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Dokumentenidentifikation DE102004022574A1 29.12.2005
Titel Identifizierung des Tollwutvirus Phosphorproteins P als Interferon-Antagonist und dessen Anwendungen
Anmelder Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr., 82061 Neuried, DE
Erfinder Conzelmann, Karl-Klaus, Dr., 82061 Neuried, DE;
Finke, Stefan, Dr., 80689 München, DE;
Brzózka, Krzysztof, 80802 München, DE
Vertreter Dr. Volker Vossius, Corinna Vossius, Tilman Vossius, Dr. Martin Grund, Dr. Georg Schnappauf, 81679 München
DE-Anmeldedatum 07.05.2004
DE-Aktenzeichen 102004022574
Offenlegungstag 29.12.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.12.2005
IPC-Hauptklasse A61K 39/12
IPC-Nebenklasse A61K 39/295   C07H 21/00   C12N 15/86   
Zusammenfassung Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Phosphoprotein P (P Protein) oder einer Nukleinsäuresequenz, die P Protein kodiert, für die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung zum Modulieren der IFN-Antwort für die Behandlung einer entzündlichen Funktionsstörung. Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung eines rekombinanten Rhabdovirus, das eine modifizierte P kodierende Nukleinsäuresequenz trägt, für die Herstellung eines Impfstoffes, wobei die Modifizierung die Fähigkeit des Virus, der durch IFN vermittelten Wirtsimmunantwort zu entgehen, reduziert oder zerstört oder verstärkt.

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung

Das Typ I Interferon (&agr;/&bgr;-Interferon, IFN) System stellt ein entscheidendes und potentes Element der Abwehrmechanismen höherer Organismen gegen Viren und andere Pathogene dar (1). Die Transkription von &agr;/&bgr;-IFN Genen wird durch Virusinfektion in den meisten Zelltypen induziert. Die Bindung von sekretierten Interferonen an den IFN &agr; Rezeptor (IFNAR) aktiviert JAK/STAT Signalübertragungswege, die in der Expression einer großen Zahl von IFN-stimulierten Genen (ISGs) gipfeln.

Diese beinhalten Gene, die Enzyme mit antiviraler Funktion kodieren, wie das Mx Protein, die 2'-5' Oligoadenylatsynthetase, oder PKR. Zusätzlich können ISGs Zellwachstum inhibieren und Apoptose fördern und dadurch die Virusausbreitung einschränken.

Darüber hinaus stimuliert IFN allein und in Zusammenarbeit mit anderen Zytokinen Mechanismen der adaptiven Immunantwort wie MHC Expression, Aktivierung von NK Zellen, Reifung von dendritischen Zellen und treibt die T-Helferzell Antwort in Richtung des Th1 Typs. IFN ist deshalb ein potentes Adjuvans. In Tierexperimenten ist gezeigt worden, dass IFN-induzierende Viren bessere Immunogene sind als nicht-induzierende Viren.

Um eine Infektion eines immunkompetenten Wirtes erfolgreich zu etablieren, müssen Viren Mechanismen entwickelt haben, die effizient mit der Funktion des IFN Systems interferieren. Tatsächlich sind in den letzten Jahren für Vertreter der meisten Virusgruppen, einschließlich der Negativ Strang RNA Viren, spezifische IFN Antagonisten identifiziert worden (1).

Diese können mit der IFN Gen-Induktion, der IFN- Signalübertragung, oder mit der Aktivität von ISGs interferieren. Das NS1 Protein des Influenza A Virus bindet und maskiert virale Doppelstrang RNA und verhindert dadurch deren Erkennung und die IFN Antwort (1).

Vertreter der Paramyxovirinae Unterfamilie kodieren zusätzliche, kleine nicht-essentielle Proteine wie V und C, die vom Phosphoprotein (P) Gen durch alternative Translationsinitiation und mRNA-Editing exprimiert werden (3). Sowohl V und C Proteine interferieren mit der IFN JAK/STAT Signalübertragung, können aber unterschiedliche Angriffsziele in diesem Signalweg haben. Zum Beispiel induziert das V Protein des Simian Virus 5 die Degradierung von STAT1, während das V Protein des Humanen Parainfluenzavirus Typ 2 zur Degradierung von STAT2 führt (4).

Die C Proteine des Sendai Virus inhibieren die IFN Signalübertragung durch Interaktion mit STAT1 und JAK1 (5). Die Interferonresistenz des Respiratorischen Synzytialvirus (RSV) der Pneumovirinae Unterfamilie der Paramyxoviren, Gattung Pneumovirus, wird durch eine gemeinsame Aktion von zwei Nichtstrukturproteinen, NS1 und NS2 vermittelt, (6). In diesem Fall sind allerdings IFN Signalübertragung und Expression von IFN-stimulierten Genen nicht beeinflusst. Für die NS Proteine von RSV als auch die V Proteine von Paramyxovirinae wurde kürzlich gezeigt, dass sie IFN-Induktion verhindern können (6). Während die RSV NS Proteine spezifisch die Aktivierung des essentiellen IFN Transkriptionsfaktors IRF-3 blockieren (7), interferieren die V Protein von Paramyxovirinae mit der Aktivierung von IRF-3 und NF-kB, was zur Hemmung von IFN und Entzündungsgenen führt (3).

Auch Filoviridae kodieren einen IFN Antagonisten; für VP35 des Ebola Virus wurde bereits gezeigt, dass es Induktion von IFN verhindert. Während die Paramyxovirus V und C Proteine und die RSV NS Proteine nicht äquivalent zu Paramyxovirus und Rhabdovirus P Proteinen sind (9), scheint VP35 ein Ortholog von P zu sein (10), obwohl die Filovirus VP35 Proteine nur schwach phosphoryliert sind (11).

Im Gegensatz zu den Paramyxoviren sind Vertreter der Rhabdoviridae wie das Tollwutvirus (Rabies Virus, RV) oder das Vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) sensitiv gegenüber exogenem IFN und müssen deshalb die IFN Induktion vermeiden. Für VSV wurde die fehlende IFN Induktion mit der Aktivität des viralen Matrixproteins (M) korreliert, das ein generelles Abschalten der Wirtszell-Genexpression verursacht (Übersicht in Lyles, 2000), einschließlich der IFN Gene (Ahmed et al. and Lyles, 2003).

Im Vergleich zu VSV wächst RV langsamer, ist viel weniger zytopathogen, und ein generelles Abschalten der Wirtszelle wird nicht beobachtet, was die Expression von Wirtzszellgenen während der gesamten Infektion erlaubt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Identifizierung des Tollwutvirus Interferon-Antagonisten, des Phosphoproteins P, auf die Anwendung des besagten Interferon-Antagonisten zur Modulierung der zellulären Interferon Immunantwort (Interferonantwort) und auf die Herstellung von rekombinanten Rhabdoviren und Virusvektoren, die mutierte Interferonantagonisten mit veränderter Interferon-antagonistischer Aktivität exprimieren.

Insbesondere ist die Erfindung ausgerichtet auf die Anwendung des Phosphoproteins P (P Protein) oder einer Nukleinsäuresequenz, die das P Protein kodiert, zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung zur Modulierung der IFN-Antwort für die Behandlung von entzündlichen Krankheiten.

In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf die Anwendung des Phosphoproteins P für die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung für die Behandlung, Verhinderung oder Verbesserung von Symptomen einer entzündlichen Erkrankung.

Die Formulierungen sind geeignet, um Immunerkrankungen, die durch eine aberrante Interferonexpression und/oder Aktivität charakterisiert sind, zu verhindern, zu behandeln oder zu mildern.

Weiterhin sind die Zusammensetzungen geeignet, eine Funktionsstörung des Th1/Th2 Gleichgewichts zu behandeln.

In einer Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf die Anwendung von Lebendvirus Impfstoffen mit durch IFN Induktion vermittelter, verbesserter Antigenität und Virusvektor-Formulierungen mit bevorzugtem Wachstum in IFN-inkompetenten Tumoren und die Behandlung von solchen Tumoren im Rahmen von onkolytischen, virotherapeutischen Ansätzen.

In einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegenden Erfindung auf eine Methode, das Wirtszellspektrum von Rhabdoviren zu ändern, wobei die P kodierende Nukleinsäuresequenz durch eine P kodierende Nukleinsäuresequenz ersetzt ist, die von einem Rhabdovirus das in der Lage ist, den gewünschten Wirt zu infizieren, abgeleitet ist.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Vertreter der Rhabdoviridae wie das Tollwutvirus (RV) oder das Vesikuläre Stomatitis Virus (VSV) sind sensitiv gegenüber exogenem IFN und müssen deshalb IFN-Induktion vermeiden. Für VSV ist die fehlende IFN Induktion mit der Aktivität des viralen Matrixproteins (M) korreliert, das ein generelles Abschalten der Wirtszell-Genexpression verursacht, einschließlich der IFN Gene.

Da RV langsamer wächst, viel weniger zytopathogen ist und ein generelles Abschalten der Wirtszelle nicht beobachtet wird, was die Expression von Wirtzszellgenen während der gesamten Infektion erlaubt, folgerten wir, dass RV spezifische Mechanismen zur Verhinderung der IFN-Induktion kodieren muss.

Das RV Genom enthält fünf Gene, die für Nukleoprotein (N), Phosphoprotein (P), Matrixprotein (M), Glykoprotein (G) und Polymerase (L) in der Reihenfolge 3'-N-P-M-G-L-5' kodieren. Die M und G Proteine sind hauptsächlich an der Bildung der viralen Hülle beteiligt. N, P und L sind Bestandteile des viralen Ribonukleoproteins, und jedes ist für die Ausfuhrung der RNA Synthese essentiell. Verpackung der viralen RNA durch N ist erforderlich, um eine geeignete Matrize für die virale Polymerase (L) bereitzustellen.

Das P Protein wird durch zelluläre Kinasen phosphoryliert und liegt in Homo-Oligomeren vor. Es assoziiert sowohl mit dem L Protein, um als essentieller nicht-katalytischer Kofaktor für RNA-Polymerisierung zu fungieren, und mit N Protein, um spezifische und richtige RNA Verpackung in einer Chaperon-ähnlichen Art zu unterstützen.

Zusätzlich zum P Protein voller Länge (P1) wurden aminoterminal verkürzte Produkte (P2, P3, P4), die von internen AUG-Initiationskodons im Leseraster durch einen leaky scanning Mechanismus translatiert werden, in gereinigten RV und in infizierten Zellen gefunden. Darüber hinaus enthält das RV P Gen einen zweiten Offenen Leserahmen, der in Analogie zu ähnlichen ORFs im VSV P Gen als C bezeichnet wird. Während für VSV C Proteine gezeigt worden ist, dass sie exprimiert werden, ist die Existenz eines RV C Proteins unklar.

Das RV P Protein besteht aus 297 Aminosäuren und ist entscheidend in zahlreiche Ereignisse während des viralen Lebenszyklus involviert, einschließlich der korrekten Ausbildung von viralen RNPs und der viralen RNA Synthese. In Rhabdovirus-infizierten Zellen wird P durch zelluläre Kinasen phosphoryliert und liegt in Form von Homooligomeren vor. Man glaubt, dass die Bindung von P an N dieses formt, sodass es spezifisch die virale RNA verpackt und sie zu einer geeigneten Matrize für die RNA-Synthese durch den viralen Polymerasekomplex macht. Zusätzlich ist P ein essentieller Kofaktor des Polymerasekomplexes selbst und es wurde gezeigt, dass es direkt das katalytische L Protein bindet. RV P Protein kann auch in Interaktionen mit zellulären Faktoren involviert sein, die für eine in vivo Infektion wichtig sind. Für P wurde gezeigt dass es an Dynein Light Chain 1 bindet, was auf eine Funktion beim Transport von RNPs durch Motorproteine hindeutet. Zusätzlich zu P Protein voller Länge (P 1) sind aminoterminal verkürzte Produkte (P2, P3, P4), welche von internen AUG-Initiationskodons im Leserahmen durch einen leaky scanning Mechanismus translatiert werden, in gereinigten RV und in infizierten Zellen gefunden worden. Für eine dieser N-terminal verkürzten Formen (P3) ist beschrieben worden, dass sie in den Zellkern eindringt und mit PML Körpern ko-lokalisiert, wenn es in Abwesenheit der anderen exprimiert wird. Darüber hinaus enthält das RV P Gen einen zweiten Offenen Leserahmen, der in Analogie zu ähnlichen ORFs im VSV P Gen als C bezeichnet wird. Während für VSV C Proteine gezeigt worden ist, dass sie exprimiert werden, ist die Existenz eines RV C Proteins unklar.

Die vorliegende Erfindung eröffnet die Anwendung von P Protein oder einer Nukleinsäuresequenz, die P Protein kodiert, zur Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen zur Modulierung der IFN-Antwort.

Die Modulierung der IFN-Antwort auf eine antivirale oder immunologische Reaktion kann als wichtiges Hilfsmittel zur Behandlung, Verhinderung oder Verbesserung eines oder mehrerer Symptome, die mit einer inflammatorischen Funktionsstörung zusammenhängen, in einem Subjekt angewendet werden. Die pharmazeutische Komposition, die P Protein enthält, kann einem Subjekt, das dies braucht, in einer prophylaktisch oder therapeutisch effektiven Menge verabreicht werden.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die pharmazeutische Formulierung auch nützlich zur Behandlung, Verhinderung oder Verbesserung eines oder mehrerer Symptome, die in Zusammenhang mit einer Th1/Th2 Gleichgewichts-bezogenen Immunfunktionsstörung stehen, in einem Subjekt. Die pharmazeutische Formulierung, die P Protein enthält, kann dem Subjekt, das dies braucht, in einer prophylaktisch oder therapeutisch effektiven Menge verabreicht werden.

Entsprechend der vorliegenden Erfindung ist die Nukleinsäuresequenz, die P Protein kodiert, DNA oder RNA. Die besagte Sequenz kann in einem Plasmid oder in einem Virusabgeleiteten Vektor oder in einem rekombinanten DNA oder RNA Virus enthalten sein. Insbesondere kann der Vektor ein viraler Gen-Fähren-Vektor sein, der für Immunisierungszwecke, für Gentherapie oder für zytoreduktive Tumortherapie angewendet werden kann.

Das Virus oder der Virus-abgeleitete Vektor gemäss der Erfindung kann von einem DNA-Virus, wie Adenovirus (AdV), Adeno-Assoziiertes Virus (AAV), Herpes Virus oder Poxvirus abgeleitet sein. Das Virus oder der Virus-abgeleitete Vektor ist vornehmlich von einem Positiv Strang RNA Virus abgeleitet, bevorzugt von Viren, die zu den Alpha-, Flavi- und Picornaviridae Familien gehören.

Das Virus oder der Virus-abgeleitete Vektor kann auch von einem segmentierten oder nicht-segmentierten Negativ Strang RNA Virus abgeleitet sein, vornehmlich aus der Familie der Paramyxoviridae, Filoviridae, Bornaviridae.

Das RNA-Virus kann von der Familie der Rhabdoviridae abgeleitet sein, bevorzugt vom Tollwutvirus.

Weiterhin kann die Nukleinsäuresequenz, die P Protein kodiert, von einem Rhabdovirus abgeleitet sein.

In einer weiteren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf die pharmazeutische Formulierung ausgerichtet, die P Protein oder eine P Protein kodierende Nukleinsäuresequenz enthält und weiter einen Impfstoff enthält.

Das P Protein gemäss der vorliegenden Erfindung kann modifiziert sein. Die Modifizierungen sind aus der Gruppe bestehend aus Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen ausgewählt. Zusätzlich resultiert die Modifikation in einer Steigerung der IFN antagonistischen Aktivität des P Proteins. Die modifiziertes P Protein kodierende Nukleinsäuresequenz kann von einem Rhabdovirus abgeleitet sein, bevorzugt von einem Tollwutvirus.

Modifizierungen in einer Proteinsequenz des P Proteins beinhalten einzelne oder multiple Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen und -Insertionen. Vorzugsweise beeinflussen die Modifikationen nicht die biologische Aktivität des Proteins in der Reduzierung der IFN vermittelten Immunantwort oder, IFN zu antagonisieren. Aminosäure-Insertionsvarianten der vorliegenden Erfindung beinhalten amino- und/oder carboxyterminale Fusionen wie auch Intra-Sequenzinsertionen von einzelnen oder mehreren Aminosäuren. Aminosäure Insertionsvarianten sind solche, bei denen eine oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle im Protein eingeführt werden, obwohl zufällsmässige Insertionen auch möglich sind, in Verbindung mit einem geeigneten Auswahlverfahren für das resultierende Produkt. Deletionsvarianten sind durch die Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren aus der Sequenz charakterisiert. Aminosäure-Substitutionsvarianten sind solche, bei denen mindestens ein Rest in der Sequenz entfernt und ein andersartiger Rest an dessen Stelle inseriert worden ist. Wünschenswerterweise ist die Proteinsequenz mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugterweise mindesten 80% und am bevorzugtesten mindestens 90% homolog zum Wildtyp.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf die Anwendung eines rekombinanten Rhabdovirus gerichtet, das eine modifizierte P kodierende Nukleinsäure für die Herstellung eines Impfstoffes trägt, wobei die Modifizierung die Fähigkeit des Virus, einer durch IFN vermittelten Wirtsimmunantwort zu entgehen, vermindert, zerstört oder verstärkt wird.

Die vorliegende Erfindung zeigt weiter eine Methode zur Veränderung des Wirtszellspektrums von Rhabdoviren auf, wobei die P kodierende Nukleinsäuresequenz durch eine P kodierende Nukleinsäuresequenz ersetzt ist, die von einem Rhabdovirus abgeleitet ist, welches in der Lage ist, den gewünschten Wirt zu infizieren.

Die pharmazeutische Formulierung gemäss der vorliegenden Erfindung kann konventionelle Komponenten enthalten, z.B. einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel wie Saline, pH Regulator, Puffer, Konservierungsstoffe und ähnliches. Derartige Bestandteile sind bekannt und können vom Fachmann ausgewählt werden.

Definitionen

Der Ausdruck "IFN" gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich vorzugsweise auf Typ I Interferon, nämlich Interferon &agr; und &bgr;.

Der Ausdruck "die IFN Antwort modulieren" wie hier verwendet, bezieht sich auf die immunisierenden und/oder antiviralen Effekte, z.B. verstärkte/verminderte Expression von MHC-Glykoproteinen, Aktivierung/Inhibierung von antiviralen Mechanismen wie die Zerstörung von Virus-infizierten Zellen, Hemmung von Virus-Replikation, die durch die Wirkung von Interferon induziert werden, insbesondere Interferon &agr; und &bgr;, als Antwort auf z.B. eine Virusinfektion.

Der Ausdruck "Immunantwort vermittelt durch IFN" bezieht sich hier auf die immunisierenden und/oder antivirale Effekte, z.B. verstärkte Expression von MHC-Glykoproteinen, Aktivierung von antiviralen Mechanismen wie die Zerstörung von Virusinfizierten Zellen, Inhibition der Virus-Replikation, induziert durch die Wirkung von Interferon, insbesondere Interferon &agr; und &bgr;, als Antwort auf z.B. eine Virusinfektion.

"Reduzieren der IFN-vermittelten Immunantort" bedeutet hier, dass die immunisierenden und/oder antiviralen Effekte, z.B. erhöhte Expression von MHC-Glykoprotein, Aktivierung von antiviralen Mechanismen wie das Zerstören von Virus-infizierten Zellen, Inhibition von Virus-Replikation, induziert durch die Wirkung von Interferon, insbesondere Interferon &agr; und &bgr;, als Antwort auf z.B. eine Virusinfektion erniedrigt sind.

Zytoreduktive Tumortherapie oder onkolytische Virotherapie bezieht sich auf Ansätze, in denen replizierende Viren verwendet werden, um Tumorellen zu zerstören- Onkolytische Viren (OV) sind replikations-„konditional" mit relativer Tumorselektivität. Unterschiedliche Mechanismen sind für Tumorspezifität verantwortlich, OVs zielen auf onkogenes ras oder defekte IFN Signalübertragungswege, defekte Tumorsuppressor-Wege, oder defekte p53 Tumorsuppressor-Wege. Targeting von OV mit Tumor-spezifischen Promotoren, Targeting mit "Tumor-selektiver" Infektion. Andere Mechanismen von OV targeting: OVs die anti-Krebs cDNAs exprimieren. Viele Tumoren haben IFN-Defekte, weshalb viele IFN sensitive Viren bevorzugt in diesen Tumoren replizieren.

Beispiele von Th1 oder Th1-ähnliche Funktionsstörungen beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf, chronische entzündliche Erkrankungen und Funktionsstörungen wie Crohn's Krankheit, Reaktive Arthritis, inklusive Lyme Krankheit, Insulin-abhängige Diabetes, Organspezifische Autoimmunität, inklusive Multiple Sklerose, Hashimoto's Thyroiditis und Grave's Krankheit, Kontaktdermatitis, Psoriasis, Transplantatabstoßung, Graft-versus-host (Transplantat gegen Empfänger) Krankheit und Sarkoidose.

"IFN antagonistische Aktivität" gemäss der vorliegenden Erfindung bedeutet dass immunisierende und/oder antivirale Effekte, z.B. erhöhte Expression von MHC-Glykoproteinen, Aktivierung von antiviralen Mechanismen wie die Zerstörung von virusinfizierten Zellen, Inhibition von Virus-Replikation, induziert durch die Wirkung von Interferon, insbesondere Interferon &agr; und &bgr;, als Antwort auf z.B. eine Virusinfektion vermindert oder eliminiert sind.

Die Ausdrücke "modifiziert" oder "verändert" gemäss der vorliegenden Erfindung beziehen sich auf den Wildtyp, der als Referenz dient.

Mit "Nukleinsäuresequenz" wie hier verwendet ist jede zusammenhängende Sequenz von Nukleotid-Basen gemeint und kann Ribonukleinsäure und Desoxyribonukleinsäure sein. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure cDNA.

Modifizierungen in einer Proteinsequenz von P Protein beinhaltet einzelne oder mehrere Aminosäure-Substitutionen, Deletionen und Insertionen. Vorzugsweise beeinflussen die Modifikationen nicht die biologische Aktivität der Proteine, die durch IFN vermittelte Immunantwort zu reduzieren oder IFN zu antagonisieren. Aminosäure Insertionsvarianten der vorliegenden Erfindung beinhalten amino- und/oder carboxyterminale Fusionen als auch intra-Sequenz Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren. Aminosäure Insertionsvarianten sind solche, in denen eine oder mehrere Aminosäurereste in eine vorbestimmte Stelle im Protein eingeführt wurde obwohl zufallsmässige Insertion ebenfalls in Verbindung mit einem geeigneten Screening für das resultierende Produkt möglich sind. Deletionsvarianten sind charakterisiert durch die Entfernung einer oder mehrerer Aminosäuren aus der Sequenz. Substitutions-Aminosäurevarianten sind solche, in denen mindestens ein Rest in der Sequenz entfernt worden ist und ein anderer Rest an dessen Stelle inseriert wurde. Wünschenswerterweise ist die Proteinsequenz mindestens 40%, vorzugsweise mindestens 50%, bevorzugterweise mindesten 80% und am bevorzugtesten mindestens 90% homolog zum Wildtyp.

Bevorzugte Modifizierungen sind an Positionen, die in verschiedenen Spezies nicht konserviert sind. Vorzugsweise ersetzen solche Modifizierungen eine Aminosäure ähnlicher Größe und Polarität. Im Hinblick auf die Art der Substitutionen, die gemacht werden können, kann zunächst auf Analysen der Häufigkeiten von Aminosäureaustauschen zwischen homologen Proteinen verschiedener Organismen geachtet werden. Basierend auf solche Analysen sind konservierte Substitutionen definiert als Austausche innerhalb der Gruppen die unten aufgeführt sind.

  • 1. kleine aliphatische, nichtpolare oder schwach polare Reste: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
  • 2. negativ geladene Reste und ihre Amide: Asn, Asp, Glu, Gln
  • 3. positiv geladene Reste: His, Arg, Lys
  • 4. große aliphatische, nichtpolare Reste: Met, Leu, Ile, Val (Cys)
  • 5. große aromatische Reste: Phe, Tyr, Trp.

Drei Reste sind aufgrund ihrer speziellen Rolle bei der Proteinarchitektur in Klammern gesetzt. Gly ist der einzige Rest ohne Seitenkette und verleiht der Kette deshalb Flexibilität. Pro hat eine ungewöhnliche Geometrie welche die Flexibilität der Kette stark beschränkt. Cys kann an Disulfidbindungen beteiligt sein.

Weiterhin können Modifikationen, wie oben ausgeführt, in die Proteinsequenz des P Proteins eingeführt werden, was in einer Erhöhung oder Reduzierung der biologischen Aktivität der Proteine, die IFN vermittelte Immunantwort abzuschwächen oder IFN zu antagonisieren, resultiert.

Beschreibung der Abbildungen

1 zeigt die Sequenz des P-Phosphoproteins des Tollwutvirusstammes SAD L16.

2 zeigt die Sequenz der P1*** – Knock-out Mutante des Phosphoproteins mit einer Met>Ile Substitution an den an Positionen 20, 53, 83.

3 zeigt die Sequenz der P1**4 – Knock-out Mutante des Phosphoproteins mit einer Met>Ile Substitution an den an Positionen 20, 53.

4 zeigt die Sequenz der P1*3* – Knock-out Mutante des Phosphoproteins mit einer Met>Ile Substitution an den an Positionen 20, 83.

5 zeigt die Sequenz der P12** – Knock-out Mutante des Phosphoproteins mit einer Met>Ile Substitution an den an Positionen 53, 83.

6 zeigt die Sequenz des PdC – Phosphoproteins mit einem Basenpaaraustausch an Position 384 T>C.

7 zeigt die Sequenz des eGFP-P – Fusionsproteins von P Phosphoprotein mit eGFP am N-terminus.

8 zeigt einen Vergleich der obigen Mutanten.

9 zeigt die Sequenz des Phosphoproteins des attenuierten Stammes SAD B19 welcher die Basis Für die L 16 Mutanten ist.

10 zeigt rekombinantes IFN-induzierende und nicht-induzierende Tollwutviren.

11 zeigt, dass IFN-induzierende RV in Hep-2 Zellen attenuiert sind.

12 zeigt, dass von transfizierten Piasmiden exprimiertes RV P Protein IFN Induktion inhibiert.

Wir legen hier offen, dass das P Protein des RV zusätzlich zu seinen oben genannten Funktionen bei der RNA Synthese für die Inhibition der IFN Induktion in RV-infizierten Zellen verantwortlich ist. RV Replikons, die die N, P, und L Gene enthalten, bewahren vollständig die Fähigkeit, IFN Expression in HEp-2 Zellen zu supprimieren, was eine substantielle Beteiligung von M ausschließt. Weder verkürzte P Produkte noch das hypothetische C Protein wurden für die Verhinderung von IFN benötigt, wie durch rekombinante Viren, in denen die Expression der Proteine durch gezielte Mutagenese der entsprechenden Translationsinitiationskodons abgestellt war, demonstriert wurde. Diese Mutanten induzierten IFN nicht und vermehrten sich gut in IFN-kompetenten HEp-2 Zellen. Obwohl P für die RNA Synthese benötigt wird, war es möglich, nicht-defiziente und IFN-induzierende rekombinante RV zu erzeugen. Dies wurde erreicht durch die Reduzierung der Expressionslevel von P durch Verschieben des P Gens zum 5' Ende des Virusgenoms. Zusätzlich wurde ein IFN-induzierendes RV generiert durch die Fusion von eGFP an den N-Terminus von P. Die Viren, die limitierende Mengen von P exprimieren oder das eGFP-P Fusionsprotein induzierten IFN&bgr;, wie durch RT-PCR gezeigt (1), induzierten das IFN-abhängige MxA Gen und waren im Gegensatz zu wt RV in IFN-kompetenten HEp-2 Kulturen stark attenuiert. Die Möglichkeit, IFN-induzierende RV herzustellen, wird besonders nützlich sein für die Entwicklung von attenuierten Lebendimpfstoffen und sicheren Vektoren für onkolytische Virotherapie.

Beispiel 1: Rekombinantes IFF-induzierendes und nicht-induzierendes Tollwutvirus

10 zeigt, dass die Tollwutvirusmutanten &Dgr;PLP und L 16GFP-P INF-&bgr; Transkription induzieren. HEp-2 Zellen wurden mit einer MOI von 1 mit verschiedenen rekombinanten RV infiziert, mock-infiziert (mock-Hep-2), mit Poly (I:C) transfiziert, oder mit IFN &bgr; behandelt. Nach 20 h wurde zelluläre RNA geerntet und mit DNAse behandelt. RT-PCR wurde mit Primern durchgeführt, die für IFN-&bgr; oder Aktin als Kontrolle, spezifisch sind.

L16 wt: rekombinanter Wildtyp Tollwutvirus Stamm SAD L16; L16 LP: L16 mit einem zusätzlichen P Gen, das stromabwärts von L kodiert ist (Genreihenfolge: N-P-M-G-L-P); &Dgr;P LP: L16 mit dem nach hinter das L verschobene P Gen (Genreihenfolge: N-M-G-L-P); GFP-P: L16, das ein eGFP-P Fusionsprotein anstelle des wt P Proteins exprimiert (N-eGFP/P-M-G-L); L16P1***: L 16 bei dem die Expression von intern initiierten P Produkten P2, P3, und P4 infolge der P ORF Aminosäure-Substitutionen M20I, M53I, M83I fehlt (N-P1-M-G-L).

Beispiel 2: INF-induzierende RV sind attenuiert in Hep-2 Zellen

BSR Zellen und HEp-2 Zellen wurden mit IFN-induzierenden und nicht-induzierenden RVs mit einer MOI von 1 infiziert (11). Nach zwei Tagen Infektion wurde die Expression von Virusproteinen (Nukleoprotein, N) durch Western Blot mit dem Serum S50 analysiert. In BSR Zellen wurde effektive Vermehrung von Virus durch große Mengen an N Protein nachgewiesen.

In HEp-2 Zellen war die Replikation von IFN-induzierenden RVs &Dgr;PLP und L16 eGFP-P stark attenuiert und das IFN-abhängige antivirale Protein MxA war hochreguliert, wie durch Western Blot mit anti-MxA Antikörpern gezeigt wurde.

Beispiel 3: Von transfizierten Plasmiden exprimiertes RV P Protein inhibiert IFN Induktion.

Zellen wurden mit Plasmiden die RV P oder N Protein kodieren oder mit leeren Vektorplasmiden transfiziert, zusätzlich zu einem Plasmid, das eine IFN-stimulierende Kinase (IKK-i) kodiert. Expression von P allein ist ausreichend, um IFN-Induktion zu supprimieren. (12).

Referenzen
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Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.

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Anspruch[de]
  1. Die Verwendung von Phosphoprotein P (P Protein) oder einer Nukleinsäuresequenz, die P Protein kodiert, für die Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung zur Modulierung der IFN Antwort für die Behandlung einer entzündlichen Funktionsstörung.
  2. Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die IFN Antwort eine antivirale Antwort ist.
  3. Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die IFN Antwort eine immunologische Antwort ist.
  4. Die Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die zu behandelnde entzündliche Funktionsstörung eine Th1/Th2 Gleichgewichts-bezogene Funktionsstörung ist.
  5. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1-4, wobei die Nukleinsäuresequenz DNA oder RNA ist.
  6. Die Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die Nukleinsäuresequenz in einem Plasmid oder in einem Virus-abgeleiteten Vektor oder in einem rekombinanten DNA oder RNA Virus enthalten ist.
  7. Die Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei der Vektor ein viraler Genfähren-Vektor ist, der für Immunisierungszwecke. für Gentherapie oder für zytoreduktive Tumortherapie verwendet wird.
  8. Die Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei das Virus oder der Virus-abgeleitete Vektor abgeleitet ist von einem DNA Virus, wie Adenovirus (AdV), Adeno-Assoziiertes Virus (AAV), Herpes Virus oder Poxvirus.
  9. Die Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei das Virus oder der Virus-abgeleitete Vektor abgeleitet ist von einem Positiv-Strang RNA Virus, vorzugsweise von Viren die zu den Alpha-, Flavi-, und Picornaviridae Familien gehören.
  10. Die Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei das Virus oder der Virus-abgeleitete Vektor abgeleitet ist von einem segmentierten oder nicht-segmentierten Negativ Strang RNA Virus.
  11. Die Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei das RNA Virus abgeleitet ist von der Familie der Paramyxoviridae, Filoviridae, oder Bornaviridae.
  12. Die Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei das RNA Virus abgeleitet ist von der Familie der Rhabdoviridae.
  13. Die Verwendung gemäß Anspruch 12, wobei das RNA Virus abgeleitet ist von Tollwutvirus.
  14. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1-13, wobei die P Protein kodierende Nukleinsäuresequenz vom Tollwutvirus abgeleitet ist.
  15. Die Verwendung gemäß Ansprüche 1-14, wobei die P Protein kodierende Nukleinsäuresequenz von einem Rhabdovirus abgeleitet ist.
  16. Die Verwendung gemäß Ansprüche 1-15, wobei die pharmazeutische Formulierung weiterhin einen Impfstoff enthält.
  17. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1-16, wobei das P Protein modifiziert ist.
  18. Die Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die Modifikation von der Gruppe bestehend aus Aminosäure-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen selektiert ist.
  19. Die Verwendung gemäß Ansprüche 17 und 18, wobei die Modifikation in einer Verstärkung der IFN antagonistischen Wirkung des P Proteins resultiert.
  20. Die Verwendung gemäß Ansprüche 17 und 18, wobei die Modifikation in eine Reduktion der IFN antagonistischen Wirkung des P Proteins resultiert.
  21. Die Verwendung eines rekombinanten Rhabdovirus, das eine modifizierte P kodierende Nukleinsäuresequenz für die Präparation eines Impfstoffes trägt, wobei die Modifikation die Fähigkeit des Virus, der durch IFN vermittelten Immunantwort des Wirtes zu entgehen, reduziert oder zerstört oder verstärkt wird.
  22. Die Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die modifizierte P kodierende Nukleinsäuresequenz von Tollwutvirus abgeleitet ist.
  23. Die Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei die modifizierte P kodierende Nukleinsäuresequenz von einem Rhabdovirus abgeleitet ist.
  24. Eine Methode zur Veränderung des Wirtsspektrums von Rhabdoviren, wobei die P kodierende Nukleinsäuresequenz durch eine P kodierende Nukleinsäuresequenz ersetzt ist, die von einem Rhabdovirus abgeleitet ist, das den gewünschten Wirt infizieren kann.
Es folgen 22 Blatt Zeichnungen






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