der elastischen Fasern unter der JDE begleitet (Watson et al., Fibrillin-rich microfibrils are reduced in photoaged skin. Distribution at the dermal-epidermal junction, J. Invest. Dermatol., 1999, 112 782-787).

Weiterhin erfolgt die Neosynthese der elastischen Fasern nur geringfügig in Narben von adulten Personen, während paradoxerweise diese Eigenschaft teilweise bei alten Personen (älter als 70 Jahre) wiederzufinden ist, deren hergestellte elastischen Fasern sehr fragmentiert vorliegen. Dennoch sind die Hauptkomponenten, die an der Endzusammensetzung der elastischen Fasern beteiligt sind, vorhanden (Elastin, Mikrofibrillen) und die Lysyloxidase-Aktivität bleibt insgesamt erhalten (Pasquali-Ronchetti and Baccarani-Contri, Elastic fiber during development and aging, Microscopy Res. Tech., 1997, 38 : 428-435). Dies ließ die Erfinder vermuten, dass eine oder mehrere Faktoren fehlten, welche die Bildung von funktionellen elastischen Fasern bei Adulten ermöglichen, sie jedoch während der embryonalen Entwicklung und während der ersten Jahre existierten.

Der Stand der Technik ist nicht in der Lage, Merkmale bereitzustellen, die es ermöglichen, den Einfluss eines Wirkstoffs auf eine funktionelle Neo-Elastogenese in der dermatologischen Kosmetik („dermato-cosmetology") zu ermitteln. In diesem Zusammenhang ist es ebenfalls sehr schwierig, objektive Merkmale (Kriterien) zu erhalten, die es ermöglichen, den Einfluss dieser Wirkstoffe zu beurteilen. Die gegenwärtigen Verfahren zum Identifizieren von Wirkstoffen befassen sich mit der Ermittlung der Expression der Gene, die in die Bildung der elastischen Fasern involviert sind, wie Elastin oder den Fibrilinen.

Weiterhin sind zum gegenwärtigen Zeitpunkt in Europa Tierversuche in der Kosmetik verboten und eine humane Experimentation ist ethisch umstritten. Es ist daher für die Erfinder nicht möglich, ein Screening-Verfahren für kosmetische Anwendungen durchzuführen, das unter Verwendung von Tieren oder Menschen erfolgt.

In dreidimensionalen Modellen, wie Mimeskin^® (Coletica, Lyons, Frankreich) induzieren Keratinocyten die Synthese von Tropoelastin und die Ablagerung von Tropoelastin auf den Mikrofibrillen (Duplan-Perrat et al., Keratinocytes influence the maturation and organization of the elastin network in a skin equivalent. J. Invest. Dermatol. 114 : 365-70, 1999). In dem Mimeskin^®-Modell wies die extrazelluläre Matrix eine ultra-strukturelle Organisation auf, die ähnlich zu der von Haut ist, in welcher das Collagen in Strahlen organisiert ist und elastische Fasern, die aus Elastin aufgebaut sind, auf den Mikrofibrillen aufgelagert sind. Dieses Modell ist ebenfalls verwendet worden, um die Effektivität bestimmter Moleküle, wie Inhibitoren der Lysyloxidasen, zu testen. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass die Inhibierung der Lysyloxidasen eine Desorganisation der Kollagenfasern und der Elastinfasern induziert, und ebenfalls eine Abweichung von dem Differenzierungsprogramm der Keratinocyten induziert, indem eine Reduktion des Expressionslevels der Marker der terminalen Differenzierung, wie Filaggrin, erfolgt (Farjanel et al., Französisches Patent 01 10443, CNRS, Use of inhibitors of lysyl oxidases for cell culture and tissue engineering („Utilisation d'inhibiteurs des lysyl oxydases poul la culture cellulaire and le genie tissulaire") zu sehen. In diesem Patent wird nicht zwischen den verschiedenen Isoformen von LO unterschieden.

Weitere Studien beschäftigen sich mit der Lokalisation von LOXL und Elastin. Beispielsweise beschreiben Noblesse et al. (2004) den Nachweis, dass LOXL und Elastin ultrastrukturell ko-lokalisiert sind (Datenbank PubMed bei NCBI, Adresse www.ncbi.nlm.nih.goc, Zusammenfassung zu: Noblesse et al., J. Invest. Dermatol. (2004) 122 (3) 621-30).

In Liu et al. (2004) wird festgestellt, dass LOXL (hier LOXLI genannt) an den Orten der Elastogenese lokalisiert ist und dort neben seiner katalytischen Funktion auch strukturellräumliche Aufgaben hat (Datenbank PubMed bei NCBI, Adresse www.ncbi.nlm.nih.goc, Zusammenfassung zu: LIU, X. et al., Nat. Genet. (2004) 36 (2) 178-82).

In Kielty et al. (2002) (KIELTY, C.M. et al., J. Cell Sci. (2002) 115 (Pt 14) 2817-28) wird die Bildung von elastischen Fasern aus Tropoelastin und Mikrofibrillen und die Chemie der Quervernetzung von Elastin gezeigt. Nach Kielty et al. (2002) wurde nachgewiesen, dass die Quervernetzung von Elastin durch LOX und LOXL katalysiert werden kann. Darüber hinaus gibt Kielty et al. (2002) als Lokalisation von LOX die Mikrofibrillen/Tropoelastin an. Die Lokalisation von LOXL ist in Kielty et al. (2002) jedoch unbekannt.

WO 01/183702 nennt als Erfinder unter anderen die Autorin eines Artikels, auf den bei der Lokalisation von LOX, LOXL2 und LOXL3 in Kielty et al. (2002) Bezug genommen wird. WO 01/183702 zeigt zudem die LOXL-Sequenz und beschreiben, daß LOX und LOX-like Enzyme Oxidase-Aktivität, z.B. gegenüber dem Substrat Elastin, zeigen, was zu einer Quervernetzung der Substrate führt. Damit katalysieren nach WO 01/183702 LOX-like Enzyme, also auch LOXL, die Quervernetzung von extrazellulärem Matrix-Material. Die Aussagen in WO 01/183702 stellen jedoch lediglich Extrapolationen dar, die zum Prioritätstag wissenschaftlich nicht gesichert waren. Zudem beschreibt WO 01/183702 keine Wirkstoffe, welche die Bildung von funktionellen elastischen Fasern stimulieren.

In Dokument WO 02/1061092 werden Modulatoren der Aktivität von Lysyloxidasen und Arzneimittel, die solche Modulatoren enthalten, beschrieben. WO 02/1061092 beschreibt darüber hinaus Lysyloxidasen mit bis zu 50% Identität zu LOX auf Aminosäuresequenz-Ebene. Als konkrete Wirksubstanz der Hemmung der Proliferation von Krebszellen wird in WO 02/1061092 ein Antisense-Oligonukleotid beschrieben. WO 02/1061092 beschreibt jedoch nicht LOXL oder solche Wirkstoffe, welche die Bildung von funktionellen elastischen Fasern stimulieren.

In WO 97/148823 werden als Aktivatoren der Expression von LOX Tangeretin und Epigallocatechin-Gallat identifziert. WO 97/148823 beschreibt jedoch keinerlei Indikationen, die mit der Alterung von Häuten und Schleimhäuten assoziiert sind.

Keine der oben genannten Studien und Veröffentlichungen ermöglichten es somit bisher, ein Verfahren zum Identifizieren von Wirkstoffen zu entwickeln, welche die Bildung von funktionellen elastischen Fasern stimulieren.

Im Stand der Technik werden daher auch keine Wirkstoffe bereitgestellt, die in der Lage sind, die Bildung von funktionellen elastischen Fasern zu stimulieren.

Weiterhin wird es durch den Stand der Technik nicht ermöglicht, die Expressionszone der Isoform der Lysyloxidase LOXL dynamisch zu verfolgen, insbesondere dadurch, dass die im Stand der Technik bereitgestellten Verfahren ungenau sind.

Ziele der Erfindung:

Das Ziel der Erfindung ist es hauptsächlich, die oben angeführten technischen Probleme zu lösen, und insbesondere das technische Problem, ein Verfahren zum Identifizieren von Wirkstoffen, welche die Bildung funktioneller elastischer Fasern stimulieren, bereitzustellen. Mit „funktionelle elastische Fasern" ist die gewöhnliche Bedeutung aus dem Stand der Technik, wie sie oben beschrieben wird, gemeint, und insbesondere sind im Rahmen der Erfindung elastische Fasern gemeint, die elastische Eigenschaften aufweisen, die aus einer dreidimensionalen Struktur resultieren.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der L-Isoform der Lysyloxidase oder eines Wirkstoffs, der die enzymatische Aktivität oder die Expression der L-Isoform der Lysyloxidase (LOXL) stimuliert, insbesondere zur Stimulierung der Bildung von funktionellen elastischen Fasern.

Die Erfindung ermöglicht die Lösung des technischen Problems, das darin besteht, ein Verfahren zum Lokalisieren der Expression von LOXL und zum Verfolgen dieser Expression bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Mit dem Begriff „LOXL" oder „hLOXL" ist die L-Isoform des humanen Proteins Lysyloxidase LOXL gemeint.

Mit dem Begriff „LOX" oder „hLOX" ist die Anfangs-Isoform („Pisoform initiale" des humanen Proteins Lysyloxidase LOX gemeint.

Mit „Stimulieren der Expression der Isoform der Lysyloxidase LOXL" ist die Stimulierung der Expression des Gens, das für LOXL kodiert, oder von dessen Promotor gemeint, und insbesondere ist die Stimulierung der Synthese der messenger RNA, die für LOXL kodiert, und ebenfalls die Stimulierung der Synthese von LOXL, das aus dieser messenger RNA resultiert, gemeint.

Mit „Stimulieren der Expression von Elastin der Isoform der Lysyloxidase LOXL" ist die Stimulierung der Expression des Gens, das für das Protein Elastin kodiert, oder von dessen Promotor gemeint, und insbesondere ist die Stimulierung der Synthese der messenger RNA, die für das Protein Elastin kodiert, und ebenfalls die Stimulierung der Synthese des Proteins Elastin oder seines Vorläufers, Tropoelastin, aus dieser messenger RNA resultiert, gemeint.

Durch diese Erfindung wird es hauptsächlich ermöglicht, entweder die Expression von LOXL, wie beschrieben, oder die enzymatische Aktivität von LOXL zu stimulieren.

Diese Stimulierung muss effektiv genug sein, um die Bildung von funktionellen elastischen Fasern zu stimulieren.

Wirkstoffe sind dann als wirksam anzusehen, wenn sie eine Aktivierung oder einen 1,5-fachen Anstieg der Expression und/oder der Aktivität von LOXL in einem Modell erzielen, welches mindestens einen Zelltyp umfasst, der eine Expression und/oder Aktivität von LOXL über den Kontakt mit diesen Wirkstoffen aufweist, in Bezug auf den Expressionslevel und/oder Aktivitätslevel von LOXL in einem Kontrollmodell (ohne Kontakt mit den Wirkstoffen). Demnach betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem ersten Aspekt die Verwendung der Isoform „like" der Lysyloxidase mit der Sequenz ID Nr. 1, ebenfalls LOXL genannt, oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon oder die Verwendung einer Substanz (Wirkstoff, Wirksubstanz), welche die Aktivität und/oder die Expression von LOXL fördert, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Stimulierung der Bildung von elastischen Fasern.

Mit "eine homologe oder im Wesentlichen homologe Form hiervon" ist eine homologe Form der Isoform der Lysyloxidase LOXL gemeint, welche die gleiche oder ähnliche Aktivität wie LOXL, wie hierin definiert, besitzt.

Vorteilhafterweise ist die Expression von LOXL entweder die Expression einer Nukleotidsequenz, die für LOXL kodiert, oder die Expression einer Aminosäuresequenz, die eine Teilsequenz des Proteins LOXL darstellt, wobei die Aminosäuresequenz vorzugsweise aus der SEQ ID Nr. 1 ausgewählt wird.

Vorteilhafterweise ist die Zusammensetzung eine kosmetische, nutrazeutische, medizinische oder pharmazeutische Zusammensetzung.

Vorteilhafterweise umfasst die Zusammensetzung eine zweite Substanz, welche die Expression des Proteins Elastin stimuliert, insbesondere zum Stimulieren der Bildung von elastischen Fasern, wobei die zweite Substanz vorzugsweise die Substanz ist, welche die Aktivität und/oder die Expression von LOXL fördert.

Vorteilhafterweise umfasst die Wirksubstanz eine Region, die an mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz des Promotors des humanen LOXL-Gens (Pr) (SEQ ID Nr. 3) oder eine homologen oder im wesentlichen homologen Form hiervon bindet, oder eine Region, die die Expression eines Proteins moduliert, welches an mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz des Promotors des humanen LOXL-Gens (Pr) (SEQ ID Nr. 3) oder eine homologen oder im wesentlichen homologen Form hiervon bindet. Diese Sequenz beginnt mit dem Nukleotid -2630 vor dem ATG-Codon, wobei insbesondere die Nukleotide von -2172 bis -1 untersucht worden sind.

Vorteilhafterweise wird die Wirksubstanz ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Dill, Korinthe (Johannisbeere), Kardamom, schwarzem Rettich, kleiner Stechpalme, Zimt, Milchsäurebakterien-basierten Fermentationen, Hafer, Kartoffel, Seide, Asa foetida gum, Ethylhexenoat und seinen Derivaten, Methylbutyrat und seinen Derivaten und Ethyldecadienoat und seinen Derivaten.

Vorteilhafterweise wird die oben beschriebene Verwendung zum Induzieren einer Neo-Elastogenese der Gewebe, und insbesondere zum Stimulieren der Elastizität der so erhaltenen Gewebe, und zum Reduzieren von Hautfalten, durchgeführt.

Vorteilhafterweise wird die oben beschriebene Verwendung zum Bekämpfen der Erschlaffung der Gewebe, insbesondere wenn die Erschlaffung der Gewebe im Zuge des Alterns oder im Zuge von Sonnenexposition beobachtet wird, zum Verdichten der extrazellulären Matrix, zum Festigen der subkutanen Gewebe, zum Reduzieren von Hautfalten, zum Ausüben eines Anti-Falten-Effekts, zum Verbessern der Qualität von Narbengewebe und dem Erscheinungsbild von Narben, insbesondere dystrophen Narben und Keloid-Narben, oder zum Bekämpfen von Dehnungsmalen durchgeführt.

Gemäß einem zweiten Aspektes betrifft die Erfindung eine kosmetische Zusammensetzung, welche eine Wirksubstanz, wie oben definiert, umfasst, wahlweise in einer Mischung mit einem kosmetisch akzeptablen Träger.

Gemäß einem dritten Aspekts betrifft die Erfindung eine nutrazeutische Zusammensetzung (Nahrungsmittelzusammensetzung), welche eine Wirksubstanz, wie oben definiert, umfasst wahlweise in einer Mischung mit einem Träger, der für Nahrungsmittel akzeptabel ist.

Gemäß einem vierten Aspekts betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Wirksubstanz, wie oben definiert, umfasst wahlweise in einer Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.

Für die kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen enthalten die Träger zum Beispiel mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Konservierungsmitteln, Weichmachern, Emulgatoren, Oberflächen-aktiven Stoffen, Feuchthaltemittel, Verdickungsmittel, Konditionierern, „les agents matifiant" („matifying agents")", Stabilisatoren, Antioxidantien, Strukturbildungsstoffen („les agents de texture"; „texture agents""), Aufhellern, Film-bildenden Stoffen, Lösungsvermittlern, Pigmenten, Farbstoffen, Duftstoffen und Sonnenfiltern. Diese Trägerstoffe werden vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuren und ihren Derivaten, Polyglycerolen, Estern, Polymeren und Cellulosederivaten, Lanolinderivaten, Phosphorlipiden, Lactoferinen, Lactoperoxidasen, Sucrosebasierten Stabilisatoren, Vitamin E und seinen Derivaten, natürlichen und synthetischen Wachsen, Pflanzenölen, Triglyceriden, unverseifbaren Stoffen („insaponifiables"), Phytosterolen, Pflanzenestern, Silikonen und ihren Derivaten, Proteinhydrolysaten, Jojobaöl und seinen Derivaten, Lipo-/wasserlöslichen Estern, Betainen, Aminoxiden, Pflanzenextrakten, Sucrose-Ester, Titandioxiden, Glycinen und Parabenen, und stärker bevorzugt aus der Gruppe, bestehend aus Butylenglycol, Steareth-2, Steareth-21, Glycol-15, Stearylether, Cetearylalkohol, Phenoxyethanol, Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Butylenglycol, natürlichen Tocopherolen, Glycerin, Natriumdihydroxycetyl, Isopropylhydroxycetylether, Glycolstearat, Triisononaoin, Octylcocoat, Polyacrylamid, Isoparaffin, Laureth-7, einem Carbomer, Propylenglycol, Glycerin, Bisabolol, Dimethicon, Natriumhydroxid, PEG 30-Dipolyhydroxystearat, Capric-/Capryltriglyceriden, Cetearyloctanoat, Dibutyladipat, Traubenkeimöl, Jojobaöl, Magnesiumsulfat, EDTA, Cyclomethicon, Xanthangummi, Zitronensäure, Natriumlaurylsulfat, Mineralwachsen und -ölen, Isostearylisostearat, Propylenclycoldipelargonat, Propylenglycolisostearat, PEG 8, Bienenwachs, hydrogenierten Palmenherzölglyceriden, hydrogenierten Palmenölglyceriden, Lanolinöl, Sesamöl, Cetyllaktat, Lanolinalkohol, Castroöl, Titandioxid, Lactose, Sucrose, Polyethylen mit niedriger Dichte und einer isotonischen Kochsalzlösung.

Vorteilhafterweise werden die oben genannten Zusammensetzungen in einer Form formuliert, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Lösung, welche wässrig oder ölig ist, einer wässrigen Creme oder einem wässrigen Gel oder einem öligen Gel, insbesondere in einem Tiegel oder in einer Tube, insbesondere einem Duschgel; einem Shampoo; einer Milch; einer Mikroemulsion oder einer Nanoemulsion, insbesondere einer Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl- oder multiplen oder Silikon-enthaltenden Mikroemulsion oder Nanoemulsion; einer Lotion, insbesondere in einer Glasflasche, einer Plastikflasche oder in einer Dosierflasche oder in einer Sprühflasche oder einer Ampulle; einer flüssigen Seife; einem dermatologischen Strang ("dermatological bar"; "pain dermatologique") einer Salbe, einem Schaum; einem wasserfreien Produkt, bevorzugt einem flüssigen, pastösen oder festen wasserfreien Produkt, zum Beispiel in Form eines Stiftes, insbesondere in Form eines Lippenstiftes.

Vorteilhafterweise können die Zusammensetzungen, die ausreichend flüssig sind, insbesondere über den parenteralen, okularen, pulmonaren, oralen oder nasalen Weg verabreicht werden.

Vorteilhafterweise können die pastösen oder trockenen Zusammensetzungen (Pasten, Puder, Tabletten, Kapseln, Granulate, Zäpfchen...) insbesondere über den oralen, sublingualen, nasalen oder rektalen Weg in den Körper eingeführt werden.

Vorteilhafterweise, wenn die Formulierung der Zusammensetzung es erlaubt, ist der Verabreichungsweg kutan oder transmukös, oder die Applikation der Zusammensetzung auf die Haut oder eine Schleimhaut.

Vorteilhafterweise wird der Fachmann aus den verschiedenen Formulierungen und Verabreichungswegen eine/einen auswählen, der/die adäquat für die jeweils verfolgte Wirkung ist.

Gemäß einem fünften Aspekt, betrifft die Erfindung ein Verfahren zur kosmetischen Pflege (zum kosmetischen Schutz), das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die Verwendung einer oben beschriebenen Zusammenfassung umfasst.

Vorteilhafterweise ist die kosmetische Pflege (der kosmetische Schutz) ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Bekämpfen der Erschlaffung der Gewebe, insbesondere, wenn die Erschlaffung der Gewebe im Zuge des Alterns oder im Zuge von Sonnenexposition beobachtet wird, dem Verdichten der extrazellulären Matrix, dem Stützen der subkutanen Gewebe, dem Reduzieren von Hautfalten, Anti-Falten-Effekten, dem Verbessern der Qualität von Narbengewebe und dem Erscheinungsbild von Narben, insbesondere von dystrophen Narben und Keloid-Narben, und dem Bekämpfen von Dehnungsmalen.

Gemäß einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Substanz, welche die Aktivität von LOXL oder einer homologen Form oder im Wesentlichen homologen Form hiervon fördert, zur Stimulierung der Bildung von elastischen Fasern, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es umfasst:

– In-Kontakt-Bringen einer potentiellen Wirksubstanz (Wirkstoff) mit LOXL und/oder mindestens einem Typ von Zellen, die in der Lage sind, die Isoform LOXL oder eine homologe oder im Wesentlichen homologe Form hiervon zu exprimieren und
– a) Analysieren der Aktivität von LOXL oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon, insbesondere mit dem Ziel zu identifizieren, ob die potentielle Wirksubstanz die Aktivität von LOXL oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon stimuliert oder
– b) Analysieren der Expression von LOXL oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon, insbesondere mit dem Ziel zu identifizieren, ob die potentielle Wirksubstanz die Expression von LOXL oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon stimuliert.

Im Rahmen dem Analysieren der Expression von LOXL oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon, wird vorteilhafterweise danach gesucht, ob die potentielle Wirksubstanz:

– die Expression von mindestens einer Nukleotidsequenz, die für das Protein LOXL oder eine homologe oder im Wesentlichen homologe Form hiervon kodiert, und/oder
– die Expression einer Aminosäuresequenz, die im Wesentlichen eine Teilssequenz des Proteins LOXL oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon darstellt,

stimuliert.

Vorteilhafterweise wird die Analyse der Expression von LOXL durch qualitative und/oder quantitative Analyse der Expression von mindestens einem Teil einer Nukleotidsequenz, die für LOXL kodiert, durchgeführt.

Vorteilhafterweise ist die Nukleotidsequenz die cDNA, die komplementär zu der mRNA ist, die für LOX kodiert, wobei die cDNA von LOXL durch die SEQ ID Nr. 2 definiert wird.

Vorteilhafterweise erfolgt die Analyse der Expression von LOXL unter Verwendung einer reversen Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR), welche die Verwendung von Primern umfasst, die mit mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz der komplementären DNA, die für LOXL kodiert (SEQ ID Nr. 2), hybridisieren, um mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz, welche für LOXL kodiert, zu amplifizieren.

Vorteilhafterweise umfasst das Verfahren ebenfalls einen Schritt des Lokalisierens der Ex pression von LOXL, der an einem Hautrekonstruktionsmodell oder einem Biopsie-basierten Modell durchgeführt wird:

– durch in situ Hybridisierung, insbesondere von mindestens einem Teil einer Nukleotidsequenz, die für LOXL kodiert, zum Beispiel durch Verwenden mindestens einer DNA-Sonde, welche mit mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz der komplementären DNA, die für LOXL kodiert (SEQ ID Nr. 2), hybridisiert; oder
– durch Immun-Detektion, insbesondere durch Verwenden mindestens eines spezifischen LOXL-Antikörpers.

Die spezifischen Antikörper werden in Beispiel 1 spezifiziert.

Vorteilhafterweise umfasst das Verfahren zum Identifizieren einer Substanz den Vergleich der Expression von LOXL mit der Expression von LOXL, das in einer Kontrolle exprimiert wird, die die potentielle Wirksubstanz nicht umfasst.

Vorteilhafterweise umfassen die lebenden Zellen Fibroblasten, die insbesondere aus normaler humaner Haut stammen, wie zum Beispiel aus junger Haut (Vorhaut) ("prépuce"; "foreskin") oder aus einer Haut eines adulten Probanden (Subjektes) stammen.

Vorteilhafterweise umfassen die lebenden Zellen epitheliale Zellen, zum Beispiel Keratinocyten, die insbesondere aus normaler humaner Haut stammen, wie zum Beispiel aus junger Haut (Vorhaut) ("prépuce; foreskin") oder aus einer Haut eines adulten Probanden stammen.

Vorteilhafterweise stammen die lebenden Zellen aus mindestens einer Haut, die eine besondere Lokalisation bestizt, zum Beispiel aus dem Gesicht, aus dem Abdomen oder aus der Brust, wobei sie als "gealtert" oder als der Sonnenbestrahlung "ausgesetzt" oder nicht gekennzeichnet werden können, oder die lebenden Zellen stammen aus einer Haut, die aus einer Zone mit Narben oder Dehnungsmalen stammt.

Vorteilhafterweise erfolgt das Verfahren zum Identifizieren einer Substanz unter Verwendung eines Hautrekonstruktionsmodells, insbesondere mindestens eines Dermismodells, welches Fibroblasten umfasst, oder eines Biopsie-basierten Modells.

Vorteilhafterweise erfolgt das Verfahren zum Identifizieren einer Substanz unter Verwendung eines Hautrekonstruktionsmodells oder eines Biopsie-basierten Modells. Das verwendete Hautrekonstruktionsmodell ist vorteilhafterweise das Mimeskin^® Hautrekonstruktionsmodell, es kann jedoch ebenfalls ein Modell aus Bindegewebsmatrix, aus der Epidermis oder aus dem Epithel oder aus rekonstruierter Haut oder Schleimhaut sein:

1. Das dreidimensionale Kultivierungsmodell aus Bindegewebsmatrix (Dermis oder Chorion) umfasst einen Träger, der mit Stromazellen ausgelegt wird, um rekonstruierte Dermis oder rekonstraiertes Chorion zu bilden. Dieser Träger wird vorzugsweise ausgewählt aus:

– einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer semipermeablen synthetischen Membran, insbesondere einer semipermeablen Nitrocellulose-Membran, einer semipermeablen Nylon-Membran, einer Teflon-Membran oder einem Teflon-Schwamm, einer semipermeablen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen oder Polyethylenterephtalat (PET), einer semipermeablen anorganischen Anopore-Membran einer Celluloseacetat- oder Celluloseester-(HATF)-Membran, einer semipermeablen Biopor-CM-Membran, einer semipermeablen Polyester-Membran, einer Membran oder einem Film aus Polyglycolsäure. In dieser Gruppe befinden sich beispielsweise die dermalen Modelle Skin^2TM-Modell ZK1100 und Dermagraft^® und Transcyte^® (Advanced Tissue Sciences);

– einem Zellkultur-behandelten Kunststoff (Plastik) (formation d'un feuillit dermique: Michel M et al. in In Vitro Cell. Dev Biol.-Animal (1999) 35 : 318-326);

– einem Gel oder einer Membran, das/die auf Hylaronsäure (Hyalograft^® 3D-Fidia Advanced Biopolymers) und/oder auf Kollagen und/oder auf Fibronektrin und/oder auf Fibrin basiert; in dieser Gruppe befindet sich beispielsweise das dermale Modell Vitrix^® (Organegenesis);

– einer porösen Matrix, die beschichtet oder nicht beschichtet ist, hergestellt aus Kollagen, die einen oder mehrere Glucosaminoglykan(e) und/oder eventuell Chitosan enthalten kann (EP 0 296 078 A1 von CNRS, WO 01/911821 und WO 01/92322 von Coletica).
2. Das dreidimensionales Kultivierungsmodell aus Epidermis oder Epithel umfasst einen Träger, der vorab mit Stromazellen, insbesondere Fibroblasten ausgelegt wird oder nicht, und dann mit epithelialen Zellen, insbesondere Keratinocyten, ausgelegt wird, um so rekonstruierte Epithelien oder rekonstruierte Epidermis zu erhalten. Dieser Träger wird vorzugsweise ausgewählt aus:

– einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer semipermeablen synthetischen Membran, insbesondere einer semipermeablen Nitrocellulose-Membran, einer semipermeablen Nylon-Membran, einer Teflon-Membran oder einem Teflon-Schwamm, einer semipermeablen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen oder Polyethylenterephthalat (PET), einer semipermeablen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester-(HATF)-Membran, einer semipermeablen Biopore-CM-Mebran, einer semipermeablen Polyester-Membran; in dieser Gruppe befinden sich sowohl die Rekonstruktionsmodelle Epiderm und Epithelia (Skinethic^®) als auch die Modelle EpiDerm^®, EpiAirway^®, EpiOccular^® (Mattek Corporation);

– einem Film oder einer Membran, der/die auf Hyaluronsäure und/oder auf Kollagen und/oder auf Fibronektin und/oder auf Fibrin basiert. In dieser Gruppe befinden sich insbesondere die Modelle: Episkin^® (L'Oreal) und Laserskin^® (Fidia advanced Biopolymers).
3. Das dreidimensionales Kultivierungsmodell aus rekonstruierter Haut oder Schleimhaut umfasst einen Matrixträger (dermal oder aus Chorion), der mit epithelialen Zellen ausgelegt wird, um eine rekonstruierte Schleimhaut zu erhalten oder mit Keratinocyten ausgelegt wird, um eine rekonstruierte Haut zu erhalten. Dieser Träger wird vorzugsweise ausgewählt aus:

– einem inerten Träger, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer semipermeablen synthetischen Membran, insbesondere einer semipermeablen Nitrocellulose-Membran, einer semipermeablen Nylon-Membran, einer Teflon-Membran oder einem Teflon-Schwamm, einer semipermeablen Membran aus Polycarbonat oder Polyethylen, Polypropylen oder Polyethylenterephthalat (PET), einer semipermeablen anorganischen Anopore-Membran, einer Celluloseacetat- oder Celluloseester-(HATF)-Membran, einer semipermeablen Biopore-CM-Membran, einer semipermeablen Polyester-Membran, wobei der inerte Träger Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, enthält,

– einem Gel, das auf Kollagen und/oder Hyaluronsäure und/oder Fibronektin und/oder Fibrin basiert, wobei es Stromazellen, insbesondere Fibroblasten umfasst,

– einer porösen Matrix, welche beschichtet ist oder nicht beschichtet ist, hergestellt aus Kollagen, die einen oder mehrere Glucosaminoglykan(e) und/oder eventuell Chitosan enthalten kann, wobei in diese porösen Matrizen Stromazellen, insbesondere Fibroblasten, eingebaut sind,

– einer humanen oder tierischen de-epidermisierten (entepidermisierten) Dermis oder toten Dermis.

In dieser Gruppe befinden sich insbesondere sowohl die Modelle Apligraf^® (Organogenesis), ATS-2000 (CellSystems^® Biotechnologie Vertrieb) als auch Skin^2TM (ZK1200-1300-2000-Advanced Tissue Science).

Weiterhin existieren Modelle, die für die Gewebetherapie gedacht sind, und die ebenfalls Gegenstand solcher Untersuchungen sein können. Hier können die Modelle Epidex^TM (Modex Thérapeutiques), Epibase^® (Laboratoire Genevrier), Epicell^TM (Genzyme), Autoderm^TM und Transderm^TM (Innogenetics) genannt werden.

Vorteilhafterweise erfolgt das Verfahren zum Identifizieren einer Substanz unter Verwendung eines Hautrekonstruktionsmodells, insbesondere mindestens eines Epidermismodells, welches Keratinocyten umfasst.

Vorteilhafterweise umfasst das Verfahren einen Schritt des Analysierens der Expression einer Sequenz von mindestens dem Protein Elastin und/oder Tropoelastin oder einer Nukleotidsequenz, die für das Protein Elastin kodiert, insbesondere zum Detektieren einer eventuellen Stimulierung der Expression des Proteins Elastin, wenn die Wirksubstanz in Kontakt mit den lebenden Zellen ist.

Vorteilhafterweise umfasst das Verfahren einen Schritt des Immun-Detektierens der Expression des Proteins LOXL, insbesondere mit dem Ziel, den Nachweis (Nachweisbarkeit) der Neo-Elastogenese durchzuführen, insbesondere in den epithelialen Geweben und/oder in den Bindegeweben, wobei die Gewebe aus mindestens einem Hautrekonstruktionsmodell oder einem Biopsie-basierten Modell stammen.

Gemäß einem siebten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Lokalisieren der Expression von LOXL oder einer homologen oder im wesentlichen homologen Form hiervon in Geweben, mit dem Ziel, den Nachweis (Nachweisbarkeit) der Neo-Elastogenese durchzuführen, insbesondere in Bindegeweben, wobei die Gewebe aus mindestens einem Hautrekonstruktionsmodell oder aus Biopsien stammen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren einen Schritt des Immun-Detektierens von dem Protein LOXL oder einer homologen oder im Wesentlichen homologen Form hiervon oder des in situ-Hybridisierens von mindestens einem Teil einer Nukleotidsequenz, die für LOXL oder eine homologe oder im Wesentlichen homologe Form hiervon kodiert, umfasst.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Lokalisieren der Expression von LOXL in Geweben, mit dem Ziel, den Nachweis (Nachweisbarkeit) der Neo-Elastogenese durchzuführen, insbesondere in epithelialen Geweben und/oder in Bindegeweben, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren einen Schritt des Immun-Detekrierens von dem Protein LOXL oder des in situ-Hybridisierens von dem Gen, das für LOXL kodiert, umfasst.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung eines Wirkstoffs, der die enzymatische Aktivität oder die Expression des Proteins LOXL modifiziert, um die Bildung von elastischen Fasern zu stimulieren.

Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Behandlung eines Mangels, der mit der enzymatischen Aktivität der Isoform des Proteins Lysyloxidase LOXL assoziiert ist, welches das Verabreichen einer therapeutisch effektiven Menge einer Zusammensetzung, die das Protein Lysyloxidase LOXL oder eine homologe oder im Wesentlichen homologe Form hiervon umfasst oder einer Verbindung, die die enzymatische Aktivität oder die Expression des Proteins Lysyloxidase LOXL stimuliert, umfasst.

Vorteilhafterweise ermöglicht es dieses Behandlungsverfahren, eine Behandlung durchzuführen, die ausgewählt ist aus dem Bekämpfen gegen die Erschlaffung der Gewebe, insbesondere wenn die Erschlaffung der Gewebe im Zuge des Alterns oder im Zuge von Sonnenexposition beobachtet wird, dem Verdichten der extrazellulären Matrix, dem Festigen der subkutanen Gewebe, dem Reduzieren von Hautfalten, Anti-Falten-Effekten, dem Verbessern der Qualität von Narbengewebe und dem Erscheinungsbild von Narben, insbesondere von dystrophen Narben und Keloid-Narben, und dem Bekämpfen von Dehnungsmalen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die Erfinder haben unerwarteterweise gezeigt, dass die Synthese bzw. die Aktivität von LOXL ein wichtiges fehlendes Glied in der Kette der Elastogenese bei Adulten ist, und dass es möglich war, die Synthese dieser Isoform der Lysyloxidase zu reaktivieren, um einen stimulierenden Effekt auf die Elastogenese zu erzielen.

Die Erfinder haben tatsächlich gezeigt, dass diese Isoform der Familie der Lysyloxidasen (LO) mit der Elastogenese in einem Hautrekonstruktionsmodell, das elastische Fasern herstellt, assoziiert ist. Bei Untersuchungen, ob diese Isoform in der Haut verschiedener Altersstufen und während der Hautalterung vorhanden oder nicht vorhanden ist, haben die Erfinder die gleichzeitige Anwesenheit oder Abwesenheit dieser Isoform und der Elastogenese festgestellt, wodurch gezeigt werden konnte, dass die Aktivität dieser Isoform von LO ein fehlendes Glied in der Kette ist, und dass es erforderlich ist, dessen Synthese zu modulieren, um eine funktionelle Elastogenese zu bewirken.

Die Erfinder haben folglich ein Verfahren entwickelt, das es ermöglicht, erhöhte Expressionen dieser Isoform von LO (LOXL) sichtbar zu machen. Dann haben die Erfinder nach Wirkstoffen gesucht, insbesondere unter Pflanzenextrakten oder chemischen Molekülen, die insbesondere die Expression der mRNAs, die für LOXL kodieren, stimulieren. Die ausgewählten Wirkstoffe wurden dann in kosmetische, dermo-pharmazeutische und pharmazeutische Zusammensetzungen eingebaut, insbesondere zur Anwendung im Kampf gegen die Erschlaffung der Gewebe im Zuge des Alterns und ebenfalls in der Verbesserung der Qualität von Narbengewebe und dem Erscheinungsbild von Narben und Dehnungsmalen.

Die Erfinder haben spezifische Antikörper der reifen LOXL-Formen entwickelt (siehe Beispiele 1 und 2) und haben auf diesem Weg gezeigt, dass die Abwesenheit dieser Lysyloxidase-Isoform mit den Problemen der Synthese von funktionellen elastischen Fasern, insbesondere im Zuge des Alterns der Hautgewebe korreliert, wenn die Probleme natürlich sind oder durch Sonnenexposition induziert werden.

Die Isoformen LOXL2, LOXL3 und LOXL4 werden nicht oder gering in der Dermis exprimiert und sind nicht an der Elastogenese beteiligt (siehe Beispiel 4). Die LOX-Isoform ist in der Dermis vorhanden und kann mit den Mikrofribillen in Verbindung gebracht werden, jedoch ist LOX in die Bildung der funktionellen Kollagenfasern involviert und fehlt nicht in adulten Häuten. Die Abwesenheit von LOX steht daher nicht im Zusammenhang mit dem Verlust der Elastizität der elastischen Fasern im Zuge des Alterns (siehe Beispiel 3).

Diese Demonstration der Rolle von LOXL in der Elastogenese war entscheidend für die Durchführung der vorliegenden Erfindung (siehe Beispiel 5). Die Verbindung zwischen LOXL und den elastischen Fasern oder den Mikrofibrillen wurde während der Durchführung der vorliegenden Erfindung eindeutig durch Elektronenmikroskopie gezeigt. LOXL, assoziiert mit den Mikrofibrillen, bildet den Rahmen, auf dem Elastin aufgelagert wird.

LOXL ist das Enzym, das für die Reifung von Elastin durch Quervernetzung verantwortlich ist und ermöglicht so die Bildung von funktionellen elastischen Fasern.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder ein Verfahren zum Lokalisieren der Expression von LOXL durchgeführt.

Insbesondere umfasst dieses Verfahren zum Lokalisieren die Immun-Detektion von LOXL. Es ist ebenfalls möglich, anhand dieses Verfahrens die Expression des Proteins Elastin zu zeigen. Durch die Untersuchungen der Erfinder ist gezeigt worden, dass LOXL in Verbindung mit den dichten Ablagerungen („dépots dense") oder auf den Mikrofibrillen detektiert wurde, jedoch nicht in Verbindung mit den Kollagenfasern. Elastin wurde in den gleichen dichten Ablagerungen und den Mikrofibrillen detektiert. Diese Detektion wurde anhand von Hautrekonstruktionsmodellen, und insbesondere anhand von Hautrekonstruktionsmodellen, 30 Tage nach der Applikation der Keratinocyten, durchgeführt (siehe Beispiel 5).

Die Verbindung von LOXL mit den Mikrofibrillen und mit den elastischen Fasern wurde ebenfalls bei junger Haut (Vorhaut) ("prépuce, foreskin"), insbesondere durch Transmissionselektronenmikroskopie nach Immun-Detektion, bestätigt.

LOXL wird in der Dermis von junger Haut (Vorhaut) exprimiert, die jungen Patienten (einige Monate alt), die noch eine große Synthese von Elastin besitzen, entnommen wurde. LOXL wird jedoch nicht in der Dermis der Haut aus dem Nacken, aus der Brust, aus dem Abdomen oder aus dem Gesicht von adulten Personen exprimiert. Dieses wird durch das Fehlen der Detektion von LOXL in der Dermis der Haut aus dem Nacken, aus der Brust, aus dem Abdomen oder aus dem Gesicht von Adulten, egal welchen Alters, bestätigt. Eine starke Expression von LOXL wurde ebenfalls in der Epidermis von humaner Haut beobachtet, jedoch mit einem späten Erlöschen der Expression des Enzyms, wenn die humane Haut aus Probanden (Subjekten) stammte, die ungefähr 80 Jahre alt oder älter waren (siehe Beispiel 6).

Im Hinblick auf Narben wurde LOXL in der Dermis dieser Zonen nicht beobachtet, weder drei Monate nach der Narbe noch fünf Jahre nach der Bildung der Narbe.

In diesem Zusammenhang ist anzumerken, dass Elastin, das nach drei Monaten vorhanden war, fünf Jahre nach der Bildung der Narben nicht länger vorhanden ist.

Die Erfinder haben demnach die Rolle von LOXL bei der Bildung von elastischen Fasern gezeigt, insbesondere unter Verwendung von Hautrekonstruktionsmodellen oder unter Verwendung von Dermis aus der jungen Haut (Vorhaut) von jungen Patienten.

Die Erfinder haben ebenfalls das Fehlen der Expression von LOXL in den Narbengeweben und in der Dermis von humaner Haut verschiedener Altersstufen, also im Zuge des Alterns, gezeigt.

Unter den Isoformen der Lysyloxidasen ist LOXL eine der Isoformen, die die Quervernetzung der elastischen Fasern ermöglicht. Jedoch fehlt genau diese Isoform, LOXL, bei den Adulten für die Quervernetzung der elastischen Fasern, um funktionelle Fasern zu erhalten.

Die Erfinder haben aufgrund dieser unerwarteten Entdeckungen ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffs, der die Bildung von funktionellen elastischen Fasern stimuliert, durchgeführt, mit dem Ziel, Wirkstoffe zur Herstellung von kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen zu identifizieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Aktivierung des Promotors des humanen Gens, das für LOXL kodiert (siehe Beispiel 7).

Verschiedene Aktivitätszonen dieses Promotors sind gezeigt worden. Die Sequenz dieses Promotors wird in dem Anhang wiedergegeben und wird in dem folgenden Text mit PrhLOXL bezeichnet.

Bei diesem Promotor besitzt die Region, die den Nukleotiden -712/-391 entspricht (gemäß der Numerierung, die von +1 der Translation (Translationsinitiationsstelle) des hLOXL-Gens festgelegt ist), eine hoch-regulierende (positiv regulierende) Aktivität auf das Reportergen Luziferase aufweist, das beispielsweise nach transitionaler Transfektion in Fibroblasten aus humaner junger Haut (Vorhaut) exprimiert wird.

Die Erfinder waren in der Lage, putative Regulierungsstellen, reguliert durch Kernfaktoren (nukleare Faktoren), festzulegen. Diese Faktoren korrelierten mit Cytokinen oder anderen Faktoren, von denen bekannt ist, dass sie auf die Transkription verschiedener Gene einwirken.

Verschiedene Regionen von PrhLOXL konnten als aktivierende oder inhibierende Zonen identifiziert werden.

Insbesondere wurden die Regionen -2172/-2002; -1438/-968; -712/-391 als aktivierende Regionen lokalisiert; und die Regionen: -2002/-1438; -968/-712 wurden als inhibierende Regionen identifiziert. Die -80/-1 Region ist nicht aktiv und ist abwärts von +1 der Transkription (Transkriptionsinitiationsstelle) gelegen. Bei dieser Numerierung liegt die putative Transkription (Transkriptionsinitiationsstelle) +1 an Position -342 in Bezug auf die Initiationsstelle der Translation. Auf diese Weise sind einige Stellen dieser Region gezeigt worden, von denen anzunehmen ist, dass sie das hLOXL-Gen regulieren. Diese Stellen sind insbesondere zwei putative Stellen mit einer Antwort auf Retinolsäure, zwei putative Stellen mit einer Antwort auf TGF-&bgr; (Transforming Growth Factor &bgr;), eine putativen Stelle mit einer Antwort auf EGF (Epidermal Growth Factor), drei putative Stellen mit einer Antwort auf Östrogene und zwei putative Stellen mit einer Antwort auf Glucocorticoide (GRE).

Dies impliziert, dass die Wirkstoffe, welche die Neo-Synthese und/oder die Aktivität von hLOXL stimulieren, und so die Bildung von elastischen Fasern stimulieren, auf den Promotor des hLOXL-Gens, insbesondere in diesen Zonen, einwirken, entweder direkt oder indirekt, indem sie die Expression eines Proteins modulieren, das an diese Stellen bindet. Eine Substanz kann daher als wirksam eingestuft werden, wenn sie eine Region umfasst, die in der Lage ist, entweder an mindestens einen Teil der Nukleotidsequenz von PrhLOXL zu binden, und insbesondere an die oben definierten putativen Stellen, zu binden, oder die Expression eines Proteins zu modulieren, das in der Lage ist, dieses zu tun.

Die Gesamtheit der Untersuchungen der Erfinder haben es ermöglicht, ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffs, der die Bildung von elastischen Fasern stimuliert, zu entwickeln.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben die Erfinder eine in situ Hybridisierung durchgeführt, die es ermöglicht, die Expression, insbesondere der messenger RNAs, die für LOXL kodieren, zu lokalisieren und zu verifizieren. Diese in situ Hybridisierung wurde insbesondere mit doppelsträngigen DNA-Sonden, die mit Digoxigenin markiert sind, auf Abschnitten von Hautrekonstruktionsmodellen, die dreißig Tage nach der Zugabe von Keratinocyten angefertigt wurden und in Parafin eingeschlossen wurden, durchgeführt. Die in situ Hybridisierung wurde ebenfalls durchgeführt, um die Expression der messenger RNAs von Tropoelastin und von Kollagen &agr;1(I) zu bestätigen (siehe Beispiel 8).

Die Expression von LOXL mRNAs ist in der tiefen Dermis und durch die gesamte Epidermis hindurch positiv. Die Expression von Tropoelastin mRNA ist nahe den dermalen Fibroblasten und in der Epidermis lokalisiert. Die Expression der Kollagen &agr;1(I) mRNA ist in der Dermis, jedoch nicht in der Epidermis, lokalisiert. Dieses ermöglichst es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, das Vorhandensein der Expression von LOXL mRNAs, insbesondere in einem Hautrekonstruktionsmodell, zum Beispiel nach der Applikation eines Wirkstoffs, der die Bildung der funktionellen elastischen Fasern stimuliert, zu lokalisieren und zu bestätigen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde das hLOXL-Gen durch die Zugabe von Keratinocyten in einem Hautrekonstruktionsmodell, und insbesondere in dem Hautrekonstruktionsmodell Mimeskin^® (Coletica, Lyons, Frankreich), aktiviert. Die Induzierung der Synthese der LOXL mRNAs wurde insbesondere von der von Tropoelastin begleitet und erschien insbesondere ca. 6 Tage nach der Zugabe von Keratinocyten zu dem Dermis-Äquivalent.

Die vorliegende Erfindung hat es ebenfalls ermöglicht, die Abnahme des Expressionslevels, sowohl insbesondere von dem hLOXL-Gen, als auch von dem humanen Gen Elastin, in Fibroblasten, die aus gealterten Spendern stammen, zu zeigen.

Hierfür verwendeten die Erfinder 5 Fibroblastenstämme aus junger Haut (Vorhaut) ("fibroplastes de prépuce") (FP) (aus jungen Kindern stammend) und 6 Stämme aus adulten Fibroblasten ("fibroplastes adultes") (FA, wobei 3 Probanden durchschnittlich 20 Jahre alt waren und 3 Probanden durchschnittlich 60 Jahre alt waren), die aus dem Abdomen aus einer plastischen Chirurgie stammen. Die Expression des Gens, das für das Protein LOX kodiert, wurde ebenfalls untersucht (siehe Beispiel 9).

Die Expression dieser 3 Gene von Interesse, ebenso wie die Expression von Actin, wurde mittels Echtzeit RT-PCR analysiert. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Art der Analyse beschränkt. Diese Technik ermöglicht es, die Expression eines Gens präzise zu quantifizieren, indem sie mit der Expression von Actin, welche als konstant betrachtet wird, verglichen wird. Die Regulation des Expressionslevels des Gens kann dadurch quantifiziert werden.

Die in 12 dargestellten Ergebnisse zeigen zunächst, dass die Synthese von LOXL mRNA spektakulär und statistisch signifikant in den Fibroblasten von Adulten abnimmt, mit einer Abnahne von nahezu 70% bezogen auf die Fibroblasten aus der jungen Haut (Vorhaut), während sich die Menge an mRNA von Elastin im Alter nicht signifikant unterscheidet. Diese Daten stimmen mit der Literatur von Elastin überein, da, wenn das Elastingewebe sich verschlechtert und nicht ersetzt wird, es nicht an einer Inhibierung der Aktivität des Elastin-Gens zu liegen scheint.

Die Synthese von LOX mRNA nimmt um durchschnittlich 40% in den FAs ab, bezogen auf die FPs, da jedoch dieses Enzym in normaler humaner Haut nicht immer exprimiert wird, ist dieser Unterschied für das Phänomen in vivo nicht sehr aussagekräftig.

Vorteilhafterweise wird ebenfalls die Expression des Proteins Elastin stimuliert, um so die Bildung der elastischen Fasern stärker zu stimulieren.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, mit dem es möglich ist, die Expression von LOXL, insbesondere in den Fibroblasten, zu identifizieren. Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, diese verschiedenen Techniken so einzusetzen, dass Wirkstoffe identifiziert werden können, die die Bildung von elastischen Fasern stimulieren.

Im allgemeinen wird bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung nach der Expression des Proteins LOXL gesucht, und insbesondere nach der Expression der messenger RNAs, die für LOXL kodieren, gesucht (siehe Beispiel 10).

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Wirkstoffe, welche die Bildung von elastischen Fasern stimulieren (siehe Beispiele 11 und 12).

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung des Enzyms LOXL oder eines Derivats hiervon oder der Wirkstoffe, wie oben beschrieben, zum Herstellen von kosmetischen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen (siehe Beispiele 13 bis 18). Die Stimulierung von LOXL kann auf der Genebene, auf der Ebene der messenger RNA oder direkt auf der Ebene des Proteins durchgeführt werden. Die Aktivierung ermöglicht die Bildung von elastischen Fasern, insbesondere durch die Quervernetzung des Elastins durch das Enzym LOXL.

Andere Ziele, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden sich dem Fachmann eindeutig beim Lesen der erklärenden Beschreibung, die auf die folgenden Beispiele verweist, erschließen.

Die Beispiele stellen einen integralen Teil der vorliegenden Erfindung dar und jedes beliebige Merkmal, welches bezogen auf den Stand der Technik aus der Beschreibung einschließlich der Beispiele neu erscheint, wird in seiner Gesamtheit einbezogen, und stellt einen integralen Teil der Erfindung in seiner Funktion und in seiner Allgemeinheit dar.

Daher ist jedes Beispiel von allgemeiner Bedeutung (für die Gegenstände der Erfindung).

Weiterhin sind in den Beispielen alle Prozentsätze in Gewichts-Prozent angegeben, solange nichts anderes angegeben ist, die Temperatur wird in Grad Celsius ausgedrückt, solange nichts anderes angegeben ist, und der Druck ist Luftdruck, solange nichts anderes angegeben wird.

Die Abkürzungen „M", mM" und „&mgr;M" stehen im Folgenden für die Einheiten mol/l, mmol/l bzw. &mgr;mol/l.

Beispiel 1

Die Erfindung hat erstmals zu der Entwicklung neuer spezifischer Antikörper von LOX und LOXL geführt, die jedoch in der Lage sind, die reifen Formen von LOX und LOXL zu detektieren. Die Antikörper wurden gegen die reifen Regionen von LOX und LOXL entwickelt. Die antigenen Regionen wurden so ausgewählt, dass sie das Minimum an Ähnlichkeit mit den entsprechenden Regionen auf anderen Isoformen der Lysyloxidasen (LO) aufweisen. Die Antikörper, die gegen die Regionen des Peptids LOX^V228-S280 erhalten wurden, wurden antiLOXmat genannt und vergleichbar wurden die Antikörper, die gegen die Region des Peptids LOXL^R231-G368 erhalten wurden, anti-LOXLpro genannt.

1: Beschreibung der Sequenzen von LO, die bestimmt wurden, um spezifische Antikörper zu erzielen: Diese Figur stellt die Schritte dar, die zu der Auswahl der antigenen Regionen zum Entwickeln der Antikörper anti-LOX und anti-LOXL geführt haben.

1(A): Schematische Darstellung von hLOX (humanes LOX-Protein) und hLOXL (humanes LOXL-Protein).

Die Sequenzen von hLOX und hLOXL werden durch offene Boxen angezeigt, gepunktet in den C-terminalen Regionen, um die Regionen der höchsten Ähnlichkeit hervorzuheben. Die Position der Spaltung der Prä-Region und der Spaltungsstellen der Prokollagen-C-Proteinase (PCP), jeweils an den Resten A22 und D169 von hLOX, wird/werden angezeigt. Die Position der Spaltung der Prä-Region von LOXL vor dem Rest Q26 der N-terminalen Reifungsstelle des 56 kDa-Vorläufers (vor D135) und die Position der Spaltungsstellen des LOXL-Vorläufers von 56 kDa (vor den Resten D338) durch PCP werden angezeigt. Die entsprechenden LOXL-Proteine Q²⁶-S⁵⁷⁴,D¹³⁵-S⁵⁷⁴ und D³³⁸-S⁵⁷⁴ würden eine abgeleitete molekulare Masse von jeweils ungefähr 63 kDa, 54,6 kDa und 26,7 kDa darstellen. Die Lokalisation der rekombinanten Peptide, die verwendet wurden, um die anti-LOX-Antikörper zu erhalten, werden angezeigt: das G128-L212-Peptid für den anti-LOXpxo, das V228-S280-Peptid für den anti-LOXmat und das D305-N373-Peptid für den anti-LOXcat. Die Lokalisation der rekombinanten Peptide, die verwendet wurden, um die anti-LOXL-Antikörper zu entwickeln, wurde angezeigt: das R231-G368-Peptid für den anti-LOXLpro und S355-D415 für den anti-LOXLmat.

1(B): Der Prozentsatz der Ähnlichkeit zwischen den antigenen Regionen von LOX und LOXL mit ihren Äquivalenten auf den LO-Isoformen wird in der Tabelle angezeigt In der Tabelle von 1(B) stellt hLOXL das humane LOXL-Protein dar, bLOXL stellt das LOXL-Protein aus dem Rind dar, mLOXL stellt das LOXL Protein aus der Maus dar, hLOX stellt das humane LOX-Protein dar, bLOX stellt das LOX-Protein aus dem Rind dar, hLOXL2 stellt das humane LOXL2-Protein dar, hLOXL3 stellt das humane LOXL3-Protein dar, hLOXL4 stellt das humane LOXL4-Protein dar.

Die Längsspalte (aa) enthält die Angabe zur Anzahl der Aminosäuren, die in den entsprechenden Regionen enthalten sind.

Um die Antikörper zu erhalten, wurden die chimeren Gene konstruiert, indem die definierten Sequenzen von hLOXL oder hLOX phasengleich mit dem Gen der Glutathion-S-Transferase (GST) in die BamHI-XhoI-Stellen des Expressionsplasmids pGEX-4T-3 (Amersham Biosciences) eingeführt wurden.

Das Fusionsgen GST-LOXL^S355-D415 wurde durch Einführen der cDNA-Sequenz von hLOXL (hLOXL cDNA), die mittels PCR mit dem Sense-Primer 5'-TTGGATCCAGCGTAGGCAGCGTGTAC-3' (SEQ ID Nr. 16) bzw. und dem Antisense-Primer 5'-AAACTCGAGCATCGTAGTCGGTGGC-3' (SEQ ID Nr. In hergestellt wurde, konstruiert.

Das Fusionsgen GST-LOX^G128-L212 wurde durch Einführen der hLOX cDNA, amplifiziert mit dem Sense-Primer 5'-TCGGATCCGGCTACTCGACATCTAGAGCC-3' (SEQ ID Nr. 18) bzw. dem Antisense-Primer 5'-GTCCTCGAGACCGTACTGGAAGTAGCC-3' (SEQ ID Nr. 19), konstruiert.

Das Fusionsgen GST-LOX^V228-S279 wurde durch Einführen der hLOX-Sequenz, amplifiziert mit dem Sense-Primer 5'-TTGGATCCGTGCAGAAGATGTCCATGTAC-3' (SEQ ID Nr. 20) bzw. dem Antisense-Primer 5'-TTTCTCGAGGCTGGGTAAGAAATCTGATG-3' (SEQ ID Nr. 21), konstruiert.

Das Fusionsgen GST-LOX^D306-N373 wurde durch Einführen der hLOX cDNA, amplifiziert mit dem Sense-Primer 5'-CACTATGGATCCCTTGATGCCAACACCC-3' (SEQ ID Nr. 22) bzw. dem Antisense-Primer 5'-CACGACCTTTAGGATATCGTTTCCAGG-3' (SEQ ID Nr. 23), konstruiert.

Für alle diese Amplifikationen mittels PCR wurde die Taq-Polymerase High Fidelity (Roche Diagnostic, Meyman, Frankreich) verwendet.

Die Fusionsproteine GST-LOX und GST-LOXL ebenso wie die polyklonalen Antikörper aus Kaninchen, wurden erhalten und aufgereinigt, wie es oben für die Fusionsproteine, die aus der Expression der Fusionsgene GST-LOXL^S335-D415 und GST LOX^G128-L212 stammten, beschrieben wird (Decitre et al, Lab. Invest., 78, 143-151, 1998; Borel et al., J. Biol. Chem, 276 48944-49, 2001).

Für die Adsorptionsexperimente wurden die Antikörper für 3 Stunden bei 20°C mit den Fusionsproteinen inkubiert, wobei sie selbst vor der Immun-Detektion auf einer Nitrocellulose-Membran, Hybond-ECL-Membran (Amersham Bioscienes), adsorbiert wurden.

Diese Teile der Arbeit haben es zum ersten Mal ermöglicht, die reifen Formen von LOX und LOXL, durch die immunchemische und biochemische Charakterisierung der reifen Proteine darzustellen (siehe Beispiel 2, 2). Die entwickelten Antikörper unterscheiden sich von den im Stand der Technik für LOXL verwendeten, die es nicht ermöglichen, die reife Form von LOXL zu erkennen (Decitre et al., Lab Invest 78 : 143-151, 1998; Borel et al., J. Biol. Chem, 276 : 48944-49, 2001;). Die Erfindung hat die Antikörper anti-LOXLmat und anti-LOXmat verwendet, wodurch es möglich war, ein Protein von 31 kDa nachzuweisen, welches von dem anti-LOXLmat, jedoch nicht von dem anti-LOXmat, erkannt wurde, und welches der reifen Form von LOXL entspricht. Dieser Teil der Erfindung stellt einen echten Fortschritt gegenüber dem Stand der Technik dar, insbesondere bezogen auf das Patent von Csiszar et al., welches alle Proteine beschreibt, die von Genen der LO-Familie stammen, ohne ihre Merkmale zu definieren (WO 01/83702 A2 Patentanmeldung: Novel members of the lysyl oxidase family of amine oxidases related applications).

Beispiel 2: Immun-Detektion von LOX und LOXL aus Muskelzellen durch die neuen Antikörper anti-LOX und anti-LOXL 2

2 stellt Fotografien der Elektrophoresen dar, welche, wie unten angezeigt, durchgeführt wurden. Diese Elektrophoresen zeigen die Charakterisierung der reifen Proteine LOX und LOXL aus glatten Muskelzellen („cellules musculaires lisses" (CML); „smooth muscle cells," (SMC)) durch die in Beispiel 1 definierten Antikörper anti-LOX und anti-LOXL.

Die Proteine des Zellstamms (L) und des Zellkulturmediums (M) einer Zelllinie aus glattem Muskel der Ratte (entwickelt von Jean-Marie Daniel Lamaziere, Bordeaux) wurden extrahiert, mittels Western Blotting und unter Verwenden der Antikörper anit-LOXLmat, anti-LOXmat, anti-LOXLpro und anti-LOXpro detektiert. Die Zellen wurden bei 37°C in einer Atmosphere von 5% CO₂ in DMEM-Medium (Sigma), enthaltend 10% fötales Kälberserum, 2 mM Glutamin und 50 &mgr;g/ml Gentamycin, kultiviert.

Die Proteine des Zellstamms, welche zweimal mit PBS-Puffer gewaschen wurden, wurden 2 Stunden bei 4°C unter leichtem Rühren in Lysis-Puffer (16 mM Phosphat-Puffer pH 8, 0,5% NP40, Protease-Inhibitoren (Complete Mini, Roche Diagnostics) und Harnstoff 6 M) extrahiert. Die Lysate wurden mit zwei Volumina 16 mM Phospat-Puffer pH 8 mit Protease-Inhibitoren (Complete Mini, Roche Diagnostics, Meylan, Frankreich) verdünnt und für 5 Minuten bei 15.000 g zentrifugiert. Die löslichen Proteine wurden vor der Elektrophorese durch Zugabe von 10% Trichoressigsäure (TCA) präzipitiert.

Die Proteine aus den Kulturmedien von Zellen, die für 48 Stunden ohne Serum kultiviert wurden, wurden gewonnen und durch die Zugabe von 10% TCA oder 50% gesättigtem Ammoniumsulfat präzipitiert.

Für die Immun-Detektion wurden die Proteine mittels 10% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese separiert. Die Proteine wurden auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran (Immobilon P^SQ, Millipore) transferiert und wie oben beschrieben, immundetektiert (Borel et al., 2001).

Die entwickelten Antikörper ermöglichen folglich, die reifen und unreifen Formen von LOX und LOXL in biologischen Geweben zu charakterisieren und zu lokalisieren.

Beispiel 3: Darstellung der Rolle von LOX und LOXL in der Elastogenese

Die Erfinder haben durch Immun-Histochemie gezeigt, dass die LOX- und LOXL-Proteine mit der Bildung des Bindegewebes in der Dermis von Hautrekonstruktionsmodellen in Verbindung gebracht werden können, (3). Diese Darstellung wurde ohne jede Mehrdeutigkeit durch die Verwendung von Antikörper-Paaren von anti-LOX und anti-LOXL, die gegen die pro-enzymatischen Regionen und die reifen Regionen der zwei Enzyme (LOX und LOXL) gerichtet waren, erzielt.

3 stellt die immun-histologische Detektion von LOXL und LOX in rekonstruierter Haut („peau reconstruite"; PR) und normaler humaner Haut dar:

Die Immun-Detektion von LOXL (A, C, E, G) auf rekonstruierter Haut an den Tagen 16 (A), 35 (C) und 45 (E) unter Verwenden von anti-LOXL^R231-G368 (A, C, E) oder von anti-LOXL^R231-G368, das vor der Immun-Detektion mit dem entsprechenden Peptid GST-LOXL^R231-G368 adsorbiert wurde (G). Die Immun-Detektion von LOX (B, D, F, H) an den Tagen 16 (B), 35 (D) und 45 (F) durch Verwenden von anti-LOX^V228-S279 (B, D, F) oder anti-LOX^V228-S279, welches vor der Immun-Detektion mit dem entsprechenden Peptid GST-LOX^V228-S279 adsorbiert wurde (H). Die Immun-Detektion von LOXL (I) und LOX (J) aus humaner junger Haut (Vorhaut) wurde durch Verwenden von anti-LOXL^R231-G368 (I) und anti-LOX^V228-S279 (J) durchgeführt. Die Lage der dermal-epidermalen Verbindungsstelle wird durch einen offenen Pfeil angezeigt, die Lage des dermalen Substrats wird mit einem Pfeil und die Lokalisation der Keratinocyten an Tag 16 wird durch einen Pfeilkopf angezeigt.

Die rekonstruierte Haut (Mimeskin^®, Coletica, Lyons, Frankreich) wurde in Bouin's Fixiermittel (LOX, LOXL, Elastin) oder in einer 10%-Formol-Lösung (für Elastin) präpariert und dann in Paraffin eingeschlossen. 6 &mgr;m dicke Abschnitte wurden von dem Parafin befreit und in Glycin-HCl (100 mmol/l) gebleicht. Die Antikörper anti-LOX- und anti-LOXL wurden oben beschrieben.

Die Antikörper wurden in der folgenden Verdünnung verwendet: 1 : 500 (anti-LOX^R231-G368), 1 : 100 (anti-LOX^V228-S279, anti-LOXL^S355-D416). Die Immunkomplexe wurden mit einem anti-IgG aus Kaninchen (Ziege), konjugiert mit Peroxidase (DAKO, Trappes, Frankreich), unter Verwenden von Diaminobenzidin als Substrat (DAKO) detektiert.

LOXL ist demnach ein ausgezeichneter Kandidat, der an der Elastogenese in einem Hautrekonstruktionsmodell, wie insbesondere Mimeskin^®, beteiligt ist.

Beispiel 4: Darstellung der Rolle von LOXL2, LOXL3 und LOXL4 in der Elastogenese

Die Erfindung deckt ebenfalls die Entwicklung von zwei neuen LOXL2-Antikörpern ab, wobei einer dieser Antikörper theoretisch ebenfalls LOXL3 und LOXL4 erkennt. Hierdurch konnte festgestellt werden, ob diese Enzyme zusammen mit Elastin in der Dermis eines Hautrekonstruktionsmodells exprimiert werden. Die Analyse mittels Immunhistochemie unter Verwenden der zwei anti-LOXL2-Antikörper zeigte tatsächlich, dass dieses Antigen LOXL2, ebenso wie die zwei Antigen-verknüpften Proteine LOXL3 und LOXL4 nicht oder nur gering in der Dermis exprimiert werden, und dass sie daher nicht an der Elastogenese beteiligt sind.

In 4: wird die Immun-Detektion auf Abschnitten aus rekonstruierter Haut (16, 35 und 45 Tage) und aus humaner junger Haut (Vorhaut) mit dem Antikörper antiLOXL2^517-581 (linke Spalte) und dem Antikörper anti-LOXL2^664-720, der theoretisch LOXL2, LOXL3 und LOXL4 erkennt, (rechte Spalte) dargestellt.

Die anti-LOXL2-Antikörper wurden, wie oben beschrieben, gegen die Fusionspeptide GST-LOXL2 erhalten (Decitre et al, Lab. Invest., 78, 143-151, 1998). Das Fusionsgen GST-LOXL2^517-581 wurde durch Einfürhren der Sequenz 1543 bis 1747 des humanen LOXL2-Gens (hLOXL2) in das Plasmid konstruiert, wie oben beschrieben.

Dieses Segment wurde mittels PCR mit dem Sense-Primer 5'-GAGCTGGGATCCGCGCACTGCC-3' und dem Antisense-Primer 5'-GGCTGAGTCGACGAGGCAGTTCTCC-3' erzeugt.

Das Fusionsgen GST-LOXL2^664-720 wurde durch Einführen der entsprechenden hL0XL2-Sequenz mit dem Sense-Primer 5'-CACAGGATCCGAAGGAGACATCCAGAAG-3' und dem Antisense-Primer 5'-TTTCTGAGCTCCTGCATTTCATGATG-3' erzeugt.

Die Fusionsproteine und die Anti-Kaninchen-Antikörper, die gegen diese Proteine erzeugt wurden, wurden wie oben beschrieben hergestellt. Der Antikörper gegen das Peptid 517-580 wurde anti-LOXL2 genannt, da diese Region spezifisch für LOXL2 ist.

Der Antikörper gegen das Peptid 664-734 wurde anti-LOXL-R (für "relativ zu") genannt, da diese Region von LOXL2 eine starke Ähnlichkeit mit LOXL3 und LOXL4 besitzt (ungefähr 74,6% bzw. 60,5%).

Die rekonstruierten Häute (Mimeskin^®, Coletica, Lyons, Frankreich) vom Tag 16 (RS-D16), Tag 35 (RS-D35) und Tag 45 (RS-D45) und die junge humane Haut (Vorhaut) wurden, wie oben beschrieben, mittels Immunhistochemie mit den Antikörpern anti-LOXL2-R und anti-LOXL2 analysiert. Anti-LOXL2 zeigte eine Expression von LOXL2 in der Epidermis und nicht in der Dermis, während der Antikörper, der gegen die gemeinsame C-terminale Region von LOXL2, LOXL3 und LOXL4 gerichtet ist, die Expression dieser Enzyme in der Epidermis bestätigte und eine geringe Expression in der Dermis zeigte, jedoch in einer Zone, die nicht den Stellen der Elastogenese entspricht.

LOXL2, LOXL3 und LOXL4 sind daher nicht an der Elastogenese beteiligt.

Beispiel 5: Darstellung der Rolle von LOXL in der Elastogenese

Die Verbindung zwischen LOXL oder LOX auf der einen Seite und den elastischen Fasern oder den Mikrofibrillen auf der anderen Seite wurde durch die vorliegende Erfindung mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie eindeutig dargestellt.

LOX und LOXL, die mit den Mikrofibrillen verbunden sind, stellen den Rahmen (das Gestell) dar, auf dem das Elastin aufgelagert wird, während lediglich LOX mit der Bildung der Kollagenfasern assoziiert ist. (siehe 5).

5: stellt die Immun-Detektion von LOXL, von LOX und von Elastin mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie in dem dermalen Teil der rekonstruierten Haut, 30 Tage nach der Applikation der Keratinocyten, und in der normalen humanen Haut dar.

Die Gewebe wurden für drei Stunden bei 4°C mit 4% Paraformaldehyd in PBS-Puffer, enthaltend 0,1% Glutaraldehyd, fixiert und wurden dann in Phosphatpuffer, enthaltend 0,4 M Sucrosecacodylat und 0,2 M Lysin, gewaschen, in Ethanollösungen dehydriert und in LR White (Euromedex, Frankreich) eingeschlossen. Die Detektion wurde mit primären Antikörpern durchgeführt, die 1 : 50 in Tris-HCl-Puffer bei pH 8,2 verdünnt wurden, und zu dem 1% Rinderserumalbumin (BSA) hinzugefügt wurde. Die Immunkomplexe wurden mit einem anti-IgG-Antikörper aus Kaninchen detektiert, der mit Kolloid-Gold-Partikeln von 10 und 20 nm (Biocell, Tebu, Frankreich) konjugiert wurde, und wurden auf 1 : 40 verdünnt. Die Proben wurden mit 3% Uranylacetat und Bleicitrat ("lead citrate") kontrastiert und dann unter einem JEOL 1200 EX Elektronenmikroskop studiert. Die Immun-Detektion wurde auf der rekonstruierten Haut (A-D) und auf der jungen Haut (Vorhaut) (F-I) durchgeführt.

Auf der rekonstruierten Haut wurde sie mit den Antikörpern: anti-LOXL (A, B), anti-LOX (C), anti-Elastin (Eln) (D), humaner anti-Elastin-Antikörper, die kommerziell erhältlich sind (Sigma, USA) und 1 : 50 verdünnt wurden, und einer Negativkontrolle ohne primären Antikörper in der Dermis (Kontrolle) (E) durchgeführt. Auf der jungen Haut (Vorhaut) wurde sie mit einer Doppelmarkierung (F-I) durchgeführt.

Referenzen A-D: Immun-Detektion von LOXL, LOX und Elastin mittels Elektronenmikroskopie in dem dermalen Teil der rekonstruierten Häute nach 45 Tagen.

Referenz E: Positivkontrolle mit den Antikörpern anti-Elastin und anti-Kollagen I in der Dermis von rekonstruierten Häuten nach 45 Tagen, d.h. 30 Tage nach der Zugabe von Keratinocyten.

Referenzen F und I: Doppel-Immun-Detektion von LOXL, LOX, Elastin und Kollagen mittels Elektronenmikroskopie in dem dermalen Teil von humaner junger Haut (Vorhaut).

Referenzen G-H: Doppelmarkierung in dem dermalen Teil der humanen jungen Haut (Vorhaut) mit dem Antikörper anti-LOXL aus Kaninchen (der anti-IgG aus Kaninchen ist konjugiert mit 10 nm Goldpartikeln) und dem murinen Antikörper anti-Elastin (der anti-IgG aus Maus ist konjugiert mit 20 nm Goldpartikeln).

Legende in der Figur: m : Mikrofibrillen, c : Kollagenfasern, e : amorphes Elastin. Maßstab: 500 nm.

LOXL (A-B) wurde in Verbindung mit den dichten Ablagerungen oder auf den Mikrofibrillen, jedoch nicht mit den Kollagenfasern, welche in diesen Abschnitten weiß erscheinen, detektiert. Die Markierung von LOX (C) war gering, obwohl ein paar Goldpartikel in den dichten Ablagerungen, den Mikrofibrillen und dem Kollagen gefunden werden konnten. Die anti-Elastin-Antikörper wurden in den gleichen dichten Ablagerungen und den Mikrofibrillen (D) detektiert. Die Verbindung von LOXL und LOX mit den Mikrofibrillen und den elastischen Fasern wurde durch Elektronenmikroskopie nach der Immun-Detektion (G-H) in humaner junger Haut (Vorhaut) bestätigt. Wie bei den Beobachtungen bei den Hautrekonstruktionsmodellen, ist LOXL nicht mit den Kollagenfasern verbunden, im Gegensatz zu LOX, welches stark in den Kollagenfasern und schwach in den Mikrofibrillen vorhanden ist. Die LOXL-Antigene wurden in Verbindung mit den Mikrofibrillen und rund um die elastischen Fasern von humaner junger Haut (Vorhaut) detektiert. LOXL ist nicht mit dem amorphen Elastin verbunden, welches sich rund um die Mikrofibrillen ausdehnt, wird jedoch hauptsächlich auf deren Peripherie, und nicht in Verbindung mit den Kollagenfasern beobachtet.

LOXL ist in den Hautrekonstruktionsmodellen und in humaner junger Haut (Vorhaut) mit den elastischen Fasern verbunden.

Beispiel 6: Darstellung der Beziehung zwischen der Expression von LOXL und der Elastogenese

LOXL und LOX werden in der Dermis von junger Haut (Vorhaut), die jungen Patienten (einige Monate) entnommen wurde, die noch eine hohe Elastin-Synthese besitzen, exprimiert.

LOXL wird jedoch nicht in der Dermis von adulter Haut aus dem Nacken, der Brust, dem Abdomen oder dem Gesicht exprimiert, während LOX immer in der Dermis exprimiert wird (6).

6: stellt die Immun-Detektion von LOX und LOXL in humaner Haut dar.

Die Antikörper anti-LOX (A, C, E, G) und anti-LOXL (B, D, F, H) wurden zum Detektieren der Expression von LOX und LOXL in Proben von junger Haut (Vorhaut) (A, B), aus dem Nacken (C, D), aus der Brust (E, F) und aus dem Abdomen (G, H), welche aus der Gewebebank des Edouard Herriot Hospitals, Lyons, Frankreich, stammte, verwendet. Die Gewebe wurden mit Bouin's Reagenz fixiert, in Parafin eingeschlossen und für die Immun-Detektion so behandelt, wie es für die oben beschriebenen Immun-Detektionen erfolgt ist.

Das Ausbleiben der Detektion von LOXL in der Dermis der Haut aus dem Nacken, der Brust, dem Abdomen oder dem Gesicht wird sowohl beim Kind (jungem Patienten) als auch beim Adulten betätigt (7: Abdomen).

7: stellt die Immun-Detektion von LOX und LOXL in Häuten von humanen Abdomen, die Probanden verschiedener Altersstufen entnommen wurden, dar.

Die Antikörper anti-LOX (A, C, E, G) und anti-LOXL (B, D, F, H) wurden zum Detektieren der Expression von LOX und LOXL in Proben von Haut aus dem Abdomen verwendet, die im Alter von 1,5 Jahren (A, B), 35 Jahren (C, D), 60 Jahren (E, F) und 91 Jahren (G, H) entnommen wurde, und die von der Gewebebank des Edouard Herriot Hospitals stammten. Die Gewebe wurden mit Bouin's Reagenz fixiert, in Parafin eingeschlossen und für die Immun-Detektion, wie für die vorangehende Immun-Detektion beschrieben, behandelt.

Im Verlauf der entspxechenden Arbeitsschritte wurde eine starke Expression von LOX und LOXL in der Epidermis von humaner Haut beobachtet, mit einer sehr späten Extinktion der Expression dieser 2 Enzyme (Alter 91 Jahre) (7).

In den Narben konnte weder LOXL noch LOX in den Narbengewebszonen, weder 3 Monate nach Entstehen der Narbe noch 5 Jahre nach Entstehen der Narbe, beobachtet werden. Es ist festzustellen, dass Elastin 3 Monate nach Entstehung der Narbe immun-detektiert wurde, und dass es nach 5 Jahren ausblieb (8).

8: stellt die Immun-Detektion von LOX und LOXL in Häuten von Narbengewebe zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Heilung dar.

Die Antikörper anti-LOX (A, D, G), anti-Elastin (B, E, H) und anti-LOXL (C, F, I) wurden zum Detektieren der Expression von LOX, von Elastin und von LOXL in Proben von Haut aus dem Nacken eines 17jährigen Patienten rund um die Narbe herum ("normale" Zone, A-C), 3 Monate (D-F) oder 5 Jahre (G-H) nach einer Heilung, verwendet. Die Gewebe wurden mit Bouin's Reagenz fixiert, in Parafin eingeschlossen und für die Immun-Detektion, wie es für die vorangehenden Immun-Detektionen beschrieben wurde, behandelt. Das Markieren von Elastin erforderte ein Demaskieren mit Hilfe von 0,2 % Hyaluronidease (Sigma).

Durch diese Beispiele zeigt die Erfindung, dass folgendes existiert: (i) eine unbestreitbare Implikation von LOXL in die Bildung von elastischen Fasern in Hautrekonstruktionsmodellen und in der Dermis von junger Haut (Vorhaut) von jungen Patienten und (ii) ein wahrhaftes Defizit der Expression von LOXL in der Dermis von humaner Haut verschiedener Altersstufen und in Narben. LOXL ist daher in der Tat die einzige Lysyloxidase-Isoform, die in der Lage ist, auf der einen Seite die Quervernetzung der funktionellen elastischen Fasern zu ermöglichen und auf der anderen Seite in der Situation zu fehlen, in der eine Quervernetzung der elastischen Fasern erforderlich ist, um funktionelle Fasern herzustellen. LOX, das ebenfalls mit der Bildung von elastischen Fasern assoziiert sein könnte, fehlt nicht in der Haut von Adulten.

Beispiel 7: Untersuchung der prä-transkriptionalen Regulation des LOXL-Gens

Die Erfindung hat weiterhin gezeigt, dass das humane LOXL-Gen (hLOXL) auf der Ebene seines Promotors aktiviert werden kann (9). Die SEQ ID Nr. 3 beschreibt die Nukleotide von -2730 bis -1 der Promotorsequenz. Es wurden verschiedene Aktivitätszonen des hLOXL-Promotors gezeigt. Insbesondere die Region, die den Nukleotiden -712/-391 (entsprechend der definierten Nummerierung von +1 der Translation (Translationsinitiationsstelle) des LOXL-Gens) entspricht, zeigt eine hoch-regulierende (positive) Aktivität des Reportergens Luziferase, welches nach der transitionalen Transfektion in Fibroblasten der Haut von humaner junger Haut (Vorhaut) expirmiert wurde (9).

Es liegt daher eine prä-transkriptionale Hoch-Regulierung (positive Regulierung) des hLOXL-Gens vor, was anzeigt, dass es möglich ist, die Synthese dieses Gens, und dadurch des entsprechenden hLOXL-Proteins, zu aktivieren, da die Erfinder im Voraus gezeigt haben, dass die Unterschiede in der Expression von hLOXL begleitend verfolgt werden können, und zwar zu dem Level der Gene und/oder der Proteine. Dies ist ebenfalls für LOX gezeigt worden (Decitre et al., Invest., 78, 143-151, 1998).

Eine Untersuchung der Nukleotidsequenz von PrLOX mit Hilfe der Software Transfac^® im Internet, hat es ermöglicht, putative Regulationsstellen, reguliert durch Kernfaktoren (nukleare Faktoren) zu bestimmen. Diese Faktoren korrelieren mit Cytokinen oder anderen Effektoren, von denen bekannt ist, dass sie auf die Transkription bestimmter Gene über deren Transkriptionsfaktoren einwirken. Die interessantesten Stellen werden in 10 dargestellt. Dieses Schema fasst diese Analyse zusammen und zeigt 2 putative Stellen einer Antwort auf Retinolsäure, 2 putative Stellen einer Antwort auf TGF-&bgr;, 1 putative Stelle einer Antwort auf EGF, 3 putative Stellen einer Antwort auf Östrogene und 2 putative Stellen einer Antwort auf Glucokortioide. Es war daher möglich, verschiedene Stellen zu definieren, welche die Transkription des LOXL-Gens regulieren könnten, da sie in den Regulationszonen lagen. Dieses sind die putativen Elemente einer Antwort auf Retinolsäure, TGF-&bgr;, EGF und Glucokortioide. Diese Zonen, welche mit den putativen Regulationsstellen durch Retinolsäure und Östrogene entsprechen, scheinen eine tatsächliche Aktivierungswirkung auf die Transkription zu besitzen, da die Aktivität des Promotors ohne diese Elemente auf jeweils ungefähr 50 % und 60 % abfällt. Die Regulationsstelle durch TGF-&bgr; scheint die Promotoraktivität zu verringern.

Die so beschriebenen Hilfsmittel können verwendet werden, um Wirkstoffe zu screenen, die agonistische oder antagonistische Wirkung auf den Promotor von hLOXL haben, und insbesondere auf die putativen Regulationsstellen.

Es ist folglich vorteilhaft, nach Wirkstoffen zu suchen, die eine Region umfassen, die mit mindestens einem Teil der Nukleotidsequenz des Promotors von hLOXL hybridisiert, oder welche Effektorproteine induzieren, die diese Eigenschaft besitzen.

Funktionelle Analyse des Promotors des hLOXL-Gens

Der Promotor des humanen LOXL-Gens (PrhLOXL) wurde mittels der Sequenzen aus den Datenbanken festgelegt. Da die Transkriptionsinitiationsstelle unbekannt war, nummerierten die Erfinder diese im Verhältnis zu +1 der Translation(Translationsinitiationsstelle). Dadurch, dass die Suche nach EST (Expressed Sequence Tags) cDNA, die dieser Region entspricht, keine Sequenz weiter aufwärts von der Position -342 ergab, konnte angenommen werden, dass die Initiation der Transkription des hLOXL-Gens in dieser Region (ohne TATA-Box) erfolgt. Spezifische Primer wurden in dieser Sequenz an Position -2172 und +189 (Exon 1) erstellt. Mit ihnen konnte die Amplifikation und die Isolation von PrhLOXL aus humaner genomischer DNA, die aus Hautfibroblasten stammte, erfolgen. Es erfolgte eine Klonierung und Sequenzierung, um eine Sequenz bereitzustellen, die mit der in den Datenbanken definierten Sequenz übereinstimmt. Dann konnte der „vollständige" Promotor, der sich von -2172 bis -1 erstreckte, in den pGL3-Basisvektor (Promega, Charbonniéres, Frankreich) subkloniert werden, um ihn in eukaryotischen Zellen zu untersuchen. Er wurde aufwärts des Reportergens, dem Luziferase-Gen, platziert. Auf diese Weise steht die Produktion von Luziferase durch die transfizierten Zellen unter der Kontrolle des PrhLOXL und steht daher proportional zu dessen Aktivität. Die Zellen wurden gleichzeitig mit einem Promotor, der intensiv und reproduzierbar &bgr;-Galactosidase (&bgr;-Gal) exprimiert, transfiziert, um die Ergebnisse zu normen. Die Luziferase- und &bgr;-Gal-Enzymaktivitäten wurden dann unter den gleichen Bedingungen gemessen.

PrhLOXL wurde stufenweise reduziert (5'-Deletion), um die Rolle der entfernten Regionen zu bestimmen. Ziel war es, die Regulation von PhrLOXL in den Fibroblasten von humaner Haut zu untersuchen, wobei die Transfektion der Fibroblasten überprüft wurde. Im Gegensatz zu diesen Zelllinien, die leicht transfizierten, transfizierten normale Fibroblasten sehr schwach. Es wurde Superfect^® (Qiagen, Courtaboeuf, Frankreich) ausgewählt, da es die Transfektion von ungefähr 40 % der Fibroblasten in der Kultur ermöglicht.

Die hergestellten Konstrukte sowie ihre Aktivität in den Fibroblasten der jungen Haut (Vorhaut), werden in 9 dargestellt. Die Erfinder lokalisierten drei große aktivierende Regionen der Transkription und zwei inhibierende Regionen. Z.B. ist die Region -712 → -391 stark aktivierend, da die Aktivität des Promotors beträchtlich abnimmt, wenn diese entfernt wird (Konstrukt -391 → -1). Diese Untersuchung hat es ermöglicht, die für die Stimulation der Transkription von PrhLOXL zu untersuchenden Zonen zu spezifizieren.

9 stellt insbesondere die Luziferase/&bgr;-Galactosidase-Aktivität als eine Funktion der Promotorsequenz PrhLOXL dar. Diese Figur erleichtert das Verständnis der Definition von aktivierenden und inhibierenden Regionen des Promotors in einer humanen Fibroblastenzelle aus junger Haut (Vorhaut).

Die sukzessiven Reduzierungen von PrhLOXL am 5'-Ende haben es ermöglicht, sieben Konstrukte zu erzeugen, die aus immer kürzeren Sequenzen des Promotors bestanden: pLL-2172, pLL-2002, pLL-1438, pLL-712, -pLL-391, -pLL-81. Die Konstrukte wurden in Fibroblasten aus humaner junger Haut (Vorhaut) transfiziert und die Luziferase-Aktivität wurde gemessen: Parallel hierzu wurden die Zellen ebenfalls mit einem Plasmid transfiziert, welches das &bgr;-Galactosidase-Gen, unter Kontrolle des Promotors SV40 trägt, um als eine Transfektionseffektivitätskontrolle zu dienen. Die Endwerte entsprachen der Luziferaseaktivität (die die Aktivität (der Sequenzen) des hLOXL-Promotors ausdrückt) verglichen mit der &bgr;-Galactosidase-Aktivität (die die Effektivität der Transfektion zeigt). Die Entwicklung der Aktivitäten ermöglichte es, verschiedene Regulierungszonen des Promotors zu definieren, einschließlich drei Aktivierungszonen, gezeigt durch die Symbole + (-2172 → -2002; -1438 → -968; -712 → -391) und zwei Inhibierungszonen, gezeigt durch die Symbole – (-2002 → -1438; -968 → -712). Der -81 → -1 Promotor ist nicht aktiv und ist abwärts von dem +1 der Transkription (Transkriptionsinitiationsstelle) gelegen. Die putative Stelle +1 der Transkription (Transkriptionsinitiationsstelle) liegt an Position -342, bezogen auf die Initiationsstelle der Translation.

10 stellt eine schematische Ansicht des Promotors des hLOXL-Gens dar und identifiziert insbesondere die putativen Regulationsstellen der Transkription des hLOXL-Gens. Die durch ein "+"-Symbol angezeigten Zonen entsprechen einer Aktivierungszone der Expression des Gens, solche, die durch ein "-" dargestellt werden, entsprechend einer Inhibierungszone dieser Expression.

Beispiel 8: Darstellung der Aktivierung von LOXL durch das Einführen von Keratynocyten in ein Hautrekonstruktionsmodell

Die Detektion der Expression des Gens, das für LOXL kodiert, wurde durch in situ Hybridisierung der messenger RNA von LOXL mit doppelsträngigen DNA-Sonden, die mit Digoxygenin markiert sind, auf Abschnitten, die in Parafin eingeschlossen waren, durchgeführt.

In 11 werden die Abschnitte des Hautmodells (Mimiskin^®) an Tag 35 dargestellt:

(A) Die Expression von LOXL ist positiv in der tiefen Dermis und überall in der Epidermis.
(B) Die Expression von LOX ist positiv überall in der Dermis und in den suprabasalen Schichten der Epidermis.
(C) Die Expression von Tropoelastin (TE) wird in Verbindung mit den dermalen Fibroblasten in der Epidermis gefunden.
(D) Die Expression des Gens COL1A1 (Kollagen I&agr;1) wurde in der Dermis, jedoch nicht in der Epidermis, detektiert.
(E) Kontrolle ohne Sonde.

Die Position des JED (eng.: „DEJ") (dermal-epidermale Verbindungsstelle) wird durch einen offenen Pfeil angezeigt, die Position des porösen dermalen Substrats wird durch Pfeile angezeigt und die positiven Zellen werden durch Pfeilköpfe angezeigt.

Die doppelsträngigen DNA-Sonden wurden mittels PCR hergestellt. Es wurden jeweils die folgenden Primer verwendet:

Für das Gen des Ialphal Kollagens, Sense 5'-GTGGAGAGTACTGGATTG-3' (SEG ID Nr. 14) und Antisense 5'-TCGTGCAGCCATCGACAG-3' (SEQ ID Nr. 15), für Tropoelastin, Sense 5'-GTATATACCCAGGTGGCGTG-3' (SEQ ID Nr. 10) und Antisense 5'-CGAACTTTGCTGCTGCTTTAG-3' (SEQ ID Nr. 11); für hLOX, Sense 5'-GGTGGCCGACCCCTACTACATCC-3' (SEQ ID Nr. 12) und Antisense 5'-GCAAATCGCCTCTGGTAGCCATAGTC-3' (SEQ ID Nr. 13); für hLOXL, Sense 5'-GACATAACCGACGTGCAGCC-3' (SEQ ID Nr. 8) und Antisense 5'-ATCCACGTTCGCTCCCTGAG-3' (SEQ ID Nr. 9).

Die DNAs wurden mit Taq-Polymerase (Promega, Charbonnières, Frankreich) und Dig-11-dUTP (Roche Diagnostic, Meylan, Frankreich) als Nukleotid-Marker amplifiziert und wurden dann, nach der Elektropherese in einem Agarosegel, unter Verwenden des QIAquick-Extraktionskit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankreich) aufgereinigt. Die in situ Hybridisierung wurde auf Abschnitten, die in Parafin eingeschlossen waren, durchgeführt. Die Proben wurden von dem Parafin befreit und mit Proteinase K (Roche) bei 2 &mgr;g/ml für 15 Minuten bei 20°C behandelt. Die endogenen Peroxidasen wurden inhibiert, wie es durch das TSA⁺ Amplifizierungskit (NEN, Boston, USA) angegeben wurde. Eine Prä-Hybidisierung wurde für 2 Stunden bei 37 °C in 20 mM Phosphatpuffer pH 7,4 mit 50% deionisiertem Formamid, 2 × SSC (sodium salt citrate), 5 mM EDTA, 2,5 × Denhardt's-Lösung, 200 &mgr;g/ml denatutierter Heringssperma-DNA, 1 mg/ml Lachssperma-DNA und 10 mg/ml tRNA durchgeführt. Die Hybridisierung wurde für 16 Stunden bei 37°C in 20 mM Phosphatpuffer mit 50% deinosiertem Formamid, 2 × SSC, 5 mM EDTA, 2,5 × Denhardt's-Lösung, 200 &mgr;g/ml denaturierter Heringssperma-DNA, 10% Dextransulfat, mit oder ohne vorherige Denaturierung der Sonde für 5 Minuten in einem kochenden Wasserbad, durchgeführt. Nach der Hybridisierung wurden die Abschnitte bei 20°C (oder 37 °C für Kollagen) in 2 × SSC / 50% Formamid, 1 × SSC / 50% Formamid, 1 × SSC und 0,5 × SSC gewaschen. Nach der Dehydrierung wurden die mit Digoxigenin markierten Hybride mit einem anti-Dig-Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (Roche), detektiert. Die Enddetektion der Komplexe wurde unter Verwenden des TSA⁺-Amplifizierungskits (NEN) durchgeführt. Die positiven Signale entsprachen der Aktivität der alkalischen Phosphatase, die gemäß der Amlifizierungsvorgehensweise des TSA-Kits verwendet wurde, nach 2 Stunden Aktivität bei Umgebungstemperatur, und wurde durch die Präzipitation der gebildeten Tetrazoliumsalze festgestellt wurden (unter Verwenden der Substrate Tetrazolium-Nitroblau („Nitrobleu de tètrazolium")/Bromchlorylindolphosphat (NBT/BCIP)).

Die Erfindung zeigt, dass die Gene LOXL und LOX durch die Zugabe von Keratinocyten in einem Hautrekonstruktionsmodell (Mimeskin^®, Coletica, Lyons, Frankreich) aktiviert werden können, wie es die Zuordnung der Expression der mRNAs durch in situ Hybridisierung zeigt (11).

Die Induzierung der Synthese von LOXL wird von der von Tropoelastin begleitet (6 Tage nach der Zugabe von Keratinocyten auf das Dermis-Äquivalent).

Das LOX Gen wird ebenfalls nach der Zugabe von den Keratinocyten zur gleichen Zeit aktiviert, wie das Kollagen Ialpha1-Gen (Col1A1).

Beispiel 9: Darstellung der Abnahme des Expressionslevels des LOX-Gens in adulten Fibroblasten

Die Erfinder verwendeten fünf Fibroblastenstämme aus junger Haut (Vorhaut) ("fibroblasts de prèpuce", FP) (von jungen Kindern stammend) und sechs Stämme adulte Fibroblasten ("fibroblasts adults", FA, 3 von durchschnittlich 20 Jährigen und 3 von durchschnittlich 60 Jährigen) aus Abdomen, die aus Arztpraxen stammen. Die Expression der drei Gene von Interesse sowie die von Actin wurde durch Echtzeit-RT-PCR (quantitative reverse Transkriptase Polymerasekettenreakion, 12) analysiert. Diese Technik ermöglicht es, die Expression eines Gens genau zu quantifizieren, indem sie mit der Expression von Actin (welche als konstant betrachtet wird) verglichen wird. Die Regulation des Expressionslevels dieses Gens kann so quantifiziert werden.

Die in 12 dargestellten Ergebnisse zeigen erstmals, dass die Synthese von LOXL mRNA spektakulär und statistisch signifikant in den Fibroblasten von Adulten abnimmt, und dies ab einem Alter von 20 Jahren, mit einer Abnahme von nahezu 70% bezogen auf die Fibroblasten aus junger Haut (Vorhaut), während sich die Menge Elastin mRNA im Alter nicht signifikant unterscheidet. Diese Daten stimmen mit der Literatur von Elastin überein: wenn das elastische Gewebe sich verschlechtert und nicht ersetzt wird, scheint dies nicht durch die Inhibierung der Aktivität des Elastin-Gens verursacht zu werden.

Die Synthese von LOX mRNA nimmt um durchschnittlich 40% in den FAs bezogen auf die FPs ab, jedoch mit individuellen Unterschieden, wobei diese Abweichung nicht sehr signifikant ist.

Die Gesamt-RNAs wurden mit dem Kit "SV 96Total RNA Isolation System" (Promega, Charbonnières, Frankreich) aufgereinigt. Die aufgereinigten RNAs wurden in 100 &mgr;l RNasefreiem Wasser (Promega, Charbonnières, Frankreich) eluiert, bestimmt und auf Platten verteilt (96 Well, 10&mgr;l Gesamt-RNA bei 5 ng/&mgr;l mittels PCR). Die Primer, die für die Ausführung dieser Arbeit ausgewählt wurden, sind die folgenden und sind Gegenstand der Tabelle I:

Tabelle I:

Die Technik der Echtzeit-RT-PCR wurde mit dem "Quanti Tect SYBR Green RT-PCR" -Kit (Qiagen, Frankreich) in Wells, welche mRNA enthielten, in einem OPTICON-Thermocycler, der Aplifikationszyklen ausführt, durchgeführt. Die reverse Transkription (RT) wurde für 30 Minuten bei 50 °C durchgeführt, gefolgt von 15 Minuten bei 95 °C, um die reverse Transkriptase zu inhibieren, die Polymerase zu aktivieren und die erhaltene komplementäre DNA (cDNA) zu denaturieren. 50 Kettenpolymerationszyklen (PCR) wurden durchgeführt (15 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 60 °C, 30 Sekunden bei 72°C). Am Ende von jedem Zyklus wurde die Fluoreszenz, die proportional zu der Anzahl der amplifizierten Fragmente ist, gelesen. Der Expressionslevel wurde durch das Verhältnis der Expression von jedem Gen in Bezug auf die von Actin festgelegt.

Die vorangehenden Teile der Arbeit zeigen die Implikation von LOXL in die Elastogenese und ihre Abwesenheit in adulter Haut. Der folgende Aspekt der Erfindung ist auf die Expressionslevel der Gene LOXL, LOX und Elastin in den Fibroblasten verschiedener Altersstufen gerichtet.

Die obigen Beispiele zeigen, dass die Synthese der Genprodukte von LOXL und LOX auf der Genebene aktiviert werden kann. Die Aktivierung der Synthese der mRNA von LOXL und von Tropoelastin erfolgt in rekonstruierter Haut gleichzeitig (begleitend). Die Aktivierung der Gene von LOXL und Tropoelastin ermöglicht die Bildung von elastischen Fasern. Ein Screenen nach Wirkstoffen führt zu der Identifizierung von Molekülen, die simultan die Expression der Gene von Elastin und von LOXL induzieren, so dass die Elastogenese stimuliert wird.

Zusammenfassend zeigt die Erfindung die direkte Beziehung von LOXL zu den elastischen Fasern, die Bedeutung von LOXL bei der Bildung von elastischen Fasern in rekonstruierter Haut und die Abwesenheit von LOXL in Geweben, in denen die Synthese von funktionellen elastischen Fasern nicht erfolgt (adulte Gewebe, Narben). Die Erfindung betrifft insbesondere ein Screening-Verfahren zum Detektieren von neuen Molekülen (Verfahren zum Identifizieren von Substanzen (Wirkstoffen)), welche in der Lage sind, begleitend (gleichzeitig) die Synthese von LOXL und von Elastin zu induzieren, um die Expression funktioneller elastischer Fasern in rekonstruierter Haut, Hautbiopsien und humaner Haut zu re-induzieren.

Beispiel 10: Analyse der Expression der messenger RNAs von LOXL und/oder Elastin, zum Beispiel durch qualitative RT-PCR, mit oder ohne das In-Kontakt-Bringen von Wirkstoffen, deren Aktivität zu testen ist

Die Aktivitäten wurden bei 1% (V/V anhand von Fibroblasten aus normaler humaner Haut (die aus der jungen Haut (Vorhaut) von Kindern stammten oder von Adulten stammten) getestet. Die Kultivierung wurde zum Beispiel in einer Einzelschicht auf 24-Well-Kultivierungsplatten, in einem definierten Medium ohne Serum (Fibroblast Basal Medium) durchgeführt. Die Zellen wurden, zum Beispiel bei 40.000 pro cm², ausgelegt Bei ihrem Zusammenfluss wurden die Zellen mit den Wirkstoffen in Kontakt gebracht, vorteilhafterweise für 24 Stunden. Parallel wurden vorteilhafterweise eine -nicht behandelte Kontrolle (Medium allein) und drei Positivkontrollen (TGF-&bgr; bei 1ng/ml, IL-1&agr; bei 50 pg/ml und Phytokine^® (Coletica, Lyons, Frankreich) bei 2% (V/V) durchgeführt, zum Beispiel auf den gleichen Kultivierungsplatten.

TFG-&bgr; bei 1 ng/ml und IL-1&agr; bei 50 pg/ml wurden im voraus getestet und die Stimulierung der Synthese der Elastin-mRNA, die durch diese zwei Cytokine bei diesen Konzentrationen induziert wurde, wurde mittels einer Analyse der mRNAs, z.B. durch quantitative RT-PCR (× 10 für TGF-&bgr; und × 6 für IL-1 alpha), bestätigt. Nach dem Zeitraum, für den die Wirkstoffe mit den Zellen in Kontakt gebracht wurden, z.B. 24 Stunden, wurden die Medien entfernt und die Zellen wurden konserviert, zum Beispiel durch Trockengefrieren bei –80°C, nach dem Spülen mit Phosphatpuffer pH 7,4. Die Gesamt-RNAs wurden extrahiert, zum Beispiel mit der Hilfe eines Extraktions-Kits von 96 Wells auf Silica-Säulen, und wurden in einem 96-Well-Spektrophotometer bei 260 nm (Reinheitsindikator : Proteinbestimmung bei 280 nm) bestimmt. Die RNAs wurden verdünnt, zum Beispiel auf 5 ng/&mgr;l. Die qualitative RT-PCR in Schritt 1 wurde zum Beispiel mit 50 ng Anfangs-RNA in einer 96-Well-Platte mit den Genen von Actin, Elastin, LOX und LOXL, durchgeführt. Die für jedes Gen spezifischen Primer wurden zum Beispiel bei 0,5 &mgr;M verwendet:

– Sense Elastin-Gen: 1Ela 5'-GTA TAT ACC CAG GTG GCG TG-3'; (SEQ ID Nr. 24)
– Antisense Elastin-Gen: 2Ela 5'-CGA ACT TTG CTG CTG CTT TAG-3'; (SEQ ID Nr. 25)
– Sense LOXL-Gen: 30L1 5'-GAC TTC GGC AAC CTC AAG C-3'; (SEQ ID Nr. 26)
– Antisense LOXL-Gen: 31L1 5'-TGT TGC AGA AAC GTA GCG AC-3'; (SEQ ID Nr. 27)
– Sense LOX-Gen: Ox64 5'-ACG TAC GTG CAG AAG ATG TCC-3'; (SEQ ID Nr. 28)
– Antisense LOX-Gen: Ox65 5'-GGC TGG GTA AGA AAT CTG ATG-3'; (SEQ ID Nr. 29)
– Sense Actin-Gen: Actin U 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3' (SEQ ID Nr. 30)
– Anisense Actin-Gen: Actin D 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'. (SEQ ID Nr. 31)

Die Amplifizierungsparameter waren vorteilhafterweise die folgenden: 48 °C, 30 Minuten; 94 °C, 2 Minuten; (94 °C, 30 Sekunden; 60 °C, 30 Sekunden; 68 °C, 30 Sekunden) 28 Zyklen für Actin, 30 Zyklen für LOXL, 32 Zyklen für LOX oder 34 Zyklen für Elastin; 68 °C, 10 Minuten; 14°C, unbegrenzt („infini"; „infinity"). Nach der Amplifikation wurden die Produkte beispielsweise in einem Verhältnis von 3 &mgr;l Actin-Amplifizierungsprodukte + 5 &mgr;l Elastin-Gen-Amplifizierungsprodukte + 5 &mgr;l LOX-Gen-Amplifizierungsprodukte + 5 &mgr;l LOXL-Gen-Amplifizierungsprodukte gemischt. Es wurde ein Ladepuffer (2 &mgr;l) zugefügt und das Gesamtvolumen (20 &mgr;l) wurde auf ein vorgegossenes Agarosegel (Invitrogen, Frankreich), z.B. bei 2%, aufgetragen. Die Erfinder visualisierten die Expressionslevel anhand von Mitteln, die dem Fachmann bekannt sind, zum Beispiel wurden die Banden der Proben nach der Wanderung (15 Minuten) unter UV in einer Schwarzkammer visualisiert und digital fotografiert. Die Fotografien der Gele wurden mittels Bildanalyse und einer Quantifizierung der Intensität der Banden (Phoretix1D, Frankreich) analysiert. Der Expressionslevel der Gene von Elastin, LOX und LOXL wurden in prozentualem Unterschied in Bezug auf diejenige, die aus den Negativkontrollen (ohne Behandlung) erhalten wurden, ausgedrückt.

Interpretationen der Ergebnisse: „junge" Zellen und „reife" Zellen:

Es ist festzustellen, dass die Zellen der jungen Haut (Vorhaut) Mengen an mRNA, die für Elastin kodiert, auf einem Level exprimieren, der identisch zu dem durchschnittlichen Level bei Adulten beobachteten ist, während die Mengen an mRNA, die für LOXL kodiert, viel größer sind als im Fall von mRNA, die für LOX kodiert. Es ist daher möglich, diese Abnahme der Expression von LOXL und eventuell LOX in gealterten Zellen umzukehren. In diesem Sinn wurde ein Screening nach Wirkstoffen durchgeführt.

Screening nach Wirkstoffen:

Die Mengen an cDNA aus jeder Untersuchung wurden verglichen mit der Menge an Actin cDNA und dann mit den Negativkontrollen (ohne Aktivitäten). Eine erste Analyse ermöglichte es, die Untersuchungen, die einen ungefäbr 1,3-fachen Anstieg von Elastin (Eln) mRNA und einen ungefähr 2-fachen Anstieg von LOXL mRNA zeigten, als signifikant zu betrachten. Von mehr als 900 getesteten. Molekülen oder Wirkstoffextrakten, erfüllen 13 Wirkstoffe diese Kriterien bei den getesteten Konzentrationen und unter den definierten Bedingungen. Diese Wirkstoffe sind die folgenden und sind Gegenstand der Tabelle II.

Tabelle II:

Die Pflanzenextrakte wurden erhalten, indem es den Pflanzen ermöglicht wurde, bei 2-5% (W/W) in einer Wasser / (Alkohol, Glycol, oder Polyol) – Mischung (wie Ethanol, Glycerin, Butylenglycol und anderen Glycolen, Xylitol usw....), 100/0 bis 0/100, einzuweichen. Die erhaltenen Extrakte wurden anschließend filtriert oder destilliert, um die lösliche Fraktion zurückzugewinnen, die anschließend steril gefiltert wurde. Die chemischen Moleküle stammten von Sigma (Saint-Louis, USA) und wurden bei 1 % in einem Alkohol oder einem Glycol verdünnt oder dispergiert, verwendet.

Schlussfolgerungen: 13 Wirkstoffe aus der Bank von 960 Wirkstoffen sind in der Lage, unter den genannten Bedingungen die Syntheselevel der mRNA der Gene, die für LOXL, LOX und Elastin kodieren, in den Fibroblasten aus dem Abdomen von einem adulten reifen Alters (Spender war in diesem Fall 63 Jahre alt) signifikant zu aktivieren.

Beispiel 11: Untersuchung der Effektivität eines kosmetischen oder dermopharmazeutischen Wirkstoffs durch, zum Beispiel, Echtzeit-RT-PCR

Die Wirkstoffe, die nach dem ersten Screening-Schritt ausgewählt wurden, wurden bei verschiedenen Konzentrationen zwischen 0,1% und 5% (V/V) anhand von Fibroblasten von normaler (adulter) humaner Haut untersucht. Die Kultivierung wurde beispielsweise in einer Einzelschicht in 24-Well-Platten in einem definierten Medium ohne Serum (Fibroblast Basal Medium) ausgeführt. Die Zellen wurden ausgelegt, z.B. bei 40.000 pro cm². Nach dem Zeitraum, für welchen die Wirkstoffe mit den Zellen in Kontakt gebracht wurden (24 Stunden), wurden die Medien entfernt und die Zellen wurden konserviert, z.B. durch Trockengefrieren bei – 80 °C, nach dem Spülen mit Phosphatpuffer pH 7,4. Am Ende der Experimentierung wurde der Gehalt an mRNA von Elastin, von LOXL und von Actin durch eine mRNA-Analysetechnik beurteilt, z.B. durch Echtzeit-RT-PCR. Hierfür waren die Primer-Paare, mit welchen die Amplifikation von spezifischen Fragmenten dieser Gene ermöglicht wurde, die oben beschriebenen (Beispiel 10).

Nach der Extraktion, zum Beispiel mit Hilfe eines Extraktions-Kits in 96-Wells auf Silica-Säulen und der Bestimmung in einem 96-Well-Spektrophotometer bei 260 nm, wurden die RNAs verdünnt, z.B. auf 5 ng/&mgr;l. Die RT-PCR-Reaktionen (reverse Transkriptions-Polymerasekettenreaktion) wurden durch quantitative Echtzeit-RT-PCR mit der Hilfe des "Opticon"-Systems (MJ Research) durchgeführt. Vorteilhafterweise war die Reaktionsmischung (50 &mgr;l), die in die Wells gegeben wurde, für jede Probe die folgende:

– 10 &mgr;l RNA bei einer Konzentration von 5 ng/&mgr;l,
– die spezifischen Primer der verschiedenen nachgesuchten Marker,
– Reaktionsmischung (Qiagen – 25 &mgr;l 2 × QuantiTect SYBR Green RT-PCR master

mix, enthaltend 5 mM MgCl₂ + 0,5 &mgr;l QuantiTect RT mix), wobei der Marker SYBR Green I während des Verlängerungsschritts (Elongationsschritt) in die doppelsträngige DNA eingebaut wurde.

Die RT-PCR-Bedingungen waren vorteilhafterweise die folgenden Reverse Transkription: 30 Minuten bei 50 °C, dann 15 Minuten bei 95 °C, PCR-Reaktionen: [15 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 60°C und 30 Sekunden bei 72°C], 50 Zyklen.

Die Abwesenheit von Kontaminationen und die Reinheit der amplifizierten Produkte wurde, zum Beispiel über die Fusionskurven der amplifizierten PCR-Produkte, bestätigt. Die Produkte, die einen doppelten Peak oder eine anormale Fusionstemperatur zeigten, wurden eliminiert.

Analyse und Berechnungsverfahren:

Der Einbau von Fluoreszenz in die amplifizierte DNA wurde kontinuierlich während der PCR-Zyklen bestimmt. Durch dieses System wurden Kurven von Fluoreszenzmessungen als Funktion der Anzahl von PCR-Zyklen erhalten und so eine relative Menge amplifizierter DNA bestimmt.

Bezogen auf die vorliegende Zellpopulation, wurden alle Ergebnisse mit dem "Actin" -Signal verglichen, welches als Haushaltsgen („Housekeeping-Gen") verwendet wurde. Gemäß der Experimentierung wurde der Grenzwert der Messung von C (T) (= Zyklus-Grenzwert, "Cycle Treshold") für T zwischen 0,05 und 0,01 festgelegt, dann wurde eine willkürliche Messeinheit für jedes Gen gemäß der folgenden Formel berechnet: Sgen "x" = 10⁷ × (1/2)^C(T)Gen"x" C (T)Gen "x" gibt die Anzahl der Zyklen an, die erforderlich sind, um den Grenzwert von 0,01 – 0,05 des Gens "x" zu erlangen.

Die Werte der Gene von Interesse wurden mit dem "Actin"-Signal verglichen, durch Berechnung des Verhältnisses: R = SGen "x" / SActin.

Diese Verhältnisse wurden zwischen behandelten und nicht behandelten Proben verglichen, wobei "x". das LOXL-Gen oder das Elastin-Gen ist.

Ergebnisse: Unter den ausgewählten Wirkstoffen werden die erhaltenen Ergebnisse, als Beispiel zwei von ihnen, in Tabelle III dargestellt:

Tabelle III

Schlußfolgerung: Die ausgewählten Wirkstoffe ermöglichen die Aktivierung des Syntheselevel der mRNAs, welche für die Gene LOXL, LOX und Elastin in den Fibroblasten aus dem Abdomen von Adulten reifen Alters (Spender war in diesem Fall 63 Jahre alt) kodieren. Die Untersuchungen ermöglichten es, die optimalen Konzentrationen für jeden ausgewählten Wirkstoff zu bestimmen.

Für Beispiele 1 bis 11: Der Fachmann wird wissen, wie er aus diesen Beispielen die geeignete Lehre zieht, um Varianten der beschriebenen Zusammensetzungen (Formulierungen) herzustellen.

Beispiel 12 : Verwendung der Produkte der Erfindung in kosmetischen oder pharmazeutischen Formulierungen des Öl-in-Wasser-Emulsionstyps Formulierung 12a A Wasser qsp 100 Butylenglycol 2 Glycerin 3 Natriumdihydroxycetyl 2 Phospat, Isopropylhydroxycetylether B Glycolstearat SE 14 Triisononaoin 5 Octylcocoat 6 C Butylenglycol, 2 Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben, pH eingestellt auf 5,5 D Produkte der Erfindung 0,01-10 %

Formulierung 12b A Wasser qsp 100 Butylenglycol 2 Glycerin 3 Polyacrylamid, Isoparaffin, 2.8 Laureth-7 B Butylenglycol, 2 Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben; 2 Phenoxyethanol, Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben 0,5 Butylenglycol D Produkte der Erfindung 0,01-10 %

Formulierung 12c A Carbomer 0,50 Propylenglycol 3 Glycerin 5 Wasser qsp 100 B Octylcocoat 5 Bisabolol 0,30 Dimethicon 0,30

C Natiumhydroxid 1,60 D Phenoxyethanol, 0,50 Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben E Duftstoffe 0,30 F Produkte der Erfindung 0,01-10 %

Beispiel 13 : Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Wasser-in-Öl-Typ-Formulierung A PEG 30-Dipolyhydroxystearat 3 Caprintriglyceride 3 Cetearyloctanoat 4 Dibutyladipat 3 Traubenkernöl 1,5 Jojobaöl 1,5 Phenoxyethanol, 0,5 Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben B Glycerin 3 Butylenglycol 3 Magnesiumsulfat 0,5 EDTA 0,05 Wasser qsp 100

C Cyclomethicon 1 Dimethicon 1 D Duftstoffe 0,3 E Produkte der Erfindung 0,01-10 %

Beispiel 14 : Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung des Shampoo- oder Duschgel-Typs A Xantangummi 0,8 Wasser qsp 100 B Butylenglycol, 0,5 Methylparaben, Ethylparaben, Propylparaben Phenoxyethanol, 0,5 Methylparaben, Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben C Zitronensäure 0,8 D Natiumlaurethsulfat 40,0 E Produkte der Erfindung 0,01-10 %

Beispiel 15 : Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung des Lippenstift-Typs und anderer wasserfreier Produkte A Mineralwachs 17,0

Isostearylisostearat 31,5 Propylenglycoldipelargonat 2,6 Propylenglycolisostearat 1,7 PEG 8 Bienenwachs 3,0 Hydrogeniertes Palmenkernöl 3,4 Glyceride, Hydrogenierte Palmenglyceride Lanolinöl 3,4 Sesamöl 1,7 Cetyllactat 1,7 Mineralöl, Lanolinalkohol 3,0 B Castoröl qsp 100 Titandioxid 3,9 CI 15850 : 1 0,616 CI 45410 : 1 0,256 CI 19140 : 1 0,048 CI 77491 2,048 C Produkte der Erfindung 0,01-5 %

Beispiel 16 : Verwendung der Produkte der Erfindung in einer Formulierung von wässrigen Gelen (Eyeliner, „amincissants" ("slimmer"), usw.) A Wasser qsp 100 Carbomer 0,5 Butylenglycol 15 Phenoxyethanol, Methylparaben, 0,5 Propylparaben, Butylparaben, Ethylparaben B Produkte der Erfindung 0,01-10 %

Beispiel 17 : Zubereitung von pharmazeutischen Formulierungen, die LOXL enthalten Formulierung 17a : Zubereitung von Tabletten A Träger in g, pro Tablette Lactose 0,359 Sucrose 0,240 B Extrakt von LOXL* 0,001-0,1

Das Extrakt von LOXL wird zum Beispiel gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Extraktionsverfahren, gefolgt von einem Trocknungsschritt erhalten Formulierung 17b : Zubereitung einer Salbe A Träger Polyethylen mit geringer Dichte 5,5 Flüssiges Paraffin qsp 100 B Extrakt von LOXL* 0,001-0,1

Das Extrakt von LOXL wird zum Beispiel gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Extraktionsverfahren, gebenenfalls gefolgt von einem Trocknungsschritt, erhalten Formulierung 17c : Zubereitung einer injizierbaren Formulierung A Träger Isotonische Kochsalzlösung 5 ml B Extrakt von LOXL* 0,001-0,1 g

Das Extrakt von LOXL wird zum Beispiel gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Extraktionsverfahren, gefolgt von einem Trocknungschritt, erhalten

Phase A und Phase B werden separat in Ampullen verpackt und vor der Verwendung gemischt.

Beispiel 18 : Bestimmung der kosmetischen Akzeptanz einer Zubereitung, welche den Gegenstand der Erfindung enthält

Es wurden toxikologische Untersuchungen mit den Verbindungen, die gemäß den Beispielen 10 und 11 erhalten wurden, und die mit 10% in ein 0,5% Xantangel eingebaut wurden, durch okulare Bestimmung beim Kaninchen, durch die Untersuchung des Ausbleibens anormaler Toxizität durch orale Einzelverabreichung an die Ratte und durch die Untersuchung der Sensibilisierungskraft im Meerschweinchen, ausgeführt.

Bestimmung der Anfangsreizung der Haut beim Kaninchen

Die oben beschriebenen Zubereitungen wurden ohne Verdünnung mit einer Dosis von 0,5 ml auf die Haut von 3 Kaninchen appliziert, gemäß dem Verfahren, das von der Richtlinie der OCDE in Bezug auf die Untersuchung „der akute reizende / ätzende Effekt auf der Haut" vorgeschlagen wurde.

Die Produkte wurden gemäß den Kriterien klassifiziert, die in der Entscheidung vom 1/2/1982, veröffentlicht in dem Amtsblatt der Französischen Republik („Official Journal of the French Republic") („JORF") vom 21/02/82, definiert sind.

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen ermöglichten die Schlussfolgerung, dass die Zubereitung, welche die gemäß Beispiel 11 erhaltene Verbindung enthielt, als nicht-reizend für die Haut klassifiziert wurde.

Bestimmung der okularen Reizung beim Kaninchen:

Die oben beschriebenen Zubereitungen wurden rein und in einer Einzelverabreichung von 0,1 ml in das Auge von drei Kaninchen eingeträufelt, gemäß dem Verfahren das durch der Richtlinie der OCDE Nr. 405 vom 24. Februar 1987 in Bezug auf die Untersuchung „der akute reizende / ätzende Effekt auf den Augen" vorgeschlagen wurde.

Die Ergebnisse dieses Tests ermöglichten die Schlussfolgerung, dass die Zubereitungen als nicht-reizend für die Augen betrachtet werden können, im Sinne der Richtlinie 91/326 EEC, und zwar rein oder ohne Verdünnung verwendet.

Untersuchung des Ausbleibens anormaler Toxizität durch orale Einzelverabreichung an die Ratte:

Die beschriebenen Zubereitungen wurden in einer oralen Einzelverabreichung bei einer Dosierung von 5g/kg Körpergewicht an 5 männliche Ratten und 5 weibliche Ratten verabreicht, gemäß einem Protokoll, das an die Richtlinie der OCDE Nr. 401 vom 24. Februar 1987 angelehnt und an kosmetische Produkte angepasst wurde.

Für DL0 und UL50 („LD0 and LD50") wurde festgestellt, dass sie größer als 5000 mg/kg sind. Die getesteten Zubereitungen sind daher nicht unter die Zubereitungen klassifiziert, die gefährlich bei der Nahrungsaufnahme sind.

Bestimmung der kutanösen Sensibilisierungskraft beim Meerschweinchen:

Die beschriebenen Zubereitungen wurden einer Maximierungs-Untersuchung unterworfen, die von Magnusson und Kligmann beschrieben wurde, einem Protokoll, welches in Übereinstimmung mit der Richtlinie Nr. 406 der OCDEs ist.