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Dokumentenidentifikation DE69828654T2 29.12.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0001300463
Titel Isolierung und Verwendung von Nukleinsäuremolekülen, welche für Mitglieder der SSX-Familie kodieren
Anmelder Ludwig Institute for Cancer Research, New York, N.Y., US;
Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, N.Y., US;
Cornell Research Foundation, Ithaca, N.Y., US
Erfinder Gure, Ali O., New York, US;
Tureci, Ozlem, 66421 Homburg, DE;
Sahin, Ugur, 66421 Homburg, DE;
Tsang, Solam, New York, US;
Scanlan, Matthew J., New York, US;
Knuth, Alexander, 60488 Frankfurt am Main, DE;
Pfreundschuh, Michael, 66421 Homburg, DE;
Old, Lloyd J., New York, US;
Chen, Yao-Tseng, New York, US
Vertreter LEINWEBER & ZIMMERMANN, 80331 München
DE-Aktenzeichen 69828654
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 25.02.1998
EP-Aktenzeichen 020247698
EP-Offenlegungsdatum 09.04.2003
EP date of grant 12.01.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.12.2005
IPC-Hauptklasse C12N 5/10
IPC-Nebenklasse C12N 15/12   C12P 21/02   C12Q 1/68   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft das Isolieren und Klonieren von Genen, die zur hierin erläuterten "SSX"-Familie gehören, und deren Verwendung.

HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK

Es ist weithin bekannt, dass zahlreiche pathologische Leiden, wie beispielsweise Infektionen, Krebs, Autoimmunkrankheiten usw., durch die unzulängliche Expression bestimmter Moleküle gekennzeichnet sind. Diese Moleküle dienen somit als "Marker" für einen bestimmten pathologischen oder abnormalen Zustand. Abgesehen von ihrer Verwendung als Diagnose-"Targets", d.h. als Materialien, die es zu identifizieren gilt, um diese abnormalen Zustände zu diagnostizieren, dienen die Moleküle als Reagenzien, die verwendet werden können, um diagnostische und/oder therapeutische Mittel herzustellen. Ein keineswegs einschränkendes Beispiel hierfür ist die Verwendung von Krebsmarkern zur Herstellung von Antikörpern, die für einen bestimmten Marker spezifisch sind. Wiederum ein anderes, nicht einschränkendes Beispiel ist die Verwendung eines Peptids, das mit einem MHC-Molekül einen Komplex bildet, um zytolytische T-Zellen gegen abnormale Zellen zu bilden.

Die Herstellüng solcher Materialien geht natürlich von einer bestehenden Quelle der zur Erzeugung dieser Materialien verwendeten Reagenzien aus. Die Reinigung aus Zellen ist ein arbeitsaufwendiges Verfahren, dessen Erfolg zur Herstellung solcher Materialien nicht sichergestellt ist. Ein anderes bevorzugtes Verfahren ist das Isolieren von Nucleinsäuremolekülen, die für einen bestimmten Marker kodieren, gefolgt von der Verwendung des isolierten Codiermoleküls, um das erwünschte Molekül zu exprimieren.

Bis heute wurden zwei Verfahrensweisen zur Detektion solcher Antigene beispielsweise in menschlichen Tumoren eingesetzt. Diese werden als der genetische Ansatz und der biochemische Ansatz bezeichnet. Der genetische Ansatz wird beispielsweise von dePlaen et al., Proc. Natl. Sci. USA 85, 2275 (1988), beschrieben. In diesem Ansatz werden mehrere hundert Pools von Plasmiden einer cDNA-Bibliothek, die aus einem Tumor erhalten wurde, in Empfängerzellen, wie COS-Zellen, oder in Antigennegative Varianten von Tumorzelllinien transfiziert. Transfektionsprodukte werden über deren Fähigkeit, Reaktionen durch zytolytische Anti-Tumor-T-Zellklone hervorzurufen, auf die Expression von Tumorantigenen gescreent. Der biochemische Ansatz, erläutert von beispielsweise Mandelboim et al., Nature 369, 69 (1994), basiert auf saurer Elution von Peptiden, die an MHC-Klasse-I-Moleküle von Tumorzellen gebunden wurden, gefolgt von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). Antigene Peptide werden identifiziert, nachdem sie sich an leere MHC-Klasse-I-Moleküle von mutierten Zelllinien gebunden haben, die bei der Verarbeitung von Antigenen Defekte aufweisen, und induzieren spezifische Reaktionen mit zytotoxischen T-Lymphozyten. Diese Reaktionen umfassen die Induktion von CTL-Vermehrung, TNF-Freisetzung und Lyse von Targetzellen, messbar in einem MTT-Test oder einem 51Cr-Freisetzungstest.

Diese zwei Ansätze zur molekularen Definition von Antigenen weisen die folgenden Nachteile auf: erstens sind sie äußerst mühsam, zeitaufwendig und teuer; zweitens hängen sie von der Erstellung von zytotoxischen T-Zelllinien (CTL) mit vorbestimmter Spezifität ab; und drittens konnte ihre Relevanz in vivo für den Verlauf der Pathologie einer betreffenden Erkrankung noch nicht nachgewiesen werden, da die jeweiligen CTL nicht nur vom Patienten mit der betreffenden Erkrankung gewonnen werden können, sondern, je nach deren T-Zell-Bestand, auch von gesunden Personen.

Die innewohnenden Schwierigkeiten der zwei bekannten Ansätze zur Identifikation und molekularen Definition von Antigenen zeigt sich am besten in der Tatsache, dass beide Verfahren bisher bei der Definition von nur sehr wenigen neuen Antigenen in menschlichen Tumoren Erfolg zeigten. Siehe beispielsweise van der Bruggen et al., Science 254, 1643–1647 (1991); Brichard et al., J. Exp. Med. 178, 489–495 (1993); Coulie et al., J. Exp. Med. 180, 35–42 (1994); Kawakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3515–3519 (1994).

Darüber hinaus hängen die beschriebenen Verfahren von der Verfügbarkeit erstellter permanenter Zelllinien der in Betracht kommenden Krebsart ab. Es ist sehr schwierig, von bestimmten Krebsarten Zelllinien zu erstellen, wie beispielsweise von Oettgen et al., Immunol. Allerg. Clin. North. Am 10, 607–637 (1990), gezeigt wird. Auch ist bekannt, dass manche Epithelzelltyp-Krebsarten auf CTL in vitro nur schlecht ansprechen, was herkömmliche Analyseverfahren ausschließt. Durch diese Probleme wurde auf dem Gebiet der Erfindung ein Impuls gesetzt, zusätzliche Verfahren zur Identifikation von Krebs-assoziierten Antigenen zu entwickeln.

Ein zentrales Verfahren wird von Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810–11913 (1995), beschrieben. Siehe auch die US-Patentanmeldungen mit den Serien-Nr. 08/580.980 und 08/479.328, eingereicht am 7. Juni 1995 bzw. am 3. Jänner 1996. Kurz zusammengefasst umfasst das Verfahren die Expression von cDNA-Bibliotheken in einem prokaryotischen Wirt. (Die Bibliotheken stammen aus einer Tumorprobe.) Die exprimierten Bibliotheken werden anschließend mit absorbierenden und verdünnenden Seren immunologisch gescreent, um jene Antigene nachzuweisen, die hohe humorale Titerreaktionen hervorrufen. Diese Methodologie ist bekannt als das SEREX-Verfahren ("Serologische Identifikation von Antigenen durch Rekombinantes Expressionsklonieren"). Das Verfahren wurde eingesetzt, um Expression von zuvor identifizierten Tumor-assoziierten Antigenen zu bestätigen sowie um neue Antigene nachzuweisen. Siehe auf die zuvor verwiesenen Patentanmeldungen und Sahin et al., s.o., sowie Crew et al., EMBO J. 144, 2333–2340 (1995).

Das SEREX-Verfahren wurde an Speiseröhrenkrebsproben angewandt, und ein Speiseröhrenkrebs-assoziiertes Antigen konnte bereits identifiziert werden und das dafür kodierende Nucleinsäuremolekül isoliert und kloniert werden, wie in der US-Patentanmeldung mit der Serien-Nr. 08/725.182, eingereicht am 3. Oktober 1996, durch Verweis hierin aufgenommen, beschrieben wird.

Die Beziehung zwischen manchen der Tumor-assoziierten Gene und einer Triade von Genen, die als die SSX-Gene bekannt sind, wird derzeit untersucht. Siehe Sahin et al., s.o., Tureci et al., Cancer Res. 56, 4766–4722 (1996). Eines dieser SSX-Gene, als SSX2 bezeichnet, wurde zuerst als eines der zwei Gene identifiziert, die in ein chromosomales Translokationsereignis (t(X; 18)(p11.2; q 11.2) eingebunden sind, das in 70 % von Synovialsarkomen vorhanden ist. Siehe Clark et al., Nature Genetics 7, 502–508 (1994); Crew et al., EMBO J. 14, 2333–2340 (1995). Später wurde für dieses Gen herausgefunden, dass es in zahlreichen Tumorzellen exprimiert wird, und daher wird es nun als ein Tumor-assoziiertes Antigen betrachtet, das von Tureci et al., s.o., als HOM-MEL-40 bezeichnet wird. Seine Expression wurde bis heute nur in Krebszellen und normalem Testikel beobachtet. Somit gleicht es anderen Mitgliedern der "CT"-Familie von Tumorantigenen, da diese nur in Krebs- und Testikel-Zellen exprimiert werden. Crew et al. isolierten und klonierten auch das SSX1-Gen, das 89 % Nucleotidsequenzhomologie mit SSX2 aufweist. Siehe Crew et al., s.o. Zusätzliche Studien, die sich auf die Identifizierung von SSX-Genen konzentrierten, führten zur Identifizierung von SSX3, das von DeLeeuw et al., Cytogenet. Genet. 73, 179–183 (1996), beschrieben wird. Die Tatsache, dass die SSX-Darstellung anderen CT-Antigenen gleicht, ließ die Erfinder darauf schließen, dass andere SSX-Gene isoliert werden könnten.

Eine Anwendung einer Modifikation des SEREX-Verfahrens, das zuvor beschrieben wurde, kam gemeinsam mit anderen Verfahren zum Einsatz, um ein zusätzliches SSX-Gen, das nachstehend als SSX5 bezeichnet wird, sowie eine unterschiedliche Spleißvariante des SSX4-Gens zu klonieren. Während das SEREX-Verfahren autologes Serum verwendet, bringen die nachstehend beschriebenen Verfahren allogenes Serum zum Einsatz. Dies sowie andere Eigenschaften der Erfindung werden in der nachstehenden Offenbarung erläutert.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN BEISPIEL 1

Eine menschliche Hoden-cDNA-Expressionsbibliothek wurde erhalten und mit Serum von einem Melanompatienten, bezeichnet als MZ2, gescreent. Siehe z.B. die Stamm-Anmeldung US-Patentanmeldung der Seriennummer 08/479.328, durch Verweis aufgenommen; siehe auch US-Patentanmeldung der Seriennummer 08/725.182, auch durch Verweis aufgenommen; Sahin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11810–11813 (1995). Dieses Serum wurde unter Verwendung des in diesen Verweisen beschriebenen Verfahrens behandelt. Kurz beschrieben wurde das Serum 1:10 verdünnt und anschließend mit transfiziertem E.-coli-Lysat vorabsorbiert. Nach diesem Schritt der Vorabsorption wurde das absorbierte Serum 1:10 verdünnt, um eine Endverdünnung von 1:100 zu erlangen. Nach der letzten Verdünnung wurden die Proben über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Nitrocellulose-Membranen Phagen-Plaques enthielten, die unter Verwendung des zuvor erwähnten Verfahrens gebildet wurden. Die Nitrocellulose-Membranen wurden gewaschen, mit alkalische-Phosphatase-konjugierten Ziege-Anti-Mensch-Fc&ggr;-Sekundarantikörpern inkubiert, und die Reaktion wurde mit den Substraten 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat und Nitroblautetrazolium beobachtet. In einem zweiten Screen wurden jegliche Phagemiden, die für das menschliche Immunglobulin kodierten, eliminiert.

Insgesamt wurden 3,6 × 105 pfu gescreent, was in acht positiven Klonen resultierte. Herkömmliche Sequenzierungsreaktionen wurden durchgeführt, und die Sequenzen wurden mit Sequenzbanken bekannter Sequenzen verglichen.

Von den acht Klonen wurde für zwei festgestellt, dass sie für bekannte Moleküle, die in Verbindung mit Autoimmunerkrankungen stehen, kodieren, d.h. für Golgin – 95 (Fritzler et al., J. Exp. Med. 178, 49–62 (1993)) und für den menschlichen Stromauf-Bindungsfaktor (Chan et al., J. Exp. Med. 174, 1239–1244 (1991)). Für drei andere Klone wurde erkannt, dass sie für Proteine kodieren, die in menschlichem Gewebe häufig exprimiert werden, d.h. für den ribosomalen Rezeptor, für die globuläre Domäne von Collagen Typ VI und für Rapamycin-Bindungsprotein. Von den verbleibenden drei Sequenzen wurde eine als nicht-homolog zu sämtlichen bekannten Sequenzen erkannt, wurde jedoch überall in menschlichem Gewebe exprimiert (dies wurde über RT-PCR-Analyse erkannt, wobei hierin jedoch keine Details bereitgestellt werden). Die übrigen zwei wurden als identisch mit dem Volllängen-HOM-MEL-40 erkannt, das in 08/479.328 beschrieben wird, wobei der achte Klon als beinahe identisch mit "SSX3", das von DeLeeuw et al., Cytogenet. Cell Genet. 73, 179–183 (1996), beschrieben wurde, erkannt wurde, der sich davon nur durch zwei Basenpaar-Unterschiede in der Codierregion unterscheidet. Diese Unterschiede sind eventuell ein Artefakt in der Natur; der Klon umfasste jedoch auch eine 3'-untranslatierte 43-Basenpaar-Region.

BEISPIEL 2

Um Southern-Blotting-Versuche durchzuführen, die nachstehend beschrieben werden, wurden die SSX-Gene unter Verwendung von RT-PCR amplifiziert.

Hierzu wurden zwei Primer unter Verwendung der veröffentlichten SSX2-Sequenz gebildet, d.h. unter Verwendung von

MEL-40A:

5'-CACACAGGAT CCATGAACGG AGA (Seq.-ID Nr. 3),

und von

MEL-40B:

5'-CACACAAAGC TTTGAGGGGA GTTACTCGTC ATC (Seq.-ID Nr. 4).

Siehe Crew et al., EMBO J. 14, 2333–2340 (1995). Die Amplifikation wurde unter Verwendung von 0,25 U Taq-Polymerase in einem 25-&mgr;l-Reaktionsvolumen unter Verwendung einer Annealing-Temperatur von 60 °C durchgeführt. Insgesamt wurden 35 Zyklen durchgeführt.

BEISPIEL 3

Das zuvor beschriebene RT-PCR-Verfahren wurde an Hoden-Gesamt-RNA durchgeführt, und das Amplifikationsprodukt wurde in Southern-Blotting-Versuchen verwendet.

Genomische DNA wurde aus nicht-neoplastischen Gewebeproben extrahiert, anschließend unter Verwendung von BamHI, Eco RI oder HindIII in getrennten Versuchen Restriktionsenzymverdau unterzogen und dann auf einem 0,7%igen Agarosegel getrennt, woraufhin Blotten auf Nitrocellulosefilter folgte. Die zuvor beschriebenen Amplifikationsprodukte wurden mit 32P unter Verwendung bekannter Verfahren markiert, und die markierten Materialien wurden dann unter hochstringenten Bedingungen (65 °C, wässriger Puffer) als Sonden verwendet, wonach Waschschritte unter hochstringenten Bedingungen erfolgten, die mit einem letzten Waschschritt bei 0,2xSSC, 0,2 % SDS, 65 °C abgeschlossen wurden.

Das Southern-Blotting zeigte in jedem Fall (d.h. bei jedem der BamHI-, EcoRI- und HindIII-Verdaue) mehr als 10 Banden, was stark darauf schließen lässt, dass es eine Familie von SSX-Genen gibt, die mehr als die drei davor identifizierten Gene enthielt. In Anbetracht dieser Beobachtung wurde ein Ansatz entwickelt, der PCR-Klonieren und Restriktionskarten-Analyse kombinierte, um andere SSX-Gene zu identifizieren.

BEISPIEL 4

Bei einem Vergleich der Sequenzen von SSX1, 2 und 3 wurde herausgefunden, dass sie hoch konservierte 5'- und 3'-Regionen gemeinsam hatten, was erklärte, warum die Oligonucleotide der Seq.-ID Nr. 3 und 4 in der Lage waren, alle drei Sequenzen unter den genannten Bedingungen zu amplifizieren, und darauf schließen ließ, dass diese Homologie allen Genen der Familie von SSX-Genen unabhängig von ihrer Größe gemeinsam war. So würden die Oligonucleotide der Seq.-ID Nr. 3 und 4 ausreichend sein, um die anderen Mitglieder der SSX-Gen-Familie zu amplifizieren.

Eine Analyse der Sequenzen von SSX1, 2 und 3 zeigte, dass SSX1 und 2 eine BgIII-Stelle enthielten, die SSX3 nicht aufwies. Demähnlich enthielt SSX3 eine EcoRV-Stelle, die die anderen beiden Gene nicht mit ihm gemeinsam hatten.

In Anbetracht dieser Information wurde Hoden-cDNA unter Verwendung der Seq.-ID Nr. 3 und 4 wie zuvor beschrieben amplifiziert und wurde dann BgIII-Verdau unterzogen. Jegliche BgIII-resistente Sequenz wurde anschließend kloniert, sequenziert und mit den bekannten Sequenzen verglichen.

Dies führte zur Identifizierung einer davor nicht identifizierten Sequenz, die nachstehend als SSXS bezeichnet und hierin als Seq.-ID Nr. 2 dargestellt wird. Mittels einer Durchsuchung der GenBank-Datenbank wurden zwei Klone gefunden, die durch die Zugriffsnummern N24445 und W00507 gekennzeichnet waren, die beide aus von einer Sequenzmarkierung abgeleiteten cDNA-Segmenten bestehen. Der durch N24445 gekennzeichnete Klon enthielt die 3'-untranslatierte Region von SSX4 und einen Teil seiner Codiersequenz, während der durch W00507 gekennzeichnete Klon ein kürzeres Fragment der 3'-untranslatierten Region von SSX4 und einen längeren Teil der Codiersequenz enthielt. Insbesondere besteht N24445 von Base 344 von SSX4 (Seq.-ID Nr. 1) bis zum 3-Ende plus 319 Basen 3' vom Stoppcodon. Die W00507-Sequenz besteht aus einer 99-Basenpaar-Sequenz, die keine Homologie zu den SSX-Genen aufweist, gefolgt von einer Region, die mit Nucleotiden 280 bis zum Ende von Seq.-ID Nr. 1 identisch ist, bis 67 Basen 3' vom Stoppcodon aus Seq.-ID Nr. 1.

Zwei Formen von SSX4 (Seq.-ID Nr. 1) wurden identifiziert. Einer dieser Formen fehlten die Nucleotide 331 bis 466, war abgesehen davon jedoch mit SSX4, dargestellt durch Seq.-ID Nr. 1, identisch. Wie nachstehend beschrieben ist die kürzere Form eine alternativ gespleißte Variante.

In der nachstehenden Tabelle 1 werden die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der 5 bekannten Mitglieder der SSX-Familie verglichen. Die Tabelle ist waagrecht in Bezug auf Nucleotidhomologie und senkrecht in Bezug auf Aminosäurehomologie zu lesen.

TABELLE 1 – NUCLEOTID- UND AMINOSÄUREHOMOLOGIE UNTER SSX-FAMILIENMITGLIEDERN

Demnach weisen SSX1 und SSX4 89,4 % Homologie auf Nucleotidebene und 79,3 % Homologie auf Aminosäureebene auf.

Wird die trunkierte Form von SSX4 analysiert, so weist sie eine Aminosäuresequenz auf, die sich aufgrund veränderten Spleißens und Verschiebens eines offenen Stromab-Leserasters von den anderen völlig unterscheidet. Das mutmaßliche Protein ist 153 Aminosäuren lang, und die 42 Carboxy-terminalen Aminosäuren weisen keine Homologie zu den anderen SSX-Proteinen auf.

BEISPIEL 5

Die genomische Organisation der SSX2-Gene wurde dann studiert. Hierzu wurde eine genomische menschliche Plazenta-Bibliothek (in Lambda-Phagen) unter Verwendung derselben Arbeitsvorschriften und Sonden, wie zuvor in der Erläuterung der Southern-Blotting-Studie beschrieben, gescreent. Alle positiven primären Klone wurden durch zwei zusätzliche Klonierungszyklen gereinigt.

Mehrere positive primäre Klone wurden isoliert, wovon einer teilweise sequenziert und als der genomische Klon von SSX2 identifiziert wurde. Eine Reihe an Experimenten zur Durchführung von herkömmlichem Subklonieren und Sequenzieren folgte daraufhin, um die Exon-Intron-Grenzen zu bestimmen.

Die Analyse zeigte, dass das SSX2-Gen sechs Exons enthält und sich über zumindest 8 Kilobasen erstreckt. Für alle definierten Abgrenzungen wurde erkannt, dass sie die Consensus-Sequenz von Exon/Intron-Junctions, d.h. GT/AG, berücksichtigten.

Für die alternative Spleißvariante von SSX4, die zuvor erläutert wurde, wurde erkannt, dass ihr das fünfte Exon in der Codierregion fehlte. Dies wurde durch einen Vergleich mit dem SSX2-Genomklon und Korrelationen, die daraus erkannt wurden, bestätigt.

BEISPIEL 6

Die Expression einzelner SSX-Gene in normalem Gewebe und Tumorgewebe wurde anschließend untersucht. Dies erforderte die Konstruktion spezifischer Primer, basierend auf den bekannten Sequenzen, und diese entsprechen den Seq.-ID Nr. 5-14:

TABELLE 2 – GENSPEZIFISCHE PCR-PRIMERSEQUENZEN FÜR DIE EINZELNEN SSX-GENE

Die Spezifität der Klone wurde durch Amplifizieren der davor identifizierten cDNA für SSX1 bis SSXS bestätigt. Taq-Polymerase wurde bei 60 °C für SSX1 und 4 und bei 65 °C für SSX2, 3 und 5 verwendet. Jedes Set an Primer-Paaren wurde als spezifisch erkannt, mit Ausnahme der SSX2-Primer, für die erkannt wurde, dass sie kleinste Mengen (weniger als 1/20 von SSX2) von SSX3-Plasmid-DNA amplifzieren.

Nachdem die Spezifität bestätigt worden war, wurden die Primer verwendet, um Hoden-mRNA unter Verwendung der zuvor beschriebenen RT-PCR-Arbeitsvorschriften zu analysieren.

Die erwarteten PCR-Produkte wurden in allen 5 Fällen gefunden, und Amplifikation mit dem SSX4-Paar führte zu zwei Amplifikationsprodukten, was mit alternativen Spleißvarianten übereinstimmt.

Die Expression von SSX-Genen in kultivierten Melanocyten wurde anschließend untersucht. RT-PCR wurde unter Verwendung der zuvor beschriebenen Arbeitsvorschriften durchgeführt. Kein PCR-Produkt wurde gefunden. Reamplifikation führte zu einer geringen Menge an SSX4-Produkt, das beide unterschiedlichen Formen umfasste, was darauf hinweist, dass SSX4-Expression in kultivierten Melanocyten unbeständig ist und, sofern sie auftritt, nur in geringen Konzentrationen erfolgt.

Diese Analyse wurde auf ein Panel von zwölf Melanom-Zelllinien erweitert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt.

TABELLE 3 – SSX-EXPRESSION IN MELANOM-ZELLLINIEN, NACHGEWIESEN DURCH RT-PCR1

Die vorangehenden Beispiele beschreiben das Isolieren und Klonieren von Nucleinsäuremolekülen für das SSX5-Gen. Wie bereits oben angegeben wird dieses Gen in Tumorzellen exprimiert, was Fachleuten ermöglicht, dieses Gen z.B. zum Testen auf das Vorhandensein von Krebs wie beispielsweise ein Melanom zu verwenden. Da das Gen ein Protein exprimiert, das seinerseits die Bildung von Antikörpern in vivo hervorrufen würde, ist dieses Protein, wie auch die für dieses Protein spezifischen isolierten Antikörper, ebenfalls Teil der Erfindung.

Die isolierten Nucleinsäuremoleküle der Erfindung umfassen jene degenerierten Sequenzen, die, obwohl sie mit Seq.-ID Nr. 2 nicht identisch sind, für dieselben Proteine kodieren wie diese Sequenzen. Auch Expressionsvektoren, die diese Moleküle umfassen und operabel an einen Promotor gebunden sind, sowie die Zelllinien oder Zellstämme, die mit diesen Vektoren transformiert oder transfiziert sind, oder die Nucleinsäuremoleküle selbst sind Teil der Erfindung. all diese Elemente sind z.B. zur Herstellung des Proteins sowie zur Bildung amplifzierter Kopien der relevanten Sequenzen nützlich.

Auch Teil der Erfindung sind jene Nucleinsäuremoleküle, die hierin durch Seq.-ID Nr. 13 und 14 definiert sind, Zusammensetzungen, die diese enthalten, und die Verwendung davon zum Testen auf Expression eines oder mehrerer SSX-Gene. Hierbei kann jedes beliebige Nucleinsäure-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, umfassend z.B. PCR-Verfahren. Die Antikörper der Erfindung können auch in Tests verwendet werden, wobei jedoch in diesem Fall das Target das Expressionsprodukt der SSX-Gene ist.

Andere Eigenschaften der Erfindung sind Fachleuten bekannt und müssen hierin nicht explizit erwähnt werden.

Die Bezeichnungen und Ausdrücke, die verwendet wurden, dienen der Beschreibung und nicht der Einschränkung der Erfindung, und es wird im Rahmen der Verwendung solcher Bezeichnungen und Ausdrücke keineswegs die Absicht verfolgt, jegliche Äquivalente der gezeigten und beschriebenen Eigenschaften oder von Teilen davon auszuschließen; es gilt demnach anzumerken, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung möglich sind.

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
  • (i) ANMELDER: Gure, Ali O.; Tureci, Ozlem; Sahin, Ugur; Tsang, Solam; Scanlan, Matthew J.; Knuth Alexander; Pfreundschuh, Michael; Old, Lloyd J.; Chen, Yao-Tseng
  • (ii) TITEL DER ERFINDUNG: Isolierte Nucleinsäuremoleküle, die für SSX-Familienmitglieder kodieren, und deren Verwendung
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
  • (iv) KORRESPONDENZADRESSE:

    (A) ADRESSAT: Felfe & Lynch

    (B) STRASSE: 805 Third Avenue

    (C) STADT: New York City

    (D) BUNDESSTAAT: New York

    (F) POSTLEITZAHL: 10022
  • (v) COMPUTERLESBARE FORM:.

    (A) ART DES MEDIUMS: Diskette, 3,5 Zoll, 144 kb Speicherplatz

    (B) COMPUTER: IBM

    (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS

    (D) SOFTWARE: Wordperfect
  • (vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:

    (A) ANMELDUNGSNUMMER:

    (B) EINREICHDATUM:
  • (vii) PRIORITÄTSANMELDUNGSDATEN:

    (A) ANMELDUNGSNUMMER: 08/851.138

    (B) ANMELDUNGSDATUM: 5. Mai 1997

    (C) KLASSIFIKATION: 435
  • (viii) INFORMATIONEN ÜBER ANWALT/VERTRETER:

    (A) NAME: Hanson, Norman D.

    (B) REGISTRATIONSNUMMER: 30.946

    (C) KENNZAHL/ZEICHEN: LUD 5480-PCT
  • (ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:

    (A) TELEFON: (212) 688-9200

    (B) TELEFAX: (212) 838-3884
(2) INFORMATIONEN ZU SEQ.-ID NR. 2
  • (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:

    (A) LÄNGE: 576 Nucleotide

    (B) TYP: Nucleinsäure

    (C) STRANGBESCHAFFENHEIT: einfach

    (D) TOPOLOGIE: linear

    (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 2
SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein Protein kodiert, dessen Aminosäuresequenz aus der von Seq.-ID Nr. 2 kodierten Aminosäuresequenz besteht.
  2. Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das aus der Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 2 besteht.
  3. Expressionsvektor, umfassend das isolierte Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, operabel an einen Promotor gebunden.
  4. Zelllinie oder Zellstamm, mit dem isolierten Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 transformiert oder transfiziert.
  5. Zelllinie oder Zellstamm, mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 3 transformiert oder transfiziert.
  6. Isoliertes Protein, das durch das isolierte Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 kodiert ist.
  7. Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das zur Bestimmung der Expression eines SSXS-Gens in einer Probe des isolierten Nucleinsäuremoleküls, das aus der in Seq.-ID Nr. 13 oder Seq.-ID Nr. 14 dargestellten Nucleotidsequenz, wie in Tabelle 2 gezeigt, besteht, nützlich ist.
  8. Zusammensetzung, die zur Bestimmung der Expression eines SSX-Gens in einer Probe nützlich ist, umfassend (a) Seq.-ID Nr. 3 und Seq.-ID Nr. 4, wie in Beispiel 2 gezeigt, (b) Seq.-ID Nr. 5 und Seq.-ID Nr. 6, (c) Seq.-ID Nr. 7 und Seq.-ID Nr. 8, (d) Seq.-ID Nr. 9 und Seq.-ID Nr. 10, (e) Seq.-ID Nr. 11 und Seq.-ID Nr. 12 und (f) Seq.-ID Nr. 13 und Seq.-ID Nr. 14, wie in Tabelle 2 gezeigt.
  9. Verfahren zur Bestimmung der Expression eines SSXS-Gens in einer Probe, umfassend das Kontaktieren der Probe mit zumindest einem isolierten Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 7 und das Bestimmen der Hybridisierung des isolierten Nucleinsäuremoleküls an ein Target als eine Bestimmung der Expression eines SSX5-Gens in der Probe.
  10. Isolierter Antikörper, der sich spezifisch an das isolierte Protein nach Anspruch 6 bindet.
  11. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart eines Expressionsprodukts eines SSX5-Gens in einer Probe, umfassend das Kontaktieren der Probe mit dem isolierten Antikörper nach Anspruch 10 und das Bestimmen der Bindung des Antikörpers an ein Target als eine Bestimmung der Gegenwart des Expressionsprodukts eines SSX5-Gens in der Probe.
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