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Dokumentenidentifikation DE69829069T2 29.12.2005
EP-Veröffentlichungsnummer 0001034281
Titel MILCHDRÜSENGEWEBE-SPEZIFISCHES EXPRESSIONSSYSTEM MIT EINER BETA-KASEIN PROMOTOR STELLE AUS DER KOREANISCHEN ZIEGE
Anmelder Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd., Kyunggi, KR;
Korea Advanced Institute of Science and Technology, Taejon, KR
Erfinder YOO, Joon, Ook, Sungnam, Kyunggi-do 463-400, KR;
LEE, Kwang, Kyung, Taejeon 306-050, KR;
HAN, Mahn, Young, Taejeon 305-345, KR;
KIM, Sun Jung, Taejeon 305-335, KR;
JEONG, Young, Hae, Taejeon 305-333, KR;
KO, Ho, Jung, Taejeon 305-338, KR;
OH, Jun, Won, Seoul 132-030, KR
Vertreter Ostertag & Partner, Patentanwälte, 70597 Stuttgart
DE-Aktenzeichen 69829069
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 11.09.1998
EP-Aktenzeichen 989443197
WO-Anmeldetag 11.09.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/KR98/00277
WO-Veröffentlichungsnummer 0000015808
WO-Veröffentlichungsdatum 23.03.2000
EP-Offenlegungsdatum 13.09.2000
EP date of grant 16.02.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.12.2005
IPC-Hauptklasse C12N 15/63
IPC-Nebenklasse C12N 15/12   C12N 15/27   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Milchdrüsengewebespezifisches Expressionssystem, das die Promotorstelle des &bgr;-Caseingens von nativen koreanischen Ziegen verwendet, wodurch physiologische aktivierende Substanzen produziert werden können. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung neue rekombinante Säuger-Expressionsvektoren, in denen eine die &bgr;-Casein-Genexpression regulierende Region, ein Gen einer physiologischen aktivierenden Substanz und eine die Termination regulierende Region verknüpft sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion von physiologischen aktivierenden Substanzen in von Milchdrüsen abstammenden Zell-Linien und in Tieren unter Verwendung der neuen rekombinanten Vektoren.

Stand der Technik

Physiologische aktivierende Substanzen werden in Spurenmengen im menschlichen Körper produziert und sekretiert und spielen eine wesentliche Rolle in verschiedenen Metabolismen und Modulationen. Die bis heute bekannten physiologischen aktivierenden Substanzen umfassen Insulin, Interleukine, hämopoetische Wachstumsregulierungsfaktoren, wie den Stammzellenfaktor, den Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor, Erythropoetin usw., und sind zu zahlreich, um ihre großen Funktionen im menschlichen Körper in Einzelheiten zu beschreiben. Der Grund, warum derartige physiologische aktivierende Substanzen trotz ihrer Bedeutung noch nicht industrialisiert worden sind, ist, dass sie aufgrund ihrer Spurenmenge im menschlichen Körper schwierig zu isolieren und zu reinigen sind. Weiter erfüllen die physiologischen aktivierenden Substanzen, die unter Verwendung eines prokaryotischen Expressionssystems, wie dem aus E. coli erhaltenen, produziert werden, häufig nicht ihre normalen Funktionen im menschlichen Körper, ebenso wie sie noch nicht das Sicherheitsproblem überwunden haben, das vor der Verabreichung gelöst werden muss.

Gemäß den Berichten, die von akademischen Kreisen beigetragen wurden, ist bekannt, dass, selbst wenn eine Promotorstelle für ein Gen verwendet wird, das spezifisch in Milchdrüsengewebe exprimiert wird, das Expressionsniveau unterschiedlich ist, abhängig von der Art, aus welcher der Promotor erhalten wird, und von den zu exprimierenden Genen (Clark et al. (1987) Trends Biotech. 5, 20-24; Simons et al., (1987) Nature 328, 530-532; Lee et al., (1988) Nucl. Acids Res. 16, 1027-1041; Vilotte et al., (1988) Eur. J. Biochem. 186, 43-48; Gorden et al., (1987) Bio/Technology 8, 443-446; Shani et al., (1992) Transgenic Res. 1, 195-208; Wright et al., (1991) Bio/Technology 9, 830-834; Ebert et al., (1991) Bio/Technology 9, 835-838; Mega et al., (1994) Transgenic Res. 3, 36-42; Wei et al., (1995) Transgenic Res. 4, 232-240; Gutierrez et al., (1996) Transgenic Res. 5, 271-279).

Um physiologische aktivierende Substanzen zu produzieren, sind gewöhnlich die Expressionssysteme verwendet worden, die den Vorteil von E. coli (koreanische Patentveröffentlichung Nr. 94-5585) und Tierzellen verwenden. Diese Techniken würden irgendwann einmal zu industriellen Erfolgen führen, aber es sind immer noch bedeutende Probleme zu lösen. Beispielsweise ist im Fall der Expression unter Verwendung von E. coli eine Massenproduktion mit geringen Kosten möglich. Da jedoch E. coli, ein Prokaryot, keine Posttranslations-Modifikation durchführt, welche ein Merkmal von Eukaryoten ist, kann eine menschliche physiologische aktivierende Substanz wie EPO nicht ihre Aktivität ausüben, wenn sie in E. coli produziert wird. Um dieses Problem zu vermeiden, wurde und wird eine aktive Forschung auf die Entwicklung von Expressionssystemen gerichtet, welche den Vorteil von Tierzellen wahrnehmen. Die in diesen Systemen exprimierten Produkte sind im menschlichen Körper aktiv, da sie Posttranslations-Modifikationen unterzogen werden. Jedoch bleibt das Problem der hohen Kosten für die Kultivierung von Tierzellen ungelöst.

Nahezu alle physiologischen aktivierenden Substanzen, die industriell erzeugt werden, verwenden die oben erwähnten Techniken, so dass die Probleme gelöst werden müssen, einschließlich der Aufrechterhaltung der Aktivität, der Kosten und der Isolierung und Reinigung.

Offenbarung der Erfindung

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter Vektor pGbc (KCTC 0515BP) bereitgestellt, der eine &bgr;-Casein-Promotorstelle von nativen koreanischen Ziegen verwendet.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter Vektor pGbc_L (KCTC 0514BP) bereitgestellt, der eine &bgr;-Casein-Promotorstelle von nativen koreanischen Ziegen verwendet.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinanter Vektor pGbc_S (KCTC 0513BP) bereitgestellt, der eine &bgr;-Casein-Promotorstelle von nativen koreanischen Ziegen verwendet.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Produktion gewünschter Proteine bereitgestellt, in dem die gewünschten Proteine in von Milchdrüsengewebe abstammenden Zellen exprimiert werden, welche mit dem pGbc_L-Vektor oder dem pGbc_S-Vektor transfiziert sind.

Bevorzugt werden die von Milchdrüsengewebe abstammenden Zellen aus der HC11-Linie.

Bevorzugt werden die HC11-Zellen mit einem ein Gen tragenden pGbc_L-Vektor oder pGbc_S-Vektor durch Calciumphosphat-Copräzipitation oder Elektroporation transfektiert.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Produktion von gewünschten Proteinen bereitgestellt, in dem die gewünschten Proteine in Zellen der Milchdrüse von transgenen nicht-menschlichen Tieren mit dem pGbc-Vektor exprimiert werden.

Die von den gegenwärtigen Erfindern entwickelten Milchdrüsen-spezifischen Expressionssysteme, die als pGbc, pGbc_L und pGbc_S bezeichnet werden und bei der Korean Collection for Type Cultures, Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology, am 17. August 1998 hinterlegt wurden (Hinterlegungsnummern KCTC 0515BP, 0514BP bzw. 0513BP), machen es möglich, dass gewünschte Proteine durch Expression in von Milchdrüsengewebe abstammenden Tierzellen oder durch die Milch produziert werden, welche von den transgenen Tieren mit den Expressionssystemen abgesondert wird, wodurch die oben erwähnten Probleme, d.h. die Beibehaltung der Aktivität, die Produktionskosten und die Isolierung und Reinigung der gewünschten Proteine, gelöst werden.

Die Verwendung der Expressions-regulierenden Region eines &bgr;-Caseingens, das spezifisch in Milchdrüsengeweben exprimiert wird, bei der Produktion von humanen physiologischen aktivierenden Substanzen führt zu den folgenden industriellen Vorteilen. Zuerst können, da die Zielproteine, die durch die Rekombinationstechnik der vorliegenden Erfindung erzeugt werden, der gleichen Posttranslations-Modifikation wie derjenigen unterliegen, welcher die entsprechenden natürlich vorkommenden Proteine unterliegen, die Zielproteine ihre Aktivität im menschlichen Körper beibehalten. Zweitens können aufgrund der Ausnutzung des Vorteils ihrer Spezifität für Milchdrüsengewebe die Expressionssysteme der vorliegenden Erfindung, die von Milchdrüsengewebe abstammende Zellen oder transgene Tiere verwenden, physiologische aktivierende Substanzen mit viel geringeren Kosten erzeugen als dies bei Expressionssystemen der Fall ist, die allgemeine Tierzellen verwenden. Die in von Milchdrüsengewebe abstammenden Zellen oder durch die von transgenen Tieren abgesonderte Milch produzierten Proteine sind von geringer Zahl, so dass das Zielprotein leicht zu isolieren und zu reinigen ist. Zusätzlich erfordern transgene Tiere keine weiteren bedeutenden Kosten bei der Hinaufskalierung der Produktion der Zielproteine, ebenso wie sie keine Umweltverschmutzung während deren Produktion erzeugen. Ein dritter Vorteil ist die Sicherheit der erzeugten physiologischen aktivierenden Substanzen. Da in den Produkten, die von Milchdrüsengeweben abgesondert werden, keine Toxine vorliegen, ist das Expressionssystem der vorliegenden Erfindung sicherer als andere herkömmliche Systeme.

Um physiologische aktivierende Substanzen zu produzieren, wurden Verfahren unter Verwendung von E. coli oder Tierzellen entwickelt, und in jüngerer Zeit wurde der Vorteil von transgenen Tieren ausgenutzt. Die Expressionstechniken unter Verwendung von E. coli als Wirt oder unter Verwendung von Tierzellen haben aufgrund der oben erwähnten Probleme, d.h. der Aktivitätsbeibehaltung, der Produktionskosten und der Isolierung und Reinigung der produzierten physiologischen aktivierenden Substanzen nun eine Begrenzung bei der industriellen Anwendung erfahren. Als Maßnahme zur Lösung dieser Probleme haben sich transgene Tier- und verwandte Techniken rasch entwickelt und machen nun einen großen Fortschritt bei biologischen Studien.

Die vorliegende Erfindung verwendet eine von Milchdrüsengewebe abstammende Zell-Linie und ein transgenes Tier bei der Produktion von Proteinen. Dafür werden in der vorliegenden Erfindung eine molekularbiologische Technologie und andere Spitzentechnologien verwendet. Zum Beispiel werden DNA-Rekombinationstechniken für die Konstruktion der Säuger-Expressionsvektoren benötigt, die spezifisch in Milchdrüsengeweben exprimiert werden können, und eine Mikroinjektionstechnik dient zur Erzeugung eines transgenen Tiers mit den Vektoren.

Obwohl es dem Fachmann wohlbekannt ist, die Promotorstellen der Gene, die spezifisch in Milchdrüsengeweben exprimiert werden, bei der Konstruktion eines Säuger-Expressionsvektors zu verwenden, der in der Lage ist, Proteine spezifisch in Milchdrüsengeweben zu exprimieren, und der Säuger-Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung aus pRc/RSV, einem kommerziellen Vektor (Invitrogen Inc.) abstammt, sind die Expressionssysteme der vorliegenden Erfindung von denjenigen anderer herkömmlicher Techniken in den folgenden Aspekten ziemlich verschieden. Zuerst wird der in der vorliegenden Erfindung verwendete Ziegen-&bgr;-Casein-Promotor aus nativen koreanischen Ziegen erhalten. Ein zweiter charakteristisch verschiedener Punkt ist, dass die Ziegen-&bgr;-Casein-Promotorstelle mit dem ersten Exon eines Strukturgens über das erste Exon des Ziegen-&bgr;-Caseingens verknüpft ist. In den meisten Fällen wird ein Intron zwischen eine Promotorstelle und das erste Exon eines Strukturgens eingeschoben. Drittens folgt in den Säuger-Expressionsvektoren gemäß der vorliegenden Erfindung ein Rinder-Wachstumshormon einem Strukturgen, mit dem Ziel der Bewerkstelligung einer vorzuziehenden Transkriptionstermination. Unabhängig davon, ob das poly(A)-Signal des Strukturgens vorliegt oder nicht, ist der Rinder-Wachstumshormon-Terminator mit dem Strukturgen verknüpft.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die obigen und andere Gegenstände und Aspekte der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsformen mit Bezug auf die begleitende Zeichnung ersichtlich, in der:

1 eine schematische Ansicht ist, welche einen Teil der gemeinsamen Struktur der neuen Vektoren pGbc_S und pGbc_L für die Transfektion in Tierzellen und eines neuen Vektors pGbc für transgene Tiere zeigt;

2 die Basensequenz des &bgr;-Casein-Promotors von nativen koreanischen Ziegen ist;

3 ein schematisches Diagramm ist, das die Konstruktion des rekombinanten Vektors pGbc_S gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;

4 ein schematisches Diagramm ist, das die Konstruktion des rekombinanten Vektors pGbc_L gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;

5 ein schematisches Diagramm ist, das die Rekombination des Vektors pGbc_S mit einem hGCSF-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;

6 ein schematisches Diagramm ist, das die Rekombination des Vektors pGbc_S mit einem hGMCSF-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;

7 ein schematisches Diagramm ist, das die Rekombination des Vektors pGbc_L mit einem hGCSF-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;

8 ein schematisches Diagramm ist, das die Rekombination des Vektors pGbc_L mit einem hGMCSF-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;

9 ein schematisches Diagramm ist, das die Rekombination des Vektors pGbc mit einem hGCSF-Gen oder einem hGMCSF-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht;

10 eine Western-Blotting-Analyse für die hGM-CSF-Proteine zeigt, die von den von Maus-Milchdrüsengewebe abstammenden HC11-Zellen produziert wurden, welche gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem rekombinanten Vektor pGbc_L oder pGbc_S transfiziert sind, der ein hGM-CSF-Gen trägt;

11 eine ELISA-Grafik für die hGM-CSF-Proteine ist, welche aus den von Maus-Milchdrüsengewebe abstammenden HC11-Zellen produziert werden, die gemäß der Erfindung mit einem rekombinante Vektor pGbc_L oder pGbc_S transfiziert sind, der ein hGM-CSF-Gen trägt;

12 eine ELISA-Grafik für das hG-CSF-Protein ist, das aus den von Maus-Mildrüsengeweben abstammenden HC11-Zellen abstammt, die gemäß der vorliegenden Erfindung mit einem rekombinanten Vektor pGbc_L oder pGbc_S transfiziert sind, der ein hG-CSF-Gen trägt;

13 eine Fotografie der PCR-Produkte ist, die unter Verwendung der genomischen DNAs von transgenen Mäusen als Matrizen erhalten wurden;

14 eine Western-Blotting-Analyse für die hG-CSF-Proteine zeigt, die gemäß der vorliegenden Erfindung in der Milch von transgenen Mäusen abgesondert wurden;

15 eine ELISA-Grafik für die hG-CSF-Proteine ist, die gemäß der vorliegenden Erfindung in der Milch von transgenen Mäusen abgesondert wurden; und

16 eine ELISA-Grafik für die hGM-CSF-Proteine ist, die gemäß der vorliegenden Erfindung in der Milch von transgenen Mäusen abgesondert wurden.

Beste Weisen zur Durchführung der Erfindung [1] Konstruktion der Expressionsvektoren 1. Amplifikätion des &bgr;-Casein-Promotors und der Exone 1 und 2 von koreanischen nativen Ziegen

Zwei Paare von Primern werden konstruiert, um durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) einen Teil des &bgr;-Caseingens zu amplifizieren, von dem mitgeteilt wurde, dass es spezifisch in nativen koreanischen Ziegen exprimiert wird. Ein Paar der Primer ist für die Amplifikation eines Teilgens verantwortlich, welches die Ziegen-&bgr;-Casein-Promotorstelle und das Exon 1 einschließt, und das andere für die Amplifikation eines Teilgens, welches das Ziegen-&bgr;-Casein-Intron 1 und -Exon 2 einschließt. Das PCR-Produkt des Ziegen-&bgr;-Casein-Promotors und -Exons 1 wird mit den Endonukleasen Sac I und Hind III verdaut, während das PCR-Produkt des Ziegen-&bgr;-Casein-Introns 1 und -Exons 2 mit den Endonukleasen Hind III und Sal I verdaut wird. Die zwei Upstream- und Downstream-Primer für die Amplifikation des Ziegen-&bgr;-Caseins und -Exons 1 werden als GBC-F1 bzw. GBC-R1 bezeichnet und weisen die folgenden Basensequenzen auf: GBC-F1, 5'-GCT GAG CTC TTT AGT ATA TTG TTA AGG A-3' und GBC-R1, 5'-TGT CAA GCT TAT CTT AAA CAC CCT TA-3'. Die zwei Upstream- und Downstream-Primer für die Amplifikation des Ziegen-&bgr;-Casein-Introns 1 und -Exons 2 werden als GBC-F2 bzw. GBC-R2 bezeichnet und weisen die folgenden Basensequenzen auf: GBC-F2, 5'-GCA TAA GCT TTA CAC TAT TTT CAG CAG-3' und GBC-R2, 5'-ATA GTC GAC CCA GAG TTG TGG TC-3'. Nachdem die zwei verdauten PCR-Produkte zusammen in einen pBluescript II SK-Vektor, der kommerziell von Stratagene erhältlich ist, inseriert worden sind, wird das resultierende Plasmid einer Doppelstrang-Sequenzierungsanalyse unterzogen, um die Basensequenz der ligierten Genfragmente zu identifizieren.

2) Konstruktion von pGbc_5 und pGbc_L

Von der Genregion, die in den pBluescript II SK (Stratagene) subkloniert wurde, wird ein DNA-Bereich, der von 501 Nukleotiden bis zu einem Nukleotid auf der Stromaufwärtsseite des Translations-Startkodons für Exon 1 reicht, durch PCR amplifiziert. Dieses PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen Nru I und Hind III verdaut. Getrennt wird pRc/RSV, ein Säuger-Expressionsvektor, mit den gleichen Enzymen behandelt, um die LTR-Region zu entfernen. An dieses geöffneten Plasmid wird das verdaute PCR-Produkt durch Ligierung inseriert, was pGbc_S ergibt.

Das verdaute PCR-Produkt wird weiter mit dem Restriktionsenzym Dra I behandelt, und eine Extraktion und Reinigung des Genfragments werden vorgenommen, dessen entgegengesetzte Enden mit Hind III und Dra I geschnitten werden. Der pBluescript II SK, der die Ziegen-&bgr;-Promotor-, Exon 1-, Intron 1- und Exon 2-Region umfasst, wird einem doppelten Verdau mit den Restriktionsenzymen Stu I und Dra I unterzogen, gefolgt von der Extraktion und Reinigung des Fragments, das kein Exon 1-Gen umfasst. Die zwei Genfragmente werden zusammen an einen pRc/RSV-Vektor ligiert, der zuvor durch Nru I und Hind III gespalten worden ist, was pGbc_L ergibt.

Ob pGbc_S und pGbc_L korrekt konstruiert worden sind oder nicht, wird durch Basensequenzierungsanalyse bestätigt.

3) Konstruktion von pGbc und Rekombination mit Genen von physiologischer aktivierender Substanz (humanem Granulozytenkolonie-stimulierender Faktor (hGCSF) und humanem Granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierender Faktor (hGMCSF))

Das PCR-Produkt, ein Genfragment, das die Promotorstelle und die Exon 1-Region einschließt, wird doppelt mit Sac I und Dra I verdaut, um ein Genfragment zu ergeben, das die Promotorstelle und ein partielles Exon 1 einschließt, das sich bis zu einem Nukleotid auf der 5'-Seite des Translations-Startkodons erstreckt. Getrennt wird das oben in 2) erhaltene PCR-Produkt mit einer Größe von 500 by mit Dra I und Hind III verdaut. Durch Ligieren werden diese zwei Genfragmente zusammen in einen mit Sac I/Hind II gespaltenen pBluescript II SK-Vektor (Stratagene) inseriert, der dann durch die Spaltung mit Hind III und EcoR I geöffnet wird. An dieses geöffneten Plasmid wird ein verkürztes Genfragment ligiert, welches ein Strukturgen einschließt, das mit einem Rinder-Wachstumshormon-Terminator verknüpft ist und mit Hind III und EcoR I verkürzt ist. Die allgemeine Struktur der Vektoren vom pGbc-Typ ist schematisch in 1 gezeigt.

[2] Rekombination von Milchdrüsengewebe-spezifischen Expressionsvektoren und hGCSF-Gen und hGMCSF-Gen

1) Unter Verwendung wohlbekannter Gensuch- und PCR-Techniken (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York) werden ein hGCSF-Gen und ein hGMCSF-Gen in pUC19, einen kommerziell erhältlichen Plasmid-Vektor, kloniert.

2) Rekombination des hGCSF-Gens und der Milchdrüsengewebespezifischen Expressionsvektoren pGbc_S und pGbc_L

Der pUC19-Vektor, in den das hGCSF-Gen kloniert ist, wird mit den Restriktionsenzymen BamH I und Xba I verdaut. Fragment 1, das eine Region einschließt, die vom Exon 2 durch ein poly(A)-Signal reicht, wird isoliert und gereinigt. Der so geöffnete Vektor wird mit dem Restriktionsenzym Pst I verdaut, was ein Fragment 2 ergibt, das eine Region einschließt, die von einem Nukleotid auf der 5'-Seite des Translations-Startkodons bis zu einem Nukleotid auf der 5'-Seite des Exons 2 reicht. Die Fragmente 1 und 2 werden an einen pBluescript II SK-Vektor inseriert und ligiert, der mit den Restriktionsenzymen Pst I und Xba I geöffnet ist, um ein rekombinantes Plasmid pBluescript II SK-hGCSF zu erzeugen. Dieses Plasmid wird einem doppelten Verdau mit den Endonukleasen Hind III und Xba I unterzogen, um ein modifiziertes hGCSF-Gen zu erhalten, das dann an einen pGbc_S-Vektor ligiert wird, der an denselben Endonuklease-Stellen Hind III und Xba I verdaut wird, um ein neues Plasmid pGbc_S-hGCSF herzustellen.

Ähnlich wird ein neues Plasmid pGbc_L-hGCSF durch Ligieren eines Fragments, das durch den Endonukleaseverdau eines Ziegen-&bgr;-Casein-Promotors und eines modifizierten hGCSF-Genfragments erhalten wird, welches durch doppelten Verdau des pBluescript II SK-hGCSF mit Hind III und Xba I erhalten wird, an einen pGbc_L-Vektor, der mit den gleichen Endonukleasen geöffnet ist, konstruiert.

3) Rekombination von hGMCSF-Gen und Milchdrüsen-spezifischen Expressionsvektoren pGbc_S und pGbc_L

Das hGMCSF-Gen, das in den pUC19-Vektor subkloniert ist, wird durch Verdau mit den Restriktionsenzymen BamH I und EcoR I extrahiert und dann durch Ligieren an einen pBluescript II SK-Vektor (Stratagene) inseriert, welcher mit den gleichen Endonukleasen verdaut ist, um ein rekombinantes Plasmid pBluescript II SK-hGMCSF zu erzeugen. Durch Verdau des rekombinanten Plasmids mit Hind III und Xba I und dann Ligieren an einen pGbc_S-Vektor, der an den gleichen Endonuklease-Stellen Hind III und Xba I verdaut ist, um ein neues Plasmid pGbc_S-hGMCSF zu konstruieren, wird ein modifiziertes Gen gewonnen.

Ähnlich wird ein neues Plasmid pGbc_L-hGMCSF durch Ligieren eines Fragments, das durch den Endonuklease-Verdau eines Ziegen-&bgr;-Promotors erhalten wird, und eines modifizierten hGMCSF-Genfragments, das durch doppelten Verdau des pBluescript II SK-hGMCSF mit Hind III und Xba I erhalten wird, an einen pGbc_L-Vektor, der mit den gleichen Endonukleasen geöffnet ist, konstruiert.

Die erfolgreiche Konstruktion der Expressionsvektoren wird durch Basensequenzierungsanalysen bestätigt.

[3] Transfektion von pGbc_S-hGCSF/hGMCSF und pGbc_L-hGCSF/hGMCSF in von Maus-Milchdrüsengewebe abstammende HC11-Zellen und Expressionsinduktion mit laktogenem Hormon 1) Kultur des HC11-Zellenstamms

HC11-Zellen werden in RPMI-Medium, im Handel erhältlich von Gibco BRL, kultiviert, welches mit fetalem Rinderserum bei einer Endkonzentration von 10 %, epidermalem Wachstumsfaktor zu 10 ng/ml, Insulin zu 5 &mgr;g/ml und Gentamicin (Sigma) zu 50 &mgr;g/ml ergänzt ist.

2) Transfektion von pGbc_S-hGCSF, pGbc_S-hGMCSF, pGbc_L-hGCSF und pGbc_L-hGMCSF in HC11-Zellen

Die vier neuen, in der vorliegenden Erfindung konstruierten Plasmide werden unter Verwendung von QIAGEN-tip 100, im Handel erhältlich von Qiagen Company, gemäß dem von Qiagen Company empfohlenen Protokoll gereinigt. Die Einführung der gereinigten Plasmide in HC11-Zellen wird unter Verwendung eines von Invitrogen hergestellten Elektroporators durchgeführt. Ein detailliertes Verfahren folgt dem vom Lieferanten empfohlenen Protokoll.

3) Selektion mit Antibiotika

Die HC11-Zellen werden in T25-Kolben überführt und 24 – 48 Stunden in einem Inkubator kultiviert, der bei 5 % CO2 und 37 °C gehalten wird, wonach das Kulturmedium mit frischem RPMI 1640-Medium (Gibco BRL) ausgetauscht wird, das mit fetalem Rinderserum bei einer Endkonzentration von 10 %, epidermalem Wachstumsfaktor zu 10 ng/ml, Insulin zu 5 &mgr;g/ml und den Antibiotika Gentamicin (Sigma) zu 50 &mgr;g/ml und Geneticin (Sigma) zu 200 &mgr;g/ml ergänzt ist, um die transfizierten Zellen zu selektieren.

4) Expressionsinduktion mit laktogenem Hormon

Nach der Selektion wird das selektive Medium mit Induktionsmedium ausgetauscht, das RPMI 1640-Medium (Gibco BRL) umfasst, welches mit Insulin bei einer Endkonzentration von 5 &mgr;g/ml, Geneticin (Sigma) zu 200 &mgr;g/ml, Gentamicin zu 50 &mgr;g/ml, Ziegen-Prolactin zu 5 &mgr;g/ml und Dexamethasone zu 1 &mgr;M ergänzt ist. Die Zellen werden in einem 5 % CO2, 37 °C- Inkubator 4 Tage lang ohne Auffrischen des Mediums kultiviert.

5) Expressionsniveau-Assay

Die humanen physiologischen aktivierenden Substanzen, die als Ergebnis der Exspressionsinduktion ihrer Gene erzeugt werden, werden in das Medium sekretiert. Eine Western-Blotting-Technik wird für die qualitative Analyse der sekretierten Produkte verwendet, während ein Enzyme-linkedimmunosorbent-Assay (ELISA) zur quantitative Analyse dient. Als primärer Antikörper für das Western-Blotting werden ein monoklonaler oder polyklonaler Anti-Human-G-CSF-Maus-IgG-Antikörper für die Analyse der Expression des humanen Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktors und Anti-Human-GM-CSF-Maus-IgG für die Analyse der Expression des humanen Granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierenden Faktors verwendet. Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes Anti-Maus-IgG wird als sekundärer Antikörper für das Western-Blotting verwendet. Für den ELISA werden zuerst polyklonale Anti-Human-G-CSF-Ziegen-IgG-Antikörper oder polyklonale Anti-Human-GM-CSF-Ziegen-IgG-Antikörper an Platten mit 96 Vertiefungen angebracht, die dann mit dem exprimierten Produkt als entsprechendem Antigen oder mit einem im Handel erhältlichen, als Standard verwendeten Faktor behandelt werden. An diese wurde der monoklonale Anti-Human-G-CSF- oder Anti-Human-CGM-CSF-Antikörper geknüpft, welcher der gleiche wie der im Western-Blotting verwendete ist. Die resultierenden Antikörper-Komplexe werden mit monoklonalem an alkalische Phosphatase konjugiertem Anti-Maus-IgG-Antikörper mit dem Ziel der Induktion einer Farbreaktion behandelt. (Ed Harlow und Davis Lane (1989) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).

[4] Expression in transgener Maus 1) Reinigung der Vektoren für die Transfektion

Für die Reinigung der Vektoren für die Transfektionen aus E. coli werden QIAGEN-tip 100 (Qiagen) und Elutip (Schleicher & Schuell) verwendet. Zuerst werden die Vektoren für die Transfektion mit Hilfe von QIAGEN-tip 100 gereinigt. Die gereinigten Vektoren werden mit Restriktionsenzymen verdaut, gefolgt von einer Extraktion mit einem Geneclean II-Kit. Die extrahierten Vektoren werden weiter unter Befolgung des Protokolls, das von Schleicher & Schuell empfohlen wird, gereinigt und dann in einer Lösung dialysiert, die 10 mM Tris·Cl (pH 7,2) und 10 mM EDTA umfasst, um einen Vektor in einer Menge von 40 ng/ml zu erzeugen, der später für eine Mikroinjektion verwendet wird.

2) Mikroinjektion

Der endgereinigte Expressionsvektor wird durch Mikroinjektion in die männliche pronukleäre Stelle der Zygote einer Maus der CBA-Linie eingeführt. Diese Zygote wird unter Verwendung einer chirurgischen Operationstechnik in die Gebärmutter ein Leihmutter eingenistet.

3) Isolierung von genomischer DNA und Geninduktions-Assay

Den Nachkommen der Leihmutter werden die Schwänze abgeschnitten. Aus diesen wird gemäß einem bekannten Verfahren (Vilotte, J.-L. et al., (1989) Eur. J. Biochem. 186, 43-48) genomische DNA isoliert und gereinigt. Ob das gewünschte Gen korrekt in die Maus eingeführt ist oder nicht, wird durch geeignete Verfahren, einschließlich Southern-Blotting und PCR, identifiziert.

4) Milchextraktion und Expressionsniveau-Assay

Man lässt die Mäuse-Nachkommenen, in welche die Gene korrekt eingeführt sind, sich mit nicht-transgenen, normalen Mäusen paaren, um Nachkommen der nächsten Generation zu erzeugen. 10 Tage nach der Geburt werden die transgenen Mäuse, die entbunden hatten, 3 Stunden von ihren Nachkommen getrennt. Nach peritonealer Injektion von Oxytocin wird Milch aus den Mäusen, die entbunden hatten, extrahiert. Das Expressionsniveau der Gene wird auf die gleiche Weise wie auf der Zellebene unter Verwendung von Western-Blotting und ELISA für die qualitative bzw. quantitative Analyse getestet.

Nun wird das Expressionssystem gemäß der Erfindung mit Bezug auf die Zeichnung weiter beschrieben.

In 1 ist eine Genstruktur dargestellt, welche die rekombinanten Vektoren pGbc_S, pGbc_L und pGbc zeigt. Die ersten beiden Vektoren sind für die Expression in Tierzellen konstruiert, während der letztgenannte für die transgene Maus bestimmt ist. Wie in 1 gezeigt, umfasst diese Genstruktur eine Ziegen-&bgr;-Casein-Genexpressionsregulationsregion, eine CSF-Strukturgenregion und eine Rinder-Wachstumshormon-Terminatorregion.

Die &bgr;-Casein-Genexpressionsregulationsregion besteht aus einem partiellen &bgr;-Casein-Exon 1, das sich nur bis zu einem Nukleotid auf der 5'-Seite des Translations-Startkodons erstreckt, und einer 5'-flankierenden Region, welche die Ziegen-&bgr;-Casein-Promotorstelle einschließt.

In der CSF-Strukturgenregion ist "ATG", das Startkodon, geschrieben, um zu betonen, dass es von der zu exprimierenden physiologischen aktivierenden Substanz selbst herrührt. Das hG-CSF-Gen besteht aus 4 Exonen, wohingegen das hGM-CSF-Gen aus 5 Exonen besteht, wofür "Exon 4 oder 5" steht. "TER" bezeichnet das Terminationskodon des CSF-Gens.

In dieser Figur sind die Entfernungen der Regionen nicht proportional zu ihren tatsächlichen Längen.

2 ist die Basensequenz des &bgr;-Casein-Promotors aus der nativen koreanischen Ziege, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird. Die Basensequenz ist mit derjenigen des Capra hircus-&bgr;-Casein-Promotors und -Exons 1 identisch, welche von Roberts, B. T., Ditullio, P., Vitale, J., Hehir, K. und Gordon, K. in Gene (1992) 121, 255-262 mitgeteilt wurde.

In 3 ist schematisch ein Konstruktionsverfahren für den rekombinante Vektor pGbc_S gezeigt. In der Figur spiegelt die Länge jeder Region nicht den Maßstab ihrer tatsächlichen Länge wider. Wenn zwei Linien zu einer Pfeillinie zusammenlaufen, veranschaulicht dies eine Ligierung, während MCS für die Multiklonierungsstelle steht, das PCR-Produkt das Produkt ist, das durch eine Polymerasekettenreaktion erhalten wird, und RSV LTR die Rous-Sarcoma-Virus lange Tandemsequenzwiederholung darstellt. Die dickeren Linien in dem PCR-Produkt und den pGbc_S-Veranschaulichungen bezeichnen das Exon 1 eines Ziegen-&bgr;-Caseingens. Die Restriktionsenyzme sind über ihren eigenen Erkennungsstellen auf den Veranschaulichungen angeordnet.

In 4 ist schematisch ein Konstruktionsverfahren für den rekombinanten Vektor pGbc_L gezeigt. In der Figur spiegelt die Länge jeder Region nicht den Maßstab ihrer tatsächlichen Länge wider. Eine Pfeillinie, in der drei Linien zusammenlaufen, steht für eine Ligierung, MCS steht für die Multiklonierungsstelle, das PCR-Produkt ist das Produkt, das durch eine Polymerasekettenreaktion erhalten wird, und RSV LTR ist die Rous-Sarcoma-Virus lange Tandemsequenzwiederholung. Die dickeren Linien in der PCR-Produkt-, Ziegen-&bgr;-Casein-Promotor- und Exon 1- und pGbc_L-Veranschaulichung bezeichnen das Exon 1 des Ziegen-&bgr;-Caseingens.

In 5 ist schematisch ein Verfahren für die Rekombination zwischen dem Plasmid pGbc_S und dem hGCSF-Gen gezeigt.

In dieser Figur sind die Längen der Plasmide und DNR-Fragmente nur veranschaulichend, spiegeln aber nicht den Maßstab ihrer tatsächlichen Längen wider. Die Restriktionsenyzme sind über ihren eigenen Erkennungsstellen auf den Veranschaulichungen angeordnet. Die Ligierung wird durch die Vereinigung von zwei oder mehr Linien zusammen zu einer Pfeillinie ausgedrückt. Exon-Gene sind durch dickere Linien ausgedrückt als solche, die Intron-Gene ausdrücken. In den pBluescript II SK-hGCSF-, pGbc_S- und pGbc_S-hGCSF-Veranschaulichungen sind Exone und Introne ununterscheidbar ausgedrückt.

In 6 ist schematisch ein Verfahren für die Rekombination zwischen dem Plasmid pGbc_S und dem hGMCSF-Gen gezeigt.

In dieser Figur sind die Längen der Plasmide und DNA-Fragmente nur veranschaulichend, spiegeln aber nicht den Maßstab ihrer tatsächlichen Längen wider. Die Restriktionsenzyme sind über ihren eigenen Erkennungsstellungen auf den Veranschaulichungen angeordnet. Die Ligierung wird durch Vereinigung von zwei oder mehr Linien zu einer Pfeillinien ausgedrückt. Exon-Gene sind durch dickere Linien als solche ausgedrückt, welche Intron-Gene ausdrücken. In der pBluescript II SK-hGMCSF-, pGbc_S- und pGbc_S-hGMCSF-Veranschaulichung sind Exone und Introne ununterscheidbar ausgedrückt.

7 ist ein schematisches Diagramm, das ein Verfahren für die Rekombination zwischen dem Plasmid pGbc_L und dem hGCSF-Gen zeigt.

In dieser Figur spiegelt die jeweilige Länge der Plasmide und DNA-Fragmente nicht den Maßstab ihrer tatsächlichen Länge wider. Die Restriktionsenzyme sind über ihren eigenen Erkennungsstellen auf den Veranschaulichungen angeordnet. Die Linie mit einem Pfeil, in die viele Linien zusammenlaufen, veranschaulicht eine Ligierung. In der Veranschaulichung für das DNA-Fragment, das durch den Verdau des pBluescript II SK-hGCSF-Vektors mit den Restriktionsenzymen Hind III und Xba I erhalten wird, stehen dickere Linien für Exone. In den anderen Veranschaulichungen sind Exone und Introne ununterscheidbar ausgedrückt.

8 ist ein schematisches Diagramm, das ein Verfahren zur Rekombination zwischen dem Plasmid pGbc_L und dem hGMCSF-Gen zeigt.

In dieser Figur spiegelt die jeweilige Länge der Plasmide und DNA-Fragmente nicht den Maßstab ihrer tatsächlichen Länge wider. Die Restriktionsenzyme sind über ihren eigenen Erkennungsstellen auf den Veranschaulichungen angeordnet. Die Linie mit einem Pfeil, in die viele Linien zusammenlaufen, veranschaulicht eine Ligierung. In der Veranschaulichung des DNA-Fragments, das durch den Verdau des pBluescript II SK-hGMCSF-Vektors mit den Restriktionsenzymen Hind III und Xba I erhalten wird, stehen dickere Linien für Exone. In den anderen Veranschaulichungen sind Exone und Introne ununterscheidbar ausgedrückt.

9 zeigt eine Rekombination der pGbc-Vektoren mit dem hGCSF- und hGMCSF-Gen.

In dieser Figur spiegelt die jeweilige Länge der Plasmide und DNA-Fragmente nicht den Maßstab ihrer tatsächlichen Länge wider. Die Restriktionsenzyme sind über ihren eigenen Erkennungsstellen auf den Veranschaulichungen angeordnet. Die Linie mit einem Pfeil, in die viele Linien zusammenlaufen, veranschaulicht eine Ligierung. In Veranschaulichungen des Ziegen-&bgr;-Casein-Promotors und Exons 1 und des PCR-Produkts stehend dickere Linien für Exone.

In 10 ist eine qualitative Analyse der Expression von hGM-CSF in HC11-Zellen durch eine Western-Blotting-Technik gezeigt. Proteine für dieses Western-Blotting werden durch Induktion der Zellen zur Expression aus den HC11-Zellen, einer Zell-Linie, die von dem Maus-Milchdrüsengewebe abstammt, erhalten, welche mit jedem der Säuger-Expressionsvektoren pGbc_S und pGbc_L transfiziert sind, die jeweils ein hGM-CSF-Gen enthalten.

In 11 ist eine quantitative Analyse der Expression von hGM-CSF in HC11-Zellen durch ELISA gezeigt. Proteine für ELISA werden durch Induktion der Zellen zur Expression aus den HC11-Zellen erhalten, die mit jedem der Säuger-Expressionsvektoren pGbc_5 und pGbc_L transfiziert sind, in die ein hGM-CSF-Gen kloniert ist.

In 12 ist eine quantitative Analyse der Expression von hG-CSF in HC11-Zellen durch ELISA gezeigt. Proteine für ELISA werden durch Induktion der Zellen zur Expression aus den HC11-Zellen erhalten, die mit jedem der Säuger-Expressionsvektoren pGbc_S und pGbc_L transfiziert sind, in die ein hG-CSF-Gen kloniert ist.

13 ist eine Fotografie, welche die Elektrophorese von PCR-Produkten von hGCSF-Genen auf einem Agarosegel zeigt. In der Figur bezeichnet die Bahn (+) ein hGCSF-PCR-Produkt, das als Matrize das Plasmid pGbc-hGSF verwendet. Ein PCR-Produkt, das als Matrize die genomische DNA der transgenen Mäuse verwendet, die von einer Leihmaus geboren wurden, in deren Gebärmutter eine mit dem Plasmid pGbc-hGCSF transfizierte Zygote eingenistet worden war, ist auf Bahn TG-2 elektrophoresiert. TG-2.1 steht für die transgenen Nachkommen von TG-2. Auf Bahn (-) wurde ein PCR-Produkt laufen gelassen, das als Matrize die genomische DNA von nicht-transgenen, d.h. normalen Mäusen verwendet.

In 14 ist eine qualitative Analyse durch eine Western-Blotting-Technik der Expression von hG-CSF in von transgenen Mäusen sekretierter Milch gezeigt. Proteine für dieses Western-Blotting werden aus der Milch erhalten, die von transgenen Mäusen sekretiert wurde, in welche die Säuger-Expressionsvektoren pGbc_S und pGbc_L, die jeweils ein hG-CSF-Gen enthielten, eingeführt waren.

In 15 ist eine quantitative Analyse durch ELISA der Expression von hG-CSF in von transgenen Mäusen sekretierter Milch gezeigt. Proteine für ELISA werden aus der Milch erhalten, die von den transgenen Mäusen sekretiert wurde, in welche die Säuger-Expressionsvektoren pGbc_S-hGCSF und pGbc_L-hG-CSF eingeführt waren.

16 zeigt eine quantitative Analyse durch ELISA der Expression von hG-CSF in der von transgenen Mäusen sekretierten Milch. Proteine für ELISA werden aus der Milch erhalten, die von den transgenen Mäusen sekretiert wurde, in welche die Säuger-Expressionsvektoren pGbc_S-hGMCSF und pGbc_L-hGMCSF eingeführt waren.

Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung kann im Licht der folgenden Beispiele erhalten werden, die angegeben sind, um die vorliegende Erfindung zu erläutern, die aber nicht als beschränkend angesehen werden sollten.

BEISPIEL I: Konstruktion der Expressionsvektoren für HC11-Zelle unter Verwendung der Ziegen-&bgr;-Casein-Promotorstelle und des Rinder-Wachstumshormon-Terminators 1) Konstruktion des pGbc_S-Vektors

Aus einem Vektor pBluescript II SK (Stratagene), in den ein DNA-Fragment subkloniert war, das die Promotorstelle, Exon 1, Intron 1 und Exon 2 eines Ziegen-&bgr;-Caseingens einschloss, wurde ein DNA-Bereich, der 501 Nukleotide ab einem Nukleotid auf der 5'-Seite des Translations-Startkodons für Exon 1 abdeckte, durch eine PCR erhalten, welche die Primer CAS-F1 und CAS-R1 verwendete, die eine Basenseguenz von 5'-TGA TCG CGA GTC CAC CAG GCT CTA CTG TC-3' bzw. 5'-GAG AAG CTT AAT GGA TAA TGA TCT GA-3' aufwiesen. Die PCR bestand aus 35 Wärmezyklen, in denen die Erwärmung in der Reihenfolge 3 min bei 94 °C, 1 min bei 55 °C und 1 min bei 72 °C im ersten Zyklus, in der Reihenfolge 1 min bei 94 °C, 1 min bei 55 °C und 1 min bei 72 °C in den Zyklen 2 – 34 und in der Reihenfolge 1 min bei 94 °C, 1 min bei 55 °C und 5 min bei 72 °C im letzten Zyklus durchgeführt wurde.

In einen Säuger-Expressionsvektor pRc/RSV, der mit den Endonukleasen Nru I und Hind III verdaut war, um ihn zu öffnen und sein LTR zu entfernen, wurde das PCR-Produkt, nachdem es mit den gleichen Endonukleasen doppelt verdaut worden war, durch Ligierung inseriert. Im Ergebnis wurde ein neues Plasmid pGbc_S erhalten, wie in 3 zusammengefasst.

2) Konstruktion des pGbc_L-Vektors

Das verkürzte PCR-Produkt von 1) oben wurde mit dem Restriktionsenzym Dra I behandelt. Das so erhaltene Dra I/Hind III-verkürzte DNA-Fragment wurde durch Elektroelution isoliert. Getrennt wurde aus dem Vektor pBluescript II SK (Stratagene), in den ein DNA-Fragment subkloniert war, das die Promotorstelle, Exon 1, Intron 1 und Exon 2 eines Ziegen-&bgr;-Caseingens einschloss, ein Stu I/Dra I-verkürztes DNA-Fragment durch enzymatische Spaltung und durch Isolierung auf Agarosegel erhalten, welches den Promotor und ein partielles Exon 1 einschloss, das sich ab einem Nukleotid auf der Stromaufwärtsseite des Translations-Startkodons erstreckte. Die zwei DNA-Fragmente wurden zusammen in einen pRc/RSV-Vektor inseriert, der durch doppelten Verdau mit den Restriktionsenzymen Nru I und Hind III geöffnet war, um ein neues Plasmid pGbc_L herzustellen. Dieses Verfahren ist in 4 zusammengefasst.

3) Identifikation des pGbc_S- und pGbc_L-Konstrukts

Die erfolgreiche Konstruktion der Plasmide pGbc_S und pGbc_L wurde durch Basensequenzierungsanalyse bestätigt. Die Basensequenzierungsanalyse wurde unter Verwendung eines Sequenase-Kits Ver 2.0, geliefert von Amersham U.S.A., gemäß dem Protokoll des Lieferanten durchgeführt. Für die Sequenzierung wurden zwei Primer V1 und V2 so konstruiert, dass sie eine Basensequenz von 5'-AGG CAA GGC TTG ACC GAC-3' bzw. 5'-GGA GGG GCA AAC AAC AGA TG-3' aufwiesen.

BEISPIEL II: Rekombination zwischen dem hGCSF-Gen und dem Säuger-Expressionsvektor für HC11-Zelle

Gemäß der in den 5 und 7 veranschaulichten Rekombinationsstrategie wurde ein hGCSF-Gen in jeden der Vektoren pGbc_S und pGbc_L inseriert. In der Rekombination war das &bgr;-Casein-Exon 1 direkt mit dem Exon 1 des hG-CSF-Gens verknüpft, während das Translations-Startkodon des Exons 1 des hG-CSF-Gens verfügbar gehalten wurde.

In mehr Einzelheiten wurde zuerst der pUC 19-Vektor, in den ein hG-CSF-Gen subkloniert war, mit BamH I und Xba I verdaut und auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um die resultierenden zwei DNA-Fragmente voneinander zu trennen. Diese zwei DNA-Fragmente, die aus dem Fragment 1 und dem anderen Fragment bestanden, wurden getrennt unter Verwendung eines Geneclean II-Kits, im Handel erhältlich von BIO101, gereinigt. Man nahm an, dass das Fragment 1 Exon 2 bis zum poly(A)-Signal umfasste. Das andere Fragment, das den Vektor und Exon 1 umfasste, wurde mit dem Restriktionsenzym Pst I geschnitten, und dann wurden die kleineren geschnittenen Fragmente auf einem Agarosegel laufen gelassen, um sie voneinander zu trennen. Die Reinigung unter Verwendung eines Geneclean II-Kits, im Handel erhältlich von BI0101, lieferte das Fragment 2, das ein Nukleotid auf der 5'-Seite des Translations-Startkodons bis zu einem Nukleotid auf der 5'-Seite des Exons 2 umfasste. Das Fragment 1 und das Fragment 2 wurden zusammen durch Ligieren in das Plasmid pBluescript II SK inseriert, was ein neues rekombinantes Plasmid pBluescript II SK-hGCSF ergab. Dieses Plasmid wurde doppelt mit den Restriktionsenzymen Hind III und Xba I geschnitten, wodurch man ein modifiziertes hG-CSF-Gen erhielt, das dann in den pGbc_S-Vektor inseriert wurde, der zuvor durch Verdau mit Hind III und Xba I geöffnet worden war. Im Ergebnis wurde ein neues rekombinantes Plasmid pGbc_S-hGCSF erhalten.

Getrennt wurde der pGbc_L-Vektor durch enzymatischen Verdau mit Hind III und Xba I geöffnet. Nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase und Elektrophorese auf einem Agarosegel wurde der geöffnete pGbc_L-Vektor unter Verwendung eines Geneclean II-Kits gereinigt. Ein DNA-Fragment, das durch den Endonuklease-Verdau eines Ziegen-&bgr;-Casein-Promotors erhalten wurde, und ein modifiziertes hGCSF-Genfragment, das durch doppelten Verdau des pBluescript II SK-hGCSF mit Hind III und Xba I erhalten wurde, werden zusammen an den geöffneten Vektor ligiert, was ein neues rekombinantes Plasmid pGbc_L-hGCSF ergibt.

Die erfolgreiche Konstruktion der neuen rekombinanten Plasmide pGbc_S-hGCSF und pGbc_L-hGCSF wurde durch Basensequenzierungsanalyse bestätigt. Die Basensequenzierungsanalyse wurde unter Verwendung eines Sequenase-Kits Ver 2.0, geliefert von Amersham U.S.A., gemäß dem Protokoll des Lieferanten durchgeführt. Für die Sequenzierung wurden drei Primer, V1, V2 und P1 so konstruiert, dass sie eine Basensequenz von 5'-AGG CAA GGC TTG ACC GAC-3', 5'-GGA GGG GCA AAC AAC RGA TG-3' bzw. 5'-CAC TAT TGG TTT TAT TTC-3' aufwiesen.

BEISPIEL III: Rekombination zwischen dem hGMCSF-Gen und den Säuger-Expressionsvektoren pGbc_S und pGbc_L für HC11-Zellen

Die Rekombination wurde unter Befolgen der in den 6 und 8 veranschaulichten Strategie durchgeführt.

Zuerst wurde das hGMCSF-Gen, das in einen pUC19-Vektor subkloniert war, durch Verdau mit den Restriktionsenzymen BamH I und EcoR I und durch Reinigung mit einem Geneclean II-Kit (BI0101) aus einem Agarosegel, auf dem die verdauten DNA-Fragmente elektrophoresiert wurden, extrahiert. Dann wurde das hGMCSF-Gen durch Ligieren an einen pBluescript II SK-Vektor (Stratagene) inseriert, der mit den gleichen Endonukleasen und dann mit einer bovinen alkalischen Phosphatase verdaut worden war, was ein rekombinantes Plasmid pBluescript II SK-hGMCSF lieferte. Aus diesem rekombinanten Plasmid wurde durch Verdau mit Hind III und Xba I, Elektrophorese auf einem Agarosegel und Reinigen mit einem Geneclean II-Kit (BI0101) ein neues Gen gewonnen und dann an einen pGbc_S-Vektor ligiert, der zuvor mit den gleichen Endonukleasen und dann mit einer bovinen alkalischen Phosphatase behandelt worden war, um ein neues Plasmid pGbc_S-hGMCSF zu konstruieren.

Ähnlich wurde ein neues Plasmid pGbc_L-hGMCSF durch Ligieren eines DNA-Fragments, das durch den Endonuklease-Verdau eines Ziegen-&bgr;-Casein-Promotors erhalten wurde, und eines modifizierten hGMCSF-Genfragments, das durch den doppelten Verdau des pBluescript II SK-hGMCSF mit Hind III und Xba I erhalten wurde, an einen geöffneten pGbc_L-Vektor, der durch Behandlung mit den Restriktionsenzymen Hind III und Xba I und dann mit einer bovinen alkalischen Phosphatase erhalten wurde, und durch die Reinigung aus einem Agarosegel konstruiert, auf dem die Elektrophorese vorgenommen wurde.

Die erfolgreiche Konstruktion der Expressionsvektoren wird durch Basensequenzierungsanalyse unter Verwendung der Primer V1, V2 und P1 bestätigt.

BEISPIEL IV: Konstruktion des Vektors für die Transfektion

Säuger-Expressionsvektoren für die Transfektion mit derselben Genstruktur wie der von 1 wurden gemäß der Rekombinationsstrategie von 9 konstruiert. Sie konnten durch Inserieren einer Ziegen-&bgr;-Casein-Promotorstelle, eines Gens einer physiologischen aktivierenden Substanz und eines Rinder-Wachstumshormon-Terminators in einen pBluescript II SK-Vektor (Stratagene) hergestellt werden.

In mehr Einzelheiten wurde aus einem Ziegen-&bgr;-Caseingen oder dessen Fragment ein DNA-Fragment durch Schneiden mit Sac I und Hind III erhalten, welches die Promotorstelle und ein partielles Exon 1 einschloss, das sich bis zu einem Nukleotid auf der Stromaufwärtsseite des Translations-Startkodons erstreckte. Nach einem Reinigungsverfahren, welches die Schritte der Extraktion mit einer 1 : 1-Phenol-Chloroform-Lösung, der Fällung mit 95%-igem Ethanol und des Lösens in destilliertem Wasser umfasste, wurde das DNA-Fragment weiter mit dem Restriktionsenzym Dra I geschnitten. Elektrophorese auf einem Agarosegel unter Verwendung eines Geneclean II-Kits (BI0101) lieferte ein Fragment 1, welches das partielle Exon 1 umfasste.

Getrennt wurde ein DNA-Bereich, der 501 Nukleotide bis zu einem Nukleotid auf der 5'-Seite des Translations-Startkodons des Exons 1 des &bgr;-Caseingens abdeckte, durch eine PCR unter Verwendung der Primer CAS-F1 und CAS-R1 erhalten und dann mit Dra I und Hind III gespalten. Durch Elektroelution wurde ein Fragment 2 erhalten, welches das Exon 1 umfasste.

Die Fragmente 1 und 2 wurden durch Ligieren in einen pBluescript II SK-Vektor (Stratagene) inseriert, der enzymatisch mit Sac I und Hind III und dann mit einer bovinen alkalischen Phosphatase behandelt worden war. Das so erhaltene rekombinante Plasmid wurde durch doppelten Verdau mit Hind III und EcoR I geöffnet. An diese geöffnete Klonierungsstelle wurde ein DNA-Fragment inseriert, in dem ein Gen einer physiologischen aktivierenden Substanz mit einem Rinder-Wachstumshormon-Terminator verknüpft war.

Der Erfolg des obigen Rekombinationsverfahrens wurde durch eine Basensequenzierungsanalyse unter Verwendung des Primers P1 bestätigt.

BEISPIEL 5: Expression von hGMCSF in von Maus-Milchdrüse abstammenden HC11-Zellen

Die Plasmide pGbc_S-hGMCSF und pGhc_L-hGMCSF, die in Beispiel III aus der Rekombination zwischen dem Plasmid pGbc_S und dem hGMCSF-Gen bzw. zwischen dem Plasmid pGbc_L und dem hGMCSF-Gen resultierten, wurden unter Verwendung von QIAGEN-tip 100 (Qiagen) gereinigt, bevor sie in HC11-Zellen eingeführt wurden.

Nachdem sie mit jedem der Plasmide transformiert worden waren, wurden E. coli-Zellen in 150 ml LB-Medium eingeimpft, das Ampicillin in einer Konzentration von 100 &mgr;g/ml enthielt, und 10 Stunden bei 37 °C unter Bewegen inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, und die Plasmide wurden unter Verwendung des von Qiagen empfohlenen Protokolls aus den Zellen gereinigt.

Die Transfektion der gereinigten Plasmide in HC11-Zellen wurde unter Verwendung eines Elektroporators bewerkstelligt, der im Handel von Invitrogen erhältlich ist. HC11-Zellen wurden auf T75-Kolben zur Gewebekultur in einem 5 % CO2, 37 °C-Inkubator dicht gezüchtet, bis sie 80 % der Bodenfläche des Kolbens bedeckten. Danach wurden sie mit einer Trypsin-Lösung (Gibco BRL) zum Aufschwimmen gebracht und mit einem PBS-Puffer suspendiert. Diese Zellsuspension wurden bei 1500 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu ernten, die dann mit einem gekühlten PBS-Puffer gewaschen wurden. Ein kleines Volumen der Zell-Lösung wurde verwendet, um die Zellenzahl zu zählen, und das verbleibende Volumen wurde durch Zentrifugation bei 1500 U/min gefällt. Die gefällte Masse der Zellen wurde mit einem PBS-Puffer so verdünnt, dass sich eine Zellsuspension mit 3 × 106 – 1 × 107 Zellen/500 &mgr;l ergab.

20 &mgr;g des gereinigten Plasmids und 500 &mgr;l der Zellsuspension wurden in eine 0,4 cm-Küvette gegeben, die dann 10 min in Eis gegeben wurde. Nachdem er auf jeden Wert aus 71, 250, 500 und 1000 &mgr;F eingestellt worden war, wurde der Elektroporator bezüglich Spannung und Widerständen kontrolliert. Der Elektroporator wurde 3 min geladen, um Pulse auf die Küvette abzugeben, die in die Kammer des Elektroporators gebracht wurde. Dann wurde die Küvette 10 min in Eis gegeben, wonach die Zellsuspension in der Küvette mit 1 ml eines Wachstumsmediums versetzt wurde und auf 4 ml eines Wachstumsmediums in einem T25-Kolben gegossen wurde. Nach 24-bis 48-stündigem Kultivieren in einem 5 % CO2, 37 °C-Inkubator wurden die Zellen mit frischem RPMI 1640-Medium (Gibco BRL) versorgt, das mit fetalem Rinderserum bei einer Endkonzentration von 10 %, epidermalem Wachstumsfaktor zu 10 ng/ml, Insulin zu 5 &mgr;g/ml und den Antibiotika Gentamicin zu 50 &mgr;g/ml und Geneticin (Sigma) zu 200 &mgr;&mgr;g/ml ergänzt war, um transfizierte Zellen zu selektieren. Das selektive Medium wurde jeden zweiten oder dritten Tag aufgefrischt. Am siebten Tag nach Kultivieren in dem selektiven Medium überlebten nur die Zellen, in welche die Plasmide eingeführt waren. Die transfizierten Zellen wuchsen weiterhin dicht.

Nach der Selektion wurde das selektive Medium durch ein Induktionsmedium ausgetauscht, das RPMI 1640-Medium (Gibco BRL) umfasste, welches mit Insulin bei einer Endkonzentration von 5 &mgr;g/ml, Geneticin (Sigma) zu 200 &mgr;g/ml, Gentamicin zu 50 &mgr;g/ml, Ziegen-Prolactin zu 5 &mgr;g/ml und Dexamethason zu 1 &mgr;M ergänzt war. Die Zellen wurde vier Tage in einem 5 % CO2, 37 °C-Inkubator ohne Auffrischung des Mediums kultiviert.

Der hGMCSF, der als Ergebnis der Expressionsinduktion des Gens produziert wurde, wurde in das Medium sekretiert. Eine Western-Blotting-Technik wurde für die qualitative Analyse des sekretierten Produkts verwendet, während ein Enzymelinked-immunosorbent-Assay (ELISA) für eine quantitative Analyse verwendet wurde. Als primärer Antikörper für das Western-Blotting für die Analyse der Expression des Human-Granulozytenmakrophagenkolonie-stimulierenden Faktors wurde ein Anti-Human-GM-CSF-Maus-IgG verwendet. Ein Meerrettichperoxidase-konjugiertes Anti-Maus-IgG wurde als sekundärer Antikörper für das Western-Blotting verwendet. Für ELISA wurden zuerst polyklonale Anti-Human-GM-CSF-Ziegen-IgG-Antikörper an Platten mit 96 Vertiefungen angebracht, die dann mit dem exprimierten Produkt als entsprechendem Antigen oder mit einem als Standard verwendeten, kommerziell erhältlichen Faktor behandelt wurden. An diese wurden die monoklonalen Anti-Human-GM-CSF-Antikörper geknüpft, welche die gleichen wie die im Western-Blotting verwendeten waren. Die resultierenden Antikörper-Komplexe wurden mit alkalische Phsophatase-konjugiertem monoklonalem Anti-Maus-IgG-Antikörper mit dem Ziel der Induktion einer Farbreaktion behandelt (Ed Harlow und Davis Lane (1989) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).

Die aus dem Western-Blot und ELISA erhaltenen Daten sind in den 10 und 11 angegeben und zeigen, dass die neuen rekombinanten Vektoren pGbc_S und pGbc_L beide induzierten, dass das Protein bei einem Niveau von 40 ng/ml exprimiert wurde.

BEISPIEL VI: Expression von hGCSF in HC11-Zellen

Die Plasmide pGbc_S-hGCSF und pGbc_L-hGCSF, die aus der Rekombination zwischen dem Plasmid pGbc_S und dem hGCSF-Gen bzw. zwischen dem Plasmid pGbc_L und dem hGCSF-Gen resultierten, wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel V unter Verwendung von QIAGEN-tip 100 (Qiagen) gereinigt, bevor sie in HC11-Zellen eingeführt wurden. Die Einführung wurde durch ein Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahren oder ein Elektroporationsverfahren erzielt. Nach der Transfektion ließ eine Kultur in einem selektiven Medium, welches die gleiche Zusammensetzung wie jenes von Beispiel V umfasste, nur Geneticin-resistente Kolonien zurück. Diese durchmusterten Kolonien wurden auf T75-Kolben überführt und darauf dicht gezüchtet. Die Zellen wurden mit einem frischen Induktionsmedium versorgt, das laktogene Hormone, Prolactin und Dexamethason, enthielt, und 4 Tage kultiviert, wonach das Medium und die Zellen durch Zentrifugation getrennt wurden. Der Überstand wurde für eine Western-Blotting-Analyse und ELISA verwendet. Die erhaltenen Daten sind in 12 angegeben und zeigen, dass die neuen rekombinanten Vektoren pGbc_S und pGbc_L beide induzierten, dass das Protein bei einem Niveau von 40 ng/ml exprimiert wurde.

BEISPIEL VII: Expression von hGCSF in transgenen Mäusen

Der neue rekombinante Vektor pGbc-hGCSF, der aus der Rekombination zwischen dem Vektor pGbc und dem hGCSF-Gen resultierte, wurde mit Hilfe von QIAGEN-tip 100 gereinigt und mit den Restriktionsenzymen BssH I und Kpn I verdaut, gefolgt von einer Extraktion mit einem Geneclean II-Kit (BI0101) aus einem Agarosegel. Zur Verwendung in einer Mikroinjektion wurden die extrahierten Vektoren weiter unter Befolgen des von Schleicher & Schuell empfohlenen Protokolls gereinigt und dann in einer Lösung dialysiert, die 10 mM Tris·Cl (pH 7,2) und 10 mM EDTA umfasste, um eine DNA-Lösung mit einer Konzentration von 40 ng/ml zu ergeben.

Der endgereinigte Expressionsvektor wurde mittels Mikroinjektion in die männliche pronukleäre Stelle der Zygote einer Maus der CBA-Linie eingeführt. Diese Zygote wurde in die Gebärmutter einer Leihmutter eingenistet. Aus den Schwänzen der Nachkommen der Leihmutter wurden genomische DNAs isoliert. Mittels PCR wurde identifiziert, welche Maus transgen war, wie in 13 gezeigt, und mit einer Southern-Blotting-Analyse bestätigt.

Man ließ die Mäuse-Nachkommen, von denen bestätigt wurde, dass sie das Gen in ihre genomische DNA eingeführt aufwiesen, sich mit nicht-transgenen normalen Mäusen paaren, um Nachkommen der nächsten Generation zu erzeugen. Zehn Tage nach der Geburt wurden die transgenen Mäuse, die entbunden hatten, 3 Stunden von ihrem Nachwuchs getrennt. Nach peritonealer Injektion von Oxytocin zusammen mit einem Anästhetikum wurde Milch aus den Mäusen extrahiert, die entbunden hatten.

Die Expressionsniveaus der Gene wurden auf die gleiche Weise wie auf der Zellebene unter Verwendung von Western-Blotting und ELISA für die qualitative bzw. quantitaive Analyse getestet. Die in diesen Analysen verwendeten Antikörper waren die gleichen wie diejenigen, die in Beispiel V angeführt wurden. Die Ergebnisse sind in den 14 und 15 angegeben. Aus dem Western-Blot ist es ersichtlich, dass ein Protein aus den transgenen Mäusen das gleiche ist wie kommerziell erhältlicher hGCSF (Gibco BRL) und durch das Milchdrüsengewebe der transgenen Mäuse exprimiert wird, wie in 14 gezeigt. Die Daten des ELISA zeigen, dass der hGCSF bei einem Niveau von 150 ng/&mgr;l exprimiert wird, wie in 15 gezeigt.

BEISPIEL VIII: Expression von hGMCSF in transgenen Mäusen

Der neue rekombinante Vektor pGbc-hGMCSF, der aus der Rekombination zwischen dem Vektor pGbc und dem hGMCSF-Gen resultierte, wurde mit Hilfe von QIAGEN-tip 100 gereinigt und mit den Restriktionsenzymen BssH I und Kpn I vedaut, gefolgt von der Extraktion mit einem Geneclean II-Kit (BI0101) aus einem Agarosegel. Zur Verwendung bei der Mikroinjektion wurden die extrahierten Vektoren weiter unter Befolgen des Schleicher & Schuell empfohlenen Protokolls gereinigt und dann in einer Lösung dialysiert, die 10 mM Tris·Cl (pH 7,2) und 10 mM EDTA umfasste, so dass sich eine DNA-Lösung mit einer Konzentration von 40 ng/ml ergab.

Der endgereinigte Expressionsvektor wurde mittels Mikroinjekton wurde in die männliche pronukleäre Stelle einer Maus-Zygote der CBA-Linie eingeführt. Diese Zygote wurde in die Gebärmutter einer Leihmutter eingenistet. Aus den Schwänzen der Nachkommen der Leihmutter wurden genomische DNAs isoliert. Mittels PCR, gefolgt von einer Bestätigung mit einer Southern-Blotting-Analyse, wurde identifiziert, welche Maus transgen war.

Milch wurde den transgenen Mäusen entnommen und Western-Blotting und ELISA unterzogen. Die Daten der Western-Blotting-Analyse, in denen ein kommerzieller hGMCSF (BIO101) als positive Kontrolle verwendet wurde, zeigen, dass ein Protein aus den transgenen Mäusen hGMCSF ist und durch deren Milchdrüsengewebe exprimiert wird. Aus dem ELISA wurde ermittelt, dass der hGMCSF aus den transgenen Mäusen bei einem Niveau von 130 ng/&mgr;l exprimiert wurde, wie in 16 gezeigt.

Industrielle Anwendbarkeit

Wie vorstehend beschrieben, ermöglichen die erfindungsgemäßen Milchdrüsen-spezifischen Expressionssysteme, welche die &bgr;-Casein-Promotorstelle von nativen koreanischen Ziegen verwenden, dass physiologische aktivierende Substanzen in vivo, d.h. in von Milchdrüsengewebe abstammenden Zellen sowie in transgenen Tieren, produziert werden. Deshalb unterliegen die erhaltenen Proteine einer Posttranslations-Modifikation und können so ihre normale Aktivität im menschlichen Körper aufrechterhalten. Auch machen es die Expressionssysteme gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, die Proteine leicht in großer Menge zu produzieren. Wenn die Proteine auf der Zellebene produziert werden, wird ein laktogenes Hormon als potenter Expressionsinduktor verwendet. Im Fall der transgenen Tiere können die Proteine leicht durch die von diesen sekretierte Milch erhalten werden. So kann die Hinaufskalierung der Produkion der Proteine bis zum indusriellen Ausmaß erzielt werden. Zusätzlich sind die Milchdrüsengewebe-spezifischen Expressionssysteme gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Isolierung und Reinigung der gewünschten Proteine mit Leichtigkeit und Sicherheit vorteilhaft.

Die folgenden sind die großen industriellen Vorteile, welche das Milchdrüsengewebe-spezifische Expressionssystem der vorliegenden Erfindung mit sich bringt.

Erstens können, da die Zielproteine, die in den Milchdrüsengewebe-spezifischen Expressionssystemen produziert werden, welche die &bgr;-Casein-Promotorstelle von nativen koreanischen Ziegen verwenden, der gleichen Posttranslations-Modifikation unterliegen wie die entsprechenden natürlich vorkommenden Proteine, die Zielproteine ihre Aktivität im menschlichen Körper aufrechterhalten. Indem die Beschränkung der herkömmlichen Expressionssysteme unter Verwendung von E. coli als Wirt überwunden wird, können die Expressionssysteme der vorliegenden Erfindung gleichermaßen auf alle Arten der physiologischen aktivierenden Substanzen angewendet werden.

Zweitens ermöglicht der Ziegen-&bgr;-Casein-Promotor, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, dass das begleitete Strukturgen induzierbar in großer Menge exprimiert wird, was zu einer großen Verringerung der Produktionskosten der ensprechenden Proteine führt. Es ist wohlbekannt, dass die Expression des Ziegen-&bgr;-Caseingens in hohem Niveau durch die Hormone aus dem Milchdrüsengewebe, d.h. laktogenen Hormonen, induziert werden kann. Die von Milchdrüsengewebe abstammenden Zellen, die mit den Expressionssystemen transfiziert sind, welche den Ziegen-&bgr;-Casein-Promotor verwenden, können die gewünschten Proteine in einer Menge von 40 ng/ml durch die Behandlung einer Spurenmenge eines Induktors, eines laktogenen Hormons, produzieren, während die transgenen Tiere mit den Expressionssystemen die gewünschten Proteine in einer Menge von 130 – 150 ng/&mgr;l durch die eigenen Hormone der Tiere produzieren können. Unseres Wissens ist es möglich, größere Mengen dieser Produkte zu erhalten, indem die Länge der Ziegen-&bgr;-Casein-Promotorstelle und die Expressionsbedingungen modifiziert werden. Deshalb schlägt die vorliegende Erfindung ein neues Massenproduktionsverfahren für Proteine vor.

Drittens kann die Hinaufskalierung für die Massenproduktion der Zielproteine leicht durch die Mildrüsengewebespezifischen Expressionssysteme der vorliegende Erfindung erzielt werden, ohne dass signifikante Kosten erforderlich sind. Da die Zielproteine in Milch sekretiert werden, kann die Hinaufskalierung einfach durch Erhöhen der Zahl der transgenen Tiere erzielt werden. Dies kann weiter Kosten einsparen, die erforderlich sind, um die Proteinproduktion vom Labormaßstab zum industriellen Maßstab hinaufzuskalieren.

Das heißt, die Produktionskosten der physiologischen aktivierenden Substanzen können durch die Verwendung der Milchdrüsengewebe-spezifischen Expressionssysteme der vorliegenden Erfindung signifikant verringert werden.

Viertens beruht die vorliegende Erfindung auf der Einfachheit und Harmlosigkeit der aus der Milchdrüse sekretierten Proteine. Es gibt wenige Arten von Proteinen, die in Milchdrüsengeweben exprimiert werden, so dass die Proteine jeweils durch gewöhnliche Techniken isoliert werden können. Weiter werden keine schädlichen Proteine aus der Milch nachgewiesen.

Die vorliegende Erfindung ist auf erläuternde Weise beschrieben worden, und es sollte verstanden werden, dass die verwendete Terminologie beschreibender, nicht beschränkender Natur sein soll. Viele Modifikationen und Abwandlungen der vorliegenden Erfindung sind im Licht der obigen Lehren möglich. Zum Beispiel können andere verschiedene physiologische aktivierende Substanzen durch die Expressionssysteme der Erfindung mit ein wenig Hilfe der wohlbekannten DNA-Rekombinationstechniken exprimiert werden. Deshalb sollte die vorliegende Erfindung nicht nur auf die Expression von hG-CSF oder hGM-CSF beschränkt werden, welche in der Beschreibung erläutert sind. Es versteht sich, dass innerhalb des Bereichs der beigefügten Ansprüche die Erfindung anders als speziell beschrieben durchgeführt werden kann.


Anspruch[de]
  1. Rekombinanter Vektor pGbc (KCTC 0515BP) mit einer &bgr;-Casein-Promotorstelle aus nativen koreanischen Ziegen.
  2. Rekombinanter Vektor pGbc_L (KCTC 0514BP) mit einer &bgr;-Casein-Promotorstelle aus nativen koreanischen Ziegen.
  3. Rekombinanter Vektor pGbc_S (KCTC 0513BP) mit einer &bgr;-Casein-Promotorstelle aus nativen koreanischen Ziegen.
  4. Verfahren zur Herstellung gewünschter Proteine, bei welchem die gewünschten Proteine in aus Milchdrüsengewebe abgeleiteten Zellen exprimiert werden, welche mit dem pGbc_L-Vektor oder dem pGbc_S-Vektor transfiziert werden.
  5. Verfahren zur Herstellung gewünschter Proteine, bei welchem die gewünschten Proteine in Zellen der Milchdrüse transgener nicht-menschlicher Säugetiere mit dem pGbc-Vektor exprimiert werden.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, bei welchem die genannten aus Milchdrüsengewebe gewonnenen Zellen aus der HC11-Reihe sind.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, bei welchem die HC11-Zellen mit einem Gen-tragenden pGbc_L-Vektor oder pGbc_S-Vektor durch Calciumphosphat-Kopräzipitation oder Elektroporation transfiziert werden.
Es folgen 16 Blatt Zeichnungen






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