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Dokumentenidentifikation DE69828940T2 29.12.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0000918878
Titel VERBESSERTES VERFAHREN ZUR FERMENTATIVEN HERSTELLUNG VON CEPHALOSPORIN
Anmelder DSM IP Assets B.V., TE Heerlen, NL
Erfinder KRIJGSMAN, John, NL-3328 HJ Dordrecht, NL;
SMEETS, Willem, Jan, NL-3135 WB Vlaardingen, NL;
DE BRAAL, Elisabeth, Henriette, NL-2613 ZA Delft, NL;
DE VROOM, Erik, NL-2313 JM Leiden, NL;
FASEL, Pieter, Herman, NL-2331 HM Leiden, NL
Vertreter Diehl & Partner, 80333 München
DE-Aktenzeichen 69828940
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 22.04.1998
EP-Aktenzeichen 989254842
WO-Anmeldetag 22.04.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/EP98/02459
WO-Veröffentlichungsnummer 0098048036
WO-Veröffentlichungsdatum 29.10.1998
EP-Offenlegungsdatum 02.06.1999
EP date of grant 09.02.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.12.2005
IPC-Hauptklasse C12P 35/02

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Gewinnung von fermentativ hergestellten Cephalosporinverbindungen.

Halbsynthetische Wege zum Herstellen von Cephalosporinen gehen meistens von Fermentationsprodukten, wie Penicillin G, Penicillin V und Cephalosporin C, aus, welche in die entsprechenden &bgr;-Lactamkerne umgewandelt werden, z. B. in einer Weise, wie sie beschrieben ist in K. Matsumoto, Bioprocess. Techn., Band 16 (1993), Seiten 67–88, J.G. Shewale & H. Sivaraman, Process Biochemistry, August 1989, Seiten 146–154, T.A. Savidge, Biotechnology of Industrial Antibiotics (Herausgeber E.J. Vandamme), Marcel Dekker, New York, 1984, oder J.G. Shewale et al., Process Biochemistry International, Juni 1990, Seiten 97–103. Die erhaltenen &bgr;-Lactamkerne werden nachfolgend durch Kuppeln mit einer geeigneten Seitenkette in das gewünschte Antibiotikum überführt, wie unter anderem in den Druckschriften EP 0339751, JP-A-53005185 und CH-A-640240 beschrieben ist. Durch Auswählen verschiedener Kombinationen aus Seitenketten und &bgr;-Lactamkernen kann eine Vielzahl an Penicillin- und Cephalosporinantibiotika erhalten werden.

Die 7-Aminodesacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) und die 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) sind als die wichtigsten Zwischenprodukte zur Herstellung von Antibiotika, die in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden, bekannt.

7-ADCA wird beispielsweise durch chemische oder enzymatische Spaltung (Deacylierung) von Phenylacetyl-7-ADCA hergestellt, wobei 7-ADCA und Phenylessigsäure erhalten werden. Die Phenylacetyl-7-ADCA wird normalerweise durch chemische Behandlung von Penicillin-G-sulfoxid hergestellt, das aus Penicillin G gebildet wird. Bei diesem Herstellungsverfahren wird eine große Menge von chemischen Stoffen benötigt, um sicherzustellen, daß die gewünschte Reaktion stattfindet. Dies ist kostspielig und verursache eine große Belastung bei der Abfallbehandlung. Darüber hinaus ist die Gesamtausbeute des Verfahrens nicht so hoch wie erwünscht.

Um einige Nachteile des chemischen Verfahrens zu überwinden, wurde ein Fermentationsverfahren für die Herstellung von 7-ADCA und 7-ACA angegeben. Dieses beinhaltet die fermentative Herstellung von N-substituierten &bgr;-Lactamen, wie Adipyl-7-ADCA oder Adipyl-7-ACA, durch einen rekombinanten Stamm von Penicillium chrysogenum, der in der Lage ist, eine Deseacetoxycephalosporansäuresynthase (DAOCS), auch bekannt als "Expandase", aus einem Transgen zu exprimieren (EP 0532341, EP 0540210, WO 93/08287, WO 95/04148, WO 95/04149). Die Expandase sorgt für die Erweiterung des fünfgliedrigen Rings bestimmter N-acylierter Penicillansäuren, wobei die entsprechenden N-acylierten Desacetoxydcephalosporansäuren entstehen.

Bekannte Verfahren zum Gewinnen von chemisch oder enzymatisch hergestellten Penicillan- und Cephalosporansäuren sind für die Gewinnung der N-substituierten &bgr;-Lactamzwischenprodukte und der deacylierten Amino-&bgr;-Lactame nicht effektiv. Das Hauptproblem bei der Gewinnung von fermentativ hergestellten N-substituierten Cephalosporinverbindungen, die oben erwähnt sind, ist die Komplexität der Brühe oder des Kulturfiltrats. Die Brühe enthält normalerweise verschiedene Penicillansäuren, wie &agr;-Aminoadipyl-6-penicillansäure, &agr;-Hydroxyadipyl-6-penicillansäure, 6-Aminopenicillansäure (6-APA), verschiedene Cephalosporansäuren, einschließlich &agr;-Aminoadipyl- und &agr;-Hydroxyadipyl-7-ADCA, sowie viele Proteinstoffe. Bekannte Gewinnungsverfahren ergeben keine annehmbare Qualität des Cephalosporansäureprodukts hinsichtlich der Reinheit.

Bei der enzymatischen Deacylierung führt dies zu Schwierigkeiten hinsichtlich der reduzierten Enzymhalbwertszeit, einer langsameren Biokonversionsgeschwindigkeit und mehr Kosten bei der Gewinnung nach der Biokonversion und/oder hinsichtlich inakzeptabler Verunreinigungsmengen. Darüber hinaus verhindern oder zumindest erschweren solche Verunreinigungen nach der Deacylierung das Gewinnen der gewünschten deacylierten Cephalosporinverbindung mit den gewünschten Eigenschaften.

Deshalb ergeben die bekannten Penicillin- und Cephalosporinverfahren keine annehmbare Qualität des Endprodukts. Das Endprodukt, z. B. 7-ADCA oder 7-ACA, enthält eine inakzeptable Menge an Penicillinkomponenten als Verunreinigungen.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Verfahren zum Herstellen von deacylierten &bgr;-Lactamen, z. B. von 7-ADCA oder 7-ACA, aus einer Fermentationsbrühe eines Mikroorganismus, der Cephalosporin bildet.

Insbesondere offenbart die vorliegende Erfindung ein verbessertes Verfahren zum Herstellen eines Cephalosporins der allgemeinen Formel I

worin R0 Wasserstoff oder C1-3-Alkoxy bedeutet, Y ein CH2, O, S oder eine oxidierte Form von S darstellt und R1 einen der Reste H, OH, Halogen, C1-3-Alkoxy, einen gegebenenfalls substituierten, gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthaltenden, gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder geradkettigen C1-5-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten, gegebenenfalls einen oder mehrere Heteroatome enthaltenden C5-8-Cycloalkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Aryl- oder Heteroarylrest oder eine gegebenenfalls substituierte Benzylgruppe bedeutet, mit den Stufen
  • a. Züchtung eines Cephalosporin bildenden Mikroorganismus in Gegenwart eines Seitenkettenvorläufers,
  • b. Extraktion der in der Fermentationsbrühe oder dem Fermentationsfluid vorliegenden N-substituierten Cephalosporinverbindung in ein organisches Lösungsmittel,
  • c. Rückextraktion der N-substituierten Cephalosporinverbindung in Wasser,
  • d. Behandlung der wäßrigen Phase mit einer Dicarboxylatacylase und
  • e. Isolierung der Cephalosporinverbindung der Formel I aus der so erhaltenen Umwandlungslösung durch Kristallisation,
dadurch gekennzeichnet, daß vor der Extraktion der Fermentationsbrühe oder des Fermentationsfluids mit einem organischen Lösungsmittels oder vor der Weiterverarbeitung des Rückextrakts die Fermentationsbrühe oder das Fermentationsfluid oder der Rückextrakt bei einem pH-Wert von unter 4 und bei einer Temperatur von 60 bis 140 °C inkubiert wird.

Die Betriebstemperatur liegt vorzugsweise im Bereich von 60 bis 80 °C. Die Verweilzeit bei diesen Bedingungen liegt im Bereich von mehreren Tagen bis zu mehreren Minuten und beträgt vorzugsweise weniger als 60 Minuten, insbesondere 1 bis 30 Minuten.

Weitere Verbesserungen des Verfahrens werden durch Waschen des ersten Extrakts des organischen Lösungsmittels, der die N-substituierte Cephalosporinverbindung enthält, mit angesäuertem Wasser und/oder durch Behandeln der gebildeten wäßrigen Cephalosporinlösungen in einer oder mehreren Stufen beim erfindungsgemäßen Verfahren mit Kohlendioxid und/oder durch Extrahieren der enzymatisch freigesetzten Seitenkette in ein organisches Lösungsmittel vor dem Kristallisieren des deacylierten Cephalosporins erreicht.

Das erfindungsgemäßen Verfahren führt zu einer besseren Gesamtausbeute und Produktqualität im Vergleich zu den gegenwärtig bekannten Verfahren.

Die Säurebehandlung einer N-sustituierten Cephalosporinverbindung im Verfahren zum Herstellen von 7-ADCA ist in der internationalen Patentveröffentlichung WO 95/04148 beschrieben. Jedoch werden gemäß dieser Veröffentlichung die Säurebedingungen in der organischen Phase (während der Rückextraktion) und nicht in einer wäßrigen Phase angewandt, wie es beim erfindungsgemäßen Verfahren der Fall ist.

Bei den neuen Gewinnungsverfahren, die angewandt werden, um eine deacylierte Cephalosporinverbindung aus ihrem N-acylierten Gegenstück, z. B. 7-ADCA aus Adipyl-7-ADCA oder 7-ACA aus Adipyl-7-ACA, zu erhalten, werden die folgenden Stufen noch mehr im Einzelnen beschrieben.

Wie oben erwähnt, wird aus irgend einem geeigneten Fermentationsverfahren, z. B. aus einer Fermentation unter Einsatz eines Stammes von Penicillium chrysogenum in Gegenwart eines geeigneten Seitenkettenvorläufers, eine Fermentationsbrühe erhalten.

Die Biomasse wird unter Anwendung irgend einer geeigneten Technologie, z. B. durch Zentrifugierung oder Filtrierung, von der Fermentationsbrühe abgetrennt, wobei ein Cephalosporin enthaltendes Fermentationsfluid erhalten wird. Vorzugsweise wird eine Filtrationsstufe angewandt, um diese Trennung zu erreichen. Die restlichen Feststoffe werden gegebenenfalls gewaschen.

Eines der Hindernisse bei der Herstellung von N-substituierter Cephalosporansäure ist die Anwesenheit von unerwünschten verunreinigenden &bgr;-Lactamkomponenten, insbesondere von 6-Aminopenicillansäure (6-APA), N-substituierter 6-APA oder &agr;-Aminoadipyl-7-RDCA.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Verunreinigungen dadurch merklich vermindert, daß eine wäßrige Lösung inkubiert wird, welche die N-substituierte Cephalosporinverbindung enthält, die in irgend einer Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens unter sauren Bedingungen und erhöhter Temperatur gebildet worden ist. Die wäßrige Lösung, welche die N-substituierte Cephalosporinverbindung enthält, wird bis zu einem pH-Wert angesäuert, der unter 4, vorzugsweise unter 3, liegt. Dazu werden eine oder mehrere bekannte Säuren, z. B. Schwefelsäure, Salzsäure oder Salpetersäure oder eine Kombination hiervon, verwendet.

Die obige Inkubationsstufe gemäß der Erfindung kann auf eine Fermentationsbrühe oder ein Fermentationsfluid oder auf den wäßrigen Rückextrakt, der das N-substituierte Cephalosporin enthält, angewandt werden. Vorzugsweise wird die Inkubationsstufe auf die Fermentationsstufe oder das Fermentationsfluid angewandt. Ferner kann die Inkubationsstufe entweder vor oder nach dem Abtrennen der Biomasse durchgeführt werden. Vorzugsweise wird die Inkubation vor dem Filtrieren durchgeführt, um einen Vorteil beim Filtrieren zu erhalten.

Die N-substituierte Cephalosporinverbindung wird aus der wäßrigen Phase, d. h. aus der Fermentationsbrühe oder dem Fermentationsfluid, durch Ansäuern der Fermentationsbrühe oder des Fermentationsfluids und nachfolgendes Extrahieren der N-substituierten Cephalosporinverbindung in ein organisches Lösungsmittel abgetrennt. Das Ansauern geschieht normalerweise bis zu einem ph-Wert von unter 4, vorzugsweise von unter 3, und nur in dem Fall, wenn die Fermentationsbrühe oder das Fermentationsfluid noch nicht der vorgenannten Inkubation unter sauren Bedingungen und erhöhter Temperatur unterworfen worden ist. Der Fermentationsbrühe oder dem Fermentationsfluid kann ein geeigneter Demulgator zugesetzt werden, um die Extraktion deutlich zu verbessern.

Vorzugsweise wird das organische Lösungsmittel aus Amylacetat, Butylacetat, Ethylacetat, Methylisobutylketon, Cyclohexanon, Isobutanol oder n-Butanol ausgewählt.

Die oben beschriebene Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel weist bezüglich der unerwünschten &bgr;-Lactam-produkte, wie &agr;-Aminoadipyl-7-ADCA und 6-APA, keine zufriedenstellende Selektivität auf. Deshalb wird bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ein Waschvorgang für das spezielle Entfernen dieser Verbindungen durchgeführt. Der Waschvorgang ist durch das Mischen des Extraktes des organischen Lösungsmittels mit einer kleinen Menge von angesäuertem Wasser und nachfolgende Phasentrennung gekennzeichnet. Das angesäuerte Wasser hat normalerweise einen pH-Wert von unter 4, vorzugsweise von unter 3, insbesondere von unter 2. Zusätzlich liegt das Phasenverhältnis normalerweise im Bereich zwischen 1:1 bis 1:20 Wasser:Lösungsmittel, vorzugsweise bei 1:2 Wasser:Lösungsmittel.

Die N-substituierte Cephalosporinverbindung wird auf üblichen Wegen in Wasser zurückextrahiert, und zwar durch Extrahieren der organischen Phase mit einer alkalischen Lösung, um einen wäßrigen Rückextrakt mit einem pH-Wert im Bereich von 6 bis 9 zu erhalten. Üblicherweise wird ein Phasenverhältnis von 1:10 (Wasser:Lösungsmittel) angewandt. Die alkalische Lösung ist eine wäßrige Lösung mit einem Gehalt an einer üblichen Mineralbase, wie NaOH oder NH3.

Die Extraktion, das Waschen und die Rückextraktion werden vorzugsweise in einer Reihe von kontinuierlichen Extraktoren mit intensivem Kontakt durchgeführt, z. B. in einer Kombination aus einem Intensivmischer, beispielsweise einem Mischer mit hoher Scherkraft, und einer Zentrifugaltrennung, vorzugsweise 2 bis 8, insbesondere 3 bis 6 und ganz besonders bevorzugt 4 bis 5.

Nach der Phasentrennung wird die wäßrige Phase gegebenenfalls gestrippt, um das Lösungsmittel zu entfernen.

Nachfolgend wird die wäßrige Lösung mit einem geeigneten Dicarboxylatacylaseenzym in Kontakt gebracht, um die N-substituierte Cephalosporinverbindung zu deacylieren, beispielsweise zur Bildung von 7-ADCA oder 7-ACA aus den entsprechenden N-Adipylderivaten.

Organismen, bei denen gefunden wurde, daß sie Dicarboxylatacylase bilden, sind Spezies von Alcaligenes, Arthrobacter, Achromobacter, Aspergillus, Acinetobacter, Bacillus und Pseudomonas. Insbesondere bilden die folgenden Spezies sehr geeignete Dicarboxylatacylasen: Achromobacter xylosooxidans, Arthrobacter viscosis, Arthrobacter CA128, Bacillus CA78, Bacillus megaterium ATCC53667, Bacillus cereus, Bacillus laterosporus J1, Paecilomyces C2106, Pseudomonas diminuta sp N176, Pseudomonas diminuta sp V22, Pseudomonas paucimobilis, Pseudomonas diminuta BL072, Pseudomonas Stamm C427, Pseudomonas sp SE83, Pseudomonas sp SE495, Pseudomonas ovalis ATCC950, Comamonas sp SY77, Pseudomonas GK 16, Pseudomonas SY-77-1, Pseudomonas sp A14, Pseudomonas vesicularis B965, Pseudomonas syringae, Ps putida ATCC17390, Ps aeroginosa NCTC 10701, Proteus vulgaris ATCC9634, Ps fragi DSM3881 und B. subtilus IFO3025.

Die Dicarboxylatacylase kann in irgend einer geeigneten Weise aus dem Microorganismus, der sie produziert, erhalten werden, wie es beispielsweise für den Stamm Pseudomonas sp SE83 in der US 4774179 beschrieben ist. Auch können die Gene für beispielsweise SE83- oder SY77-Dicarboxylatacylasen in einem unterschiedlichen geeigneten Wirt exprimiert werden, wie z. B. E. coli von Matsuda et al., in J. Bacteriology, Band 169 (1987), Seiten 5818–5820, für den Stamm SE83 und in der US 5457032 für den Stamm SY77 beschrieben wurde.

Die Enzyme, welche aus den oben genannten Quellen isoliert wurden, werden oft als Glutarylacylasen bezeichnet. Jedoch ist die Seitenkettenspezifikation der Enzyme auf die Glutarylseitenkette nicht beschränkt, sondern umfaßt alle kleineren und größeren Dicarboxylseitenketten. Einige der Dicarboxylatacylasen exprimieren auch eine gamma-Glutamyltranspeptidase-Aktivität und werden deshalb manchmal als gamma-Glutamyltranspeptidasen klassifiziert.

Dicarboxylatacylase kann als freies Enzym, aber auch in jeder geeigneten immobilisierten Form, z. B. in der in der Druckschrift EP 0222462 beschriebenen Form, verwendet werden.

Bei einer Ausführungsform der Erfindung wird die deacylierte Cephalosporinverbindung, z. B. 7-ADCA oder 7-ACA, aus der Umwandlungslösung durch Kristallisierung unter saueren Bedingungen isoliert. Normalerweise wird die Kristallisierung der deacylierten Cephalosporinverbindung aus einer wäßrigen Lösung durch Einstellen des pH-Werts der wäßrigen Lösung auf einen sauren Wert durch Zusetzen eines Titriermittels zu der wäßrigen Lösung, bis der pH-Wert einen Wert innerhalb eines Bereichs von 2,5 bis 4,5, vorzugsweise einen Wert von 3 bis 4, erreicht hat, durchgeführt.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Auskristallisierung einer deacylierten Cephalosporinverbindung aus einer wäßrigen Lösung durch Einbringen der wäßrigen Lösung in einen Kristallisationsbehälter durchgeführt, der auf einem festgelegten pH-Wert im Bereich von 2,5 bis 4,5 gehalten wird, unter Einsatz eines geeigneten Titriermittels durchgeführt.

Bei einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Kristallisation durch eine stufenweise Einstellung des pH-Werts der wäßrigen Lösung auf einen Endwert innerhalb des Bereichs von 2,5 bis 4,5 durch Einbringen der wäßrigen Lösung in eine Reihe von untereinander verbundenen Kristallisationsbehältern, z. B. durch Einbringen der wäßrigen Lösung in einen ersten Behälter, wobei gleichzeitig der Inhalt des ersten Behälters in einen zweiten Behälter überführt wird und gleichzeitig der Inhalt des zweiten Behälters in einen dritten Behälter gebracht wird usw., und wobei unter Verwendung eines geeigneten Titriermittels ein pH-Bereich in den miteinander verbundenen Behältern eingestellt wird. Dabei wird mit einem pH-Wert in den ersten Behälter begonnen, der um etwa 0,5 bis 2 pH-Einheiten vom pH-Wert der das deacylierte Cephalosporin enthaltenden wäßrigen Lösung abweicht, und man endet in dem letzten Behälter bei einem pH-Wert, der in einem Bereich von 2,5 bis 4,5 liegt. Zweckmäßigerweise wird der pH-Wert der wäßrigen Lösung, die das deacylierte Cephalosporin enthält, auf den gewünschten Endwert eingestellt, wobei eine Reihe von 2 bis 6 miteinander verbundenen Behälter benutzt wird.

Beispielsweise kann, um eine Kristallisierung eines deacylierten Cephalosporins aus der Umwandlungslösung zu erreichen, ein abnehmender pH-Bereich von 8 bis 3 angewandt werden, wobei ein Titriermittel verwendet wird, das eine Säure z. B. in Form von Schwefelsäure, Salzsäure und/oder Salpetersäure ist, und wobei eine Reihe von 3 bis 4 miteinander verbundenen Behältern eingesetzt wird.

Die zwei bevorzugten Ausführungsformen, welche oben beschrieben worden sind, werden vorzugsweise in einem kontinuierlichen Modus durchgeführt.

Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Seitenkette, gefärbte Produkte und Spuren der nicht umgesetzten Verbindung vor dem Kristallisieren aus der Umwandlungslösung abgetrennt, wobei die nachfolgend angegebenen Stufen angewandt werden.

Die Umwandlungslösung wird angesäuert und mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. mit Amylacetat, Butylacetat, Ethylacetat, Methylisobutylketon, Cyclohexanon, Isobutanol oder n-Butanol, in Kontakt gebracht, um vor der Kristallisation die Seitenkette zu entfernen. Das Ansäuern erfolgt mit einer Säure, wie Schwefelsäure, Salzsäure oder Salpetersäure oder einer Kombination hiervon, vorzugsweise mit Schwefelsäure, bis zu einem pH-Wert unter 3, vorzugsweise unter 2. Unerwarteterweise wird zusätzlich zur Abtrennung der Seitenkette auch eine gute Abtrennung der gefärbten Verunreinigungen erreicht.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden verunreinigende Penicillinkomponenten, z. B. eine zwitterionische 6-APA, die in wäßrigen, Cephalosporin enthaltenden Lösungen vorliegen, welche in einer oder mehreren Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens gebildet werden, z. B. in der Fermentationsbrühe oder in dem Fermentationsfluid, dem Rückextrakt, der Umwandlungslösung oder der das gelöste deacylierte Cephalosporin gemäß der Formel I enthaltenden Lösung, deutlich vermindert; und zwar durch Kontaktieren des Penicillin enthaltenden Fluids mit Kohlendioxid bei einem pH-Wert von normalerweise 5 bis 7. Das Kohlendioxid kann der Lösung auf jede geeignete Weise, z. B. in fester oder gasförmiger Form oder als Lösung von Carbonationen, zugegeben werden. Die wäßrige, Cephalosporin enthaltende Lösung wird bei einer Temperatur von 10 bis 60 °C, vorzugsweise von 20 bis 40 °C, mit der CO2-Quelle in Kontakt gebracht, wobei die Lösung während 4 bis 10 Stunden mit molekularem CO2 gesättigt wird. Nach dem Reduzieren der Penicillinkomponenten kann die Reinigung der Cephalosporinverbindungen gemäß der Formel I erreicht werden.

Nach der Extraktion der Seitenkette in ein organisches Lösungsmittel kann die deacylierte Cephalosporinverbindung aus der wäßrigen Phase auf verschiedene Weisen auskristallisiert werden, z. B. auf den Wegen, die oben zur Kristallisierung der deacylierten Cephalosporinverbindung aus einer wäßrigen Lösung angegeben wurden.

Bei einer bevorzugten Verfahrensweise wird der pH-Wert der wäßrigen Phase auf einen Wert im Bereich von 2,5 bis 5, vorzugsweise auf einen Wert innerhalb des Bereichs von 3,5 bis 4,5 erhöht. Dies erfolgt durch Zugabe der die deacylierte Cephalosporinverbindung enthaltenden Lösung in einer Stufe in einen Kristallisationsbehälter, der auf dem gewünschten pH-Wert gehalten wird, oder in eine Reihe von 2 bis 6 miteinander verbundenen Kristallisationsbehältern, die einen zunehmenden pH-Bereich aufweisen. Diese Verfahren können in bequemer Weise kontinuierlich durchgeführt werden.

Die Kristalle werden durch Filtration oder Zentrifugierung isoliert und in einem üblichen Trockner getrocknet, der kontinuierlich oder absatzweise betrieben wird.

Alle vorgenannten Stufen, d. h. die Extraktion, das Waschen, die Rückextraktion und die Kristallisation, können absatzweise oder nach einem Fed-Batch-Verfahren durchgeführt werden. Aus Gründen der Stabilität ist aber eine kontinuierliche Verfahrensweise die bevorzugte Methode.

Das nachfolgende Beispiel dient nur zur beispielhaften Erläuterung und soll nicht als Einschränkung in irgend einer Weise betrachtet werden.

BEISPIEL

Eine Probe von 1 Liter einer Adipyl-7-ADCA-Brühe wurde filtriert, um die Biomasse zu entfernen. Das Mycel wurde mit Leitungswasser gewaschen, um ein endgültiges Volumen des Filtrats von etwa 2 1 zu erhalten.

Etwa 2 Liter des Filtrats wurden bei 40 °C mit 250 ml 6 n H2SO4 bis zu einem pH-Wert von 1,5 angesäuert. Es wurden 2/3 des Volumens des angesäuerten Filtrats an n-Butanol hinzugefügt und nach kräftigem Mischen abgetrennt. Die Wasserphase wurde zwei weiteren solchen Behandlungen mit n-Butanol unterworfen. Anschließend wurden die vereinigten organischen Phasen mit Portionen von 0,25 1 angesäuertem Wasser mit einem pH-Wert von 2 gewaschen. Die erhaltene organische Phase wurde bei 20 °C mit 245 ml 2 n NaOH-Lösung rückextrahiert. Nach der Phasentrennung wurden die Spuren an n-Butanol in der Wasserphase durch Abziehen unter Vakuum entfernt.

135 g der Wasserphase wurden bei 30 °C mit demineralisiertem Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 650 ml verdünnt und mit 4 n NaOH bis zu einem pH-Wert von 8,5 gemischt. Es wurden 50 g immobiliertes Deacylierungsenzym hinzugefügt, und nach zwei Stunden bei 30 °C und bei einem pH-Wert von 8,5 unter Zugabe von 13,5 ml 4 n NaOH wurde die Wasserphase gesammelt. Das Filtrat wurde bei einem pH-Wert von 0,4 mit 3 Portionen von 125 ml Wasser, das mit n-Butanol gesättigt war, extrahiert. Während der Extraktion wurden insgesamt 50,6 ml 37%-ige HCl zugegeben. Die restliche Wasserphase wurde mit 56,5 ml 8 n NaOH neutralisiert. Das Produkt wurde aus der Wasserphase, die frei von n-Butanoltröpfchen war, durch Senken des pH-Werts auf 5,3 mit 6 n H2SO4 auskristallisiert. Nach 5 Minuten wurde der pH-Wert weiter auf den endgültigen Wert von 3,5 herabgesetzt. Es wurden insgesamt 15 ml Säure verwendet. Die Aufschlämmung wurde filtriert. Der Kristallkuchen wurde mit 50 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 4,1 g 7-ADCA mit einer Reinheit von 96 % erhalten.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zum Herstellen eines Cephalosporins der allgemeinen Formel (I)
    worin R0 Wasserstoff oder den Rest C2-3-Alkoxy,

    Y den Rest CH2, O, S oder eine oxidierte Form von S und

    R1 einen der Reste H, OH, Halogen, C1-3-Alkoxy, einen gegebenenfalls substituierten, gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthaltenden, gesättigten oder ungesättigten, verzweigten oder geradkettigen C1-5-Alkylrest, einen gegebenenfalls substituierten, gegebenenfalls einen oder mehrere Heteroatome enthaltenden C5-8-Cycloalkylrest, einen gegebenenfalls substituierten Aryl- oder Heteroarylrest oder eine gegebenenfalls substituierte Benzylgruppe bedeuten,

    mit den folgenden Stufen

    a. Züchtung eines Cephalosporin bildenden Mikroorganismus in Gegenwart eines Seitenkettertvorläufers,

    b. Extraktion der in der Fermentationsbrühe oder dem Fermentationsfluid vorliegenden N-substituierten Cephalosporinverbindung in ein organisches Lösungsmittel,

    c. Rückextraktion der N-substituierten Cephalosporinverbindung in Wasser,

    d. Behandlung der wässrigen Phase mit einer Dicarboxylatacylase und

    e. Isolierung der Cephalosporinverbindung der Formel (I) aus der so erhaltenen Umwandlungslösung durch Kristallisation,

    dadurch gekennzeichnet, daß vor der Extraktion der Fermentationsbrühe oder des Fermentationsfluids mit einem organischen Lösungsmittel oder vor der Weiterverarbeitung des Rückextrakts die Fermentationsbrühe oder das Fermentationsfluid oder der Rückextrakt bei einem pH-Wert von unter 4 und bei einer Temperatur von 60 bis 140 °C inkubiert wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fermentationsbrühe oder das Fermentationsfluid oder der Rückextrakt bei einer Temperatur im Bereich von 60 bis 80 °C inkubiert wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Fermentationsbrühe oder das Fermentationsfluid oder der Rückextrakt bei einem pH-Wert von unter 3 inkubiert wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Inkubationszeit bei einem pH-Wert von unter 4 weniger als 60 Minuten beträgt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, ferner dadurch gekennzeichnet, daß der die N-substituierte Cephalosporinverbindung enthaltende Extrakt vor der Rückextraktion mit angesäuertem Wasser, das einen pH-Wert von unter 4 aufweist, gewaschen wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, ferner dadurch gekennzeichnet, daß der die N-substituierte Cephalosporinverbindung enthaltende Extrakt in dem organischen Lösungsmittel mit angesäuertem Wasser, das einen pH-Wert von unter 3 aufweist, gewaschen wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der die N-substituierte Cephalosporinverbindung enthaltende Extrakt mit angesäuertem Wasser, das einen pH-Wert von unter 2 aufweist, gewaschen wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, ferner dadurch gekennzeichnet, daß die in der Umwandlungslösung vorliegende Seitenkette vor der Kristallisation der Cephalosporinverbindung gemäß der Formel (I) in ein organisches Lösungsmittel extrahiert wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine Cephalosporin enthaltende wässerige Lösung in einer oder mehreren Stufen, ausgewählt aus der Fermentationsbrühe, dem Fermentationsfluid, dem Rückextrakt, der Umwandlungslösung und der die gelöste Cephalosporinverbindung gemäß der Formel (I) enthaltenden Lösung, mit Kohlendioxid kontaktiert wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Kohlendioxid in fester oder gasförmiger Form oder als Lösung von Carbonationen vorliegt.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, worin das organische Lösungsmittel aus Amylacetat, Butylacetat, Ethylacetat, Methylisobutylketon, Cyclohexanon, iso-Butanol und n-Butanol ausgewählt wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Kristallisation der Cephalosporinverbindung gemäß der Formel (I) aus der Umwandlungslösung oder der wässrigen Phase durch Zugabe der wässrigen Lösung oder Phase in einen Kristallisationsbehälter, der auf einen festen pH-Wert im Bereich von 2,5 bis 4,5 gehalten wird, unter Verwendung eines geeigneten Titrans durchgeführt wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Kristallisation der Cephalosporinverbindung gemäß der Formel (I) aus der Umwandlungslösung oder der wässrigen Phase durch Zugabe der wässrigen Lösung oder Phase in eine Reihe von miteinander verbundenen Kristallisationsbehältern durchgeführt wird, während unter Verwenden eines geeigneten Titrans ein Bereich des pH-Werts eingestellt wird, wobei der Beginn im ersten Behälter bei einem pH-Wert stattfindet, der um etwa 0,5 bis 2 pH-Wert-Einheiten vom pH-Wert der 6-APA-Lösung abweicht, und das Ende im letzten Behälter bei einem pH-Wert im Bereich von 2,5 bis 4,5 liegt.
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