Warning: fopen(111data/log202004060544.log): failed to open stream: No space left on device in /home/pde321/public_html/header.php on line 107

Warning: flock() expects parameter 1 to be resource, boolean given in /home/pde321/public_html/header.php on line 108

Warning: fclose() expects parameter 1 to be resource, boolean given in /home/pde321/public_html/header.php on line 113
VIRALE CHIMÄREN AUS CAEV UND HIV-1 GENETISCHEN ELEMENTEN - Dokument DE69922642T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69922642T2 22.12.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0001073461
Titel VIRALE CHIMÄREN AUS CAEV UND HIV-1 GENETISCHEN ELEMENTEN
Anmelder University of Southern California, Los Angeles, Calif., US
Erfinder DOUVAS, Angeline, Pasadena, US;
PARR, B., Tyler, Chula Vista, US
Vertreter LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69922642
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 30.04.1999
EP-Aktenzeichen 999197569
WO-Anmeldetag 30.04.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/06556
WO-Veröffentlichungsnummer 0099056774
WO-Veröffentlichungsdatum 11.11.1999
EP-Offenlegungsdatum 07.02.2001
EP date of grant 15.12.2004
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.12.2005
IPC-Hauptklasse A61K 39/21
IPC-Nebenklasse C07H 21/00   C07H 21/04   C07K 14/15   C07K 16/10   C12N 7/01   C07K 14/16   C07K 7/00   C12N 7/00   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen die wissenschaftlichen Bereiche Immunologie und Medizin und spezifischer Verfahren zur Herstellung einer Immunantwort gegen HIV-1.

HINTERGRUNDINFORMATION

Die Inzidenz von erworbenem Immunschwächesyndrom (Aids) hat bereits ein epidemisches Ausmaß angenommen, insbesondere in Dritte-Welt-Ländern in Afrika, Asien und der Karibik. Der Auslöser für Aids ist das menschliche Immunschwächevirus (HIV-1). HIV-1 ist ein Primaten-Lentivirus, von dem angenommen wird, dass es in den 1950ern von einer Spezies zur anderen übergangen ist, also von einer Affenpopulation in Afrika auf die Menschen.

Bei Menschen infiziert HIV-1 zwei Primärzelltypen: Makrophagen und T-Lymphozyten. In einem typischen Übertragungsereignis geht ein tropischer Makrophagen-Stamm von einer Körperflüssigkeit einer Person auf Makrophagen in der Haut oder der Schleimhaut einer anderen Person über. Anfänglich kann sich das Virus in Makrophagen replizieren, ohne klinische Erkrankungen hervorzurufen. Schreitet die Infektion jedoch voran, so werden als Resultat der schnellen Mutationsgeschwindigkeit des Virus, die zumindest teilweise auf eine reverse Transkriptase mit geringer Präzision zurückzuführen ist, divergente Stämme gebildet. Schließlich entstehen tropische T-Zell-Stämme, die zur Verarmung des Immunsystems und zu jenen klinischen Symptomen führen, die unter dem Namen Aids bekannt sind.

Diese Entwicklung dauert typischerweise sechs bis zehn Jahre oder länger, was teilweise von den Immunsystemfaktoren des Wirts abhängt. Ein T-Zell-tropischer HIV-1-Stamm kann jedoch auch direkt übertragen werden, was zu einem sehr viel schnelleren Verlauf der Infektion führt. Im Verlauf der Krankheit ist das Wirtsimmunsystem nicht in der Lage, die T-Zellen-Population so rasch zu ersetzen, wie sie durch die Virusinfektion erschöpft wird, was zu einer katastrophalen Reduktion der T-Zell-Konzentrationen führt. Als Konsequenz sterben Aids-Patienten typischerweise an Infektionen, die bei gesunden Menschen normalerweise, im schlimmsten Fall, eine harmlose Krankheit verursachen würden.

Trotz finanzieller Aufwände für Forschungsarbeiten in Milliarden-Dollar-Höhe konnten nur bescheidene Fortschritte in der Behandlung dieser Krankheit erreicht werden. Anfänglich war die Therapie auf Verfahren zur Behandlung der opportunistischen Infektionen beschränkt, die bei immungeschwächten Patienten auftraten. Später wurden Nucleosid-Analoga wie AZT, ddC und ddI identifiziert, die HIV-1-Replikation hemmen konnten. Diese Wirkstoffe, insbesondere in Kombination, verlängerten das Leben einiger Aids-Patienten. Erst in jüngeren Jahren erwies sich eine Gruppe an Wirkstoffen, die als Protease-Inhibitoren bezeichnet wurden, als noch wirksamer zur Hemmung von HIV-1-Replikation. Wurden sie in Kombination mit Nucleosid-Analoga verwendet, so reduzierten Protease-Inhibitoren bei einigen Patienten Virustiter auf ein nicht nachweisbares Niveau. In jüngster Vergangenheit war die Sterblichkeitsrate von Aids in den Vereinigten Staaten zum ersten Mal seit Beginn der Epidemie rückläufig. Es wird angenommen, dass dies ein Ergebnis solcher Behandlungsweisen ist, zumindest teilweise, neben Aufklärungsprogrammen, die von riskantem Verhalten abbringen sollen.

Hoffnungen für diese Behandlungsweisen wurden durch das darauf folgende Auftreten von Resistenz gegen Arzneimittelcocktails geschmälert. Ging auch das Niveau an zirkulierenden Viren bei manchen Patienten, die mit Kombinationen aus Protease-Inhibitoren und Nucleosidanaloga behandelt wurden, zurück, so resultierte eine solche Behandlung bei diesen Patienten dennoch nicht in der Eliminierung des Virus. Es wird angenommen, dass Virenspeicher sogar in Patienten erhalten bleiben, die kein nachweisbares zirkulierendes Virus aufweisen, beispielsweise im Lymphsystem und in Makrophagen. Weiters kann, wenn auch kein zirkulierendes Virus vorhanden ist, als Resultat der fusogenen Eigenschaften von Zellen, die bereits mit HIV-1 infiziert sind, die virale Weiterverbreitung dennoch auftreten. Schließlich führte der Arzneimittelcocktail nicht bei allen Patienten zu positiven Resultaten und schien daher nicht in der Lage zu sein, gegen alle Virusstämme wirksam zu sein.

Die mühsame Art der Dosierung, die bei Mehrfach-Arzneimitteltherapien erforderlich ist, stellt hinsichtlich der Einhaltung seitens der Patienten auch ein Problem dar. Überleben behandelte Patienten längere Zeit, so wird dieser Problempunkt der Einhaltung noch gravierender und führt zu der Möglichkeit, dass solche Patienten schließlich einen Nährboden für die Bildung und Weiterverbreitung von HIV-1-Stämmen bieten, die gegen Arzneimittelcocktails resistent sind.

Wenn sich auch in den USA manche Patienten solche teuren Kombinationstherapien leisten können, übersteigen die Kosten solcher Arzneimittel dennoch bei weitem das Jahreseinkommen zahlreicher Menschen, die in Entwicklungsländern leben. Dies ist aufgrund des raschen Anstiegs der HIV-1-Übertragung in Entwicklungsländern ein besonders beunruhigender Aspekt.

Ein bevorzugter Ansatz wäre natürlich die Prävention von HIV-1-Übertragung. Vakzinen sind eine logische Möglichkeit, um dies zu erreichen. Beispielsweise wurden Vakzinen verwendet, um verschiedene Viruskrankheiten zu vermeiden bzw. das Ausmaß zu mindern, beispielsweise in den Fällen von Poliomyelitis, Masern, Pocken und Influenza. Darüber hinaus kann eine Vakzine das Immunsystem von Personen stärken, die bereits mit einem Virus infiziert sind. Beispielsweise wird die Tollwutimpfung nur nach einem Übertragungsereignis wie einem Biss durch ein infiziertes Tier verabreicht.

Zahlreiche Versuche wurden unternommen, um eine Vakzine zu entwickeln, die die Resistenz einer Person gegen HIV-1-Infektion stärken würde, doch solche Ansätze leiden zur Zeit unter schwerwiegenden Einschränkungen. Beispielsweise wurden Vakzinen, die sich aus Teilen eines HIV-1-Proteins zusammensetzen oder ein getötetes HIV-1-Virus verwenden, bereits hergestellt. Doch HIV-1 mutiert rasch während viraler Replikation, wodurch es neue Varianten schneller produziert als das Immunsystem reagieren kann. Folglich ist eine Immunantwort, die gegen ein bestimmtes HIV-1-Protein oder einen bestimmten HIV-1-Stamm stimuliert wird, gegen Varianten, die während der Infektion auftreten, eventuell unwirksam. Weiters kann die Impfung mit Teilen von HIV-1-Oberflächenproteinen die Bildung von Antikörpern stimulieren, die HIV-1-Infektion eher erleichtern können, als dass sie sie unterbinden. Abgeschwächte Vakzinen, die aus Lebendviren bestehen, jedoch in Bezug auf Reproduktion Defekte aufweisen, wurden auch vorgeschlagen. Es gibt hier jedoch gerechtfertigte Bedenken, einem Menschen solch ein HIV-1-Virus zu injizieren, insbesondere sonst gesunden Menschen. Demnach besteht Bedarf an einer Vakzine, die eine Immunantwort gegen HIV-1 hervorruft, jedoch nicht die Risiken und Einschränkungen mit sich bringt, die mit der Verwendung von HIV-1 als Impfwirkstoff einhergehen.

Ein Ansatz zur Entwicklung eines Tiermodells zur Untersuchung von HIV-1-Infektion und möglichen Impfstrategien war die Herstellung eines rekombinanten Virus zwischen dem Affen-Immunschwächevirus (SIV) und HIV-1 oder SHIV, das niedrige Primaten infizieren kann. Das In-vivo-Verhalten des SHIV-Modells machte zahlreiche Aspekte der retroviralen Pathologie und der Wirtsreaktion einsichtig. Diese umfassen den Beweis, dass Wirtsbereich, zytopathogene Eigenschaft und die Spezifität neutralisierender Antikörper durch die Hüllsequenzen bestimmt werden (Luciw et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 7490-7494 (1995)). Für SHIV als abgeschwächte Lebendimpfstoffe wurde gezeigt, dass sie Makaken wirksam vor Ansteckung über die Schleimhaut mit SIV schützen (Baba et al., Science 267, 1820-1825 (1995); Quesada-Rolander et al., AIDS Res. Hum. Retro. 12, 993-999 (1996)).

In den Jahren 1985 und 1986 wurde die Beziehung zwischen dem Nucleotid und Aminosäuresequenzen von HIV-1 und Ziegen-Arthritis-Encephalitis-Virus ("Caprine Encephalitis Virus", CAEV) beschrieben. CAEV und HIV-1 sind phylogenetisch eng miteinander verwandt und teilen einen Grad an Homologie, umfassend beispielsweise zwischen ihren RNA-abhängigen DNA-Polymerasen (pol) und zwischen gp120/41 in HIV-1 und gp135/38 in CAEV (siehe beispielsweise Gonda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4007–4711 (1986); Gonda et al., Retroviridae 3, 83–109 (1994); Garry et al., Retroviridae 4: 491–603 (1995)).

CAEV infiziert Ziegen und verursacht bei manchen infizierten Tieren Anomalien im Immunsystem (siehe beispielsweise Banks et al., Arthrit. Rheum. 30, 1046–1053 (1987); Crawford et al., Science 207, 997–999 (1980)). CAEV ist bei Ziegen mit drei Krankheitssyndromen verbunden: Arthritis, die bei 20–30 % der infizierten Tiere auftritt; Leukoencephalitis, die bei jungen Tieren auftritt; und sporadische neurologische Erkrankungen, die bei erwachsenen Ziegen auftreten. Hierbei zeigen jedoch 60 der infizierten Tiere langfristig kein Fortschreiten der Krankheit und entwickeln keine klinisch sichtbaren Läsionen (Cheevers et al., Lab. Invest. 58, 510–517 (1988); Knowles et al., J. Virol. 64, 2396–2398 (1990); Perry et al., J. Infect. Dis. 171, 328–334 (1995)). CAEV-Infektion ist weltweit zu finden, wobei geschätzte 80 % der Ziegenherden an Infektionen unterschiedlicher Ausprägung leiden.

CAEV wird unter Ziegen über infizierte Milch, vor allem über Kolostrom, übertragen, und die Infektion breitet sich durch die Praxis des Sammelns von Kolostrum in der Landwirtschaft zum Füttern von Jungtieren aus. CAEV vervielfältigt sich in Zellen der Monozyten/Makrophagen-Linie und in Fibroblasten-Zelllinien, infiziert jedoch nicht T-Zellen. Makrophagen, die CAEV exprimieren, werden in der Gelenksschmiere, in der Lunge, im zentralen Nervensystem, in Lymphknoten, in der Milz, im Magen-Darm-Trakt und in den Brustdrüsen der infizierten Ziegen verbreitet.

Perales et al. beschreiben in J. Acquired Immune Deficiency Syndromes & Human Retroviruses 10, 27–35 (1995), die Expression des HIV-1-env-Gens aus Vakzinia und die Verwendung dieses Gens als eine Vakzine. Die Verwendung von CAEV als einen viralen Vektor wird von Mselli-Lakhal et al. in Arch. Virol. 8, 681-695 (1998), beschrieben.

Die WO 97/33615 beschreibt eine Vakzine, die ein CAEV-Immunogen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Es wird eine Immunantwort gegen HIV-1-Infektion bei Menschen bei Verabreichung eines CAEV-Immunogens beschrieben. CAEV wird zwar bei Ziegen als pathogen beschrieben, jedoch nicht bei Menschen.

Es gibt auf dem Gebiet der Erfindung Bedarf an einem nicht-pathogenen Lentivirus, der eine Immunantwort gegen HIV-1 bei Primaten, insbesondere bei Menschen, hervorrufen kann.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung wird diesem Bedarf gerecht und bringt noch zusätzliche Vorteile. In einer Ausführungsform wird ein Polynucleotid, umfassend ein chimäres retrovirales Genom, bereitgestellt, das Elemente von CAEV und HIV-1 umfasst. Dieses chimäre Retrovirus wird als CHIV bezeichnet. Das retrovirale Genom umfasst die Regulationssequenzen von CAEV zusammen mit anderen, CAEV-kodierenden Sequenzen, die erforderlich sind, um das CHIV nicht-pathogen zu machen, sowie ein HIV-1-env-Gen. Andere retrovirale Gene können entweder von CAEV oder von HIV-1 bereitgestellt werden. Das CHIV muss in der Lage sein, sich in zumindest einer Säugetier-Wirtszelle zu vermehren.

Die Erfindung stellt weiters ein CHIV-Immunogen bereit, das in der Lage ist, eine Immunantwort zu stimulieren. In einer Ausführungsform ist das CHIV-Immunogen ein Viruspartikel, das in der Lage ist, eine Wirtszelle zu infizieren. In einer anderen Ausführungsform ist das CHIV-Immunogen ein Polynucleotid-Expressionskonstrukt, das exprimiert werden kann, wenn es in einen Organismus eingeführt wird, um eine Immunantwort auf die Expressionsprodukte zu stimulieren.

Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Vakzine bereit, die ein CHIV-Immunogen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Eine Vakzine der Erfindung ist beispielsweise nützlich, um eine Immunantwort gegen das menschliche Immunschwächevirus (HIV-1) bei einem Menschen oder einem anderen Primaten zu stimulieren.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort in einer Person gegen HIV-1 durch Verabreichung eines CHIV-Immunogensan die Person bereit. Solch ein Verfahren ist nützlich, um beispielsweise die Resistenz gegen HIV-1-Infektion einer Person zu stärken, die zuvor HIV-1 nicht ausgesetzt war, oder um das Ausmaß einer Pathologie zu reduzieren, die durch HIV-1 bei einer HIV-1-infizierten Person verursacht wurde. Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Verfahren zur Stimulierung einer Immunantwort in vitro durch Kontaktieren eines Lymphozyten mit einem CHIV-Immunogen bereit.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 ist eine schematische Darstellung eines chimären CHIV-Virusgenoms, die die Segmente der zu verwendenden CAEV- und HIV-1-Virusgenome zeigt.

2A zeigt das verwendete Schema zur Herstellung von Segmenten des CAEV-Co-Virusgenoms zur Einbindung in das CHIV.

2B zeigt die Detektion durch RT-PCR von CAEV-Co-Sequenzen im Kulturüberstand von Zellen, die nach Einführung der ligierten und nicht-ligierten Segmente, die in 2A hergestellt wurden, CAEV-Co exprimieren.

3A zeigt eine detaillierte Strategie zur Herstellung von Segmenten der HIV-1-und CAEV-Genome zur Einbindung in ein CHIV.

3B zeigt eine detaillierte Strategie zur Einbindung der 3'-LTR-Region von CAEV-Co zusammen mit den in 3A gezeigten Segmenten, um ein komplettes CHIV-Viruskonstrukt zu bilden.

3C zeigt Details der Nucleotidsequenz der Verbindungen zwischen den CAEV-Co und HIV-1-Segmenten im CHIV, gezeigt in 3B, zusammen mit der Codierregion des trunkierten CAEV-tat-Proteins. Dargestellt sind die 5'-CAEV-Co/HIV-p162/3'-SX-Junction (Seq.-ID Nr. 1), die trunkierte CAEV-tat-Proteinsequenz (Seq.-ID Nr. 2) und die 3'-CAEV-Co/HIV-p162/3'-SX-Junction (Seq.-ID Nr. 3).

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das hierin dargestellte chimäre CAEV/HIV-1-Retrovirus ("CHIV") ist ein neuer Ansatz zur Entwicklung eines abgeschwächten Aids-Lebendimpfstoffs, der den Kern von CAEV und die Immunogenität von HIV-1 aufweist. Der Vorteil der Entwicklung eines CHIV ist, dass jede erwünschte HIV-1-env-Sequenz prinzipiell anstelle des CAEV-env-Gens gesetzt werden kann, um eine stärkere und spezifischere Immunantwort hervorzurufen.

Ein Vorgänger des CHIV existiert in rekombinanten Viruschimären von SIV und HIV-1 (SHIV). Die Verwendung von SHIV zeigte, dass Wirtsbereich, zytopathogene Eigenschaft und die Spezifität neutralisierender Antikörper durch die Hüllsequenzen bestimmt werden (Luciw et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 7490–7494 (1995)). Die Entwicklung des SHIV zeigte auch, dass Gene zwischen Lentiviren ausgetauscht werden können (Shibata et al., J. Virol. 65, 3514-3520 (1991)).

CHIV kann demähnlich verwendet werden, um Beziehungen zwischen HIV-1- und CAEV-Genen einsichtig zu machen, die Anwendung in der Entwicklung von Vakzinen finden. Verglichen mit HIV-1 weist CAEV ein einfacheres Genom auf, in dem manche entsprechenden Gene (z.B. tat ) für Replikation in vivo oder in vitro nicht notwendig sind (Harmache et al., J. Virol. 69, 5445-5454 (1995)). So kann das Ersetzen dieser Gene mit den entsprechenden HIV-1-Genen ein lebensfähiges chimäres Retrovirus schaffen, während die HIV-1-Antigenität des CHIV verstärkt und ausgeweitet wird.

Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Vakzine bereit, die ein CHIV-Immunogen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Wie hierin offenbart ruft die Impfung einer Person mit einem CHIV-Immunogen eine Immunantwort hervor. Impfung gegen HIV-1 unter Verwendung eines CHIV-Immunogens bringt bedeutende Vorteile für die Verwendung von beispielsweise einer getöteten oder abgeschwächten Form von HIV-1 oder einem HIV-1-Proteinantigen, da von CAEV nicht bekannt ist, ob es ein menschliches Pathogen ist.

Eine Vakzine der Erfindung kann einer Person verabreicht werden, die nicht mit HIV-1 infiziert ist, um eine Immunantwort hervorzurufen, die die Wahrscheinlichkeit einer Infektion reduzieren kann, oder sie kann einer Person verabreicht werden, die bereits mit HIV-1 infiziert ist, um für eine therapeutische Reaktion gegen die Immunpathologie von HIV-1 zu sorgen (siehe beispielsweise Cease & Berzofsky, Ann. Rev. Immunol. 12, 923–989 (1994)). So kann eine Vakzine der Erfindung nützlich sein, um die Resistenz einer Person gegen HIV-1-Infektion zu stärken oder das Ausmaß der auf HIV-1 zurückzuführenden Pathologie bei einer HIV-1-infizierten Person zu reduzieren.

Definitionen

Die Bezeichnung "CHIV-Immunogen", wie hierin verwendet, bedeutet ein CHIV-Viruspartikel, das ein lebendes, abgeschwächtes oder getötetes CHIV oder ein Polynucleotid-Expressionskonstrukt eines CHIV-Virus sein kann. Ein CHIV-Immunogen ist dadurch gekennzeichnet, dass es, entweder in vivo oder ex vivo, eine Immunantwort stimulieren kann. Ein CHIV-Viruspartikel kann oder kann nicht ein chimäres virales Genom enthalten, doch es enthält zumindest ein CAEV- und ein HIV-1-Virusprotein. Vorzugsweise stimuliert das CHIV-Immunogen eine Immunantwort, die kreuzreaktiv gegen HIV-1 ist, wenn es einem Menschen verabreicht wird. Expressionskonstrukte eines CHIV-Retrovirus können in eine Person über Injektion eingeführt werden, wie in den US-Patenten Nr. 5.561.064, 5.703.055, 5.580.859 und 5.589.466 beschrieben wird, um immunogene Expressionsprodukte in vivo zu exprimieren.

Wie hierin verwendet bedeutet die Bezeichnung "Stärken der Resistenz", wenn sie unter Verweis auf HIV-1-Infektion verwendet wird, dass die Wahrscheinlichkeit viraler Infektion oder viraler Vermehrung in einer Person aufgrund der Stimulierung einer kreuzreaktiven Immunantwort gegen HIV-1, erzeugt durch ein CHIV-Immunogen, reduziert wird.

Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Polynucleotid" auf alle Formen von DNA und RNA, ob einzelsträngig, doppelsträngig oder höherer Ordnung. Ein Polynucleotid kann chemisch synthetisiert werden oder kann aus einer Wirtszelle oder einem -organismus isoliert werden. Ein bestimmtes Polynucleotid kann sowohl natürlich vorkommende Reste als auch synthetische Reste enthalten.

Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Expressionssteuerungssegmente" auf Polynucleotidsegmente, die die Transkription und Translation des rekombinanten CHIV-Retrovirus steuern können. Solche Segmente umfassen Promotoren, Enhancer, Poly-A-Signale, Donor-Spleißstellen und Akzeptor-Spleißstellen, Translationsinitiationsstellen und Translationsterminationsstellen. Typischerweise umfassen die Expressionssteuerungssegmente für Transkriptionsinitiation und -termination die lange terminale Redundanz- (LTR-) Regionen eines Retrovirus, vorzugsweise erhalten aus CAEV oder HIV-1.

Wie hierin verwendet bedeutet die Bezeichnung "Probe", wenn sie unter Verweis auf ein diagnostisches Verfahren der Erfindung verwendet wird, ein Gewebemuster oder ein Flüssigkeitsmuster, wie beispielsweise Blut (das Vollblut, Plasma oder Serum sein kann) oder Urin, das von einer Person erhalten werden kann, die auf CHIV- oder HIV-1-Infektion zu testen ist. Verfahren zum Erhalten solch einer Probe sind bekannt und gehören auf dem Gebiet der Erfindung der Routine an.

Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "TCID50" auf die "50 % Gewebekultur-Infektionsdosis", d.h. die Menge an Wirkstoff, die erforderlich ist, um 50 % einer Population kultivierter Zellen zu infizieren.

Wie hierin verwendet bedeutet die Bezeichnung "therapeutisch wirksame Menge", dass die Menge eines Immunogens ausreichend ist, um eine Immunantwort bei einer Person, die einer Behandlung unterzogen wird, zu stimulieren.

Wie hierin verwendet bedeutet die Bezeichnung "Vakzine" eine Zusammensetzung, die ein Immunogen enthält, das bei Verabreichung an eine Person eine Immunantwort stimuliert. Insbesondere enthält eine Vakzine der Erfindung ein CHIV-Immunogen, das beispielsweise einem Menschen verabreicht werden kann, worin eine Immunantwort gegen CHIV stimuliert wird, die gegen HIV-1 kreuzreaktiv ist. So ist CHIV-Immunogen als ein Ersatz-Immunogen zur Stimulierung einer Immunantwort gegen HIV-1 nützlich.

Konstruktion des chimären CHIV-Retrovirus

Der 9,7-kb-Co-Klon ist zur Zeit der einzige infektiöse DNA-Klon von CAEV (Pyper et al., J. Vir. 58(2), 665–670 (1986)). Die Nucleinsäuresequenz von CAEV-Co ist als GenBank-Zugriffsnummer M33677 erhältlich (siehe auch Saltarelli et al., Virology 179, 347-364 (1990); Knowles et al., J. Virol. 65, 5744–5750 (1991)). Jedoch kann prinzipiell jede Variante von CAEV oder HIV-1 als Materialquelle für die Chimären der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Varianten sind, bestimmt durch Hamming-Entfernungsmessung, vorzugsweise weniger als 15 % von bekannten CAEV- oder HIV-1-Sequenzen divergent (Faulkner et al., TIBS 13, 321–322 (1988)). Obwohl diese Divergenz auf Nucleotidniveau für isolierte Stämme von CAEV oder HIV-1 aufgrund der Degeneration des genetischen Codes gemessen wird, wäre es möglich, Polynucleotide zu synthetisieren, die auf Nucleotidniveau mehr als 15 % divergent sind und dennoch für ähnliche Proteine kodieren. So kann auch ein Polynucleotid verwendet werden, das für ein Protein kodiert, das die Funktion eines entsprechenden CAEV- oder HIV-1-Retrovirusproteins in einem rekombinanten Virus erfüllen kann und durch ein Polynucleotid, das weniger als etwa 15 % von einem bekannten CAEV- oder HIV-1-Polynucleotid divergent ist, kodiert werden könnte.

Demähnlich können die HIV-1-Komponenten der Chimäre aus jedem beliebigen HIV-1-Stamm isoliert werden. In bestimmten Ausführungsformen werden die HIV-1-env-Codierregionen durch einen der folgenden Stämme bereitgestellt: SF162 (Makrophagen-tropisch) oder SF33 (T-Zellinien-tropisch). Env- oder andere HIV-1-Codierregionen, die von den hierin beschriebenen divergent sind, können auch verwendet werden, umfassend jene, die Infektion von sowohl Makrophagen als auch T-Zellen vermitteln können. Divergente HIV-1-Gene sind weniger als 15 % divergent von einem wie zuvor beschriebenen, bekannten HIV-1-Gen oder kodieren für ein Protein, das durch ein HIV-1-Gen kodiert werden könnte, das weniger als etwa 15 % divergent ist und die Funktion des kodierten HIV-1-Proteins in einem rekombinanten Retrovirus erfüllen kann. Weiters ist solch ein divergentes env-Protein vorzugsweise in der Lage, die Infektion menschlicher T-Zellen, menschlicher Makrophagen oder von beiden zu vermitteln.

Die zur Herstellung der hierin beschriebenen chimären CHIV-Viren verwendeten Verfahren umfassen die Standardverfahren zur Polynucleotidmanipulation und -vermehrung. Prinzipiell kann jedes beliebige Verfahren verwendet werden, um das chimäre Polynucleotid zu bilden, umfassend chemische Synthese sich überlappender Oligonucleotide, gefolgt von Verlängerung und Ligation, PCR erwünschter Abschnitte des individuellen Ausgangsmaterials unter Verwendung von Oligonucleotiden, die komplementäre 5'-Verlängerungen aufweisen, die in einer darauf folgenden PCR kombiniert werden können, sowie eher herkömmliche Restriktionsenzymverdaue, um erwünschte Segmente zu isolieren, gefolgt von Ligation unter Verwendung von Linkern und Adaptern je nach Bedarf. Darüber hinaus wurde herausgefunden, dass Cotransfektion in Wirtszellen nicht-ligierter komplementärer Abschnitte des viralen Konstrukts zur Bildung intakter reproduktiver Viren in den Wirtszellen selbst führt.

Die resultierenden Polynucleotidkonstrukte können unter Verwendung von Standardverfahren vermehrt werden. Beispielsweise kann das chimäre virale Genom in einen bakteriellen Vektor eingeführt und in einer bakteriellen Wirtszelle vermehrt werden, oder das Virus kann in einer Säugetier-Wirtszelle exprimiert und das resultierende Virus-Ausgangsmaterial fortlaufend passagiert werden, oder ein DNA-Konstrukt, umfassend das chimäre virale Genom, kann in vitro unter Verwendung von Verfahren wie langer PCR vermehrt werden. Das Virus kann auch in einem Tier wie einem Makaken vermehrt und aus einer Blutprobe gewonnen werden. Vorzugsweise werden die Polynucleotidkonstrukte auf eine Weise vermehrt, die die Integrität des gebildeten Konstrukts bewahrt, sowohl hinsichtlich der Sequenz des Polynucleotids als auch hinsichtlich der Gesamtstruktur des chimären Retrovirus. Eine bevorzugte Weise der Vermehrung der Polynucleotidkonstrukte wird daher innerhalb eines replizierenden bakteriellen Vektors, beispielsweise eines Plasmids, in einem bakteriellen Wirtsstamm durchgeführt, der für Rekombination defekt ist und vorzugsweise rec A ist. Dies hemmt Rekombination zwischen den direkten Wiederholungen, die in den LTR-Regionen im chimären retroviralen Konstrukt zu finden sind. Tritt Rekombination in einem rec-A-Bakterien-Wirtsstamm auf, so können weitere Rekombinations-defekte Stämme, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, verwendet werden, um solch ein Plasmidkonstrukt zu vermehren.

Ein Prototyp einer CAEV/HIV-Chimäre wird durch molekulare Substitution der tat-, vpu-, env- und rev-Gene von HIV-1 in einen infektiöses 9,7-kb-Klon von CAEV-Co konstruiert, der die gag-, pol-, vif- und LTR-Funktionen von CAEV beibehält. Das Grundprinzip der Ersetzungsstrategie, die in den 3A–C dargestellt wird, ist das Entfernen des CAEV-env-Gens und der Initiationsstellen für die env- und rev-Gene, während gleichzeitig das CAEV-tat-Gen mit einem Stoppcodon vorzeitig abgeschlossen wird. Deletion oder Stoppcodon-Termination des schwach transaktivierenden CAEV-tat-Gens zeigt keine Wirkung auf CAEV-Replikationsraten in vivo oder in vitro (Harmache et al., J. Virol. 69, 5445–5454 (1995)). Die Auswahl dieser Möglichkeit beruht weitgehend auf dem Bedarf, die Aktivität des CAEV-vif-Gens zu erhalten, das für funktionelle Replikation erforderlich ist (Harmache et al., J. Virol. 69, 2347–3257 (1995)) und eine 8-bp-Out-of-Frame-Überlappung zwischen seiner Terminationsstelle und der tat-Initiationsstelle aufweist.

Dieses CHIV-Konstrukt basiert auf den env- und rev-Genen, die aus HIV-1 erhalten werden, um eine angemessene Leistung zu erbringen, da beide Gene für CAEV-Replikation unerlässlich sind. Die Beobachtung, dass das CAEV-Genom ein rev-Reaktionselement (RRE) enthält, das eine stabile Stammschleifenstruktur umfasst, die hinsichtlich Anordnung, Stabilität und Konfiguration jener von HIV-1 ähnlich ist (Saltarelli et al., Virol. 179(1), 347–364 (1990)), unterstützt die Annahme einer analogen Rolle von rev sowohl in CAEV als auch in HIV-1. Daher wird dieses CHIV-Konstrukt empirisch getestet. Sofern erforderlich kann komplexere Gentechnik durchgeführt werden, um das CAEV-rev-Gen in die Chimäre zu inkorporieren. Das entbehrliche nef-Gen, dessen Platzierung auch die 3'-HIV-1-LTR überlappt, wird in diesem CHIV-Konstrukt deletiert.

Zusätzliche Codierregionen können auch in die CHIV-Konstrukte inkorporiert werden. Beispielsweise können selektierbare oder detektierbare Marker in die CHIV-Konstrukte eingebunden werden, um Expressionszellen zu selektieren oder detektieren. Gene, die für immunstimulierende Moleküle kodieren, können auch eingebunden werden, um die Antigenität infizierter Zellen zu steigern und dadurch eine stärkere Immunantwort zu stimulieren.

Weiters, obwohl die Verwendung von Replikations-fähigen CHIV-Konstrukten und viralem Ausgangsmaterial erwogen wird, liegen auch Replikations-defektes) CHIV-Konstrukte und virales Ausgangsmaterial innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung. Werden sie in eine Person eingeführt, so produzieren solche Konstrukte eine abortive Infektion. Replikations-defekte CHIV-Konstrukte können wie zuvor beschrieben hergestellt werden, wobei ihnen jedoch zumindest eine funktionierende Codierregion, die zur Virusvermehrung erforderlich ist, fehlt. Beispielsweise kann das Viruskonstrukt eine Deletion oder Mutation in einem maßgeblichen Gen aufweisen, und die verwendeten Wirtszellen würden die fehlende Funktion bereitstellen, um ein Replikations-defektes Viren-Ausgangsmaterial zu bilden. Beispielsweise könnte dem CHIV-Konstrukt ein pol-Gen fehlen, dessen Funktion von der Wirtszelle bereitgestellt werden könnte. Die Wirtszelle könnte dann infektiöse Viruspartikel produzieren, die das von der Wirtszelle gebildete pol-Protein einbinden, was reverse Transkription des defekten retroviralen RNA-Genoms in DNA ermöglichen würde, nachdem ein Viruspartikel eine andere Zelle infiziert hatte. Hat sich das Replikations-unfähige Virusgenom erst einmal in das infizierte Zellgenom integriert und wurde es exprimiert, so könnten virale Antigene durch die infizierte Zelle gebildet werden, wobei jedoch der Mangel an pol-Protein eine darauf folgende produktive Infektion unterbinden würde. Es ist auch möglich, chimäre retrovirale Partikel, die CAEV- und HIV-1-Proteine enthalten, durch Exprimieren von Codiersequenzen für diese Proteine unabhängig in einer Wirtszelle zu bilden, ohne ein chimäres Polynucleotid zu verwenden.

Das resultierende CHIV-Konstrukt kann durch jedes beliebige Verfahren in eine Säugetier-Wirtszelle eingeführt werden. Beispiele für Verfahren, die verwendet werden können, umfassen Transfektion, wie beispielsweise Calciumphosphattransfektion, Lipofektion, Verkapselung in künstlichen Virushüllen, Elektroporation, Schab- und Reibverfahren und bolistische Einwirkung. Nachdem Partikel, die das Konstrukt enthalten, gebildet wurden, kann Virusinfektion auch in Zellen verwendet werden, die die geeigneten viralen Rezeptoren exprimieren.

Säugetierwirtszellen, die im Rahmen der Erfindung nützlich sind, umfassen jene, die in der Lage sind, eingeführte CHIV-Konstrukte zu exprimieren, sowie jene Zellen, die einer Infektion durch die hergestellten CHIV-Viruspartikel unterzogen werden können. Wirtszellen können etablierte Zelllinien oder Primärisolate sein. Beispielsweise können CHIV-Konstrukte in Primär-Ziegensynovialmembran- ("goat synovial membrane"-, GSM-) Zellen, die mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren hergestellt wurden, oder in eine menschliche Rhabomyosarkom-Zelllinie eingeführt werden, beispielsweise die Zelllinien RD (ATCC Nr. CCL-136) oder RD-5 (Luciw et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 7490–7494 (1995)). Weitere Beispiele für Säugetier-Wirtszellen, die verwendet werden können, umfassen primäre menschliche und Makaken-PBMC und -Makrophagen, hergestellt mittels bekannter Verfahren, und die CD4+-Zelllinien HUT78 (Marchalonis et al., Cell Immunol. 77(1), 161-175 (1983); ATCC Nr. TIB-161) und CEMX174 (Sei et al., Cell Immunol. 125(1), 1–13 (1990)).

Die Wirtszellen können analysiert werden, um das Funktionieren des eingeführten Konstrukts nachzuweisen. Tests, die durchgeführt werden können, umfassen: (a) Immuntests, um Produktion von gp120 (durch gp120-Antigen-Capture-ELISA) und des CAEV-gag-Proteins p28 (durch Western-Blotting unter Verwendung von polyklonalen Ziegenseren) nachzuweisen; (b) CAEV-gag- und HIV-1-env-PCR der genomischen GSM- oder RD-5-DNA, um provirale DNA-Sequenzen nachzuweisen; und (c) CAEV-gag- und HIV-1-env-RT-PCR der gesamten Zell-RNA.

Die Lebensfähigkeit des vollständigen CHIV-Konstrukts wird durch Transfektion in eine geeignete Wirtszelle, beispielsweise GSM-Zellen, oder alternativ dazu in die menschliche Rhabdomyosarkom-Linie RD-5 getestet (Luciw et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 7490-7494 (1995)). Überstände werden durch reversen Transkriptase- (RT-) Test und CAEV- und HIV-1-RT-PCR beobachtet. Der Wirtszellenbereich der gebildeten Chimären kann durch Impfen in menschliche und Rhesusmakaken-PBMC und -Makrophagen und HUT78- und CEMX174-Zelllinien, gefolgt von Tests auf virale Replikation (RT-PCR und RT-Test) analysiert werden. Die Produktion von HIV-1-env- und CAEV-gag-Proteinen kann durch gp120-Antigen-Capture-ELISA und CAEV-p28-Western-Blotting getestet werden. Basierend auf dem Tropismus des HIV-1-Stamms, von dem das Hüllgen abgeleitet wird, kann der Tropismus der CHIV-Chimäre vorhergesagt werden.

Beispielsweise wird für die CHIVSF33-Chimäre vorhergesagt, dass sie sich in HUT78- und CEMX174-Zelllinien vermehrt, die die Expression von T-Zelllinien-tropischen HIV-1-Stämmen unterstützen. Für die CHIVSF162-Chimären wird vorhergesagt, dass sie in menschlichen, Makaken- und GSM-Zellkulturen wachsen. Expression von chimären Genen in den Kulturen wird durch RT-Tests und durch RT-PCR für CAEV-gag und HIV-1-env bewertet. Darüber hinaus kann eine Sequenzierung von RT-PCR-Produkten durchgeführt werden, um die Identität der exprimierten Gene zu bestätigen. Kulturen werden mittels Mikroskopie auf Bildung von Synzytium oder auf zytopathische Eigenschaft untersucht. Synzytien sind gewaltig große, vielkernige Zellen, die für ergiebige retrovirale Infektion charakteristisch sind. Zytopathische Eigenschaft kann durch Synzytiumbildung sowie durch zytoplasmatische(n) Vakuolenbildung oder Zelltod bestimmt werden. Es ist wünschenswert, dass das CHIV in vitro Synzytien in den beabsichtigten Targetzellen bildet oder sonst zytopathisch gegenüber diesen Zellen ist, da es kein Wirtsimmunsystem gibt, das die Infektion bekämpft. Vorzugsweise bildet das CHIV solch eine zytopathische Wirkung in einem großen Anteil solcher Zellen.

Virale Proteinproduktion wird durch immunologische Verfahren wie in den Transfektionsexperimenten und, sofern notwendig, durch Immunfällung radioaktiv markierter Kulturen, die beispielsweise mit 35S-Methionin markiert sind, überwacht.

Werden provirale DNA und zelluläre RNA in Abwesenheit von Protein nachgewiesen, wird die Möglichkeit anormalen Spleißens einer oder mehrerer Genfunktionen durch Northern-Blotting analysiert. Kryptische Spleißstellen, die unzulässigerweise in der Chimäre aktiviert sind, können mittels herkömmlicher Verfahren wie ortsgerichteter Mutagenese oder mutagener PCR entfernt werden. Starke Consensus-Spleißstellen können mittels ähnlicher Verfahren eingeführt werden, sofern es notwendig ist, um die Verwendung erwünschter Spleißstellen zu verbessern. Alternativ dazu können innere Ribosomen-Eintrittsstellen in das Konstrukt eingeführt werden, um die Translation eines erwünschten Proteins direkt zu fördern.

Werden Proteine in den Zellen nachgewiesen, jedoch keine reifen Viruspartikel gebildet, besteht möglicherweise ein Anordnungsproblem. Bei HIV-1-Anordnung werden naszierende Hüllmoleküle auf Matrixprotein- (MA-) Stellen gerichtet, die myristyliert werden, ein Mechanismus, der bei Ungulat-Lentivirusanordnung unbekannt ist (Dorfman et al., J. Virol. 68(3), 1689–1696 (1994)). Eine Inkompatibilität aufgrund eines Mangels an Myristylierung kann jedoch durch Bereitstellen einer myristylierten Membran-Bindungsdomäne aus einem anderen Virus korrigiert werden (Wills et al., J. Virol. 65(7), 3804–3812 (1991)).

Schließlich kann, sofern keine integrierte chimäre DNA nachgewiesen wird, ein Reportergen wie bakterielle Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) verwendet werden, um die Rolle des tat-Gens in CAEV-Co zu evaluieren (Saltarelli et al., Virology 197(1), 35–44 (1993)). Das CAT-Gen kann unter der Kontrolle des CAEV-Co-LTR-Promotors platziert werden, und Konstrukte mit oder ohne dem/das CAEV-tat-Gen werden auf Expression in der Wirtszelle bewertet. Wird CAT in der Wirtszelle exprimiert, das CHIV jedoch nicht, dann können, sofern erforderlich, zusätzliche CAEV-Gene in das CHIV eingebunden werden, um virale Replikation zu ermöglichen.

Auf der Grundlage der Ergebnisse dieses diagnostischen Ansatzes werden Modifikationen am in den 3A–C dargestellten Konstrukt vorgenommen. Zusätzliche Codierregionen von CAEV und/oder HIV-1 können in die Chimäre eingebunden werden, um ein besser funktionierendes Retrovirus zu erhalten. Codierregionen, die die Chimäre negativ beeinflussen, können deletiert werden.

Das Resultat ist ein chimäres Retrovirus, das: zumindest das Hüllgen aus einem HIV-1-Stamm umfasst; ausreichend CAEV-Sequenzen umfasst, um die biologischen Wirkungen des rekombinanten Virus in einem Primaten soweit abzuschwächen, dass das CHIV nicht-pathogen wird; die Restsubstanz des viralen Genoms, abgeleitet von entweder CAEV oder HIV-1, aufweist; in der Lage ist, sich in vitro in einer Wirtszelle zu replizieren; und das eine Immunantwort gegen HIV-1 hervorbringt.

Ein virales Ausgangsmaterial, das CHIV-Viruspartikel enthält, kann aus einer exprimierenden Wirtszelle unter Verwendung herkömmlicher Verfahren gebildet werden. Beispielsweise kann der Kulturüberstand aus einer 3H-Uridin-markierten Wirtszellkultur, die CHIV exprimiert, Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation unterzogen werden. Die Anordnung der retroviralen Partikel kann durch Sammeln von Fraktionen aus dem Gradienten und Testen auf Radioaktivität und reverse Transkriptaseaktivität bestimmt werden. Noch direkter kann eine Kultur, die CHIV exprimiert, bei 130.000 × g zentrifugiert werden, um die Viruspartikel zu pelletieren. Das resultierende Pellet kann gewaschen und, falls erwünscht, neuerlich pelletiert und in einer geeigneten Lösung resuspendiert werden.

Sind die Viruspartikel in einen Primaten einzuführen, sollte das Virus in Wirtszellen passagiert werden, die von diesem Primaten abgeleitet sind, um nichtspezifische Immunantworten auf Wirtszellenantigene zu vermeiden. Sind die Viruspartikel beispielsweise in einen Menschen einzuführen, dann wird das Virus vorzugsweise in menschlichen PBMC vermehrt, um Immunantworten auf nichtmenschliche Wirtszellenantigene, die unzulässigerweise in den Viruspartikeln verpackt sind, zu vermeiden.

Ein Tiermodell kann verwendet werden, um das CHIV vor der Verwendung an Menschen weiter zu bewerten. In-vivo-Infektion kann an einem Tier, beispielsweise einem Makaken, durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob das CHIV pathogen ist und ob sich die HIV-1-Stamm-spezifische Immunantwort gegen die HIV-1-Hülle entwickelt. Das Tier kann mit einem Virusinokulat, das wie zuvor beschrieben hergestellt wurde, transfundiert werden. Blut kann in regelmäßigen Abständen abgenommen werden, um zu bestimmen, ob Infektion eingetreten ist und ob pathogene Veränderungen im Blutbild des Tieres aufgetreten sind.

Umfasst das CHIV-Immunogen ein Polynucleotid, das ein CHIV-Virusgenom enthält, kann das Polynucleotid mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung für die Herstellung von Polynucleotidvakzinen bekannt sind, hergestellt werden. Beispielsweise können die in den US-Patenten Nr. 5.561.064, 5.703.055, 5.580.859 und 5.589.466 beschriebenen Verfahren verwendet werden, um Polynucleotide herzustellen, die zur Verabreichung an ein Säugetier, um eine Immunantwort hervorzurufen, geeignet sind.

Eine Vakzine der Erfindung enthält vorzugsweise, zusätzlich zu einem CHIV-Immunogen, einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Pharmazeutisch annehmbare Träger sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen Lösungen wie physiologisch gepufferte Salzlösung oder andere Lösungsmittel oder Vehikel wie Glykole, Glycerin, Öle, beispielsweise Olivenöl, oder injizierbare organische Ester. Sofern erwünscht kann eine Vakzine der Erfindung einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten, der ein Adjuvans ist. Adjuvantien wie Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, komplettes oder inkomplettes Freundsches Adjuvans, QS21 (beschrieben im US-Patent Nr. 5.889.176, Rovinski et al.) oder andere geschützte Adjuvantien sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und im Handel erhältlich (Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton MT). Der Zusatz eines Adjuvans senkt im Allgemeinen die erforderliche Menge eines CHIV-Immunogens, um eine Immunantwort hervorzurufen.

Ein pharmazeutisch annehmbarer Träger kann auch eine physiologisch annehmbare Verbindung enthalten, die beispielsweise wirkt, um das CHIV-Immunogen zu stabilisieren oder seine Absorption zu steigern. Physiologisch annehmbare Verbindungen umfassen beispielsweise Kohlenhydrate, wie beispielsweise Glucose, Saccharose oder Dextrane; Antioxidantien, beispielsweise Ascorbinsäure oder Glutathion; Chelatbildner; niedermolekulare Proteine; oder andere Stabilisatoren oder Arzneimittelträger. Fachleuten würden wissen, dass die Auswahl einer pharmazeutisch annehmbaren Verbindung, umfassend eine physiologisch annehmbare Verbindung, beispielsweise von der Art der Verabreichung der Vakzine und von den bestimmten physiochemischen Eigenschaften des CHIV-Immunogens abhängt.

Ein CHIV-Immunogen kann selbst immunogene Eigenschaften aufweisen, kann immunogene Moleküle in vivo produzieren oder kann an ein Trägermolekül wie Rinderserumalbumin oder einen inerten Träger gebunden sein, sodass der CHIV-Immunogen-Trägerkomplex eine Immunantwort stimulieren kann (siehe beispielsweise Harlow & Lane, Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Enthält beispielsweise eine Vakzine CHIV-Viruspartikel, ist das Virus immunogen und kann in einer geimpften Person eine Immunantwort stimulieren.

Verfahren zur Impfung einer Person, um eine Immunantwort zu stimulieren, sind auch bekannt (Harlow and Lane, s.o., 1988). Das Immunogen kann beispielsweise intravenös, intradermal, subkutan, oral, anal, vaginal, intranasal oder transdermal verabreicht werden. Die Vakzine wird unter Berücksichtigung des beabsichtigten der Verabreichungsweges formuliert. Weiters kann es von Vorteil sein, eine oder mehrere Booster-Impfungen zu verabreichen. Der Bedarf an einer Booster-Impfung und die zeitliche Anordnung solcher Booster-Impfungen können durch Messen beispielsweise der Gegenwart und des Titers von Anti-HIV-1-Antikörpern im Serum einer geimpften Person empirisch bestimmt werden.

Obwohl hierin auf die Verabreichung eines CHIV-Immunogens an eine Person Bezug genommen wird, wird anerkannt, dass eine Immunantwort gegen HIV-1 in vivo oder ex vivo stimuliert werden kann. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, eine Immunantwort gegen HIV-1 ex vivo zu stimulieren, wenn die zu behandelnde Person an Aids leidet oder mit HIV-1 infiziert ist. Zur Ex-vivo-Stimulierung werden der Person Lymphozyten entnommen und in Kultur immunisiert. Gleichzeitig wird die Lymphozytenpopulation vergrößert. Diese stimulierten, erweiterten Immunzellen können dann der Person über Infusion wieder zugeführt werden, wodurch eine therapeutische Wirkung erreicht wird. Solch eine Behandlung kann palliativ wirken und kann die Lebensqualität einer an Aids erkrankten Person steigern.

Die Menge eines CHIV-Immunogens, das eine therapeutisch wirksame Menge darstellt, kann variieren, je nachdem, ob beispielsweise Stimulierung der Immunantwort in vivo oder ex vivo erfolgt, ob die Verabreichung eine erste Verabreichung oder eine Booster-Verabreichung ist, ob ein Adjuvans mit dem Immunogen verabreicht wird und, wenn in vivo verabreicht wird, je nach Art der Verabreichung und je nach Gewicht des Patienten. Verfahren zur Bestimmung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Immunogens sind Routineverfahren und auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (siehe Powell & Newman, Vaccine Design: The subunit and adjuvant approach (Plenum Publ. Corp.; 1994)).

Werden CHIV-Viruspartikel beispielsweise einem Affen verabreicht, kann eine therapeutisch wirksame Menge des partikulären CHIV-Immunogens im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1×108 TCID50, üblicherweise von etwa 7×102 bis etwa 7×104 TCID50, liegen. Werden CHIV-Viruspartikel einem Menschen verabreicht, kann eine therapeutisch wirksame Menge des partikulären CHIV-Immunogens im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1×108 TCID50, üblicherweise von etwa 5×103 bis etwa 5×105 TCID50, liegen. Ist das Immunogen ein Polynucleotid, umfassend ein einzelnes vollständiges CHIV-Retrovirusgenom, so kann eine therapeutisch wirksame Menge im Bereich von etwa 0,05 &mgr;g/kg bis etwa 50 mg/kg, üblicherweise von etwa 0,005 bis etwa 5 mg/kg, liegen.

Proben können von einer Person, die ein CHIV-Immunogen erhalten hat, entnommen und getestet werden, um zu bestimmen, ob die Person eine Immunantwort auf das Immunogen entwickelt hat, beispielsweise um zu bestimmen, ob die Person Antikörper gegen HIV-1 gebildet hat. Verfahren zur Detektion einer Antigen-Antikörper-Wechselwirkung, die in einer Probe vorhanden ist, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen beispielsweise die Verwendung eines nachweisbaren, markierten Antigens oder die Verwendung eines nachweisbaren, markierten Sekundärantikörpers, der ein Antikörper ist, der sich spezifisch an eine bestimmte Klasse von Antikörpern wie IgG, IgA, IgM, IgD oder IgE aus einer bestimmten Säugetierspezies bindet (siehe beispielsweise Green & David, US-Patent Nr. 4.376.110, ausgegeben im August 1983, das durch Verweis hierin aufgenommen ist). Ist eine Probe beispielsweise eine Blutserum- oder Blutplasmaprobe von einem Menschen, so kann ein Sekundärantikörper ein Ziegen-Anti-Mensch-IgG sein. Solche Sekundärantikörper können unter Verwendung bekannter Verfahren hergestellt werden oder können aus üblichen Handelsquellen erhalten werden. Verfahren zum nachweisbaren Markieren eines CHIV-Antigens oder eines Antikörpers sind auf dem Gebiet der Erfindung auch bekannt.

Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Veranschaulichung beschrieben und stellen keine Einschränkung der vorliegenden Erfindung dar.

BEISPIEL 1 BILDUNG EINES CHIMÄREN CAEV/HIV-1-RETROVIRUS

Der experimentelle Entwurf basiert auf dem infektiösen Klon CAEV-Co, in dem die env-Funktionen von HIV-1 substituiert sind. Eine detaillierte Darstellung der Substitution der HIV-1-env-Funktionen, abgeleitet von Stämmen SF162 (Cheng-Mayer et al., J. Virol. 64(8), 4012-4020 (1990)), in CAEV-Co ist in den 3A–C dargestellt. Zur Herstellung eines CAEV/HIV- (CHIV-) Konstrukts wird das 5'-9,4-kb-Hindlll-Fragment von CAEV durch Deletieren von Abschnitten der tat/env/rev-Gene, die für die Expression erforderlich sind und die dann durch die tat/vpu/env/rev-Gene von HIV-1 ersetzt werden, modifiziert. Diese Modifikation ist in 3A, Schritte 1–5, dargestellt.

Die pUC18- und pGem2-Vektoren, die die 9,4-kb-5'- bzw. 0,4-kb-3'-CAEV-Co-Segmente enthielten (Pyper et al., J. Virol. 58(2), 665-670 (1986)), wurden von Dr. J. Clements (Johns Hopkins University) erhalten und zum rec-A-Bakterienwirt DHSa transformiert. Selektierte Klone wurden unter Verwendung herkömmlicher SDS-NaOH-Lyse, Fällung durch hohe Salzkonzentration, um bakterielle DNA und Zelltrümmer zu entfernen, und Isopropylalkohol-Fällung einer Maxiprep unterzogen.

Auf RNase- und Proteinase-K-Behandlung neuerlich aufgelöster Plasmid-DNA folgte Phenol/Chloroform-Extraktion, Ethanolfällung und Resuspension in TE-Puffer. Beide Plasmide wurden Restriktionsverdau und Teilsequenzierung unterzogen, um Identität zu bestätigen.

Das 9,4-kb-5'-CAEV-Co-Insert in pUC18, gezeigt in 3A als Konstrukt 1, weist einzigartige Spl-1-Stellen bei 5745 und 8097 auf. Das Spl-1-Spl-1-Stück enthält den Großteil des CAEV-tat-Gens sowie die Startstellen und den Großteil der Codierregionen für die env- und rev-Gene. Dieses Stück kann durch Verdau von Konstrukt 1 mit Spl 1 und neuerliches Ligieren des geschnitten Plasmids deletiert werden, um eine einzelne Spl-1-Insertionsstelle-5'-CAEV-Plasmid zu bilden, das in 3A als Konstrukt 2 bezeichnet ist. Die nicht-exzidierten Regionen der 3'-distalen env- und rev-Gene (umfassend die Tm-Region von env) weisen keine Translationsinitiationsstellen auf und sollten daher nicht translatiert werden. Weiters wird das CAEV-tat-Gen vorzeitig abgeschlossen, wobei eine HIV-1-tat-Sequenz substituiert wird (nachstehend beschrieben).

Zwei verschiedene HIV-1-Kassetteninserts, wobei jedes vollständige tat-, vpu-, env- und rev-Gene von HIV-1 enthält, werden von den Plasmidkonstrukten p33/3'SX und p162/3'SX abgeleitet (Luciw et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 92, 7490-7494 (1995)), die jeweils die SF33- (York-Higgins et al., J. Virol. 64(8), 4012–4020 (1990)) und SF162-(Cheng-Mayer et al., J. Virol. 64(9), 4390–4398 (1990)) env-Gene enthalten, die schematisch in Konstrukt 3 aus 3A dargestellt sind. Diese Plasmide wurden mit 5'-Sph-1- und 3'-Xho-1-Stellen konstruiert, die das HIV-1-tat/vpu/env/rev-Insert flankieren. Diese Sph-1-Xho-1-Fragmente werden exzidiert, und spezifische terminale Adaptersequenzen, die beide in einer Spl-1-Stelle enden, welche in den HIV-1-Konstrukten nicht vorhanden ist, werden ligiert. Die DNA-Junction-Sequenzen sind in 3C beschrieben.

Im abschließenden Schritt des Konstruierens des 5'-CAEV-HIV-Konstrukts wird das/werden die Spl-1-abgeschlossenen HIV-1-Insert(s) in den geschnittenen Spl-1-Insertionsvektor 2 ligiert. Die Wirksamkeit dieses Vorgangs kann durch erstes Entfernen der 5'-überstehenden Phosphatgruppen des Insertionsvektors 2 mit alkalischer Kalbsphosphatase (CIP) sichergestellt werden, um Selbstschluss des Vektors zu vermeiden.

Wie in 3B gezeigt, wird der vollständige CAEV-HIV-Klon durch Ligieren der Hindlll-Fragmente aus dem End-5'-Konstrukt 5 mit den Hindlll-Fragmenten des 0,4-kb-CAEV-Fragments 6, das die 3'-CAEV-LTR enthält, assembliert. Alternativ dazu können die zwei Fragment zusammen in GSM-Zellen eingeführt werden, wo sich die zwei Fragmente selbst-ligieren können. Das Endergebnis dieser Ligation ist das CAEV-HIV-'CHIV'-Viruskonstrukt 7.

Die Details der Spl-1-DNA-Adapter Anoden 5'-CAEV/HIV- und 3'-HIV/CAEV-Junctions sind in 3C gezeigt. Die 5'-CAEV-HIV-Junction zeigt die 8-bp-Out-of-Frame-Überlappung der CAEV-viv- und -tat-Gene (5688-5693), die den Entwurf eines CAEV-tat-"in-frame"-Stoppcodons (TGA) in der Adapterregion erforderte. Die DNA und die 21 Aminosäuresequenzen des trunkierten CAEV-tat-Gens von der Startstelle des Terminationscodons sind unmittelbar nachstehend gezeigt. Die Sph-1-Restriktionsstelle im p162/3'-SX-Plasmid (5814) wird zusammen mit der kontinuierlichen Sequenz von HIV-1 162 bis gerade nach der HIV-1-tat-Startstelle gezeigt. Auch in den 5'-Spl-1-Adapter eingebaut ist eine einzigartige Cla-1-Stelle (ATCGAT), die weder im CAEV-Plasmid noch im HIV-1-Insert (das mit einer Not-1-Stelle zu verwenden ist, wie nachstehend beschrieben) vorhanden ist.

Die 3'-HIV-CAEV-Junction-DNA-Sequenz ist mit der HIV-1-Xho-1-Stelle und der Adapter/CAEV-Spl-1-Stelle sowie der HIV-1-env-Gen-Stoppstelle (8801) auch in 3C gezeigt. Auch eine einzige Not-1-Stelle (GCGGCCGC), die in den CAEV-Klonen und dem HIV-1-Insert nicht vorhanden ist, ist in den 3'-Xho-1-Spl-1-Adapter eingebunden. Die Not-1-Stelle, zusammen mit der Cla-1-Stelle im 5'-Adapter, ermöglicht die Ersetzung dieser HIV-1-DNA-Kassette auf eine 5'-Cla-1-3'-Not-1-richtungsspezifische Weise.

Das Grundprinzip der Ersetzungsstrategie, die in den 3A–C dargestellt wird, ist das Entfernen des CAEV-env-Gens und der Startstellen für die env- und rev-Gene, wobei das CAEV-tat-Gen vorzeitig mit einem Stoppcodon abgeschlossen wird. Deletion oder Stoppcodon-Termination des schwach transaktivierenden CAEV-tat-Gens zeigt auf die CAEV-Replikationsraten in vivo oder in vitro keine Auswirkung (Harmache et al., J. Virol. 69, 5445–5454 (1995)). Die Auswahl dieser Möglichkeit begründete sich weitgehend durch den Bedarf, die Aktivität des CAEV-vif-Gens aufrechtzuerhalten, das für funktionelle Replikation erforderlich ist (Harmache et al., J. Virol. 69, 3247–3257 (1995)) und eine 8-bp-Out-of-Frame-Überlappung zwischen seiner Terminationsstelle und der tat-Startstelle aufweist.

Dieses CHIV-Konstrukt basiert auf den env- und rev-Genen, die von HIV-1 bereitgestellt werden, um eine angemessene Leistung zu erbringen, da beide Gene unverzichtbar sind. Die Beobachtung, dass das CAEV-Genom ein rev-Reaktionselement (RRE) enthält, das eine stabile Stammschleifenstruktur umfasst, die hinsichtlich ihrer Anordnung, Stabilität und Konfiguration jener von HIV-1 ähnlich ist (Saltarelli et al., Virol. 179(1), 347–364 (1990)), unterstützt die Annahme einer analogen Rolle von rev in CAEV und HIV-1. Daher wird dieses CHIV-Konstrukt empirisch getestet. Sofern notwendig können auch komplexere gentechnologische Verfahren durchgeführt werden, um das CAEV-rev-Gen in die Chimäre zu inkorporieren. Das unerlässliche HIV-1-nef-Gen, dessen Platzierung die 3'-HIV-1-LTR auch überlappt, ist in diesem CHIV-Konstrukt deletiert.

BEISPIEL II EXPRESSION REKOMBINANTER RETROVIREN IN WIRTSZELLEN

Die Lebensfähigkeit des kompletten CHIV-Konstrukts wird durch Transfektion in GSM-Zellen oder die menschliche Rhabdomyosarkomlinie RD-5 getestet (Luciw et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 92, 7490–7494 (1995)). Transfizierte und schein-transfizierte Kulturüberstände werden auf Virusproduktion durch CAEV-gag- und HIV-1-env-RT-PCR und durch RT-Test getestet. Eine stufenweise Analyse transfizierter Zellen wird durchgeführt, um das Funktionieren des Konstrukts nachzuweisen, umfassend (a) Immuntests zur Detektion der Produktion von gp120 (durch gp120-Antigen-Capture-ELISA) und des CAEV-gag-Proteins p28 (durch Western-Blotting unter Verwendung polyklonaler Ziegenseren); (b) CAEV-gag- und HIV-1-env-PCR der genomischen GSM- oder RD-5-DNA, um provirale DNA-Sequenzen nachzuweisen; (c) CAEV-gag- und HIV-1-env-RT-PCR von vollständiger Zell-RNA.

Die 2A-B zeigen, dass die zwei CAEV-Fragmente, die das CAEV-Co-Genom umfassen, ein 9,4-kb-5'-Fragment in pUC18 und ein 0,4-kb-3'-Fragment in pGem2, Lebendviren produzieren, wenn sie in GSM-Zellen transfiziert werden. GSM-Zellen wurden Lipofectamin-transfiziert, entweder mit: (1) unligierten 5'- und 3'-Fragmenten oder ligierter DNA ohne (2) oder mit (3) Behandlung mit alkalischer Kalbsphosphatase, wie in 2A gezeigt ist. Alle drei Modalitäten resultierten in Virusproduktion, die durch CAEV-gag-RT-PCR der Kulturüberstände bestimmt wurde (2B). So ist zum Transfizieren von GSM-Zellen mit den 5'- und 3'-Fragmenten der Chimäre Präligation möglicherweise nicht erforderlich. Schein-transfizierte GSM-Kulturen, Bahnen (4), (5) und (6), waren PCR-negativ.

Verfahren: Die CAEV-Co-9,4-kb- (5'-Klon) und -0,4-kb- (3'-Klon) Plasmide wurden getrennt mit Hind III verdaut, und die Fragmente wurden Gel-gereinigt, um präparative Mengen zu erhalten. Die Fragmente wurden mit oder ohne Phosphatasebehandlung der kleineren Fragmente ligiert oder wurden ohne Ligation transfiziert. Transfektion in GSM-Zellen erfolgte unter Verwendung von Lipofectamin (BRL) gemäß den Vorschriften des Herstellers. Nach 12 Stunden in Optimen/Lipofectamin/DNA-Reagenzien wurden die GSM-Kulturen in DMEM mehrere Male gewaschen und auf Standard-Gewebekulturbedingungen von DMEM zurückgebracht, das 5 % fötales Rinderserum bei 37 °C und 5 % CO2 enthielt.

Sechs Tage nach Transfektion wurden Überstands-Aliquoten mit Triazol (BRL) extrahiert, und CAEV-gag-Nested-RT-PCR wurde durchgeführt, wobei eine 173-bp-Sequenz amplifiziert wurde. Transfizierte Zellen, die beide Fragmente erhielten, entweder Phosphatase-behandelt oder ligiert, bildeten ein amplifiziertes 173-bp-Fragment aus dem extrahierten Überstand.

Transfektion der CHIV-Konstrukte in GSM oder RD-5-Zellen erfolgt ähnlich, und der Kulturüberstand wird auf Produktion von rekombinantem chimärem Virus getestet.

BEISPIEL III BESTIMMUNG DES WIRTSBEREICHS VON CHIV

Der Wirtszellenbereich lebensfähiger Chimären wird wie von Luciw et al. beschrieben (Luciw et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 7490-7494 (1995)) durch Impfen der folgenden Zellkulturen mit einem CHIV-Virusausgangsmaterial, gebildet durch transfizierte Zellen, wie zuvor beschrieben, oder durch darauf folgende Passage, und die, sofern erforderlich, auch konzentriert werden können: menschliche und Makaken-PBMC und -Makrophagen, GSM-Zellen und CD4+-Zelllinien HUT78 und CEMX174. Reihenverdünnungen des viralen Ausgangsmaterial können verwendet werden, um die Kulturen zu impfen, und eine typischerweise verwendete Menge an Viren kann im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 1×106 TCID50 liegen. Expression chimärer Gene in den Kulturen wurde durch RT-Tests sowie CAEV-gag- und HIV-1-env-RT-PCR wie in den Transfektionsexperimenten bewertet. Weiters wurden RT-PCR-Produkte sequenziert, um die Identität der exprimierten Gene zu bestätigen. Virale Proteinproduktion wird mittels immunologischer Verfahren wie in den Transfektionsexperimenten und sofern erforderlich mittels Immunfällung radioaktiv markierter Kulturüberstände oder -lysate, beispielsweise mit 35S-Methionin markiert, beobachtet. Kulturen werden mittels mikroskopischer Beobachtung auf Synzytiumbildung oder zytopathische Eigenschaften untersucht.

In-vitro-Vermehrung von CHIV in Makaken-PBMC: PBMC wurde aus 10 ml Blut von zwei nichtimmunisierten Makaken hergestellt und in 6-Well-Mikrotiterplatten (Falcon), 3×106 Zellen/Well in RPMI, 10 % fötales Rinderserum und 10 &mgr;g/ml PHA, ausplattiert. Nach 24 Stunden wurden 0,5 ml virales Inokulat oder Medium pro Well zugesetzt. Die Kulturen werden nach 4 Tagen geerntet, und die Zellen und Überstände werden getrennt und mit Trizol für Nested-gag-RT-PCR extrahiert.

In-vitro-Vermehrung von CHIV in menschlichen PBMC: PBMC werden von einem menschlichen, CAEV- und HIV-1-negativen Spender durch Ficoll-Dichtezentrifugation hergestellt. PBMC werden den 24-Well-Mikrotiterplatten (Falcon 3047), 0,8×106 Zellen/Well in RPMI, 10 % menschliches AB-Serum und 10 &mgr;g/ml PHA, zugesetzt. Nach 24 Stunden werden 200 &mgr;l virales Inokulat zugesetzt. Nach 4 weiteren Tagen werden die Kulturen geerntet, und die Zellen und Überstände werden durch Zentrifugation getrennt. Die Zellen werden 3× in PBS, pH 7,4, gewaschen. Extraktionen von genomischer DNA, zellulärer RNA und Überstands-RNA sowie PCR und RT-PCR werden unter Verwendung von Nested-CAEV-gag-Primer wie zuvor beschrieben durchgeführt.

Detektion reverser Transkriptaseaktivität, gebildet durch virale Passage: PHA-stimulierte, menschliche PBMC von einem PCR-(–)-Spender werden in 24-Well-Mikrotiterplatten ausplattiert und mit dem CHIV-Virusinokulat (105 TCID50/Well) geimpft. Gleichzeitig werden zellfreie Aliquoten des CHIV-Virusinokulats in den CO2-Inkubator platziert. Aliquoten von Kulturüberständen werden an den Tagen 0, 2 und 6 gesammelt, und RT-Tests werden wie beschrieben durchgeführt (Cheng-Mayer et al., J. Virol. 64(9), 4390–4398 (1990)). Kurz zusammengefasst werden 15 &mgr;l zellfreier Überstand in zweifacher Ausführung in 96-Wellplatten aliquot aufgeteilt und mit 50 &mgr;l 32P-TTP einer Reagenzienmischung aus 50 mM Tris, pH 7,8, 75 mM KCl, 2 mM DTT, 5 mM MgCl2, 5 &mgr;g/ml Poly-A-Matrize, 6,2 &mgr;g/ml Oligo-dT-12-18-Primer, 0,05 NP40, 0,5 mM EGTA und 10 &mgr;Ci/ml 32P vermischt. Die Platten werden in einer Feuchtkammer bei 37 °C 1,5–2 Stunden lang inkubiert, und anschließend werden 10 &mgr;l aus jedem Well auf CD81-Filterpapier aufgesprenkelt und 30 Minuten lang luftgetrocknet. Das Filter wird dann fünfmal mit 1x SSC und einmal mit Ethanol gewaschen. Radioaktive Inkorporation wird unter Verwendung eines Phosphor-ImagerTM quantitativ gemessen.

BEISPIEL IV HERSTELLUNG EINES CHIV-VIRUSAUSGANGSMATERIALS

Der Kulturüberstand aus einer 3H-Uridin-markierten, CHIV-bildenden Wirtszellenkultur wird Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation unterzogen. Die Anordnungen der retroviralen Teilchen werden durch Sammeln von Fraktionen aus dem Gradienten und Testen auf Radioaktivität und reverse Transkriptaseaktivität bestimmt. Alternativ dazu können die Kulturen unmarkiert sein, und immunologische Verfahren können verwendet werden, um Fraktionen, die Virusproteine enthalten, zu identifizieren.

BEISPIEL V EIN TIERMODELL FÜR CHIV-INFEKTION

Es wird eine In-vivo-Infektion an Makaken durchgeführt, um zu bestimmen, ob das CHIV pathogen ist und ob sich auf CHIV-Infektion HIV-1-stammspezifische Immunantworten entwickeln. Pathogenität wird durch ein rasches Sinken der Zellzahl des Zelltyps, den das Virus infiziert, bestimmt. Pathogenität kann durch steigende Konzentrationen an Virämie nachgewiesen werden, was zu positiver haemolytischer Coomb-Anämie oder Thrombozytopenie führen kann. Pathogenität kann auch durch klinische Symptome wie Gewichtsverlust oder Vergrößerung der periphären Lymphknoten nachgewiesen werden. Ein CHIV, das auf solche Pathogenität hinweist, kann durch Substituieren entsprechender HIV-1-Sequenzen im CHIV durch zusätzliche CAEV-Sequenzen nachgebaut werden.

Verfahren: Einem gesunden erwachsenen Makaken werden über die femorale Vene 10 ml CHIV-Virusinokulat, das von etwa 7×102 bis etwa 7×104 TCID50, vorzugsweise etwa 7×103 TCID50, enthält, transfundiert. Blut wird dem Makaken in etwa 4-Wochen-Abständen zur PBMC-Isolierung und zur RT-PCR abgenommen. Nested-gag- und -env-RT-PCR zellulärer RNA werden wie zuvor beschrieben durchgeführt.

BEISPIEL VI VERWENDUNG EINER CHIV-VAKZINE ZUM IMPFEN EINER PERSON

Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Verabreichung einer CHIV-Vakzine an eine Person zur Stimulierung einer Immunantwort.

Das CHIV-Virus wird durch Impfen einer Wirtszelle wie zuvor beschrieben gebildet. Zellüberstände werden geerntet, und CHIV-Virionen werden durch Zentrifugieren bei 150.000 × g bei 4 °C pelletiert, um eine sterile Suspension von etwa 2 × 108 pfu/ml, die 50 % Glycerin als Verdünnungsmittel enthält, zu bilden (siehe Graham et al., J. Infect. Dis. 166, 244–252 (1992)). Die Empfänger des Lebendvirus werden unter Verwendung einer sterilen, gegabelten Nadel mit 50 &mgr;l CHIV-Suspension an einer einzelnen Hautstelle intradermal geimpft. Impfungen können auch unter Verwendung eines getöteten oder abgeschwächten CHIV-Präparats oder eines anderen CHIV-Immunogens, beispielsweise eines DNA-Konstrukts, das das CHIV-Virusgenom enthält, durchgeführt werden. Ein transparenter Sterilverband wird an der Impfstelle angebracht und entfernt, nachdem sich eine Kruste gebildet hatte.

Blutproben werden an oder etwa an den Tagen 14, 28 und 54 nach der Verabreichung des CHIV-Immunogens entnommen und bewertet, um Antikörpertiter (humorale Reaktion) oder T-Helferzellen- oder zytotoxische T-Zellimmunantwort (zelluläre Reaktion) zu bestimmen. Verfahren zur Untersuchung der humoralen und zellulären Antworten sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (siehe beispielsweise Egan et al., J. Infect. Dis. 171, 1623–1627 (1995); siehe auch Narlow & Lane, s.o. (1988)). Sofern erwünscht wird eine sekundäre (Booster-) Impfung an oder etwa an Tag 56 nach der ersten Impfung verabreicht. Zusätzliche Bewertungen humoraler und zellulärer Reaktionen erfolgen an oder etwa an den Tagen 70, 90, 160, 180, 270 und 355 nach der ersten Impfung. Sofern erwünscht wird eine tertiäre (Booster-) Impfung an oder etwa an Tag 365 oder später, wie erforderlich, verabreicht. Die Bildung von HIV-1-env- und CAEV-gag-Proteinen in der Person kann auf Grundlage der Blutproben durch gp-120-Capture-ELISA und CAEV-p28-Western-Blotting getestet werden.

BEISPIEL VII NACHWEIS NEUTRALISIERENDER ANTIKÖRPER BEI MIT CHIV GEIMPFTEN MENSCHEN

Dieses Beispiel beschreibt das Verfahren, das für den Nachweis verwendet wird, dass CHIV-infizierte Personen eine Immunantwort auf CHIV-Antigene hervorbringen.

Blutproben und Reagenzien:

Blutproben von Menschen und Ziegen werden gesammelt, und die Serumkomponente wird für immunologisches Testen verwendet. Die in den ELISA- und Western-Blotting-Tests zur Messung der Konzentration an Serumantikörper verwendeten Antigene umfassen rohes CHIV und CAEV sowie rekombinantes HIV-1 gp120 und p24, erworben bei Intracel (Shepreth UK).

Das CHIV-Virus wird aus einer exprimierenden Wirtszellkultur wie GSM- oder RD-5-Zellen, wie zuvor beschrieben, hergestellt. Das Medium von CHIV-infizierten Kulturen wird gesammelt und durch Zentrifugation bei 600 × g geklärt. Aliquoten des rohen CHIV-Präparats können gefroren bei –70 °C gelagert werden. Das rohe CHIV-Präparat kann verwendet werden, um gereinigtes CHIV zu isolieren, oder es kann verwendet werden, um gereinigte Proteine herzustellen.

HIV-1-ELISA und Western-Blotting-Tests:

Zertifizierte HIV-1- und Western-Blotting-Diagnosesets werden bei Organon Teknika (Cambridge UK) erworben, und die Tests werden gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.

ELISA und Western-Blotting-Tests werden unter Verwendung der einzelnen rekombinanten HIV-1-Antigene, gp120 und p24, und HRP-konjugierter Kaninchen-Anti-Ziegen- und Ziegen-Anti-Menschen-Sekundärantikörper (Zymed Laboratories Inc.), wie bereits beschrieben wurde (Douvas & Takehana, AIDS Res. Hum. Retrovir. 10, 253–262 (1994); Crow et al., Cell. Immunol. 121, 99–112 (1989)), durchgeführt.

HIV-1-Virusneutralisierungstest:

Virusneutralisierungstests werden in 48-Well-Gewebekulturplatten unter Verwendung von PHA-aktivierten normalen Spender-PBMC, die in Wachstumsmedium bei einer Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml als Targets für Infektion aufbewahrt wurden, durchgeführt. Verschiedene Verdünnungen von HIVIGTM, wärmeaktivierte (56 °C, 30 min) Seren oder gereinigtes IgG werden mit 10 oder 50 TCID50 Viren 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.

Negativkontrollen für die Seren und für HIVIGTM umfassen wärmeaktiviertes Serum von Personen, die nicht mit HIV-1 infiziert und nicht von einer systemischen rheumatischen Erkrankung betroffen sind, bzw. IVIGTM. HIVIGTM, das ein neutralisierendes IgG-Präparat aus gepooltem Serum von 9 seropositiven Spendern in Frühstadien von HIV-1-Infektion ist, und IVIGTM, das IgG von normalen Spendern ist, werden von North American Biologicals Inc. (Miami FL) erhalten. Alternativ dazu können andere Quellen für HIV-1-neutralisierende Antikörper und Kontrollantikörper verwendet werden. TCID50 wird unter Einsatz von Routineverfahren zum viralen Titrieren bestimmt.

Nach Inkubation des Serums oder IgG mit dem Virus werden den Targetzellen in dreifacher Ausfertigung Serum/IgG-Virus-Gemische zugesetzt. Nach einer Über-Nacht-Inkubation bei 37 °C werden die Platten bei 1.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert, und das Medium wird vollständig ersetzt. Dieser Waschschritt wird dreimal wiederholt, um vollständiges Entfernen des Serum/IgG-Virus-Impfmaterials sicherzustellen. Am Tag 4 der Kultur wird das Medium ausgetauscht, und an Tag 7 wird der Überstand zur Quantifizierung von p24-Kernantigenen geerntet. Prozentuelle Hemmung wird durch Vergleichen der mittleren p24-Kernantigen-Konzentration in jedem Serum/IgG-behandelten Gewebekultur-Well mit jener der spezifischen Negativkontrolle bestimmt.

Gleichzeitig wird eine Kontrolle hergestellt, um jegliche nicht-spezifische Reduktion in der Menge, die für p24-Kernantigen gemessen wurde, aufgrund eines Serums oder HIVIGTM, das nicht vollständig durch die Waschschritte entfernt wurde, zu messen. Zu dem Zeitpunkt, zu dem die Serum/IgG-Virusgemische den Targetzellen zugesetzt werden, werden auch die Seren, IVIGTM oder HIVIGTM den Targetzellen ohne Präinkubation mit Viren zugesetzt. Diese Wells werden gleichzeitig mit den Experimentkulturen behandelt. Nach 7 Tagen Kultivieren wird der Überstand aus jedem Well 1:1 mit jenem der Negativkontrolle gemischt, und die p24-Antigenkonzentration wird quantifiziert. Eine Messung, die weniger als 50 % des Wertes der Negativkontrolle beträgt, wird als nicht-spezifische Hemmung von p24-Antigen erachtet, die auf die Gegenwart von verbleibenden p24-Antikörpern zurückgeführt werden kann.

Obwohl die Erfindung unter Verweis auf die obigen Beispiele beschrieben wurde, gilt anzumerken, dass verschiedene Modifikationen durchgeführt werden können, ohne von der der Erfindung zugrunde liegenden Idee abzuweichen. Demgemäß ist die Erfindung nur durch die beiliegenden Patentansprüche eingeschränkt. Alle zuvor zitierten Verweise sind in ihrer Gesamtheit hierin aufgenommen.


Anspruch[de]
  1. Polynucleotid, umfassend ein chimäres retrovirales Genom (CHIV), worin das chimäre retrovirale Genom Expressionssteuerungssegmente umfasst, die seine Expression in einer Säugetierwirtszelle steuern, und worin das durch Exprimieren des retroviralen Genoms in einer Wirtszelle produzierte retrovirale Partikel eine Immunreaktion gegen HIV-1 bewirkt, jedoch für einen Primaten nicht pathogen ist, dadurch gekennzeichnet, dass das chimäre retrovirale Genom aus einem viralen Ziegen-Arthritis-Encephalitis-Virus- ("Caprine Encephalitis Virus"-, CAEV-) Genom besteht, worin das CAEV-Hüllen-Gen durch das HIV-1-Hüllen-Gen substituiert ist.
  2. Polynucleotid nach Anspruch 1, worin zusätzlich die HIV-1-tat- und/oder -rev-Gene anstelle der entsprechenden CAEV-Gene substituiert sind.
  3. Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2, worin das HIV-1-env-Gen aus dem SF33- oder dem SF162-Stamm von HIV-1 erhalten ist.
  4. Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2, worin das HIV-1-env-Gen um nicht mehr als 15 % vom env-Gen der HIV-1-Stämme SF33 und SF162 abweicht.
  5. Gereinigtes Retrovirus, umfassend ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
  6. Vakzine, umfassend ein CHIV-Immunogen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, worin das CHIV-Immunogen ein Polynucleotid nach Anspruch 1 oder ein retrovirales Partikel-Expressionsprodukt davon ist.
  7. Vakzine nach Anspruch 6, worin das CHIV-Immunogen ein gereinigtes Retrovirus ist.
  8. Vakzine nach Anspruch 6, worin das CHIV-Immunogen ein gereinigtes Polynucleotid ist, das ein chimäres CHIV-Retrovirus-Genom umfasst.
  9. Verwendung eines CHIV-Immunogens nach Anspruch 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Prophylaxe gegen oder Behandlung von HIV-Infektionen.
  10. Verwendung eines Lymphozyten, der in vitro mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines CHIV-Immunogens nach Anspruch 6 kontaktiert wird, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Prophylaxe gegen oder Behandlung von HIV-Infektionen.
  11. Verfahren zur Herstellung eines viralen Präparats, umfassend das Einführen eines Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in eine Säugetierwirtszelle, die fähig ist, das retrovirale Genom zu exprimieren, das Kultivieren der Wirtszellen in einem Medium, sodass virale Partikel produziert werden, und das Reinigen der viralen Partikel aus dem Kulturmedium.
Es folgen 6 Blatt Zeichnungen






IPC
A Täglicher Lebensbedarf
B Arbeitsverfahren; Transportieren
C Chemie; Hüttenwesen
D Textilien; Papier
E Bauwesen; Erdbohren; Bergbau
F Maschinenbau; Beleuchtung; Heizung; Waffen; Sprengen
G Physik
H Elektrotechnik

Anmelder
Datum

Patentrecherche

Patent Zeichnungen (PDF)

Copyright © 2008 Patent-De Alle Rechte vorbehalten. eMail: info@patent-de.com