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Dokumentenidentifikation DE68929529T2 29.12.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000717109
Titel Rekombinante HIV-2 Antigene, abgeleitet aus synthetischen DNA
Anmelder Abbott Laboratories, Abbott Park, Ill., US
Erfinder Devare, Sushil G., Northbrook, Illinois 60062, US;
Casey, James M., Gurnee, Illinois 60031, US;
Desai, Suresh M., Libertyville, Illinois 60048, US
Vertreter Schieber und Kollegen, 80469 München
DE-Aktenzeichen 68929529
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, GR, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 21.11.1989
EP-Aktenzeichen 951145457
EP-Offenlegungsdatum 19.06.1996
EP date of grant 12.01.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.12.2005
IPC-Hauptklasse C12N 15/48
IPC-Nebenklasse C07K 14/16   C12N 15/62   G01N 33/569   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf rekombinante HIV (Human Immunodeficiency Virus) Antigene. Es können rekombinante Antigene, die durch molekulare Klonierung und Expression der synthetischen DNA-Sequenzen der verschiedenen HIV Antigene in einem heterologen Expressionssystem abgeleitet werden, als Reagenzien für die Detektion von Antikörpern und Antigen in Körperfluiden von Individuen, die verschiedenen HIV-Isolaten ausgesetzt waren, verwendet werden.

Die Nukleotidsequenz des proviralen Genoms wurde für mehrere HIV-Isolate bestimmt, einschließlich der HIV-1 Stämme HTLV-III (Ratner et al., Nature (1985) 313: 277), ARV-2 (Sanchez-Pescador et al., Science (1985) 227: 484), LAV (Wain-Hobson et al., Cell (1985) 40: 9) und CDC-451 (Desai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8380). Über die Nukleotidsequenz des HIV-2 ROD Isolats wurde von Guyader et al. (Nature (1987) 326: 662) berichtet.

Von dem in Gewebekultur gezüchteten Virus oder von einem molekular klonierten genomischen Fragment, das in heterologen Wirten, wie Escherichia coli, exprimiert wurde, wurden HIV-Antigene erhalten. Das aus der Gewebekultur abgeleitete Virus schließt das beschwerliche und oft schwierige Verfahren der Zucht von Virus-infizierten Zellen unter stringenten sterilen Bedingungen ein. Außerdem ist das von Gewebekultur abgeleitete Virus infektiös und daher gefährlich für die Gesundheit von Individuen, die in die Vermehrung und Reinigung involviert sind. Die Expression von molekular klonierten HIV-Genomfragmenten überwindet das Problem der Biogefährdung. Im allgemeinen wird ein HIV-Genomfragment von einem einzelnen HIV-Isolat mit Säugetiercodons in einem heterologen System, wie Bakterien oder Hefe, exprimiert und ist auf die Verwendung von im viralen Genom verfügbaren Restriktionsstellen zur Klonierung und Expression eingeschränkt.

Im Falle einiger der HIV-Proteine, wie das HIV-1 Hüll-Antigen gp41, war es schwierig eine Expression in heterologen Systemen zu erhalten. Mehrere Forscher haben versucht die hydrophoben Regionen des HIV-1 gp41 zu deletieren, um Expressionsniveaus zu erhöhen. Die UK-Patentanmeldung GB 2188639 offenbart ein HTLV-III gag/env Gen Protein, worin das env Fragment der DNA-Sequenz Codons deletierte, die der ersten hydrophoben Region des gp41 Proteins entsprachen. Das U.S. Patent Nr. 4.753.873 offenbart ein Peptidfragment, das von einer Nukleotidsequenz codiert wird, worin die Nukleotide, die eine erste und eine zweite hydrophobe Region von HTLV-III gp41 codieren, deletiert sind.

Eine schwache Expression kann das Ergebnis zahlreicher Faktoren sein, einschließlich der spezifischen Nukleinsäuresequenz des zu exprimierenden Gens, dass die Säugetier-Codons der zu exprimierenden Gensequenz in einem bestimmten heterologen System nicht effizient transkribiert und translatiert werden können, und der Sekundärstruktur der transkribierten messenger-RNA. Die Verwendung von synthetischen DNA-Fragmenten kann die Expression in heterologen Systemen erhöhen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es werden rekombinante Antigene bereitgestellt, die aus der molekularen Klonierung und Expression synthetischer DNA-Sequenzen in heterologen Wirten abgeleitet sind. Es werden außerdem synthetische DNA-Sequenzen bereitgestellt, die die rekombinanten Antigene der Erfindung codieren. Die für die Expression verschiedener HIV-Antigene ausgewählten synthetischen DNA-Sequenzen basieren auf der Aminosäuresequenz entweder eines einzigen Isolats oder mehrerer Isolate, die durch spezifische Codonauswahl zur Expression in Escherichia coli optimiert wurden. Die synthetische DNA-Sequenz führt zu einer höheren Expression des speziellen codierten Antigens. Diese Antigene können virale Antigene ersetzen, die von Gewebekulturen zur Verwendung als diagnostische oder therapeutische Reagenzien abgeleitet werden.

Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um ein HIV Transmembran-Hüll-Gen in voller Länge unter Verwendung von Bakterien-Codons zu synthetisieren. Ein anderer Aspekt der Erfindung involviert die Verknüpfung von Sequenzen, die als einzelne Proteine schwach exprimiert werden, an Sequenzen die mit hoher Effizienz exprimiert werden. Die Kombination der Sequenz der gesamten codierenden Region eines Gens eines Virus mit codierenden Sequenzen eines anderen Gens von einem anderen Virus, um ein Fusionsprotein zu erhalten, kann erreicht werden. Die so exprimierten Fusionsproteine haben einen einzigartigen Vorteil von Antigenepitopen von zwei viralen Antigenen.

Die vorliegende Erfindung schließt synthetische Gene in voller Länge (full length synthetic genes, FSG) für HIV-2 Transmembranglycoprotein (TMP) ein.

BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 veranschaulicht die DNA- und Aminosäuresequenz des synthetischen HIV-2 TMP in voller Länge, wobei Restriktionsenzyme angezeigt werden, die zur Assemblierung des Gens verwendet wurden, einschließlich Linker-Sequenzen an beiden Enden, um die Klonierung zu erleichtern.

2 veranschaulicht die drei Haupt-Teilfragmente, die zur Konstruktion des synthetischen HIV-2 TMP Gens verwendet wurden.

3 ist ein schematisches Diagramm des Zusammenbaus der Haupt-Teilfragmente, um das vollständige (gesamtlängen) synthetische HIV-2 TMP zu bilden und seine Klonierung in pUC8, um pJC28 zu erzeugen.

4 ist ein schematisches Diagramm der Klonierung von synthetischem HIV-2 TMP Fragment A in pUC19, um pJC22 zu erzeugen und in pTB210 um pJC100 zu erzeugen.

5 ist ein schematisches Diagramm der Klonierung von synthetischem HIV-2 TMP in lambda pL Expressionsvektoren um pSD306 und pSD307 zu erzeugen.

6 zeigt die spezifischen Aminosäuresequenzen von pL Konstrukten pSD306 und pSD307, wobei alle Linker-Sequenzen, HIV-1 gag Sequenzen und HIV-2 TMP Sequenzen angezeigt werden.

7 veranschaulicht Ergebnisse der Expressionsanalyse von pSD306 in E. coli CAG456 Zellen. A) Coomassie-gefärbtes Gel; B) Immunoblot, unter Verwendung von HIV-2 positiven humanen Seren.

8 veranschaulicht Ergebnisse der Expressionsanalyse von pSD307 in E. coli pRK248.c1ts/RR1 Zellen. A) Coomassie-gefärbtes Gel; B) Immunoblot, unter Verwendung von HIV-2 positiven humanen Seren.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Synthetische DNA-Fragmente des HIV-Genoms können synthetisiert werden basierend auf ihrer entsprechenden Aminosäuresequenz. Durch Vergleich der speziellen Region von Interesse zwischen verschiedenen Isolaten kann eine Sequenz selektiert werden, die sich von jeglicher Sequenz, die in der Natur existiert, unterscheidet, weil die Sequenz eine Zusammenstellung der Sequenzen von verschiedenen Isolaten ist.

Es können andere Eigenschaften in die Sequenz eingebaut werden. Zum Beispiel können Codons zur optimalen Expression in Bakterien oder Hefe getauscht werden, es können spezifische Restriktionsstellen eingeführt werden und andere Restriktionsstellen können entfernt werden. Zusätzlich sollte die Sequenz sowohl am 5' als auch am 3' Ende des Fragments spezifische Restriktionsstellen haben, um die Klonierung in einen bestimmten Vektor zu erleichtern. Synthetische DNA-Fragmente können wie folgt synthetisiert werden (1) wähle eine einzigartige Proteinsequenz, (2) translatiere umgekehrt, um die komplementäre DNA-Sequenz zu bestimmen, (3) optimiere Codons für bakterielle oder Hefe-Expression und (4) führe ein und/oder entferne spezifische Restriktionsstellen.

Einundsechzig unterschiedliche Nukleotidcodons codieren 20 Aminosäuren, wobei die Degenerierung des genetischen Codes hervorgerufen wird. Sowohl für eukaryotische als auch für prokaryotische Organismen haben Forscher die Häufigkeiten von in Nucleinsäuren verwendeten Codons berichtet. (Grantham et al., Nucleic Acids Res. [1980] 9: r43; Gouy et al., Nucleic Acids Res. [1982] 10: 7055; Sharp et al., Nucleic Acids Res. [1986] 14: 7737.) Es sind Sequenzen aus dem ganzen E. coli Genom analysiert worden, mit Sequenz-Beispielen von dem Chromosom, den Transposons und Plasmiden. Diese Sequenzen codieren Strukturproteine, Enzyme und Regulationsproteine. Zwischen dem Grad an Codon-Bias innerhalb eines bestimmten Gens und dem Niveau einer Genexpression wurde eine Korrelation gezeigt.

Vorzugsweise wird das gleiche Codon-Triplett für jede individuelle Aminosäure der synthetischen DNA-Sequenz verwendet. Es kann (können) aber auch alternative(s) Codon(s) verwendet werden, um eine bestimmte Restriktionsstelle hinzuzufügen oder zu deletieren. Die Sequenz sollte einzigartige Restriktionsstellen einschießen, die zur Deletion eines bestimmten Fragments oder einer Sequenz verwendet werden können, oder eine bestimmte Sequenz ersetzen, im Falle eines Fehlers in der ursprünglichen Synthese.

Die Vektor-Systeme, die verwendet werden können, schließen Pflanzen-, bakterielle, Hefe-, Insekten- und Säugetier-Expressionssysteme ein. Vorzugsweise werden die Codons zur Expression im verwendeten System optimiert. Die von der Erfindung bereitgestellten Proteine und Polypeptide, die in heterologen Systemen kloniert und exprimiert werden, wie oben beschrieben, können zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken verwendet werden.

Ein bevorzugtes Expressionssystem verwendet das lambda pL Vektor-System. Dieses Expressionssystem hat die folgenden Merkmale: (1) einen starken lambda pL Promotor, (2) einen starken drei-Leseraster Translationsterminator rrnBt1 und (3) Translation beginnt an einem ATG-Codon, acht Basen-Paare von der innerhalb einer zugänglichen NcoI Restriktionsstelle gelegenen Ribosom-Bindungsstelle.

Ein anderer Vorteil des Expressionssystems der vorliegenden Erfindung ist, dass man die synthetischen DNA-Fragmente speziell anfertigen kann, so dass sie spezifische DNA-Sequenzen enthalten, die Proteine mit erwünschten Aminosäuresequenzen exprimieren, und einem außerdem die Möglichkeit zulassen, entweder an das 5' oder an das 3' Ende andere DNA-Sequenzen hinzuzufügen, um den Transfer von synthetischen Fragmenten in verschiedene Vektoren zu erleichtern.

Zusätzlich könnte die Verwendung von bestimmten Restriktionsstellen an beiden Enden des Fragments auch eine Inkorporation des Fragments in andere Sequenzen erleichtern, um Fusionsproteine herzustellen, die auch als diagnostische und therapeutische Reagenzien verwendet werden können, die, zum Beispiel, in einem einzelnen Assay-Screening-System zur Detektion von sowohl AIDS als auch Hepatitis B bei potentiellen Blutspendern verwendet werden können. Alternativ kann das System zur Verfolgung des Verlaufs der Infektion eines Patienten verwendet werden.

Andere Proteine aus irgendeiner Quelle, einschließlich bakterielle, Hefe-, Insekten-, Pflanzen- oder Säugetierquellen, können mit den synthetischen DNA-Fragmenten der Erfindung verwendet werden, um Fusionsproteine zu erzeugen. Diejenigen, die in ihren entsprechenden Expressionssystemen effizient exprimiert werden, werden besonders bevorzugt, weil sie die Expression des synthetischen Fragments des Fusionsproteins verstärken können.

Die synthetischen DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung, die von verschiedenen HIV-Isolaten abgeleitet und für Expression in E. coli optimiert sind, stellen eine andauernde Verfügbarkeit und Einheitlichkeit von HIV-Antigen-Zubereitungen bereit, die Test-Seren von Individuen erkennen werden, die genetisch unterscheidbaren abweichenden HIV-Isolaten ausgesetzt waren. Die rekombinante Antigen-Expression ist sehr stabil, weil für ihre Synthese E. coli Codons verwendet wurden. Zusätzlich erlaubt die Insertion spezifischer Restriktionsstellen das Hinzufügen, Deletion oder Substitution in wichtigen Antigen-Epitopen in den codierenden Sequenzen, eine Eigenschaft, die schwer zu erreichen ist, wenn natürlich vorkommende HIV-Sequenzen zur Expression verwendet werden. Die Konstruktion von synthetischen Genen erlaubt auch das Hinzufügen von Proteinsequenzen, entweder am Amino- oder am Carboxy-Terminus des Gens, wodurch die Entwicklung von neuen Reagenzien ermöglicht wird. Zum Beispiel kann die HIV-1-Kern-Antigen-DNA-Sequenz an die HIV-2 gp41 Sequenzen fusioniert werden, von denen beide in hohen Spiegeln in heterologen Wirtssystemen wie zum Beispiel E. coli exprimiert werden können.

Ein E. coli Stamm, der ein für Konstrukte der vorliegenden Erfindung nützliches Plasmid enthält, ist bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland am 22 November 1988 hinterlegt worden, unter der Zugangsnr. ATCC 67856 (pSD306/CAG456).

Die folgenden Beispiele beschreiben weiterhin die Erfindung. Die Beispiele sind nicht dazu bestimmt die Erfindung in irgend eine Weise einzuschränken.

Reagenzien und Enzyme

Medien, wie Luria-Bertani (LB) und Superbroth II (Dri Form) wurden von Gibco Laboratories Life Technologies, Inc., Madison, Wisconsin erhalten. Restriktionsenzyme, Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I, T4 DNA-Ligase, T4 Oligonukleotid-Kinase; Nucleinsäure-Molekulargewicht-Standards, M 13 Sequenziersystem, X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indonyl-&bgr;-D-galactosid), IPTG (Isopropyl-&bgr;-D-thiogalactosid), Glycerol, Dithiotreitol, 4-Chloro-1-naphtol wurden von Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana erworben; oder von New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts; oder von Bethesda Research Laboratories Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland. Vorgefärbte Protein-Molekulargewicht-Standards, Acrylamid (kristallisiert, Elektrophorese-Grad > 99%), N-N'-Methylen-bisacrylamid (BIS), N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) und Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden von BioRad Laboratories, Richmond, California erworben. Lysozym und Ampicillin wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri erhalten. Meerrettichperoxidase (HRPO) markierte Sekundärantikörper wurden von Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland erhalten. Seaplaque-Agarose (niedrigschmelzende Agarose) wurde von FMC Bioproducts, Rockland, Maine erworben.

T50E10 enthielt 50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM EDTA; 1 × TG enthielt 100 mM Tris, pH 7,5 und 10% Glycerol; 2 × SDS/PAGE Auftragspuffer bestand aus 15% Glycerol, 5% SDS, 100 mM Tris Base, 1 M &bgr;-Mercaptoethanol und 0,8% Bromphenolblau-Farbstoff; TBS enthielt 50 mM Tris, pH 8,0 und 150 mM Natriumchlorid; Blocker-Lösung bestand aus 5% Carnation fettfreier Trockenmilch in TBS.

Wirts-Zellkulturen. DNA-Quellen und Vektoren

E. coli JM103 Zellen, pUC8, pUC18, pUC19 und M13 Klonierungsvektoren wurden von Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, New Jersey erworben; kompetente EpicureanTM coli Stämme XL1-Blue und JM109 wurden von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, California erworben. RR1 Zellen wurden vom Coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, Conneticut und E. coli CAG456 von Dr. Carol Gross, University of Wisconsin, Madison, Wisconsin erhalten. Der Vektor pRK248.c1ts wurde von Dr. Donald R. Helinski, University of California, San Diego, California, erhalten.

Allgemeine Verfahren

Alle Restriktionsenzym-Verdauungen wurden entsprechend den Gebrauchsanweisungen des Lieferanten durchgeführt. Pro Mikrogramm DNA wurden mindestens 5 Einheiten Enzym verwendet und es wurde ausreichende Inkubation erlaubt, um DNA-Verdauungen zu vervollständigen. Für Minipräparationen von Zelllysat-DNA, Phenol-Chloroform Extraktion, Ethanol-Fällung von DNA, Restriktionsanalyse von DNA auf Agarose und niedrigschmelzende-Agarose-Gel-Reinigung von DNA-Fragmenten wurden Standardverfahren verwendet (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual [New York: Cold Spring Harbor, 1982]). Zu Plasmid-Isolierungen aus E. coli Stämmen wurde das Verfahren der alkalischen Lyse und das Caesiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradientenverfahren (Maniatis et al., supra) verwendet. Für T4 DNA-Ligase und T4 Polynukleotid-Kinase wurden Standardpuffer verwendet (Maniatis et al., supra).

BEISPIELE Beispiel 1 Synthese und Klonierung von synthetischem HIV-2 TMP und eines Fragments davon

Das gesamte HIV-2 Transmembran-Protein (TMP) wurde chemisch synthetisiert, mit Hilfe des Oligonukleotid-gerichteten Doppelstrang Abbruch-Reparatur Verfahrens, das in der U.S. Patentanmeldung mit der SerienNr. 883.242 offenbart ist, die am 8 Juli 1986 von Mandecki (EPO 87109357,1) angemeldet wurde, die hierin durch die Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Hüll-Aminosäurereste 502–858 des HIV-2 ROD Isolats (Nummerierung von Guyader et al., supra) wurden umkehr-translatiert, mit Hilfe von für die Expression in E. coli optimierten Codon-Zuordnungen. Nachdem den verbliebenen ambiguen (zweideutigen) Nukleotiden spezifische Nukleotide zugeordnet worden waren, wie vorhin beschrieben, wurde die TMP-Sequenz in voller Länge, wie in 1 gezeigt, generiert. Das synthetische Gen wurde zusammengebaut und als drei getrennte Teilfragmente kloniert, dargestellt durch Fragment A, ein 335 bp langes HindIII-NcoI Fragment, Fragment B, ein 309 bp langes NcoI-BamHI Fragment (29 hydrophobe Aminosäurereste deletiert) und Fragment C, ein 362 bp langes BamHI-HindIII Fragment, wie in 2 dargestellt. Ein viertes Fragment, das die die neunundzwanzig deletierten hydrophoben Aminosäurereste enthielt, wurde in das 309 bp lange NcoI-BamHI Fragment, als ein EcoRV-SnaBI Fragment, kloniert (2). Die drei Hauptteilfragmente wurden in pUC Vektoren kloniert, in JM109 Zellen transformiert und ihre primären Nukleotidsequenzen wurden bestätigt, wie vorher beschrieben. Die Fragmente wurden dann über Gele gereinigt und zusammenligiert, um das vollständige 1089 bp lange synthetische HIV-2 TMP zu bilden. Dieses 1089 bp lange HindIII Fragment wurde in pUC8 kloniert und als pJC28 bezeichnet (3).

Das Fragment A, welches die 108 Amino-terminalen Aminosäuren des HIV-2 TMP (von Tyr 502 bis Trp 609 [Guyader et al., supra]) codiert, wurde in die HindIII-SalI Stellen von pUC19 kloniert. Ein als pJC22 bezeichneter Klon wurde durch Restriktionskartierung identifiziert und seine Nukleotid-Primärsequenz wurde bestätigt. Das Plasmid pJC22 wurde mit HindIII-Asp718 verdaut, um ein 361 bp langes Fragment freizugeben, das das synthetische HIV-2 TMP Genfragment enthielt, das in die HindIII-Asp718 Stellen von Plasmid pTB210 ligiert wurde und in E. coli XL1 Zellen transformiert wurde. Das Plasmid pTB210 wird in einer als "CKS Verfahren zur Proteinsynthese" benannten U.S. Patentanmeldung offenbart, die gleichzeitig von T. Bolling et al. angemeldet wurde, die eine CIP (continuation-in-part-Anmeldung) einer früheren Anmeldung ist, U.S. SerienNr. 167.067, angemeldet am 11 März 1988, die hiermit durch die Bezugnahme eingeschlossen ist. Ein als pJC100 (4) bezeichneter Klon wurde isoliert und restriktionskartiert, um das Hybridgen aus kdsB (das CKS codiert) und dem HIV-2 TMP Fragment zu identifizieren.

Beispiel 2 Klonierung von synthetischem HIV-2 TMP in lambda pL Vektoren

Das 1089 bp lange HindIII Fragment, das das gesamte HIV-2 TMP Fragment enthält, wurde aus pJC28 isoliert, mit dem Klenow Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt, um glatte Enden herzustellen und direkt nach einem ATG Startcodon kloniert, das von der aufgefüllten NcoI Stelle von pSD305 (pSDKR816) bereitgestellt ist, mit c1ts eingefügt. Der Vektor pSDKR816 enthält den starken lambda pL Promotor und das temperaturempfindliche c1 Repressorgen, das in Benard et al., Gene (1979) 5: 59, beschrieben wird. Solch ein Vektor ist ein pBR322-Derivat, der einen lambda pL Promotor und eine synthetische Shine-Dalgarno Sequenz enthält, gefolgt von einer Restriktionsstelle, die zur Klonierung verschiedener Gene von Interesse verwendet wird. Zusätzlich enthält dieser Vektor den starken drei-Leseraster-Translationsterminator rrnBt1. Der Vektor pSDKR816 enthält eine NcoI Restriktionsstelle, die ein ATG Startcodon bereitstellt, das zum Start der Transkription in optimalem Abstand steht. Ähnlich wurde ein 1097 bp langes SalI-Asp718 Fragment, das das gesamte HIV-2 TMP enthält, aus pJC28 isoliert, mit dem Klenow Fragment von DNA-Polymerase I aufgefüllt, um glatte Enden zu produzieren, und in die SmaI Stelle von pKRR955 kloniert (Vektor, der den starken lambda pL Promotor und das temperaturempfindliche c1 Repressorgen, das in Benard et al., Gene (1979) 5: 59 beschrieben wird, enthält. Solch ein Vektor ist ein pBR322-Derivat, der einen lambda pL Promotor und eine synthetische Shine-Dalgarno Sequenz enthält, gefolgt von einer Restriktionsstelle, die zur Klonierung verschiedener Gene von Interesse verwendet wird. Zusätzlich enthält dieser Vektor den starken drei-Leseraster Translationsterminator rrnBt1.), um ein HIV-1 gag/HIV-2 TMP Fusionsprotein zu produzieren. Der Klon, der das HIV-2 TMP Gen unter Kontrolle des lambda pL Promotors enthielt, wurde als pSD306 bezeichnet und der Klon, der das HIV-2 TMP als eine Fusion mit HIV-1 gag unter Kontrolle des lambda pL Promotors enthielt, wurde als pSD307 bezeichnet, wie in 5 in groben Zügen dargestellt. Nach Transformation von pSD306 in E. coli CAG456 Zellen (Baker, PNAS (1984) 81: 6779) und pSD306 in E. coli pRK248.c1ts/RR1 Zellen, wurden einzelne Zellklone isoliert und eine Restriktionskartierung durchgeführt, um das Vorhandensein und die Orientierung des HIV-2 TMP Gens zu zeigen. Die spezifischen Aminosäuresequenzen von pSD306 und pSD307 sind in 6 gezeigt, wobei Linker-abgeleitete Sequenzen, HIV-1 gag Sequenzen und HIV-2 TMP Sequenzen angezeigt werden. In diesen Kulturen wurde die Expression des synthetischen HIV-2 TMP Gens durch Temperaturshift-Verfahren induziert (Zellen wurden in Superbroth II Medien bei 30°C bis zu einer OD600 von 0,5 gezüchtet, zu welchem Zeitpunkt die Kulturen auf 42°C umgestellt wurden, um den temperaturempfindlichen c1 Repressor zu inaktivieren und somit die Expression vom lambda pL Promotor aus zu induzieren). Es wurden Aliquote der Kulturen, vor und nach der Induktion, der SDS-PAGE Analyse unterworfen, sowohl zur Coomassie blue Färbung als auch fürs Immunoblotting, mit Hilfe von HIV-2 positiven Humanseren, wie folgt.

Die Zellen wurden pelletiert, dann entweder in 1 × TG Puffer oder T50E10 Puffer resuspendiert. Zu den 1 × TG suspendierten Zellen wurde ein gleiches Volumen 2 × SDS/PAGE Auftragspuffer hinzugefügt, um das Gesamtlysat herzustellen. Die in T50E10 resuspendierte Probe wurde acht Mal jeweils 30 Sekunden lang ultrabeschallt, bei einer Leistungseinstellung von 10 Watt, unter Verwendung der Mikrospitze (microtip), die mit dem Vibra Cell Sonicator bereitgestellt wird (Sonics and Materials, Inc., Danbury, CT). Die ultrabeschallte Probe wurde dann zentrifugiert, um die unlösliche Fraktion zu entfernen, die in dem ursprünglichen Ausgangsvolumen von T50E10 resuspendiert wurde. Ein gleiches Volumen an 2 × SDS/PAGE Auftragspuffer wurde sowohl zu den ultrabeschallten löslichen als auch unlöslichen Fraktionen hinzugefügt, die zusammen mit dem Gesamtzelllysat 5 Min. lang gekocht wurden, zentrifugiert wurden, um alles verbliebene unlösliche Material zu entfernen, und es wurden Aliquote (15 &mgr;l) auf doppelten 12,5%igen SDS/PAGE-Gelen getrennt. Von einem solchen Gel wurden Proteine elektrophoretisch auf Nitrozellulose übertragen, für Immunoblotting mit Seren von AIDS-Patienten, wie vorher beschrieben. Das zweite Gel wurde in einer Lösung aus 50% Methanol, 10% Essigsäure zwanzig Minuten lang bei Raumtemperatur fixiert und dann gefärbt, mit 0,25%igem Coomassie blue Farbstoff, in einer Lösung aus 50% Methanol, 10% Essigsäure, 30 Minuten lang. Die Entfärbung wurde mit Hilfe einer Lösung aus 10% Methanol, 7% Essigsäure 3–4 Std. lang durchgeführt, oder bis ein klarer Hintergrund erhalten wurde.

Es wurden Gesamtzelllysate und die ultrabeschallten löslichen und unlöslichen Fraktionen der Kulturen analysiert und sie sind in den 7 und 8 für die pSD306 beziehungsweise pSD307 Konstrukte erläutert.

7 stellt die Expression von pSD306 dar, vor (T0) und zwei Stunden nach (T2) der Induktion, mittels Coomassie blue Färbung (7A) und Immunoblotting (7B) analysiert. Die Proben waren T0 Gesamtzelllysat (Spur 1), T0 ultrabeschallte lösliche Fraktion (Spur 2), T0 ultrabeschallte unlösliche Fraktion (Spur 3), T2 Gesamtzelllysat (Spur 4), T2 ultrabeschallte lösliche Fraktion (Spur 5), T2 ultrabeschallte unlösliche Fraktion (Spur 6) und BioRad vorgefärbte Molekulargewichtsmarker (Spur M). 7 demonstriert, dass pSD306 eine signifikante Menge von dem HIV-2 TMP zur Zeit T2 exprimierte, wie durch die Pfeile auf sowohl dem Coomassie gefärbten Gel als auch dem Immunoblot angezeigt. Dieses exprimierte Protein ist sowohl im Gesamtzelllysat als auch in der ultrabeschallten unlöslichen Zellfraktion dieser Kulturen sichtbar.

Ähnlich stellt 8 die Expression von pSD307 dar, vor (T0) und zwei Stunden nach (T2) Induktion, analysiert mittels Coomassie blue Färbung (8A) und Immunoblotting (8B). Die Proben waren pKRR955, T2 Gesamtzelllysat (Spur 1); pSD307, T0 Gesamtzelllysat (Spur 2), T0 ultrabeschallte lösliche Fraktion (Spur 3), T0 ultrabeschallte unlösliche Fraktion (Spur 4), T2 Gesamtzelllysat (Spur 5), T2 ultrabeschallte lösliche Fraktion (Spur 6), T2 ultrabeschallte unlösliche Fraktion (Spur 7) und BioRad vorgefärbte Molekulargewichtsmarker (Spur M). 8 demonstriert, dass pSD307 eine signifikante Menge von dem HIV-1 gag/HIV-2 TMP zur Zeit T2 exprimierte, wie durch die Pfeile auf sowohl dem Coomassie gefärbten Gel als auch dem Immunoblot angezeigt. Dieses Fusionsprotein ist sowohl im Gesamtzelllysat als auch in der ultrabeschallten unlöslichen Fraktion dieser Kulturen sichtbar. Der HIV-1 gag Fusionspartner (Spur 1), obwohl auf höheren Niveaus vorhanden als das HIV-1 gag/HIV-2 TMP Fusionsprotein, zeigte niedrigere Immunoreaktivität gegen HIV-2 spezifische Antikörper.

Beispiel 3 Diagnostischer Nutzen synthetischer DNA-abgeleiteter HIV Proteine

Die HIV-spezifischen Proteine, die in E. coli überexprimiert wurden, wurden mit Hilfe von im Fachgebiet bekannten Verfahren gereinigt. Die in hohen Spiegeln exprimierten Proteine waren immunogen und wurden von Antikörpern erkannt, die von HIV-infizierten Individuen (siehe 7 und 8) produziert worden waren. Die von E. coli abgeleiteten HIV-spezifischen Proteine können in verschiedenen Immunoassay-Konfigurationen verwendet werden, wie in der CIP Anmeldung U.S. SerienNr. 020.282, am 27 Februar 1987 von Dawson et al. angemeldet, beschrieben, die hiermit durch die Bezugnahme eingeschlossen ist. Die Ausgangsanmeldung ist EPO 86116854.0 (4. Dezember 1986). In einer bevorzugten Ausgestaltung wurde ein fester Träger mit HIV-spezifischen Proteinen beschichtet und mit Testproben inkubiert. Die in der Testprobe vorhandenen Virus-spezifischen Antikörper erkannten die HIV-Proteine auf dem festen Träger und wurden daran gebunden. Die HIV-spezifischen Antikörper wurden mit Hilfe von an HRPO konjugiertem Ziegen-anti-humanen-Immunoglobulin quantifiziert.

Die gegenüber HIV-1 exponierten Individuen wurden mit Hilfe von HIV-1-spezifischen Proteinen detektiert, wie zum Beispiel HIV-1 gp41 und HIV-1 p24 Proteinen, die mittels rekombinanter DNA-Verfahren abgeleitet wurden, beschrieben in der CIP Anmeldung SerienNr. 020.282. Mit Hilfe dieser HIV-1 spezifischen Proteine wurden aber nur 70 bis 90% der an HIV-2 exponierten Individuen detektiert, wegen der Kreuzreaktivität zwischen den zwei Stämmen. Die gegenüber HIV-2 exponierten Individuen, die mit Hilfe dieser HIV-1-spezifischen Proteine nicht detektiert wurden, wurden mit Hilfe von synthetische DNA-abgeleiteten HIV-2 Proteinen detektiert.

Zum Beispiel erhöhte das an CKS (pJC100) fusionierte HIV-2 TMP Fragment, wenn zu den rekombinanten HIV-1 Proteinen auf dem oben beschriebenen festen Träger hinzugefügt, signifikant die Detektion von Testproben, die HIV-2 Antikörper enthielten, wie in Tabelle 1, weiter unten, veranschaulicht.

Tabelle 1

Zusätzlich wurden 3.411 normale Blutspender gescreent, mit Hilfe des oben beschriebenen HIV-1/HIV-2 rekombinanten Assays. Der rekombinante Assay zeigte eine Spezifizität von 99,77, mit nur acht (0,23%) ursprünglich reaktiven und vier (0,12) wiederholt reaktiven Proben.

Beispiel 4 Differenzierung von HIV-1 und HIV-2 Infektionen

Oft haben Individuen, die gegenüber HIV-2 exponiert worden sind, Antikörper, die gegen Epitope auf HIV-2 Proteinen, die auch auf HIV-1 Proteinen vorhanden sind, gerichtet sind. In ähnlicher Weise haben Individuen, die gegenüber HIV-1 exponiert worden sind, Antikörper die mit HIV-2 Proteinen kreuzreagieren. Weil die meisten Kreuzreaktionen sich auf die gag Gen Produkte beziehen, wurden das pJP100 Protein und ein rekombinantes Protein von dem HIV-1 Hüllprotein (beschrieben in CIP Anmeldung SerienNummer 020.282) verwendet, um zwischen mit HIV-1 und mit HIV-2 infizierten Individuen zu differenzieren.

Zwei unabhängige Enzym-gebundene Immunoassays wurden entwickelt. Test 1 verwendete HIV-1 rekombinante Proteine, mit denen eine feste Phase beschichtet wurde. Test 2 verwendete HIV-2 TMP (pJP100), mit denen eine feste Phase beschichtet wurde. Es wurden Proben von HIV seropositiven Individuen aus den Vereinigten Staaten, Portugal oder Westafrika auf Antikörper mit Hilfe dieser zwei Tests getestet. Es wurden Endpunkt-Titer bestimmt, durch Verdünnung der Proben in normalem Humanplasma und durch Testen der Verdünnungen. Wie in Tabelle 2, weiter unten, veranschaulicht, können spezifische Tests, unter Verwendung von synthetischen rekombinanten Proteinen in effektiver Weise verwendet werden, um zwischen HIV-1 und HIV-2 Infektionen zu differenzieren.

Tabelle 2

Leicht durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung zu testende biologische Proben schließen humane und tierische Körperfluide, wie Vollblut, Serum, Plasma, Urin, Speichel, Stuhl, Lymphozyten- oder Zellkultur-Zubereitungen und gereinigte oder teilweise gereinigte Immunoglobuline ein. Die hierin beschriebenen Polypeptide und Fragmente können zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von Antikörpern gegen HIV-1 und HIV-2 Antigene verwendet werden, mittels Assay-Verfahren, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind, und um zwischen HIV-1 und HIV-2 Infektionen zu unterscheiden.

Ein solcher Assay umfasst:

  • a) Beschichtung eines festen Trägers mit den hierin offenbarten Polypeptiden und Polypeptidfragmenten;
  • b) in Kontakt bringen des beschichteten festen Trägers mit der biologischen Probe, um einen Antikörper-Polypeptid Komplex zu bilden;
  • c) Entfernen von ungebundener biologischer Probe vom festen Träger;
  • d) in Kontakt bringen des Komplexes auf dem festen Träger mit einem für den Antikörper spezifischen markierten Immunoglobulin; und
  • e) Detektieren des Markers, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von HIV-2 Antikörpern in der biologischen Probe zu bestimmen.

Ein zweites Assay-Verfahren umfasst folgendes

  • a) Beschichtung eines festen Trägers mit den hierin offenbarten Polypeptiden und Polypeptidfragmenten;
  • b) in Kontakt bringen des beschichteten festen Trägers mit der biologischen Probe und den an einen Marker konjugierten homologen Polypeptiden;
  • c) Entfernen ungebundener biologischer Probe und ungebundenem markierten Polypeptid; und
  • d) Detektion des Markers um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von HIV-2 Antikörpern in der biologischen Probe zu bestimmen.

In solchen Immunoassays verwendbare feste Träger schließen Vertiefungen ("wells") von Reaktionsplatten, Teströhrchen, Kügelchen, Streifen, Membranen, Filter, Mikropartikel oder andere feste Träger ein, die denjenigen, die im Fachgebiet bewandert sind, wohlbekannt sind. In den oben erwähnten Assays können enzymatische, Radioisotopen-, fluoreszierende, chemilumineszierende und kolloidale Partikelmarker verwendet werden. Außerdem können Hapten/markierte anti-Hapten Systeme, wie zum Beispiel ein Biotin/markiertes anti-Biotin System in den erfinderischen Assays verwendet werden. Sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper sind als Reagenzien nützlich und sowohl IgG als auch IgM Klasse HIV Antikörper können als feste Träger oder markierte Reagenzien verwendet werden.

Aus den zuvor erwähnten Beispielen ist es offensichtlich, dass jemand, der im Fachgebiet bewandert ist, spezifische Teilfragmente der synthetischen Gene zusammenklonieren könnte, die so konstruiert sind, dass sie neue synthetische Gene erzeugen, die die gleichen Merkmale haben würden wie diejenigen, die hierin veranschaulicht sind. Zum Beispiel können das c-term gp120 Teilfragment, BS2-10 und das Teilfragment 413-1 zusammengekloniert werden, um synthetische Genprodukte zu erzeugen, die als diagnostische und therapeutische Reagenzien für AIDS nützlich sind.


Anspruch[de]
  1. Ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, dargestellt durch folgende:
  2. Ein Polypeptid-Fragment des Polypeptids von Anspruch 1, das eine Aminosäuresequenz umfasst, dargestellt durch folgende
  3. Das Polypeptid von Ansprüchen 1 oder 2, produziert durch E. coli.
  4. Ein Fusions-Polypeptid, das ein Polypeptid umfasst, wie in einem der Ansprüche 1 bis 2, worin das Polypeptid an ein prokaryotisches oder eukaryotisches Protein fusioniert ist.
  5. Das Fusions-Polypeptid von Anspruch 4, worin das prokaryotische oder eukaryotische Protein das E. coli Enzym CKS ist.
  6. Ein synthetisches Gen, das eine DNA-Sequenz umfasst, dargestellt durch folgende:
  7. Das synthetische Gen von Anspruch 6, das für das Polypeptid von Anspruch 1 kodiert.
  8. Ein synthetisches Gen, das eine DNA-Sequenz umfasst, die durch folgende dargestellt ist:
  9. Das synthetische Gen von Anspruch 8, das für das Polypeptid von Anspruch 2 kodiert.
  10. Ein Fusions-Polypeptid, das ein Polypeptid wie in einem der Ansprüche 1 bis 2 umfasst, worin das Polypeptid an ein HIV-gag-Protein fusioniert ist.
  11. Das Fusions-Polypeptid von Anspruch 10, worin das HIV-gag-Protein ein HIV-1 gag-Protein ist, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die durch folgende dargestellt ist:
  12. Ein Verfahren zum Detektieren von Antikörpern gegen HIV-Antigene in einem Individuum, das die folgenden Schritte umfasst:

    a) Erhalten einer Probe aus einem Körper-Fluid, das aus dem Individuum erhalten wurde;

    b) Inkubieren des Körper-Fluids mit dem Polypeptid von Ansprüchen 1 oder 2;

    c) Inkubieren des Körper-Fluids mit einem markierten Antikörper gegen Immunglobulin; und

    d) Detektieren des Markers und daraus die Anwesenheit oder die Abwesenheit von Antikörpern gegen HIV-Antigene bestimmen.
  13. Ein Verfahren zur Detektion von Antikörpern gegen HIV-Antigene in einem Individuum, welches die folgenden Schritte umfasst:

    a) Erhalten einer Probe eines Körper-Fluids, das aus dem Individuum erhalten wurde;

    b) Inkubieren des Körper-Fluids mit dem Polypeptid von Ansprüchen 1 oder 2;

    c) Inkubieren des Körper-Fluids mit einem markierten Antigen; und

    d) Detektieren des Markers und daraus die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antikörpern gegen HIV-Antigene bestimmen.
Es folgen 8 Blatt Zeichnungen






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