Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunoassays zur
Bestimmung eines Analyten, insbesondere eines an einer Oberfläche adsorbierten Analyten,
oder eines Analyten, wie er in einer flüssigen Probe in Lösung oder an einem speziellen
Ort darin vorliegt, wie an einer speziellen Oberfläche.
Die Erfindung betrifft insbesondere enzymgebundene Immunosorptionsassays
(ELISA) zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer flüssigen Probe
einschließlich seiner Konzentration in der Masse der flüssigen Probe oder seiner
Konzentration an einer speziellen Oberfläche. Die vorliegende Erfindung betrifft
speziell neue Immunoassayverfahren und Kits, die speziell an die Durchführung dieser
neuen Immunoassayverfahren angepasst sind.
Hintergrund der Erfindung
Immunoassays wie ELISA werden weitverbreitet zur entweder qualitativen
oder meistens quantitativen Bestimmung einer nahezu unbegrenzten Vielfalt von organischen
Substanzen, die entweder natürlicher Herkunft oder synthetische chemische Verbindungen
sind, wie beispielsweise Peptiden, Proteinen, Enzymen, Hormonen, Vitaminen, Arzneimittelwirkstoffen,
Kohlehydraten, usw., für verschiedene Zwecke, wie beispielsweise insbesondere für
diagnostische Zwecke, jedoch auch für forensische Anwendungen, zur Nahrungsmittelqualitätskontrolle
und allgemein für jeden analytischen Zweck eingesetzt. Alle derartigen zu bewertenden
Substanzen werden hier allgemein als Analyte bezeichnet.
Es gibt viele verschiedene Varianten von ELISA-Verfahren. Die hier
im Folgenden gegebene Beschreibung soll eine typische ELISA-Technik illustrieren.
Sie gibt nicht vor, vollständig zu sein, und sollte in keinerlei Weise als den Umfang
der vorliegenden Erfindung einschränkend angesehen werden. In der folgenden Beschreibung
werden ELISA-Verfahren beispielsweise als separate Stufen des Inkubierens einer
Probe mit einem ersten Bindungspartner des Analyten und des Inkubierens des gebildeten
Reaktionsprodukts mit einem zweiten Bindungspartner des Analyten umfassend beschrieben
(anschließend werden Bindungspartner des Analyten mitunter als Bindungspartner für
den Analyten beschrieben). Einige existierende ELISA-Ausführungsformen umfassen
jedoch keine derartigen separaten Inkubationsstufen und ermöglichen das Reagieren
des Analyten simultan oder kurz nacheinander in einer und derselben Inkubationsstufe
mit sowohl seinem ersten als auch seinem zweiten Bindungspartner. Konkurrierende
ELISA sind ein weiteres Beispiel für ELISA-Varianten, die hier nicht detailliert
erörtert werden. Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf irgendwelche und
alle ELISA-Varianten und auf ähnliche Immunoassayverfahren anwendbar, die genau
genommen keine ELISA-Verfahren sind, z. B. weil an ihnen nicht die Verwendung eines
Enzyms beteiligt ist.
In einem typischen ELISA wird die Probe mit einem ersten Bindungspartner
für den Analyten in Kontakt gebracht, und die Probe und der Bindungspartner für
den Analyten werden für eine ausreichende Zeitdauer inkubiert, damit der in der
Probe enthaltene Analyt an den Bindungspartner binden kann, um die Anwesenheit eines
interessierenden Analyten nachzuweisen, oder die Konzentration eines interessierenden
Analyten zu messen, insbesondere in einer flüssigen Probe, die eine Körperflüssigkeit
wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Speichel, Sputum, usw. sein kann.
Ein typisches Beispiel für einen solchen Bindungspartner ist ein Analyt-spezifischer
Antikörper, z. B. ein monoklonaler Antikörper mit Spezifizität für den fraglichen
Analyten. Andere Arten von Substanzen und Strukturen können sich jedoch ebenfalls
als Bindungspartner eignen. Der natürliche Rezeptor des fraglichen Analyten könnte
beispielsweise als Bindungspartner nützlich sein, ebenso wie andere Substanzen und
Strukturen, an die sich der Analyt binden kann. Der Bindungspartner ist normalerweise
ein spezifischer Bindungspartner, dies ist jedoch kein Muss. Es ist sogar möglich,
ohne einen ersten Bindungspartner zu arbeiten und den Analyten entweder direkt (z.
B. durch Adsorption) oder durch eine nicht spezifisch bindende Verbindersubstanz
zu immobilisieren (d. h. an eine feste Phase zu binden). Alle derartigen Varianten
sollen ausdrücklich in den Umfang dieser Erfindung eingeschlossen sein. Die Worte
"an einer Oberfläche adsorbierter Analyt" beziehen sich hier auf irgendein Verfahren,
das zum Anbringen oder Binden des Analyten an einer Oberfläche führt.
Der erste Bindungspartner wird üblicherweise in einer immobilisierten
Form, d. h. an einer festen Phase wie beispielsweise Polystyrolperlen oder der Innenfläche
des Reaktionsbehälters (z. B. eines Reaktionsröhrchens oder eine Mulde einer Mikrotiterplatte)
angebracht verwendet. Der Bindungspartner kann an der festen Phase physikalisch
adsorbiert sein, oder üblicherweise durch kovalentes Binden befestigt werden. Der
Bindungspartner wird gemäß einigen ELISA-Ausführungsformen durch
Verwendung eines geeigneten Kupplungsmittels und in anderen durch Verwendung geeigneter
Verbindersubstanzen, wie beispielsweise Biotin und (Strept)avidin befestigt. In
einigen ELISA-Ausführungsformen wird die Immobilisierung des Bindungspartners nach
der Inkubation der Probe und des Bindungspartners durchgeführt, wodurch die Reaktion
zwischen Analyten und Bindungspartner in der flüssigen Phase ablaufen kann. Der
Bindungspartner kann in einer biotinylierten Form aufgebracht werden, um seine nachfolgende
Immobilisierung zu ermöglichen. Immobilisierung kann danach durch Verwendung einer
festen Phase bewirkt werden, die (Strept)avidin trägt.
Infolge dieser ersten Reaktion wird sich jeglicher in der Probe vorhandene
Analyt an seinen Bindungspartner und dadurch an die feste Phase gebunden haben.
Nachdem die Flüssigkeit entfernt worden ist und die feste Phase gewaschen worden
ist, werden üblicherweise Schritte durchgeführt, um das Ergebnis nachweisbar zu
machen. Die feste Phase, an der der Bindungspartner und der Analyt, soweit vorhanden,
angebracht worden sind, wird mit einem zweiten Bindungspartner für den Analyten
in Kontakt gebracht. Wiederum ist ein spezifischer Bindungspartner die Regel, jedoch
nicht absolut erforderlich. Dieser zweite Bindungspartner trägt üblicherweise eine
Markierung/einen Marker, der seinen Nachweis ermöglicht. In einigen ELISA-Ausführungsformen
wird der zweite Bindungspartner jedoch in nicht-markierter Form verwendet und wird
nach seiner Bindung markiert, indem ein markierter Bindungspartner für den zweiten
Bindungspartner verwendet wird. Der zweite Bindungspartner kann beispielsweise ein
(entweder polyklonaler oder monoklonaler) Maus-Antikörper gegen den fraglichen Analyten
sein, und nach seiner Bindung an den Analyten, der über seinen ersten Bindungspartner
an der festen Phase angebracht worden ist, wird ein markiertes Anti-Maus-IgG der
Ziege verwendet, um eine Markierung an dem immobilisierten Komplex anzubringen.
Bei ELISA besteht die Markierung aus einem Enzym, das zu einer nachweisbaren
Umwandlung eines Substrats in der Lage ist, z. B. einer Peroxidase wie Meerrettich-Peroxidase,
die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid ein Substrat wie 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin
in ein farbiges Produkt umwandeln kann.
Nachdem der Enzym-markierte Reaktant an dem immobilisierten Komplex
angebracht worden ist, wird normalerweise vor Eintreten in die eigentliche Nachweisphase
die feste Phase mit daran gebundenem Komplex gewaschen.
In der Nachweisphase wird Substratlösung zu der festen Phase mit angebrachtem
Komplex gegeben, und die Umwandlung des Substrats, soweit vorhanden, wird nachgewiesen.
Um quantitative Messung des Analyten zu ermöglichen, wird die feste Phase mit der
Substratlösung für einen festgelegten Zeitraum inkubiert, der ausreichend lang sein
sollte, um eine wesentliche enzymatische Umwandlung des Substrats in eine gefärbte
Substanz zu ermöglichen. Nach Beendigung der Substratumwandlungsreaktion wird die
Intensität der Färbung, die proportional zu der Menge des immobilisierten Enzyms
ist, durch optische Mittel wie ein Photometer gemessen, um die Extinktion bei einer
gewählten Wellenlänge, wie 450 nm, zu messen.
Ein Nachteil der existierenden ELISA-Techniken ist, dass die Adsorptions-
und Nachweisphasen, um Assay-Empfindlichkeit zu gewährleisten, bei niedrigen Analytkonzentrationen
sehr zeitraubend sind. Die Adsorptionsgeschwindigkeit des Analyten an der Oberfläche
ist proportional zu der Konzentration des Analyten in der Lösung und wird daher
auch sehr niedrig, selbst in gut gerührten Systemen. Um eine zuverlässige Messung
von Analyten zu ermöglichen, die in einer Flüssigkeit in einer Konzentration in
der Größenordnung von Nanogramm oder sogar Picogramm pro ml vorliegen, kann die
Adsorptionsphase eine Reaktionszeit von einer bis mehreren Stunden erfordern.
Ein weiterer Nachteil der bestehenden ELISA-Techniken ist, dass sie
nicht die Messung extrem niedriger Oberflächenkonzentrationen von Analyten ermöglichen,
wie sie an der Oberfläche biologischer (Modell)-Membranen vorkommen.
Eine Aufgabe dieser Erfindung liegt in der Bereitstellung einer modifizierten
Immunoassay-, z. B. ELISA-, -Technik, wodurch die Inkubationszeit in der Adsorptions-
und/oder Nachweisphase verringert oder die Empfindlichkeit der Assays erhöht wird,
oder beides.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung modifizierter
Immunoassay-, z. B. ELISA-, -Techniken, die die Messung der Analytkonzentrationen
an einer speziellen Oberfläche ermöglichen.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von Produkten,
die speziell zur Durchführung dieser modifizierten Immunoassaytechniken adaptiert
sind.
Die Erfindung betrifft eine fundamentale Modifikation des Assayprinzips
der Immunoassays, z. B. ELISA, wobei die Messung der Ansammlung des Enzymprodukts
in der (Massephasen)-Lösung durch in-situ-Messung der Akkumulation des Niederschlags
auf einer festen Oberfläche ersetzt wird. Die vorliegende Erfindung bezieht die
Verwendung eines Niederschlag bildenden Systems, wie einer Enzym-Substrat-Kombination,
die zur Bildung, eines Niederschlags auf einer festen Oberfläche führt, und die
Messung der Oberflächenmasse ein, z. B. durch Ellipsometrie oder andere Oberflächenmassenmesstechniken.
Durch Anwendung dieser Erfindung können sehr niedrige Konzentrationen
von adsorbiertem Analyten auf der festen Oberfläche bestimmt werden, und die Adsorptionsphase
des Analyten aus der Flüssigkeit an die Oberfläche kann wesentlich verkürzt werden.
Der zeitraubende Aufbau der Produktkonzentration in der Massenflüssigphase ist auch
nicht länger erforderlich und wird durch eine Adsorption einer dünnen Niederschlagsschicht
mit nur molekularen Abmessungen auf der festen Oberfläche ersetzt. Diese Modifikation
führt zu einem wesentlichen Anstieg der Assayempfindlichkeit und bietet die Möglichkeit
deutlich kürzerer Assayzeiten. Sie ermöglicht auch die Bestimmung extrem niedriger
Oberflächenkonzentrationen, wie sie. an der Oberfläche biologischer (Modell)-Membranen
vorliegen können.
Die Bestimmung der Analytkonzentrationen durch "Immunoausfällung"
ist eine wohl bekannte Technik. Der Niederschlag der Analyt-Antikörper-Aggregate,
der nach diesem Verfahren nach Zugabe des ausfällenden Antikörpers gebildet wird,
wird üblicherweise einfach sedimentieren gelassen, aufgefangen und gewogen. Trotz
schlechter Ausfällung, wenn entweder der Analyt oder der Antikörper in großem Überschuss
vorhanden ist, ist gezeigt worden, dass diese Technik unter gut definierten Bedingungen
quantitative Interpretation der Daten ermöglicht (siehe z. B. die EP-A-0 368 462).
In einer empfindlicheren und schnelleren Version dieser Technik werden mit Antikörper
beschichtete (Latex)-Partikel zugefügt, und die Aggregatbildung wird durch Lichtstreuung
gemessen. Auf diese Weise wird die zeitraubende Sedimentierung vermieden, und die
Messungen können in Sekunden fertig sein. Das vorliegende Verfahren unterscheidet
sich fundamental von diesen Techniken. In jenen Techniken wird der Analyt nicht
an einer Feststoff/Flüssig-Grenzfläche konzentriert, und die Niederschlagmenge wird
nicht kontinuierlich im Zeitverlauf erhöht, wie wenn sie durch ein Enzym produziert
wird. Wegen dieser Faktoren und wegen einer unspezifischen Aggregation haben diese
Techniken eine begrenzte Empfindlichkeit und lassen Messung von Analytkonzentrationen
unter dem ng/ml-Bereich im Allgemeinen nicht zu.
Analytische Verfahren, die eine Enzym-gesteuerte Bildung eines (gefärbten)
Niederschlags beinhalten, sind an sich bekannt. Ein solches Verfahren ist beispielsweise
auf dem Sektor der Immunocytochemie bekannt. Bei diesem bekannten Verfahren wird
ein spezielles Protein in dem Gewebe bestimmt, indem nach Gefrieren des Gewebes
oder mittels verschiedener Formen chemischer Fixierung zuerst dünne Gewebeschnitte
hergestellt werden und danach Antikörper zugegeben werden, die spezifisch das Protein
erkennen und sich an dieses binden, um die Anwesenheit und/oder Lokalisierung verschiedener
Gewebeproteine in histologischen Untersuchungen zu zeigen. Überschüssige Antikörper
werden entfernt, und danach wird ein zweiter Enzym-verbundener Antikörper, beispielsweise
ein IgG-HRP-Konjugat, zugefügt. Nach Entfernen des überschüssigen Konjugats wird
ein geeignetes Substrat, wie beispielsweise 3,3'-Diaminobenzidin (DAB), zugefügt.
Wenn das spezifische Protein in dem Gewebe vorhanden ist, erfolgt eine lokalisierte
Anfärbung infolge der Bildung eines von DAB abgeleiteten Niederschlags.
Die vorliegende Erfindung betrifft jedoch nicht die Lokalisierung
und den Nachweis von Proteinen in Gewebe, sondern den Nachweis und die Messung von
Analyt (Konzentrationen), der auf festen Oberflächen adsorbiert ist oder in Lösungen
vorliegt. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem eine (vorzugsweise quantitative)
Messung der Oberflächenmasse (im ng/cm2-Bereich), während bei dem bekannten
immunocytochemischen Verfahren qualitative Ergebnisse erhalten werden, üblicherweise
durch visuelle oder mikroskopische Untersuchung. In einigen Untersuchungen ist die
Intensität der Verfärbung gemessen worden, indem optische Dichtemessungen verwendet
wurden, die Technik ist jedoch nie mit einer Technik zur quantitativen Messung der
Oberflächenmasse kombiniert werden, wie Ellipsometrie oder anderen. Dies wäre in
der Durchführung auch sehr schwierig, weil die Dicke der Gewebeschnitte (Mikrometer)
in einer anderen Größenordnung als die Dicke der Niederschlagschichten (Nanometer)
liegt, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen wird.
Der Stand der Technik schlägt die Verwendung von Immunoassays auf
Basis von optischer Interferenz auf speziell hergestellten, optisch aktiven Aufnahmeoberflächen
vor, die mit dünnen Oxid-, Nitrid- oder Polymerfilmen beschichtet sind. Mittels
dieser Vorbeschichtung führt die zusätzliche Adsorption einer Niederschlagschicht
zu visuell nachweisbaren Farbveränderungen. Solche Anwendungen sind in der US-A-5
418 136 vorgestellt worden. Die EP-A-0 546 222 beschreibt einen Immunoassay auf
Basis von optischer Interferenz auf einer Analyt bindenden Substratoberfläche, wobei
ein enzymatischer Marker an den oberflächengebundenen Analyten
gebunden wird und wobei ein Niederschlag als Ergebnis einer Reaktion zwischen dem
Marker und einem Ausfällungsmittel auf der Oberfläche gebildet wird. Nach Waschen
und Trocknen der Oberfläche wird der Niederschlag nachgewiesen, um die Anwesenheit
des Analyten auf der Oberfläche zu zeigen. Neben visuellem Nachweis der Niederschlagsbildung
wurde in diesen Verfahren des Standes der Technik auch Messung des Niederschlags
durch Ellipsometrie verwendet. Die verschiedenen Spül- und/oder Trocknungsstufen,
die in diesen Techniken erforderlich sind, schließen jedoch die hohe Empfindlichkeit
aus, die durch in-situ-Messungen erhalten werden kann. Zum Nachweis sehr niedriger
Analytkonzentrationen in biologischen Flüssigkeiten wie Plasma, Serum, Blut, Milch
oder Urin übersteigt die unspezifisch adsorbierte Masse anderer Massensubstanzen,
wie Albumin, oft die winzigen Mengen des adsorbierten. Niederschlags, und Spülen
oder Trocknen führt zu Veränderungen in der Oberflächenmasse, die den spezifischen
Effekt bei weitem übertreffen. In-situ-Messung bietet auch die Möglichkeit eines
einstufigen ELISA, wobei der Analyt, das Konjugat und das chromogene Substrat zusammen
ohne dazwischen liegende Wasch- oder Trocknungsstufen zugegeben werden. Dies wäre
bei einem normalen ELISA unmöglich, weil die Farbproduktion durch den Überschuss
des nicht-gebundenen Konjugats die Farbproduktion der geringen Menge an Analyt-gebundenem
Konjugat an der Oberfläche bei weitem übertreffen würde. Im Unterschied dazu misst
die vorliegende Technik nur den Niederschlag, der durch oberflächengebundenes Konjugat
produziert wird. Zusätzlich zu einer höheren Empfindlichkeit ermöglicht die vorliegende
Verwendung der in-situ-Messung auch einen schnelleren Assay, weil zeitraubende Spül-
und/oder Trocknungsstufen mit anschließender separater Messung des Niederschlagsvermieden
werden.
Ein weiterer fundamentaler Unterschied zu den in den beiden genannten
Patenten beschriebenen Techniken liegt darin, dass erfindungsgemäß keine speziell
hergestellten, optisch aktiven oder polymerbeschichteten Oberflächen erforderlich
sind. Solche Oberflächen sind teuer, genau wie die optisch aktiven Scheibchen, die
in Techniken auf Basis von Oberflächenplasmonresonanz (SPR) verwendet werden, während
in dem erfindungsgemäßen Verfahren preisgünstige reflektierende (Einweg)-Oberflächen,
wie Siliciumwafer oder mit Chrom bedampfte Glasscheibchen verwendet werden können.
Der Stand der Technik schlägt die Verwendung verstärkter Ellipsometrie
als Mittel zur Erhöhung der Empfindlichkeit von Proteinadsorptionsmessungen vor
[5]. Bei dem betreffenden Verfahren des Standes der Technik wurde die Masse des
Markierungsantikörpers erhöht, indem er an Siliciumdioxidpartikel gekuppelt wurde.
Antikörperbeschichtete Goldpartikel sind auch verwendet worden, vorwiegend in Kombination
mit Elektronenmikroskopie in Lokalisierungsuntersuchungen [6]. Eine weitere Technik
des Standes der Technik zur Verstärkung der Oberflächenmasse verwendet biotinylierte
oder analytbeschichtete Liposomen [7, 8].
Diese Techniken unterscheiden sich fundamental von der vorliegenden
Erfindung, weil sie keine kontinuierliche Akkumulation von Niederschlag pro Markierungsmolekül
verwenden, sondern einfach schwerere Markierungen verwenden. Der Vorteil der besseren
Nachweisbarkeit solcher schweren Markierungen muss wegen ihrer langsameren Diffusion
in Richtung Oberfläche gegen ihre langsamere Adsorption abgewogen werden, und daher
kommt die Verwendung dieser Verfahren für schnelle Assays nicht in Frage.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung liefert ein Immunoassayverfahren zum Bestimmen eines
Analyten, der an einer Oberfläche adsorbiert ist oder in einer flüssigen Probe vorhanden
ist, bei dem der Analyt an eine feste Phase gebunden wird, ein Marker an dem Analyten
angebracht wird und an der festen Phase angebrachter Marker nachgewiesen wird, wobei
eine Kombination aus Marker und Nachweismittel verwendet wird, die in der Lage ist,
einen Niederschlag an einer festen Phase zu produzieren, die den Marker trägt, und
das Binden des Analyten an die feste Phase nachgewiesen wird, ohne Manipulationen
wie Waschen, Trocknen oder Spülen durchzuführen, indem die Änderung der Oberflächenmasse
der festen Phase infolge der Bildung des Niederschlags in situ bestimmt wird.
Die Erfindung liefert ferner einen Kit zur Durchführung eines Immunoassayverfahrens
zum Bestimmen eines Analyten, der an einer Oberfläche adsorbiert oder in einer flüssigen
Probe vorhanden ist, wobei der Kit mindestens ein spezifisch an die Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens angepasstes Mittel umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Figur zeigt die Ergebnisse einer Niederschlag-verstärkten ellipsometrischen
Messung von Fettsäure bindendem Protein (a) und Annexin V (b) auf PVC-beschichteten
Siliciumscheiben.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert gemäß einem ersten Aspekt ein Immunoassayverfahren
zum Bestimmen eines Analyten, der auf einer Oberfläche adsorbiert ist oder in einer
flüssigen Probe vorhanden ist, bei dem der Analyt an eine feste Phase gebunden wird,
ein Marker an dem Analyten angebracht wird und an der festen Phase angebrachter
Marker nachgewiesen wird, wobei eine Kombination aus Marker und Nachweismittel verwendet
wird, die in der Lage ist, einen Niederschlag an einer festen Phase zu produzieren,
die den Marker trägt, und das Binden des Analyten an die feste Phase in-situ nachgewiesen
wird, indem die Oberflächenmasse der festen Phase infolge der Bildung des Niederschlags
in situ bestimmt wird.
Der Begriff "in-situ Nachweis" soll wiederspiegeln, dass eine Änderung
der Oberflächenmasse bestimmt wird, wenn der Niederschlag gebildet wird. Mit anderen
Worten werden kein Waschen, Trocknen, Spülen oder andere Manipulationen durchgeführt,
die zu Fehlern des gemessenen Ergebnisses führen können, weil sie eine weitere Änderung
der Oberflächenmasse bewirken. Ein in-situ-Nachweis ermöglicht zudem die Messung
der Niederschlagsbildung durch oberflächengebundenes Enzym, sogar in Anwesenheit
von Substratumwandlung durch überschüssiges Enzym in der Lösungsphase (einstufiger
ELISA).
Wie bereits zuvor im Hintergrundabschnitt angegeben wurde, betrifft
die Erfindung eine große Vielfalt unterschiedlicher Immunoassayverfahren. Die meisten
haben die Gemeinsamkeit, dass der Analyt, falls er in der Probe vorhanden ist, durch
das Zwischenstadium eines Bindungspartners des Analyten an die feste Phase gebunden
wird, üblicherweise eines spezifischen Bindungspartners, wie eines Antikörpers,
der den Analyten spezifisch bindet. In einigen Ausführungsformen kann der Analyt
jedoch direkt durch Adsorption oder durch unspezifische Verbindermittel an die feste
Phase gebunden werden.
Der Bindungspartner kann, falls verwendet, vorab an die feste Phase
angebracht worden sein. Alternativ wird er an die feste Phase gebunden, nachdem
er mit dem Analyten, falls vorhanden, reagiert hat.
Die meisten Immunoassayausführungsformen haben ferner die Gemeinsamkeit,
dass ein zweiter Bindungspartner des Analyten verwendet wird, um einen Marker an
dem Analyten anzubringen. Der Bindungspartner, falls verwendet, ist wiederum vorzugsweise
ein spezifischer Bindungskörper, wie ein Antikörper, der spezifisch an den Analyten
bindet.
Dieser zweite Bindungspartner des Analyten kann den Marker tragen.
Alternativ trägt den Marker jedoch eine Substanz, die an den zweiten Bindungspartner
des Analyten binden kann. Wenn der zweite Bindungspartner des Analyten beispielsweise
ein monoklonaler Antikörper der Ratte gegen den Analyten ist, kann der Marker direkt
an diesem monoklonalen Antikörper angebracht werden, oder er kann alternativ an
einen Anti-Maus-Ig-Antikörper angebracht werden (d. h. einen Antikörper, der spezifisch
an Immunoglobuline der Ratte bindet).
Das Anbringen des Markers an dem Analyten kann entweder gleichzeitig
mit dem Anbringen des Analyten an der festen Phase durchgeführt werden, oder vorher,
oder danach. Es ist in den meisten Immunoassayverfahren bevorzugt, den Analyten
zuerst zu immobilisieren und lediglich danach den Marker an den immobilisierten
Analyten zu binden.
Das Verfahren ist vorzugsweise ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung
der Konzentration des Analyten in der Probe. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist das vorliegende Verfahren ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung der Konzentration
des Analyten an einer speziellen Oberfläche. Die fragliche Oberfläche kann eine
biologische (Modell)-Membran, d. h. die Oberfläche einer zellulären Membran, oder
eine künstliche Oberfläche sein, z. B. eine künstliche Oberfläche, die eine natürlich
vorkommende, interessierende Oberfläche imitieren soll, die vorzugsweise auf einer
einheitlich zugänglichen Oberfläche abgesetzt ist und quantitative Interpretation
der Niederschlagsbildung ermöglicht. Die Erfindung ist jedoch nicht. auf quantitative
Verfahren begrenzt und kann nützlich sein, um die Anwesenheit einer extrem niedrigen
Konzentration des Analyten in der Probe entweder in der Masse der Probe oder an
einem speziellen Ort, wie einer speziellen Oberfläche, qualitativ zu bestimmen.
Die Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase wird vorzugsweise
durch Ellipsometrie bestimmt. Die Erfindung erstreckt sich jedoch auf andere Techniken
zur Bestimmung der Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase, wie Oberflächenplasmonresonanz
und totale innere Reflexionsfluoreszenz.
In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist
der Marker ein Enzym, und das Nachweismittel umfasst ein Substrat
des Enzyms. Der Immunoassay ist vorzugsweise ein ELISA-Verfahren. Vorzugsweise werden
eine Meerrettich-Peroxidase als das Enzym und 3,3'-Diaminobenzidin als das Substrat
verwendet. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich jedoch auf andere Enzym-Substrat-Kombinationen,
die einen Niederschlag produzieren können, wie alkalische Phosphatase als das Enzym
und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und Nitroblau-tetrazolium als Substrat. Die
Erfindung deckt ferner irgendwelche anderen Kombination von Marker und Nachweismittel
ab, die einen Niederschlag auf einer festen Phase, die den Marker trägt, produzieren
kann. Die Bildung eines Niederschlags kann beispielsweise das Ergebnis von Nukleierung
durch nukleiertes Wachstum von Metall- oder Nichtmetallpartikeln oder das Ergebnis
von Ketten- oder Polymerisationsreaktionen von z. B. ungesättigten Kohlenwasserstoffen
sein, die durch Einwirkung von z. B. Ultraviolettstrahlung, usw. polymerisiert werden
können. Der Marker könnte beispielsweise einen ungesättigten Kohlenwasserstoff umfassen,
und das Nachweismittel könnte eine weitere Menge des gleichen oder eines anderen
Kohlenwasserstoffs zusammen mit Mitteln zum Initiieren der Polymerisation (wie UV-Strahlung)
umfassen. Alternativ könnte der Marker kolloidale Partikel eines Metalls, z. B.
Gold, Silber, usw., oder eines Nichtmetalls, z. B. Selen, Tellur, Kohlenstoff, Siliciumdioxid,
usw. umfassen, während das Nachweismittel eine Quelle einer weiteren Menge des gleichen
oder eines anderen Metalls oder Nichtmetalls zusammen mit Mitteln (z. B. einem geeigneten
Reduktionsmittel, wie einer Borhydridverbindung, die das Metall aus einer chemischen
Verbindung freisetzen kann, die das Metall enthält) umfasst, um das Wachstum der
als Marker verwendeten kolloidalen Partikel zu fördern.
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass eine Siliciumscheibe als feste
Phase verwendet wird. Die Erfindung erstreckt sich jedoch auf andere feste Phasen,
die zur Verwendung in einer Technik zur Bestimmung der Änderung der Oberflächenmasse
der festen Phase geeignet sind, wie ein mit Chrom bedampftes Glasscheibchen. Prinzipiell
kann die feste Phase aus irgendeiner einfachen und preisgünstigen reflektierenden
Oberfläche bestehen und erfordert keine Vorbehandlung, wie Ablagerung spezieller,
optisch aktiver Schichten, wie beispielsweise in der US-A-5 418 136 beschrieben
ist.
Die Menge des Analyten, die auf feste Oberflächen adsorbiert wird,
hängt im Allgemeinen von den Transportbedingungen. (Diffusion und Rühren) in dem
System ab. Bei den üblichen laminaren Strömungssystemen impliziert dies, dass adsorbierte
Mengen in Strömungsrichtung abnehmen können, weil die Fluidgrenzflächenschicht zunehmend
an Analyt verarmt. Diese Ortsabhängigkeit der Menge an adsorbiertem Analyten kann
die quantitative Beschreibung der Rate der Niederschlagsbildung stören, wenn beispielsweise
die biologische Auswirkung einer winzigen Proteinmenge, die an einer Membran adsorbiert
wird, gemessen wird [4] und danach die für diesen Effekt verantwortliche Proteinmenge
die Messung wäre. Es ist gefunden worden, dass dieses Problem überwunden werden
kann, indem das vorliegende Verfahren quantitativ an sogenannten einheitlich zugänglichen
Oberflächen durchgeführt wird, das heißt, mit identischen Adsorptionsbedingungen
über die gesamte Oberfläche. Unter Verwendung einer solchen Oberfläche kann die
biologische Wirkung mit der adsorbierten Menge an Analyt verknüpft werden, ausgedrückt
pro Flächeneinheit. Eine einheitlich zugängliche Oberfläche, eine rotierende Scheibe
in Lösung, ist entwickelt worden und ermöglicht ellipsometrische Messung der Analytadsorption
auf ihrer Oberfläche [9]. Die Kombination mit Ellipsometrie an einer rotierenden
Scheibe ist daher eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Die Adsorption von Analyten aus Pufferlösungen auf und allgemeiner
die Akkumulation fester Substanzen an planaren Oberflächen kann mittels Ellipsometrie
nachgewiesen und quantifiziert werden. Dies ist eine optische Technik, die Reflexion
von monochromatischem Licht gegen die adsorbierende Oberfläche verwendet, wobei
die Technik eine quantitative Messung der Analytadsorption mit einer Nachweisgrenze
von 1 bis 5 ng/cm2 ermöglicht.
Die reflektierende Oberfläche, in den hier gegebenen Beispielen ein
vorbehandeltes Siliciumscheibchen, wird beispielsweise in einer Quarzküvette angeordnet,
die mit z. B. 5 ml Pufferlösung gefüllt wird. Monochromatisches Licht aus einem
He-Ne-Laser mit einer Wellenlänge von 632,8 nm durchläuft zuerst ein polarisierendes
Prisma P und danach eine Viertelwellenplatte mit seiner schnellen Achse bei 45°
zur Einfallebene. Das Licht tritt danach in die Küvette ein, wird gegen das Siliciumscheibchen
reflektiert, tritt aus der Küvette aus, durchläuft ein zweites polarisierendes Prisma
A und wird schließlich durch eine Photodiode nachgewiesen. Die Positionen von P
und A werden mittels eines Computers eingestellt, um so die resultierende Lichtintensität,
die die Photodiode erreicht, auf einem Minimum zu halten. Wenn eine feste Substanz
auf der reflektierenden Oberfläche adsorbiert, werden die Positionen von P und A
verändert, um die Intensität minimal, zu halten. Eine solche Adsorption führt somit
zu einer Veränderung der Positionen von dem "Polarisator" P und dem "Analysator"
A. In dem speziellen Fall von Siliciumscheibchen als reflektierender Oberfläche
und organischen Substanzen, wie beispielsweise Proteinen, Lipiden, Zuckern oder
organischen Niederschlägen, als adsorbierenden Analyten ist die Änderung der adsorbierten
Oberflächenmasse direkt proportional zu der Veränderung in dem Polarisator.
Die in den Beispielen verwendeten Scheibchen wurden aus Siliciumwafern geschnitten
(Wacker Chemitronic; n-Typ, phosphordotiert). Die Messungen wurden bei Raumtemperatur
(20°C ± 1°C) unter kontinuierlichem Rühren mit einem sich drehenden
Rührer durchgeführt. Das Instrument und die Datenanalyse sind in früheren Veröffentlichungen
unserer Gruppe [1, 2] beschrieben worden.
In einem typischen Experiment wird das vorbehandelte Scheibchen in
die Ellipsometerküvette gegeben und eine Nullablesung (P0, A0) durchgeführt. Danach
wird das zu bewertende Protein zu dem Puffer gegeben und eine geeignete Zeitdauer,
beispielsweise 5 Minuten, auf das Scheibchen adsorbieren gelassen. Bei sehr niedrigen
Proteinkonzentrationen, wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, bleibt
die Proteinmenge, die in diesem Zeitraum adsorbiert, unter der Nachweisgrenze des
Ellipsometers, so dass die Positionen P0 und A0 im Wesentlichen unverändert bleiben.
Die Küvette wird danach mit frischem Puffer gewaschen, und der freie Oberflächenraum
auf dem Scheibchen wird durch Adsorption von Albumin oder anderen Massenproteinen
blockiert. Ein Antikörper-Meerrettichperoxidase- (HRP)-Konjugat wird danach zugegeben
und eine geeignete Zeitdauer adsorbieren gelassen, beispielsweise zwei Minuten lang.
Die Küvette wird wieder gewaschen, und eine Substratlösung, die 3,3'-Diaminobenzidin
(DAB) und H2O2 enthält, wird zugegeben. An Stellen, an denen
sich Konjugatmoleküle an das adsorbierte Protein gebunden haben, bildet sich durch
die enzymatische Wirkung von HRP DAB-Niederschlag. Wegen der fortlaufenden DAB-Umwandlung
wird die Oberflächenmasse des Niederschlags schon bald viel größer als die ursprüngliche
Proteinmasse und wird durch Ellipsometrie nachweisbar.
In einem anderen Aufbau, der die Bestimmung sehr niedriger Proteinkonzentrationen
anstrebt, werden die Waschstufen zwischen der Zugabe von Analyt, Konjugat und Ausfällungssubstrat
weggelassen und der Analyt, das Konjugat und das DAB-Substrat werden zusammen oder
kurz nacheinander zugegeben. Auf diese Weise wird ein einstufiger ELISA erhalten.
Erfindungsgemäß wird die Messung der Rate der Niederschlagsbildung
auf der festen Oberfläche vorzugsweise durch Ellipsometrie durchgeführt. Das. Assayprinzip
der vorliegenden Erfindung kann jedoch gleichermaßen gut auf andere Techniken zur
quantitativen Messung der Oberflächenmasse angewendet werden, wie anderen Formen
von Reflektometrie als Ellipsometrie, Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und totale
innere Reflexionsfluoreszenz. Ellipsometrie ist eine spezielle Form von Reflektometrie,
und es gibt einfachere Formen davon, beispielsweise Ausführungsformen ohne die Viertelwellenplatte.
Diese Techniken haben als gemeinsames Merkmal, dass Lichtreflexion an der gleichen
Seite der reflektierenden Oberfläche stattfindet wie die Analytadsorption. Dies
trifft auf die SPR und die TIRF nicht zu, und die Lichtreflexion findet an der nichtadsorbierenden
Seite des Scheibchens statt.
Bei der SPR ist eine sogenannte "dämpfende" Lichtwelle, die an der
anderen Seite des Scheibchens austritt, empfindlich gegenüber dem Brechungsindex
der adsorbierten Analytschicht. Bei einem bestimmten Einfallwinkel erfolgt eine
optische Resonanz, und die adsorbierte Masse des Analyten kann aus diesen Daten
berechnet werden. Die SPR hat ungefähr die gleiche Nachweisgrenze wie Ellipsometrie,
die reflektierenden Scheibchen benötigen jedoch eine dünne Schicht aus einer Substanz
mit einem hohen Brechungsindex auf der Analyt adsorbierenden Seite des Scheibchens,
üblicherweise eine dünne Goldschicht. Weil diese Schicht enge Spezifikationen erfüllen
muss, sind SPR-Scheibchen teuer. Im Unterschied dazu sind die in einem Ellipsometer
verwendeten Siliciumscheibchen preisgünstig und können als Einwegmaterialien verwendet
werden.
Bei der TIRF liegt die gedämpfte Welle bei einem Einfallwinkel, der
zu Totalreflexion führt. Die Welle dringt ein kurzes Stück in die Lösung ein und
regt Fluoreszenzsonden an, die an den Analyten angebracht sind. Die Intensität des
Fluoreszenzsignals ist proportional zu der adsorbierten Menge des Analyten. Es sind
keine teuren Scheibchen erforderlich, die Technik ist jedoch weniger empfindlich
als die Ellipsometrie oder die SPR.
Neben anderen Techniken zur Messung der Oberflächenmasse können erfindungsgemäß
auch andere Enzym-Substrat-Kombinationen verwendet werden, solange sie einen Niederschlag
erzeugen. Statt des beispielhaften Systems aus Meerrettichperoxidase (HRP) und 3,3'-Diaminobenzidin
(DAB) könnten beispielsweise alkalische Phosphatase (AP) als Enzym und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat
(BCIP) mit Nitroblautetrazolium (NBT) als Substrate verwendet werden. Irgendeine
andere Enzym/Substrat-Kombination oder sogar Niederschlagsbildung, die nicht auf
enzymatischer Umwandlung, sondern beispielsweise auf Nukleierung basiert, könnte
ebenso verwendet werden.
Obwohl die hier gegebenen Beispiele die Bestimmung von Proteinkonzentrationen
in Pufferlösungen illustrieren, gilt das Prinzip ebenso für irgendeinen anderen
Lösungs- oder Suspensionstyp, insbesondere jene, die für medizinische Zwecke verwendet
werden, wie Urin, Plasma oder Vollblut.
Zur Veranschaulichung der Erfindung betreffen die hier gegebenen Beispiele
drei verschiedene Proteinassays, die sich in Bezug auf das zu bewertende Protein
(Analyt) unterscheiden, sich jedoch auch in Bezug auf Oberflächenvorbereitung und
Nachweisprinzip unterscheiden.
Beispiel 1 betrifft einen Assay von Annexin V. Annexin V ist ein intrazelluläres
Protein mit einer noch unbekannten biologischen Funktion. Annexin V ist wegen der
wohl definierten Parameter für seine Adsorption an Phospholipidmembranen als Modellprotein
verwendet worden. Es ist ein Protein, das in Gegenwart von Calcium hohe Bindungsaffinität
für Phospholipidmembranen hat, vorausgesetzt, dass diese Membranen Aminophospholipide
wie Phosphatidylserin (PS) enthalten. Der Adsorptionsprozess ist transportbegrenzt,
und die Rate der Annexin V Adsorption kann genau aus den Rührbedingungen und der
Annexin V Konzentration in Lösung berechnet werden. Wie in Beispiel 1 gezeigt ist,
wurde Annexin V direkt auf Siliciumscheibchen adsorbiert, die mit Phospholipiddoppelschichten
vorbeschichtet worden waren, und wurde erfindungsgemäß mit einem zweistufigen Immunoverfahren
nachgewiesen. Die Phospholipid-Doppelschichten sind ein Beispiel für einen spezifischen
Bindungspartner, der kein Antikörper für den fraglichen Analyten ist. Dieses Beispiel
zeigt, dass Binden von Annexin V an Membranen erfindungsgemäß in dem normalen physiologischen
Konzentrationsbereich von Annexin V im Plasma von 1 bis 5 ng/ml untersucht werden
kann.
In Beispiel 2 wurden Fettsäure-Bindungsprotein (FABP) (und auch Annexin
V) auf Polyvinylchlorid(PVC)-beschichteten Siliciumscheibchen unter Verwendung des
Sandwich-Prinzips zum Nachweis bestimmt. FABP ist ein Herzmarkerprotein mit einer
normalen Plasmakonzentration von 1 bis 2 ng/ml, das momentan als Frühmarker für
den akuten Herzinfarkt und als Marker für die erfolgreiche Reperfusionstherapie
nach akutem Herzinfarkt verwendet wird. Die heutigen ELISA für dieses Protein benötigen
etwa eine Stunde Versuchszeit, während diese Zeit mit der Technik der vorliegenden
Erfindung auf wenige Minuten verkürzt werden könnte. Mit einem eigens dafür verwendeten
Instrument würde dies rasche Messung am Bett ermöglichen.
Beispiel 3 veranschaulicht die Verwendung der Erfindung zur Bewertung
von Interleukin 6 (IL6). IL6 ist ein wichtiger Mediator der entzündlichen Reaktion
mit einer normalen Plasmakonzentration unter 10 pg/ml. Die Bestimmung solcher Konzentrationen
mit konventionellen ELISA benötigt momentan mehrere Stunden, während sie, wie hier
gezeigt wird, mit der neuen erfindungsgemäßen Technik innerhalb von 30 Minuten durchgeführt
werden kann. Bei IL6 wurde der Abfänger-Antikörper nur 15 Minuten auf stark hydrophoben
(silanisierten) Siliciumscheibchen adsorbiert, und das Biotin-Streptavidin-System
wurde zum Nachweis verwendet.
Diese Beispiele zeigen, dass das Verfahren für einen umfassenden Bereich
von Oberflächen und Nachweisprinzipien verwendet werden kann. Andere reflektierende
Oberflächen als Siliciumscheibchen, beispielsweise mit Chrom bedampfte Glasscheibchen,
können gleichermaßen gut verwendet werden und sind in der Tat von unserer Gruppe
in der Vergangenheit verwendet worden [1, 2].
Unter Berücksichtigung dieser Umstände werden die folgenden Aspekte
als Teil der Erfindung angesehen:
1) Quantitative Messung der Konzentrationen spezieller Analyten, wie Proteine,
Peptide, Zucker, usw., in Lösungen mittels in-situ-Ellipsometriemessung (der Geschwindigkeit)
der Akkumulation des durch die kontinuierliche Wirkung von (Enzym)-Molekülen gebildeten
Niederschlags, welche sich entweder direkt an den oberflächengebundenen Analyten
binden oder an andere Moleküle gekoppelt werden, die sich an diese Analyten binden.
2) Die Verwendung von Prinzip 1) zur Messung der Konzentrationen dieser Analyten
in irgendeinem Typ von Lösung oder Suspension, wie destilliertem Wasser, Pufferlösungen,
physiologischer Salzlösung, Urin, Plasma, Vollblut, usw.
3) Die Verwendung von Prinzip 1) in Kombination mit anderen Techniken zur quantitativen
Messung der Oberflächenmasse, wie anderen Formen von Reflektometrie als Ellipsometrie,
Oberflächenplasmonresonanz, totale innere Reflexionsfluoreszenz, usw.
4) Die Verwendung von Prinzip 1) in Kombination mit irgendeiner anderen Form
von reflektierenden Oberflächen oder anderen Formen von Oberflächenherstellung,
wie Vorbeschichten reflektierender Oberflächen mit Phospholipiden oder Polymeren.
5) Die Verwendung von Prinzip 1) in Kombination mit irgendeiner Modifizierung
des Nachweisprinzips, wie anderen Enzym/Substrat-Kombinationen oder Niederschlag
bildenden Reaktionen, Sandwich-Techniken, einzelnen gegen mehrfachen Enzym-Molekül-Markierungen,
direkter oder kompetitiver Bindung, usw.
6) Die Verwendung von Prinzip 1) in einem Immunoassay mit gleichzeitiger Zugabe,
oder Zugabe kurz nacheinander, von Analyt, Konjugat und Niederschlag bildendem Substrat
ohne dazwischen erfolgende Spül- oder Waschstufen (einstufiger ELISA).
7) Kombination von Prinzip 1) mit der Verwendung einheitlich zugänglicher Oberflächen,
vorzugsweise einer rotierenden Scheibe, zur quantitativen Beschreibung
der Rate der Niederschlagsbildung und zum Ausdruck der oberflächengebundenen (biologischen)
Aktivität in der Menge des gebundenen Wirkstoffs pro Oberflächeneinheit.
Beispiel 1. Bestimmung der Annexin V Konzentrationen
Siliciumscheibchen wurden durch Zugabe von 20 &mgr;M Phospholipidvesikeln,
erhalten durch Ultraschallbehandlung einer 20 DOPS/80 % DOPC-Mischung, wie beschrieben
[3,4], mit Phospholipiddoppelschichten bedeckt. Nach Bildung einer stabilen Phospholipid-Doppelschicht
auf der Oberfläche wurde überschüssiges Phospholipid durch Waschen der Küvette mit
Puffer entfernt, und Human-Annexin V wurde zugefügt. Nach 200 s langer Adsorption
wurde die Küvette gewaschen, und 120 s lang wurde polyklonales Anti-Annexin V des
Kaninchens zugefügt. Die Küvette wurde wiederum gewaschen und Anti-Kaninchen-IgG
des Schweins, konjugiert an HRP, wurde 120 s lang zugefügt. Die Küvette wurde wiederum
gewaschen, 0,278 mM DAB und 0,834 mM H2O2 zugegeben und die
Bildung von Niederschlag an der Oberfläche durch Ellipsometrie gemessen. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1. Bestimmung der Annexin V Konzentrationen
Die Werte geben Polarisatoränderungen in Grad (± Standardabweichung)
von vier Experimenten an.
Wenn die Nachweisgrenze als Polarisatoränderung definiert ist, die
die Polarisatoränderung plus drei Mal die Standardabweichung der Blindprobe übersteigt,
folgt aus Tabelle 1, dass die niedrigste Oberflächenkonzentration von 0,01 ng/cm2,
die etwa 100 Mal niedriger als durch direkte Elipsometrie nachweisbar ist,q bereits
innerhalb von 300 s Inkubationszeit gemessen werden kann.
Beispiel 2. Bestimmung der FABP-Konzentrationen
Siliciumscheibchen wurden durch ein automatisiertes Tauchverfahren
der Scheibchen in eine Lösung von PVC in Cyclohexanon mit homogenen PVC-Schichten
mit 20 bis 25 nm Dicke beschichtet. Die Scheibchen wurden durch über Nacht erfolgende
Adsorption mit monoklonalen Antikörpern gegen FABP (und Annexin V) beschichtet,
und freier Oberflächenraum wurde durch entweder Albumin oder Magermilchpulver blockiert.
Die Scheibchen wurden dann 10 Minuten lang verschiedenen Konzentrationen von FABP
(oder Annexin V) ausgesetzt, und die adsorbierten Proteine wurden direkt mit monoklonalen
Antikörper/HRP-Konjugaten, oder bei Annexin V mit dem beschriebenen Zweistufenverfahren
nachgewiesen. Die Niederschlagsbildung nach Zugabe von DAB, gemessen mittels Ellipsometrie,
ist in der Figur gezeigt. Innerhalb von 120 s DAB-Umwandlungszeit konnte eine Konzentration
von 0,5 ng/ml gemessen werden.
Beispiel 3. Bestimmung der IL6-Konzentrationen
Ein monoklonaler Abfänger-Antikörper gegen IL6 wurde nur 15 Minuten
lang auf stark hydrophoben (silanisierten) Siliciumscheibchen adsorbiert, und verschiedene
Konzentrationen von IL6 wurden nur 10 Minuten lang zugegeben. Es folgten zwei kurze
Inkubationsstufen mit biotinylierten Anti-IL6-Antikörpern und Streptavidin-markierter
(Multi)-HRP. Die Ergebnisse der ellipsometrischen Messung der Niederschlagsbildung
nach Zugabe von DAB sind in Tabelle 2 gezeigt. Eine Konzentration von 10 pg/ml IL6
konnte in weniger als 300 s DAB-Umwandlungszeit und einer Gesamtassayzeit von weniger
als 30 Minuten ermittelt werden.
Tabelle 2. Bestimmung der IL6-Konzentrationen
Die Werte zeigen Polarisatoränderungen in Grad (± Standardabweichung).
Referenzen
1. P. A. Cuypers, J. W. Corsel, M. P. Janssen, J. M. M. Kop, W. Th. Hermens,
H. C. Hemker. The adsorption of prothrombin to phosphatidylserine multilayers, quantitated
by ellipsometry. J Biol Chem 1983; 258: 2426-31.
2. J. W. Corsel, G. M. Willems, J. M. M. Kop, P. A. Cuypers, W. Th. Hermens.
The role of intrinsic binding rate and transport rate in the adsorption of prothrombin,
albumin and fibrinogen. to phospholipid bilayers. J. Colloid Interface Sci 1986;
111:544-54.
3. P. L. A. Giesen, G. M. Willems, H. C. Hemker, W. Th. Hermens: Membrane-mediated
assembly of the prothrombinase complex. J Biol Chem 1991; 266: 18720-5.
4. P. L. A. Giesen, H. C. Hemker, W. Th. Hermens: Production of thrombin as
a probe for mixing of phospholipids in membranes on solid supports. Biochim Biophys
Acta 1995; 1237: 43-8.
5. C. F. Mandenius, K. Mosbach. Detection of biospecific interactions using
amplified ellipsometry. Anal Biochem 1988; 170: 68-72.
6. H. Nygren. Experimental demonstration of lateral cohesion in a layer of adsorbed
protein and in layers of goldantibody complexes bound to surface-immobilized, antigen.
J Immunol Meth 1988; 114: 107-114.
7. H. A. H. Rongen, H. M. van der Horst, G. W. K. Hugenholtz, A. Bult, W. P.
van Bennekom. Development of a liposome immunosorbent assay for human interferon-gamma.
Anal Chim Acta 1994; 287: 191-199.
8. S. G. Reeves, S. T. A. Siebert, M. A. Roberts, R. A. Durst. Liposome immunosensing
devices for environmental Contaminant screening. Trends in Anal Chem 1995; 14: 351-355.
9. G. N. Willems, P. L. A. Giesen, W. Th. Hermens: Adsorption and conversion
of prothrombin on a rotating disc. Blood 1993; 82: 497-504.
Anspruch[de]
Immunoassayverfahren zum Bestimmen eines Analyten, der an einer Oberfläche
adsorbiert ist oder in einer flüssigen Probe vorhanden ist, bei dem der Analyt an
eine feste Phase gebunden wird, ein Marker an dem Analyten angebracht wird und an
der festen Phase angebrachte Marker nachgewiesen wird, wobei eine Kombination aus
Marker und Nachweismittel verwendet wird, die in der Lage ist, einen Niederschlag
an einer festen Phase zu produzieren, die den Marker trägt, und das Binden des Analyten
an die feste Phase nachgewiesen wird, ohne Manipulationen wie Waschen, Trocknen
oder Spülen durchzuführen, indem die Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase
infolge der Bildung des Niederschlags in situ bestimmt wird.
Immunoassayverfahren nach Anspruch 1, das ein quantitatives Verfahren
zum Bestimmen der Konzentration von Analyt in einer Probe ist.
Immunoassayverfahren nach Anspruch 1 oder 2, das ein quantitatives
Verfahren zur Messung von Oberflächenkonzentrationen von Analyt ist, der an festen
Oberflächen oder biologischen (Modell)-Membranen adsorbiert oder gebunden ist.
Immunoassayverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die
Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase durch Ellipsometrie bestimmt wird.
Immunoassayverfahren nach Anspruch 4, bei dem die Ellipsometrie an
einer einheitlich zugänglichen Oberfläche durchgeführt wird, vorzugsweise einer
rotierenden Scheibe.
Immunoassayverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die
Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase durch Oberflächenplasmonresonanz
bestimmt wird.
Immunoassayverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die
Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase durch Totalinternreflexionsfluoreszenz
bestimmt wird.
Immunoassayverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem
der Marker ein Enzym ist und das Nachweismittel ein Substrat von diesem Enzyms umfasst.
Immunoassayverfahren nach Anspruch 8, bei dem eine Meerrettich-Peroxidase
als Enzym und 3,3-Diaminobenzidin als Substrat verwendet wird.
Immunoassayverfahren nach Anspruch 8, bei dem eine alkalische Phosphatase
als Enzym verwendet wird und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und Nitroblau-tetrazolium
als Substrat verwendet werden.
Immunoassayverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das als einstufiger
ELISA durchgeführt wird.
Immunoassayverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
dem eine Siliciumscheibe als feste Phase verwendet wird.
Immunoassayverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem ein
mit Chrom bedampftes Glasscheibe als feste Phase verwendet wird.