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REKOMBINANTE HEFE ZUR EFFIZIENTEN FERMENTATION VON GLUCOSE UND XYLOSE - Dokument DE69434291T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69434291T2 29.12.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000728192
Titel REKOMBINANTE HEFE ZUR EFFIZIENTEN FERMENTATION VON GLUCOSE UND XYLOSE
Anmelder Purdue Research Foundation, West Lafayette, Ind., US
Erfinder HO, Nancy W.Y., West Lafayette, US;
TSAO, George T., West Lafayette, US
Vertreter Marks & Clerk, Luxembourg, LU
DE-Aktenzeichen 69434291
Vertragsstaaten AT, BE, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 08.11.1994
EP-Aktenzeichen 959011768
WO-Anmeldetag 08.11.1994
PCT-Aktenzeichen PCT/US94/12861
WO-Veröffentlichungsnummer 0095013362
WO-Veröffentlichungsdatum 18.05.1995
EP-Offenlegungsdatum 28.08.1996
EP date of grant 09.03.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.12.2005
IPC-Hauptklasse C12N 1/14
IPC-Nebenklasse C12N 9/00   C12N 9/12   C12P 7/08   C12N 15/81   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf gentechnisch entwickelte Hefen, die in der Lage sind, gleichzeitig die zwei Hauptzuckerbestandteile von Zellulose-Biomasse, Glukose und Xylose zu Ethanol zu fermentieren. Genauer gesagt, die vorliegende Erfindung bezieht sich auf solche Hefen, die durch Klonierung eines Xylosereduktase-Gens, eines Xylitoldehydrogenase-Gens und eines Xylulokinase-Gens zu Hefen konstruiert werden können, welche in der Lage sind, Glukose zu Ethanol zu fermentieren.

Untersuchungen aus jüngster Zeit haben den Beweis geliefert, dass Ethanol ein idealer Flüssigkraftstoff für Kraftfahrzeuge ist. Er kann direkt als unverdünnter Kraftstoff (100% Ethanol) oder als eine Mischung mit Benzin in verschiedenen Konzentrationen verwendet werden.

Die Verwendung von Ethanol als Ergänzung oder Ersatz für Benzin kann die Abhängigkeit vieler Nationen von importiertem, ausländischen Öl verringern und auch einen erneuerbaren Kraftstoff für das Transportwesen liefern. Darüber hinaus hat sich Ethanol als sauberer Kraftstoff erwiesen, der weit weniger Schadstoffe in die Umgebung freisetzt als das übliche Benzin. Beispielsweise konnte nachgewiesen werden, dass die Verwendung von sauerstoffhaltigen Stoffen im Benzin die Emission des umweltfeindlichen Schadstoffs Kohlenmonoxid in die Luft verringern kann. Unter den verschiedenen sauerstoffhaltigen Verbindungen, die derzeit zur Erhöhung des Sauerstoffgehalts im Benzin benutzt werden, besitzt Ethanol den höchsten Sauerstoffgehalt. Die Umweltschutzbehörde (EPA) der Vereinigten Staaten von Amerika hat nachgewiesen, dass Benzin, das mit 10% Ethanol vermischt worden ist, die Kohlenstoffmonoxid-Emissionen um etwa 25–30% reduziert.

Bis heute bestand das Ausgangsmaterial, das für die Herstellung von industriellem Alkohol durch Fermentierung verwendet worden ist aus Zuckern, die herrühren aus Zuckerrohr oder Zuckerrüben, aus Stärke von Mais oder von anderen Nahrungspflanzen. Allerdings sind diese landwirtschaftlichen Pflanzen zu teuer, um sie als Ausgangsmaterial für die großtechnische Herstellung von Ethanol-Kraftstoff zu verwenden.

Pflanzliche Biomasse ist ein attraktives Ausgangsmaterial für die Herstellung von Ethanolkraftstoff durch Fermentierung, weil sie erneuerbar ist und zu geringen Kosten und in großen Mengen verfügbar ist. Das Konzept, Alkohol zu verwenden, der durch mikrobielle Fermentierung von Zuckern aus landwirtschaftlicher Biomasse hergestellt wurde, entstand mindestens vor zwei Jahrzehnten. Die wichtigsten der fermentierbaren Zuckerarten aus Zellulosematerialien sind Glucose und Xylose (mit einem Verhältnis von Glucose zu Xylose von etwa 2 oder 3 zu 1). Die am meisten erwünschten Fermentierungen von Zellulosematerialien würden natürlich sowohl Glucose als auch Xylose vollständig in Ethanol umwandeln. Leider gibt es selbst heute nicht einen einzigen bekannten Mikroorganismus, der in der Lage wäre, sowohl Glucose als auch Xylose wirksam zu fermentieren.

Hefen, vor allem Saccharomyces, sind nach herkömmlicher Art zur Fermentierung von Glucosebasierenden Ausgangsmaterialien zu Ethanol benutzt worden, und sie sind noch immer die besten Mikroorganismen zur Umwandlung von Glucose in Ethanol. Allerdings hat man herausgefunden, dass diese Hefen, welche Glucose fermentieren, nicht nur unfähig sind, Xylose zu fermentieren, sondern auch unfähig sind, den Pentose-Zucker zu Wachstumszwecken zu nutzen. Trotzdem können diese Hefen, welche Glucose fermentieren, Xylulose zu Wachstums- und Fermentierungszwecken (1) benutzen, wenn auch mit variierender Wirksamkeit. Beispielsweise fermentiert S. cerevisiae die Xylulose sehr schlecht, während Arten von Schizosaccharomyces dies sehr wirkungsvoll tun (Chiang et al., 1981; Lastick et al., 1989).

Obwohl die Hefen, welche Glucose fermentieren, nicht in der Lage sind, Xylose sowohl zu Wachstums- als auch zu Fermentierungszwecken zu benutzen, gibt es viele natürliche Hefen, die Xylose aerob zu Wachstumszwecken nutzen können, aber sie können Xylose nicht zu Ethanol fermentieren. Diese Xylose benutzenden/nicht fermentierenden Hefen basieren auf zwei Enzymen – Xylose-Reduktase und Xylitol-Dehydrogenase – um Xylose in Xylulose umzuwandeln. Diese Hefen sind verschieden von den meisten Bakterien, welche auf einem einzelnen Enzym – Xylose-Isomerase – basieren, um Xylose direkt in Xylulose (1) umzuwandeln. Die Xylose-Reduktase und Xylitol-Dehydrogenase der Hefen benötigen für ihr Funktionieren auch Co-Faktoren; Xylose-Reduktase hängt von NADPH als dessen Co-Faktor ab, und Xylitol-Dehydrogenase hängt von NAD als dessen Co-Faktor ab. Im Gegensatz hierzu benötigt die bakterielle Xylose-Isomerase keinen Co-Faktor zur direkten Umwandlung von Xylose in Xylulose (1).

Vor zwei Jahrzehnten wurde viel Aufwand betrieben, um neue Hefen zu finden, die in der Lage wären, sowohl Glucose als auch Xylose wirksam zu Ethanol zu fermentieren. Obwohl man keine solche ideale Hefe gefunden hat, hatten diese Anstrengungen doch einen begrenzten Erfolg. Beispielsweise hat man im Zusammenhang mit einige Hefen gefunden, dass dieselben nicht nur in der Lage sind, Xylose aerob zu Wachstumszwecken zu nutzen, sondern auch Xylose zu Ethanol zu fermentieren (Toivola et al., 1984; Dupreez und van der Walt, 1983), obwohl keine dieser Hefen, welche Xylose fermentieren, eine vollständige Wirksamkeit bei der Fermentierung von Xylose zu Ethanol zeigten (Jeffries, 1985). Darüber hinaus waren diese Hefen nicht dazu in der Lage, Glucose wirksam zu fermentieren.

Von den Hefen, welche Xylose fermentieren, wurden drei Arten ausführlich gekennzeichnet, Pachysolen tannophilus (Toivola et al., 1984), Candida shehatae (Dupreez und van der Walt, 1983), und Pichia stipitis (Grootjen et al., 1990). P. stipitis und Candida shehatae können Xylose besser fermentieren als andere Hefen, welche Xylose fermentieren (Grootjen et al., 1990). Dennoch fehlt sogar denjenigen Hefen, die Xylose am besten fermentieren können, eine große Wirksamkeit bei der Fermentierung von Xylose, und sie sind auch bezüglich der Fermentierung von Glucose höchst unwirksam (Jeffries, 1985).

In den vergangenen zehn Jahren wurden auch Anstrengungen unternommen, die Hefen, die traditionell Glucose fermentieren, genetisch zu verändern, vor allem S. cerevisiae, und zwar durch rekombinante DNA-Verfahren. Die ursprünglichen Bemühungen wurden auf die Klonierung eines Xylose-Isomerase-Gens zu Hefe konzentriert, so dass diese in der Lage wäre, Xylose unabhängig von Co-Faktoren direkt in Xylulose umzuwandeln. Allerdings waren diese Bemühungen nicht erfolgreich, weil die Gene, die verschiedene bakterielle Xylose-Isomerase codieren nicht in der Lage sind, die Synthese eines aktiven Enzyms in S. cerevisiae zu steuern (Rosenfeld et al., 1984; Ho et al., 1983; Sarthy et al., 1987; Wilhelm und Hollenberg, 1984; Amore et al., 1989).

In den letzten paar Jahre haben sich die Anstrengungen zur genetischen Entwicklung von Hefen, insbesondere von S. cerevisiae zur Fermentierung von Xylose, dahingehend konzentriert, Gene zu klonieren, welche Xylose-Reduktase (Takama et al., 1991; Hallborn et al., 1991; Strasser et al., 1990), Xylitol Dehydrogenase (Kötter et al., 1990; Hallborn et al., 1990) und Xylulokinase (Stevis et al., 1987; Chang und Ho, 1988, Ho und Chang, 1989; Deng und Ho, 1990) codieren. S. cerevisiae und andere Hefen, welche Glucose fermentieren, beinhalten keinerlei nachweisbaren Xylose-Reduktase- oder Xylitol-Dehydrogenase-Aktivitäten, aber alle scheinen sie eine Xylulokinase-Aktivität zu enthalten. Somit können alle Hefen, welche Glucose fermentieren, Xylulose fermentieren, aber dies mit wechselnder Wirksamkeit (Deng und Ho, 1990).

Kürzlich haben Kötter et al. (1990), Strasser et al. (1990) und Hallborn et al. (1990; 1991) sowohl die Xylose-Reduktase-Gene als auch die Xylitol-Dehydrogenase-Gene in S. cerevisiae kloniert. Aber diese gentechnisch entwickelten Hefen können Xylose immer noch nicht wirksam fermentieren. Beispielsweise waren diese Hefen unfähig, mehr als 2% Xylose zu fermentieren. Darüber hinaus produzieren sie große Mengen an Xylitol aus Xylose (Hallborn et al., 1990; Kötter und Ciriacy, 1993), wodurch das wertvolle Xylose-Substrat vom gewünschten Fermentierungsweg hin zum Ethanol abgelenkt wird.

Der umfangreiche Hintergrund in diesem Bereich zeigt, wie oben beschrieben, dass trotz der konzertierten und lang anhaltenden Anstrengungen zahlreicher Forscher, solche Hefen nicht gewonnen werden konnten, welche in der Lage wären, sowohl Glucose als auch Xylose wirksam zu Ethanol zu fermentieren. Somit bleibt die notwendige Suche nach solchen Hefen und Verfahren zu ihrer Herstellung und Anwendung bestehen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich genau auf diese notwendigen Erfordernisse.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Merkmal dieser Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung, der zufolge neue Hefestämme geschaffen werden können, welche in der Lage sind, Xylose allein oder gleichzeitig mit Glucose wirksam zu fermentieren, unter Verwendung von rekombinanter DNA und von Genklonierungs-Verfahren. Insbesondere sind diese Verfahren benutzt worden zur Schaffung neuer rekombinanter Hefen, die klonierte Xylose-Reduktase (XR)-, Xylitol-Dehydrogenase (XD)- und Xylulokinase (XK)-Gene enthalten, welche zu Promotoren verschmolzen werden, die von der anwesenden Glucose nicht gehemmt werden.

Dementsprechend liefert eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung einen rekombinanten Hefestamm, der eingeschleuste Gene enthält, welche Xylose-Reduktase, Xylitol-Dehydrogenase und Xylulokinase codieren und in der Lage sind, Xylose zu Ethanol zu fermentieren. Der rekombinante Hefestamm ist vorzugsweise auch in der Lage, Glucose zu Ethanol zu fermentieren, und noch stärker bevorzugt werden derartige Hefestämme verwirklicht, welche diese beiden Zuckerarten gleichzeitig wirksam zu Ethanol fermentieren können, wobei die XR-, XD- und XK-Gene zu Promotoren verschmolzen werden, die durch die Anwesenheit von Glucose nicht gehemmt werden und auch keine Xylose zur Induktion benötigen.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung liefert einen rekombinanten Hefestamm, der Gene enthält, welche Xylose-Reduktase, Xylitol-Dehydrogenase und Xylulokinase codieren, wobei die genannten Gene zu Promotoren verschmolzen werden, welche von Glucose nicht gehemmt werden, und wobei die genannte Hefe in der Lage ist, Xylose zu Ethanol zu fermentieren. Der rekombinante Hefestamm ist vorzugsweise auch in der Lage, Glucose zu Ethanol zu fermentieren.

Andere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beziehen sich auf Reagenzien, die für die Herstellung von rekombinanten Hefen gemäß der Erfindung nützlich sind. Auf diese Weise liefert die vorliegende Erfindung auch ein rekombinantes DNA-Molekül, das Gene enthält, welche Xylose-Reduktase, Xylitol-Dehydrogenase und Xylulokinase codieren. Die Erfindung liefert auch einen Vektor, der Gene enthält, welche Xylose-Reduktase, Xylitol-Dehydrogenase und Xylulokinase codieren. In diesen Reagenzien werden die Gene vorzugsweise zu Promotoren verschmolzen, die durch Glucose nicht gehemmt werden und auch keine Xylose zur Induktion benötigen, um so die zweckdienliche Herstellung rekombinanter Hefen zu ermöglichen, welche in der Lage sind, gleichzeitig Glucose und Xylose zu Ethanol zu fermentieren.

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liefert ein Verfahren zur Gewinnung einer rekombinanten Hefe, die in der Lage ist, Xylose zu Ethanol zu fermentieren. Dieses Verfahren beinhaltet den Schritt des Einschleusens der DNA in eine Hefe, um dadurch die Hefe zu veranlassen, dass die eingeschleusten Gene Xylose-Reduktase, Xylitol-Dehydrogenase und Xylulokinase codieren. Vorzugsweise werden diese Gene zu Promotoren verschmolzen, die durch Glucose nicht gehemmt werden, um das gleichzeitige Fermentieren von Glucose und Xylose zu Ethanol zu ermöglichen. Vorteilhafterweise können alle drei Gene gleichzeitig eingeschleust werden, beispielsweise unter Verwendung der Reagenzien gemäß der Erfindung, so wie dies oben diskutiert worden ist.

Noch weitere Ausführungsformen der Erfindung liefern Verfahren zum Fermentieren von Xylose oder Glucose zu Ethanol. Die Verfahren gemäß der Erfindung umfassen den Schritt des Fermentierens eines Xylose oder Glucose enthaltenden Mediums mit einem rekombinanten Hefestamm, der eingeschleuste Gene enthält, welche Xylose-Reduktase, Xylitol-Dehydrogenase und Xylulokinase codieren. Es ist erwünscht, dass die drei eingeschleusten Gene zu Promotoren verschmolzen werden, welche nicht durch Glucose gehemmt werden, und dass das Medium sowohl Glucose als auch Xylose enthält, um das gleichzeitige Fermentieren von Xylose und Glucose zu Ethanol zu liefern.

Zusätzliche bevorzugte Ausführungsformen, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden durch die nachfolgende die Beschreibung offenkundig werden.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

1 ist ein schematisches Diagramm der Enzyme, die mit den frühen Stadien des Xylose-Metabolismus in Bakterien und Hefen assoziiert sind.

2 zeigt die Nukleotid-Sequenz und die abgeleitete Aminosäure-Sequenz der Xylulokinase-Hefegene, einschließlich ihrer 5'- und 3'-Flankierungs-Sequenzen. Das Start-Kodon und das Stop-Kodon sind unterstrichen. Die möglichen Steuerungs-Sequenzen in den nicht-codierenden 5'- und 3'-Bereichen sind durch Pfeile angegeben.

3 zeigt die auf dem Plasmid pLSK15 klonierten Gene und die Restriktionskarte des pLSK15-Plasmids.

4 zeigt die auf dem Plasmid pUCKm10 klonierten Gene und die Restriktionskarte des pUCKm10-Plasmids.

5 zeigt die auf dem Plasmid pLNH21 klonierten Gene und die Restriktionskarte des pLNH21-Plasmids.

6A zeigt ein HPLC-Chromatogramm einer Fermentierungs-Nährbrühe, die durch Fermentieren von Xylose mit rekombinanter Hefe SC (pLNH21) (S. cerevisiae, die eingeschleuste XR-, XD- und XK-Gene enthält) während (I) 2 Tagen und während (II) 4 Tagen gewonnen wurde.

6B zeigt ein HPLC-Chromatogramm einer Fermentierungs-Nährbrühe, die durch Fermentieren von Xylose mit rekombinanter Hefe SC (pLNH13-32) (S. cerevisiae, die eingeschleuste XR- und XD-, aber keine XK-Gene enthält) während (I) 2 Tagen und während (II) 6 Tagen gewonnen wurde.

6C zeigt ein HPLC-Chromatogramm einer Fermentierungs-Nährbrühe, die durch Fermentieren von Xylose mit einer nicht (gentechnisch) entwickelten S. cerevisiae-Hefe, (die keine eingeschleuste XR-, XD- oder XK-Gene enthält) während (I) 2 Tagen und während (II) 7 Tagen gewonnen wurde, so wie weitergehender im Beispiel 6 beschrieben.

7 zeigt die auf dem Plasmid pLNH33 klonierten Gene und die Restriktionskarte des Plasmids pLNH33.

8A zeigt ein HPLC-Chromatogramm einer Fermentierungs-Nährbrühe, die durch Fermentieren eines Glucose und Xylose enthaltenden Mediums (jeweils 10% bzw. 5%) mit einem nicht (gentechnisch) entwickelten Hefestamm 1400 (der keine eingeschleusten XR-, XD- oder XK-Gene enthält) während (I) 0 Tagen und während (II) 2 Tagen gewonnen wurde, so wie weitergehender im Beispiel 8 beschrieben.

8B zeigt ein HPLC-Chromatogramm einer Fermentierungs-Nährbrühe, die durch Fermentieren eines Glucose und Xylose enthaltenden Mediums (jeweils 10% bzw. 5%) mit einer rekombinanten Hefe 1400 (pLNH33) (Hefe 1400, die eingeschleuste XR-, XD- und XK-Gene enthält) während (I) 0 Tagen und während (II) 2 Tagen gewonnen wurde, so wie weitergehender im Beispiel 8 beschrieben.

9 ist ein schematisches Diagramm, das die Erzeugung von pBluescript II KS(–) beschreibt, welches die klonierten XR-, XD- und XK-Gene enthält: Vier derartige Plasmide wurden konstruiert: pKS(–)-KK-A*R-KD-1; pKS(–)-KK-A*R-KD-2; pKS(–)-KK-AR-KD-3; und pKS(–)-KK-AR-KD-4, wie weitergehender in Beispiel 4 beschrieben.

10 zeigt die unmittelbare Amplifikation der intakten Xylitol-Dehydrogenase-Gene und das promotorfreie XD aus P. stipitis Chromosomen-DNA mit Hilfe des Polymerase-Kettenreaktionsverfahrens (PCR); von links, Streifen 1: Molekül-Marker, durch BamHI-EcoRI digerierte 1 DNA; Streifen 2: Pichia-Xylitol-Dehydrogenase-Gen (intakt); Streifen 3: Pichia-Xylitol-Dehydrogenase-Gen (promotorfrei); und Streifen 4: Molekül-Marker, durch HaeIII digeriert ϕX-DNA.

11 stellt die für das Sequenzieren des Hefe-Xylulokinase-Gens benutzten Strategien als Diagramm dar.

12 ist ein schematisches Diagramm, welches die Erzeugung des Plasmids pLNH21 beschreibt.

13 zeigt ein HPLC-Chromatogramm einer Fermentierungs-Nährbrühe, die durch Fermentieren einer Mischung aus Glucose (10%) und Xylose (5%) mit S. cerevisiae SC (pLNH13-32), (welche nur die XR- und die XD-Gene enthält) während (I) 0 Tagen, während (II) 2 Tagen und während (III) 5 Tagen gewonnen wurde.

14 zeigt ein HPLC-Chromatogramm der Fermentierungs-Nährbrühe, die durch Fermentieren einer Mischung aus Glucose (10%) und Xylose (5%) mit nicht (gentechnisch) entwickelter Pichia stipitis während (I) 0 Tagen, während (II) 3 Tagen und während (III) 5 Tagen gewonnen wurde.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG

Zum Zweck des besseren Verständnisses der Grundlagen der Erfindung wird nun hier auf bestimmte Ausführungsformen derselben Bezug genommen, und dabei wird eine spezielle Sprache zur Beschreibung der Erfindung benutzt. Dennoch muss verstanden werden, dass dadurch keine Begrenzung des Umfangs der Erfindung beabsichtigt ist, dass derartige Veränderungen, zusätzliche Änderungen und Anwendungen der Grundlagen der Erfindung, wie sie hierin bildlich dargestellt werden, so zu betrachten sind, als würden sie von Fachleuten des technischen Bereiches vorgenommen, zu dem die Erfindung gehört.

Die vorliegende Erfindung liefert rekombinante Hefen, DNA-Moleküle und Vektoren, welche XR-XD- und XK-Gene enthalten. Es ist hinreichend bekannt, dass derartige Gene bei vielen verschiedenen Mikroorganismen vorkommen, und es wurden, wie hier oben diskutiert, zahlreiche XR-, XD- und XK-Gene tatsächlich identifiziert und isoliert. Die besondere Quelle dieser Gene ist für die breiten Aspekte dieser Erfindung nicht von Bedeutung; vielmehr eignen sich beliebige DNAs, welche Proteine (Enzyme) codieren, die eine Xylose-Reduktase-Aktivität aufweisen (die Fähigkeit, D-Xylose zu Xylitol mit NADPH oder NADH als Co-Faktor umzuwandeln), die eine Xylitol-Dehydrogenase-Aktivität aufweisen (die Fähigkeit, Xylitol zu D-Xylulose mit NAD+ als Co-Faktor umzuwandeln), oder die eine Xylulokinase-Aktivität aufweisen (die Fähigkeit, D-Xylulose zu D-Xylulose-5-Phosphat umzuwandeln). Diese Gene können als natürlich vorkommende Gene gewonnen werden, oder sie können modifiziert werden, beispielsweise durch Addition, Substitution oder Entfernen von Basisstrukturen zu den natürlich vorkommenden Genen oder von den natürlich vorkommenden Genen, so lange das codierte Protein noch eine XR-, XD- oder XK-Aktivität aufweist. In ähnlicher Weise können die Gene oder Teile davon mit Hilfe bekannter Verfahren synthetisch hergestellt werden, wiederum so lange wie die resultierende DNA ein Protein codiert, welches die gewünschte XR-, XD- oder XK-Aktivität zeigt.

Beispielsweise gehören zu geeigneten Quellen von XR- und XD-Genen solche Hefen, welche Xylose benutzen, beispielsweise Candida shehatae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus, zu geeigneten Quellen von XK-Genen gehören die oben genannten Hefen, welche Xylose benutzen, sowie auch Hefen, welche keine Xylose benutzen, beispielsweise die von der Gattung Saccharomyces, z. Bsp. S. cerevisiae, von der Gattung Schizosaccharomyces, z. Bsp. Schizosaccharomyces pombe, und Bakterien wie Escherichia coli, die Bazillus-Art, die Streptomyces-Art, usw. Aus diesen Quellen kann man unter Verwendung von herkömmlichen methodologischen Verfahren die Gene wiedergewinnen, die von Interesse sind. Beispielsweise können zu diesem Zweck Verfahren der Hybridisierung, der Komplementation oder PCR-Verfahren angewandt werden.

Die besonderen XR-Gene, die bei den hier vorliegenden Studien der Antragsteller verwendet wurden, sind durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Chen und Ho, 1993) aus P. stipitis kloniert worden. Die für die Amplifikation von XR aus der Chromosomen-DNA durch PCR erforderlichen Oligonukleotiden wurden gemäß der veröffentlichten Sequenz des P. stipitis-XR-Gens synthetisiert (Takama et al., 1991). Das amplifizierte XR wurde zuerst kloniert und in dem Plasmid UC19 gespeichert. Das klonierte XR wurde dann mit unterschiedlichen Promotoren zusammengeschlossen, einschließlich der Promotoren des Hefe-TRP5-Gens (Zalkin und Yanofsky, 1982) und des Hefe-Alkohol-Dehydrogenase-I-Gens (ADCI) (Ammerer, 1983; Bennetzen und Hall, 1982).

Das in den Studien der Antragsteller benutzte XD-Gen wurde auch durch PCR aus P. stipitis kloniert. Die für die Amplifikation von XD aus der Pichia-Chromosom-DNA erforderlichen Oligonukleotiden wurden gemäß der veröffentlichten Sequenz des Pichia-XD-Gens synthetisiert (Kötter et al., 1990). Das amplifizierte XD wurde auch zuerst kloniert und in pUC19 gespeichert. Das Gen wurde dann anschließend mit glycolytischen Promotoren des Pyruvat-Kinase-Gens (PYK) von Hefe (Burke et al., 1983) und des Glycerinaldehyd-3-Phosphodehydrogenase-Gens (GPD) von Hefe (Holland und Holland, 1979) zusammengeschlossen.

Die Antragsteller haben drei unterschiedliche XK-Gene kloniert, und zwar die von S. cerevisiae (Ho und Chang, 1989), P. tannophilus (Stevis et al., 1987) und E. coli, und sie haben herausgefunden, dass alle drei Gene wirkungsvoll in S. cerevisiae exprimiert werden können, nach dem Zusammenschluss zu einem hochwirksamen Hefepromotor. Das klonierte S. cerevisiae-Xylulokinase-Gen ist in der hierin dargestellten Arbeit benutzt worden. Zur Unterstützung des richtigen Zusammenschlusses des XK-Hefe-Gens mit einem geeigneten Promotor ist die vollständige Nukleotidensequenz des S. cerevisiae-XK-Gens, einschließlich dessen 5'- und 3'-nicht codierenden Sequenz, analysiert und in der 2 dargestellt worden.

Eine große Vielfalt von Promotoren wird sich zur Verwendung im Rahmen der Erfindung eignen. Grob gesprochen wird man hefeverträgliche Promotoren verwenden, die in der Lage sind, die Transkription der XR-, XD- oder XK-Gene zu steuern. Solche Promotoren sind aus zahlreichen Quellen verfügbar, einschließlich der Hefen, Bakterien und sonstiger Zell-Quellen. Vorzugsweise handelt es sich bei den im Rahmen dieser Erfindung benutzten Promotoren um wirksame, nicht durch Glucose gehemmte Promotoren, die keine Xylose für die Induktion benötigen. In dieser Hinsicht bezieht sich ein „wirksamer" Promotor, so wie hier benutzt, auf einen Promotor, der ein hohes Transkriptionsniveau des zusammengeschlossenen Gens liefert. Promotoren mit diesen Merkmalen sind auch reichlich verfügbar, und ihre Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird, nach Maßgabe der hier gegebenen Lehren, innerhalb des beruflichen Wissensbereichs normaler Fachleute liegen, so wie auch der Fall ist für den Zusammenschluss der Promotoren mit den XR-, XD- und XK-Genen, für das Klonieren der Promotor-/Gen-Zusammenschluss-Produkte zu geeigneten Vektoren und für die Verwendung der Vektoren zur Hefetransformation. Alle diese Manipulationen können unter Verwendung von herkömmlichen gentechnischen Verfahren durchgeführt werden, welche in Fachkreisen und in der Fachliteratur wohlbekannt sind.

Wenn man die hier vorliegende darstellende Arbeit des Antragstellers genauer beschreibt, so ist das Xylulokinase-Gen XK der Hefe mit Promotoren aus Alkohol-Dehydrogenase-Hefe-Gen (ADCI), Pyruvatkinase-Hefe-Gen (PYK), aus TRP5-Hefe-Gen usw. zusammengeschlossen worden. Das mit dem TRP-5 Promotor zusammengeschlossene XK wurde zum Konstruieren von pLNH21 (5) benutzt und das mit dem PYK Promotor zusammengeschlossene XK wurde zum Konstruieren von pLNH33 (7) benutzt.

Der Zusammenschluss von XR, XD und XK zu intakten Promotoren aus ADCI, PYK, GPD usw. wurde durch Klonieren sowohl des Fragment-Gens, das den spezifischen Promotor enthält, als auch des Struktur-Gens von XR, XD oder XK auf einem der Bluescript-KS-Plasmide (Stratagene, La Jolla, CA) durchgeführt, gefolgt von einem Entfernen der extra unerwünschten Nukleotiden durch ortsspezifische Mutagenese (Kunkel et al., 1987). Die Erfindung liefert somit auch verschiedene pBluescript II KS(–) Derivate [nachfolgend hierin als pKS(–) bezeichnet], welche die klonierten XD (mit dem Pyruvat-Dehydrogenase-Promotor zusammengeschlossen), XR (mit dem ADCI-Promotor zusammengeschlossen), und XK (mit dem Pyruvatkinase-Promotor zusammengeschlossen) enthalten. Diese rekombinanten Plasmide werden als pKS(–), KD-AR (oder A*R)-KK) bezeichnet. Es wurden vier solche Plasmide konstruiert, wie in 9 dargestellt. Diese Plasmide besitzen ähnliche, aber keine identischen Strukturen. Die XR, XD und XK [oder KD-AR (oder A*R)-KK], welche auf diese Plasmiden kloniert wurden können von dem Mutter-pKS(–)-Plasmid mit Hilfe einer einzelnen Xho1-Restriktionsdigestion getrennt werden.

Die XR-, XD- und XK-Gene, die zu den richtigen Promotoren zusammengeschlossen wurden, sind dann auf pLSK15 (3) oder pUCKm1o (4) kloniert worden. Das pLSK15, ein Derivat von pLX10-14 (Stevis und Ho, 1985), ist ein Plasmid mit einer niedrigen Kopienanzahl (copy number), welches eine Kopienanzahl von etwa 10 in Hefe (S. cerevisiae) aufweist. Es enthält das 2 &mgr;-Hefe-Replikon, mit dessen Hilfe das Plasmid in S. cerevisiae und in Arten mit engem Bezug dazu autonom dupliziert werden kann. Das pLSK15 enthält auch das Geneticin-(Kanamycin)-Resistenz-Gen (KmR) und das Ampicillin-Resistenz-Gen (ApR und auch ampr), welche als Selektions-Marker in S. cerevisiae und in anderen Hefen gelten. Das pLSK15 enthält auch das XK-Gen, das zum TRP-5-Promotor zusammengeschlossen wurde. Auf diese Weise sind XR- und XD-Gene, die zu richtigen, nicht-codierenden 5'-Sequenzen zusammengeschlossen wurden, die geeignete Promotoren enthalten, in pLSK15 eingesetzt worden, um die Wirkungsweise der resultierenden Plasmide auf die Xylose-Hefe-Fermentierung darzustellen. Um die Wirkung der Anwesenheit verschiedener Gene auf die Xylose-Hefe-Fermentierung zu vergleichen, wurde auch ein Plasmid verwendet, das nur XR und XD enthielt, um S. cerevisiae und die bei vergleichenden Fermentierungen verwendete resultierende Hefe umzuwandeln. In 6A, 6B, und 6C werden die Ergebnisse der Fermentierung von Xylose durch eine nicht entwickelte S. cerevisiae-Hefe gezeigt, welche die klonierten XR, XD und XK (SC(pLNH21)) enthält, und Hefe, welche die kloniertenXR und XD, nicht aber die XK-Gene (SC(pLNH13-32)) enthält.

Das pUCKm10 (4) ist ein Plasmid mit einer hohen Kopienanzahl (d.h. ein Plasmid mit einer Kopienanzahl von etwa 50 oder mehr), das eine Kopienanzahl von dicht bei 100 in S. cerevisiae aufweist. Das pUCKm10 ist ein pUC9-Derivat, welches das identische 2 &mgr;-Replikon enthält, sowie die in pLSK15 vorhandenen KmR- und ApR-Gene. Diese spezifischen DNA-Fragmente dienen als Replikon und Selektionsmarker, welche es ermöglichen, dass das Plasmid in S. cerevisiae (und in entsprechenden Hefen) autonom dupliziert werden kann, und welche es auch ermöglichen, dass die Hefe-Transformatoren, welche das Plasmid enthalten, von den nicht umgewandelten Wirtszellen unterschieden werden können.

Die Antragsteller haben pUCKm10-basierte, rekombinante Plasmide konstruiert, welche die gleichen XR, XD und XK enthalten, das zu richtigen, nicht kodierenden 5'-Sequenzen zusammengeschlossen wurden, welche geeignete Promotoren enthalten. Diese Vektoren sind so ausgelegt, dass sie für die Umwandlung bzw. Transformation aller S. cerevisiae-Stämme und der Stämme ähnlicher Arten nützlich sind. Es sind keine speziellen Mutanten erforderlich, die als die Empfänger-Stämme wirken sollen. Auf diese Weise können Plasmide wie z. B. das pLNH33 (7) sowie das pLNH21 (5) verwendet werden, um industrielle S. cerevisiae und andere Stämme einer Transformation zu unterziehen.

Die Hefe-Transformation mit Derivaten entweder von pLSK15 oder von pUCKm10 wurde mit Hilfe der Elektroporation durchgeführt, wobei im Allgemeinen die von Becker und Guarente (1991) beschriebene Prozedur angewandt wurde. Authentische Umwandler bzw. -Transformatoren der Hefe, welche Derivate entweder von pLSK15 oder von pUCKm10 enthalten, sind isoliert worden, wie weiter unten beschrieben. Das in den Plasmiden vorhandene KmR diente als der primäre Selektionsmarker, welcher beliebige Wirtszellen, die eine dieser Plasmide erhalten, gegenüber einer viel höheren Konzentration eines in dem Medium vorhandenen Geneticins widerstandsfähig macht. Allerdings können einige Hefezellen induziert werden, damit sie gegenüber den Transformatoren, welche das Plasmid enthalten, in gleichem Maße geneticin-resistent werden. Somit ist nicht jede geneticin-resistente Kolonie ein wirklicher Transformator. Es ist berichtet worden, dass ApR in S. cerevisiae exprimiert werden kann, letztere aber ohne Anwesenheit von ApR ampicillin-resistent ist. Somit kann ApR nicht als Selektionsmarker für Hefetransformation mit Plasmid-Mediation dienen. Trotzdem können Hefen, die das hoch exprimierte ApR enthalten, genügend Penicillinase erzeugen und es ermöglichen Kolonien, welche solche Hefen enthalten, auf speziellen festen Platten durch den Penicillinase-Test zu identifizieren (Chevallier und Aigle, 1979). Mit dem letzten Test steht ein Verfahren zur Verfügung, mit dem die wirklichen Transformatoren von S. cerevisiae und anderen Hefen aus den geneticin-resistenten Kolonien identifiziert werden können.

Eine Xylose-Hefe-Fermentierung (oder Xylose- und Glucose-Hefe-Fermentierung) ist unter Verwendung der erfundenen rekombinanten Hefen unter anaeroben Bedingungen, wie in den Beispielen 6 bis 9 beschrieben, durchgeführt worden. Der Verbrauch an Zuckern (Xylose und Glucose) und die Bildung von Ethanol und anderen Produkten, etwa von Xylitol, wurden während der Fermentierung dadurch überwacht bzw. verfolgt, dass man Proben nahm und sie durch HPLC analysiert hat, wie dies weitgehender in Beispiel 6 beschrieben wird.

Beispielsweise wurde das pLNH21 (5) zur Transformation von S. cerevisiae benutzt. Der resultierende Transformant, der pLNH21 enthält, wird als SC(pLNH21) bezeichnet und kann 5% Xylose in zwei bis vier Tagen nahezu vollständig zu Ethanol fermentieren, wie in 6A gezeigt.

Als weiteres Beispiel wurde pLNH33 (7) benutzt, um den Hefestamm 1400 umzuwandeln, der einen engen Bezug zu S. cerevisiae besitzt sowie eine hohe Toleranz gegenüber Alkohol und der Temperatur (D'Amore et al., 1989; D'Amore, 1990) aufweist. Die resultierende, genetisch entwickelte Hefe mit der Bezeichnung 1400 (pLNH33), kann 10% Glucose und 5% Xylose in zwei bis vier Tagen vollständig zu Ethanol fermentieren, ohne hohe Zelldichten zu benötigen, wie in den 8A und 8B gezeigt wird.

Das pLNH33 ist ein wirksameres Plasmid zur Xylose-Fermentierung als das pLNH21, weil es sich um ein Plasmid mit höherer Kopienanzahl handelt. Darüber hinaus wird XK in pLNH33 zu einem wirksameren Promotor zusammengeschlossen als XK in pLNH21. S. cerevisiae wurde auch mit pLNH33 umgewandelt und trägt die Bezeichnung SC(pLNH33). Obwohl SC(pLNH33) viel wirksamer bei der Fermentierung von Xylose oder von Mischungen von Xylose und Glucose ist als SC(pLNH21), hat man gefunden, dass 1400(pLNH33) bei der Fermentierung von Mischungen von Xylose und Glucose wirksamer ist als SC(pLNH33). Somit haben individuelle Stämme auch Auswirkungen auf die Wirksamkeit der Fermentierung. Ähnlich wie bei S. cerevisiae kann der nicht entwickelte Stamm 1400 die Xylose nicht benutzen oder fermentieren (allein oder in einer Mischung von Glucose und Xylose), so wie in 8B gezeigt.

Im Allgemeinen zeigen die Ergebnisse dieser Fermentierungstests, dass es notwendig ist, dass die Hefe drei eingeschleusten Gene enthält, nämlich XR, XD und XK, die zu geeigneten Promotoren richtig zusammengeschlossen wurden (vorzugsweise wirksame glycolytische oder sonstige Promotoren, die nicht durch Glucose gehemmt sind und die keine Xylose für die Induktion benötigen), und dass diese Gene in koordinierter Weise exprimiert werden, um die Hefe in die Lage zu versetzen, Xylose nur zu Ethanol, und nicht zu anderen Nebenprodukten wie Xylitol zu fermentieren.

Die Ergebnisse zeigen darüber hinaus die Bedeutung des Klonierens eines Xylulokinase-Gens (XK) zusätzlich zu dem XR und XD, um die Hefen dazu zu bringen, Xylose wirksam zu fermentieren, insbesondere dazu zu bringen, sowohl Glucose als auch Xylose gleichzeitig zu fermentieren, wenn sie in dem gleichen Medium vorhanden sind, wie z.B. in den Hydrolyzaten von Zellulose-Biomasse. Ähnlich wie beim XR und XD wird das klonierte XK vorzugsweise zu einem geeigneten, wirksamen glycolytischen oder sonstigen Promotor zusammengeschlossen, der nicht einer Hemmung durch Glucose unterliegt und der darüber hinaus keine Xylose für die Induktion benötigt.

Die Antragsteller haben auch herausgefunden, dass eine Hefe, welche lediglich die klonierten XR und XD enthält, nur Glucose zu Ethanol fermentieren kann, nicht aber Xylose, wenn diese beiden Zuckerarten in dem Kulturmedium vorhanden sind (siehe 13). Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse der Antragsteller, dass es notwendig ist, dass jede beliebige Hefe, einschließlich der Hefen, die Xylose fermentiert, wie z.B. P. stpitis und C. shehatae, auch XR, XD und XK enthält und zu Promotoren zusammengeschlossen werden, welche nicht durch die Anwesenheit von Glucose gehemmt sind und welche keine Xylose für die Induktion benötigen, um in der Lage zu sein, sowohl Glucose als auch Xylose zu Ethanol zu fermentieren, wenn diese beiden Zuckerarten gemeinsam in dem Kulturmedium vorhanden sind. 13 zeigt, dass S. cerevisiae und verwandte Arten, welche nur die klonierten XR- und XD-Gene enthalten, die zu richtigen Promotoren zusammengeschlossen wurden, nur Glucose, aber nicht Xylose zu Ethanol fermentieren können, wenn diese beiden Zuckerarten in dem Kulturmedium vorhanden sind. In ähnlicher Weise zeigt 14, dass nicht entwickelte P. stipitis, welche ihre ursprünglichen XR, XD und XK enthält, die Xylose fermentieren kann, wenn letztere Zuckerart die einzige Kohlenstoffquelle des Mediums ist (Ergebnisse sind nicht gezeigt), jedoch die Xylose nicht fermentieren kann, wenn sowohl Glucose als auch Xylose die in dem gleichen Medium vorliegenden Kohlenstoffquellen sind.

Es versteht sich, dass bei den Hefen, welche nur geringe Aktivitätsgrade der Xylulokinase aufweisen, das Einschleusen der XK-Gene zwei Zwecken dient. Der eine Zweck besteht darin den Aktivitätsgrad des Enzyms zu erhöhen. Hohe Grade an XK-Aktivität sind wichtig, um eine vorteilhaftere Hefe-Fermentierung von Xylose zu Ethanol zu erreichen, im Gegensatz zu Xylitol. Der andere Zweck besteht darin, das Gen unter die Steuerungskontrolle eines wirksamen Promotors zu stellen, welcher durch die Anwesenheit von Glucose nicht gehemmt wird. Es ist wohlbekannt, dass natürliche Mikroorganismen von der wilden Art, einschließlich der Hefen, andere Zuckerarten zu Wachstums- und Fermentierungszwecken nicht verwenden können, wenn Glucose in dem Kulturmedium vorhanden ist. Glucose wird die Synthese der für das Metabolisieren von anderen Zuckermolekülen erforderlichen Enzyme hemmen (der so genannte Glucose-Effekt). Somit werden Promotoren aus Genen für die Synthese von Enzymen, welche Zuckermoleküle metabolisieren, ausschließlich der Glucose, nicht bevorzugt werden, weil diese Promotoren keine gleichzeitige Fermentierung der zwei im Überfluss vorhandenen Zuckerarten bewerkstelligen. Darüber hinaus hat man bei den Arbeiten der Antragsteller herausgefunden, dass das Zellwachstum auch eine Voraussetzung für die Induktion ist. Somit werden Promotoren, welche Xylose für die Induktion benötigen, nicht für die Expression von XR, XD und XK bevorzugt.

Die folgenden Beispiele werden geliefert, um das Verständnis der vorliegenden Erfindung und die Vorteile derselben noch weiter zu verbessern. Es wird verständlich, dass diese Beispiele lediglich illustrativen Charakter besitzen und von ihrer Natur her keine Begrenzung darstellen.

BEISPIEL 1 SYNTHETISIEREN VON XR- UND XD-GENEN DURCH PCR

Die Synthese von intakten oder promotorlosen XR durch PCR ist zuvor beschrieben worden (Chen und Ho, 1993). Für die Synthese von XD durch PCR wurden drei Oligonukleotide gemäß der Nukleotidensequenz von XD (Kötter et al., 1990) synthetisiert und unten aufgelistet:

Oligonukleotid I: pTCTAGACCACCCTAAGTCG

Oligonukleotid II: pCACACAATTAAAATGA

Oligonukleotid III: pGGATCCACTATAGTCGAAG

Die Oligonukleotide I und II wurden verwendet, um das intakte XD-Gen zu synthetisieren und die Oligonukleotiden II und III wurden verwendet, um das promotorlose XD zu synthetisieren, wie in 10 gezeigt. Das intakte XD und das promotorlose XD wurden zuerst im pKS(–)-Plasmid kloniert. Das intakte XR wurde dann auf pUCKm10 (4) unter-kloniert, und das resultierende Plasmid pUCKm10-XD wurde verwendet, um S. cerevisiae durch Elektroporation umzuwandeln, so wie im Beispiel 5 beschrieben. Die Hefe-Transformanten wurden verwendet, um die Xylitol-Dehydrogenase-Aktivität zu prüfen und um zu zeigen, dass das klonierte Gen intakt ist und in S. cerevisiae exprimiert werden kann.

BEISPIEL 2 ZUSAMMENSCHLUSS DES PROMOTORLOSEN XD-GENS MIT DEM PYRUVATKINASE-HEFE-GENPROMOTOR

Der Zusammenschluss des XD-Gens mit dem PPK wurde gewählt, um den präzisen Zusammenschluss von die Xylose metabolisierenden Genen zu intakten Promotoren mit Hilfe einer durch den Standort gesteuerten Mutagenese anschaulich darzustellen. Bei diesen Promotoren handelt es sich entweder um glycolytische Promotoren oder um Promotoren, die durch die Anwesenheit von Glucose in dem Kulturmedium nicht gehemmt werden und auch keine Anwesenheit von Xylose für die Induktion benötigen.

Das Promotor-Fragment der Pyruvatkinase-Hefe von –910 bis +23 (Burke et al., 1983) wurde zur Synthese des XD-Gen, so wie in dem Beispiel 1 beschrieben mit Hilfe der PCR synthetisiert. Sowohl das PPK-Fragment als auch das promotorlose XD wurden auf pKS(–)-Plasmid unter-kloniert und die unerwünschten Nukleotide zwischen dem PPK und dem intakten XD-Struktur-Gen wurden durch eine für den Standort spezifische Mutagenese gemäß der Prozedur von Kunkel entfernt (Kunkel, 1987). Das resultierende, zusammengeschlossene Gen enthält –910 bis –1 Promotorfragmente von dem Pyruvatkinase-Gen und +1 bis +1963 Nukleotide von dem Pichia-XD-Gen. Das resultierende pKS(–)-Plasmid, welches PPK-XD (oder KD) enthält wird mit pKS(–)-KD oder pKD2 bezeichnet.

BEISPIEL 3 ANALYSE DER NUKLEOTID-SEQUENZ DES XYLULOKINASE-HEFE-GENS

Über das Klonieren eines DNA-Fragments mit 7,0 kb Hefe (S. cerevisiae), welches das Xylulokinase-Hefe-Gen enthält, ist schon früher berichtet worden (Ho und Chang, 1989). Das XK-Gen ist durch Unter-Klonieren auf einem 2,4 kb-Fragment lokalisiert worden. Die Nukleotid-Sequenz des 2,4 kb-Fragmentes ist analysiert worden. Der 5'-, nicht-codierende Bereich enthält 345 Nukleotiden, der einer Translation unterworfene Bereich enthält 2118 Nukleotiden, und die durch XK codierte Xylulokinase enthält 591 Aminosäuren, wie in 2 gezeigt. Die für das Sequenzieren des XK-Gens benutzte Strategie wird in 11 dargestellt.

BEISPIEL 4 KONSTRUKTION EINES INTAKTEN ADC1-PROMOTORS

Das Plasmid pMA56 (Ammerer, 1983) enthält den Alkohol-Dehydrogenase-I-Hefepromotor (PADC1). Die Antragsteller haben diesen Promotor verwendet, um einige Gene bei ihrer Arbeit zu verändern. Beispielsweise wurde PADC1 zu XR zusammengeschlossen, und das resultierende Gen erhielt die Bezeichnung PADC1-XR oder AR. Trotzdem ist dieses PADC1 nicht intakt und enthält nicht die –1 bis –14 Nukleotide des intakten ADC1-Promotors (Bennetzen und Hall, 1982). Der Bereich –1 bis –14 eines Gens ist gewöhnlich für die Steuerung der Proteinsynthese sehr bezeichnend. Jedes beliebige Gen, das zu einem derartigen Promotor zusammengeschlossen wird, muss sich auf sein ursprüngliches genetisches Signal zur Steuerung der Synthese seines Proteinproduktes verlassen.

Zu besseren Steuerung der Expression des zu dem ADCI-Promotor zusammengeschlossenen Gens haben die Antragsteller eine für den Standort spezifische Mutagenese angewandt, um die fehlenden Nukleotide (–1 bis –14) zu dem auf pMA56 klonierten ADCI-Promotor hinzuzufügen. Der neue intakte ADCI-Promotor wird mit P*ADC1 bezeichnet. Dieser Promotor ist verwendet worden, um XR zu verändern und das resultierende Gene wird als P*ADC1-XR oder als A*R bezeichnet.

BEISPIEL 5 KONSTRUKTION DES PLASMIDS pLNH21 (AUCH ALS pLSK15-KD-AR BEZEICHNET) UND TRANSFORMATION VON S. CEREVISIAE UND 1400 MIT pLNH21

Die Konstruktion von pLNH21 wird in 12 umrissen. Das pLNH21 wurde benutzt, um S. cerevisiae und den Stamm 1400 unter den nachfolgenden Bedingungen durch Elektroporation zu transformieren. 50 ml Hefezellen, die bis zu einer frühen Bestimmungsphase gezüchtet worden waren [Klett-Einheit („KU") 130] wurden zentrifugiert, um das Medium zu entfernen, zweimal mit kaltem Wasser gewaschen, einmal mit kaltem 1 M-Sorbitol gewaschen und erneut in 200 &mgr;l 1 M-Sorbitol in Suspension gebracht. Sechzig &mgr;l der Zellen wurden in ein vorher sterilisiertes 4 ml-Plastikröhrchen (mit Deckel) überragen und in dieses wurden zwischen 0,1 &mgr;g und 1 &mgr;g Plasmid-DNA hinzugefügt. Fünfzig &mgr;l der resultierenden Zellen und der Plasmidmischung wurden in eine vorher gekühlte Genpulser-Kuvette mit einem 0,2 cm Elektrodenabstand hinein pipettiert, und der Inhalt der Küvette wurde mit Hilfe des Genpulsers mit einem Pulskontrollers (BioRad) bei 2,0 KV, 25 &mgr;F und 200 Ohm einem Pulsieren unterworfen.

In die Küvette wurden sofort 0,50 ml YEPD (1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Glucose) hinzu gegeben. Der Inhalt der Küvette wurde in ein neues, sterilisiertes 4 ml-Plastikröhrchen übertragen und bei 30°C während 1 Stunde inkubiert. 100 &mgr;l der Zellen wurden schichtförmig auf Agar-Platten aufgetragen, welche YEPD und 50 &mgr;g/ml G418 (Geneticin) enthielten. Schnell wachsende Kolonien wurden ausgewählt und auf eine andere Platte repliziert, welche das gleiche Medium enthielt. Die ausgewählten Kolonien wurden dem Ampicillin-Test (Chevallier und Aigle) unterworfen, bis ein positive Kolonie Test identifiziert wurde. Die oben beschriebene Prozedur der Elektroporation beruht auf der von Becker und Guarente (1971) beschriebenen Prozedur. Unser Verfahren für die Auswahl von G418-resistenten Transformanten ist sehr wirkungsvoll, und die meisten der ausgewählten Kolonien, welche auf die Platten repliziert worden waren, welche YEPD plus 50 &mgr;g/ml G418 enthielten, waren im Penicillinase-Test positiv.

Die Transformation des Stamms 1400 mit pLNH21 oder sonstigen Plasmiden erfolgte unter Anwendung einer mit der oben beschriebenen Prozedur ähnlichen Prozedur, außer dass die Zellen bis 140–190 KU statt bis 130 KU gezüchtet wurden, und dass die YEPD-Platten für die ursprüngliche Selektion der Transformanten nach der Elektroporation 40 &mgr;g/ml Geneticin G 418 enthielten statt 50. Die Transformation des Stamms 1400 nach der oben beschriebenen Prozedur war nicht so wirksam wie die Transformation von S. cerevisiae.

BEISPIEL 6 FERMENTIERUNG VON XYLOSE MIT (GENTECHNISCH) ENTWICKELTEM SC(pLNH21), SC(pLNH13-32) UND NICHT (GENTECHNISCH) ENTWICKELTEM MUTTER-S. CEREVISIAE

Diese drei Hefen wurden in einer Kultur in einem reichen YEPD-Medium aerob unter identischen Bedingungen gezüchtet. [Das SC(pLNH13-32) wurde durch Transformation von S. cerevisiae mit einem Plasmid der Bezeichnung pLNH13-32 konstruiert, welches nur die XR- und XD-Gen-/Promotor-Kombinationen enthielt]. Diese Hefezellen wurden dann benutzt, um 5% Xylose in einem YEP-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton) anaerob auch unter identischen Bedingungen zu fermentieren. Der Verbrauch an Xylose und die Bildung von Ethanol und Xylitol wurden während des Fermentierens durch Probenahmen in richtigen Zeitabständen verfolgt und mit Hilfe der HPLC unter den nachfolgenden Bedingungen analysiert.

Die Proben, welche die Fermentierungsnährbrühe (0,6 ml bis 1,0 ml) enthielten und von den Kulturen entfernt worden waren, wurden in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen aufbewahrt. Die Zellen und andere Reste wurden zuerst durch Zentrifugieren entfernt. Der überstehende Teil wurde darüber hinaus mit Hilfe steriler Spritzfilter (Aerodisc von Gelman Sciences) mit 0,2 oder 0,45 mm filtriert. Das resultierende Filtrat aus einer jeden einzelnen Probe wurde mit Hilfe der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einem Hitachi-System gemäß den nachfolgenden Bedingungen auf seinen Gehalt an Ethanol, Glucose, Xylose und Xylitol analysiert.

Kolonne: Aminex HPX-87C, 300 × 7,8 mm

Mobile Phase: Wasser

Strömungsgeschwindigkeit: 0,8 ml/min

Erkennungsgerät: Hitachi L-3350 RI-Detektor

Temperatur: 80°C

Injektionsvolumen: 20 &mgr;l

Die in den 6A, 6B, und 6C dargestellten Ergebnisse (die Ethanolspitzenwerte bei diesen und anderen Figuren sind tatsächlich 2½ mal kleiner, als sie aufgrund der Empfindlichkeit des Instrumentes sein sollten) zeigen, dass nur die entwickelte Hefe SC(pLNH21), welche das klonierte XR, XD und XK enthält, die hohen Konzentrationen an Xylose (5%) zu Ethanol fermentieren kann, nicht aber die nicht entwickelte S. cerevisiae Mutterhefe, und auch nicht das gentechnisch entwickelte SC(pLNH13-32), welches nur das klonierte XD und XR, nicht das XK enthält. Das SC(pLNH13-32) fermentiert Xylose hauptsächlich zu Xylitol.

BEISPIEL 8 WIRKSAME FERMENTIERUNG VON HOHEN KONZENTRATIONEN SOWOHL AN GLUCOSE ALS AUCH AN XYLOSE DURCH 1400 (pLNH33) ZU ETHANOL

Eine Mischung aus Glucose und Xylose (etwa 10% Glucose und 5% Xylose) wurde mit dem Stamm 1400 und mit 1400 (pLNH33) unter identischen Bedingungen fermentiert. Diese Hefen wurden auf Agar-Platten aufbewahrt, welche die geeigneten Medien enthielten und welche unmittelbar von den Agar-Platten in das 50 ml YEPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 2% Glucose) hinein inokuliert wurden, und zwar in einem 250 ml Erlemeyerkolben mit einem Seitenarm, durch den eine umnittelbare Überwachung des Wachstums der Hefekulturen mit dem Klett-Colorimeter möglich war. Die Kulturen wurden in einem Schüttelgefäß bei 30°C und 200 U/min aerob inkubiert.

Sobald die Zelldichte eine mittlere log-phase (400 Klett-Einheiten) erreicht hatte, wurden 12,5 ml (40%) Glucose und 6,25 ml (40%) Xylose in einen jeden Kolben hinein gegeben. Nach gründlichem Mischen wurde 1 ml der Kultur-Mischung aus dem Kolben entfernt, um als das Null-Muster zu dienen. Der Kolben wurde dann mit Saranband versiegelt, damit die Fermentierung anaerob ablaufen konnte. Proben von 1 ml der Fermentierungsnährbrühe (mit einigen Zellen) wurden in richtigen Zeitabständen (alle 24 h) entfernt, um als Muster zum Messen der Zucker- und Ethanol-Gehalte der Nährbrühe während des Fermentierens zu dienen. Die Gehalte an Ethanol, Glucose, Xylose und Xylitol der Proben wurden analysiert, und zwar mit Hilfe der HPPLC, so wie in Beispiel 6 beschrieben. Die in den 8A und 8B dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die gentechnisch entwickelten Hefe 1400(pLNH33) in zwei bis vier Tagen ohne die Notwendigkeit einer hohen Zelldichte 10% Glucose und 5% Xylose gleichzeitig zu Ethanol fermentieren kann. Andererseits kann der Mutterstamm 1400 nur Glucose zu Ethanol umwandeln, nicht aber Xylose. Die Fermentierung erfolgte unter normalen Bedingungen, ohne dass ein spezielles Medium, ein spezieller pH-Wert und auch ohne dass ein Hefewachstums zu einer hohen Zelldichte notwendig gewesen wären. Somit kann das gentechnisch entwickelte 1400 (pLNH33), welches XR, XD und XK enthält, welche alle vollständig zu glycolytischen Promotoren zusammengeschlossen wurden und auf einem Plasmid pUCKm10 mit hoher Kopienanzahl kloniert wurden, hohe Konzentrationen sowohl von Glucose als auch von Xylose in 2 bis 4 Tagen gleichzeitig zu Ethanol fermentieren, wobei nur ein sehr geringer Anteil an Xylitol als Nebenprodukt erzeugt wurde.

BEISPIEL 9 VERSUCHTE FERMENTIERUNG VON XYLOSE/GLUCOSE MIT ENTWICKELTEM SC(pLNH13-32)

Das Fermentierungsverfahren von Beispiel 8 wurde wiederholt, außer dass S. cerevisiae SC (pLNH13-32) (enthält nur XR- und XD-Gene) als Fermentierungsorganismus benutzt wurde. Die in 13 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eine solche gentechnisch entwickelte Hefe, welche nur die XR- und XD-Gene enthält, schon Glucose aber nicht Xylose fermentieren kann, wenn diese beiden Zuckerarten in dem fermentierten Medium vorhanden sind.

BEISPIEL 10 VERSUCHTE FERMENTIERUNG VON XYLOSE/GLUCOSE MIT NICHT ENTWICKELTER PICHIA STIPITIS

Die Fermentierungsprozedur aus Beispiel 8 wurde wiederholt, außer dass nicht entwickelte Pichia stipitis als Fermentierungsorganismus verwendet wurde. Die Proben der Fermentierungsnährbrühe wurden nach dem Fermentieren während (I) 0 Tagen; (II) 3 Tagen; und (III) 5 Tagen mit Hilfe der HPLC analysiert. Die in 14 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass P. stipitis nur Glucose aber nicht Xylose fermentieren kann, wenn diese beiden Zuckerarten in dem gleichen Medium vorhanden sind.

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  • Takuma, S. N. Nakashima, M. Tantirunkij, S. Kinoshita, H. Okada, T. Seki und T. Yoshida, «Isolation of xylose reductase gene of Pichia stipitis and its expression in Saccharomyces cerevisiae (Isolieren des Xylosereduktase-Gens von Pichia stipitis und dessen Expression in Saccharomyces cerevisiae), Appl. Biochem. Biotechnol., 27–28, 327 (1991).
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  • Zalkin, H. und C. Yanofsky, J. Biol. Chem. 257, 1491–1500 (1982).

Anspruch[de]
  1. Rekombinante Hefe, welche eingeschleuste Gene enthält, die für Xylose-Reduktase, Xylitol-Dehydrogenase und Xylulokinase codieren, und welche als Mittel zum Fermentieren von Xylose zu Ethanol wirksam ist.
  2. Rekombinante Hefe gemäß Anspruch 1, wobei die Hefe auch als Mittel zum Fermentieren von Glucose zu Ethanol wirksam ist.
  3. Rekombinante Hefe gemäß Anspruch 2, wobei die Hefe von der Gattung des Saccharomyces-Genus ist.
  4. Rekombinante Hefe gemäß Anspruch 3, wobei besagte Gene mit nicht-Glucose-inhibierten Promotern zusammengeschlossen werden, und wobei die Hefe als Mittel zum gleichzeitigen Fermentieren von Glucose und Xylose zu Ethanol wirksam ist.
  5. Rekombinantes DNA-Molekül, das Gene enthält, die für Xylose-Reduktase, Xylitol-Dehydrogenase und Xylulokinase codieren.
  6. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 5, wobei das rekombinante DNA-Molekül auf einem Vektor vorhanden ist, der für die Hefetransformierung wirksam ist.
  7. Rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei besagte Gene mit nicht-Glucoseinhibierten Promotern zusammengeschlossen werden.
  8. Verfahren zur Gewinnung einer rekombinanten Hefe, die als Mittel zum Fermentieren von Xylose zu Ethanol wirksam ist, und welches das Einschleusen von DNA in eine Hefe beinhaltet, so dass die Hefe dazu gebracht wird, eingeschleuste Gene, die für Xylose-Reduktase, Xylitol-Dehydrogenase und Xylulokinase codieren, zu beinhalten.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei besagte eingeschleuste DNA Gene enthält, die für Xylose-Reduktase, Xylitol-Dehydrogenase und Xylulokinase codieren.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei besagte Hefe von der Gattung des Saccharomyces-Genus ist.
  11. Verfahren zum Fermentieren von Xylose oder Glycose zu Ethanol, welches das Fermentieren eines Xylose oder Glycose enthaltenden Mediums umfasst, dies mit Hilfe einer rekombinanten Hefe, die eingeschleuste Gene enthält, die für Xylose-Reduktase, Xylitol-Dehydrogenase und Xylulokinase codieren, und die als Mittel zum Fermentieren von Xylose oder Glucose zu Ethanol wirksam ist.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das Medium sowohl Xylose als auch Glucose enthält, und die Hefe zum Fermentieren sowohl der Xylose als auch der Glycose zu Ethanol wirksam ist.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die Hefe von der Gattung des Saccharomyces-Genus ist.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei besagte Gene mit nicht-Glucose-inhibierten Promotern zusammengeschlossen werden, und die Hefe als Mittel zum gleichzeitigen Fermentieren von Glucose und Xylose zu Ethanol wirksam ist.
  15. Rekombinante Hefe gemäß Anspruch 1, wobei besagte Gene mit nicht-Glucose-inhibierten Promotern zusammengeschlossen werden, und wobei die Hefe als Mittel zum Fermentieren von Xylose zu Ethanol wirksam ist.
  16. Rekombinante Hefe gemäß Anspruch 15, wobei besagte Hefe auch als Mittel zum Fermentieren von Glucose zu Ethanol wirksam ist.
Es folgen 18 Blatt Zeichnungen






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