Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Cytogenetik und die Anwendung von genetisch-diagnostischen Methoden in der Pathologie und der Hämatologie. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Nukleinsäuresonden zur Verwendung in Hybridisierungsmethoden für den Nachweis von chromosomalen Anomalien und anderen Genumlagerungen, wie beispielsweise Immunglobulin (Ig)- und T-Zell-Rezeptor-(TCR)-Genumlagerungen.

Chromosomale Anomalien sind eine Hauptursache für genetische Störungen oder Krankheiten einschließlich kongenitaler Störungen und erworbener Krankheiten, wie beispielsweise Malignitäten. Die Grundlage der oben genannten Malignitäten liegt in der Tatsache, dass alle Zellen einer Malignität einen gemeinsamen klonalen Ursprung besitzen. Chromosomale Anomalien bei Malignitäten stammen von Umlagerungen, Translokationen, Inversionen, Insertionen, Deletionen und anderen Chromosomenmutationen, aber auch Verluste oder Zunahme von ganzen Chromosomen werden bei Malignitäten gefunden. An vielen Chromosomenanomalien sind zwei verschiedene Chromosomen beteiligt. So werden Gene oder Fragmente von Genen aus dem normalen physiologischen Kontext eines bestimmten Chromosoms entfernt und werden an ein Empfängerchromosom in der Nähe von nicht-verwandten Genen oder Genfragmenten (häufig Onkogenen oder Proto-Onkogenen) übertragen. Eine derartige anomale genetische Kombination kann die Grundlage einer Malignität bilden.

Häufig geschehen derartige Umlagerungen, an denen zwei nicht-anomale Chromosomen beteiligt sind, in einem einigermaßen etablierten Muster. Brüche erscheinen in einem der zwei Chromosomen an einem potentiellen Bruchpunkt oder einer Bruchpunkt-Cluster-Region, was zur Entfernung eines Gens oder Genfragments von einem Chromosom führt und zu nachfolgender Translokation zu dem anderen Chromosom, wobei ein umgelagertes Chromosom gebildet wird, in dem die umgelagerten Fragmente in einem Fusionsbereich fusioniert sind.

Nachweis von Chromosomenanomalien kann durch Verwendung einer breiten Auswahl an Methoden ausgeführt werden, von denen viele moderne biomolekulare Methoden umfassen. Traditionelle Methoden, wie beispielsweise cytogenetische Analysen durch konventionelle Chromosomen-Bandentechniken sind, obwohl sehr präzise, doch sehr arbeitsintensiv, erfordern Fachpersonal und sind teuer. Automatisierte Karyotypisierung ist für einige diagnostische Anwendungen nützlich, wie beispielsweise pränatale Diagnostik, ist aber uneffektiv zum Analysieren von komplexen chromosomalen Anomalien vieler Malignitäten. Weiterhin erfordern oben genannte Methoden frische (kultivierte) Zellen, die nicht immer verfügbar sind.

Andere modernere Methoden sind Southem-Blotting oder andere Nukleinsäure-Hybridisierungs- oder Amplifikationsmethoden, wie beispielsweise PCR, zum Nachweis von gut definierten Chromosomenanomalien, für die geeignete Nukleinsäuresonden oder Primer verfügbar sind. Bei diesen Methoden können frische oder gefrorene Zellen verwendet werden und manchmal sogar Sonden nach Formalin-Fixierung, solange die Nukleinsäuresequenzen, die hybridisiert oder amplifiziert werden, intakt und zugänglich bleiben. Wie auch immer, sogar bei der oben genannten modernen Technologie können verschiedene Nachteile gefunden werden, die die Anwendung von diesen diagnostischen schnellen Screening-Methoden auf chromosomale Anomalien, bezogen auf die genannten Malignitäten, behindern.

Das Southern-Blotting dauert 3 bis 4 Wochen, was zu langsam für eine effiziente Diagnose und Therapiewahl für Malignitäten ist, und es können nur 10 bis 15 kb Nukleinsäuresequenzen pro Probenanalyse analysiert werden.

Obwohl PCR grundsätzlich gut geeignet ist für schnelles und umfangreiches diagnostisches Testen oder sogar Screening, können nur 0,1 bis 2 kb Nukleinsäure pro PCR-Analyse analysiert werden, was das schnelle Screening von langen Chromosomenabschnitten und Bruchpunkt-Cluster-Regionen innerhalb des Chromosoms sehr behindert. Ein zusätzlicher Nachteil von PCR ist ihre inhärente Sensibilität gegenüber Primer-Fehlpaarungen. Kleine, normale und physiologische Abweichungen, die immer in Nukleinsäuresequenzen der Genfragmente vorliegen können, die komplementär zu dem Primer sind, behindern eine verlässliche Anwendung der PCR und ergeben eventuell falsch-negative Ergebnisse. Insbesonders falschnegative Ergebnisse machen einen PCR-basierten Diagnosetest, obwohl sehr spezifisch, doch nicht sensitiv genug für eine verlässliche Diagnose, und es ist selbstverständlich, dass nur eine verlässliche Diagnose von Malignitäten zu einem Verstehen der Prognose und der Entwicklung einer adäquaten Therapie führen kann.

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechniken (FISH) sind weniger abhängig von der vollständigen Übereinstimmung von Nukleinsäuresequenzen, um positive diagnostische Ergebnisse zu ergeben. Im allgemeinen wird bei FISH die Analyse mittels Sonden mit großen, meist undefinierten Nukleinsäuresonden durchgeführt, die jedoch häufig mit variierender Stringenz mit den Genen oder Genfragmenten, die zu beiden Seiten der Fusionsregion in dem umgelagerten Chromosom der malignen Zelle lokalisiert sind, hybridisieren. Das Verwenden großer Sonden macht die FISH-Technik sehr empfindlich. Die Bindung der co-lokalisierten Sonden ist im allgemeinen entweder direkt oder indirekt mit Fluorochromen nachweisbar und wird durch Fluoreszenzmikroskopie einer Zellpopulation, die von der zu testenden Probe erhalten wird, sichtbar gemacht.

Jedoch haben sogar die gegenwärtig verwendeten FISH-Protokolle inhärente Nachteile, wobei sich diese hauptsächlich auf die Selektion der in den gegenwärtigen FISH-Protokollen verwendeten Nukleinsäuresonden beziehen, die falsch-positive Ergebnisse in der Diagnose von chromosomalen Anomalien zeigen können. Zum Beispiel stellen Sonden, die gegen verschiedene Chromosomen jedoch mit benachbarten Signalen bei Translokationen gerichtet sind, eine relativ große Gefahr dar, falsch-positive Ergebnisse zu ergeben. Daher sind die diagnostischen Tests, obwohl sensitiv, nicht spezifisch genug, um Standard-FISH-Techniken bei umfangreichem oder schnellem diagnostischen Testen zu verwenden, ganz zu schweigen von automatisierten Tests oder Screening.

Bisher wurden im allgemeinen große Sonden, die von Cosmid-Klonen, YAC-Klonen oder anderen klonierten DNA-Fragmenten erhalten wurden, als Sonden bei FISH verwendet. Die genaue Position dieser Sonden in Bezug zur Fusionsregion in dem umgelagerten Chromosom ist nicht bekannt und sie besitzen weitgehend unbestimmte und variierende genomische Länge (genomische Länge oder Abstand, ausgedrückt als die Anzahl an Nukleotiden oder Basen (b)) und benötigen keine spezifische Selektion oder Modifikation dieser Sonden, die über das reine Markieren der Sonden mit den notwendigen Reporter-Molekülen, d.h. Fluorochromen, hinausgeht. Zum Entwickeln oder Auswählen von Sonden gibt es nur wenige oder keine Richtlinien im Stand der Technik, die über die reinen Vorschläge, wo mutmaßliche Sonden zu lokalisieren sind, hinausgehen. Falschpositive Ergebnisse, die mit diesen Sonden erhalten werden, können von unspezifischer Hybridisierung mit einem breiten Spektrum an (häufigen) repetitiven Sequenzen stammen, die überall in vielen Chromosomen vorliegen können, oder von Kreuz-Hybridisierung mit homologen Sequenzen im Genom, oder vom Überlappen der verwendeten Sonden mit der Bruchpunkt-Cluster-Region oder von dem Unterschied in Signalintensitäten, insoweit diese durch Größenunterschiede der Sonden entstehen. Diese Ursachen der falsch-positiven Ergebnissen werden häufig nicht erkannt. Falschpositive Ergebnisse sind insbesondere nachteilig für die Schnelldiagnose, falls schnelles oder Routine-Screening von Patienten notwendig ist, um Malignitäten nachzuweisen oder um Behandlungsprotokolle festzusetzen. Ein falsch-positives Ergebnis macht dann ein mühsames Nachprüfen von Patienten oder sogar arglosen Probanden notwendig, die zu Routine-Screening-Protokollen aufgefordert wurden, und kann diese Menschen sehr aufschrecken. Ferner werden Translokationen allgemein mit zwei verschiedenen Sonden nachgewiesen, eine Sonde für jedes der beteiligten Chromosomen, wobei die Sonden dann während der in situ-Hybridisierung im Falle einer Translokation co-lokalisieren, aber Einzelsignale zeigen, wenn keine Translokation vorliegt (siehe z.B. EP 0430402, EP-A-0500290, Tkachuk et al., Science 250, 559–562, 1990; Tkachuk et al., „Klinische Anwendung von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung", Genetic analysis techniques and applications vol. 8, 67–74, 1991). Jedoch werden in der Praxis aufgrund der Tatsache, dass die zwei Sonden zufällig co-lokalisieren, 2 bis 4 % der normalen, mittels FISH getesteten Interphasezellen falsch-positive Ergebnisse zeigen. Ein zusätzlicher Nachteil der gegenwärtigen FISH-Protokolle ist, dass es in der Praxis notwendig ist, beide Chromosomen, die an der Translokation beteiligt sind, zu kennen als auch die relevanten Bruchpunkt-Regionen der beiden Chromosomen, um die Nukleinsäuresonden, die zum Nachweis der spezifischen Translokation befähigt sind, zu definieren, während noch unbekannte oder schlecht definierte Translokationen, die von einem bekannten Gen und einem unbekannten Partner abstammen, nicht nachgewiesen werden können.

Die vorliegende Erfindung stellt Nukleinsäuresonden, die zum diagnostischen Testen auf Chromosomenanomalien verwendet werden können, bereit, die eine hohe Sensitivität und eine hohe Spezifität kombinieren. Die Sonden, die durch die Erfindung bereitgestellt werden, können in situ oder in vivo oder in vitro mit komplementären Nukleinsäuremolekülen hybridisieren, wie beispielsweise (m)RNA oder DNA, wie z.B. transkribiert von oder gefunden in (nicht-anomalen und/oder umgelagerten) Chromosomen. Die vorliegende Erfindung stellt für jede Translokationsanalyse ein bestimmtes und ausgewogenes Nukleinsäuresondenpaar bereit. Die Sonden sind bestimmt darin, dass sie jeweils mit einer unterschiedlichen Sequenz hybridisieren, die spezifisch ausgewählt wird und einen eindeutigen potentiellen Bruchpunkt in einem nicht-anomalen Chromosom flankieren. Weiterhin ist das durch z.B. Sonde A und Sonde B gebildete Paar von dem durch z.B. Sonde A und Sonde X gebildete Paar verschieden. Weiterhin erzeugen die Sonden A, B und X der oben genannten Beispiele drei Paare, A-B, B-X und A-X. Die Sonden in den Paaren sind vergleichbar oder ausgewogen darin, dass sie so ausgestaltet sind, dass sie eine vergleichbare Größe oder genomische Länge besitzen, mit dem endgültigen Ziel die Erzeugung von Signalen mit vergleichbarer Intensität zu erreichen. Zusätzlich können die Sonden mit Reporter-Molekülen in vergleichbarer Weise markiert werden, was zu Signalen von vergleichbarer Intensität führt. Zusätzlich können die Sonden jeweils mit einem unterschiedlichen Fluorochrom markiert werden, was den Nachweis in einem einzigen Punkt mit unterschiedlicher Farbe erleichtert, wenn die Sonden co-lokalisieren sofern keine Anomalie nachgewiesen wird. Auch können die Sonden so selektiert werden, um mit einem Chromosom an entsprechend komplementären Hybridisierungs-Stellen, die in vergleichbaren Abständen auf jeder Seite eines Bruchpunkts oder einer Bruchpunkt-Cluster-Region eines Chromosoms liegen, zu reagieren. Das eindeutige und abgestimmte Nukleinsäuresondenpaar, das durch die Erfindung bereitgestellt wird, umfasst Sonden, die z.B. von vergleichbarer Größe oder genomischer Länge sind, jede Sonde von dem Paar z. B. eine Länge von 1 bis 10 kb, oder 7 bis 15 kb, oder 10 bis 20 kb, oder 15 bis 30 kb, oder 20 bis 40 kb, oder 30 bis 50 kb, oder 40 bis 60 kb, oder 50 bis 70 kb, oder 60 bis 80 kb, oder 70 bis 90 kb, oder 80 bis 100 kb aufweist. Durch Verwenden eines derartig bestimmten und ausgewogenen Sondenpaares, das eine Bruchpunkt-Region flankiert und die korrespondierende Fusionsregion nicht überlappt, wird ein falschpositives Diagnostizieren in Hybridisierungs-Studien vermieden. Die Erfindung stellt ferner ein bestimmtes und ausgewogenes Nukleinsäuresondenpaar bereit, wovon jede Sonde mit mindestens einem unterschiedlichen Reporter-Molekül markiert ist. Nukleinsäuresonden können mit Chromophoren oder Fluorochromen markiert werden (z.B. FITC oder TRITC) oder durch Bereitstellen eines Haptens, wie beispielsweise Biotin und Digoxigenin. Fluorochom-markierte Sonden können direkt nachgewiesen werden. Bei Hybridisierung mit haptenisierten Nukleinsäuresonden erfolgt ein indirekter Nachweis unter Verwendung von Chromophoren, Fluorochromen oder Enzymen, wie z.B. Peroxidase. Die Erfindung stellt weiterhin ein bestimmtes und ausgewogenes Nukleinsäuresondenpaar bereit, das dadurch charakterisiert ist, dass beide Sonden mit einem einzigen korrespondierenden Nukleinsäuremolekül oder seinem Komplementärstrang oder mit einem (nicht-anomalen) Chromosom oder mit einem Fragment davon, das möglicherweise die Anomalie enthält, hybridisieren, an Stelle von zwei Sonden, die einzeln mit den beiden, an einer gegebenen Translokation beteiligten Chromosomen hybridisieren, wie sie gegenwärtig in Hämatologie und Onkologie im allgemeinen verwendet werden (siehe z.B. Tkachuk et al., Science 250, 559–562, 1990; Tkachuk et al., „Klinische Anwendungen von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung", Genetic analysis techniques and applications. vol. 8, 67–74, 1991).

Die Erfindung stellt weiterhin ein bestimmtes und ausgewogenes Nukleinsäuresondenpaar bereit, das mit den Nukleinsäuremolekülen in einem genomischen Abstand von nicht mehr als 100 kb, aber vorzugsweise nicht mehr als 50 kb, hybridisiert. Zusätzlich stellt die Erfindung ein bestimmtes und ausgewogenes Nukleinsäuresondenpaar bereit, das in situ hybridisiert und z. B. in diagnostischen Tests, die die FISH-Techniken umfassen, verwendet werden kann. Weiterhin stellt die Erfindung ein bestimmtes und ausgewogenes Nukleinsäuresondenpaar bereit, wovon jede Sonde in situ unter variierenden, aber im allgemeinen niedrig-stringenten Bedingungen mit nur wenigen DNA-Molekülen pro Zelle hybridisiert. Die Nukleinsäuresonden, die aus mehreren DNA-Fragmenten zusammengestellt sind, werden entweder auf Metaphase-Ausstrichen oder durch Southern-Blotting auf Hybridisierungssensitivität und -spezifität getestet, um die Sonde auszuwählen, die so wenig wie möglich von häufigen repetitiven Sequenzen enthält, um ein hohes Hintergrundfärben zu vermeiden. Die Nukleinsäuresonden werden zur Kartierung und Prüfung ihrer relativen Position mit Fiber-FISH (z.B. Hybridisierung auf ausgestreckte einzelne DNA-Fasern, die auf Glasplättchen immobilisiert sind) getestet, bevor sie in diagnostischen Tests eingesetzt werden.

Die Sonden werden getestet, um z. B. zu vermeiden, dass Sonden verwendet werden, die mit repetitiven Sequenzen hybridisieren. Sonden können aus Sätzen von unterschiedlichen Oligonukleotiden bestehen, wobei vorhandene repetitive Sequenzen in einer flankierenden Region vermieden werden. Derartige Sätze werden eindeutig mit getrennten oder bestimmten Reporter-Molekülen für jede Sonde (oder Satz von Oligonukleotiden) markiert, die für die entsprechenden flankierenden Regionen bestimmt sind. Derartige Sonden können jeweils aus mehrfach markierten Oligonukleotiden bestehen, wobei jedes mit einem eindeutigen Bereich in einer flankierenden Region hybridisiert. Eine Sonde kann z.B. von 10 bis zu 200 von derartigen Oligonukleotiden enthalten, vorzugsweise von 50 bis 150, wobei jedes Oligonukleotid z.B. 10 bis 20 Nukleotide lang ist. Zum Beispiel wird die Intron-Exon-Struktur des MLL-Gens in Br J Haematol 1996; 93:966–972 beschrieben. Die Veröffentlichung zeigt auch, dass die meisten Bruchpunkte des MLL-Gens zwischen Exon 9 und Exon 14 lokalisiert sind. PNA-enthaltende Sonden können in Exon 3 bis 8 für die „stromaufwärts gelegene FISH-Sonde" entwickelt werden und in Exon 15 bis 31 für die „stromabwärts gelegene FISH-Sonde". Insbesondere Exon 4 und Exon 28 sind für das Konstruieren der Sonden von Bedeutung, da diese zwei Exons ziemlich lang sind und daher die meisten der PNA-Sonden enthalten können. PNA-Oligonukleotide können z.B. aufgrund ihrer Kapazität mit Exon 4 oder Exon 28 des 119QR-Zielgens zu hybridisieren, synthetisiert werden und können in einer Mischung als Sonde für eine flankierende Region verwendet werden.

Die Erfindung stellt weiterhin die Verwendung der bestimmten und ausgewogenen Sondenpaare für diagnostisches Testen auf Chromosomenanomalien bereit. Die Sondenpaare gemäß der Erfindung können zum Nachweis von Nukleinsäuren verwendet werden, die die Anomalie oder Fragmente der Anomalie enthalten oder für den in situ oder in vitro Nachweis von Zellen, die die Chromosomenanomalie enthalten. Die Erfindung stellt somit ein Paar oder Paare von bestimmten und ausgewogenen Sonden für den Nachweis von Störungen oder Krankheiten bereit, die im Zusammenhang mit chromosomalen Anomalien stehen, z.B. Malignitäten, wie beispielsweise den nachstehend weiter erläuterten hämatopoetischen Malignitäten.

Ferner stellt die Erfindung einen diagnostischen Kit oder Assay bereit, das ein Nukleinsäuresondenpaar gemäß der Erfindung enthält, der zum Nachweis von Störungen oder Krankheiten verwendet werden kann, die mit chromosomalen Anomalien im Zusammenhang stehen, d.h. Malignitäten, wie beispielsweise hämatopoetische Malignitäten. Mit einem derartigen, durch die Erfindung bereitgestellten, diagnostischen Kit oder Assay, ist es z. B. möglich, die Wirkungen der Therapie zu überwachen und eine minimale Resterkrankung oder frühen Krebsrückfall nachzuweisen. Man kann auch den Ursprung von Knochenmarkszellen, die einer Knochenmarkstransplantation folgen, identifizieren. Man kann ebenso virale Sequenzen und deren Lokalisierung in dem Chromosom und in Zellen nachweisen. Die vorliegende Erfindung wird mit Bezug auf den molekularen Nachweis von Chromosomenanomalien in hämatopoetischen Malignitäten genauer beschrieben, ist aber weithin einsetzbar für die Analyse von Chromosomenanomalien im allgemeinen.

Die Entwicklung von verlässlichen Sonden zum Nachweis der klar definierten oder sogar schlecht definierten Chromosomenanomalien in hämatologischen Malignitäten wird als nicht-einschränkendes Beispiel beschrieben, um die Erfindung zu erläutern. Derartige Sonden können für die Diagnose und molekulare Klassifizierung der beteiligten Malignitäten verwendet werden. Die neuen Sonden können für diagnostische Tests in mehreren Arten von hämatologischen Malignitäten mit erhöhter Sensitivität, Spezifität und Effizienz der Analyse verwendet werden.

Weltweit werden jedes Jahr viele Fälle von hämatopoetischen Malignitäten diagnostiziert. In der Europäischen Union (etwa 375 Mio. Einwohner) betrifft dies etwa 98.000 Patienten pro Jahr. Die geschätzte Anzahl von Patienten in den USA (etwa 250 Mio. Einwohner) beträgt etwa 65.500 pro Jahr. Die Mehrzahl der hämatologischen Malignitäten haben lymphoiden Ursprung: akute lymphatische Leukämie (ALL), chronische lymphocytische Leukämien, die meisten bösartigen Lymphome und multiple Myelome. Die größte Gruppe bilden die Non-Hodgkin's Lymphome (NHL), die ungefähr die Hälfte aller hämatopoetischen Malignitäten repräsentiert. Ferner haben europäische epidemiologische Studien gezeigt, dass die Häufigkeit von NHL stetig steigt (etwa 5% pro Jahr), was zeigt, dass NHL ein signifikantes Gesundheitsproblem in Europa darstellt und sehr wahrscheinlich in der ganzen westlichen Welt. Obwohl die jährliche Anzahl an Patienten, die mit ALL diagnostiziert wird, kleiner ist als die für NHL, hat ALL ein höheres Vorkommen bei Kindern, und stellt die häufigste Malignität in der Kindheit dar.

Lymphoide Malignitäten bestehen aus einem breiten Bereich von etwa 25 unterschiedlichen Krankheitsbildern, die sich in der klinischen Darstellung, der Prognose und den Behandlungsprotokollen unterscheiden. Diese Krankheitsbilder wurden in der neuesten „Revised European American Lymphoid neoplasm (REAL)-Klassifizierung" definiert. In dieser Klassifizierung werden die lymphoiden Malignitäten in B-Zell-Malignitäten (etwa 90%) und T-Zell-Malignitäten (etwa 10%) eingeteilt.

Die Diagnose und Klassifizierung von lymphoiden Malignitäten basiert im allgemeinen auf Cytomorphologie und Histomorphologie, und wird mit immunophänotypischer Information mittels Durchflusscytometrie und/oder Immunohistochemie ergänzt. Diese immunophänotypische Information scheint wertvoll für die Klassifizierung von lymphoiden Malignitäten zu sein, wie beispielsweise die Klassifizierung der ALL in Pro-B-ALL, gewöhnlicher ALL, Pre-B-ALL und mehreren Arten von T-ALL. Bei Malignitäten in reifen B-Zellen mit Immunglobulin (Ig)-Expression kann die Diagnose mit immunophänotypischer Bewertung der Klonalität durch den Nachweis von Expression einzelner Ig-leichter-Ketten unterstützt werden, z.B. der Verteilung von Igk- und Ig&lgr;-positiver B-Zellen, die im Fall einer B-Zell-Malignität stark verzerrt ist.

Der Wert der Bewertung der Klonalität basiert auf der Tatsache, dass alle Zellen einer Malignität einen gemeinsamen klonalen Ursprung besitzen. Bei lymphoiden Malignitäten wird dies durch das Auftreten von identischen (klonalen) umgelagerten Ig- und T-Zell-Rezeptor-(TCR)-Genen gezeigt: klonale Ig- und/oder TCR-Genumlagerungen werden in den meisten unreifen lymphoiden Malignitäten (90–95%) und im Grunde in allen reifen lymphoiden Malignitäten (>98%) gefunden. Daher ist die molekulare Analyse der Klonalität von Ig- und TCR-Genen für die Unterscheidung von monoklonalen (bösartigen) und polyklonalen (reaktiven) Lymphoproliferationen äußerst geeignet. Verdächtige Lymphoproliferationen sollten daher einer molekularen Bewertung der Klonalität unterworfen werden.

Während des letzten Jahrzehnts hat das Wissen über genetische Anomalien in hämatopoetischen Malignitäten bedeutend zugenommen, insbesondere über akute Leukämien und NHL. Gegenwärtig werden gut bekannte Chromosomenanomalien bei 35–40 % von ALL und in 30–40 % von NHL festgestellt. Diese Chromosomenanomalien können als alternative oder zusätzliche Marker für die molekulare Bewertung der Klonalität verwendet werden. Wichtiger erscheint, dass diese Chromosomenanomalien als Klassifizierungsmarker relevant sind, die die gegenwärtig verwendeten morphologischen und immunophänotypischen Klassifizierungssysteme ergänzen. Es wurde deutlich gezeigt, dass mehrere genetische Anomalien mit einer günstigen Prognose einhergehen, wohingegen andere mit einer schlechten Prognose einhergehen, wie beispielsweise t(4;11) in Pro-B-ALL und t(9;22) in der gewöhnlichgen ALL. Mehrere Behandlungsprotokolle wurden begonnen, die diese Information zum Aufbau der Behandlung verwenden. Daher kann angenommen werden, dass ein schneller und verlässlicher Nachweis von gut definierten genetischen Anomalien in der Diagnose und Behandlung von hämatopoetischen Malignitäten wichtig werden wird.

Mehrere unterschiedliche Arten von Chromosomenanomalien bei ALL und NHL wurden identifiziert. Die Chromosomenanomalien in Vorläufer-B-ALL betreffen hauptsächlich Translokationen, die zu Fusionsgenen führen, die für Fusionsproteine mit neuen oder modifizierten Funktionen kodieren. Beispiele umfassen die E2A-PBX und BCR-ABL-Fusionsproteine, die aus t(1;19) bzw. t(9;22) entstanden sind. Eine weitere wichtige Chromosomenregion, die 11q23 Region mit dem MLL-Gen, ist bei mehreren Arten von Translokationen bei akuten Leukämien beteiligt. Bei diesen 11q23 Translokationen sind verschiedene Partner-Gene beteiligt, die zu verschiedenen Fusionsproteinen führen.

Eines von ihnen ist t(4;11), das in etwa 70 % der akuten Leukämien bei Säuglingen beobachtet wird. Viele Chromosomenanomalien in T-ALL und NHL involvieren Ig- oder TCR-Gensequenzen in Kombination mit Onkogensequenzen. Diese Chromosomenanomalien ergeben keine Fusionsproteine, führen aber zu erhöhter oder stabilisierter Expression der beteiligten Onkogene und tragen dabei zu unkontrolliertem Wachstum bei. Sie erscheinen mit relativ hoher Häufigkeit in bestimmten Krankheitskategorien, wie beispielsweise t(14;18) unter Beteiligung des BCL2-Gens in etwa 90% derfollikulären Lymphome und t(11;14) unter Beteiligung des BCL1/Cyclin D1-Gens in etwa 70% der Mantelzelllymphome.

Von Anbeginn an war die cytogenetische Analyse von Chromosomen die Standardtechnik zum Nachweis von Chromosomenanomalien. Diese Technik benötigt das Vorhandensein von Metaphasezellen, was im allgemeinen verschiedene Zellkultursysteme erfordert, abhängig vom Typ der Malignität. Die Erfolgsrate, um verlässliche Karyogramme zu erhalten, ist äußerst abhängig vom Typ der Malignität und der Erfahrung des Labors und reicht von weniger als 50% bis über 90%. Ferner können manche Chromosomenanomalien nicht oder kaum durch eine cytogenetische Analyse nachgewiesen werden, wie beispielsweise TAL1-Deletionen in T-ALL und t(12;21) in Vorläufer-B-ALL. Daher wurde im Fall von gut etablierten Chromosomenanomalien die arbeitsintensive und zeitaufwendige klassische Cytogenetik durch molekulare Methoden ersetzt. Wie gesagt, können molekulare Analysen von genetischen Anomalien mit Southem-Blotting, Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und FISH-Techniken ausgeführt werden.

Southem-Blot-Analyse war lange Zeit das verlässlichste molekulare Verfahren zum Nachweis von gut etablierten Chromosomenanomalien, aber dieses Verfahren ist von der Verfügbarkeit geeigneter DNA-Sonden abhängig, die alle relevanten Bruchpunkt-Cluster-Region der beteiligten Chromosomenanomalien erkennen. Das letztere erklärt wahrscheinlich, warum BCL2- und BCL1/Cyclin-D1-GenAnomalien in nur 75% von follikulären Lymphomen bzw. in nur 50% von Mantelzelllymphomen durch Southern-Blotting nachweisbar sind. Weiterhin ist die Southem-Blot-Analyse zeitaufwendig und erfordert relativ große Mengen an DNA mit hoher Qualität, die von frischen oder gefrorenen Zellproben abstammt.

Über die letzten fünf Jahre wurden PCR-basierte Methoden als Alternative zum Southem-Blotting entwickelt. PCR-Methoden haben den Vorteil, dass sie schnell sind und nur kleine Mengen an DNA mit mittlerer Qualität erfordern, die sogar von Formalinfixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebeproben erhalten werden kann. Ebenso kann mRNA nach reverser Transkription (RT) zu cDNA verwendet werden. RT-PCR ist besonders wertvoll im Fall von Chromosomenanomalien mit Fusionsgenen und Fusionstranskripten, wie beispielsweise in Vorläufer-B-ALL und in t(2;5) bei anaplastischen, großzelligen Lymphomen häufig gesehen wird. Trotz dieser offensichtlichen Vorteile wird die breite Anwendung von PCR-Methoden zum Nachweis von Chromosomenanomalien in hämatopoetischen Malignitäten durch mehrere Probleme behindert. Falsch-negative PCR-Ergebnisse können erhalten werden, falls die DNA oder mRNA von Formalin-fixierten, Paraffin-eingebetteten Gewebeproben weniger optimal als erwartet ist oder wenn Primer fehlgepaart sind. Falsch-positive Ergebnisse können infolge von Kreuzkontamination von PCR-Produkten zwischen Proben verschiedener Patienten erhalten werden; besonders im Fall von RT-PCR-Studien von Fusionsgen-Transkripten mag es schwierig sein, falsch-positive Ergebnisse auszuschließen. Schließlich kann die PCR-Routineanalyse nur verwendet werden, um relativ kleine Fusionsregionen von Chromosomen-Bruchpunkten (<2 kb) zu untersuchen. Daraus folgt, dass Primer-Sätze mit multiplen Oligonukleotiden benötigt werden, um die wichtigsten Bruchpunkt- und Fusionsregionen zu bedecken, obwohl es schwierig sein wird, große Bruchpunkt- oder Fusionsregionen (>10 kb) zu untersuchen. Dies erklärt die niedrige Nachweisbarkeit von Chromosomenanomalien und daher wiederum das Auftreten von falsch-negativen Ergebnissen auf DNA-Niveau durch PCR im Vergleich zu Southem-Blotting.

Ein Hauptvorteil der FISH-Techniken im Vergleich zur cytogenetischen Analyse, Southem-Blotting und PCR-Analyse ist, dass FISH auf Interphasekerne aller Gewebearten und Zellproben ausgeführt werden kann und kein Bedarf für die Extraktion von DNA oder mRNA besteht. In FISH-Techniken werden im allgemeinen große DNA-Sonden (>25 kb) verwendet, die um die Bruchpunkt-Regionen der beiden Chromosomen der untersuchten Chromosomenanomalie lokalisiert sind. Daraus folgt, dass FISH-Sonden größere Regionen als Sonden des Southern-Blots oder PCR-Primer überprüfen können. Dieser Vorteil ist besonders wichtig zum Nachweis von Bruchpunkten außerhalb der herkömmlichen Bruchpunkt-Cluster-Regionen. Weiterhin erlaubt die Verwendung von großen Fluoreszenz-markierten DNA-Sonden ein direktes und schnelles Erkennen von Deletionen und Translokationen auf den untersuchten Genregionen. Die Anwendung der letzten Generation von Fluoreszenzmikroskopen mit Mehrfach-Fluorochrom-Filterkombinationen, CCD-Kamera und geeigneter Computersoftware erlaubt die kombinierte Verwendung von multiplen FISH-Sonden, die mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind.

Die Verfügbarkeit von geeigneten Sonden ist der größte limitierende Faktor bei Verwendung der FISH-Technik zum Nachweis von Chromosomenanomalien. Bisher wurden allgemein Cosmid-Klone, YAC-Klone oder andere klonierte DNA-Fragmente ohne spezifische Selektion oder Modifikation dieser Sonden verwendet. Für viele dieser Sonden ist die Position im Genom nicht genau bekannt; häufig überlappen diese sogar mit Bruchpunkt-Cluster-Regionen und häufig enthalten sie repetitive Sequenzen, die ein hohes Hintergrundfärben verursachen. Ferner werden Translokationen im allgemeinen durch die Verwendung von zwei unterschiedlichen Sonden nachgewiesen, eine Sonde für jedes der beteiligten Chromosomen; für diese zwei Sonden wird angenommen, im Fall von Translokationen zu co-lokalisieren, aber Einzelsignale zu zeigen, wenn keine Translokation vorliegt. Jedoch werden in der Praxis 2 bis 4% von normalen Interphasezellen aufgrund der Tatsache, dass die zwei Signale zufällig co-lokalisiert sind, falsch-positive Ergebnisse zeigen.

Für die Routineanwendbarkeit der FISH-Techniken oder anderer Sonden-Analyse-Assays oder -Kits zum Nachweis von Chromosomenanomalien in der Diagnose und Klassifizierung von hämatopoetischen Malignitäten ist es notwendig, bestimmte und ausgewogene Sonden zu entwickeln.

• 1. Die Sonden gemäß der Erfindung werden ausgewählt, um ein bestimmtes und ausgewogenes Nukleinsäuresondenpaar zu bilden; die Größe der Sonden liegt jeweils innerhalb bestimmter Grenzen des nachzuweisenden Genoms (z.B. 1–10, oder 10–30, oder 20–40, oder 30–50 oder 40–60 kb), mit dem endgültigen Ziel, dass die Intensität der Fluoreszenzsignale der verschiedenen Sonden vergleichbar ist.
• 2. In einer zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung wird die Position der das Paar darstellenden Sonden genau bestimmt, d.h. keine Überlappung mit Bruchpunkt-Cluster-Regionen, die relevanten Bruchpunkte sind vorzugsweise innerhalb 50 kb lokalisiert oder vorzugsweise sogar innerhalb 25 kb von jeder Sonde lokalisiert, und ein zusätzliches Sondenpaar muss konstruiert werden, wenn zwei Bruchpunkt-Regionen einer bestimmten Chromosomenanomalie mehr als 30–50 kb voneinander entfernt sind, abhängig von der genauen Position der Sonden.
• 3. In einer weiteren Ausführungsform enthalten die Nukleinsäuresonden keine (häufigen) repetitiven Sequenzen und kreuz-hybridisieren nicht, was ein hohes Hintergrundfärben ergibt. Aus diesem Grund können die Nukleinsäuresonden, die aus verschiedenen Fragmenten bestehen, entweder auf Metaphase-Ausstrichen oder mit Southem-Blotting auf Hybridisierungssensitivität und -spezifität getestet werden.
• 4. Bevor sie in diagnostischen Tests eingesetzt werden, können die Nukleinsäuresonden alternativ oder zusätzlich mit Fiber-FISH zur Kartierung und Prüfung ihrer relativen Positionen getestet werden.
• 5. Es wurde zusätzlich herausgefunden, dass der Nachweis von Chromosomen-Bruchpunkten leichter und verlässlicher wird, wenn zwei getrennte, mit zwei unterschiedlichen Fluorochromen markierte Sonden, die das Paar bilden, um eine der Bruchpunkt-Regionen einer Chromosomenanomalie herum konstruiert werden. Dies führt zur Co-Lokalisierung der Signale wenn kein Bruchpunkt vorliegt. Wenn ein Bruchpunkt in der untersuchten Bruchpunkt-Region auftritt, werden jedoch die zwei unterschiedlich markierten Sonden zwei getrennte Signale ergeben.
• 6. Zusätzlich erlaubt die Konstruktion einer dritten Sonde (markiert mit einem dritten Fluorochrom) und somit die Konstruktion von zwei zusätzlichen bestimmten Sondenpaaren für das Partner-Gen der Chromosomenanomalie eine genaue Identifizierung der Chromosomenanomalie.

Chromosomenanomalien, die in Malignitäten gefunden werden, sind nützlich zur molekularen Klassifizierung, wie beispielsweise im Fall von akuten Leukämien, bösartigen Lymphomen und soliden Tumoren (Tabelle 1). Wegen ihrer hohen Häufigkeit oder wegen ihres prognostischen Werts sind jedoch mehrere von diesen Anomalien wichtiger als andere. Zum Beispiel tritt t(14;18) oftmals in NHL auf, wohingegen t(12;21) häufiger in Vorläufer-B-ALL in der Kindheit gefunden wird. Andererseits stellen Translokationen, die das MLL-Gen in der 11q23-Region involvieren, einen schlechten prognostischen Faktor dar und das Auftreten von 11q23 (MLL-Gen)-Anomalien wird bereits als ein wichtiger Faktor für den Behandlungsaufbau bei akuten Leukämien verwendet. Ebenso besitzt t(9;22) bei ALL eine schlechte Prognose und wird zum Behandlungsaufbau verwendet.

Das MLL-Gen (für myeloide/lymphoide Leukämie oder „mixed-lineage" Leukämie) in der Chromosomenregion 11q23 ist an mehreren Translokationen bei sowohl ALL als auch bei akuten myeloiden Leukämien (AML) beteiligt. Bei diesen Translokationen wird das MLL-Gen, das für ein Protein kodiert, das Homologie zu dem Drosophila trithorax-Genprodukt zeigt, an Partner-Gene auf verschiedenen Chromosomen fusioniert. Bis heute wurden mindestens zehn Partner-Gene identifiziert. Einige von diesen Translokationen, wie die t(4;11) (q21;q23), t(11;19) (q23;p13) und t(1:11) (p32;q23), treten vorwiegend bei ALL auf, wohingegen andere, wie t(1;11) (q21;q23), t(2;11) (p21;q23), t(6;11) (q27;q23) und t(9;11) (p22;q23) häufiger bei AML beobachtet werden. Andere Arten wurden bei ALL als auch bei AML beschrieben. Behandlungs-ausgelöste AML mit 11q23-Anomalien können bei Patienten erscheinen, die vorher mit Topoisomerase II-Inhibitoren behandelt wurden. Umlagerungen, die die 11g23-Region betreffen, treten häufiger bei akuten Säuglingsleukämien (etwa 60–70 %) auf und, in einem kleineren Ausmaß, bei Kindheits- und Erwachsenenleukämien (jeweils etwa 5 %). MLL-Genumlagerungen, besonders die t(4;11), haben gezeigt, dass sie ein schlechter prognostischer Faktor bei Säuglingsleukämien sind, woraus sich eine 3 jährige Gesamtüberlebensrate von 5 % im Vergleich zu 85–90 % in Fällen mit Keimbahn-MLL-Genen ergibt.

Das große MLL-Gen (>100 kb) besteht aus 21 Exons, die für über 3900 Aminosäuren kodieren. Bruchpunkte in dem MLL-Gen sind in einer Region von 8,5-9 kb verteilt, die die Exons 5–11 einschließt. Wegen ihrer relativ kleinen Größe ist diese Bruchpunkt-Region leicht zugänglich für den molekularen Nachweis von Translokationen. Bei der Auswahl von zwei eindeutig markierten FISH-Sonden in den die Bruchpunkt-Region flankierenden Sequenzen kann jede Translokation, die die 11q23-Region involviert, auf der Grundlage der Auftrennung der zwei Fluorochromsignale nachgewiesen werden, wohingegen die zwei Fluorochrome co-lokalisieren, wenn keine Umlagerung in dem MLL-Gen aufgetreten ist. Ferner ermöglicht die Verwendung eines dritten Fluorochroms für gegen die Partner-Gene gerichtete Sonden, die Identifizierung des genauen Translokationstyps. Diese Zwei-Schritt-Methode der FISH-Analyse garantiert im ersten Schritt einen effizienten und direkten Nachweis aller Anomalien, die die 11q23 (MLL-Gen)-Region involvieren, wohingegen im zweiten Schritt der Typ der 11q23-Translokation bestimmt werden kann.

Chromosomenanomalien bei lymphoiden Malignitäten involvieren häufig Ig- oder TCR-Gene. Beispiele umfassen die drei Typen von Translokationen (t(8;14), t(2;8) und t(8;22)), die in Burkitt's Lymphomen gefunden werden, in welchen das MYC-Gen an die Ig-schwere-Kette (IGH)-, Ig-Kappa (IGK)- bzw. Ig-Lambda (IGL)-Gensegmente fusioniert ist. Ein weiterer häufiger Translokationstyp dieser Kategorie ist t(14;18) (q23;q21), der in etwa 90 % der follikulären Lymphome beobachtet wird, einem der wichtigsten NHL-Typen. Bei dieser Translokation wird das BCL2-Gen an Regionen innerhalb des IGH-Locus innerhalb oder angrenzend an die JH-Gensegmente umgelagert. Das Ergebnis dieser Chromosomenanomalie ist die Überexpression des BCL2-Proteins, das eine Rolle als Überlebensfaktor bei der Wachstumskontrolle durch das Verhindern des programmierten Zelltods spielt.

Das BCL2-Gen besteht aus nur drei Exons, diese sind aber über einen großen Bereich verteilt. Von diesen Exons kodiert das letzte Exon für eine große 3'-nicht-translatierte Region (3' UTR). Diese 3' UTR ist eine der zwei Regionen, in dem viele der t(14;18)-Bruchpunkte verteilt sind und wird als „große Bruchpunkt-Region" (mbr) bezeichnet; die andere in t(14;18)-Translokationen involvierte Bruchpunkt-Region liegt 20–30 kb stromabwärts des BCL2-Locus und wird als die „kleine Cluster-Region" (mcr) bezeichnet. Eine dritte BCL2-Bruchpunkt-Region, die vcr (variante Cluster-Region), liegt am 5'-Ende des BCL2-Locus und ist unter anderem an verschiedenen Translokationen beteiligt, z.B. t(2;18) und t(18;22), bei denen IGK- und IGL-Gensegmente die Partner-Gene sind.

Bei der Auswahl eines Satzes an FISH-Sonden, die in den Regionen stromaufwärts der mbr-Region und stromabwärts der mcr-Region lokalisiert sind, können Translokationen in diesen Regionen durch Auftrennung der Fluorochromsignale nachgewiesen werden. Ein zusätzlicher Satz von FISH-Sonden wird für die vcr-Region konstruiert, da der Abstand zwischen der vcr-Region und den anderen beiden Bruchpunkt-Clustern viel zu groß ist (ungefähr 400 kb), um die gleichen Sonden zu verwenden.

Als zweiter Schritt in all diesen Ansätzen werden FISH-Sonden in den IGH-, IGK- und IGL-Genen zur Identifizierung des genauen Translokationstyps verwendet.

Mehrere Arten von Nukleinsäuresonden, die gemäß der Erfindung für den Nachweis von Chromosomenanomalien bereitgestellt werden, können in der FISH-Technologie verwendet werden. Jede dieser Sondenarten hat ihre eigenen charakteristischen Eigenschaften und Vorteile, wobei sie zusammen einen komplementären Ansatz bilden, d.h. Cosmid-, PAC- oder YAC-abstammende Sonden, PCR-basierte Sonden oder PNA-basierte Sonden.

Klone, die von Cosmid-, PAC- oder YAC-Bibliotheken erhalten wurden, stellen große Sonden dar, die geeignete Signale nach Hybridisierung ergeben, wenn sie mit Fluorochromen markiert sind (Gingrich et al., 1996). Herkömmlicherweise ergibt sich jedoch häufig das Risiko der Überlappung mit den Bruchpunkt-Cluster-Region der beteiligten Chromosomenanomalie, da die genauen Positionen von diesen Sonden unbekannt sind, wenn keine weitere Selektion oder Modifikation dieser Sonden durchgeführt wird. Ferner enthalten derart große Sonden repetitive Sequenzen, die ein hohes Hintergrundfärben verursachen. Bestimmte und ausgewogene Sondenpaare, die Cosmid-, PAC- oder YAC-Sonden enthalten und konstruiert wurden, um mit den flankierenden Regionen stromab- und -aufwärts der Bruchpunkt-Region auf einem der beteiligten Chromosomen zu reagieren, können daher mit Fiber-FISH-Experimenten oder durch Verwendung von Southem-Blotting mittels Verwenden von kleinen gut definierten Einschluss- und Ausschlusssonden, die um die Bruchpunkt-Region herum entwickelt wurden, um ein Überlappen mit den Bruchpunkt-Cluster zu vermeiden, genau positioniert werden. Das Auftreten von potentiellen repetitiven Sequenzen wird mittels Southem-Blot-Analyse der genomischen DNA ausgeschlossen.

Sonden, die mittels PCR hergestellt wurden haben den zusätzlichen Vorteil, dass sie genau positioniert werden können, jedoch ist für diesen Ansatz Sequenzinformation zumindest für die Gebiete notwendig, um die Ziel-spezifischen PCR-Primer zur Herstellung der Sonden zu konstruieren. Einmal hergestellt, werden die PCR-Produkte auf das Vorkommen von repetitiven oder kreuz-hybridisierenden Sequenzen überprüft, die einen spezifischen Nachweis der flankierenden Regionen stromabwärts und stromaufwärts des beteiligten Bruchpunkt-Clusters behindern. PNA-basierte Sonden für die FISH-Technologie umfassen mehrere (z.B. 50–150) bestimmte PNA-Oligonukleotide, wobei jedes eine typische Größe von 5–40 zeigt, noch typischer 10–25 Nukleotide und welche zusammen ein geeignetes Signal zum Nachweis von Chromosomenanomalien unter Verwendung der FISH-Technologie erzeugen. PNA-Sonden, die ein neutrales Peptidrückgrad besitzen, an welches die vier Deoxynukleotide gekoppelt sind, sind stabile Nukleinsäurefragmente, die mit komplementären Nukleinsäuresequenzen mit hoher Affinität hybridisieren (Egholm et al.; Corey, 1997). Aufgrund der Tatsache, dass Fehlpaarungen die PNA-Hybridisierung stark beeinflussen, kann die Sequenzspezifität der PNA-Erkennung leicht erreicht werden, dabei hochselektive Sonden der PNA-Sonden, die in der FISH-Technologie verwendet werden, erzeugend. PNA-Sonden wurden bisher in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet, die in situ-Hybridisierung an hochrepetitive centromere oder telomere Sequenzen einschließen (Corey, 1997). Soweit war nur ein einziges PNA-Oligonukleotid, das gegen wiederholte Sequenzen gerichtet war, für ausreichende Signalintensitäten geeignet. Die Konstruktion eines ausgewogenen Nukleinsäuresondenpaares, das mehrere (z.B. 50–150) bestimmte PNA-Oligonukleotide enthält, die gegen Zielsequenzen in den flankierenden Regionen eines Bruchpunkt-Clusters gerichtet sind, stellt den Nachweis von Chromosomenanomalien, sowie andere Nukleinsäuresonden, bereit.

Jede der vorstehend genannten Arten von FISH-Sonden hat ihre spezifische Anwendbarkeit, zusammen jedoch bilden sie komplementäre und teilweise überlappende Strategien.

Das MLL-Gen in der Chromosomenregion 11q23 ist ein Beispiel für eine nachweisbare Region, die an verschiedenen Translokationen sowohl bei ALL als auch bei AML beteiligt ist (Tabelle 1), und stellt ein perfektes Beispiel einer Chromosomenanomalie bereit, für welche PCR-basierte oder PNA-basierte FISH-Sonden bevorzugt konstruiert werden können. Da die Bruchpunkt-Region in dem MLL-Gen so eng mit reichlich Exons, die in den flankierenden Regionen stromaufwärts und stromabwärts des Bruchpunkt-Clusters verfügbar sind, angereichert ist, ist die Sequenz-basierte Konstruktion und Herstellung von bestimmten und ausgewogenen Paaren von PCR-basierten und/oder PNA-basierten FISH-Sonden sehr nützlich in dieser Chromosomenregion. Die Entwicklung von genau positionierten Cosmid- oder PAC-Klonen könnte als eine alternative oder zusätzliche Strategie sehr nützlich sein.

Die BCL2-Genregion ist ein Beispiel, die an mehreren Chromosomenanomalien bei bösartigen Lymphomen (Tabelle 1) beteiligt ist, und die mehrere Bruchpunkt-Regionen enthält, die außerhalb der kodierenden Sequenzen an den 5'- und 3'-Enden des BCL2-Locus lokalisiert sind und die weit auseinanderliegen. Der BCL2-Locus ist daher beispielhaft für ein Gen, das an Chromosomenanomalien beteiligt ist, für welches bestimmte und ausgewogene Paare von FISH-Sonden mittels PCR und/oder mittels Vereinigen von PNA-Oligonukleotiden schwieriger zu erzeugen sind, da weniger Sequenzinformation verfügbar ist. In derartigen Chromosomenanomalien können bestimmte und ausgewogene Paare von Cosmid-, PAC- und/oder YAC-abstammenden FISH-Sonden nach sorgfältiger Auswahl und Modifikation der genauen Position eingesetzt werden.

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