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Dokumentenidentifikation DE69828646T2 29.12.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0001036331
Titel IMMUNOASSAY VERFAHREN UND TESTSATZ
Anmelder Nederlandse Organisatie voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO, Delft, NL
Erfinder HERMENS, Theodoor, Willem, NL-6247 CV Gronsveld, NL;
ROBERS, Markus, NL-6228 CX Maastricht, NL;
HACK, Erik, Cornelis, NL-1111 ND Diemen, NL;
AARDEN, Adrianus, Lucien, NL-1151 CV Broek in Waterland, NL
Vertreter Uexküll & Stolberg, 22607 Hamburg
DE-Aktenzeichen 69828646
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 25.11.1998
EP-Aktenzeichen 989572318
WO-Anmeldetag 25.11.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/NL98/00670
WO-Veröffentlichungsnummer 0099028751
WO-Veröffentlichungsdatum 10.06.1999
EP-Offenlegungsdatum 20.09.2000
EP date of grant 12.01.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.12.2005
IPC-Hauptklasse G01N 33/552
IPC-Nebenklasse G01N 33/543   G01N 33/557   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Immunoassays zur Bestimmung eines Analyten, insbesondere eines an einer Oberfläche adsorbierten Analyten, oder eines Analyten, wie er in einer flüssigen Probe in Lösung oder an einem speziellen Ort darin vorliegt, wie an einer speziellen Oberfläche.

Die Erfindung betrifft insbesondere enzymgebundene Immunosorptionsassays (ELISA) zur Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer flüssigen Probe einschließlich seiner Konzentration in der Masse der flüssigen Probe oder seiner Konzentration an einer speziellen Oberfläche. Die vorliegende Erfindung betrifft speziell neue Immunoassayverfahren und Kits, die speziell an die Durchführung dieser neuen Immunoassayverfahren angepasst sind.

Hintergrund der Erfindung

Immunoassays wie ELISA werden weitverbreitet zur entweder qualitativen oder meistens quantitativen Bestimmung einer nahezu unbegrenzten Vielfalt von organischen Substanzen, die entweder natürlicher Herkunft oder synthetische chemische Verbindungen sind, wie beispielsweise Peptiden, Proteinen, Enzymen, Hormonen, Vitaminen, Arzneimittelwirkstoffen, Kohlehydraten, usw., für verschiedene Zwecke, wie beispielsweise insbesondere für diagnostische Zwecke, jedoch auch für forensische Anwendungen, zur Nahrungsmittelqualitätskontrolle und allgemein für jeden analytischen Zweck eingesetzt. Alle derartigen zu bewertenden Substanzen werden hier allgemein als Analyte bezeichnet.

Es gibt viele verschiedene Varianten von ELISA-Verfahren. Die hier im Folgenden gegebene Beschreibung soll eine typische ELISA-Technik illustrieren. Sie gibt nicht vor, vollständig zu sein, und sollte in keinerlei Weise als den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränkend angesehen werden. In der folgenden Beschreibung werden ELISA-Verfahren beispielsweise als separate Stufen des Inkubierens einer Probe mit einem ersten Bindungspartner des Analyten und des Inkubierens des gebildeten Reaktionsprodukts mit einem zweiten Bindungspartner des Analyten umfassend beschrieben (anschließend werden Bindungspartner des Analyten mitunter als Bindungspartner für den Analyten beschrieben). Einige existierende ELISA-Ausführungsformen umfassen jedoch keine derartigen separaten Inkubationsstufen und ermöglichen das Reagieren des Analyten simultan oder kurz nacheinander in einer und derselben Inkubationsstufe mit sowohl seinem ersten als auch seinem zweiten Bindungspartner. Konkurrierende ELISA sind ein weiteres Beispiel für ELISA-Varianten, die hier nicht detailliert erörtert werden. Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf irgendwelche und alle ELISA-Varianten und auf ähnliche Immunoassayverfahren anwendbar, die genau genommen keine ELISA-Verfahren sind, z. B. weil an ihnen nicht die Verwendung eines Enzyms beteiligt ist.

In einem typischen ELISA wird die Probe mit einem ersten Bindungspartner für den Analyten in Kontakt gebracht, und die Probe und der Bindungspartner für den Analyten werden für eine ausreichende Zeitdauer inkubiert, damit der in der Probe enthaltene Analyt an den Bindungspartner binden kann, um die Anwesenheit eines interessierenden Analyten nachzuweisen, oder die Konzentration eines interessierenden Analyten zu messen, insbesondere in einer flüssigen Probe, die eine Körperflüssigkeit wie Blut, Plasma, Serum, Urin, Speichel, Sputum, usw. sein kann.

Ein typisches Beispiel für einen solchen Bindungspartner ist ein Analyt-spezifischer Antikörper, z. B. ein monoklonaler Antikörper mit Spezifizität für den fraglichen Analyten. Andere Arten von Substanzen und Strukturen können sich jedoch ebenfalls als Bindungspartner eignen. Der natürliche Rezeptor des fraglichen Analyten könnte beispielsweise als Bindungspartner nützlich sein, ebenso wie andere Substanzen und Strukturen, an die sich der Analyt binden kann. Der Bindungspartner ist normalerweise ein spezifischer Bindungspartner, dies ist jedoch kein Muss. Es ist sogar möglich, ohne einen ersten Bindungspartner zu arbeiten und den Analyten entweder direkt (z. B. durch Adsorption) oder durch eine nicht spezifisch bindende Verbindersubstanz zu immobilisieren (d. h. an eine feste Phase zu binden). Alle derartigen Varianten sollen ausdrücklich in den Umfang dieser Erfindung eingeschlossen sein. Die Worte "an einer Oberfläche adsorbierter Analyt" beziehen sich hier auf irgendein Verfahren, das zum Anbringen oder Binden des Analyten an einer Oberfläche führt.

Der erste Bindungspartner wird üblicherweise in einer immobilisierten Form, d. h. an einer festen Phase wie beispielsweise Polystyrolperlen oder der Innenfläche des Reaktionsbehälters (z. B. eines Reaktionsröhrchens oder eine Mulde einer Mikrotiterplatte) angebracht verwendet. Der Bindungspartner kann an der festen Phase physikalisch adsorbiert sein, oder üblicherweise durch kovalentes Binden befestigt werden. Der Bindungspartner wird gemäß einigen ELISA-Ausführungsformen durch Verwendung eines geeigneten Kupplungsmittels und in anderen durch Verwendung geeigneter Verbindersubstanzen, wie beispielsweise Biotin und (Strept)avidin befestigt. In einigen ELISA-Ausführungsformen wird die Immobilisierung des Bindungspartners nach der Inkubation der Probe und des Bindungspartners durchgeführt, wodurch die Reaktion zwischen Analyten und Bindungspartner in der flüssigen Phase ablaufen kann. Der Bindungspartner kann in einer biotinylierten Form aufgebracht werden, um seine nachfolgende Immobilisierung zu ermöglichen. Immobilisierung kann danach durch Verwendung einer festen Phase bewirkt werden, die (Strept)avidin trägt.

Infolge dieser ersten Reaktion wird sich jeglicher in der Probe vorhandene Analyt an seinen Bindungspartner und dadurch an die feste Phase gebunden haben. Nachdem die Flüssigkeit entfernt worden ist und die feste Phase gewaschen worden ist, werden üblicherweise Schritte durchgeführt, um das Ergebnis nachweisbar zu machen. Die feste Phase, an der der Bindungspartner und der Analyt, soweit vorhanden, angebracht worden sind, wird mit einem zweiten Bindungspartner für den Analyten in Kontakt gebracht. Wiederum ist ein spezifischer Bindungspartner die Regel, jedoch nicht absolut erforderlich. Dieser zweite Bindungspartner trägt üblicherweise eine Markierung/einen Marker, der seinen Nachweis ermöglicht. In einigen ELISA-Ausführungsformen wird der zweite Bindungspartner jedoch in nicht-markierter Form verwendet und wird nach seiner Bindung markiert, indem ein markierter Bindungspartner für den zweiten Bindungspartner verwendet wird. Der zweite Bindungspartner kann beispielsweise ein (entweder polyklonaler oder monoklonaler) Maus-Antikörper gegen den fraglichen Analyten sein, und nach seiner Bindung an den Analyten, der über seinen ersten Bindungspartner an der festen Phase angebracht worden ist, wird ein markiertes Anti-Maus-IgG der Ziege verwendet, um eine Markierung an dem immobilisierten Komplex anzubringen.

Bei ELISA besteht die Markierung aus einem Enzym, das zu einer nachweisbaren Umwandlung eines Substrats in der Lage ist, z. B. einer Peroxidase wie Meerrettich-Peroxidase, die in Gegenwart von Wasserstoffperoxid ein Substrat wie 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin in ein farbiges Produkt umwandeln kann.

Nachdem der Enzym-markierte Reaktant an dem immobilisierten Komplex angebracht worden ist, wird normalerweise vor Eintreten in die eigentliche Nachweisphase die feste Phase mit daran gebundenem Komplex gewaschen.

In der Nachweisphase wird Substratlösung zu der festen Phase mit angebrachtem Komplex gegeben, und die Umwandlung des Substrats, soweit vorhanden, wird nachgewiesen. Um quantitative Messung des Analyten zu ermöglichen, wird die feste Phase mit der Substratlösung für einen festgelegten Zeitraum inkubiert, der ausreichend lang sein sollte, um eine wesentliche enzymatische Umwandlung des Substrats in eine gefärbte Substanz zu ermöglichen. Nach Beendigung der Substratumwandlungsreaktion wird die Intensität der Färbung, die proportional zu der Menge des immobilisierten Enzyms ist, durch optische Mittel wie ein Photometer gemessen, um die Extinktion bei einer gewählten Wellenlänge, wie 450 nm, zu messen.

Ein Nachteil der existierenden ELISA-Techniken ist, dass die Adsorptions- und Nachweisphasen, um Assay-Empfindlichkeit zu gewährleisten, bei niedrigen Analytkonzentrationen sehr zeitraubend sind. Die Adsorptionsgeschwindigkeit des Analyten an der Oberfläche ist proportional zu der Konzentration des Analyten in der Lösung und wird daher auch sehr niedrig, selbst in gut gerührten Systemen. Um eine zuverlässige Messung von Analyten zu ermöglichen, die in einer Flüssigkeit in einer Konzentration in der Größenordnung von Nanogramm oder sogar Picogramm pro ml vorliegen, kann die Adsorptionsphase eine Reaktionszeit von einer bis mehreren Stunden erfordern.

Ein weiterer Nachteil der bestehenden ELISA-Techniken ist, dass sie nicht die Messung extrem niedriger Oberflächenkonzentrationen von Analyten ermöglichen, wie sie an der Oberfläche biologischer (Modell)-Membranen vorkommen.

Eine Aufgabe dieser Erfindung liegt in der Bereitstellung einer modifizierten Immunoassay-, z. B. ELISA-, -Technik, wodurch die Inkubationszeit in der Adsorptions- und/oder Nachweisphase verringert oder die Empfindlichkeit der Assays erhöht wird, oder beides.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung modifizierter Immunoassay-, z. B. ELISA-, -Techniken, die die Messung der Analytkonzentrationen an einer speziellen Oberfläche ermöglichen.

Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Bereitstellung von Produkten, die speziell zur Durchführung dieser modifizierten Immunoassaytechniken adaptiert sind.

Die Erfindung betrifft eine fundamentale Modifikation des Assayprinzips der Immunoassays, z. B. ELISA, wobei die Messung der Ansammlung des Enzymprodukts in der (Massephasen)-Lösung durch in-situ-Messung der Akkumulation des Niederschlags auf einer festen Oberfläche ersetzt wird. Die vorliegende Erfindung bezieht die Verwendung eines Niederschlag bildenden Systems, wie einer Enzym-Substrat-Kombination, die zur Bildung, eines Niederschlags auf einer festen Oberfläche führt, und die Messung der Oberflächenmasse ein, z. B. durch Ellipsometrie oder andere Oberflächenmassenmesstechniken.

Durch Anwendung dieser Erfindung können sehr niedrige Konzentrationen von adsorbiertem Analyten auf der festen Oberfläche bestimmt werden, und die Adsorptionsphase des Analyten aus der Flüssigkeit an die Oberfläche kann wesentlich verkürzt werden. Der zeitraubende Aufbau der Produktkonzentration in der Massenflüssigphase ist auch nicht länger erforderlich und wird durch eine Adsorption einer dünnen Niederschlagsschicht mit nur molekularen Abmessungen auf der festen Oberfläche ersetzt. Diese Modifikation führt zu einem wesentlichen Anstieg der Assayempfindlichkeit und bietet die Möglichkeit deutlich kürzerer Assayzeiten. Sie ermöglicht auch die Bestimmung extrem niedriger Oberflächenkonzentrationen, wie sie. an der Oberfläche biologischer (Modell)-Membranen vorliegen können.

Die Bestimmung der Analytkonzentrationen durch "Immunoausfällung" ist eine wohl bekannte Technik. Der Niederschlag der Analyt-Antikörper-Aggregate, der nach diesem Verfahren nach Zugabe des ausfällenden Antikörpers gebildet wird, wird üblicherweise einfach sedimentieren gelassen, aufgefangen und gewogen. Trotz schlechter Ausfällung, wenn entweder der Analyt oder der Antikörper in großem Überschuss vorhanden ist, ist gezeigt worden, dass diese Technik unter gut definierten Bedingungen quantitative Interpretation der Daten ermöglicht (siehe z. B. die EP-A-0 368 462). In einer empfindlicheren und schnelleren Version dieser Technik werden mit Antikörper beschichtete (Latex)-Partikel zugefügt, und die Aggregatbildung wird durch Lichtstreuung gemessen. Auf diese Weise wird die zeitraubende Sedimentierung vermieden, und die Messungen können in Sekunden fertig sein. Das vorliegende Verfahren unterscheidet sich fundamental von diesen Techniken. In jenen Techniken wird der Analyt nicht an einer Feststoff/Flüssig-Grenzfläche konzentriert, und die Niederschlagmenge wird nicht kontinuierlich im Zeitverlauf erhöht, wie wenn sie durch ein Enzym produziert wird. Wegen dieser Faktoren und wegen einer unspezifischen Aggregation haben diese Techniken eine begrenzte Empfindlichkeit und lassen Messung von Analytkonzentrationen unter dem ng/ml-Bereich im Allgemeinen nicht zu.

Analytische Verfahren, die eine Enzym-gesteuerte Bildung eines (gefärbten) Niederschlags beinhalten, sind an sich bekannt. Ein solches Verfahren ist beispielsweise auf dem Sektor der Immunocytochemie bekannt. Bei diesem bekannten Verfahren wird ein spezielles Protein in dem Gewebe bestimmt, indem nach Gefrieren des Gewebes oder mittels verschiedener Formen chemischer Fixierung zuerst dünne Gewebeschnitte hergestellt werden und danach Antikörper zugegeben werden, die spezifisch das Protein erkennen und sich an dieses binden, um die Anwesenheit und/oder Lokalisierung verschiedener Gewebeproteine in histologischen Untersuchungen zu zeigen. Überschüssige Antikörper werden entfernt, und danach wird ein zweiter Enzym-verbundener Antikörper, beispielsweise ein IgG-HRP-Konjugat, zugefügt. Nach Entfernen des überschüssigen Konjugats wird ein geeignetes Substrat, wie beispielsweise 3,3'-Diaminobenzidin (DAB), zugefügt. Wenn das spezifische Protein in dem Gewebe vorhanden ist, erfolgt eine lokalisierte Anfärbung infolge der Bildung eines von DAB abgeleiteten Niederschlags.

Die vorliegende Erfindung betrifft jedoch nicht die Lokalisierung und den Nachweis von Proteinen in Gewebe, sondern den Nachweis und die Messung von Analyt (Konzentrationen), der auf festen Oberflächen adsorbiert ist oder in Lösungen vorliegt. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem eine (vorzugsweise quantitative) Messung der Oberflächenmasse (im ng/cm2-Bereich), während bei dem bekannten immunocytochemischen Verfahren qualitative Ergebnisse erhalten werden, üblicherweise durch visuelle oder mikroskopische Untersuchung. In einigen Untersuchungen ist die Intensität der Verfärbung gemessen worden, indem optische Dichtemessungen verwendet wurden, die Technik ist jedoch nie mit einer Technik zur quantitativen Messung der Oberflächenmasse kombiniert werden, wie Ellipsometrie oder anderen. Dies wäre in der Durchführung auch sehr schwierig, weil die Dicke der Gewebeschnitte (Mikrometer) in einer anderen Größenordnung als die Dicke der Niederschlagschichten (Nanometer) liegt, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen wird.

Der Stand der Technik schlägt die Verwendung von Immunoassays auf Basis von optischer Interferenz auf speziell hergestellten, optisch aktiven Aufnahmeoberflächen vor, die mit dünnen Oxid-, Nitrid- oder Polymerfilmen beschichtet sind. Mittels dieser Vorbeschichtung führt die zusätzliche Adsorption einer Niederschlagschicht zu visuell nachweisbaren Farbveränderungen. Solche Anwendungen sind in der US-A-5 418 136 vorgestellt worden. Die EP-A-0 546 222 beschreibt einen Immunoassay auf Basis von optischer Interferenz auf einer Analyt bindenden Substratoberfläche, wobei ein enzymatischer Marker an den oberflächengebundenen Analyten gebunden wird und wobei ein Niederschlag als Ergebnis einer Reaktion zwischen dem Marker und einem Ausfällungsmittel auf der Oberfläche gebildet wird. Nach Waschen und Trocknen der Oberfläche wird der Niederschlag nachgewiesen, um die Anwesenheit des Analyten auf der Oberfläche zu zeigen. Neben visuellem Nachweis der Niederschlagsbildung wurde in diesen Verfahren des Standes der Technik auch Messung des Niederschlags durch Ellipsometrie verwendet. Die verschiedenen Spül- und/oder Trocknungsstufen, die in diesen Techniken erforderlich sind, schließen jedoch die hohe Empfindlichkeit aus, die durch in-situ-Messungen erhalten werden kann. Zum Nachweis sehr niedriger Analytkonzentrationen in biologischen Flüssigkeiten wie Plasma, Serum, Blut, Milch oder Urin übersteigt die unspezifisch adsorbierte Masse anderer Massensubstanzen, wie Albumin, oft die winzigen Mengen des adsorbierten. Niederschlags, und Spülen oder Trocknen führt zu Veränderungen in der Oberflächenmasse, die den spezifischen Effekt bei weitem übertreffen. In-situ-Messung bietet auch die Möglichkeit eines einstufigen ELISA, wobei der Analyt, das Konjugat und das chromogene Substrat zusammen ohne dazwischen liegende Wasch- oder Trocknungsstufen zugegeben werden. Dies wäre bei einem normalen ELISA unmöglich, weil die Farbproduktion durch den Überschuss des nicht-gebundenen Konjugats die Farbproduktion der geringen Menge an Analyt-gebundenem Konjugat an der Oberfläche bei weitem übertreffen würde. Im Unterschied dazu misst die vorliegende Technik nur den Niederschlag, der durch oberflächengebundenes Konjugat produziert wird. Zusätzlich zu einer höheren Empfindlichkeit ermöglicht die vorliegende Verwendung der in-situ-Messung auch einen schnelleren Assay, weil zeitraubende Spül- und/oder Trocknungsstufen mit anschließender separater Messung des Niederschlagsvermieden werden.

Ein weiterer fundamentaler Unterschied zu den in den beiden genannten Patenten beschriebenen Techniken liegt darin, dass erfindungsgemäß keine speziell hergestellten, optisch aktiven oder polymerbeschichteten Oberflächen erforderlich sind. Solche Oberflächen sind teuer, genau wie die optisch aktiven Scheibchen, die in Techniken auf Basis von Oberflächenplasmonresonanz (SPR) verwendet werden, während in dem erfindungsgemäßen Verfahren preisgünstige reflektierende (Einweg)-Oberflächen, wie Siliciumwafer oder mit Chrom bedampfte Glasscheibchen verwendet werden können.

Der Stand der Technik schlägt die Verwendung verstärkter Ellipsometrie als Mittel zur Erhöhung der Empfindlichkeit von Proteinadsorptionsmessungen vor [5]. Bei dem betreffenden Verfahren des Standes der Technik wurde die Masse des Markierungsantikörpers erhöht, indem er an Siliciumdioxidpartikel gekuppelt wurde. Antikörperbeschichtete Goldpartikel sind auch verwendet worden, vorwiegend in Kombination mit Elektronenmikroskopie in Lokalisierungsuntersuchungen [6]. Eine weitere Technik des Standes der Technik zur Verstärkung der Oberflächenmasse verwendet biotinylierte oder analytbeschichtete Liposomen [7, 8].

Diese Techniken unterscheiden sich fundamental von der vorliegenden Erfindung, weil sie keine kontinuierliche Akkumulation von Niederschlag pro Markierungsmolekül verwenden, sondern einfach schwerere Markierungen verwenden. Der Vorteil der besseren Nachweisbarkeit solcher schweren Markierungen muss wegen ihrer langsameren Diffusion in Richtung Oberfläche gegen ihre langsamere Adsorption abgewogen werden, und daher kommt die Verwendung dieser Verfahren für schnelle Assays nicht in Frage.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung liefert ein Immunoassayverfahren zum Bestimmen eines Analyten, der an einer Oberfläche adsorbiert ist oder in einer flüssigen Probe vorhanden ist, bei dem der Analyt an eine feste Phase gebunden wird, ein Marker an dem Analyten angebracht wird und an der festen Phase angebrachter Marker nachgewiesen wird, wobei eine Kombination aus Marker und Nachweismittel verwendet wird, die in der Lage ist, einen Niederschlag an einer festen Phase zu produzieren, die den Marker trägt, und das Binden des Analyten an die feste Phase nachgewiesen wird, ohne Manipulationen wie Waschen, Trocknen oder Spülen durchzuführen, indem die Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase infolge der Bildung des Niederschlags in situ bestimmt wird.

Die Erfindung liefert ferner einen Kit zur Durchführung eines Immunoassayverfahrens zum Bestimmen eines Analyten, der an einer Oberfläche adsorbiert oder in einer flüssigen Probe vorhanden ist, wobei der Kit mindestens ein spezifisch an die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angepasstes Mittel umfasst.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Figur zeigt die Ergebnisse einer Niederschlag-verstärkten ellipsometrischen Messung von Fettsäure bindendem Protein (a) und Annexin V (b) auf PVC-beschichteten Siliciumscheiben.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert gemäß einem ersten Aspekt ein Immunoassayverfahren zum Bestimmen eines Analyten, der auf einer Oberfläche adsorbiert ist oder in einer flüssigen Probe vorhanden ist, bei dem der Analyt an eine feste Phase gebunden wird, ein Marker an dem Analyten angebracht wird und an der festen Phase angebrachter Marker nachgewiesen wird, wobei eine Kombination aus Marker und Nachweismittel verwendet wird, die in der Lage ist, einen Niederschlag an einer festen Phase zu produzieren, die den Marker trägt, und das Binden des Analyten an die feste Phase in-situ nachgewiesen wird, indem die Oberflächenmasse der festen Phase infolge der Bildung des Niederschlags in situ bestimmt wird.

Der Begriff "in-situ Nachweis" soll wiederspiegeln, dass eine Änderung der Oberflächenmasse bestimmt wird, wenn der Niederschlag gebildet wird. Mit anderen Worten werden kein Waschen, Trocknen, Spülen oder andere Manipulationen durchgeführt, die zu Fehlern des gemessenen Ergebnisses führen können, weil sie eine weitere Änderung der Oberflächenmasse bewirken. Ein in-situ-Nachweis ermöglicht zudem die Messung der Niederschlagsbildung durch oberflächengebundenes Enzym, sogar in Anwesenheit von Substratumwandlung durch überschüssiges Enzym in der Lösungsphase (einstufiger ELISA).

Wie bereits zuvor im Hintergrundabschnitt angegeben wurde, betrifft die Erfindung eine große Vielfalt unterschiedlicher Immunoassayverfahren. Die meisten haben die Gemeinsamkeit, dass der Analyt, falls er in der Probe vorhanden ist, durch das Zwischenstadium eines Bindungspartners des Analyten an die feste Phase gebunden wird, üblicherweise eines spezifischen Bindungspartners, wie eines Antikörpers, der den Analyten spezifisch bindet. In einigen Ausführungsformen kann der Analyt jedoch direkt durch Adsorption oder durch unspezifische Verbindermittel an die feste Phase gebunden werden.

Der Bindungspartner kann, falls verwendet, vorab an die feste Phase angebracht worden sein. Alternativ wird er an die feste Phase gebunden, nachdem er mit dem Analyten, falls vorhanden, reagiert hat.

Die meisten Immunoassayausführungsformen haben ferner die Gemeinsamkeit, dass ein zweiter Bindungspartner des Analyten verwendet wird, um einen Marker an dem Analyten anzubringen. Der Bindungspartner, falls verwendet, ist wiederum vorzugsweise ein spezifischer Bindungskörper, wie ein Antikörper, der spezifisch an den Analyten bindet.

Dieser zweite Bindungspartner des Analyten kann den Marker tragen. Alternativ trägt den Marker jedoch eine Substanz, die an den zweiten Bindungspartner des Analyten binden kann. Wenn der zweite Bindungspartner des Analyten beispielsweise ein monoklonaler Antikörper der Ratte gegen den Analyten ist, kann der Marker direkt an diesem monoklonalen Antikörper angebracht werden, oder er kann alternativ an einen Anti-Maus-Ig-Antikörper angebracht werden (d. h. einen Antikörper, der spezifisch an Immunoglobuline der Ratte bindet).

Das Anbringen des Markers an dem Analyten kann entweder gleichzeitig mit dem Anbringen des Analyten an der festen Phase durchgeführt werden, oder vorher, oder danach. Es ist in den meisten Immunoassayverfahren bevorzugt, den Analyten zuerst zu immobilisieren und lediglich danach den Marker an den immobilisierten Analyten zu binden.

Das Verfahren ist vorzugsweise ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung der Konzentration des Analyten in der Probe. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das vorliegende Verfahren ein quantitatives Verfahren zur Bestimmung der Konzentration des Analyten an einer speziellen Oberfläche. Die fragliche Oberfläche kann eine biologische (Modell)-Membran, d. h. die Oberfläche einer zellulären Membran, oder eine künstliche Oberfläche sein, z. B. eine künstliche Oberfläche, die eine natürlich vorkommende, interessierende Oberfläche imitieren soll, die vorzugsweise auf einer einheitlich zugänglichen Oberfläche abgesetzt ist und quantitative Interpretation der Niederschlagsbildung ermöglicht. Die Erfindung ist jedoch nicht. auf quantitative Verfahren begrenzt und kann nützlich sein, um die Anwesenheit einer extrem niedrigen Konzentration des Analyten in der Probe entweder in der Masse der Probe oder an einem speziellen Ort, wie einer speziellen Oberfläche, qualitativ zu bestimmen.

Die Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase wird vorzugsweise durch Ellipsometrie bestimmt. Die Erfindung erstreckt sich jedoch auf andere Techniken zur Bestimmung der Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase, wie Oberflächenplasmonresonanz und totale innere Reflexionsfluoreszenz.

In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist der Marker ein Enzym, und das Nachweismittel umfasst ein Substrat des Enzyms. Der Immunoassay ist vorzugsweise ein ELISA-Verfahren. Vorzugsweise werden eine Meerrettich-Peroxidase als das Enzym und 3,3'-Diaminobenzidin als das Substrat verwendet. Die vorliegende Erfindung erstreckt sich jedoch auf andere Enzym-Substrat-Kombinationen, die einen Niederschlag produzieren können, wie alkalische Phosphatase als das Enzym und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und Nitroblau-tetrazolium als Substrat. Die Erfindung deckt ferner irgendwelche anderen Kombination von Marker und Nachweismittel ab, die einen Niederschlag auf einer festen Phase, die den Marker trägt, produzieren kann. Die Bildung eines Niederschlags kann beispielsweise das Ergebnis von Nukleierung durch nukleiertes Wachstum von Metall- oder Nichtmetallpartikeln oder das Ergebnis von Ketten- oder Polymerisationsreaktionen von z. B. ungesättigten Kohlenwasserstoffen sein, die durch Einwirkung von z. B. Ultraviolettstrahlung, usw. polymerisiert werden können. Der Marker könnte beispielsweise einen ungesättigten Kohlenwasserstoff umfassen, und das Nachweismittel könnte eine weitere Menge des gleichen oder eines anderen Kohlenwasserstoffs zusammen mit Mitteln zum Initiieren der Polymerisation (wie UV-Strahlung) umfassen. Alternativ könnte der Marker kolloidale Partikel eines Metalls, z. B. Gold, Silber, usw., oder eines Nichtmetalls, z. B. Selen, Tellur, Kohlenstoff, Siliciumdioxid, usw. umfassen, während das Nachweismittel eine Quelle einer weiteren Menge des gleichen oder eines anderen Metalls oder Nichtmetalls zusammen mit Mitteln (z. B. einem geeigneten Reduktionsmittel, wie einer Borhydridverbindung, die das Metall aus einer chemischen Verbindung freisetzen kann, die das Metall enthält) umfasst, um das Wachstum der als Marker verwendeten kolloidalen Partikel zu fördern.

Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass eine Siliciumscheibe als feste Phase verwendet wird. Die Erfindung erstreckt sich jedoch auf andere feste Phasen, die zur Verwendung in einer Technik zur Bestimmung der Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase geeignet sind, wie ein mit Chrom bedampftes Glasscheibchen. Prinzipiell kann die feste Phase aus irgendeiner einfachen und preisgünstigen reflektierenden Oberfläche bestehen und erfordert keine Vorbehandlung, wie Ablagerung spezieller, optisch aktiver Schichten, wie beispielsweise in der US-A-5 418 136 beschrieben ist.

Die Menge des Analyten, die auf feste Oberflächen adsorbiert wird, hängt im Allgemeinen von den Transportbedingungen. (Diffusion und Rühren) in dem System ab. Bei den üblichen laminaren Strömungssystemen impliziert dies, dass adsorbierte Mengen in Strömungsrichtung abnehmen können, weil die Fluidgrenzflächenschicht zunehmend an Analyt verarmt. Diese Ortsabhängigkeit der Menge an adsorbiertem Analyten kann die quantitative Beschreibung der Rate der Niederschlagsbildung stören, wenn beispielsweise die biologische Auswirkung einer winzigen Proteinmenge, die an einer Membran adsorbiert wird, gemessen wird [4] und danach die für diesen Effekt verantwortliche Proteinmenge die Messung wäre. Es ist gefunden worden, dass dieses Problem überwunden werden kann, indem das vorliegende Verfahren quantitativ an sogenannten einheitlich zugänglichen Oberflächen durchgeführt wird, das heißt, mit identischen Adsorptionsbedingungen über die gesamte Oberfläche. Unter Verwendung einer solchen Oberfläche kann die biologische Wirkung mit der adsorbierten Menge an Analyt verknüpft werden, ausgedrückt pro Flächeneinheit. Eine einheitlich zugängliche Oberfläche, eine rotierende Scheibe in Lösung, ist entwickelt worden und ermöglicht ellipsometrische Messung der Analytadsorption auf ihrer Oberfläche [9]. Die Kombination mit Ellipsometrie an einer rotierenden Scheibe ist daher eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Die Adsorption von Analyten aus Pufferlösungen auf und allgemeiner die Akkumulation fester Substanzen an planaren Oberflächen kann mittels Ellipsometrie nachgewiesen und quantifiziert werden. Dies ist eine optische Technik, die Reflexion von monochromatischem Licht gegen die adsorbierende Oberfläche verwendet, wobei die Technik eine quantitative Messung der Analytadsorption mit einer Nachweisgrenze von 1 bis 5 ng/cm2 ermöglicht.

Die reflektierende Oberfläche, in den hier gegebenen Beispielen ein vorbehandeltes Siliciumscheibchen, wird beispielsweise in einer Quarzküvette angeordnet, die mit z. B. 5 ml Pufferlösung gefüllt wird. Monochromatisches Licht aus einem He-Ne-Laser mit einer Wellenlänge von 632,8 nm durchläuft zuerst ein polarisierendes Prisma P und danach eine Viertelwellenplatte mit seiner schnellen Achse bei 45° zur Einfallebene. Das Licht tritt danach in die Küvette ein, wird gegen das Siliciumscheibchen reflektiert, tritt aus der Küvette aus, durchläuft ein zweites polarisierendes Prisma A und wird schließlich durch eine Photodiode nachgewiesen. Die Positionen von P und A werden mittels eines Computers eingestellt, um so die resultierende Lichtintensität, die die Photodiode erreicht, auf einem Minimum zu halten. Wenn eine feste Substanz auf der reflektierenden Oberfläche adsorbiert, werden die Positionen von P und A verändert, um die Intensität minimal, zu halten. Eine solche Adsorption führt somit zu einer Veränderung der Positionen von dem "Polarisator" P und dem "Analysator" A. In dem speziellen Fall von Siliciumscheibchen als reflektierender Oberfläche und organischen Substanzen, wie beispielsweise Proteinen, Lipiden, Zuckern oder organischen Niederschlägen, als adsorbierenden Analyten ist die Änderung der adsorbierten Oberflächenmasse direkt proportional zu der Veränderung in dem Polarisator. Die in den Beispielen verwendeten Scheibchen wurden aus Siliciumwafern geschnitten (Wacker Chemitronic; n-Typ, phosphordotiert). Die Messungen wurden bei Raumtemperatur (20°C ± 1°C) unter kontinuierlichem Rühren mit einem sich drehenden Rührer durchgeführt. Das Instrument und die Datenanalyse sind in früheren Veröffentlichungen unserer Gruppe [1, 2] beschrieben worden.

In einem typischen Experiment wird das vorbehandelte Scheibchen in die Ellipsometerküvette gegeben und eine Nullablesung (P0, A0) durchgeführt. Danach wird das zu bewertende Protein zu dem Puffer gegeben und eine geeignete Zeitdauer, beispielsweise 5 Minuten, auf das Scheibchen adsorbieren gelassen. Bei sehr niedrigen Proteinkonzentrationen, wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, bleibt die Proteinmenge, die in diesem Zeitraum adsorbiert, unter der Nachweisgrenze des Ellipsometers, so dass die Positionen P0 und A0 im Wesentlichen unverändert bleiben. Die Küvette wird danach mit frischem Puffer gewaschen, und der freie Oberflächenraum auf dem Scheibchen wird durch Adsorption von Albumin oder anderen Massenproteinen blockiert. Ein Antikörper-Meerrettichperoxidase- (HRP)-Konjugat wird danach zugegeben und eine geeignete Zeitdauer adsorbieren gelassen, beispielsweise zwei Minuten lang. Die Küvette wird wieder gewaschen, und eine Substratlösung, die 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) und H2O2 enthält, wird zugegeben. An Stellen, an denen sich Konjugatmoleküle an das adsorbierte Protein gebunden haben, bildet sich durch die enzymatische Wirkung von HRP DAB-Niederschlag. Wegen der fortlaufenden DAB-Umwandlung wird die Oberflächenmasse des Niederschlags schon bald viel größer als die ursprüngliche Proteinmasse und wird durch Ellipsometrie nachweisbar.

In einem anderen Aufbau, der die Bestimmung sehr niedriger Proteinkonzentrationen anstrebt, werden die Waschstufen zwischen der Zugabe von Analyt, Konjugat und Ausfällungssubstrat weggelassen und der Analyt, das Konjugat und das DAB-Substrat werden zusammen oder kurz nacheinander zugegeben. Auf diese Weise wird ein einstufiger ELISA erhalten.

Erfindungsgemäß wird die Messung der Rate der Niederschlagsbildung auf der festen Oberfläche vorzugsweise durch Ellipsometrie durchgeführt. Das. Assayprinzip der vorliegenden Erfindung kann jedoch gleichermaßen gut auf andere Techniken zur quantitativen Messung der Oberflächenmasse angewendet werden, wie anderen Formen von Reflektometrie als Ellipsometrie, Oberflächenplasmonresonanz (SPR) und totale innere Reflexionsfluoreszenz. Ellipsometrie ist eine spezielle Form von Reflektometrie, und es gibt einfachere Formen davon, beispielsweise Ausführungsformen ohne die Viertelwellenplatte. Diese Techniken haben als gemeinsames Merkmal, dass Lichtreflexion an der gleichen Seite der reflektierenden Oberfläche stattfindet wie die Analytadsorption. Dies trifft auf die SPR und die TIRF nicht zu, und die Lichtreflexion findet an der nichtadsorbierenden Seite des Scheibchens statt.

Bei der SPR ist eine sogenannte "dämpfende" Lichtwelle, die an der anderen Seite des Scheibchens austritt, empfindlich gegenüber dem Brechungsindex der adsorbierten Analytschicht. Bei einem bestimmten Einfallwinkel erfolgt eine optische Resonanz, und die adsorbierte Masse des Analyten kann aus diesen Daten berechnet werden. Die SPR hat ungefähr die gleiche Nachweisgrenze wie Ellipsometrie, die reflektierenden Scheibchen benötigen jedoch eine dünne Schicht aus einer Substanz mit einem hohen Brechungsindex auf der Analyt adsorbierenden Seite des Scheibchens, üblicherweise eine dünne Goldschicht. Weil diese Schicht enge Spezifikationen erfüllen muss, sind SPR-Scheibchen teuer. Im Unterschied dazu sind die in einem Ellipsometer verwendeten Siliciumscheibchen preisgünstig und können als Einwegmaterialien verwendet werden.

Bei der TIRF liegt die gedämpfte Welle bei einem Einfallwinkel, der zu Totalreflexion führt. Die Welle dringt ein kurzes Stück in die Lösung ein und regt Fluoreszenzsonden an, die an den Analyten angebracht sind. Die Intensität des Fluoreszenzsignals ist proportional zu der adsorbierten Menge des Analyten. Es sind keine teuren Scheibchen erforderlich, die Technik ist jedoch weniger empfindlich als die Ellipsometrie oder die SPR.

Neben anderen Techniken zur Messung der Oberflächenmasse können erfindungsgemäß auch andere Enzym-Substrat-Kombinationen verwendet werden, solange sie einen Niederschlag erzeugen. Statt des beispielhaften Systems aus Meerrettichperoxidase (HRP) und 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) könnten beispielsweise alkalische Phosphatase (AP) als Enzym und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) mit Nitroblautetrazolium (NBT) als Substrate verwendet werden. Irgendeine andere Enzym/Substrat-Kombination oder sogar Niederschlagsbildung, die nicht auf enzymatischer Umwandlung, sondern beispielsweise auf Nukleierung basiert, könnte ebenso verwendet werden.

Obwohl die hier gegebenen Beispiele die Bestimmung von Proteinkonzentrationen in Pufferlösungen illustrieren, gilt das Prinzip ebenso für irgendeinen anderen Lösungs- oder Suspensionstyp, insbesondere jene, die für medizinische Zwecke verwendet werden, wie Urin, Plasma oder Vollblut.

Zur Veranschaulichung der Erfindung betreffen die hier gegebenen Beispiele drei verschiedene Proteinassays, die sich in Bezug auf das zu bewertende Protein (Analyt) unterscheiden, sich jedoch auch in Bezug auf Oberflächenvorbereitung und Nachweisprinzip unterscheiden.

Beispiel 1 betrifft einen Assay von Annexin V. Annexin V ist ein intrazelluläres Protein mit einer noch unbekannten biologischen Funktion. Annexin V ist wegen der wohl definierten Parameter für seine Adsorption an Phospholipidmembranen als Modellprotein verwendet worden. Es ist ein Protein, das in Gegenwart von Calcium hohe Bindungsaffinität für Phospholipidmembranen hat, vorausgesetzt, dass diese Membranen Aminophospholipide wie Phosphatidylserin (PS) enthalten. Der Adsorptionsprozess ist transportbegrenzt, und die Rate der Annexin V Adsorption kann genau aus den Rührbedingungen und der Annexin V Konzentration in Lösung berechnet werden. Wie in Beispiel 1 gezeigt ist, wurde Annexin V direkt auf Siliciumscheibchen adsorbiert, die mit Phospholipiddoppelschichten vorbeschichtet worden waren, und wurde erfindungsgemäß mit einem zweistufigen Immunoverfahren nachgewiesen. Die Phospholipid-Doppelschichten sind ein Beispiel für einen spezifischen Bindungspartner, der kein Antikörper für den fraglichen Analyten ist. Dieses Beispiel zeigt, dass Binden von Annexin V an Membranen erfindungsgemäß in dem normalen physiologischen Konzentrationsbereich von Annexin V im Plasma von 1 bis 5 ng/ml untersucht werden kann.

In Beispiel 2 wurden Fettsäure-Bindungsprotein (FABP) (und auch Annexin V) auf Polyvinylchlorid(PVC)-beschichteten Siliciumscheibchen unter Verwendung des Sandwich-Prinzips zum Nachweis bestimmt. FABP ist ein Herzmarkerprotein mit einer normalen Plasmakonzentration von 1 bis 2 ng/ml, das momentan als Frühmarker für den akuten Herzinfarkt und als Marker für die erfolgreiche Reperfusionstherapie nach akutem Herzinfarkt verwendet wird. Die heutigen ELISA für dieses Protein benötigen etwa eine Stunde Versuchszeit, während diese Zeit mit der Technik der vorliegenden Erfindung auf wenige Minuten verkürzt werden könnte. Mit einem eigens dafür verwendeten Instrument würde dies rasche Messung am Bett ermöglichen.

Beispiel 3 veranschaulicht die Verwendung der Erfindung zur Bewertung von Interleukin 6 (IL6). IL6 ist ein wichtiger Mediator der entzündlichen Reaktion mit einer normalen Plasmakonzentration unter 10 pg/ml. Die Bestimmung solcher Konzentrationen mit konventionellen ELISA benötigt momentan mehrere Stunden, während sie, wie hier gezeigt wird, mit der neuen erfindungsgemäßen Technik innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden kann. Bei IL6 wurde der Abfänger-Antikörper nur 15 Minuten auf stark hydrophoben (silanisierten) Siliciumscheibchen adsorbiert, und das Biotin-Streptavidin-System wurde zum Nachweis verwendet.

Diese Beispiele zeigen, dass das Verfahren für einen umfassenden Bereich von Oberflächen und Nachweisprinzipien verwendet werden kann. Andere reflektierende Oberflächen als Siliciumscheibchen, beispielsweise mit Chrom bedampfte Glasscheibchen, können gleichermaßen gut verwendet werden und sind in der Tat von unserer Gruppe in der Vergangenheit verwendet worden [1, 2].

Unter Berücksichtigung dieser Umstände werden die folgenden Aspekte als Teil der Erfindung angesehen:

  • 1) Quantitative Messung der Konzentrationen spezieller Analyten, wie Proteine, Peptide, Zucker, usw., in Lösungen mittels in-situ-Ellipsometriemessung (der Geschwindigkeit) der Akkumulation des durch die kontinuierliche Wirkung von (Enzym)-Molekülen gebildeten Niederschlags, welche sich entweder direkt an den oberflächengebundenen Analyten binden oder an andere Moleküle gekoppelt werden, die sich an diese Analyten binden.
  • 2) Die Verwendung von Prinzip 1) zur Messung der Konzentrationen dieser Analyten in irgendeinem Typ von Lösung oder Suspension, wie destilliertem Wasser, Pufferlösungen, physiologischer Salzlösung, Urin, Plasma, Vollblut, usw.
  • 3) Die Verwendung von Prinzip 1) in Kombination mit anderen Techniken zur quantitativen Messung der Oberflächenmasse, wie anderen Formen von Reflektometrie als Ellipsometrie, Oberflächenplasmonresonanz, totale innere Reflexionsfluoreszenz, usw.
  • 4) Die Verwendung von Prinzip 1) in Kombination mit irgendeiner anderen Form von reflektierenden Oberflächen oder anderen Formen von Oberflächenherstellung, wie Vorbeschichten reflektierender Oberflächen mit Phospholipiden oder Polymeren.
  • 5) Die Verwendung von Prinzip 1) in Kombination mit irgendeiner Modifizierung des Nachweisprinzips, wie anderen Enzym/Substrat-Kombinationen oder Niederschlag bildenden Reaktionen, Sandwich-Techniken, einzelnen gegen mehrfachen Enzym-Molekül-Markierungen, direkter oder kompetitiver Bindung, usw.
  • 6) Die Verwendung von Prinzip 1) in einem Immunoassay mit gleichzeitiger Zugabe, oder Zugabe kurz nacheinander, von Analyt, Konjugat und Niederschlag bildendem Substrat ohne dazwischen erfolgende Spül- oder Waschstufen (einstufiger ELISA).
  • 7) Kombination von Prinzip 1) mit der Verwendung einheitlich zugänglicher Oberflächen, vorzugsweise einer rotierenden Scheibe, zur quantitativen Beschreibung der Rate der Niederschlagsbildung und zum Ausdruck der oberflächengebundenen (biologischen) Aktivität in der Menge des gebundenen Wirkstoffs pro Oberflächeneinheit.

Beispiel 1. Bestimmung der Annexin V Konzentrationen

Siliciumscheibchen wurden durch Zugabe von 20 &mgr;M Phospholipidvesikeln, erhalten durch Ultraschallbehandlung einer 20 DOPS/80 % DOPC-Mischung, wie beschrieben [3,4], mit Phospholipiddoppelschichten bedeckt. Nach Bildung einer stabilen Phospholipid-Doppelschicht auf der Oberfläche wurde überschüssiges Phospholipid durch Waschen der Küvette mit Puffer entfernt, und Human-Annexin V wurde zugefügt. Nach 200 s langer Adsorption wurde die Küvette gewaschen, und 120 s lang wurde polyklonales Anti-Annexin V des Kaninchens zugefügt. Die Küvette wurde wiederum gewaschen und Anti-Kaninchen-IgG des Schweins, konjugiert an HRP, wurde 120 s lang zugefügt. Die Küvette wurde wiederum gewaschen, 0,278 mM DAB und 0,834 mM H2O2 zugegeben und die Bildung von Niederschlag an der Oberfläche durch Ellipsometrie gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1. Bestimmung der Annexin V Konzentrationen

Die Werte geben Polarisatoränderungen in Grad (± Standardabweichung) von vier Experimenten an.

Wenn die Nachweisgrenze als Polarisatoränderung definiert ist, die die Polarisatoränderung plus drei Mal die Standardabweichung der Blindprobe übersteigt, folgt aus Tabelle 1, dass die niedrigste Oberflächenkonzentration von 0,01 ng/cm2, die etwa 100 Mal niedriger als durch direkte Elipsometrie nachweisbar ist,q bereits innerhalb von 300 s Inkubationszeit gemessen werden kann.

Beispiel 2. Bestimmung der FABP-Konzentrationen

Siliciumscheibchen wurden durch ein automatisiertes Tauchverfahren der Scheibchen in eine Lösung von PVC in Cyclohexanon mit homogenen PVC-Schichten mit 20 bis 25 nm Dicke beschichtet. Die Scheibchen wurden durch über Nacht erfolgende Adsorption mit monoklonalen Antikörpern gegen FABP (und Annexin V) beschichtet, und freier Oberflächenraum wurde durch entweder Albumin oder Magermilchpulver blockiert. Die Scheibchen wurden dann 10 Minuten lang verschiedenen Konzentrationen von FABP (oder Annexin V) ausgesetzt, und die adsorbierten Proteine wurden direkt mit monoklonalen Antikörper/HRP-Konjugaten, oder bei Annexin V mit dem beschriebenen Zweistufenverfahren nachgewiesen. Die Niederschlagsbildung nach Zugabe von DAB, gemessen mittels Ellipsometrie, ist in der Figur gezeigt. Innerhalb von 120 s DAB-Umwandlungszeit konnte eine Konzentration von 0,5 ng/ml gemessen werden.

Beispiel 3. Bestimmung der IL6-Konzentrationen

Ein monoklonaler Abfänger-Antikörper gegen IL6 wurde nur 15 Minuten lang auf stark hydrophoben (silanisierten) Siliciumscheibchen adsorbiert, und verschiedene Konzentrationen von IL6 wurden nur 10 Minuten lang zugegeben. Es folgten zwei kurze Inkubationsstufen mit biotinylierten Anti-IL6-Antikörpern und Streptavidin-markierter (Multi)-HRP. Die Ergebnisse der ellipsometrischen Messung der Niederschlagsbildung nach Zugabe von DAB sind in Tabelle 2 gezeigt. Eine Konzentration von 10 pg/ml IL6 konnte in weniger als 300 s DAB-Umwandlungszeit und einer Gesamtassayzeit von weniger als 30 Minuten ermittelt werden.

Tabelle 2. Bestimmung der IL6-Konzentrationen

Die Werte zeigen Polarisatoränderungen in Grad (± Standardabweichung).

Referenzen
  • 1. P. A. Cuypers, J. W. Corsel, M. P. Janssen, J. M. M. Kop, W. Th. Hermens, H. C. Hemker. The adsorption of prothrombin to phosphatidylserine multilayers, quantitated by ellipsometry. J Biol Chem 1983; 258: 2426-31.
  • 2. J. W. Corsel, G. M. Willems, J. M. M. Kop, P. A. Cuypers, W. Th. Hermens. The role of intrinsic binding rate and transport rate in the adsorption of prothrombin, albumin and fibrinogen. to phospholipid bilayers. J. Colloid Interface Sci 1986; 111:544-54.
  • 3. P. L. A. Giesen, G. M. Willems, H. C. Hemker, W. Th. Hermens: Membrane-mediated assembly of the prothrombinase complex. J Biol Chem 1991; 266: 18720-5.
  • 4. P. L. A. Giesen, H. C. Hemker, W. Th. Hermens: Production of thrombin as a probe for mixing of phospholipids in membranes on solid supports. Biochim Biophys Acta 1995; 1237: 43-8.
  • 5. C. F. Mandenius, K. Mosbach. Detection of biospecific interactions using amplified ellipsometry. Anal Biochem 1988; 170: 68-72.
  • 6. H. Nygren. Experimental demonstration of lateral cohesion in a layer of adsorbed protein and in layers of goldantibody complexes bound to surface-immobilized, antigen. J Immunol Meth 1988; 114: 107-114.
  • 7. H. A. H. Rongen, H. M. van der Horst, G. W. K. Hugenholtz, A. Bult, W. P. van Bennekom. Development of a liposome immunosorbent assay for human interferon-gamma. Anal Chim Acta 1994; 287: 191-199.
  • 8. S. G. Reeves, S. T. A. Siebert, M. A. Roberts, R. A. Durst. Liposome immunosensing devices for environmental Contaminant screening. Trends in Anal Chem 1995; 14: 351-355.
  • 9. G. N. Willems, P. L. A. Giesen, W. Th. Hermens: Adsorption and conversion of prothrombin on a rotating disc. Blood 1993; 82: 497-504.

Anspruch[de]
  1. Immunoassayverfahren zum Bestimmen eines Analyten, der an einer Oberfläche adsorbiert ist oder in einer flüssigen Probe vorhanden ist, bei dem der Analyt an eine feste Phase gebunden wird, ein Marker an dem Analyten angebracht wird und an der festen Phase angebrachte Marker nachgewiesen wird, wobei eine Kombination aus Marker und Nachweismittel verwendet wird, die in der Lage ist, einen Niederschlag an einer festen Phase zu produzieren, die den Marker trägt, und das Binden des Analyten an die feste Phase nachgewiesen wird, ohne Manipulationen wie Waschen, Trocknen oder Spülen durchzuführen, indem die Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase infolge der Bildung des Niederschlags in situ bestimmt wird.
  2. Immunoassayverfahren nach Anspruch 1, das ein quantitatives Verfahren zum Bestimmen der Konzentration von Analyt in einer Probe ist.
  3. Immunoassayverfahren nach Anspruch 1 oder 2, das ein quantitatives Verfahren zur Messung von Oberflächenkonzentrationen von Analyt ist, der an festen Oberflächen oder biologischen (Modell)-Membranen adsorbiert oder gebunden ist.
  4. Immunoassayverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase durch Ellipsometrie bestimmt wird.
  5. Immunoassayverfahren nach Anspruch 4, bei dem die Ellipsometrie an einer einheitlich zugänglichen Oberfläche durchgeführt wird, vorzugsweise einer rotierenden Scheibe.
  6. Immunoassayverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase durch Oberflächenplasmonresonanz bestimmt wird.
  7. Immunoassayverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Änderung der Oberflächenmasse der festen Phase durch Totalinternreflexionsfluoreszenz bestimmt wird.
  8. Immunoassayverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem der Marker ein Enzym ist und das Nachweismittel ein Substrat von diesem Enzyms umfasst.
  9. Immunoassayverfahren nach Anspruch 8, bei dem eine Meerrettich-Peroxidase als Enzym und 3,3-Diaminobenzidin als Substrat verwendet wird.
  10. Immunoassayverfahren nach Anspruch 8, bei dem eine alkalische Phosphatase als Enzym verwendet wird und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und Nitroblau-tetrazolium als Substrat verwendet werden.
  11. Immunoassayverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das als einstufiger ELISA durchgeführt wird.
  12. Immunoassayverfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem eine Siliciumscheibe als feste Phase verwendet wird.
  13. Immunoassayverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem ein mit Chrom bedampftes Glasscheibe als feste Phase verwendet wird.
Es folgt ein Blatt Zeichnungen






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