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Dokumentenidentifikation DE60202361T2 22.12.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0001384083
Titel VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON TRANSCOBALAMINE II
Anmelder Axis-Shield ASA, Oslo/Osló, NO
Erfinder ÖRNING, Lars, N-0510 Oslo, NO
Vertreter Reitstötter, Kinzebach & Partner (GbR), 81679 München
DE-Aktenzeichen 60202361
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.04.2002
EP-Aktenzeichen 027244243
WO-Anmeldetag 23.04.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/GB02/01846
WO-Veröffentlichungsnummer 0002086513
WO-Veröffentlichungsdatum 31.10.2002
EP-Offenlegungsdatum 28.01.2004
EP date of grant 22.12.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.12.2005
IPC-Hauptklasse G01N 33/82

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Verbesserungen bei und in Bezug auf diagnostische Testverfahren, insbesondere Transcobalamin-Tests.

Cobalamin oder Vitamin B12 ist ein wasserlösliches Vitamin, welches Teil des in Lebensmitteln zu findenden Vitamin B-Komplexes ist. Das Kernmolekül besteht aus einem Corrinring mit 4 Pyrroleinheiten, die das essentielle Cobaltatom umgeben. Cobalamin ist das einzige Vitamin, das von Tieren oder Pflanzen nicht synthetisiert werden kann und aus der Nahrung über den Darm absorbiert werden muss. Es kann allerdings in der Leber gespeichert werden. Es wird von Mikroorganismen, insbesondere von anaeroben Bakterien und Hefen, synthetisiert.

In vivo wirkt Cobalamin als Coenzym, und Cobalaminenzyme katalysieren drei Arten von Reaktionen: (i) intramolekulare Umlagerungen, z. B. die Bildung von Succinyl-CoA auf L-Methylmalonyl-CoA; (ii) Methylierungen, z. B. die Bildung von Methionin durch Methylierung von Homocystein; und (iii) Reduktionen von Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden in einigen Mikroorganismen. Von Säugern ist bekannt, dass lediglich zwei enzymatische Reaktionen, nämlich die oben unter (i) und (ii) speziell erwähnten, Cobalamin als Coenzym benötigen.

Ein Haptocorrin genanntes Speichelprotein, das im Folgenden als HC bezeichnet wird (und von der Fachwelt auch als R-Binder oder kollektiv als Transcobalamine I und III bezeichnet wird) bindet während des Verdauungsprozesses im oberen Verdauungstrakt Cobalamin, wobei sich ein magengängiger Komplex bildet. Enzyme aus der Bauchspeicheldrüse verdauen den Cobalamin-Haptocorrin (Holo-HC)-Komplex im Ileum, wodurch Cobalamin freigesetzt wird, das dann an ein intrinsischer Faktor genanntes Protein gebunden wird, welches von der Magenschleimhaut sekretiert wird, wobei sich ein weiterer Komplex bildet. Der Komplex aus Cobalamin und dem intrinsischen Faktor bindet an einen speziellen Rezeptor auf der Auskleidung des terminalen Ileums, wonach der Komplex durch einen Freisetzungsfaktor dissoziiert wird und das Cobalamin über die Membran des Ileums aktiv in den Blutstrom transportiert wird.

In freier Form zirkuliert Cobalamin im Körper nicht in nennenswerter Menge. Wahrscheinlich sind etwa 99% des Cobalamins von Haptocorrin, Transcobalamin oder Albumin gebunden.

Man glaubt, dass das für den Transport von Cobalamin in Zielgewebe verantwortliche Protein Transcobalamin II (im Folgenden der Einfachheit halber als Transcobalamin oder TC bezeichnet) ist, ein kritisches Spurenprotein, ohne das Cobalamin Zellmembranen nicht überwinden kann. Trotz dieser wichtigen metabolischen Funktion sind lediglich etwa 6–25% Cobalamin im Serum an TC gebunden und wird der überwiegende Teil von HC getragen. TC ist ein einzelkettiges Polypeptid mit 45 kDa, das vornehmlich in Serum, Samenflüssigkeit und Cerebrospinalflüssigkeit zu finden ist. Cobalamin gebundenes TC oder Holo-TC bindet an spezielle Rezeptoren auf Zellmembranen und, einmal gebunden, wird der Holo-TC-Komplex durch Pinocytose in Zellen aufgenommen.

TC wird von der Leber, dem Gefäßendothel, Enterocyten, Macrophagen und Fibroblasten synthetisiert und zirkuliert vornehmlich als Apo-TC, d. h. ohne gebundenes Cobalamin. Es besitzt eine kurze Halbwertzeit von annähernd 90 Minuten.

Weniger als ein Viertel des gesamten Plasma-Cobalamins ist mit TC assoziiert. Der Rest ist an HC oder Albumin, wie oben erwähnt, gebunden.

Da Cobalamin aus der Nahrung absorbiert werden muss, kann jeder zu einer gestörten Magenfunktion führender Zustand, beispielsweise eine Gastroenteritis oder zu einer Magenatrophie führende Zustände, oder kann ein Unvermögen, funktionelles Haptocorrin, funktionellen intrinsischen Faktor, funktionellen Freisetzungsfaktor, funktionelles TC oder funktionelle TC-Rezeptoren hervorzubringen, zu einer gestörten Aufnahme von Cobalamin und einer damit einhergehenden Defizienz führen.

Bestimmte Bevölkerungsuntergruppen, beispielsweise Alte, schwangere Frauen, Patienten mit chronischen oder akuten gastrointestinalen Erkrankungen, diejenigen, die an bestimmten Autoimmunerkrankungen leiden, diejenigen mit einer familiären Vorgeschichte für perniziöse Anämie und AIDS-Kranke, sind für eine Cobalamin-Defizienz besonders anfällig.

Die klinischen Anzeichen für eine Cobalamin-Defizienz sind vielfältig und zahlreich; in erster Linie gehören hierzu jedoch die Anämie, megaloblastische Hämatopoese sowie funktionelle und strukturelle Erkrankungen des Nervensystems. Etwa 60% der Individuen, bei denen eine Cobalamin-Defizienz diagnostiziert wird, sind anämisch, doch bei vielen sind neurologische Symptome die einzigen beobachteten klinischen Anzeichen. Etwa 10% der Patienten zeigen psychiatrische Symptome und etwa 40% zeigen sowohl neurologische als auch psychiatrische Symptome.

Um eine gute Prognose für Patienten sicherzustellen, ist es entscheidend, eine Cobalamin-Defizienz früh zu diagnostizieren, da einige der Erscheinungsformen einer Cobalamin-Defizienz, insbesondere die neuropsychiatrischen Effekte, irreversibel sind, wenn sie nicht rasch erkannt und durch eine Cobalamin-Therapie gelindert werden.

Es ist daher wünschenswert, den Cobalaminspiegel eines Individuums auf zweckmäßige und effiziente Weise akkurat zu bestimmen, um festzustellen, ob das Individuum an einer Cobalamin-Defizienz leidet.

Die Messung des gesamten Plasma-Cobalamins, d. h. des an HC oder TC gebundenen Cobalamins (und Cobalamin-artiger Substanzen), wurde bereits versuchsweise zur Beurteilung einer Cobalamin-Defizienz verwendet. Diese Technik führt innerhalb einer Population zu einer Konzentrationsverteilung mit breiter Basis, die als normal angesehen wird und daher einen weiten Referenzbereich ergibt. Individuell ist der als normal für ein bestimmtes Individuum angesehene Bereich von zur Verfügung stehendem Cobalamin allerdings sehr eng. Man hat beobachtet, dass selbst dann, wenn die metabolisch aktive Cobalaminkonzentration eines Individuums den eigenen Referenzbereich verlassen hat, der gesamte Plasma-Cobalamingehalt nichtsdestotrotz innerhalb des als normal für die Population angesehenen Bereichs bleibt. Unter solchen Umständen kann eine Cobalamin-Defizienz unentdeckt bleiben. Ein derart unzuverlässiges Verfahren ist klar unerwünscht, und es ist hinlänglich anerkannt, dass solche Serum- oder Plasma-Cobalaminmessungen eine geringe diagnostische Sensitivität und Spezifität besitzen.

Mikrobiologische Tests mit Mikroorganismen, deren Wachstum von Cobalamin abhängt, sind entwickelt und verwendet worden, um Plasma-Cobalaminkonzentrationen zu messen; doch zusätzlich zu der Schwierigkeit, den geeigneten Referenzbereich abzuschätzen, ist es bei diesen Verfahren erforderlich, die Cobalamine zu extrahieren und umzuwandeln, was sehr zeitaufwendig, störanfällig und für ein rasches Screening im Labor vollkommen ungeeignet ist.

Bei alternativen Verfahren zur Beurteilung eines Cobalaminmangels misst man die Akkumulation von Metaboliten im Plasma, die für ihre Umsetzung Cobalamin benötigen. Methylmalonat- und Homocystein-Plasmaspiegel nehmen in Individuen mit Cobalaminmangel zu und stellen gute Kandidaten für Moleküle dar, die mit einem Vitamin B12-Mangel korrelieren. Auf der Beurteilung von Homocystein basierende Verfahren stellten sich allerdings als kompliziert, impraktikabel und wenig spezifisch und sensitiv heraus. Während auf der Messung von Methylmalonat basierende Verfahren exakt und verlässlich sind, erfordern diese viel Aufwand und benötigen eine Analyse durch kombinierte Gaschromatographie/Massenspektrometrie und sind daher kostspielig und wiederum für das routinemäßige klinische Screening ungeeignet.

Man hat auch vorgeschlagen, dass die Messung von TC-gebundenem Cobalamin im Gegensatz zum gesamten Plasmacobalamin ein verlässlicher klinischer Indikator für die Wahrscheinlichkeit einer Cobalamin-Defizienz sein kann (Herbert et al. (1990) Am. J. Hematol. 34: 132–139; Wickramasinghe und Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46: 537–539; US-Patent 4,680,273). Solche Anstrengungen, Holo-TC-Konzentrationen zu bestimmen, waren meist indirekt, wobei die Holo-TC-Konzentration als Differenz zwischen dem gesamten Plasma-Cobalamin und der Cobalaminkonzentration von TC-abgereichertem Plasma bestimmt wurde.

Eine solche TC-Abreicherung kann man mittels Adsorption an Ammoniumsulfat (Carmel (1974) Am. J. Clin. Pathol. 62: 367–372), Mikrosiliciumdioxid (Herzlich & Hubert (1988) Lab. Invest. 58: 332–337; Wickramasinghe & Fida (1993) J. Clin. Pathol. 46: 537–539), mikrofeines Glas (Vu et al. (1993) Am J. Hematol. 42: 202–211) oder immobilisierte polyklonale Antikörper (Lindemans et al. (1983) Clin. Chim Acta 132: 53–61) erreichen. Die Konzentration von Cobalamin im Gesamtplasma und der abgereicherten Fraktion führt man mit Verfahren durch, die in der Fachwelt hinlänglich bekannt sind, wie Radio- oder Enzymimmunoassay-Techniken. Für ein routinemäßiges Screening, ob automatisiert oder nicht automatisiert, sind diese Verfahren ungeeignet, da sie komplex und zeitaufwendig sind und da der geringe Spezifitätsgrad der verwendeten Adsorptionsmaterialien zu einer ungenügenden zifitätsgrad der verwendeten Adsorptionsmaterialien zu einer ungenügenden Auftrennung von Holo-TC und Holo-HC führt, was wiederum zu einer Überbewertung des Holo-TC führt. Unterschiede zwischen einzelnen Chargen des Adsorptionsmaterials sind weitere Fehlerquellen; größte Bedeutung ist der Tatsache beizumessen, dass die Subtraktion eines großen Volumens von einem weiteren großen Volumen zu unannehmbaren Ungenauigkeiten und Unzuverlässigkeiten führt.

Bei weiteren Versuchen TC zu beurteilen, hat man TC von anderen Serumkomponenten, HC eingeschlossen, unter Verwendung seiner Lipophilie abgetrennt. In diesem Sinne beschreiben Kapel et al. (1988) Clin. Chim. Acta 172: 297–310, Benhayoun et al. (1993) Acta Haematol. 89: 195–199 und Toft et al. (1994) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 54: 62 Verfahren, um TC von HC abzutrennen, wobei man Heparinsepharose, Silicagel bzw. Cellulose verwendet. Diese Verfahren haben allerdings denselben Nachteil wie die indirekten Verfahren, da sie auf denselben Adsorptionsmaterialien aufbauen. Auch die geringe Plasmakonzentration von Holo-TC macht diese Verfahren für eine Kombination mit bestehenden Verfahren zur Cobalaminquantifizierung ungeeignet. Der normale Bereich von Holo-TC liegt bei 35–160 pM und Werte unterhalb von 35 pM werden im Allgemeinen als ein Hinweis auf eine Cobalamin-Defizienz angesehen. Die berichtete analytische Sensivität der meisten Routineverfahren für Plasmacobalamin liegt bei etwa 40 pM, ist in der Praxis aber oftmals viel höher, typischerweise bei etwa 90 pM. Normale Plasmaspiegel von Holo-TC liegen daher unterhalb von oder nahe an der Sensitivitätsgrenze der Routineverfahren zur Cobalaminquantifizierung.

Bei dem möglicherweise genauesten, derzeit für die Bestimmung von TC-gebundenem Cobalamin anerkannten Verfahren adsorbiert man TC an Siliciumdioxid und untersucht dann die gebundene Fraktion auf den Cobalamingehalt, wobei man entweder einen Immunoassay, wie beispielsweise von Kuemmerle et al. (1992) Clin. Chem. 38/10: 2073–2077 beschrieben, oder einen mikrobiologischen Test verwendet, wobei letzterer scheinbar die besten Resultate hervorbringt. Bei diesem Verfahren benötigt man einen gesamten Arbeitstag, um lediglich 20 Tests durchzuführen. Er ist sehr kostspielig und impraktikabel und für routinemäßige, klinische, diagnostische Laboruntersuchungen wenig geeignet.

In WO 00/17659 ist ein alternatives Verfahren zur Bestimmung von Holo-TC-Konzentrationen beschrieben, bei dem man beispielsweise eine zellfreie Probe mit einem TC-spezifischen, an magnetisierbaren Partikeln immobilisierten Antikörper und mit einem nicht überlappenden, nicht immobilisierten, radiomarkierten, holo-TCspezifischen Antikörper in Kontakt bringt. Man trennt die Partikel unter Verwendung eines magnetischen Feldes ab, wäscht und bestimmt ihre Radioaktivität, und stellt so eine Messung des Holo-TC-Gehalts der Probe zur Verfügung. Dieses Verfahren benötigt aber eine Eichung und ist geeigneter, in einem klinischen Laboratorium durchgeführt zu werden als von einem Mediziner oder einer medizinischen Assistentin im Bereich der Krankenpflege.

Es gibt somit nach wie vor einen Bedarf für einen Test für Holo-TC, der einfach ist und im Pflegebereich eingesetzt werden kann.

Wir haben erkannt, dass solch ein einfacher Test möglich ist, indem man nicht den Holo-TC-Gehalt, sondern die TC-Sättigung, d. h. den in der Holo-Form vorliegenden TC-Anteil, bestimmt, wobei man zwei markierte spezifische Bindungspartner verwendet, einen für Holo-TC und den anderen für Apo-TC oder für sowohl Holo- als auch für Apo-TC, und das Verhältnis der Signale von den beiden Markierungen bestimmt. Ein solcher Test ist darüber hinaus volumenunabhängig, d. h. die verwendete Menge der Flüssigkeitsprobe (z. B. Körperflüssigkeit) muss nicht exakt bestimmt werden. Dies ist ein großer Vorteil bei der Verwendung im Pflegebereich.

Einem Aspekt zufolge stellt die vorliegend Erfindung somit ein Testverfahren zur Bestimmung der Transcobalaminsättigung zur Verfügung, wobei man eine Transcobalamin enthaltende Flüssigkeitsprobe mit einem porösen Substrat, auf dem ein Transcobalamin immobilisierender Ligand immobilisiert ist, und mit einem Reportermarkierten Transcobalamin-Bindungspartner in Kontakt bringt und Signale von Reporter-Markierungen, die auf dem Substrat immobilisiert werden, nachweist, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass entweder der Ligand oder der Bindungspartner einen ersten Liganden oder Bindungspartner, der an Holo-Transcobalamin spezifisch zu binden vermag, und einen zweiten Liganden oder Bindungspartner, der an Apo-Transcobalamin oder an Holo- und Apo-Transcobalamin zu binden vermag, umfasst.

Gemäß einer Ausführungsform beinhaltet das Testverfahren, dass man:

  • (i) eine Transcobalamin enthaltende Flüssigkeitsprobe mit einem porösen Substrat, auf der ein Transcobalamin immobilisierender Ligand immobilisiert ist, in Kontakt bringt;
  • (ii) vor, während oder nach obigem Schritt (i) Transcobalamin der Probe mit einem ersten und einem zweiten Reporter-markierten Bindungspartner für Transcobalamin in Kontakt bringt, wobei der erste Bindungspartner sowohl an Holo- als auch Apo-Transcobalamin zu binden vermag oder ein für Apo-Transcobalamin spezifischer Bindungspartner ist und der zweite Bindungspartner ein für Holo-Transcobalamin spezifischer Bindungspartner ist; und
  • (iii) Signale von den Reporter-Markierungen der auf dem Substrat immobilisierten Bindungspartner nachweist und daraus einen Hinweis auf die Transcobalaminsättigung in der Probe entnimmt.

Alternativ kann das Substrat einen ersten Abschnitt mit einem darauf immobilisierten Liganden, der ein für Holo-Transcobalamin spezifischer Bindungspartner ist, und einen zweiten mit einem darauf immobilisierten Liganden, der ein für Apo-Transcobalamin spezifischer Bindungspartner ist oder der sowohl Holo- als auch Apo-Transcobalamin zu immobilisieren vermag, aufweisen und kann der Schritt (iii) den Nachweis von Signalen aus besagten ersten und zweiten Abschnitten beinhalten.

Mit spezifischem Bindungspartner oder Ligand meint man einen, der aufgrund seiner spezifischen chemischen Struktur oder Konformation und nicht nur aufgrund einer allgemeinen physicochemischen Eigenschaft (wie die Lipophilie), die vielen Komponenten einer Körperflüssigkeitsprobe gemein sein kann, an TC (d. h. Apo-TC und/oder Holo-TC je nach Bedarf) bindet.

Der spezifische Bindungspartner oder Ligand wird im Allgemeinen entweder ein Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Einzelkettenantikörper, ein Antikörperfragmentendimer, -trimer oder -tetramer, oder eine Verbindung mit Affinität zu Apo-TC und/oder Holo-TC, beispielsweise ein Zelloberflächenrezeptor, ein Polypeptid, ein Oligopeptid, ein Oligonukleotid, eine kleine organische Substanz, etc. sein. Weitere spezifische Bindungspartner oder Liganden können aus einer kombinatorischen Chemie- oder Phage-Display-Bank oder aus spezifischen DNA- oder RNA-Bindungssequenzen ausgewählt werden.

Ist der spezifische Bindungspartner oder Ligand ein Antikörper, so kann dieser polyklonal sein; monoklonale Antikörper sind allerdings bevorzugt. Monoklonale Antikörper können mit sehr viel größerer Spezifität und Gleichförmigkeit erzeugt werden als polyklonale Antikörper, und dies verringert die Kreuzreaktitivät mit anderen Komponenten aus der Körperflüssigkeit, insbesondere mit HC, und gegebenenfalls der alternativen Konformation, z. B. der Apo-Form, des Zielanalyten. Die Gleichförmigkeit und Reproduzierbarkeit, die monoklonale Antikörper im Vergleich zu polyklonalen Antikörpern bieten, sorgt für eine höhere Genauigkeit, was für einen Test, bei dem der Analyt in solch geringer Konzentration vorliegt, absolut notwendig ist. Eine Alternative sind Antikörperfragmente, z. B. ein F(ab)-, F(ab')2- oder F(v)-Fragment. Die Antikörper oder Antikörperfragmente können monovalent oder divalent sein und mittels Hybridomtechnologie produziert werden, oder synthetischen Ursprungs sein und mittels rekombinanter DNA-Technologie oder chemischer Synthese erzeugt werden. Einzelkettenantikörper oder weitere Antikörperderivate oder -mimetika können beispielsweise verwendet werden. Die Antikörper können gegen ein beliebiges Epitop, eine beliebige Komponente oder Struktur des Apo- und/oder Holo-TC-Proteins gerichtet sein oder dadurch ausgelöst werden, je nachdem was zweckmäßig ist.

Der in dem erfindungsgemäßen Testverfahren verwendete, für Holo-TC spezifische Bindungspartner oder Ligand (SBP) sollte für Holo-TC (im Gegensatz zu Apo-TC) eine Spezifität aufweisen, die wenigstens das 10-fache, vorzugsweise wenigstens das 50-fache und noch bevorzugter wenigstens das 100-fache beträgt, d. h. bei einem Überschuss von wenigstens 10 × soviel Apo-TC als Holo-TC soll der SBP eher an Holo-TC als an Apo-TC binden. Im Allgemeinen ist es daher bevorzugt, den Holo-TC-SBP zu selektieren, indem man eher in vitro-Verfahren verwendet als Antikörper in einem Wirtstier erzeugt. Dementsprechend ist es bevorzugt, für das Screening auf Holo-TC-SBP in vitro-Banken, z. B. Phage-Display-Antikörper-Banken (vor allem Einzelkettenantikörper-Banken) oder Oligonukleotid- oder chemische Banken zu verwenden. Die Affinität des Holo-TC-SBP für Holo-TC wird darüber hinaus bevorzugt so sein, dass nanomolare Konzentrationen Holo-TC nachgewiesen werden können.

Holo-TC-SBP-Kandidaten kann man beispielsweise selektieren, indem man Holo-TC auf einem Substrat (z. B. Kügelchen oder Blättchen) z. B. mittels Amidkopplung immobilisiert und die Bank im Beisein eines Überschusses an nicht immobilisiertem Apo-TC austestet (panning). Das Substrat sollte dann gründlich gewaschen werden und Holo-TC-Bindungskandidaten sollten dann freigesetzt und mit üblichen Mitteln je nach Typ der Bank identifiziert werden.

Man kann Kandidaten dann auf eine Kreuzreaktivität mit Apo-TC austesten und Kandidaten mit einer ausreichenden Bevorzugung für Holo-TC versus Apo-TC auswählen. Es ist erwünscht, dass Holo-TC-SBP-Kandidaten auch gescreent werden, um SBP, die mit HC kreuzreagieren, aus der Auswahl herauszunehmen.

Am bevorzugtesten sollten die bindenden Abschnitte des Holo-TC-SBP nichtpeptidisch sein; sie können beispielsweise kleine organische Moleküle oder Oligonukleotide (z. B. 20- bis 50-mere) sein.

Apo-TC-SBP-Kandidaten können in entsprechender Weise selektiert werden; allerdings ist es im Allgemeinen bevorzugt, einen Holo-TC-SBP und einen nicht überlappenden TC-SBP (d. h. einer der sowohl an Apo- als auch an Holo-TC bindet) zu verwenden, und TC-SBP sind aus der Literatur gut bekannt (siehe beispielsweise Quadros et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 222: 149–154 (1996) und McLean et al., Blood 89: 235–242 (1997)).

Sobald man Holo-TC-SBP-Kandidaten und TC- oder Apo-TC-SBP-Kandidaten selektiert hat, können diese mit konventionellen Mitteln mit Reporter-Markierungen versehen werden.

Die Reporter können gleich sein, falls verschiedene Liganden auf verschiedenen Abschnitten des Substrats immobilisiert sind; ansonsten sollten die Reporter allerdings unterschiedlich sein, d. h. ihre Signale sollten voneinander unterscheidbar sein.

Die Reportereinheiten in den SBP können irgendeine von den herkömmlichen Reportern sein, z. B. Emitter oder Absorber von Strahlung, insbesondere Emitter oder Absorber von elektromagnetischer Strahlung, Enzyme, oder weniger bevorzugt Radiomarkierungen, etc. Im Fall von enzymatischen Reportereinheiten werden die Nachweissignale Signale, z. B. emittiertes Licht, aus der von dem Enzym katalysierten Reaktion sein. Die Nachweissignale können daher direkt oder indirekt von den Reportereinheiten erzeugt werden.

Einige geeignete Beispiele farbiger oder fluoreszierender Verbindungen, die man erfindungsgemäß verwenden kann, um einen SBP nachweisbar zu markieren, sind Anthrachinone, Azofarbstoffe, Azinfarbstoffe wie Oxazine und Thiazine, Triazine, natürlich vorkommende Pigmente wie Porphyrine, Phycobiliproteine, Phycoerythrine und Phycoguanine eingeschlossen, Chlorophylle sowie Analoga und Derivate davon, Carotenoide, Acrinidine, Xanthene, Fluoreszeine und Rhodamine eingeschlossen, Indigofarbstoffe, Thioxanthene, Coumarine, Polymethine, Di- und Triarylmethine sowie Derivate davon mit Phthalocyaninen und Metallphthalocyaninen eingeschlossen, nur um Beispiele zu nennen.

In ähnlicher Weise kann man ein breites Spektrum an radioaktiven Verbindungen als signalgebende Markierungen verwenden, unter anderem Iod-125-markierte Verbindungen.

Alternativ kann man den SBP an natürliche oder synthetische Verbindungen konjugieren, die in bekannter Weise auszutestende chemilumineszierende Signale hervorrufen (Cormier, M. J. et al., Chemiluminescence and Bioluminescence, Plenum Press, New York 1973). Zu geeigneten chemilumineszierenden Verbindungen gehören Luciferin, Oxalsäureester, 1,2-Dioxethane, Luminol und Derivate davon, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein. Gegebenenfalls kann man Wasserstoffperoxid, Enzyme, z. B. Luciferase, Alkalische Phosphatase oder andere Chemikalien verwenden, um das chemilumineszierende Signal aus den verwendeten, signalhervorrufenden Molekülen hervorzurufen.

Vorzugsweise konjugiert man den SBP an ein polymeres „Gerüst", das eine Vielzahl von Reportereinheiten trägt, z. B. Enzyme, Chromophore, Fluorophore, etc. Auf diese Weise kann das Signal verstärkt werden, z. B. mehrere 100-fach. Zu typischen Polymergerüsten gehören Dextran (z. B. Amdex), Polyethylenglykol und Dendrimere (z. B. Starburst-Dendrimere).

Es kann sein, dass stark anionische, signalgebende Moleküle im erfindungsgemäßen Verfahren nicht bevorzugt zu verwenden sind, da diese dazu neigen, an Serumproteine wie Humanserumalbumin (HSA) zu binden, welche in der Probe zugegen sein können. Besonders geeignete, zu verwendende Beispiele sind Fluoreszeinisothiocyanat, Rhodamin B oder N-(Resorufin-4-carbonyl)piperidin-4-carbonsäure-N-hydroxysuccinimidester)(Resos).

Ist der Reporter ein Lichtemitter oder Lichtabsorber, so ist es besonders bevorzugt (vor allem für den markierten Holo-TC-SBP), dass der Reporter eine Vielzahl von Chromophoren oder Fluorophoren umfasst, so dass das Signal verstärkt ist. Eine besonders bevorzugte Gruppe von Reportern ist die Gruppe von Reportern mit der Fähigkeit zur zeitverzögerten Fluoreszenz und eine andere ist die Gruppe mit der Fähigkeit, Lumineszenz hervorzurufen. Zu speziellen Beispielen von Reportern gehören &bgr;-Galactosidase und Alkalische Phosphatase aus Huhn.

Im Fachgebiet ist es hinlänglich bekannt, Affinitätsmoleküle, z. B. Antikörper und Antikörperfragmente zu Trennzwecken, zu immobilisieren, beispielsweise durch Bindung oder Kopplung der Liganden, gegebenenfalls mittels eines Linkers, an irgendeinen oder irgendeine der hinlänglich bekannten festen Träger oder Matrices, die derzeit für Trennungen oder Immobilisierungen häufig verwendet oder vorgeschlagen werden, und man kann irgendein im Fachgebiet bekanntes Verfahren verwenden. Derartige feste Phasen können die Form von Partikeln, Blättchen, Gelen, Filtern, Membranen, Fasern oder Kapillaren haben. Techniken für die Bindungen des Liganden an das poröse Substrat sind somit extrem gut bekannt und häufig in der Literatur beschrieben.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist das Substrat vorzugsweise ein poröses Blättchen oder poröser Streifen (z. B. aus einem Material auf Cellulosebasis, vorzugsweise Nitrocellulose), das besonders bevorzugt auf einem nichtporösen Träger angeordnet ist, gegebenenfalls mit einem absorbierenden Material auf der Rückseite, welches dazu dient, die Absorption der Flüssigkeitsprobe in das Substrat durch Kapillarwirkung zu unterstützen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Substratschicht, auf der Rückseite vorzugsweise mit einer absorbierenden Schicht versehen, auf einem Dipstick angeordnet. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die auf der Rückseite vorzugsweise mit einer absorbierenden Schicht versehene Substratschicht in einem Plastikgehäuse gehalten, das mit einer Öffnung versehen ist, um die Flüssigkeitsprobe auf die zugängliche Oberfläche der Substratschicht aufzutragen und um die Signale von der Substratschicht abzulesen.

Die Signalerzeugung kann, soweit erforderlich, mit jedem beliebigen für die gewählte Markierung geeigneten Mittel geschehen, z. B. durch Einwirkung von Licht oder eines Substrats für eine enzymatische Markierung, und der Signalnachweis kann mit jedem beliebigen, zum Nachweis des emittierten Signals geeigneten Detektor erfolgen, z. B. mit Detektoren für Radioaktivität oder Licht. Falls die Signale Lichtsignale sind, ist es besonders bevorzugt, eine Digitalkamera als Detektor zu verwenden, die, falls erforderlich, mit einem Filter, Prisma oder anderen Mitteln versehen ist, um sicherzustellen, dass man das gewünschte Wellenlängenband den Detektor erreichen lässt.

Der Nachweis der Signale aus den zwei markierten SBP kann simultan oder sequenziell erfolgen. Der simultane Nachweis ist bevorzugt.

Der Umgang mit dem nachgewiesenen Signal zur Erzeugung eines quantitativen, semiquantitativen oder qualitativen Hinweises auf die TC-Sättigung erfolgt zweckmäßigennreise durch einen Computer, der vorzugsweise Teil des Gerätes ist, das man zur Durchführung des Tests verwendet, und der zur Leistungskontrolle des Tests ausgelegt ist. Sind diese signalgebenden Markierungen in den SBP unterschiedlich, ist es erforderlich, den Test in herkömmlicher Weise zu kalibrieren, um das Signalverhältnis (Sa/Sb oder Sa/(Sa + Sb), worin Sa das Holo-TC-SBP-Signal bzw. Sb das TC- oder Apo-TC-SBP-Signal ist) in einen TC-Sättigungswert umzusetzen. Dementsprechend kann der Test gewünschtenfalls mit Eichstandards versehen werden, die Apo- und Holo-TC in bekannten Verhältnissen enthalten.

Gemäß einer alternativen Ausführungsform kann jedes erfindungsgemäße Verfahren auf der Oberfläche eines Chip-artigen Substrats in einem Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Detektor durchgeführt werden. Mit einem solchen Verfahren vermeidet man die Notwendigkeit, die spezifischen Liganden oder Substrate aktiv zu markieren; man weist die Bindung direkt durch die zusätzliche Masse der an die Oberfläche gebundenen spezifischen Bindungsliganden oder spezifischen Bindungspartner nach. Bei einem bevorzugten Beispiel dieser Alternative ist ein TCII-Binder auf der Oberfläche eines SPR-„Chips" immobilisiert (z. B. durch ein Beschichten des Chips mit Gold und anschließender Absorption eines Thiol-konjugierten TCII-Binders oder durch Amidkopplung des Binders an einen Dextran-beschichteten Chip). Der Chip wird dann in den Oberflächenplasmonresonanz-Detektor gegeben und man lässt eine die Probe enthaltende Lösung über den Chip fließen, so dass Holo-TC und Apo-TC aus der Probe an den immobilisierten Liganden binden. Dann lässt man eine einen ersten spezifischen Binder mit Spezifität für Apo-TC oder mit Spezifität sowohl für Apo-TC als auch Holo-TC über den Chip fließen und bestimmt die Bindung mittels Oberflächenplasmonresonanz, was ein erstes Signal ergibt. Diesen ersten spezifischen Binder wäscht man dann gegebenenfalls ab und gibt einen zweiten spezifischen Binder mit Spezifität für Holo-TC über den Chip. Ein zweites Signal, das für die Bindung an Holo-TC steht, weist man mittels Oberflächenplasmonresonanz nach. Dieser Unterschied zwischen dem ersten und dem zweiten SPR verwendet man dann, um die TCII-Sättigung auszurechnen. Indem man SPR verwendet, kann man beliebige als „markiert" oder „Reporter-markiert" bezeichnete, spezifische Bindungspartner anhand von Masse ohne irgendeine zusätzliche oder aktive Markierung nachweisen. In diesem Fall stellt einfach die Masse des spezifischen Bindungspartners oder Liganden die „Markierung" dar.

Die auf das Substrat aufgetragene Probe ist vorzugsweise eine Körperflüssigkeit oder eine von Gewebe abstammende Flüssigkeit, vorzugsweise eine zellfreie Flüssigkeit, insbesondere Plasma oder Serum, eines Säugers, vor allem eines Menschen.

Einem weiteren Aspekt zufolge betrifft die Erfindung ein Testkit, umfassend:

ein poröses Substrat, auf dem ein TC-immobilisierender Ligand immobilisiert ist;

einen ersten und einen zweiten Reporter-markierten Bindungspartner für Transcobalamin, wobei der erste Bindungspartner sowohl an Holo- als auch Apo-Transcobalamin zu binden vermag oder ein spezifischer Bindungspartner für Apo-Transcobalamin ist und der zweite Bindungspartner ein spezifischer Bindungspartner für Holo-Transcobalamin ist;

gegebenenfalls ein Waschagens;

gegebenenfalls ein Substrat für eine enzymatische Reporter-Markierung;

gegebenenfalls wenigstens einen Apo- und Holo-TC in einem bekannten Verhältnis enthaltenden Eichstandard; und

gegebenenfalls einen Detektor, der Signale von den Reporter-Markierungen nachzuweisen vermag.

Bei einem alternativen Format kann man die Transcobalaminsättigung bestimmen, indem man zwei Liganden an unterschiedliche Abschnitte des Substrats bindet, wobei ein erster Ligand Holo-TC immobilisiert und ein zweiter Ligand Apo-TC (oder Apo- und Holo-TC) immobilisiert, und man das Substrat mit der TC enthaltenden Probe und einem Reporter-markierten SBP für TC in Kontakt bringt. In dieser Form, die einen weiteren Aspekt der Erfindung bildet, liest man die Signale aus den verschiedenen Abschnitten des Substrats ab, und das Signalverhältnis Sa/(Sa + Sb) oder Sa/Sb (worin Sa das Signal für den Holo-TC-Ligandenabschnitt und Sb das Signal für den Apo-TC- oder Holo- und Apo-TC-Ligandenabschnitt ist) ist ein Hinweis auf den TC-Sättigungsspiegel. Die „Abschnitte" des Substrats können diesem oder weiteren Aspekten der Erfindung zufolge beispielsweise verschiedene Flächen auf der Oberfläche einer Membran, verschiedene Membranoberflächen auf einem Dipstick, verschiedene Membranen in einem Gehäuse, oder verschiedene Sets voneinander trennbarer Kügelchen (wobei z. B. ein Set magnetisierbar ist, das andere aber nicht) sein.

Bei diesem Format beinhaltet das erfindungsgemäße Testverfahren typischerweise, dass man

  • (i) eine Transcobalamin enthaltende Flüssigkeitsprobe mit einem porösen Substrat, auf dem ein erster und ein zweiter Transcobalamin immobilisierender Ligand in verschiedenen Abschnitten des Substrats immobilisiert ist, in Kontakt bringt, wobei der erste Ligand an Holo-Transcobalamin spezifisch zu binden vermag und der zweite Ligand Apo- oder Apo- und Holo-Transcobalamin zu immobilisieren vermag;
  • (ii) vor, während oder nach Schritt (i) Transcobalamin der Probe mit einem Reporter-markierten Bindungspartner für Transcobalamin in Kontakt bringt; und
  • (iii) Signale von den Reporter-Markierungen des in verschiedenen Abschnitten auf dem Substrat immobilisierten Bindungspartners nachweist und daraus einen Hinweis auf die Transcobalaminsättigung in der Probe entnimmt.

Einem weiteren Aspekt zufolge betrifft die Erfindung ein Testkit, umfassend:

ein poröses Substrat, auf dem ein erster und ein zweiter Transcobalamin immobilisierender Ligand in verschiedenen Abschnitten des Substrats immobilisiert ist, wobei der erste Ligand an Holo-Transcobalamin spezifisch zu binden vermag und der zweite Ligand Apo- oder Apo- und Holo-Transcobalamin zu immobilisieren vermag; und

einen Reporter-markierten Bindungspartner für Transcobalamin;

gegebenenfalls ein Waschagens;

gegebenenfalls ein Substrat für eine enzymatische Reporter-Markierung;

gegebenenfalls wenigstens einen Apo- und Holo-TC in bekannten Verhältnissen enthaltenden Eichstandard; und

gegebenenfalls einen Detektor, der Signale von den Reporter-Markierungen nachzuweisen vermag.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden, nicht beschränkenden Beispiele und Zeichnungen genauer beschrieben, worin:

1 ein Substrat darstellt, auf dem TC-Liganden immobilisiert sind;

2 ein Substrat mit zwei Abschnitten darstellt, wobei einer immobilisierte Liganden mit Spezifität für Holo-TCII enthält und ein zweiter immobisierte Liganden mit Spezifität für Apo-TCII aufweist; und

3 einen Chip in einem Oberflächenplasmonresonanz-Detektor mit auf der Oberfläche immobilisierten Antikörpern für TC darstellt.

In 1 steht „Markierung-spb1" für einen ersten spezifischen Bindungspartner mit einer ersten angehängten Markierung und steht „SBP-Markierung2" für einen zweiten spezifischen Bindungspartner mit einer zweiten angehängten Markierung. Es ist ersichtlich, dass das Signal von Markierung1 dem Holo-TC-Spiegel und das Signal von Markierung2 den gesamten Apo- und Holo-TC-Spiegeln entspricht.

In 2 ist ersichtlich, dass Holo-TCII an den ersten (links gelegenen) Abschnitt und Apo-TCII an den zweiten (rechts gelegenen) Abschnitt gebunden ist. „SBP-Markierung" steht für einen spezifischen Bindungspartner für TC mit einer angehängten Markierung. Auf diese Weise stehen die Signale aus den beiden Abschnitten für den Holo-TC- bzw. Apo-TC-Gehalt.

In 3 ist eine Chipoberfläche dadurch modifiziert, dass ein erster monoklonaler Antikörper (mAb1) angehängt ist. Dieser bindet an Apo-TC und an Holo-TC aus der Probe. Der zweite Antikörper (mAb2) bindet ebenfalls entweder an Holo-TC oder Apo-TC, womit sich ein SPR-Signal für den TC-Gesamtgehalt ergibt, wenn dies zugegeben wird. Der dritte Antikörper (mAb3) bindet lediglich an Holo-TC und ergibt somit ein SPR-Signal, das für den Holo-TC-Gehalt steht.

BEISPIEL 1 – Erzeugung eines Holo-TC-SBP A) Immobilisierung von Holo-TC auf Kügelchen

Man vermischt 1 ml von 0,2 M 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDAC) in 0,1 M 2-(N-Morpholin)-ethansulfonsäure (MES), pH 5,0, mit 1,0 ml 2% (G/V) Carboxylat-modifizierten Kügelchen (1 &mgr;m Durchmesser; Merck-Estapor) in 0,1 M MES, pH 5,0. Man behandelt das Gemisch in einem Bad mit Schall, um die Reagenzien zu dispergieren und rotiert es dann 1 Stunde bei Raumtemperatur kopfüber. Man zentrifugiert das Gemisch bei 300 g und wäscht das Pellet mit 0,1 M MES, pH 7,0, zentrifugiert und suspendiert erneut in 1,0 ml entionisiertem Wasser. Die EDAC-aktivierten Kügelchen vermischt man in kleinen Plastikvials mit demselben Volumen von 1 mg/ml Holo-TC in 0,1 M 3-[N-Morpholino]-propansulfonsäure (MOPS), pH 7,5, und rotiert über Nacht bei Raumtemperatur. Danach wäscht man das Gemisch zweimal mit 0,05% Tween 20 (aq) und zweimal mit 50 mM Tris-Puffer, pH 7,4, der 5 mg/ml BSA enthält. Die beschichteten Kügelchen mit einer Holo-TC-Schicht (Mono) von etwa 10 &mgr;g/mg werden bei 0,1% in 50 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl und 1 mg/ml BSA aufbewahrt.

B) (i) Biopanning von Aptamer-Banken mit Holo-TC als Zielmolekül

Man stellt eine Bank doppelsträngiger DNA-Sequenzen mit teils chemischen, teils enzymatischen Verfahrensschritten her. Typischerweise stellt man 1014–1015 einzelsträngige DNA (ssDNA)-Sequenzen mit einer Länge von 40 Nukleotiden synthetisch her und überführt diese dann mit enzymatischen Mitteln in die doppelsträngige Form, bevor man mittels PCR amplifiziert. Zweitens transkribiert man die doppelsträngige DNA, was eine Bank einzelsträngiger RNA oder modifizierter RNA ergibt. Drittens lässt man das beabsichtige Zielmolekül auf die RNA-Bank einwirken. Man transkribiert die ausgewählten Moleküle zurück und amplifiziert dann mittels PCR (für DNA-Banken reicht die PCR aus). Die Untergruppe von Sequenzen, die an das Ziel binden, stellen den Pool für die zweite Runde des Biopanning dar. Gewöhnlicherweise benötigt der Auswahlvorgang 7 bis 15 Runden.

Man amplifiziert 5 nmol einer gelgereinigten, synthetischen Templat-DNA, die eine durch definierte Primeranlagerungssequenzen [5'-GGGAGGACGATGCGG-(N)40-CAGACGACTCGCCCGA-3'] flankierte fortlaufende Sequenz von 40 Nukleotiden enthält, mit Hilfe von 4 PCR-Zyklen mit den Primern 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3' und 5'-TCGGGCGAGTCGTCTG-3'. Man transkribiert etwa 800 pmol der mittels PCR erhaltenen Templat-DNA (etwa 5 × 1014 Moleküle) in vitro mittels T7-RNA-Polymerase (1000 U) in einem 3 ml-Transkriptionsreaktionsmedium, das aus 40 mM TrisHCl (pH 8,0), 12 mM MgCl2, 1 mM Spermidin, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 0,002% Triton X-100 (V/V), 4% Polyethylenglycol (G/V) und jeweils 2 mM ATP, Guanidin-5'-triphosphat (GTP), 2'-NH2CTP und 2'-NH2UTP (CTP = Cytidin-5'-Triphosphat und UTP = Uridin-5'-triphosphat) besteht. Man reinigt Transkriptionsprodukte von vollständiger Länge auf 8% Polyacrylamidgelen unter denaturierenden Bedingungen, suspendiert in Bindungspuffer (10 mM TrisHCl, 0,1 mM EDTA, 2,5 mM MgCl2, pH 6,8), erwärmt auf 70°C und kühlt auf Eis ab.

Man inkubiert den RNA-Pool 15 Minuten bei 37 °C mit etwa 10 &mgr;g von dem auf Kügelchen immobilisierten Holo-TC und 100 &mgr;g von frei in der Lösung vorliegendem Apo-TC als Kompetitor. Man trennt die Kügelchen mittels Zentrifugation ab und wäscht sie mit 5 ml Bindungspuffer. Man eluiert gebundene RNA-Moleküle von den Kügelchen, indem man den pH-Wert senkt, gewinnt sie mittels Ethanolfällung und transkribiert sie mit Hilfe der Transkriptase des Vogel-Myoleblastosis-Virus (Life Sciences) 45 Minuten bei 48°C mit der DNA-Sequenz 5'-TCGGGCGAGTCGTCTG-3' als Primer zurück. Im Anschluss an die PCR-Amplifikation der cDNA transkribiert man das resultierende Duplex-DNA-Templat in vitro, um RNA für die nächste Auswahlrunde zu erhalten. Man verringert sukzessive die Menge an Holo-TC-beschichteten Kügelchen in der Bindungsreaktion, um den Selektionsdruck zunehmend zu erhöhen. Man wiederholt den Selektionsvorgang, bis die Affinität des angereicherten RNA-Pools für Holo-TC wesentlich erhöht ist. An dieser Stelle amplifiziert man die c-DNA mittels PCR mit den Primern 5'-CCGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGAGGACGATGCGG-3' und 5'-GCCGGATCCTCGGGCGAGTCGTCTG-3', die BamHI- und HindIII-Restriktionsschnittstellen (unterstrichen) an den 5'- bzw. 3'-Enden der PCR-Produkte einführen. Man verdaut die PCR-Produkte mit BamHI und HindIII und kloniert sie in pUC18, das man mit denselben Enzymen verdaut hat, und führt sie mittels Elektroporation in Escherichia coli SURE (Stratagene) ein. Man isoliert Plasmide von einzelnen Bakterienklonen und screent und sequenziert diese, wobei man Standardtechniken verwendet, wie beispielsweise in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, S. C1 beschrieben.

Um für eine Resistenz gegen RNA-Nukleasen zu sorgen, kann man die RNA-Moleküle an der 2'-Position des Zuckers modifizieren, beispielsweise Aminosubstituieren.

Das Biopanning-Protokoll bleibt im Wesentlichen gleich, ob die Bank auf RNA-Aptameren oder ssDNA-Aptameren basiert, oder ob die Bank unvorbereitet oder vorbereitet ist. Der Unterschied liegt hauptsächlich darin, dass ssDNA-Banken keine Transkription benötigen.

(ii) Biopanning von Phagen-Display-Peptiden oder Antikörperbanken mit Holo-TC

Man vermischt 1 pmol einer Phagen-Display-Bank mit 10 &mgr;g auf Kügelchen immobilisiertem Holo-TC und 100 &mgr;g Apo-TC in 100 &mgr;l PBS-Tween mit 1 mg/ml BSA oder 3% BLOTTO. (BLOTTO steht für 5% G/V Magermilchpulver in 100 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7, 4, 0,01% Antifoam A, 0,01% Thimerosal). Man inkubiert das Gemisch über Nacht bei 5°C und trennt die Kügelchen mittels Zentrifugation ab, wäscht sie neunmal mit 1 ml PBS-Tween und einmal mit normaler Kochsalzlösung, um jegliche Pufferkapazität zu entfernen. Man suspendiert die Kügelchen erneut in 600 &mgr;l 0,1 M Glycin-HCl-Puffer, pH 2,2, und trennt nach 15 Minuten die Kügelchen wieder mittels 3-minütiger Zentrifugation bei 3000 g ab. Man entfernt den Überstand und neutralisiert mit 36 &mgr;l 2 M Tris, pH 9,0, und vermischt mit 400 &mgr;l Escherichia coli (z. B. K91-Kan). Man isoliert Plasmide aus einzelnen Bakterienklonen und screent und sequenziert sie, wobei man Standardtechniken verwendet, beispielsweise wie in Sambrook J. et al., supra beschrieben. Die Bindungs- und Elutionsreaktionen werden wenigstens dreimal durchgeführt. In den Bindungsreaktionen verwendet man abwechselnd BSA und BLOTTO, um eine Anreicherung von Phagen, die an diese Proteine binden, zu vermeiden.

BEISPIEL 2 Immobilisierung von TC-spezifischen Bindern auf Cellulosepapier

Man aktiviert Cellulosepapier (z. B. Whatman Nr. 52), indem man es zunächst in deionisiertem Wasser 3 Minuten quellen lässt und dann mit 3% CNBr (aq) behandelt. Man erhöht den pH-Wert durch Zugabe von 1 mM NaOH auf 10,5. Nach 30 Minuten wäscht man das Papier mit 12 × 500 ml 5 &mgr;M NaHCO3, 2 × 500 ml deionisiertem Wasser und jeweils 2 × 500 ml von 25%, 50% und 75% Aceton. Schließlich wäscht man es mit 4 × 500 ml Aceton und trocknet an der Luft bei Raumtemperatur.

Man koppelt anti-TC-Antikörper kovalent an, indem man den Antikörper auf 10 &mgr;g/ml in 100 ml 0,1 M NaHCO3 verdünnt und 20 g geschnittenes Papier dazugibt. Man rührt das Gemisch vorsichtig bei 4°C 3 Stunden, wäscht es dann bei Raumtemperatur 10 Minuten mit 2 × 100 ml 0,5 mM NaHCO3, drei Stunden mit 100 ml 50 mM Ethanolamin in 0,1 M MaHCO3, 10 Minuten mit 2 × 100 ml 0,5 mM NaHCO3, 30 Minuten mit 100 ml 0,1 M Natriumacetat, pH 4,0, und zweimal mit 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, der 0,15 M NaCl, 0,1% Tween 20 und 0,1% Gelatine enthält. Man bewahrt das mit Antikörpern beladene Papier in einem kleinen Volumen dieses Puffers auf.

Dann fügt man Ausschnitte des mit Antikörper beladenen Papiers an einen flexiblen Plastikdipstick an.

BEISPIEL 3 – Test

Man trägt 50 ml Humanserum auf das Membrankissen eines gemäß Beispiel 2 hergestellten Dipsticks auf. Nach 5 Minuten wäscht man den Dipstick mit 100 &mgr;l Trisgepufferter Kochsalzlösung (TBS – 100 mM Tris, pH 7,2, 150 mM Natriumchlorid) und man gibt 50 &mgr;l einer Nachweislösung dazu und inkubiert 5 Minuten. Die Nachweislösung enthält einen an &bgr;-Galactosidase konjugierten, nicht überlappenden, spezifisch gegen humanes TC gerichteten monoklonalen Antikörper und einen Holo-TC-SBP aus Beispiel 1 (oder einen nicht überlappenden, gegen humanes Holo-TC gerichteten monoklonalen Antikpörper), an Alkalische Phosphatase aus Huhn konjugiert. Man wäscht den Dipstick dann mit 100 &mgr;l TBS. Man gibt 50 &mgr;l eines lumineszierenden Substrats für die Alkalische Phosphatase in TBS dazu (z. B. 0,25 mM CPD-Star von Tropix). Man vermisst den Dipstick in einem Luminometer für eine Dauer von 1 Sekunde bis 15 Minuten. Man spült den Dipstick dann mit 100 &mgr;l PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) und man gibt 50 &mgr;l eines lumineszierenden Substrats für &bgr;-Galactosidase in PBS (z. B. 0,1 mM Galacton-Star von Tropix) und einen Inhibitor der Alkalischen Phosphatase (z. B. 40 &mgr;M Cyclohexantrismethylensulfonat) dazu. Man liest den Dipstick dann ein weiteres Mal in einem Luminometer ab. Während das erste Ablesen den Holo-TC-Gehalt auf dem Dipstick ergibt, ergibt das zweite Ablesen den TC-Gesamtgehalt. Das Verhältnis dieser beiden Werte ergibt den nicht vom Volumen abhängenden Wert für die Cobalamin-Sättigung von TC in der Probe.

BEISPIEL 4 Entwicklung eines monoklonalen Mausantikörpers mit Spezifität für humanes Transcobalamin und humanes Holo-Transcobalamin i) Immunisierung

Man immunisierte weibliche BALB/c-Mäuse i. p. mit 20 &mgr;g rekombinantem humanen Holo-Transcobalamin im Gemisch mit AdjuPrime Immunmodulator (Pierce, IL, USA), gefolgt von zwei Booster-Injektionen von 20 &mgr;g in vierwöchigem Abstand.

ii) Fusion

Vier Tage nach dem letzten Boost entnahm man die Milzen und fusionierte die Milzzellen mit HAT (Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin; Sigma)-sensitiven Plasmazytomen OUR1 (einem Unterklon von X63-Ag8.653), wobei man dazu PEG (Boehringer Mannheim, Deutschland) verwendete. Man verteilte die Fusionsprodukte auf 5 × 96 F-Platten (Nunc) in Gegenwart von HAT in Kulturmedium (DMEM/Ham's F12 (Invitrogen) plus 10% CPSR3 (Sigma)). Nach einer Woche fütterte man die Fusionen mit HT-haltigem Kulturmedium (Sigma).

iii) Primäres Screening

Nach zwei Wochen screente man das Medium von den Hybridomen, wobei man einen Festphasen-Einfangtest verwendet. Man vermischte die Zellmedien mit 10 &mgr;l einer 1% (G/V) Suspension von 1 &mgr;m magnetisierbaren Kügelchen, die mit einem gegen Maus-IgG gerichteten Schaf-Antikörper (Merck-Estapor, Frankreich) beschichtet waren und hielt die Zellmedien 1 Stunde bei Raumtemperatur. Man isolierte die magnetisierbaren Kügelchen mit gebundenem monoklonalen Maus-Antikörpern, indem man einen Magneten verwendete, und man wusch sie viermal mit 1 ml Phosphatpuffer, pH 7,2, 0,15 M NaCl und 1 mg/ml Rinderserumalbumin. Man suspendierte gewaschene Kügelchen erneut in 100 &mgr;l gepooltem Humanserum (Scantibodies, USA), das man zuvor mit 57Co-markiertem Cobalamin (ICN, USA) behandelt hatte, um Apo-Transcobalamin im Serum in 57Co-markiertes Holo-TC zu überführen. Man hielt die Gemische 30 Minuten bei Raumtemperatur und isolierte die Kügelchen, indem man einen Magneten verwendete. Die mit den Kügelchen verbundene Radioaktivität zählte man in einem Gammazähler.

iv) Klonierung

Vertiefungen, die hinsichtlich Anti-Transcobalamin-Antikörper-positiv waren, klonierte man durch limitierende Verdünnung auf Platten mit 96 Vertiefungen F(Nunc), die zuvor mit peritonealen Fütter-Balb/c-Zellen (10.000 pro Vertiefung) beimpft worden waren. Man wählte positive Klone aus und klonierte erneut, bis 100% der Unterklone spezifische Antikörper produzierten. Man fror die Zellbestände, in 10% DMSO (Sigma) enthaltendem CPSR3 (Sigma) in flüssigem Stickstoff ein.

Sekundärscreening. Man isolierte die Antikörper aus den Zellmedien auf magnetisierbaren Kügelchen, wie zuvor beschrieben. Man vermischte 10 &mgr;l antikörperbeschichtete Kügelchen mit Serum, das zuvor mit 57Co, wie oben beschrieben, im Beisein zunehmender Konzentrationen von rekombinantem humanen Apo-Transcobalamin oder rekombinantem humanen Holo-Transcobalamin.

Man selektierte zwei Anti-Transcobalamin-Antikörper (mAb1 und mAb2) anhand ihrer Affinität für sowohl Apo- als auch Holo-Transcobalamin, und man selektierte einen monoklonalen Antikörper (mAb3) anhand der Spezifität für Holo-Transcobalamin. Die jeweiligen Klone expandierte man in vitro in Tecnomouse, CL1000. Man reinigte die Antikörper aus dem Zellmedium mittels Protein A-Affinitätschromatographie. Kurzum, man verdünnte den Antikörper-haltigen Kulturüberstand 1 : 1 in 0,1 M Tris, pH 8,0, das 1 M NaCl (Bindungspuffer) enthielt, und gab ihn auf eine Protein-A-Säule, die zuvor mit Bindungspuffer äquilibriert worden war. Dann wusch man die Protein-A-Säule ausgiebig mit 15 Säulenvolumina Bindungspuffer. Man eluierte den Antikörper mit 0,1 M Citratpuffer, pH 4,0, den man mit 1 M Tris-Puffer pH 8, auf pH 7,0 neutralisierte und auf einer Sephadex G-25-Säule (Pharmacia) auf 0,1 M Phosphat, pH 7,2, enthaltend 0,15 M NaCl, umpufferte.

BEISPIEL 5 Immobilisierung des TC-spezifischen monoklonalen Antikörpers mAb1 auf Dextran-beschichteter Oberfläche

Man aktivierte die carboxylierte Oberfläche des Dextran-beschichteten Chips (Pharmacia, Schweden) mit 0,05 M N-Hydroxysuccinimid (NHS)/0,2 M N-ethyl-N'-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimidhydrochlorid (EDC), spülte mit deionisiertem Wasser und beschichtete kovalent mit mAb1 (aus Beispiel 4) bei 50 &mgr;g/ml in 0,01 HEPES-Puffer, pH 7,4, der 0,15 M NaCl, 0,003 M EDTA und 0,005% Polysorbat (HBS) enthielt. Nicht umgesetztes NHS blockierte man mit 1 M Ethanolamin, und man wusch den Chip ausgiebig mit HBS.

BEISPIEL 6 Bindung von Holo-Transcobalamin, mAb2 und mAb3 an immobilisiertem mAb1

Man beobachtete die Bindungsereignisse in Realzeit, wobei man Oberflächenplasmonresonanz verwendete und auf einem Biocore-Instrument (Biacore, Schweden) arbeitete. Man maß die Menge an freiem Liganden, der an den Chip band, als Antworteinheiten (RU für „response units"), was sowohl die Masse des bindenden Liganden als auch seine Affinität für das immobilisierte Ziel wiedergibt. Man führte den Chip mit immobilisiertem mAb1 (Beispiel 5) in das Instrument ein, wonach man 5 &mgr;l 100 nM Holo-Transcobalamin, 5 &mgr;l 50 &mgr;g/ml mAb2 und 5 &mgr;l 50 &mgr;g/ml mAb3 sukzessive injizierte, wobei man zwischen jedem Schritt wusch. Nach dem Durchfluss von Holo-Transcobalamin durch das Instrument banden 565 RU mAb3 an den immobilisierten mAb1. In Abwesenheit von Holo-Transcobalamin, banden weder mAb2 noch mAb3 an den Chip mit dem immobilisierten mAb1.


Anspruch[de]
  1. Testverfahren zur Bestimmung der Transcobalaminsättigung, wobei man eine Transcobalamin enthaltende Flüssigkeitsprobe mit einem porösen Substrat, auf dem ein Transcobalamin immobilisierender Ligand immobilisiert ist, und mit einem Reporter-markierten Transcobalamin-Bindungspartner in Kontakt bringt und Signale von Reporter-Markierungen, die auf dem Substrat immobilisiert werden, nachweist, dadurch gekennzeichnet, dass entweder der Ligand oder der Bindungspartner einen ersten Liganden oder Bindungspartner, der an Holo-Transcobalamin spezifisch zu binden vermag, und einen zweiten Liganden oder Bindungspartner, der an Apo-Transcobalamin oder an Holo- und Apo-Transcobalamin zu binden vermag, umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Bestimmung der Transcobalaminsättigung in einer Transcobalamin enthaltenden Flüssigkeitsprobe, wobei man:

    (i) die Probe mit einem porösen Substrat, auf der ein Transcobalamin immobilisierender Ligand immobilisiert ist, in Kontakt bringt;

    (ii) vor, während oder nach obigem Schritt (i) Transcobalamin der Probe mit einem ersten und einem zweiten Reporter-markierten Bindungspartner für Transcobalamin in Kontakt bringt, wobei der erste Bindungspartner sowohl an Holo- als auch Apo-Transcobalamin zu binden vermag oder ein für Apo-Transcobalamin spezifischer Bindungspartner ist und der zweite Bindungspartner ein für Holo-Transcobalamin spezifischer Bindungspartner ist; und

    (iii) Signale von den Reporter-Markierungen der auf dem Substrat immobilisierten Bindungspartner nachweist und daraus einen Hinweis auf die Transcobalaminsättigung in der Probe entnimmt.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei auf dem Substrat ein Ligand immobilisiert ist, der sowohl Holo- als auch Apo-Transcobalamin zu immobilisieren vermag und die Signale von den ersten und zweiten Reporter-Markierungen voneinander unterscheidbar sind.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei man:

    (i) eine Transcobalamin enthaltende Flüssigkeitsprobe mit einem porösen Substrat, auf dem ein erster und ein zweiter Transcobalamin immobilisierender Ligand in verschiedenen Abschnitten des Substrats immobilisiert ist, in Kontakt bringt, wobei der erste Ligand an Holo-Transcobalamin spezifisch zu binden vermag und der zweite Ligand Apo- oder Apo- und Holo-Transcobalamin zu immobilisieren vermag;

    (ii) vor, während oder nach Schritt (i) Transcobalamin der Probe mit einem Reporter-markierten Bindungspartner für Transcobalamin in Kontakt bringt; und

    (iii) Signale von den Reporter-Markierungen des in verschiedenen Abschnitten auf dem Substrat immobilisierten Bindungspartners nachweist und daraus einen Hinweis auf die Transcobalaminsättigung in der Probe entnimmt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der spezifische Bindungspartner für Holo-Transcobalamin oder der Ligand, der an Holo-Transcobalamin spezifisch zu binden vermag, eine an Holo-Transcobalamin bindende Nicht-Peptid-Einheit umfasst.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei der spezifische Bindungspartner für Holo-Transcobalamin oder der Ligand, der an Holo-Transcobalamin spezifisch zu binden vermag, einen monoklonalen Antikörper umfasst.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei der spezifische Bindungspartner für Holo-Transcobalamin oder der Ligand, der an Holo-Transcobalamin spezifisch zu binden vermag, eine mindestens 10-fache Spezifität für Holo-Transcobalamin versus Apo-Transcobalamin besitzt.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei die Signale elektromagnetische Strahlung sind.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Signale von einer Digitalkamera nachgewiesen werden.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei die Probe Blut oder eine von Blut abstammende Flüssigkeit ist.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei das Substrat ein Blatt Cellulose ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, wobei das Substrat auf einem Dipstick angeordnet ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, wobei man in Schritt (i) die Probe auf eine Fläche des porösen Substrats appliziert und die Probe durch einen Kapillarfluss, der von einem an die gegenüberliegende Fläche des porösen Substrats angrenzenden wasserabsorbierenden Material unterstützt wird, in das poröse Substrat hineingesaugt wird.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei der Reporter-markierte spezifische Bindungspartner lediglich durch seine eigene Masse markiert ist und mittels Oberflächenplasmonresonanz nachgewiesen wird.
  15. Testkit, umfassend:

    ein poröses Substrat, auf dem ein TC immobilisierender Ligand immobilisiert ist; und

    einen ersten und einen zweiten Reporter-markierten Bindungspartner für Transcobalamin, wobei der erste Bindungspartner sowohl an Holo- als auch Apo-Transcobalamin zu binden vermag oder ein spezifischer Bindungspartner für Apo-Transcobalamin ist und der zweite Bindungspartner ein spezifischer Bindungspartner für Holo-Transcobalamin ist.
  16. Testkit, umfassend:

    ein poröses Substrat, auf dem ein erster und ein zweiter Transcobalamin immobilisierender Ligand in verschiedenen Abschnitten des Substrats immobilisiert ist, wobei der erste Ligand an Holo-Transcobalamin spezifisch zu binden vermag und der zweite Ligand Apo- oder Apo- und Holo-Transcobalamin zu immobilisieren vermag; und

    einen Reporter-markierten Bindungspartner für Transcobalamin.
  17. Kit nach einem der Ansprüche 15 oder 16, der des Weiteren ein Waschagens umfasst.
  18. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 17, der des Weiteren wenigstens ein Substrat für eine enzymatische Reporter-Markierung aufweist.
  19. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 18, der des Weiteren wenigstens einen Apo- und Holo-TC in einem bekannten Verhältnis enthaltenden Eichstandard umfasst.
  20. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 19, der des Weiteren einen Detektor umfasst, der Signale von den Reporter-Markierungen nachzuweisen vermag.
Es folgt ein Blatt Zeichnungen






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