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Dokumentenidentifikation DE69732188T2 29.12.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000956025
Titel VERFAHREN ZUR IMMUNUNTERDRÜCKUNG
Anmelder Immune Modulation, Inc., Santa Monica, Calif., US
Erfinder OJO-AMAIZE, A., Emmanuel, Glendora, US;
COTTAM, B., Howard, Fallbrook, US;
KINI, D., Ganesh, San Diego, US
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69732188
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 25.07.1997
EP-Aktenzeichen 979351269
WO-Anmeldetag 25.07.1997
PCT-Aktenzeichen PCT/US97/13134
WO-Veröffentlichungsnummer 0098004271
WO-Veröffentlichungsdatum 05.02.1998
EP-Offenlegungsdatum 17.11.1999
EP date of grant 05.01.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.12.2005
IPC-Hauptklasse A61K 31/70
IPC-Nebenklasse C07H 19/213   A61P 37/02   

Beschreibung[de]
HINTERGRUND DER ERFINDUNG 1. Fachgebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Immunsuppressiva und deren Verwendung in der Transplantationstherapie. Im Besonderen ist die Erfindung auf die Verwendung von cyclischen AMP-Verbindungen, deren Nucleosidderivaten und Agonisten davon zur Unterdrückung von Transplantatabstoßung gerichtet.

2. Fachlicher Hintergrund

Viele Krankheiten des Menschen sind durch überschießende oder unangemessene Immunantworten gekennzeichnet. Bei der Transplantation greift das Immunsystem Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-disparates Spendergewebe an, was zu Transplantatabstoßung führt. Bei Autoimmunkrankheit greift das Immunsystem normale Gewebe an. Bei Allergie hyperreagiert das Immunsystem gegenüber sonst harmlosen Antigenen aus der Umgebung. Es ist nun klar, dass immunsuppressive Therapie zur Behandlung jeder dieser Störungen geeignet ist (Blood Reviews, 1995, 9: 117–133).

Seit den 1950er Jahren hat es eine phänomenale Zunahme beim Erfolg von Organtransplantaten gegeben und Transplantation ist die Behandlung der Wahl für Nieren- und Herzinsuffizienz im Endstadium geworden. Vor kurzem sind beim Verstehen der Immunregulation und bei der Entwicklung und Verwendung von immunsuppressiven Therapien eine Reihe von Fortschritten gemacht worden (Thomson, A. W. et al., Immunol.. Rev., 1993, 136: 71–98; Allison, A. C. et al. Hrsg., 1993, Ann. NY Acad. Sci. 696: 1–419; Kahan, B. D., 1994, Therapeutic Immunol.. 1: 33–44; Thomson, A. W., et al., Hrsg., 1994, Immunosuppressive Drugs, London: Edward Arnold). Obwohl die Entwicklung von Arzneistoffen wie Cyclosporin A (CsA) und FK506 zu beträchtlichen Verbesserungen bei der Vorbeugung vor Transplantatabstoßung, besonders das erste Jahr über, geführt hat (Sigal, N. H., et al, 1992, Ann. Rev. Immunol.. 10: 519–560; Thomson, A. W., et al., 1994, Clin. Exp. Immunol.. 98: 351–357), gibt es schwerwiegende Nebenwirkungen im Zusammenhang mit der Verwendung, wie Nephrotoxizität und Neurotoxizität (Kahan, B. D., et al., 1985, Surgery 97: 125). Außerdem sind die weithin verwendeten immunsuppressiven Arzneistoffe nicht löslich oder nicht zum Einnehmen in Pillenform verfügbar und erfordern eine Verabreichung durch Injektion.

Transplantat-Wirt-Reaktion (GVHD) tritt auf, wenn genetisch disparate Lymphocyten in einen abwehrgeschwächten Empfänger, der nicht imstande ist, das Spendertransplantat abzustoßen, übertragen werden (Billingham, R. E. Harvey, Lect,, 1967, 62: 21–78; Nash, R. A. und Storb, R., Current Opinion in Immunology, 1996, 8: 674–680). Akute GVHD ist eine bedeutende und häufige Komplikation der Knochenmarktransplantation (BMT) (Ferrara, J. L. M. et al., Transplantation, 1989, 47: 50–54). Obwohl T-Zellen sowohl in klinischen als auch in Tiermodellen für BMT offensichtlich für die Induktion der Reaktion erforderlich sind, sind natürliche Killer (NK)-Zellen mit Schädigungen des Zielgewebes in Zusammenhang gebracht worden (Ferrara, J. L. M. et. al., Transplantation, 1989, 47: 50–54; Ghayur, T. et. al., Transplantation, 1987, 44: 261–267; Nash, R. A. und Storb, R., Current Opinion in Immunology, 1996, 8: 674–680). Die Vorbeugung vor GVHD ist am häufigsten mit pharmakologischer Immunsuppression versucht worden. Die am üblichsten verwendeten Mittel sind Cyclosporin-A (CsA), Methrotrexat, Prednison und FK506 (Storb, R. et. al, New England Journal of Medicine, 1986, 314: 729–735; Storb, R. et. al., Blood, 1990, 76: 1037–1045; Nash, R. A. et. al., Blood, 1995, 85: 3746–3753). Jedoch weisen diese Mittel mögliche Nebenwirkungen wie Nephrotoxizität, verstärktes Wachstum der Körperbehaarung und Neurotoxizität auf (Kahan, B. D. et. al., Surgery, 1985, 97: 125; Fay, J. W. et. al., Blood, 1996, 87: 3514–3519). Deshalb besteht eine klinische Notwendigkeit, neue Verbindungen zur wirksamen Immunsuppression ohne diese Nebenwirkungen und mit größerer Bequemlichkeit der Anwendung bereitzustellen.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist auf Methoden zur Induzierung der Immunsuppression bei Empfänger-Tieren, welche eine immunsuppressive Behandlung brauchen, und auf Methoden zur Induzierung der Immunsuppression eines Spender vor Übertragung von Spendergewebe auf einen Empfänger gerichtet, um einem Scheitern der Transplantation bei dem Empfänger vorzubeugen.

Die Methode umfasst Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des cyclischen AMP-Mittels HE-33 oder des entsprechenden Nucleosidderivats von HE-33 oder von Agonisten davon an einen Empfänger oder an ein Spender-Tier. Eine Ausführungsform der Erfindung bezieht Verabreichen von HE-33 oder dessen Nucleosid in Verbindung mit einem physiologisch verträglichen pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel ein. Eine weitere Ausführungsform bezieht Verabreichen von HE-33 oder dessen Nucleosid in Kombination oder Verbindung mit einem oder mehreren Mitteln, ausgewählt aus Immunsuppressiva oder Mitteln, die in der immunsuppressiven Therapie verwendbar sind, ein. Die Erfindung charakterisiert auch ein Arzneimittel, das eine therapeutisch wirksame Menge von HE-33 oder dessen Nucleosid in Verbindung mit einem oder mehreren Mitteln, ausgewählt aus Immunsuppressiva oder Mitteln, die in der immunsuppressiven Therapie verwendbar sind, umfasst.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 zeigt die hemmende Wirkung von HE-33 in vivo auf die Generierung von cytotoxischer H-2k-anti-H-2d-T-Zellaktivität.

2 zeigt die immunsuppressiven Wirkungen der Behandlung von Spender-Tieren mit HE-33 auf GVHD bei Empfängern.

3 zeigt die immunsuppressiven Wirkungen der Behandlung von Spender-Tieren mit entweder HE-33 oder Cyclosporin auf GVHD bei Empfängern.

ARTEN DER AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG Allgemeine Beschreibung und Definitionen

Die Ausübung der vorliegenden Erfindung wird, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Molekularimmunologie, Zellbiologie, Biochemie und organische Synthese innerhalb des Könnens auf dem Fachgebiet einsetzen. Solche Techniken werden ganz in der Literatur erklärt. Siehe z.B. Abbas, A. K., et al., Hrsg., 1994, 2te Ausg. Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co., USA; Harlow, E. und D. Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Auchinclos, Jr., H. und Sachs, D. H. Transplantation and Graft Rejection in: Fundamental Immunology, Paul, W. E. Hrsg., 1993, Raven Press).

Die folgende Terminologie wird gemäß den nachstehend dargestellten Definitionen bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Für die Zwecke der Erfindung bezeichnet der Ausdruck „immunsuppressive Behandlung" eine Methode der Vorbeugung und des Managements von Krankheiten und Syndromen, welche zur Therapie die Suppression von Lymphocyten und Immunocyten erfordern. Solche Krankheiten und Syndrome schließen Transplantat-Wirt-Reaktion, Autoimmunkrankheiten wie Diabetes, rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus erythematodes, Sjögren-Syndrom und Sklerodermia ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Es ist selbstverständlich, dass eine allgemein verwendete Methode der Immunsuppression Verabreichen einer wirksamen Menge eines Immunsuppressivums, um T-Zellen zu hemmen oder zu lysieren, an ein Tier, das eine solche Behandlung braucht, einbezieht.

Der Ausdruck „Lymphocyten und Immunocyten" bezeichnet Zellen, die die Spezifität der Immunantworten vermitteln. Wie hier verwendet, beziehen sich die Ausdrücke auf T-Lymphocyten, welche in Einzelheiten bei Abbas et al beschrieben sind.

Der Ausdruck „Transplantation" bezeichnet das Verfahren des Entnehmens von Zellen, Geweben oder Organen, Transplantat genannt, von einem Individuum und üblicherweise deren Einbringen in einen anderen, genetisch nicht-identischen Empfänger. Das Individuum, das das Transplantat liefert, wird als der Spender bezeichnet und das Individuum, das das Transplantat erhält, wird entweder als der Empfänger oder der Wirt bezeichnet. Transplantation führt zu einer spezifischen Immunantwort, Abstoßung genannt, die das Transplantat zerstören kann. Transplantat-Gewebe schließen feste Organe wie Leber, Herz und Nieren; Gewebe wie Haut und Knochenmark oder andere Zellen oder Gewebe ein. In vivo wird die Abstoßung von T-Zellen vermittelt. Es ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, dass durch Immunsuppression beim Empfänger (Wirt) der Abstoßung vorgebeugt oder sie behandelt werden kann. Die meiste Immunsuppression ist gegen T-Zell-Antworten unter Verwendung von spezifischen Immunsuppressiva gerichtet. Transplantat-Empfänger benötigen vorbereitende Immunsuppression, bevor sie ein Transplantat erhalten. Beispielsweise kann durch Unterdrücken der Immunreaktion des Empfängers (Wirts) durch Verabreichen von therapeutisch wirksamen Mengen von Verbindungen wie Cyclosporin A oder FK506 an den Wirt sowie Verabreichen der hier veranschaulichten Zusammensetzungen der Abstoßung vorgebeugt oder sie behandelt werden. Die Immunsuppression ist am stärksten gegen T-Zell-Antworten gerichtet, unter Verwendung von spezifischen Immunsuppressiva, nicht unähnlich den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen.

Wenn reife T-Lymphocyten einem nicht-identischen immuninkompetenten Empfänger injiziert werden, können sie den Empfänger-Wirt als fremd erkennen und den Empfänger angreifen, was eine Transplantat-Wirt (GVH)-Reaktion und Scheitern der Transplantation verursacht. Bei menschlichen Patienten verursachen reife T-Zellen in allogenen Knochenmarktransplantaten Transplantat-Wirt-Reaktion.

Demgemäß spielt Immunsuppression der NK-Zellfunktion bei Spendern eine wichtige therapeutische Rolle bei der Behandlung von oder Vorbeugung vor Transplantat-Wirt-Antworten wie die Transplantat-Wirt-Reaktion (GVHD). „Natürliche Killer Zellen" oder „NK-Zellen" sind non-T-, non-B-Lymphocyten, die üblicherweise granuläre Morphologie aufweisen. NK-Zellen sind wichtig bei der angeborenen Immunität gegen Viren und andere intrazelluläre Krankheitserreger sowie bei der Antikörper-abhängigen, zellvermittelten Cytotoxizität (ADCC). NK-Zellen sind in großem Maß für die Transplantat-Wirt-Reaktion (GVHD) verantwortlich (Ferrara, J. L. M., et al. (1989) Transplantation 47: 50–54; Ghayur, T. et al. (1987) Transplantation 44: 261–267; Ghayur, T., et al. (1988) Transplantation 45: 586–590. Wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt, wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen und Methoden NK-Zellaktivität in vivo unterdrückten, und sie fanden Verwendung bei der Vorbeugung vor oder Überwindung der GVHD bei Tieren, die eine solche Behandlung brauchen. Demgemäß benötigen Transplantat-Spender eine vorbereitende Immunsuppression durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Immunsuppressivums vor Spenden eines Transplantats zur Vorbeugung vor der Transplantat-Wirt-Reaktion bei einem Empfänger.

Der Ausdruck „Tiere" wird gebraucht, um darunter Menschen sowie andere Tiere zu verstehen.

Der Ausdruck „HE-33 und dessen Nucleosid" bezeichnet das Nucleotid-Mittel HE-33, welches ein cyclisches Adenosinmonophosphat (AMP) ist, wie nachstehend beschrieben, und das HE-33 entsprechende Nucleosid, nachstehend als Verbindung 1–46 bezeichnet. Die chemischen Strukturen von „HE-33 und dessen Nucleosid" werden in Formeln I beziehungsweise II veranschaulicht.

Der Ausdruck „HE-33 und dessen Nucleosid" wird auch so verstanden, dass er Agonisten von HE-33 und dessen Nucleosid einschließt. Demgemäß schließt HE-33 Agonisten von HE-33 ein, wobei

R1, R2 gleich oder verschieden sind und H, -(CH2)nOH, wobei n = 1–5; C1–12-Alkyl, substituiert oder unsubstituiert, geradkettig oder verzweigt, mit 0–6-Doppelbindungen, bedeuten,

R3, R4, R5 gleich oder verschieden sind oder in einer unabhängigen Kombination aus H, Cl, Br, F, I, NH2, NHR1, N(R1)2, OH, OR1, SH und SR1 ausgewählt werden können,

R6 = H, NH4+, Na+ und andere physiologisch verträgliche Kationen,

R6 = N-Alkyl (mono-, di- oder trisubstituiertes) linear- oder verzweigtkettiges C1-6.

Es ist selbstverständlich, dass der Ausdruck „Agonisten von HE-33", wie hier verwendet, Substanzen bezeichnet, die die gleiche Antwort (d.h. Induzierung der Immunsupression bei Tieren, die eine solche Behandlung brauchen) hervorrufen wie HE-33. Agonisten von HE-33 schließen die vorstehend aufgezählten Derivate oder strukturellen Modifikationen von HE-33 ein. Ein Beispiele eines HE-33-Agonisten ist Verbindung 1–24 (siehe Tabelle 1).

Es wird selbstverständlich sein, dass 1–46 Agonisten von 1–46 einschließt, wobei R1, R2 gleich oder verschieden sind und H, -(CH2)nOH, wobei n = 1–5; C1–12-Alkyl, substituiert oder unsubstituiert, geradkettig oder verzweigt, mit 0–6 Doppelbindungen, bedeuten,

R3, R4, R5 gleich oder verschieden sind oder in einer unabhängigen Kombination aus H, Cl, Br, F, I, NH2, NHR1, N(R1)2, OH, OR1, SH und SR1 ausgewählt werden können.

Es ist selbstverständlich, dass der Ausdruck „Agonisten von 1–46", wie hier verwendet, Substanzen bezeichnet, die die gleiche Antwort (d.h. Induzierung der Immunsuppression bei Tieren, die eine solche Behandlung brauchen) hervorrufen wie 1–46. Agonisten von 1–46 schließen die vorstehend aufgezählten Derivate oder strukturellen Modifikationen von 1–46 ein.

Alle der gerade erwähnten Agonisten von HE-33 oder dessen Nucleosid, welche verwendet werden können, um die vorliegende Erfindung auszuüben, und hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind, sind in Artikeln und Publikationen enthalten, die nachstehend (in den Abschnitten mit den Überschriften „Erfindungsgemäße Verbindungen" und „Verbindungsherstellung") aufgezählt werden. Die Fähigkeit eines Analogs oder Derivats von HE-33 oder dessen Nucleosids, in der erfindungsgemäßen Methode Immunsuppression bei Tieren, die eine solche Behandlung brauchen, zu induzieren, wird ohne weiteres durch Überprüfen des Analogs oder Derivats mit den hier aufgezählten Durchmusterungsverfahren zur Identifizierung von Agonisten bestimmt.

Die erfindungsgemäßen Methoden sind auf immunsuppressive Therapie unter Verwendung des Mittels HE-33 (1–18) oder dessen Nucleosids (1–46) und Agonisten davon gerichtet. Sowohl HE-33 als auch 1–46 sind verwendbar, weil sie pharmakologische Wirkung in Tieren entfalten, wie nachstehend dargelegt (siehe Tabellen 3 und 9). Im Einzelnen beziehen die erfindungsgemäßen Methoden das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge des Mittels HE-33 oder dessen Nucleosids an ein Tier, das eine solche Behandlung braucht, ein. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verabreichen eines Arzneimittels, das eine therapeutisch wirksame Menge von HE-33 oder dessen Nucleosid-Verbindung umfasst, an einen Transplant-Spender, um vor GVHD bei dem Empfänger vorzubeugen oder sie zu bessern. Alle Ausführungsformen der Erfindung beziehen die Verbindung von HE-33 oder dessen Nucleosid mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel zur Verabreichung an ein Tier ein.

Die erfindungsgemäße Methode findet bei der Unterdrückung der Abstoßung von Transplantaten bei Tieren Verwendung, wie durch die Wirkungen von HE-33 und dessen Nucleosid auf zelluläre Immunität in dem Einweg („one-way") – MLR-Test und MLR-Test in zwei Richtungen („two-way"), nachstehend dargelegt, veranschaulicht (siehe Tabellen 1 und 2). Somit ist die erfindungsgemäße Methode bei der Unterdrückung der Bildung von, oder Proliferation von, Immunocyten oder Lymphocyten verwendbar und ist deshalb bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten und bei der Unterdrückung der Abstoßung von Transplantaten, z.B. Organtransplantaten wie Haut-, Knochenmark-, Nieren-, Leber- und Herztransplantaten verwendbar. Die Wirkungen von HE-33 und dessen Nucleosid wurden in den nachstehend beschriebenen Tests ermittelt.

Wie durch 1 und Tabellen 3, 4 und 5 angedeutet, findet die erfindungsgemäße Methode bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten bei Tieren Verwendung. Es ist selbstverständlich, das Immunsuppressiva für T-Zellen wie Cyclosporin A (Forsell, T et al., J. Urol., 1996, 5: 1591–3; Yocum, D. E., et al., Rheum. Dis. Clin. North. Am., 1995, 3: 835–44) oder Tacrolimus (Ketel, B. L., et al., Transplant. Proc., 1996, 2: 899) Immunreaktionen unterdrücken und zu Hemmung oder Besserung von Autoimmun-Störungen führen. Von T-Zellen und ihren Produkten (Cytokine) ist bekannt, dass sie an der Erzeugung und Bewirkung von Autoimmunreaktionen in vivo beteiligt sind.

Für alle vorstehend erwähnten Verwendungen wird die therapeutisch wirksame Menge oder Dosierung natürlich je nach der eingesetzten Verbindung, der Applikationsweise und der gewünschten Behandlung variieren. Jedoch würden im Allgemeinen befriedigende Ergebnisse erhalten werden, wenn sie oral mit einer täglichen Dosierung von etwa 1 mg bis etwa 600 mg je kg Körpergewicht des Tieres, praktischerweise in aufgeteilten Dosen 1- bis 4- mal am Tag gegeben oder in einer Form mit verlängerter Freisetzung verabreicht würden. Falls durch Injektion verabreicht, würden im Allgemeinen befriedigende Ergebnisse erhalten werden, wenn sie oral mit einer täglichen Dosierung von etwa 1 mg bis etwa 200 mg je kg Körpergewicht des Tieres, praktischerweise in aufgeteilten Dosen 1- bis 4- mal am Tag gegeben oder in einer Form mit verlängerter Freisetzung verabreicht würden. Für die größeren Säuger läge die Gesamttagesdosierung im Bereich von etwa 5 bis etwa 500 mg und zur oralen Verabreichung geeignete Darreichungsformen umfassen von etwa 5 mg bis etwa 500 mg der Verbindungen im Gemisch oder in Verbindung mit einem festen oder flüssigen pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel. Verfahren zur Bestimmung der therapeutisch wirksamen Menge von HE-33 oder dessen Nucleosid sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Solche Verfahren beziehen die Analyse der pharmazeutischen/pharmakokinetischen Parameter in der immunsuppressiven Therapie zur Induzierung der Immunsuppression, zur Unterdrückung der Bildung von Lymphocyten und Immunocyten, zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten und zur Unterdrückung der Abstoßung von Transplantaten bei Tieren oder andere Indikationen ein (Recent Developments in Transplantation Medicine, Bd. 1: New Immunosuppressive Drugs: Hrsg. D. Przepiorka und H. Sollfinger, Physicians and Scientists Pub. Co., Glenview, IL, 1994;).

Die erfindungsgemäße Methode schließt das Verabreichen eines Arzneimittels, das eine wirksame Menge von HE-33 oder dessen Nucleosid in reiner Form oder als ein pharmazeutisch verträgliches rohes Konzentrat in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst, ein. Solche Zusammensetzungen enthalten praktischerweise mehr als 1 Gew.-% der Verbindung der Formel I oder II und können mit herkömmlichen Techniken in herkömmlichen Formen, beispielsweise Kapseln, Tabletten, Zäpfchen, dispergierbaren Pulvern, Sirupen, Elixieren, Suspensionen oder Lösungen zur enteralen oder parenteralen Verabreichung, hergestellt werden. Geeignete pharmazeutische Verdünnungsmittel oder Träger schließen beispielsweise Wasser, Alkohole, natürliche oder gehärtete Öle und Wachse, Calcium- und Natriumcarbonate, Calciumphosphat, Kaolin, Talkum und Lactose ein, sowie geeignete Konservierungsmittel wie Ethyl-p-hydroxybenzoat, Suspendiermittel wie Methylcellulose, Tragant und Natriumalginat, Netzmittel wie Lecithin, Polyoxyethylenstearat und Polyoxyethylensorbitanmonooleat, Granulier- und Sprengmittel wie Stärke und Alginsäure, Bindemittel wie Stärke, Gelatine und Gummi arabicum und Schmiermittel wie Magnesiumstearat, Stearinsäure und Talkum, um ein elegantes und schmackhaftes pharmazeutisches Präparat zu liefern. Zusammensetzungen in Tablettenform können mit herkömmlichen Techniken beschichtet werden, um den Zerfall der Tablette und die Aufnahme des Wirkstoffs im Gastrointestinaltrakt zu verzögern und dadurch eine verlängerte Wirkung über einen langen Zeitraum bereitzustellen. Andere auf dem Fachgebiet bekannte Verbindungen und Verfahren zur Verzögerung des Zerfalls oder zur zeitverzögerten oder zeitlich abgemessenen Abgabe der Wirkstoffe finden bei der Formulierung der Wirkstoffe zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Methoden auch Verwendung. Beispielsweise können HE-33 oder dessen Nucleosid auch mit Liposomen oder anderen Trägerhilfsmitteln zur verzögerten Freisetzung kombiniert werden, um HE-33 oder dessen Nucleosid davon vor Abbau zu schützen, bis es sein Ziel erreicht und/oder um die Bewegung von HE-33 oder dessen Nucleosid durch Gewebeschranken zu erleichtern.

Die bevorzugten Zusammensetzungen vom Standpunkt der Bequemlichkeit der Anwendung aus sind feste Zusammensetzungen, insbesondere mit Feststoffen gefüllte Gelatinekapseln oder Tabletten.

Es sollte auch selbstverständlich sein, dass eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Methode das Kombinieren eines oder mehrerer Mittel in einer Vielfalt von Protokollen, einschließlich Prophylaxe, mit der erfindungsgemäßen Methode zum Verabreichen von HE-33 oder dessen Nucleosid an Tiere, die eine immunsuppressive Behandlung brauchen, einbezieht. Kombinationsprotokolle und Verfahren zur Bestimmung ihrer Wirksamkeit, einschließlich Überwachung therapeuratischer Arzneistoffe, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (Lazarus, H. M. et al. Blood Reviews, 1995, 9: 117–133; Aggarwal, B. B., et al., Hrsg., 1995, Human Cytokines: Their role in Disease and Therapie, Blackwell Science, Inc., Cambridge, MA; Ambrus, J. L. et al., 1993, Surgery, Gynecology & Obstetrics, 176: 588). Beispiele für Immunsuppressiva oder Mittel, die in der immunsuppressiven Therapie verwendbar sind, welche mit Verabreichen von HE-33 oder dessen Nucleosid in der erfindungsgemäßen Methode kombiniert werden können, schließen Kortikosteroide, Methotrexat, Cyclosporin, Rapamycin, FK506 (PrografTM), Antithymocytenglobulin, Präparate aus monoclonalen Antikörpern, Präparate aus polyclonalen Antikörpern, Interleukin-1-Antagonisten, Interleukin-2-Antagonisten, TNF-Antagonisten, Immuntoxine, Thalidomid, Interferon, Stickstoffmonoxid, Mizoribin, Desoxyspergualin, Leflunomid und anti-Adhäsionsmoleküle ein, sind aber nicht darauf beschränkt.

Es wird weiterhin selbstverständlich sein, dass die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel einschließt, das eine therapeutisch wirksame Menge von HE-33 oder dessen Nucleosid in Verbindung mit einem oder mehreren Mitteln umfasst, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Immunsuppressiva oder der Mittel, die in der immunsuppressiven Therapie verwendbar sind, bestehend aus Kortikosteroiden, Methotrexat, Cyclosporin, Rapamycin, FK506 (PrografTM), Antithymocytenglobulin, Präparaten aus monoclonalen Antikörpern, Präparaten aus polyclonalen Antikörpern, Interleukin-1-Antagonisten, Interleukin-2-Antagonisten, TNF-Antagonisten, Immuntoxinen, Thalidomid, Interferon, Stickstoffmonoxid, Mizoribin, Desoxyspergualin, Leflunomid und anti-Adhäsionsmolekülen. Verfahren zur Bestimmung der therapeutisch wirksamen Mengen von HE-33, dessen Nucleosid, und Mitteln, ausgewählt aus Immunsupprssiva oder Mitteln, die in der immusuppressiven Therapie verwendbar sind, in Verbindung mit HE-33, wenn sie in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung verbunden sind, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt ((Lazarus, H. M. et al. Blood Reviews, 1995, 9: 117–133; Aggarwal, B. B., et al., Hrsg., 1995, Human Cytokines: Their role in Disease and Therapy, Blackwell Science, Inc.. Cambridge, MA; Ambrus, J. L. et al., 1993, Surgery, Gynecology & Obstetrics, 176: 588).

Die folgenden Materialien und Methoden wurden in den nachstehend dargestellten, nicht-begrenzenden Beispielen eingesetzt.

Blutspender.

Heparinisiertes Blut (30 cc) wurde durch Venenpunktion von Freiwilligen erhalten. Zwei Spender mit verschiedenen genetischen Hintergründen sind üblicherweise erforderlich, um eine Leukocytenmischkultur (MLC) zu initiieren.

Kulturmedium.

RPMI-1640-Medium (Fisher Scientific Co., Santa Clara, CA) wurde mit 20% hitze-inaktiviertem, humanem AB-Serum und 1% Penicillin/Streptomycin-Gemisch ergänzt.

Isolierung von mononukleären Leukocyten.

Mononukleäre Leukocyten wurden durch Schichten von geeignet verdünntem Blut in Hanks balancierter Salzlösung (H-BSS) auf einen Ficoll-Hypaque-Gradienten, gefolgt von Zentrifugation, aus dem Blut isoliert. Die gewonnenen Zellen wurden dreimal in Kulturmedium gewaschen und die Lebensfähigkeit wurde mit dem Trypanblau-Farbausschluß-Verfahren bestimmt. Die Zellkonzentration wurde in komplettem Kulturmedium auf 2 × 106/ml eingestellt.

Leukocytenmischreaktion (MLR)

Die MLR ist ein in-vitro-Modell zur T-Zell-Erkennung von fremden Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Genprodukten und wurde als Test zur Vorhersage von zellvermittelter Transplantatabstoßung verwendet (Abbas, AK., et al., Hrsg., 1994, 2te Ausg. Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co., USA). Es ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, dass die MLR durch co-Kultivieren mononukleärer Leukocyten von einem Individuum mit mononukleären Leukocyten, die von einem anderen Individuum stammen, induziert wird. Falls es Unterschiede in den Allelen der MHC-Gene zwischen den beiden Individuen gibt, wird ein großer Anteil der mononukleären Zellen über einen Zeitraum von 4–7 Tagen proliferieren. Die Höhe der proliferativen Antwort wird durch den Einbau von 3H-Thymidin in die DNA während der Zellreplikation gemessen und wird als allogene MLR bezeichnet. Weil die Zellen von jedem Spender reagieren und gegen die anderen proliferieren, ist die resultierende Antwort als „MLR in zwei Richtungen" bekannt. HE-33, dessen Nucleosid und andere Kandidaten wurden in dem MLR auf ihre Fähigkeit zu „immunsupprimieren" getestet.

Ansetzen der „MLR in zwei Richtungen" in Mikrotiterplatten

Mononukleäre Zellen (mit 2 × 106/ml) von jedem Spender wurden zuerst in einem 50 ml-Röhrchen mit einem Volumenverhältnis von 1:1 gründlich zusammen gemischt. Das Gemisch wurde in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen mit U-förmigem Boden in Volumina von 100 &mgr;l je Vertiefung verteilt. Verbindungen oder vermutete Immunsuppressiva wurden in Kulturmedium in Volumina von 100 &mgr;l je Vertiefung mit variierenden Konzentrationen von 100, 10, 1, 0,1 bzw. 0,01 &mgr;M zugegeben. 100 &mgr;l Kulturmedium wurden zu Kontroll-Vertiefungen ohne Arzneistoff zugegeben. Die Kulturen wurden für 5 Tage in einem feuchten Inkubator bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 gehalten. 4 Stunden vor der Ernte wurden die Kulturen in jeder Vertiefung mit 1 &mgr;Ci tritiummarkiertem Thymidin (spezifische Aktivität 719,5 mCi/mg; Dupont, Wilmington, DE) gepulst. Die Zellen wurden auf Glasfaserfiltern (Parkard, Downers Grove, IL) mit einem automatischen Zellharvester für 96 Vertiefungen (TOMTEC, Hamden, CT) geerntet und wurden direkt in einem Matrix 9600-beta-Zählgerät (Packard) ausgezählt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 und in 2 gezeigt.

Erzeugung von MHC beschränkten cytolytischen CD8+-T-Lymphocyten in „humanen Einweg-MLR"-Kulturen

Die „Einweg-MLR" wurde in Gewebekulturkolben mit mononukleären Zellen von zwei verschiedenen Spendern, wie in der vorstehend beschriebenen „MLR in zwei Richtungen", angesetzt. Jedoch wurde in der „Einweg-MLR" eine der beiden mononukleären Leukocytenpopulationen durch Behandlung mit Mitomycin C, einem antimitotischen Arzneistoff, vor der Kultur proliferationsunfähig gemacht. In dieser „Einweg-MLR" dienten die behandelten Zellen ausschließlich als Stimulatoren und die unbehandelten Zellen, immer noch zur Proliferation fähig, dienten als die Responder. Die Responderzellen exprimierten während eines 5–7-tägigen Kulturzeitraums den CD8+-Phänotyp, nicht aber den CD4+-Phänotyp. Diese CD8+-Zellen dienten ausschließlich als cytolytische T-Lymphocyten (CTLs), welche Zielzellen vom gleichen Individuum wie die ursprüngliche Stimulator-Zellpopulation lysieren. Bei der Transplantation lysieren diese MHC beschränkten cytotoxischen CD8+-T-Zellen MHC-disparate Spendergewebeziele auf, was zu Transplantatabstoßung führt (Abbas, A. K, Hrsg., 1994, 2te Ausg., Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co., USA; Imagawa, D. K., et al., in Aggarwal, B. B., et al., Hrsg., 1995, Human Cytokines: Their role in Disease and Therapie, Blackwell Science, Inc., Cambridge, MA). Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Ansetzen der „Einweg-MLR" in Gewebekulturkolben

Mononukleäre Zellen von einem Spender wurden zuerst mit Mitomycin C (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) (50 &mgr;g/50 × 106 Zellen) in 15 ml-Röhrchen, eingewickelt in Aluminiumfolie, behandelt und in einem 37°C-Wasserbad für 1 Std. inkubiert. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen dreimal mit Gewebekulturmedium gewaschen und auf 2 × 106/ml eingestellt und mit einem Volumenverhältnis von 1:1 gemischt und für 5–7 Tage in Gegenwart von entweder 100 &mgr;M HE-33, CsA oder nur Medium in Gewebekulturkolben inkubiert. Einige der Stimulatorzellen, welche nicht Mitomycin C-behandelt waren, wurden in IL-2-konditionierten Medien zur Verwendung als Ziele am Ende von 5 oder 7 Tagen kultiviert.

CTL-Test

Am Ende des Kultivierungszeitraums wurden die Zielzellen mit 51Na2CrO4 (51Cr) markiert und auf 0,5 × 106/ml eingestellt. Die Effektorzellen (d.h. Responderzellen) wurden geerntet, zweimal in Medium gewaschen und lebende Zellen wurden auf 2,5 × 106/ml eingestellt. Effektor- und Zielzellen wurden mit einem Effektor:Ziel(E:Z)-Zellverhältnis von 25:1 in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit U-förmigem Boden gemischt und für 4 Std. in einem 37°C/5%CO2-Inkubator inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde die Lyse der Zielzellen im Wesentlichen, wie zuvor für einen 51Cr-Freisetzungs-Test (Ojo-Amaize, E. A., et al., 1994, Clin. Infect. Dis. 18 (Erg. Bd.): S154–159) beschrieben, bewertet und die Ergebnisse als %-spezifische Lyse ausgedrückt.

Erzeugung von H-2 beschränkten, cytolytischen T-Lymphocyten in Mäusen

Ein Mauskorrelat zu der humanen „Einweg-MLR" wurde in durch Inzucht erzeugten Mäusestämmen entwickelt. Die Zellen des einen Mäusestammes (H-2d) wurden in einen anderen Mäusestamm (H-2k) i.v. injiziert. Die Mäuse wurden von Charles River Laboratories, Hollister, CA erhalten. Wegen der Histoinkompatibilität zwischen den beiden Stämmen entwickeln die H-2k-Mäuse cytotoxische T-Zellen, die fähig sind, die Zellen des H-2d-Mäusestammes abzutöten (Abbas, A. K., id), was die Art der Reaktion ist, die bei Menschen oder Tieren, die Gewebetransplantate von histoinkompatiblen Spendern erhalten, beobachtet wird. Die für H-2d-Zellen/Alloantigene sensibilisierten H-2k-Mäuse wurden entweder mit HE-33 (100 mg/kg i.v. oder 400 mg/kg oral) jeden dritten Tag für 9 Tage behandelt oder wurden nicht mit Arzneistoff behandelt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.

Ex-vivo-Test.

Am zehnten Tag wurden alle Mäuse geopfert und die Milz wurde entfernt, um sie auf Milz-T-Zell-vermittelte Cytotoxizität gegen CON-A-stimulierte DBA/2-Milzzellen, die H-2d-Antigene exprimieren, zu testen. CON-A wurde von Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, erhalten. Milzzellsuspensionen wurden in komplettem Kulturmedium hergestellt und auf die gewünschten Konzentrationen eingestellt. Die CON-A-Blasten wurden mit 51Cr radiomarkiert und mit den jeweiligen Milz-Effektorzellen mit variierenden Effektor:Ziel-Zellverhältnissen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gemischt. Die Gemische wurden für 4 Std. bei 37°C in einem 5% CO2-Inkubator kultiviert. Die Lyse der Zielzellen wurde im Wesentlichen, wie zuvor für einen 51Cr-Freisetzungs-Test (Ojo-Amaize, E. A., et al., id) beschrieben, bewertet und die Ergebnisse als %-spezifische Lyse ausgedrückt (1).

Bildung von autokrinen Wachstumsfaktoren (IL-2, IL-4, IL-10 und Interferon-gamma) in PHA-stimulierten, humanen PBMC-Kulturen

Humane mononukleäre Zellen aus peripherem Blut (PBMC) wurden mit einem T-Zell-Mitogen, PHA (Gibco BRL, Grand Island, NY) (3 &mgr;g/ml), mit 2 × 106/ml in 1,0 ml-Volumina in Platten mit 24 Vertiefungen in Gegenwart von entweder 10 &mgr;M HE-33, CsA, 10 ng FK506 oder Medium für variierende Zeiträume (jeweils 24, 48, 72 oder 96 Std.) in einem 37°C-Inkubator mit 5% CO2 kultiviert. Die Kulturüberstände wurden zu den angegeben Zeitpunkten gesammelt und bei –20°C eingefroren. Am Ende der 96 Std. wurden alle Überstände mit einem Enzym-Immunotest auf das Vorhandensein der Cytokine: Interleukin-2, -4, -10 und Interferon (IFN)-gamma getestet. Die Ergebnisse wurden in pg/ml Cytokinkonzentration und %-Hemmung der Cytokinbildung ausgedrückt. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.

Induktion von antigen-spezifischer T-Zellproliferation

PBMC eines Labor-Freiwilligen, der drei Monate zuvor eine Auffrischungsimpfung mit Tetanustoxoid (TTX) erhalten hatte, wurde in vitro auf eine sekundäre proliferative Antwort auf TTX-Antigen in Gegenwart oder Abwesenheit von HE-33 (1 oder 10 &mgr;M) und CsA (10 oder 100 &mgr;M) getestet. Die proliferative Antwort wurde durch Einbau von 3H-Thymidin in die DNA von sich teilenden Zellen bestimmt. Die Ergebnisse, gezeigt in Tabelle 5, wurden in Zählimpulsen pro Minute (CPM) und %-Hemmung der Proliferation ausgedrückt.

Anti-T-Zell-Rezeptor (TCR)/CD3-induzierte T-Zellproliferation

PBMC eines gesunden Freiwilligen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit 2 × 105 Zellen/Vertiefung kultiviert. Die Zellen wurden mit monoklonalen anti-CD3-Antikörpern (Pharmingen, San Diego, CA) mit einer Konzentration von 1 ng/ml in Gegenwart von entweder HE-33 (10 &mgr;M, 100 &mgr;M), CsA (100 &mgr;M) oder Medium stimuliert. Die Kulturen wurden für 3 Tage bei 37°C in einem 5% CO2-Inkubator inkubiert. Die proliferative Antwort wurde durch Einbau von 3H-Thymidin bestimmt. Wie in Tabelle 6 gezeigt, wurden die Ergebnisse in CPM und %-Hemmung der Proliferation ausgedrückt.

Bestimmung der Wirkung von HE-33 auf die PK-C-vermittelte Signalkette

PBMC eines gesunden Freiwilligen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit 2 × 105 Zellen/Vertiefung kultiviert. Die Zellen wurden mit optimalen Stimulierungsdosen von Phorbolmyristatacetat (PMA) (1,25 ng/ml) und Calciumionophor (A23187)) (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) (0,25 &mgr;M) in Gegenwart von 100 &mgr;M-Konzentrationen von HE-33, I-24, dbcAMP, CsA, Forskolin (Sigma Chem. Co.) oder Medium stimuliert. Forskolin ist ein Mittel, von dem bekannt ist, dass es die intazellulären cAMP-Spiegel durch Aktivieren der Adenylatcyclase erhöht. Die Kulturen wurden für 3 Tage bei 37°C in einem 5% CO2-Inkubator inkubiert. Die proliferative Antwort wurde durch Einbau von 3H-Thymidin bestimmt. Die Ergebnisse wurden in CPM und %-Hemmung der Proliferation ausgedrückt (Tabelle 7).

Einzeldosisbereich-Findungs-Studie von HE-33 in Mäusen

Swiss-Webster-Mäuse (Charles River Laboratories, Hollister, CA) wurden für die toxikologische Voruntersuchung verwendet. Einer Maus je Dosishöhe wurde eine einzelne intravenöse (i.v.) Dosis von entweder 1,5, 15, 75, 100, 150, 200, 300 oder 400 mg HE-33/kg Körpergewicht verabreicht. Das Dosisvolumen für alle Mäuse, die physiologische Kochsalzlösung oder Formulierungen von HE-33 erhielten, betrug 10 ml/kg Körpergewicht. Alle Dosen wurden als langsam eingespritzte i.v.-Injektion in die Schwanzvene verabreicht. Tag 1 der Studie für jede Maus war am Tag der Verabreichung des Arzneistoffs oder der physiologischen Kochsalzlösung.

Klinische Beobachtungen/Körpergewicht

Jede Maus wurde annähernd 10, 30 und 60 Minuten und 5 Stunden nach Verabreichen der Dosis an Tag 1 und einmal täglich an Tagen 2–8 eingehend auf klinische Zeichen für Toxizität beobachtet. Außerdem wurden zweimal täglich Prüfungen auf Mortalität ausgeführt. Das Körpergewicht wurde von jeder Maus vor Verabreichen der Dosis an Tag 1 erhalten. Das Körpergewicht (Tag 1) der in dieser Untersuchung verwendeten Mäuse lag zwischen 27,3 und 32,5 g (Tabelle 8).

Erzeugung von F1-Empfänger-Mäusen:

Männliche Mäuse von durch Inzucht erzeugten Stämmen, C57BL/6 (H-2b-Haplotyp), wurden mit weiblichen Mäusen von durch Inzucht erzeugten Stämmen, C3H/j (H-2k-Haplotyp), gepaart. Die so erhaltenen Hybride (C57BL/6 × C3H/j)F1 wurden als Empfänger für die B6-Milz-Zellen verwendet.

Eliminierung der endogenen und induzierbaren NK-Zellaktivität von den Zell-Spender-Mäusen (C57BL/6):

Sechs bis zehn Wochen alte C57BL/6-Mäuse wurden für 24 Stunden oral oder intravenös mit HE-33 behandelt. Oral behandelte Mäuse erhielten 400 mg/kg zweimal am Tag (Bid) und intravenös behandelte Mäuse erhielten einmalig 100 mg/kg i.v.

NK-Zellen-Cytotoxizitäts-Test:

Am Ende der 24-stündigen Vorbehandlung mit HE-33 wurden alle behandelten Mäuse und nicht-behandelte Kontroll-Mäuse (d.h. Mäuse behandelt mit Vehikel, PBS), durch zervikale Dislokation geopfert. Milz und Lymphknoten wurden entfernt und eine Einzelzellsuspension der vereinten Milzen und Lymphknoten von Mäusen in jeder Spendergruppe wurde in RPMI-1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin/Streptomycin, hergestellt. Die Zielzellen waren 51Cr-markierte Moloney-Leukämievirus-induzierte Lymphom (YAC)-Tumorzellen. Verschiedene Effektor:Ziel-Zellverhältnisse wurden in dreifachen Proben in Mikrotiterplatten mit U-förmigem Boden für 4 Stunden bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre, enthaltend 5% CO2, kultiviert. Die Mikrotiterplatten wurden dann zentrifugiert und 100-&mgr;l-Aliquote der Überstände wurden auf 51Cr-Freisetzung geprüft. Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als Prozent Lyse und Prozent Unterdrückung der Lyse. Das Verfahren von Ojo-Amaize, E. et. al., Scand. Journal of Immunology, 1978, 7: 297–306, wurde für die NK-Tests verwendet.

Bestrahlung der Empfänger B6 × C3H)F1-Mäuse:

Zehn bis zwölf Wochen alte (B6 × C3H)F1-Mäuse wurden subletal mit einer Cobalt-60 gamma-Quelle bei 450 Rad mit einer Einzeldosis bestrahlt.

Induktion von GVHD:

GVHD wurde bei bestrahlten (B6 × C3H)F1-Mäusen durch die intravenöse Injektion von 5 × 107 Spender-B6 (H-2b)-Milz- und Lymphknotenzellen induziert.

Beurteilung der GVHD:

Die Mäuse wurden wöchentlich gewogen, um den Gewichtsverlust zu dokumentieren, und wurden täglich auf gekrümmte Erscheinung, ausgedehnte Dermatitis, Durchfall und, letztlich, Tod beobachtet (Ferrara, J. L. M. et. al., Transplantation, 1989, 47: 50–54).

ERFINDUNGSGEMÄSSE VERBINDUNGEN

Wie in Tabelle 1 abgebildet, schließen synthetisierte und in der erfindungsgemäßen Methode getestete Verbindungen cyclische 3',5'-Adenosinmonophosphatderivate (1-18, 1-5, 1-15, 1-16, 1-22, 1-24, 1-41, 1-42) oder Nucleoside (1-46, 1-49, 1-50) ein. Zur Bezugnahme, die zur Synthese der an N-6 modifizierten Verbindungen verwendeten Techniken basieren auf dem zuvor beschriebenen Verfahren (Kataoka, S., et al., 1990), Chem. Pharm. Bull. 38: 3147–3154). Für die 2'-O-Alkylierungen wurde das Verfahren von Tazawa, et al. (Biochemistry (1972) 11: 4931–4937)) verwendet. (Abbas, A. K., et al., Hrsg., 1994, 2te Ausg. Cellular and Molecular Immunology, W. B. Saunders Co., USA).

VERBINDUNGSHERSTELLUNG 2'-O-Tosyl-c-AMP (1-5)

Zu einer Lösung von c-AMP (gekauft von SIGMA Chemical Company) in Dioxan wurde eine wässrige Natriumhydroxidlösung zugegeben. p-Toluolsulfonylchlorid wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Der so erhaltene weiße Feststoff wurde abfiltriert, mit kaltem Dioxan gewaschen und getrocknet, was die Titelverbindung als einen amorphen Feststoff ergab.

N6,N6-Di-n-Propyl-2'-O-tosyl-c-AMP (1-15)

Eine Lösung des obigen Feststoffs (1-5) in trockenem N,N-Dimethylformamid wurde mit Hexan-gewaschenem Natriumhydrid versetzt und das so erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 15 min gerührt. 3-Brom-1-propan wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Der Reaktionsansatz wurde durch die Zugabe von wässrigem Methanol abgeschreckt, an Kieselgel adsorbiert und mit einem steigenden Gradienten (0 bis 15%) von Methanol in Dichlormethan als Eluent flash-chromatographiert, was das Reinprodukt als amorphen, schmutzig-weißen Feststoff ergab.

N6,N6-Di-n-Propyl-c-AMP (1-18, d.h. HE-33)

Die 2'-O-Tosylverbindung (1-15) wurde in Methanol gelöst und mit wässrigem 2 N Natriumhydroxid versetzt. Das so erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur für zwei Tage gerührt. Das Gemisch wurde an Kieselgel adsorbiert und mit einem Gemisch aus Ethylacetat:Methanol:Aceton:Wasser::7:1:1:1 als Eluent flash-chromatographiert. Geeignete Fraktionen wurden vereint und in vacuo konzentriert, was die Zielverbindung oder das Mittel 1–18, d.h. HE-33, als einen Schaum ergab.

Mittel HE-33 (1-18)

Die chemischen Eigenschaften, Synthese und Isolierung von Mittel 1-18, hier als HE-33 bezeichnet, werden in Kataoka, S. et al. Chem. Pharm. Bull 38 (11) 3147–3154 (1990) und im U.S.-Patent, Serien-Nr. 5,246,922, in welchem mehrere Agonisten von HE-33 offenbart sind, beschrieben. Das U.S.-Patent, Serien-Nr. 5,246,922, wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.

Mittel 1-46

Die chemischen Eigenschaften, Synthese und Isolierung von Mittel 1-46 (siehe Formel &Pgr;), hier als das Nucleosid von HE-33 bezeichnet, sind in Roth, J. A. et al., Photochem. Photobiol. 6 (9): 657–64 (1967) beschrieben, worin mehrere Agonisten von 1–46 offenbart sind.

Tabelle 1 enthält die folgenden Nucleotid-Verbindungen:

HE-33: R1 = R2 = n-Propyl; R3 = R4 = H; R5 = OH; R6 = Na

1-15: R1 = R2 = n-Propyl; R3 = R4 = H; R5 = O-Tosyl; R6 = NH4

1-16: R1 = n-Propyl; R2 = H; R3 = R4 = H; R5 = OH; R6 = NH4

1-22: R1 = R2 = n-Butyl; R3 = R4 = H: R5 = O-Tosyl; R6 = NH4

1-24: R1 = R2 = n-Butyl; R3 = R4 = H; R5 = OH; R6 = NH4

1-42: R1 = R2 = n-Propyl; R3 = Benzyl-thiol; R4 = H; R5 = OH; R6 = Na

Tabelle 1 enthält die folgenden Nucleosid-Verbindungen:

1-46: R1 = R2 = n-Propyl; R3 = R4 = H; R5 = OH

1-49: R1/R2 = R1/R2 =; R3 = R4 = H; R5 = OH.

1-50: R1 = R2 = Ethyl; R3 = R4 = H; R5 = OH

ERGEBNISSE

Wie durch die folgenden Ergebnisse angedeutet, sind HE-33, dessen Nucleosid und Agonisten davon als Immunsuppressiva verwendbar, d.h. durch ihre Wirkung auf die zelluläre Immunität, wie in den vorstehend beschriebenen Standardtests angedeutet. Demgemäß sind HE-33, dessen Nucleosid bei der Immunsuppression der Bildung von, oder der Proliferation von, Immunocyten oder Lymphocyten verwendbar und sind deshalb bei der Unterdrückung der Abstoßung von Transplantaten, z.B. Organtransplantaten wie Haut-, Knochenmark- und Nierentransplantaten verwendbar; und bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten verwendbar. Die Wirkungen von HE-33 und dessen Nucleosid wurden in den vorstehend beschriebenen Tests bestimmt, deren Ergebnisse nachstehend dargelegt sind.

Tabelle 1 ist repräsentativ für Ergebnisse von mehreren Experimenten unter Verwendung von verschieden Spenderpaaren für jedes Experiment. Die Ergebnisse zeigen, dass das Hemmvermögen von HE-33 auf eine MLR in zwei Richtungen mit der von Cyclosporin (CsA) vergleichbar ist. Es kann auch gefolgert werden, das die Hemmkonzentrationso (IC50), d.h. die Arzneistoffkonzentration, die fähig ist eine 50%-Hemmung zu induzieren, sowohl für HE-33 als auch für CsA zwischen 0,1 &mgr;M und 1 &mgr;M liegt, wohingegen die anderen modifizierten Formen von HE-33 (1-5, 1-15, 1-16, 1-22 beziehungsweise 1-24) alle verschiedene IC50-Werte aufwiesen. Unter diesen wies jedoch Verbindung 1-24 signifikantes Hemmvermögen auf und findet in der erfindungsgemäßen Methode und Zusammensetzung Verwendung.

Tabelle 1

Hemmwirkung von HE-33,1-46 und Derivaten auf MLR in zwei Richtungen

Tabelle 2 zeigt die Hemmwirkung von HE-33 auf MHC-Klasse I beschränkte, cytotoxische T-Lymphocyten-vermittelte Lyse von MHC-disparaten Stimulator-Zielzellen. Bei Gewebeabstoßungsreaktionen lysieren MHC beschränkte, cytotoxische CD8+-T-Zellen MHC-disparates Spendergewebe, was zu Transplantatabstoßung führt (Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 1994, W. B. Saunders Co., USA; Imagawa, D. K., et al. in Aggarwal, B. B., et al., Hrsg. Human Cytokines: Their Role in Disease and Therapie, Blackwell Science, Inc., Cambridge, MA, 1995). In diesem Experiment wurde gezeigt, dass HE-33 signifikant (80%) die Lysefähigkeit von solchen cytotoxischen T-Zellen, erzeugt aus „humanen Einweg-MLR"-Kulturen, hemmte.

Tabelle 2

Hemmwirkung von HE-33 auf in einfacher MLR erzeugte humane T-Lymphocyten-vermittelte Cytolyse

Tabelle 3 zeigt im Wesentlichen die gleichen Ergebnisse wie Tabelle 2, außer dass diese Experimente in Mäusen (ex vivo) durchgeführt wurden. H-2 beschränkte cytotoxische T-Zellen wurden in vivo in Gegenwart oder Abwesenheit von HE-33 erzeugt. Wie in der Tabelle gesehen werden kann, induzierte HE-33, wenn 100 mg/kg davon jeden dritten Tag i.v. verabreicht wurden, eine 92% Hemmung der H-2K-anti-H-2d-spezifischen cytotoxischen T-Zellaktivität. Obwohl orale Verabreichung von HE-33 (400 mg/kg) nicht so wirksam war wie der i.v.-Weg, wurde auch eine gewisse Hemmwirkung (32%) beobachtet.

Tabelle 3

in vivo-Wirkung der Verabreichung von HE-33 auf die Erzeugung der cytotoxischen H-2K-anti-H-2d-T-Zellaktivität*
Einer CH/J-Maus wurden für 9 Tage 2 × 10 DBA/2-Milzzellen injiziert. HE-33 wurde entweder oral (400 mg/kg) oder intravenös (100 mg/kg) an Tag 0 und jeden dritten Tag verabreicht. Con-A-stimulierte DBA/2-Milzzellen wurden als Zielzellen verwendet.

Tabelle 4 ist repräsentativ für Ergebnisse von drei Experimenten, die die Hemmwirkung von HE-33 auf IL-2 und IL-4 zeigen, welche T-Zellcytokine sind, von denen bekannt ist, dass sie an der frühen Phase der Abstoßung (10) beteiligt sind.

Tabelle 4

Wirkungen von HE-33 (100 &mgr;M) auf die Bildung von IL-2, IL-4, IL-10 und Interferon-gamma in PHA-stimulierten Kulturen von humanen PBMC

Tabelle 5 zeigt die Hemmwirkung von HE-33 auf Tetanustoxoid-spezifische T-Zellproliferation. Gewebeabstoßung ist ein antigen-spezifischer Immunprozess, welcher in der frühen Phase der Immunantwort antigen-spezifische T-Zellproliferation einbezieht. Die sekundäre Immunantwort eines Individuums, das gegen ein spezifisches Antigen, Tetanus, immunisiert worden war und eine Auffrischimpfung erhalten hatte, wurde von HE-33 zu 91% gehemmt.

Tabelle 5

Hemmwirkung von HE-33 auf antigen-spezifische Proliferation

Tabelle 6 ist das Ergebnis von Experimenten, die mit dem monoclonalen Maus-Antikörper OKT3/antiCD3 ausgeführt wurden. Derzeit ist er der einzige monoclonale Antikörper, der zur Verwendung bei der klinischen Organtransplantation zugelassen ist. Der Antikörper ist gegen das humane CD3-Antigen auf allen T-Zellen gerichtet. In vitro ist anti-CD3 ein polyclonaler Aktivator, aber in vivo fungiert anti-CD3 entweder als ein lytischer Antikörper, der das Komplementsystem aktiviert, um T-Zellen zu eliminieren, oder opsonisiert T-Zellen für die Phagocytose. Die in vitro-Ergebnisse mit anti-CD3, gezeigt in Tabelle 6, deuteten darauf hin, dass HE-33 eine 97%-Hemmung der anti-CD3-induzierten polyclonalen Aktivierung der T-Zellen innerhalb der PBMC-Population induziert, was nahe legt, dass das zelluläre Ziel für HE-33 die T-Zelle ist.

Tabelle 6

Hemmwirkung von HE-33 auf anti-CD3-induzierte T-Zellproliferation

Anti-CD3-mAK wurde mit einer Konzentration von 1 ng/ml verwendet.

Tabelle 7 stellt das Ergebnis eines Experiments dar, das zeigt, dass HE-33 die calciumabhängige Proteinkinase-C (PK-C)-vermittelte Zellproliferation hemmte. Von CsA ist bekannt, das es über den Calcium/Calmodulin-Weg arbeitet (Abbas et al.). Folglich wurde CsA in diesem Experiment als eine positive Kontrolle verwendet. Wie in der Tabelle gesehen werden kann, hemmte CsA diesen Weg zu 96% ebenso gut wie HE-33 oder I-24 (97% beziehungsweise 98%). Interessanterweise hemmte die herkömmliche zellpermeable cAMP-Verbindung, dbcAMP, diesen Weg nur zu 38%. Dies legte nahe, dass HE-33/I-24 Derivate von cAMP sind, welche sich signifikant von herkömmlichen cAMPs unterscheiden.

Tabelle 7

Hemmwirkung von HE-33 auf Proteinkinase-C-vermittelte T-Zellproliferation

Tabelle 8 ist das Ergebnis einer Toxikologie-Studie. Alle Mäuse überlebten für die Dauer der Studie. Arzneistoff-bezogene klinische Zeichen von Toxizität traten zwischen 10 Minuten und 5 Std. nach Verabreichen der Dosis an Tag 1 auf. Tiere in den Gruppen mit einer Dosis von 150–400 mg HE-33/kg zeigten Zeichen von Hypoaktivität, flache Haltung mit oder ohne geschlossene Augen und langsames Atmen, was Zentralnervensystemaktivität nahe legt. Nach Tag 1 jedoch waren alle Mäuse in physiologische Kochsalzlösung- und Arzneistoff-behandelten Gruppen zwischen den Tagen 2 und 8 normal. Der keine-Wirkung-Spiegel („no-effect-level") (NOEL) für eine einzelne i.v.-Verabreichung von HE-33 bei Mäusen betrug 100 mg/kg, wohingegen die maximal tolerierte Dosis (MTD) größer als oder gleich 400 mg/kg war.

Tabelle 8

Einzeldosisbereich-Findungs-Studie des Testgegenstands HE-33 bei Mäusen

Klinische Beobachtungen bei Tieren, behandelt mit Testgegenstand HE-33 oder physiologischer Kochsalzlösung
Tiere erhielten eine Dosis mit physiologischer Kochsalzlösung, eingestellt auf pH-Wert 8,55. Beobachtungen werden als vorhanden (x) oder nicht beobachtet (–) aufgezeichnet. Zusätzliche Beobachtung wurde in dem Zeitintervall berichtet, das dem Auftreten am nächsten war. FPSR = Flache Haltung mit oder ohne geschlossene Augen; das Tier würde periodisch als Reaktion auf oder ohne einen Geräusch-Stimulus aufschrecken.
Wirkung von HE-33 auf Hauttransplantation

Um die immunsuppressive Wirkung von HE-33 in vivo zu zeigen, wurde Haut vom Schwanz von Balb/C-Mäusen auf C57BL/6-Mäuse transplantiert. Balb/C- und C57BL/6-Mäuse sind insofern genetisch histoinkompatibel, als Balb/C vom Haplotyp H-2d ist, wohingegen C57BL/6 vom Haplotyp H-2b ist. Das in diesen Experimenten verwendete Operationsverfahren wurde gemäß den von Matriano, J. E. et al. (J. Immunol., 1996, 156: 4114–4119) berichteten Verfahren ausgeführt.

Wie in Tabelle 9 gezeigt, wurde Gruppen 2 und 3 HE-33 jeden Tag von 2 Tagen vor der Transplantation an durch i.v.-Injektion gegeben. Mäusen in Gruppen 4 und 5 wurde HE-33 täglich von 2 Tagen vor der Transplantation an oral verabreicht. Die Abstoßung wurde durch Beobachten von Rötung und Trockenheit des Transplantats bewertet (Matriano, J. E. et al., J. Immunol., 1996, 153: 1505–1514). Bei einer Dosis von 100 mg/kg i.v. verlängerte HE-33 das Überleben des Transplantats um annähernd 4 Tage.

Tabelle 9

Wirkung von HE-33 auf das Überleben eines Hauttransplantats bei Mäusen

C57BL/6-Mäusen wurde Haut vom Schwanz von Balb/c-Mäusen transplantiert. Arzneistoffbehandlung wurde zwei Tage vor Transplantation begonnen. Verbände wurden an Tag 6 entfernt und das Überleben des Transplantats wurde jeden Tag bewertet. Abstoßung wurde anhand der Veränderung der Dicke, Trockenheit und > 80% Rötung des Transplantats definiert.

Vorbeugung vor GVHD

Vorbeugung vor oder Unterdrückung von GVHD bei Empfänger-Mäusen wurde durch Behandeln von Spender-Mäusen vor Transplantation mit einer therapeutisch wirksamen Menge an HE-33 eine ausreichende Zeitspanne vor Übertragung von Spenderzellen auf Empfänger (B6 × C3H)F1-Mäuse erreicht. Ein bevorzugter Zeitpunkt zur Behandlung des Spenders ist etwa 24 Stunden vor Übertragung von Zellen, Geweben oder Organen vom Spender auf den Empfänger, obwohl Vorbeugung vor oder Unterdrückung von GVHD unter Verwendung der erfindungsgemäßen Methode durch Behandeln des Spenders von etwa eine Stunde bis etwa 48 Stunden vor Übertragung von Zellen, Geweben oder Organen vom Spender auf den Empfänger erreicht werden kann.

Tabelle 10 bildet die ex-vivo-Ergebnisse auf die NK-Aktivität von übertragenen Zellen ab. Orale Vorbehandlung von Spender-Mäusen für 24 Stunden mit 400 mg/kg HE-33 (Bid) führte zu nahezu 80% Eliminierung/Unterdrückung der endogenen NK-Zellaktivität gegenüber etwa 35% für i.v.-Behandlung der Spender-Mäuse. Wie in 2. gezeigt, führte diese Unterdrückung der endogenen NK-Zellaktivität zur Vorbeugung vor GVHD bei Empfängern der NK-supprimierten Zellpopulation.

2 ist repräsentativ für Ergebnisse von einem Experiment, das die dramatische Hemmwirkung von HE-33 auf GVHD bei (B6 × C3H)F1-Mäusen, die Zellen von HE-33-vorbehandelten C57BL/6-Spendermäusen erhielten, zeigt. Bis 55 Tage post Zellübertragung waren mehr als 95% der Empfänger von Zellen von mit physiologischer Kochsalzlösung vorbehandelten Spender-Mäusen gestorben, gegenüber nur 30% der Empfänger von Zellen von HE-33-vorbehandelten Mäusen. Darüber hinaus waren bis Tag 30, post Zellübertragung, 90% der Empfänger von Zellen von mit physiologischer Kochsalzlösung behandelten Mäusen gestorben, wohingegen keiner der Empfänger von Zellen von HE-33-behandelten Zellen gestorben war (P < 0,0000001). Die mittlere Überlebenszeit (MST) der Mäuse, die starben, betrug 13 Tage für Kontroll-Mäuse und 46 Tage für Mäuse, die HE-33-vorbehandelte Zellen erhielten.

3 bildet die Ergebnisse eines zweiten Experiments ab, in welchem die Wirkung von HE-33 auf GVHD mit der von Cyclosporin-A (CsA) verglichen wurde. An Tag 33 post Zellübertragung waren 100% (25/25) der (B6 × C3H)F1-Mäuse, die Zellen von CsA-vorbehandelten C57BL/6-Mäusen erhielten, gestorben, gegenüber 50% (11/25) der (B6 × C3H)F1-Mäuse, die Zellen von HE-33-vorbehandelten C57BL/6-Mäusen erhielten. Diese Ergebnisse zeigen deutlich die Wirksamkeit von HE-33 bei der Vorbeugung vor GVHD. Sowohl der orale als auch der intravenöse Weg der Verabreichung von HE-33 war bei der Vorbeugung vor GVHD wirksam. Jedoch war der orale Weg besser als der i.v.-Weg.

TABELLE 10

Vorbehandlung von C57BL/6-Mäusen mit HE-33 über verschiedene Wege der Verabreichung

(Spender von Zellen an (C57BL/6 × C3H/j)F1-Mäuse zur GVHD-Induktion)

NK-Zellaktivität unter Verwendung von YAC-I-Zellen als Ziel

Anspruch[de]
  1. Verwendung einer Verbindung oder eines Agonisten mit einer der folgenden Strukturen:
    wobei R1, R2 gleich oder verschieden sind und H, -(CH2)nOH, wobei n = 1–5; C1-12-Alkyl, substituiert oder unsubstituiert, geradkettig oder verzweigt, mit 0–6-Doppelbindungen; Aryl oder substituiertes Aryl bedeuten,

    R3, R4, R5 gleich oder verschieden sind oder in einer unabhängigen Kombination aus H, Cl, Br, F, I, NH2, NHR1, N(R1)2, OH, OR1, SH und SR1 ausgewählt werden können,

    R6 = H, NH4+, Na+ und jedes andere physiologisch verträgliche Kation; oder

    R6 = N-Alkyl (mono-, di- oder trisubstituiertes) linear- oder verzweigtkettiges C1-6,

    für die Herstellung eines Arzneimittels, gegebenenfalls in Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel, zur Induzierung der Immunsuppression in Tieren.
  2. Verwendung nach Anspruch 1 zur Induzierung der Immunsuppression von NK-Zellen.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Vorbeugung von Transplantat-Wirt-Reaktion bei einem Transplantat-Empfänger.
  4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei bei der Verbindung von Formel I R1 = R2 = n-Propyl; R3 = R4 = H; R5 = OH; und R6 = Na ist.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei bei der Verbindung von Formel I R1 = R2 = n-Butyl; R3 = R4 = H; R5 = OH; und R6 = NH4 ist.
Es folgen 3 Blatt Zeichnungen






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