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Dokumentenidentifikation DE60018203T2 12.01.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001235483
Titel CIS-JASMON ALS SEMIO-CHEMIKALIE
Anmelder Plant Bioscience Ltd., Norwich, Norfolk, GB
Erfinder HICK, Alastair James, Great Shelford, Cambridge CB2 5EH, GB;
PICKETT, John Anthony, Hitchin, Hertfordshire SG4 8EQ, GB;
WADHAMS, Lester John, Harpenden, Hertfordshire AL5 5NB, GB;
NAPIER, Johnathan Andrew, Bedminster, Bristol BS3 3EB, GB
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 60018203
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 11.12.2000
EP-Aktenzeichen 009855271
WO-Anmeldetag 11.12.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/GB00/04733
WO-Veröffentlichungsnummer 0001041568
WO-Veröffentlichungsdatum 14.06.2001
EP-Offenlegungsdatum 04.09.2002
EP date of grant 16.02.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.01.2006
IPC-Hauptklasse A01N 35/06(2006.01)A, F, I, ,  ,  ,   

Beschreibung[de]

Gegenstand der Erfindung ist eine neue Verwendung eines Materials als eine Semiochemikalie, zum Beispiel ein Pflanzenstresssignal, und ein Verfahren zum Ändern der Physiologie von Pflanzen, umfassend die Exposition von Pflanzen gegenüber diesem Material.

Es wurde berichtet, dass Methylsalicylat die Schwarze Bohnenblattlaus, Aphis fabae, und die Getreideblattläuse, einschließlich der Großen Getreideblattlaus, Sitobion avenae, abwehrt und auch das Anlocken zu ihren Wirtspflanzen inhibiert. Siehe J. Chem. Ecol. 20, 2565–2574 (1994) (Petterson et al.) und J. Chem. Ecol. 20, 2847–2855 (1994) (Hardie et al.). Es wurde vorgeschlagen, dass dieses Abwehren aus der Beziehung des Methylsalicylats zu Salicylsäure und den induzierbaren Abwehrmechanismen der Pflanze entstand, wobei der Metabolit Methylsalicylat als ein flüchtiges und dadurch externes Signal wirkt; das Vorliegen von Methylsalicylat signalisierte, dass die chemische Abwehr induziert wurde und die anderweitig anlockenden Wirtspflanzen folglich von den Blattlaus-Schädlingen als ungeeignete Wirte wahrgenommen wurden.

In letzter Zeit wurde gezeigt, dass Methylsalicylat auch als ein Resistenz gegen Pflanzenpathogene vermittelndes luftbürtiges Signal wirkt. See Nature 385, 718–721 (1997) (Shulaev et al.). Methylsalicyat wurde initial von Pettersson et al. als eine Blattlaus-Semiochemikalie (zum Beispiel eine das Verhalten kontrollierende Chemikalie oder ein Signal, das anderweitig die Physiologie des Organismus beeinflusst) mittels der Gaschromatographie (GC), die direkt an eine Aufzeichnung einzelner Zellen (Single Cell Recording; SCR) gekoppelt ist, aus den als olfaktorischen Organen dienenden Fühlern identifiziert. In der Folge wurde gefunden, dass mehr als dreißig Insektenspezies, sowohl Pflanzenfresser als auch ihre natürlichen Feinde, aus vier Ordnungen, hochspezifische und empfindliche olfaktorische Rezeptoren für diese Verbindung besitzen.

WO-A-91119512 (Washington State University Research Foundation) offenbart ein Verfahren zum Induzieren von Pflanzenabwehrmechanismen unter Verwendung von Jasmonsäure oder ihren Estern oder substituierte Derivate davon. Die Verbindung induziert die Bildung der Pflanzen-Abwehrproteine, wie zum Beispiel Proteinase-Inhibitoren und kann die Resistenz gegen Insekten, Pathogene oder Viren in Pflanzen durch Induktion der Expression von Pflanzenabwehrgenen fördern. Die Pflanzen können mit der Verbindung durch direkte Applikation auf das Pflanzengewebe oder durch luftbürtige Übertragung der Verbindung kontaktiert werden. Die Expression der Pflanzenabwehrproteine ist beim Schutz der Pflanzen vor den Wirkungen von Insektenattacken nützlich, hindert aber die zur Frage stehenden Insekten nicht daran, die Pflanzen anzugreifen. Die Pflanzen, zusammen mit jedweden unmittelbar benachbarten Pflanzen werden weiterhin von den Räubern angegriffen. Die Wirkung hält überdies im Allgemeinen nur kurz an und klingt nach der Entfernung des Stimulus wieder ab.

Jasmonsäure und Methyljasmonat zusammen mit einer Anzahl anderer Materialien werden auch von Karban und Baldwin in Induced Responses to Herbivory 12–46 (The University of Chicago Press, Chicago, 1997) besprochen.

Ein anderes Material, cis-Jasmon, ist weithin als eine flüchtige Komponente von Pflanzen bekannt, und seine Freigabe kann durch Schädigung, zum Beispiel während des Fressens von Baumwolle, durch Schmetterlingslarven, induziert werden. Siehe J. Chem. Ecol., 21, 1217–1227 (1995) (Loughrin et al.). Es ist ein Duftstoff und ist häufig aufgrund dieser wünschenswerten Eigenschaft verwendet worden.

US-A-4788164 (Che et al./Hoechst Celanese Corporation) offenbart eine Zusammensetzung mit hinhaltender Freigabe, einschließlich eines Duftstoffes oder eines Insekten-Repellents. Ein Beispiel (Beispiel IV) verwendet eine Lösung, die Jasmon enthält, um den Duft von Jasmin zu verleihen.

US 5665344 (Pair et al./Die Vereinigten Staaten von Amerika wie durch den Landwirtschaftsminister vertreten) weist darauf hin, dass gefunden wurde, dass die Zusammensetzungen von cis-Jasmon adulte Lepidoptera anlocken. Das cis-Jasmon kann allein oder in Kombination mit einem oder mehr anderen flüchtigen Stoff(en) der Blüte des Japanischen Geißblatts, insbesondere Linalool und/oder Phenylacetaldehyd, verwendet werden. Es wird darauf hingewiesen, dass Attraktants durch Anlocken der adulten Lepidoptera an attraktizide Köder und/oder Feldfallen für die Kontrolle und Überwachung dieser landwirtschftlichen Schädlinge nützlich sind. Das cis-Jasmon kann mit einem Insektengift oder Pestizid zum Abtöten dieser Schädlinge kombiniert werden.

WO 98 00023 A offenbart ein Verfahren zum Schutz einer Pflanze gegen ein Pathogen, umfassend eine Verbindung, welche die Expression eines Pflanzendefensin-Gens durch Stimulation des Jasmonat-Pfades induziert. Als Induktoren werden Jasminsäure, Jasmonat und Jasmonat-ähnliche Verbindungen beschrieben.

Chemical Abstracts, Vol. 124, Nr. 3; 15. Januar 1996, Abstract Nr. 23889 und J. Agric. Food Chem., Vol. 44, Nr. 1, 1996, Seiten 206–209, beschreibt ein Gemisch, das aus einer Blüte (Japanischem Geißblatt) freigegeben wird, das zum Anlocken von Lepidoptera fähig ist. Das Gemisch enthält 27 Verbindungen.

Chemical Abstracts, Vol. 99, Nr. 21, 21. November 1983; Abstract Nr. 172845 und J. Agric. Food Chem., Vol. 31, Nr. 6, 1983, Seiten 1167–1170, beschreibt das Gemisch, das aus Akazien (Acacia berlandieri und Acacia rigidula) freigegeben wird, das eine Fliege, Cochliomyia homonivorax, anlockt.

Chemical Abstracts, Vol. 114, Nr. 5, 4. Februar 1991; Abstract Nr. 39576, und J. Chem. Ecol., Vol. 16, Nr. 9, 1990, Seiten 2647–2666, untersucht die Riechempfindlichkeit von zwei sympatrischen Spezies von Rice Leaf Folders (Cnaphalocrocis medinalis) für flüchtige Pflanzenstoffe einschließlich cis-Jasmon, gegenüber denen die Insekten empfindlich sind. Die Verbindung wird als ein potenzielles Attraktant gehalten.

Chemical Abstracts, Vol. 126, Nr. 4, 27. Januar 1997; Abstract Nr. 45169 und J. Chem. Ecol., Vol. 22, Nr. 10, 1996, Seiten 1735–1766, beschreibt die Riechempfindlichkeit von Motten gegenüber flüchtigen Pflanzenstoffen, einschließlich cis-Jasmon, für das ein wichtiges Signal gezeigt wird und das als ein potenzielles Attraktant beschrieben wird.

Chemical Abstracts, Vol. 127, Nr. 1, 5. Januar 1998; Abstract Nr. 366208, Helv. Chim. Acta, Vol. 80, Nr. 3, 1997, Seiten 838–850, offenbart die Biosynthese von cis-Jasmon aus Jasmonsäure und Methyl-1,2-didehydrojasmonat in Pflanzen.

Chemical Abstracts, Vol. 113, Nr. 15, 8. Oktober 1990; Abstract Nr. 129467 und Shokubutso No Kagaku Chosetsu, Vol. 24, Nr. 2, 1989, Seiten 147–150, gibt an, dass cis-Jasmon gegenüber der Induktion der Kartoffelknollenbildung inaktiv ist.

Chemical Abstracts, Vol. 122, Nr. 7, 13. Februar 1995; Abstract Nr. 76939 und Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, Nr. 25, 1994, Seiten 11836–11840, beschreibt die Emission flüchtiger Verbindungen aus Baumwollpflanzen, die von Pflanzen fressenden Insekten angegriffen wurden, einschließlich cis-Jasmon.

Biological Abstracts, I, Vol. 96, Philadelphia, PA, USA; Abstract Nr. 467116 und Nature Biotechnology, Vol. 14, Nr. 9, 1996, Seiten 1129–1132, beschreibt die Bildung von Paclitaxel und Baccatin, die von cis-Jasmon in der Zellsuspensionskultur induziert wurden.

Die Datenbank Chemabs [online] Chemical Abstracts Service, Zugriffsnummer 129; 64289 CA und Environ Entomol., Vol. 27, Nr. 2, 1998, Seiten 395–400, offenbart die Anlockung von Käfern durch cis-Jasmon-Zusammensetzungen.

Pesticide Science, Vol. 55, Nr. 3, März 1999 (1999-03), Seiten 225–235, bezieht sich auf semiochemische Verbindungen.

Wir haben nun entdeckt, dass cis-Jasmon auch direkte Signalrollen mit Pflanzen fressenden Blattläusen beim Anlocken von Blattlaus-Räubern und -Parasitoiden und als eine luftbürtige Signal-induzierende Produktion flüchtiger Pflanzenkomponenten, einschließlich des Monoterpens, (E)-&bgr;-Ocimen, das die Nahrungssuche durch Parasitoide stimuliert, aufweist. Diese Signalrolle unterscheidet sich qualitativ von der des biosynthetisch verwandten Methyljasmonats und führt zu einer lang anhaltenden Wirkung nach der Entfernung des Stimulus. Im Gegensatz zu dem, was der Stand der Technik vorschlägt, kann es zum Anlocken von Insekten, die für die Pflanzen, die sich mit unerwünschten Insekten befassen, oder zum Abwehren derselben vorteilhaft sein.

Folglich wird erfindungsgemäß die Verwendung von cis-Jasmon als eine die Physiologie von Pflanzen verändernde Semiochemikalie bereitgestellt.

Eine Semiochemikalie kann als ein chemisches Signal angesehen werden, das eine Verhaltensänderung oder eine andere physiologische Änderung veranlasst, ohne im Allgemeinen jedoch direkt an diesem Verfahren beteiligt zu sein.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von cis-Jasmon als ein Pflanzenstresssignal oder anderweitig, und trifft insbesondere zu, wenn cis-Jasmon an Pflanzen verwendet wird, um auf diese Weise das Abwehren oder Anlocken von Insekten zu veranlassen.

Die Begriffe „vorteilhaft" und „unerwünscht", wenn im Zusammenhang mit Insekten verwendet, geben entweder ihre „Erwünschtheit" für Menschen zu erkennen oder wenn cis-Jasmon an Pflanzen verwendet wird, ihre Erwünschtheit für die betreffende Pflanze zu erkennen. Wenn das cis-Jasmon jedoch an Pflanzen zur Veränderung der Physiologie dieser Pflanzen verwendet wird, ist die Erfindung nicht auf die Fähigkeit der Verbindung beschränkt, vorteilhafte Insekten anzulocken oder unerwünschte Insekten abzuwehren.

cis-Jasmon kann als ein Repellent gegen Pflanzen fressende Insekten, wie zum Beispiel Pflanzen fressende Blattläuse verwendet werden. Es ist jedoch besonders nützlich als ein Attraktant von vorteilhaften Insekten, einschließlich Insektenräubern und Insektenparasitoiden, insbesondere Räubern oder Parasitoiden von Pflanzen fressenden Blattläusen. Es kann auch, durch Andeutung einer Pflanze unter Stress, einige Pflanzenfresser anregen, die scheinbar geschwächte Pflanze anzugreifen.

cis-Jasmon kann zur Induktion der Produktion flüchtiger Pflanzen-Semiochemikalien, wie zum Beispiel (E)-&bgr;-Ocimen, (E,E)-&agr;-Farnesen, (–)-&bgr;-Caryophyllen und (E)-4,8-Dimethyl-1,3,7-nonatrien, verwendet werden. Wir haben gefunden, dass (E)-&bgr;-Ocimen nach der Exposition von Pflanzen gegenüber cis-Jasmon, besonders wenn es zur Induktion der Produktion flüchtiger Semiochemikalien aus Bohnenpflanzen verwendet wird, besonders prävalent ist.

In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur Veränderung der Physiologie von Pflanzen, umfassend die Exposition der Pflanzen gegenüber cis-Jasmon bereitgestellt.

Das cis-Jasmon kann durch Applikation auf die Blätter direkt auf Pflanzengewebe appliziert werden, bevorzugt werden Pflanzen jedoch cis-Jasmon enthaltender Luft ausgesetzt. Das cis-Jasmon wird in einer Konzentration von 10–1000 &mgr;g pro Liter Luft verwendet, besonders günstige Ergebnisse werden jedoch erhalten, wenn das cis-Jasmon in einer Konzentration von 50–200 &mgr;g pro Liter Luft, insbesondere 74–125 &mgr;g pro Liter Luft und besonders im Bereich von 100 &mgr;g pro Liter Luft verwendet wird. Dies könnte erreicht werden, wenn cis-Jasmon in eine enkapsulierte Form zur Freigabe in die Luft gebracht wird.

Das cis-Jasmon kann zum Abwehren von Insekten von den Pflanzen oder zum Anlocken von Insekten an die Pflanzen, wie zum Beispiel dem Abwehren von Pflanzen fressenden Insekten, wie zum Beispiel Blattläusen, führen. Es ist besonders nützlich, wenn es zum Anlocken von Insektenräubern oder Insektenparasitoiden, besonders Räubern oder Parasitoiden Pflanzen fressender Blattläuse führt. Dieses Signal wäre von unermesslichem Wert für die vielen Bereiche, in denen die Regulierung der Gen-Expression, d. h. das „Switch-on" von Genen für die verschiedenen Anforderungen des Pflanzenschutzes, der Ernährung oder dem Zeitpunkt des Ertrags, bevorzugt wäre. Es wird auf das Buch Induced Responses to Herbivory (The University of Chicago Press, Chicago, 1997) von Karban und Baldwin aufmerksam gemacht, in dem der Bedarf an Signalen zur Induktion der Pflanzenabwehr, wie zum Beispiel die, die den Gegenstand der Erfindung bilden, hervorgehoben wird. Die Verwendung eines Signals führt dazu, dass die Pflanzenenergie nicht vergeudet wird. Probleme hinsichtlich der Schädlingsresistenz würden durch nützliche Gene, die ihre Produkte nur exprimieren, wenn sie benötigt werden, umgangen.

Folglich schließt die Erfindung die Verwendung von cis-Jasmon als eine Semiochemikalie ein, welche die Physiologie von Pflanzen verändert, worin das cis-Jasmon zur Bewirkung der Gen-Expression verwendet wird.

Zum besseren Verständnis der Erfindung wird sie nun unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen beschrieben, worin –

1 rücktransformierte mittlere Zahlen von Getreideblattläusen pro 60 Bestockungstrieben von Winterweizen, Triticum aestivum, nach der Behandlung mit cis-Jasmon am 5. Mai und 11. Juni 1999 zeigt, wobei ein Sternchen (*) einen signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungen kennzeichnet;

2 die von Bohnenpflanzen, Vicia faba (Fabaceae), während 48-stündigen Entrainments nach 24-stündiger Exposition gegenüber cis-Jasmon (100 &mgr;g/l in Luft), produzierten (E)-&bgr;-Ocimen-Konzentrationen zeigt;

3 zum Vergleich mit dem vorstehenden cis-Jasmon-Beispiel, von V. faba während 48-stündigen Entrainments nach 24-stündiger Exposition gegenüber Methyljasmonat (100 &mgr;g/l in Luft) produzierte (E)-&bgr;-Ocimen-Konzentrationen zeigt; und

4 die differenzielle Expression einer Gen-spezifischen Sequenz (D251) in Pflanzen von Vicia faba zeigt. Die Gesamt-RNA wurde aus dem Stengel- oder Blattgewebe von Pflanzen, die der Luft, Methyljasmonat oder cis-Jasmon ausgesetzt wurden, isoliert. Es wurden 10 &mgr;g RNA pro Probe geladen und auf einem Formaldehydgel getrennt (Platte A). Die Proben wurden dann an eine Nylonmembran transferiert und mit der D251-Sequenz sondiert (Platte B). Lane 1 = Luftbehandlung (Kontrolle); Lane 2 = Behandlung mit cis-Jasmon; Lane 3 = Behandlung mit Methyljasmonat. Im Fall der aus dem Blattgewebe isolierten RNA resultierte nur die Behandlung mit cis-Jasmon in Up-Regulation.

Folgendes bildet keinen hier beanspruchten erfindungsgemäßen Teil:

cis-Jasmon wurde auch auf Verhaltensaktivität mit den Alata-Formen der Salatblattlaus, Nasonovia ribis-nigri (Homoptera: Aphidiae) in einem 4-Wege-Olfaktometer untersucht, und es wurde als signifikant abwehrend befunden (die mittlere Zahl der Einschlüsse in den Behandlungsarm betrug 2,0 ± 0,58, wohingegen die mittlere Zahl der Einschlüsse in die Kontrollarme 4,3 ± 0,58 betrug; die im Behandlungsarm verbrachte mittlere Zeit betrug 0,5 ± 0,16 Minuten, wohingegen die in den Kontrollarmen verbrachte mittlere Zeit 2,1 ± 0,36 Minuten betrug; P = < 0,05). Die Abwehr wurde auch in vorläufigen Feldversuchen mit Sommermorphen der Hopfenblattlaus, Phorodon humuli, mit der das Fangen in Wasserfallen mit visueller (gelber) Anlockung durch eine langsame Freisetzung von cis-Jasmon (2,05 &mgr;g/Tag/Falle) um 40% reduziert war (P < 0,04).

Es wurden auch Experimente mit dem Fangen in Fallen im Feld unter Verwendung von cis-Jasmon gegen Rapsglanzkäfer (Meligethes spp.) durchgeführt. Anlockende gelbe Schalenfallen in einer Höhe von 1 m und mit einem Abstand von 10 m wurden im Design eines lateinischen Quadrats platziert (eine Reihe des lateinischen Quadrats = ein Replikat; die Fallen werden auf die nächste Reihe des Quadrats rerandomisiert, wenn ein Mittelwert von 10 Käfern pro Falle gefangen wird). Die Fänge in einer Schale ohne Köder wurden mit den Schalen verglichen, die als Köder cis-Jasmon enthielten, das in zwei verschiedenen Raten freigesetzt wurde. Die Analyse wurde mittels ANOVA an Daten des transformierten Gesamtfanges vorgenommen. Die verwendete Transformation betrug x = log10(y + 1), worin x und y die transformierten bzw. nicht transformierten Daten darstellen. Die transformierten Mittelwerte wurden unter Verwendung des LSD-Tests (LSD = Least Standard Difference) verglichen und rücktransformiert, um die in Tabelle 1 ersichtlichen Ergebnisse zu geben.

TABELLE 1. Experimente mit dem Fangen mit Fallen im Feld unter Verwendung von cis-Jasmon gegen Rapsglanzkäfer.

Die Mittelwerte in der gleichen Spalte, gefolgt von den verschiedenen Buchstaben, sind signifikant unterschiedlich. P < 0,05. Die Zahlen in Klammern stellen die prozentuale Reduktion des Fanges in der Falle im Vergleich zur Falle ohne Köder dar.

1 zeigt den Vergleich der mittleren Zahlen der Getreideblattläuse auf mit cis-Jasmon behandelten und nicht behandeltem Land in Feldstudien an fünf Stichprobendaten. Die Daten wurden zur einfacheren Präsentation aus den logarithmischen Werten rücktransformiert. Die Blattlauszahlen waren in Landstücken mit cis-Jasmon konsistent niedriger und unterschieden sich an den letzten zwei Stichprobendaten signifikant von der Kontrolle. Bei den prädominanten Blattlausspezies handelte es sich um Metopolophium dirhodum, die Bleiche Getreideblattlaus. S. avenae und Rhopalosiphum padi waren auch vorhanden, aber die Zahlen waren sehr niedrig. Die Zahlen parasitisierter Blattläuse waren auch niedrig, und es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Behandlungen beobachtet.

Da Semiochemikalien, die als Repellents oder Inhibitoren der Wirtsanlockung für Pflanzen fressende Insekten wirken, die häufig am Prädatismus oder Parasitismus beteiligt sind, wurde auch die Aktivität von cis-Jasmon bei höheren trophischen Konzentrationen untersucht. Folglich wurde gezeigt, dass der Siebenpunkt-Marienkäfer, Coccinella septempunctata (Coleoptera: Coccinellidae), ein wichtiger Blattlausräuber, an eine Quelle der Verbindung im Olfaktometer angelockt wird (die mittlere Anzahl der Beobachtungen im Behandlungsarm betrug 4,1 ± 1,55, wohingegen die mittlere Anzahl der Beobachtungen in den Kontrollarmen 2,4 ± 0,69 betrug; P = < 0,005). Die Responses des Blattlaus-Parasitoiden Aphidius ervi (Hymenoptera: Braconidae), der vorzugsweise Blattläuse angreift, die Pflanzen in den Fabaceae kolonisieren, wurden auch in einem Windtunnel untersucht und wiesen nach, dass cis-Jasmon in einem Single-Choice-Test als Attraktant wirkte (Tabelle 2). Diese Experimente deuten auf eine Verhaltensrolle für cis-Jasmon bei der Beeinflussung der Interaktionen zwischen Pflanzen, Pflanzen fressenden Insekten und ihren Räubern und Parasitoiden hin.

TABELLE 2. Responses von A. ervi im Windtunnel auf synthetische Verbindungen (10 &mgr;g) auf Filterpapier (Single-Choice-Test).

ANOVA-Analyse F = 16,19, P = < 0,01. Die Werte, gefolgt von einem anderen Buchstaben sind bei P = < 0,05 signifikant unterschiedlich (Tukey's Multiple Comparison-Test).

Unter Rückkehr zur beanspruchten Erfindung wurde eine mögliche Rolle für die Verbindung als ein luftbürtiges Pflanzensignal unter Verwendung der Ackerbohne, V. faba (cv. The Sutton) untersucht. Die Pflanzen wurden 24 Stunden in reiner Luft oder in Luft gehalten, die cis-Jasmon bei 100 &mgr;g/l inkorporierte; anschließend wurden Proben von flüchtigen Stoffen, die durch die Pflanze freigegeben wurden, durch Entrainment über 4 Perioden von 48 Stunden, d. h. bis zu 192 Stunden nach dem Ende der Behandlung erhalten. Das cis-Jasmon selbst war nach 48 Stunden nicht nachweisbar. Die (E)-&bgr;-Ocimen-Konzentrationen, die durch die dem cis-Jasmon exponierten Pflanzen freigegeben wurden, erhöhte sich über die Entrainment-Periode von 192 Stunden signifikant und waren in allen 4 Proben 2½- bis 3-mal höher als die von den Kontrollpflanzen (2). Es lag auch von einigen Replikaten eine Steigerung von (E,E)-&agr;-Farnesen, (–)-&bgr;-Caryophyllen und (E)-4,8-Dimethyl-1,3,7-nonatrien vor. Alle diese Verbindungen waren bei der von Pflanzen fressenden Insekten-induzierten Produktion impliziert und erhöhten die Nahrungssuche von Parasitoiden. Das Nonatrien kann auch von Natur aus durch Pflanzen produziert werden, die die Schädigung zur Abwehr gegen Pflanzenfresser imitieren und die folglich für Parasitoide attraktiv sind. (E)-&bgr;-Ocimen und (E,E)-&agr;-Farnesen wurden mit A. ervi im Windtunnel untersucht, und es erwies sich, dass beide Verbindungen im Single-Choice-Test anlockend sind (Tabelle 2). Diese Aktivität und die erhöhten Konzentrationen dieser Verbindungen, die durch V. faba nach der Behandlung mit cis-Jasmon produziert wurden, wiesen darauf hin, dass eine vermehrte Nahrungssuche und Anlockung von A. ervi an die behandelten Pflanzen im Vergleich mit den Kontrollen vorhanden sein könnte. Tatsächlich waren V. faba-Pflanzen, die 48 Stunden nach der Behandlung gewonnen wurden, als die cis-Jasmon-Konzentrationen nicht nachweisbar waren, im Single-Choice-Test signifikant attraktiver für A. ervi im Windtunnel als unbehandelte Pflanzen (Tabelle 3a). Ein Windtunnel-Experiment, in dem A. ervi eine Auswahl behandelter oder nicht behandelter Pflanzen angeboten wurde, wies überdies nach, dass im Vergleich zur Kontrolle über 3-mal so viele Parasitoide in Richtung der mit cis-Jasmon behandelten Pflanze gerichtet waren (Tabelle 3b).

TABELLE 3. Responses von A. ervi im Windtunnel auf V. faba-Pflanzen 48 h nach Exposition gegenüber cis-Jasmon (100 &mgr;g/l in Luft) (a) Single-Choice-Test
&khgr;2 = 6,62 (Kontingenz-Test unter Verwendung von Pearson am GenStat). P = < 0,01.
b) Dual-Choice-Test (behandelte Pflanze versus Kontrollpflanze)
&khgr;2 = 5,762 (&khgr;2-Test). P = 0,05.

Zum Vergleich mit cis-Jasmon untersuchten wir auch die Aktivität von Methyljasmonat mit V. faba unter den gleichen Bedingungen wie für cis-Jasmon. In diesem System erhöhte die Exposition gegenüber Methyljasmonat nicht signifikant die freigegebenen (E)-&bgr;-Ocimen-Konzentrationen (3). Dies weist darauf hin, dass cis-Jasmon, als ein luftbürtiges Signal, Eigenschaften aufweist, die sich von denen von Methyljasmonat unterscheiden. cis-Jasmon ist eng mit der Jasmonsäure verwandt, wobei es sich um das Produkt von weiterer Katabolisierung, d. h. &bgr;-Oxidation, Dehydratation und Decarboxylierung handelt, obwohl die genaue Route noch nicht berichtet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass cis-Jasmon, anstelle lediglich als ein anderer sich von Lipooxygenase herleitender flüchtiger Stoff und eine Senke für Jasmonsäure angesehen zu werden, es vielmehr als ein potenziell wichtiges luftbürtiges Pflanzensignal betrachtet werden sollte, das sich auf andere Aspekte der Pflanzensignalvorgänge bezieht. Es sollte auch zur Kenntnis genommen werden, dass cis-Jasmon viel flüchtiger als Methyljasmonat ist und als solches eine wirksamere Signal-Verbindung darstellen könnte. Wir haben nachgewiesen, dass cis-Jasmon alles andere als biologisch inaktiv ist, sondern bei allen drei in dieser Studie untersuchten trophischen Konzentrationen über eine Aktivität verfügt.

Wir haben deshalb eine Verbindung identifiziert, die zur Induktion der Produktion dieser Verbindungstypen als ein luftbürtiges Signal, nämlich cis-Jasmon, einer extrem benignen Verbindung, die für Menschen ein angenehmes Aroma aufweist, fähig ist.

VERFAHREN Elektrophysiologie

Es wurden Elektroantennogramm-Aufzeichnungen (EAG-Aufzeichnungen) von Alata von N. ribis-nigri unter Verwendung von mit Kochsalzlösung gefüllten Ag-AgCl-Glaselektroden, wie in J. Exp. Biol. 51, 71–97 (1969) (Maddrell), aber ohne die Glucose, hergestellt. Das Insekt wurde durch Kühlen anästhesiert, und der Kopf wurde exzidiert und auf der indifferenten Elektrode aufgezogen. Die Spitze der Aufzeichnungselektrode wurde entfernt, so dass ihr Innendurchmesser gerade weit genug war, um den terminalen Fortsatz der Fühler aufzunehmen. Die Signale wurden durch einen Verstärker mit hoher Impedanz (UN-03b, Syntech) geleitet und auf einem Oszilloskop angezeigt.

Gekoppelte Gaschromatographie (GC)-Elektrophysiologie

Das gekoppelte GC-Elektrophysiologiesystem, in dem der Ablauf aus der Kapillarsäulen-GC simultan zur Fühler-Präparation und an den zuvor beschriebenen GC-Detektor geleitet wird. Siehe Wadhams in Chromatography and Isolation of Insect Hormones and Pheromones (Hrsg. McCaffery et al.) 289–298 (Plenum Press, New York, 1990). Die Trennung der Luft-Entrainment-Probe wurde an einem AI 93 G erreicht, der mit einem kalten On-Column-Injektor und einem Flammenionisationsdetektor (FID) ausgerüstet war. Die Säule (30 m × 0,53 mm ID, HP-1) wurde 2 min bei 40°C gehalten und dann bei 10°C/min auf 250°C programmiert. Das Trägergas war Wasserstoff Die Ausgänge aus dem EAG-Amplifier und des FID wurden simultan an einem Registrierschreiber überwacht.

Olfaktometrie: Blattläuse

Es wurden Verhaltensassays in einem PerspexTM-Olfaktometer, ähnlich dem in J. Entomol. Scand. 1, 63–73 (1970) (Pettersson) beschriebenen, mit einem schwachen Luftstrom der in Richtung des Zentrums von jedem der 4 Seitenarme gerichtet, durchgeführt. Die Testverbindung (1 &mgr;g) in Hexan (10 &mgr;l) wurde auf Filterpapier (Whatman Nr. 1) am Ende eines der Seitenarme gegeben, wobei Hexan allein als eine Kontrolle in den anderen Armen verwendet wurde. Eine Virginopara alata von N. ribis-nigri wurde in das Zentrum der Arena gegeben und ihre Bewegungen über 10 min beobachtet. Der Apparat, der bei 24°C gehalten wurde, wurde von oben durch das Fluoreszenzrohr erleuchtet und wurde alle 2,5 min um 90° rotiert, um jedwede Richtungsverzerrung zu vermeiden. Das Experiment wurde 6-mal wiederholt und die Ergebnisse anhand des Studentschen t-Tests analysiert.

Olfaktometrie: Marienkäfer

Der Apparat und die Methodik waren ähnlich denen, die für Blattläuse (vorstehend) eingesetzt wurden. Die Testverbindung wurde in 0,5 &mgr;l fassenden Microcaps (Drummond Sci. Co.) am Ende von einem der Seitenarme appliziert, und jeder Arm wurde mit feuchtem Filterpapier zur Minimierung der Unterschiede der relativen Feuchtigkeit versehen. In das Zentrum der Arena wurden individuelle C. septempunctata eingeführt und ihre Positionen über 20 min alle 2 min notiert. Das Experiment wurde 8-mal wiederholt und die Ergebnisse wie vorstehend analysiert.

Windtunnel-Studien

Naive weibliche A. ervi wurden, wie in J. Chem. Ecol. 16, 381–396 (1996) (Poppy et al.) beschrieben, in einen Windtunnel geflogen. Die Parasitoide wurden 25 cm in Windrichtung (Single Choice Test) oder 40 cm in Windrichtung (Dual-Choice-Test) des Targets freigesetzt, bei dem es sich entweder um eine Pflanze oder synthetische Verbindung (10 &mgr;g in 10 &mgr;l Hexan) handelte, die auf einen 2 × 1 cm großen Filterpapierstreifen (Whatman Nr. 1), umgeben von einem Ring aus grünem Krepppapier gegeben wurde. Die Anteile der Parasitoide, die auf die synthetischen Chemikalien mit einem gerichteten Flug reagierten, wurden an drei separaten Tagen jeden Tag berechnet. Diese Werte wurden dann einer Logit-Transformation zur Normalisierung der Daten vor der Analyse mittels ANOVA, gefolgt von den Tukey's Post-hoc-Tests unterzogen. Die Anzahl der Parasitoiden, die sich gegen den Wind an das Einzelpflanzentarget richten, wurden aufgezeichnet und einem &khgr;2-Kontingenz-Test (Pearson-Verfahren am GenStat – siehe GenStat 5 Ausschuss. GenStat 5 Reference Manual, Release 3 (Clarendon Press, Oxford, 1993)) zur Bestimmung, ob eine Richtungs-Response mit dem Typ der Pflanzenbehandlung verknüpft war. Die Zahlen, die sich im Dual-Choice-Test an jede Pflanze richteten, wurden mittels eines &khgr;2 zur Bestimmung analysiert, ob eine Pflanze anlockender als die andere war.

Feldstudien

Landstücke (6 m × 6 m) mit Winterweizen, Triticum aestivum (cv. Consort) wurden in einem 5 × 5 quasi-kompletten lateinischen Quadratdesign angeordnet. Die fünf mit cis-Jasmon behandelten Landstücke wurden am 5. Mai und 11. Juni 1999 unter Verwendung einer Handhydraulikvorrichtung bei einer Rate von 50 g Wirkstoff/ha in 200 l/ha wässrigem Ethylan BV (0,1%) gesprüht. Die Kontrolllandstücke waren unbehandelt. Die Getreideblattläuse und parasitisierten Blättläuse wurden bei 8 Gelegenheiten zwischen Anfang Mai und Mitte Juli gezählt. Bei jeder Zählung wurden fünf Bestockungstriebe an 12 getrennten Orten an zwei diagonalen Transekten, insgesamt 60 Bestockungstriebe pro Landstück, untersucht. Transformierte Daten (y = log(y + 1)) wurden ANOVA unterzogen und die Quadratsummen der Behandlungen wurden zum Testen auf signifikante Unterschiede verteilt.

Induktionsstudien

Bohnenpflanzen, V. faba (cv. The Sutton) wurden unter Standard-Gewächshausbedingungen bis zum 2- bis 4-Blattstadium gezogen, an welchem Zeitpunkt die Erde von ihnen abgespült wurde und sie in ofengetrocknete, gewaschenen Sand enthaltende Glassgefäße, mit 3 Pflanzen pro Gefäß, transplantiert wurden. Diese wurden zum Akklimatisieren 1–2 Tage stehen lassen. Die zu behandelnden Pflanzen (drei Behälter mit je drei Pflanzen) wurden 24 h in einem 25 l fassenden Glastank eingeschlossen, wobei entweder cis-Jasmon oder Methyljasmonat (2,5 mg) auf ein Stück Filterpapier (Whatman Nr. 1) appliziert und auf den Boden des Tanks gebracht wurde. Behandelte oder unbehandelte Pflanzen wurden dann in 101 fassende Entrainment-Glasgefäße gegeben und die flüchtigen Stoffe aus jedem über 48-Stunden-Perioden über 192 Stunden gesammelt. Siehe Blight in Chromatography and Isolation of Insect Hormones and Pheromones (Hrsg. McCaffery et al.) 289–298 (Plenum, New York, 1990). Flüchtige Stoffe wurden aus Glasrohren, enthaltend Porapak Q (50 mg), unter Verwendung von frisch destilliertem Diethylether (500 &mgr;l) eluiert und dann auf 100 &mgr;l zur Analyse mittels GC und GC-MS konzentriert.

Analyse

Die GC-Analyse wurde unter Verwendung eines Hewlett Packard 5890 GC, der mit einem Temperatur-programmierbaren On-Column-Injektor und FID ausgerüstet war, durchgeführt. Dieser wurde mit HP-1-Säulen (50 m × 0,32 mm ID) und SPB-35 (30 m × 0,32 mm ID) mit Wasserstoff als Trägergas versehen. Der Ofen wurde 1 min bei 40°C gehalten, dann bei 10°C/min auf 250°C programmiert. Die GC-MS-Analyse wurde unter Verwendung eines Hewlett Packard 5890 GC durchgeführt, der an ein VG Autospec-Massenspektrometer (Fisons Instruments) angeschlossen war. Die Ionisierung erfolgte durch Elektronenstoß bei 70 eV, 230°C. Die GC wurde 5 min bei 30°C aufrechterhalten, dann bei 5°C/min auf 180°C programmiert. Die Nachweisgrenzen für cis-Jasmon in den Entrainment-Proben betrugen 40 pg/Stunde für GC und 400 pg/Stunde für GC-MS. Die anhand der GC/GC-MS identifizierten Verbindungen wurden durch Coinjektion von authentischen Proben auf HP-1-Säulen (nicht polar) und SPB-35-Säulen (polar) identifiziert. Authentische Proben wurden aus gewerblichen Quellen erhalten, mit Ausnahme von (E)-&bgr;-Ocimen, (E,E)-&agr;-Farnesen und (E)-4,8-Dimethyl-1,3,7-nonatrien, die anhand von Standardverfahren wie folgt synthetisiert wurden.

(E,E)-&agr;-Farnesen und (E)-&bgr;-Ocimen

(E,E)-&agr;-Farnesen und (E)-&bgr;-Ocimen wurden aus 3-Methyl-2,5-dihydrothiophen-1,1-dioxid synthetisiert. Siehe J. Chem. Soc. Chem. Comm., 1984, 1323 (Chou et al.). Die Schwefeldioxid-Elimination wurde unter Verwendung von einem Überschuss Lithiumaluminiumhydrid unter Befolgung eines modifizierten Protokolls, das auf dem in Tetrahedron Lett., 1977, 11, 947 (Gaoni) basierte, erreicht.

Einer gerührten Suspension aus Lithiumaluminiumhydrid (1 Gew.-Äquiv.) in einem rückfließenden trockenen Diethylether (10 mmol/ml) wurde tropfenweise über eine Spritze eine Lösung aus dem Dihydrothiophen-1,1-dioxid (1 Äquiv.) in trockenem Diethylether (1 ml) zugefügt. Nach 1-stündigem Rückfluss wurde das gekühlte (0°C) Gemisch mit 15% NaOH (1 ml), Wasser (3 ml) behandelt und das Gemisch durch CeliteTM filtriert. Die Verdampfung des Filtrats unter reduziertem Druck, gefolgt von der Säulenchromatographie über Florisil (100% Hexan) ergab das Produkt als ein farbloses Öl.

4,8-Dimethyl-1,3,7-nonatrien

4,8-Dimethyl-1,3,7-nonatrien wurde in zwei Schritten aus Geraniol synthetisiert. Geraniol (7,0 g, 0,045 mol, 1 Äquiv.), Mangan(IV)-dioxid (100,0 g) und Dichlormethan (500 ml) wurden bei Umgebungstemperatur über Nacht zusammen gerührt. Das Gemisch wurde durch CeliteTM filtriert, und das Filtrat unter Vakuum konzentriert, um Geranial (5,42 g, 80%) zu ergeben. Eine gekühlte (–15°C) gerührte Suspension aus Methyltriphenylphosphoniumiodid (16,0 g, 0,039 mol, 1,1 Äquiv.) in Tetrahydrofuran (50 ml) und Diethylether (50 ml) wurde mit n-Butyllithium (2,5 M; 16 ml, 0,039 mol, 1,1 Äquiv.) behandelt. Nach 0,25 Stunden wurde Geranial (5,42 g, 0,036 mol, 1 Äquiv.) zugefügt, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Umgebungstemperatur rühren lassen. Das Gemisch wurde zwischen Diethylether (200 ml), Wasser (200 ml) und Petrolether, S. P. 40–60°C (200 ml), verteilt und die organische Schicht getrocknet (MgSO4) und unter Vakuum konzentriert, um ein Rohöl zu ergeben, das der Säulenchromatographie über FlorisilTM (100% Hexan) unterzogen wurde, um das Nonatrien als ein farbloses Öl (3,42 g, 64%) zu erhalten.

DIFFERENTIAL DISPLAY

Zur Bestimmung, ob cis-Jasmon zur Induktion von Änderungen der Pflanzengenexpression in der Lage war, wurde das empfindliche Verfahren des Differential Display an RNA durchgeführt, die aus Pflanzen extrahiert wurde, die der Luft, Methyljasmonat oder cis-Jasmon ausgesetzt worden waren. Es wurde beobachtet, dass eine Anzahl der resultierenden PCR-Produkte in Gegenwart von cis-Jasmon Änderungen in ihrer Abundanz erkennen ließen. Zur Bestätigung dieser Beobachtung wurden Bande von Interesse durch Exzision aus dem getrockneten Gel rückgewonnen und mit dem entsprechenden Paar von Oligonukleotid-Primern reamplifiziert. Die resultierenden PCR-Produkte wurden zur Bestätigung der homogenen Beschaffenheit des amplifizierten Produkts kloniert und sequenziert. Diese Sequenzen wurden dann zum Sondieren der aus der Kontrolle oder behandelten Pflanzen von V. faba isolierten RNA verwendet. Wie aus 4 ersichtlich ist, wurde von einer bestimmten Sequenz (D251) gezeigt, dass sie in Blattgewebe nur in Gegenwart von cis-Jasmon up-reguliert wurde. Wenn diese gleiche (klonierte) Sequenz interessanterweise zum Sondieren von aus den Stengelgeweben von V. faba isolierter RNA verwendet wurde, wurde sie in Pflanzen, die mit entweder cis-Jasmon oder Methyljasmonat behandelt wurden, auf ein ähnliches Niveau up-reguliert. Es ist wichtig, dass man zur Kenntnis nimmt, dass die Beschaffenheit des Differential Display-Verfahrens kurze Gen-spezifische Sonden, enthaltend hauptsächlich 3' untranslatierte Regionen transkribierter Sequenzen herbeiführt, und deshalb der funktionelle Teil des differenziell exprimierten Genes unbekannt ist.

Folglich haben wir unter Verwendung des Differential Display und des bestätigenden Northern Blotting gefunden, dass Methyljasmonat und cis-Jasmon scheinbar distinkte Wirkungen auf die Expression von Pflanzengenen aufweisen. In dieser Studie wurde das durch Differential Display angezeigte PCR-Produkt D251 kloniert und zum Sondieren von Northern Blots aus Blatt- und Stengelgeweben von mit Luft, Methyljasmonat und cis-Jasmon behandelten Pflanzen von V. faba verwendet. Hierbei zeigte sich deutlich (4), dass während die D251-Sequenz durch Behandlung mit Dämpfen von beiden Verbindungen in Stengelgewebe up-reguliert wurde, nur cis-Jasmon zu einer Steigerung des Transkript-Niveaus im Steady-state dieser Sequenz in Blattgewebe führte. Folglich weisen die beiden Verbindungen eine distinkte Wirkung auf die Expression des Pflanzengens auf, und die Response dieser Signal-Verbindungen könnte gewebespezifisch sein.


Anspruch[de]
  1. Verwendung von cis-Jasmon als eine Semiochemikalie, welche die Physiologie einer Pflanze verändert, auf die das cis-Jasmon appliziert wird.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das cis-Jasmon zur Veränderung der Physiologie der Pflanze durch Induktion der Expression von einem oder mehreren Genen) der Pflanze verwendet wird.
  3. Verwendung nach Anspruch 2, worin cis-Jasmon als ein Pflanzenstresssignal zur Induktion der Expression von einem oder mehreren Pflanzenstress-bezogenen Genen) verwendet wird.
  4. Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin cis-Jasmon an Pflanzen verwendet wird, um auf diese Weise das Abwehren oder Anlocken von Insekten zu veranlassen.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, worin cis-Jasmon als ein Repellent gegen Pflanzen fressende Insekten verwendet wird.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, worin die Insekten Pflanzen fressende Blattläuse sind.
  7. Verwendung nach Anspruch 4, 5 oder 6, worin cis-Jasmon als ein Attraktant für Insektenräuber oder Insektenparasitoide verwendet wird.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, worin die Insektenräuber oder Insektenparasitoide Räuber oder Parasitoide Pflanzen fressender Blattläuse sind.
  9. Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin cis-Jasmon zur Induktion der Produktion flüchtiger Pflanzen-Semiochemikalien verwendet wird.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, worin die flüchtigen Pflanzen-Semiochemikalien eine oder mehrere Verbindung(en) unfassen, die aus (E)-&bgr;-Ocimen, (E,E)-&agr;-Farnesen, (–)-&bgr;-Caryophyllen und (E)-4,8-Dimethyl-1,3,7-nonatrien ausgewählt sind.
  11. Verwendung nach Anspruch 10, worin die flüchtigen Pflanzen-Semiochemikalien (E)-&bgr;-Ocimen umfassen.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, worin das cis-Jasmon zur Induktion der Produktion von flüchtigen Semiochemikalien von Bohnenpflanzen verwendet wird.
  13. Verfahren zur Veränderung der Physiologie von Pflanzen durch Induktion der Expression von einem oder mehreren Genen) einer Pflanze, auf die das cis-Jasmon appliziert wird, umfassend die Exposition der Pflanzen gegenüber cis-Jasmon.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die Pflanzen der Luft, enthaltend cis-Jasmon, ausgesetzt werden.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, worin das cis-Jasmon in einer Konzentration von 100–1000 &mgr;g pro Liter Luft verwendet wird.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, worin das cis-Jasmon bei einer Konzentration von 100 &mgr;g pro Liter Luft verwendet wird.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, worin cis-Jasmon an Pflanzen verwendet wird, um zum Abwehren oder Anlocken von Insekten zu führen.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, worin cis-Jasmon verwendet wird, um zum Abwehren von Pflanzen fressenden Insekten zu führen.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, worin die Insekten Pflanzen fressende Blattläuse sind.
  20. Verfahren nach Anspruch 17, worin cis-Jasmon an Pflanzen verwendet wird, um zum Anlocken von Insektenräubern oder Insektenparasitoiden zu führen.
  21. Verfahren nach Anspruch 20, worin die Insektenräuber oder Insektenparasitoide Räuber oder Parasitoide von Pflanzen fressenden Blattläusen darstellen.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 21, worin die Produktion flüchtiger Pflanzen-Semiochemikalien induziert wird.
  23. Verfahren nach Anspruch 19, worin die flüchtigen Pflanzen-Semiochemikalien eine oder mehrere Verbindung(en), die aus (E)-&bgr;-Ocimen, (E,E)-&agr;-Farnesen, (–)-&bgr;-Caryophyllen und (E)-4,8-Dimethyl-1,3,7-nonatrien ausgewählt sind, umfassen.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, worin die flüchtigen Pflanzen-Semiochemikalien (E)-&bgr;-Ocimen umfassen.
  25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, worin Bohnenpflanzen dem cis-Jasmon ausgesetzt werden.
Es folgen 3 Blatt Zeichnungen






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