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Dokumentenidentifikation DE60108832T2 12.01.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001209461
Titel Verfahren zum Ablesen von Fluoreszenz
Anmelder Hitachi Software Engineering Co., Ltd., Yokohama, Kanagawa, JP
Erfinder Yokokawa, Naoki, Naka-ku, Kanagawa 231-8475, JP;
Tachibana, Mitsuhiro, Naka-ku, Kanagawa 231-8475, JP
Vertreter BOEHMERT & BOEHMERT, 80336 München
DE-Aktenzeichen 60108832
Vertragsstaaten DE, FR, GB
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 27.11.2001
EP-Aktenzeichen 011281839
EP-Offenlegungsdatum 29.05.2002
EP date of grant 09.02.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 12.01.2006
IPC-Hauptklasse G01N 21/64(2006.01)A, F, I, ,  ,  ,   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung einer Lichtmenge für jeden mehrerer in einer Ebene angeordneter Mikropunkte. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Ablesen von Fluoreszenz auf einem Biochip, auf dem biologische Substanzen, wie beispielsweise DNAs oder Proteine, die mit einer zeitaufgelösten fluoreszierenden Substanz markiert sind, als ein Array mit einer hohen Punktdichte angeordnet sind.

M. Neumann et al. offenbaren in „Capillary array scanner for time-resolved detection and identification of fluorescently labelled DNA fragments", Journal of Chromatography A, Elsevier science, NL, vol. 871, Nr. 1–2, 25. Februar 2000 (2000-02-25), Seiten 299–310 ein Verfahren, bei dem ein Kapillar-Array-Scanner zur zeitaufgelösten Erfassung von Fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmenten, der ein konfokales Fluoreszenzmikroskop umfaßt, das eine räumliche Trennung der individuellen Kanäle ohne ein Übersprechen zuläßt, und ein X-Y-Mikroskop-Abtasttisch verwendet wird, der ein diskontinuierliches bidirektionales Abtasten ermöglicht. Das Verfahren umfaßt einen ersten Schritt eines Bestrahlens eines ersten Punktes mit einem Erregungslicht und einen zweiten Schritt eines Erfassens von Fluoreszenz vom ersten Punkt, wobei diese beiden Schritte für einen zweiten Punkt wiederholt werden.

Bei momentan praktizierten Verfahren zur Analyse von chemischen und physikalischen Eigenschaften biologischer Substanzen, wie beispielsweise der DNA und von Proteinen, wird häufig Fluoreszenz verwendet. Bei diesen Verfahren wird ein Biochip verwendet, auf dem biologische Substanzen, wie beispielsweise DNAs oder Proteine mit einem eine Fluoreszenzsubstanz umfassenden Marker markiert und in einem Mikropunkt-Array hoher Dichte angeordnet sind. Um diese Punkte zu lesen, wird eine Fluoreszenzlesevorrichtung benötigt, welche die Punkte mit einem Laserstrahl abtastet, um die auf jedem Punkt auf dem Biochip vorliegende fluoreszierende Markierung anzuregen, so daß die angeregte Fluoreszenz von jedem Punkt gelesen werden kann.

7 ist eine schematische Ansicht einer herkömmlichen Fluoreszenz-Lesevorrichtung. Ein Biochip 101 ist durch eine rechtwinklige Glasplatte gegeben, deren Oberfläche mit DNAs versehen ist, die mit einer Fluoreszenzsubstanz Cy3 markiert sind (Anregungswellenlänge: 552 nm, Fluoreszenzwellenlänge: 565 nm, Dauer: 1,3 ns), die als Mikropunkte in einer Matrix entlang der x- und y-Richtung ausgerichtet sind. Der Biochip 101 wird auf einem Tisch 121 angeordnet, der sich schrittweise mittels eines Antriebsmotors für die y-Richtung 103 in die y-Richtung bewegt. Ein über dem Biochip 101 angeordneter Lesekopf 111 wird mittels eines Antriebsmotors 114 für die x-Richtung kontinuierlich in die x-Richtung bewegt. Ein von einer Laserlichtquelle 104 ausgesandter Laserstrahl 110 wird über den Lesekopf 111 auf den Biochip 101 eingestrahlt. Die auf dem Biochip 111 erzeugte Fluoreszenz wird mittels eines Photomultipliers 116 über den Lesekopf 111 erfaßt. Die Leselichtquelle 104 emittiert einen Laserstrahl bei einer Wellenlänge von 552 nm, die sich zur Anregung des Markers Cy3 eignet.

Beim Lesen des Biochips 101 wird der Lesekopf 111 unter der Steuerung eines Kontrollrechners 108 mittels des Antriebsmotors 114 für die x-Richtung längs einer x-Achsenschiene 122 kontinuierlich in die x-Richtung bewegt. In ähnlicher Weise wird der Tisch 121, der den Biochip 101 trägt, unter der Steuerung des Kontrollrechners 108 schrittweise entlang einer y-Achsenschiene 123 in die y-Richtung bewegt.

Die 8A bis 8E sind schematische Diagramme, die die Leseordnung der jeweiligen Punkte auf dem Biochip 101 gemäß einem herkömmlichen Leseverfahren zeigen. Die Punkte sind in einer zweidimensionalen Matrix entlang der x- und y-Richtung angeordnet. Ein schwarzer Punkt gibt einen Punkt wieder, dessen Fluoreszenz gelesen wurde, während ein weißer Punkt einen Punkt wiedergibt, dessen Fluoreszenz noch nicht gelesen wurde.

Wie in den 8A bis 8C gezeigt ist, werden die Punkte 119 auf dem Biochip 101 mit dem Laserstrahl mit einer konstanten Rate bestrahlt. Die Bestrahlung durch den Laserstrahl sowie das Lesen der durch die Bestrahlung mit dem Laserstrahl hervorgerufenen Fluoreszenz finden gleichzeitig und kontinuierlich statt. Wie in 8C gezeigt ist, kehrt der Lesekopf 111 zum linken Ende derselben Reihe zurück, sobald das Abtasten einer einzelnen Reihe in der x-Richtung beendet ist. Dann wird der Tisch 121 stufenweise versetzt, um den Biochip 101 über eine der Auflösung entsprechenden Strecke in die y-Richtung zu befördern. Dann wird die nächste Reihe kontinuierlich in der x-Richtung abgetastet, wie in den 8D und 8E gezeigt ist. Durch Wiederholen dieser Schrittreihen wird die gesamte Fläche des Biochips 101 vollständig abgetastet.

Wenn eine fluoreszierende Substanz wie beispielsweise Cy3 zur Markierung einer biologischen Substanz verwendet wird, sollte die Fluoreszenz während der Einstrahlung eines Erregungslichts gelesen werden, da die Dauer der Fluoreszenz kurz ist und lediglich einige wenige ns beträgt. Obwohl das Element zur Erfassung der Fluoreszenz mit einem optischen Filter oder dergleichen versehen ist, der lediglich die Wellenlänge der Fluoreszenz durchläßt und das Erregungslicht sperrt, ist es schwierig, lediglich die Fluoreszenz zu erfassen, wobei das Anregungslicht vollständig abgehalten wird, da die Intensität der Fluoreszenz der fluoreszierenden Markierung außerordentlich schwach ist und lediglich ungefähr 1/1000000 der Intensität des anregenden Laserstrahls beträgt.

Daher sollte eine zeitaufgelöste fluoreszierende Substanz, wie beispielsweise Europium (Dauer: 400 &mgr;S), mit einer im Vergleich zu beispielsweise Cy3 (Dauer: 1,3 ns) sehr großen Fluoreszenzdauer verwendet werden. Abhängig von der relativen Dauer behält die zeitaufgelöste fluoreszierende Substanz, die mit der Strahlung des Laserstrahls angeregt wurde, den Anregungszustand auch noch nach der Bestrahlung durch den Laserstrahl bei. Durch Verwenden dieser Eigenschaft können die Bestrahlung mittels des Laserstrahls und das Lesen der Fluoreszenz asynchron ausgeführt werden, so daß das Lesen der Fluoreszenz nach der Anregung durch die Bestrahlung mit Licht stattfindet, wodurch eine Verschlechterung des S/R-Verhältnisses verhindert wird, die durch Erfassen des anregenden Laserstrahls während des Lesens der Fluoreszenz hervorgerufen wird. Jedoch kann das S/R-Verhältnis der Erfassung der Fluoreszenz der Punkte selbst bei einer Verwendung einer derartigen zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz als Markierung ungünstig sein, da die zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanzen auf dem Biochip mittels einer herkömmlichen Fluoreszenzlesevorrichtung entlang des Einstrahlungswegs des Laserstrahls gelesen werden und somit aufgrund der längeren Dauer resultierende Restfluoreszenz zu einem Rauschen werden und mit dem Lesen des benachbarten Punktes interferieren kann.

Angesichtes der oben erwähnten Probleme ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Lesen von Fluoreszenz bereitzustellen, mit dem eine durch die Restfluoreszenz von einem benachbarten Punkt verursachte Verschlechterung des S/R-Verhältnisses, die aus der Verwendung der zeitaufgelösten Fluoreszenzmarkierung resultiert, verhindert werden kann, um ein Lesen der Fluoreszenz mit einem hohen S/R-Verhältnis zu realisieren.

Abriß der Erfindung

Um die obengenannte Aufgabe zu lösen, wird gemäß dem erfindungsgemäßen Fluoreszenzableseverfahren Fluoreszenz durch Einstrahlen von Erregungslichtlicht auf mehrere Punkte, die in vorgegebenen Intervallen angeordnet sind, wobei jeder Punkt eine Substanz umfaßt, die mit einer zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz markiert ist, und Erfassen der von jedem der mehreren Punkte erzeugten Fluoreszenz gelesen, wobei das Verfahren umfaßt: einen ersten Schritt des Beleuchtens eines ersten Punktes mit Erregungslicht während einer vorgegebenen Zeitspanne; einen zweiten Schritt eines Erfassens von Fluoreszenz, die von dem ersten Punkt erzeugt wird, nachdem er mit dem Erregungslicht beleuchtet wurde; einen dritten Schritt eines Beleuchtens eines zweiten Punktes mit Erregungslicht, wobei der zweite Punkt vom ersten Punkt um eine Strecke entfernt ist, die das Doppelte oder ein Mehrfaches der Strecke zwischen benachbarten Punkten beträgt; und einen vierten Schritt eines Erfassens von Fluoreszenz, die von dem zweiten Punkt erzeugt wird, nachdem er mit Erregungslicht beleuchtet wurde, wobei der dritte und der vierte Schritt wiederholt werden, um die Fluoreszenz aller Punkte zu erfassen.

Die mehreren Punkte können in einer zweidimensionalen Matrix entlang der x- und y-Richtung, in einem konzentrischen Muster oder in einem Spiralmuster angeordnet sein. Ein zweiter Punkt, der vom ersten Punkt um eine Strecke entfernt ist, die das Doppelte oder ein Mehrfaches der Strecke zwischen benachbarten Punkten beträgt, ist typischerweise zwei Punkte vom ersten Punkt entfernt, der gerade einer Fluoreszenzerfassung unterzogen wurde.

Die zeitaufgelöste Fluoreszenzsubstanz gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft eine Fluoreszenzsubstanz, die für eine Dauer von 10 ns oder länger andauert. Beispiele der zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz umfassen Europium (Anregungswellenlänge 326 nm, Fluoreszenzwellenlänge 612 nm, Dauer 400 &mgr;s) und Luziferin. Um die Empfindlichkeit der Detektion zu verbessern, ist eine längere Dauer erstrebenswert.

Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren kann eine unerwünschte Erfassung des Erregungslichts sowie eine unerwünschte Erfassung der von einem bereits erfaßten Punkt ausgesandten zeitaufgelösten Fluoreszenz vermieden werden, wodurch das S/R-Verhältnis der Fluoreszenzdetektion deutlich verbessert wird.

Gemäß einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird Fluoreszenz durch Einstrahlen von Erregungslicht auf mehrere Punkte abgelesen, die auf einer Linie in vorgegebenen Intervallen angeordnet sind, wobei jeder Punkt eine Substanz umfaßt, die mit einer zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz markiert ist, und Detektieren der von jedem der mehreren Punkte erzeugten Fluoreszenz, wobei ein Arbeitsvorgang eines Einstrahlens von Erregungslicht auf einen Punkt während einer vorgegebenen Zeitspanne und eines nachfolgenden Detektierens von Fluoreszenz, welche von diesem Punkt erzeugt wurde, nacheinander für jeden n-ten Punkt ausgeführt wird (wobei n eine ganze Zahl größer oder gleich 2 ist), und dann, wenn der Arbeitsvorgang das Ende der Linie erreicht, das Verfahren zum Anfang der Linie zurückkehrt und für jeden n-ten Punkt (wobei n eine ganze Zahl größer oder gleich 2 ist) beginnend bei einem Punkt der einer Fluoreszenzdetektion noch nicht unterzogen wurde, wiederholt wird.

Des weiteren wird gemäß einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung Fluoreszenz durch Einstrahlen von Erregungslicht auf mehrere Punkte abgelesen, die auf einer Linie in vorgegebenen Intervallen angeordnet sind, wobei jeder Punkt eine Substanz umfaßt, die mit einer zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz markiert ist, und Detektieren der von jedem der mehreren Punkte erzeugten Fluoreszenz, wobei ein Arbeitsvorgang eines Beleuchtens eines Punktes mit Erregungslicht während einer vorgegebenen Zeitspanne und eines nachfolgenden Detektierens von Fluoreszenz, welche von diesem Punkt erzeugt wurde, nacheinander für jeden zweiten Punkt ausgeführt wird, und dann, wenn das Verfahren das Ende der Linie erreicht, das Verfahren zum Anfang der Linie zurückkehrt und für die verbleibenden Punkte wiederholt wird.

Die mit der zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz markierte Substanz kann gemäß dem oben beschriebenen Verfahren zum Ablesen von Fluoreszenz eine biologische Substanz sein.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

1 ist eine schematische Ansicht, in der ein Beispiel einer Fluoreszenzlesevorrichtung gezeigt ist, mit der das erfindungsgemäße Verfahren ausgeführt werden kann;

2A und 2B sind Diagramme zur Darstellung eines konfokalen optischen Systems;

3 ist eine Graphik, die Kurvenformen des Abklingens der Fluoreszenz von Cy3 und Europium zeigt;

4 ist eine Graphik, die eine mit einer konfokalen Objektivlinse erfaßte Lichtverteilung zeigt;

5 ist ein Diagramm, das Zeitpunkte einer Bestrahlung mit einem Laserstrahl, einer Erfassung von Fluoreszenz und zum Bewegen des Kopfes zeigt;

6A bis 6G sind Diagramme zur Darstellung einer Reihenfolge zum Ablesen von Punkten gemäß der vorliegenden Erfindung;

7 ist eine schematische Ansicht, in der eine herkömmliche Fluoreszenzlesevorrichtung gezeigt ist; und

8A bis 8E sind Diagramme zur Darstellung einer Reihenfolge zum Ablesen von Punkten gemäß einem herkömmlichen Verfahren.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Im nachfolgenden wird eine Ausführungsform zur Ausführung der vorliegenden Erfindung in Einzelheiten mit Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben. Darin handelt es sich bei einer als eine Markierung verwendeten zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz um Europium mit einer Anregungswellenlänge von 326 nm, einer Fluoreszenzwellenlänge von 612 nm und einer Dauer von 400 &mgr;s. Jedoch ist die vorliegende Erfindung gleichfalls auf andere zeitaufgelöste Fluoreszenzsubstanzen anwendbar. Die numerischen, in der vorliegenden Beschreibung dargelegten Werte dienen lediglich der Veranschaulichung und stellen keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar.

1 ist eine schematische Darstellung, die ein Beispiel einer Fluoreszenzlesevorrichtung zeigt, mit der das erfindungsgemäße Verfahren ausgeführt werden kann. Ein Biochip 1 ist beispielsweise eine rechteckige Glasplatte mit 25 mm × 75 mm. Die Oberfläche des Biochips 1 ist mit Europium-markierten (mit einer zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz markierten) DNA-Mikropunkten 2 versehen, die jeweils einen Durchmesser von 50 &mgr;m aufweisen und in einem Gittermuster in der x- und y-Richtung angeordnet sind und voneinander um 100 &mgr;m beabstandet sind. Der Biochip 1 wird auf einem Tisch 21 gehalten, der stufenweise entlang einer y-Achsenschiene 23 und mittels eines Antriebsmotors 3 für die y-Richtung bewegt wird. Ein Lesekopf 11, der Teile eines optischen Systems zur Bestrahlung mit einem Laserstrahl und ein optisches System zur Erfassung von Fluoreszenz umfaßt, werden linear entlang einer x-Achsenschiene 22 mittels eines Antriebsmotors 14 für die x-Richtung als Steppermotor bewegt. Die Antriebsmotoren 14 und 3 für die x- bzw. y-Richtung werden mit einem Kontrollrechner 8 gesteuert.

Ein Laserstrahl bei einer Wellenlänge von 326 nm, der von einer Laserlichtquelle 4 ausgesandt wird, ändert seinen Verlauf mittels eines total reflektierenden Spiegels 9 so, daß er sich längs eines optischen Weges 10 für das Bestrahlungslicht ausbreitet, der parallel zur Transferrichtung des Lesekopfes 11 eingerichtet ist und mit einem Pfeil x bezeichnet ist, so daß er auf einen dichromatischen Spiegel 12 einfällt. Da der dichromatische Spiegel 12 so aufgebaut ist, daß er den Erregungslichtstrahl bei einer Wellenlänge von 326 nm reflektiert und Licht anderer Wellenlängen hindurchgehen läßt, wird der sich längs des optischen Weges 10 für das Bestrahlungslicht ausbreitende einfallende Laserstrahl in der Figur vollständig nach unten reflektiert, so daß er auf eine konfokale Objektivlinse 13 einfällt. Die konfokale Objektivlinse 13 ist im Lesekopf 11 angeordnet und von der Oberfläche des Biochips 1 um ihre Brennweite beabstandet, so daß der vom dichromatischen Spiegel 12 reflektierte Laserstrahl verengt und auf die Oberfläche des Biochips 1 als Mikropunktlicht eingestrahlt wird und so daß Licht von der Oberfläche des Biochips 1 konvergiert wird.

Wenn Licht mit einer anderen Wellenlänge als ungefähr 326 nm an der Oberfläche des Biochips 1 erzeugt wird, tritt dieses Licht durch die konfokale Objektivlinse 13 und auch durch den dichromatischen Spiegel 12 in der Figur in der Richtung nach oben hindurch, so daß es auf den total reflektierenden Spiegel 15 einfällt. Hier ändert sich der Verlauf des Lichtes so, daß es sich entlang eines optischen Wegs 16 zur Lichterfassung ausbreitet, der parallel zum optischen Weg 10 zur Lichteinstrahlung des Laserstrahls gerichtet ist, wobei das Licht vom Laserkopf 11 abgegeben wird. Das vom Laserkopf 11 abgegebene Licht breitet sich entlang des optischen Wegs 16 zur Lichterfassung aus, tritt durch ein Filter 5, das einen Durchlaßbereich bei ungefähr 612 nm aufweist (der Wellenlänge von Europium), eine Diaphragmenlinse 17 und eine Lochblendenplatte 18 hindurch und fällt auf einen Photomultiplier 6 ein. Der Photomultiplier 6 erfaßt Photonen und erzeugt einen TTL-Pegel-Puls (L-Pegel: 0 V, H-Pegel: 2,5 V). Die Zahl der vom Photomultiplier 6 pro Zeiteinheit ausgegebenen Pulse ist proportional zur Zahl der Photonen. Der vom Photomultiplier 6 als ein Photonenpuls 7 für Europium ausgegebene Puls wird mittels eines Verstärkers 28 verstärkt, mittels eines A/D-Wandlers 29 in ein Digitalsignal umgewandelt und zum Kontrollrechner 8 ausgegeben.

Bei der Vorrichtung wird ein konfokales optisches System zur Einstrahlung von Erregungslicht und zum Konvergieren von Fluoreszenz verwendet. Der Begriff „konfokal" bezieht sich auf einen Zustand, in dem sich die Lichtquelle und der Lichtdetektor in einer optisch konjugierten Positionsbeziehung im Verhältnis zur Objektivlinse befinden; d.h. von einem Punkt auf der Lichtquelle ausgesandtes Licht wird auf einen Punkt des Detektors konvergiert. Um diesen Zustand zu erreichen, werden, wie in 2A gezeigt ist, vollständig äquivalente Linsensysteme sowohl auf der Einstrahlungsseite 26 als auch auf der Detektionsseite 25 und Lochblenden 18a und 18b vor der Lichtquelle 4 bzw. dem Detektor 6 vorgesehen, wobei die Linsensysteme als konfokale Punkte dienen. In der Praxis wird jedoch der dichromatische Spiegel 12 vorgesehen, um ein Linsensystem zu verwenden, das sowohl für die Einstrahlungsseite als auch die Detektionsseite verwendbar ist, wie in 2B gezeigt ist. Aufgrund dieses Aufbaus wird mit dem vorliegenden konfokalen System lediglich Fluoreszenz von einer Probe bzw. reflektiertes Licht erfaßt (bei dem durchgelassenen Lichtbild handelt es sich nicht um das konfokale Bild). Da die Lichtquelle und der Detektor miteinander über entsprechende Punkte korreliert sind, wird für die Probe lediglich Information von Punkten erhalten. Somit muß die Probe im Inneren abgetastet werden, um eine zwei- oder dreidimensionale Information zu erhalten.

Das von der Laserlichtquelle 4 ausgegebene Laserlicht bei einer Wellenlänge von 326 nm wird in der x-Richtung über den Biochip 1 gerastert, wobei der Laserkopf 11 mit dem Antriebsmotor 14 für die x-Richtung angetrieben wird. Wenn das Laserlicht auf einen Punkt eingestrahlt wird, der eine mit Europium markierte DNA enthält, wird das Europium angeregt und Fluoreszenz erzeugt. Die Menge des erzeugten Fluoreszenzlichts hängt von der Menge der Fluoreszenzsubstanz ab (in diesem Beispiel Europium), die im Punkt enthalten ist.

3 ist eine Grafik, die die Kurvenform des Abklingens der von Cy3 abgegebenen Fluoreszenz 27 und der von Europium ausgesandten zeitaufgelösten Fluoreszenz 20 zeigt. Die horizontalen und vertikalen Achsen geben die Zeit nach einer Bestrahlung mit Erregungslicht bzw. die Fluoreszenzintensität wieder. Die Fluoreszenzintensität ist normiert, so daß die Fluoreszenzintensität unmittelbar nach einer Bestrahlung mit Erregungslicht eins ist. Wie in 3 gezeigt ist, bleibt bei einer zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz, wie beispielsweise Europium, der Erregungszustand sogar nach der Einstrahlung eines Laserstrahls für eine gewisse Dauer erhalten. Diese Eigenschaft kann dazu verwendet werden, die Einstrahlung von Laserlicht und das Ablesen der Fluoreszenz auf asynchrone Weise auszuführen. Dementsprechend kann anders als bei herkömmlichem Cy3 oder anderen fluoreszierenden Substanzen verhindert werden, daß der Erregungslaserstrahl als Rauschen beim Ablesen der Fluoreszenz erfaßt wird. Somit kann ein höheres S/R-Verhältnis als das beim Ablesen herkömmlicher Fluoreszenz (ein S/R-Verhältnis von ungefähr 10) erhalten werden.

Jedoch kann das S/R-Verhältnis beim Ablesen von Fluoreszenz durch die oben beschriebene Eigenschaft der zeitaufgelösten Fluoreszenz verschlechtert werden. Wenn die benachbarten Punkte auf dem Biochip nacheinander mittels des Lesekopfes 11 in der x-Richtung entsprechend der herkömmlichen Abtastungstechnik, die in 8 gezeigt ist, abgelesen werden, wird eine aus der langen Dauer der zeitaufgelösten Fluoreszenz des vorhergehenden Punktes resultierende Restfluoreszenz als Rauschen erfaßt.

4 ist eine Grafik, in der eine Verteilung der Fluoreszenzintensitäten von mittels einer Objektivlinse unmittelbar über dem Ursprung konvergiertem Licht zeigt, wobei ein konfokales System verwendet wird, bei dem eine Fluoreszenzlichtquelle die gesamte Fläche der x- und y-Ebene mit einer gleichen Intensität abdeckt. Die Grafik zeigt eine Normalverteilung, in der die Intensitäten im Verhältnis zum Wert am Ursprung normiert sind. Die Halbwertsbreite beträgt 10 &mgr;m. Da die Größe des Punktes auf dem Biochip 10 &mgr;m × 10 &mgr;m ist, ist die mittlere Intensität im Bereich von (x, y) = (–5 bis 5, –5 bis 5) die vom Zielpunkt stammende Fluoreszenzintensität und die mittlere Intensität im Bereich (x, y) = (5 bis 15, –5 bis 5) die vom benachbarten Punkt stammende Fluoreszenzintensität. Das Verhältnis der vom benachbarten Punkt stammenden Fluoreszenzintensität zur Fluoreszenzintensität vom Zielpunkt beträgt 18,91% und das Verhältnis der Fluoreszenzintensität mit Ursprung vom zwei Punkte vom Zielpunkt entfernten Punkt beträgt 0,04%.

Wenn die Abtastgeschwindigkeit des Lesekopfes 11 in der x-Richtung 1,25 m/s ist, bewegt sich der Kopf in 8 &mgr;s zwischen benachbarten Punkten (10 &mgr;m). Basierend auf der Abklingkurvenform der in 3 gezeigten Fluoreszenz beträgt der Anteil der verbleibenden Fluoreszenzintensität innerhalb von 8 &mgr;s 91,49% und 83,71%, wenn sich der Kopf 11 über eine Strecke von 2 Punkten bewegt (d.h. 16 &mgr;s). In Anbetracht dieser Fluoreszenzabschwächung im Verhältnis zur Zeit beträgt der Anteil der in der Fluoreszenz des Zielpunktes enthaltenen Restfluoreszenz 17,30% für den vorhergehenden Punkt, der gerade abgetastet wurde, und 0,03% für den vom Zielpunkt um 2 Punkte entfernten Punkt. Daher ist gemäß der herkömmlichen Fluoreszenzlesetechnik, bei der Fluoreszenz von in der x-Richtung aufgereihten Punkten nacheinander abgelesen wird, das S/R-Verhältnis ungefähr 5,8, so daß sich aus der Verwendung von zeitaufgelöster Fluoreszenz kein Vorteil ergibt. Gemäß dem vorliegenden Verfahren wurde ein Abtasten mit dem Lesekopf 11 zum Minimieren des Effektes der Restfluoreszenz vom benachbarten Punkt entwickelt.

Im nachfolgenden wird ein Verfahren zum Ablesen von Fluoreszenz gemäß der vorliegenden Erfindung mit Bezugnahme auf die 5 und 6A bis 6G beschrieben. 5 ist ein Diagramm, in dem der zeitliche Ablauf der Einstrahlung eines Laserstrahls, der Erfassung von Fluoreszenz und des Antriebs des Lesekopfes gezeigt sind. 6A bis 6G sind schematische Diagramme zur Veranschaulichung der Reihenfolge zum Lesen von Punkten gemäß der vorliegenden Erfindung. In 6 gibt ein schwarzer Punkt einen Punkt wieder, dessen Fluoreszenz abgelesen wurde, während ein weißer Punkt einen Punkt wiedergibt, dessen Fluoreszenz noch nicht abgelesen wurde.

Wie in 5 gezeigt ist, wird der Lesekopf 11 intermittierend in der x-Richtung bewegt und beispielsweise über jedem zweiten Punkt angehalten. Während der Lesekopf angehalten ist, finden ein Einstrahlen eines Laserstrahls und das Ablesen von zeitaufgelöster Fluoreszenz statt. Das Ablesen der zeitaufgelösten Fluoreszenz wird mit torgesteuerten Ausgangssignalen vom torgesteuerten Photomultiplier 6 ausgeführt. Der Lesevorgang wird nach dem Einstrahlen des Laserstrahls durchgeführt, um den Einfluß des Erregungslaserstrahls zu vermeiden.

6A bis 6G zeigen schematisch die Anordnung der Punkte auf dem Biochip und die Reihenfolge des Lesens der Punkte. Hier wird die Position eines Punktes, bei dem es sich um den „m-ten" in der x-Richtung und um „n-ten" in der y-Richtung handelt, als (m, n) wiedergegeben. Bei diesem Beispiel wird Fluoreszenz, wie in den 6A und 6B gezeigt ist, für jeden zweiten Punkt, d.h. (1, 1), (3, 1), (5, 1) usw. abgelesen. Durch Auslassen jedes zweiten Punktes in der x-Richtung beim Ablesen der Fluoreszenz entsteht kein schädlicher Effekt durch die vom Punkt, der gerade angeregt wurde, stammende zeitaufgelöste Fluoreszenz. Wie in 6B gezeigt ist, bewegt sich der Lesekopf zurück zum Anfang derselben Linie zu einem Punkt, der um einen Punkt gegenüber dem ersten Ablesepunkt (1, 1) in der x-Richtung verschoben ist (d.h. der Punkt (2, 1), nachdem der Lesekopf das Abtasten bis zum Ende der Zeile beendet hat. Wie in den 6C und 6D gezeigt ist, wird derselbe Arbeitsschritt mit denselben Intervallen wiederholt. Mit anderen Worten werden dieses Mal die Punkte in der Reihenfolge (2, 1), (4, 1), (6, 1) usw. abgelesen. Folglich werden durch zweifaches Abtasten alle Punkte auf dieser Zeile vollständig abgetastet.

Als nächstes wird der Tisch 21 mittels des Antriebsmotors 3 für die y-Richtung so bewegt, daß der Biochip 1 im Verhältnis zum Lesekopf 11 um einen Punkt in die y-Richtung befördert wird. Auf ähnliche Weise wird, wie in den 6E und 6F gezeigt ist, das Ablesen der Fluoreszenz für die zweite Zeile für jeden zweiten Punkt in der x-Richtung durchgeführt, d.h. (1, 2), (3, 2), (5, 2) usw. Dann wird durch Zurückbewegen zum Beginn der zweiten Zeile das Ablesen der Fluoreszenz durch den Kopf 11 für die verbleibenden Punkte (2, 2), (4, 2), (6, 2) usw., wie in 6G gezeigt ist, durchgeführt. Dieser Arbeitsschritt wird für alle Punkte auf dem Chip wiederholt. Gemäß diesem Verfahren zum Lesen von Fluoreszenz steigt das S/R-Verhältnis auf ungefähr 3000 an. Jedoch verdoppelt sich näherungsweise die zur Beendigung des Lesens der Fluoreszenz für alle Punkte erforderliche Zeit.

Für eine Fluoreszenzmarkierung mit Cy3 ist das Lesen mit Überspringen gemäß der vorliegenden Erfindung nutzlos, da die Dauer der Fluoreszenz für Cy3, d.h. 1,3 ns, im Vergleich zur Zeit für die Bewegung des Lesekopfes 11 zum benachbarten Punkt (d.h. 8 &mgr;s) ziemlich kurz ist (3). Das herkömmliche sequentielle Abtasten kann zum Lesen einer zeitaufgelösten Fluoreszenz, um ein hohes S/R-Verhältnis zu erhalten, verwendet werden, indem die Zeit zum Verschieben des Kopfes zwischen den Punkten verlängert wird, so daß es der Fluoreszenzdauer der zeitaufgelösten Fluoreszenz angepaßt ist. Da jedoch die Dauer von Europium (400 &mgr;s) 50 mal so lang ist wie die Zeit zum Bewegen des Lesekopfes in der herkömmlichen Weise (8 &mgr;s), benötigt das Ablesen der Fluoreszenz eine Zeit, die ungefähr 25 mal länger ist als die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung. Die zum Ablesen von Fluoreszenz erforderliche Zeit beträgt 5 Minuten für ein herkömmliches Ablesen mit Cy3, 10 Minuten gemäß der vorliegenden Erfindung und bis zu 250 Minuten gemäß dem herkömmlichen Verfahren, bei dem eine zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz verwendet wird, was offensichtlich unpraktisch ist.

Durch Verwenden des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Ablesen von zeitaufgelöster Fluoreszenz kann das S/R-Verhältnis gegenüber einem herkömmlichen Ableseverfahren deutlich verbessert werden, ohne die Ablesedauer stark zu verlängern.

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das aufgrund der Länge der Halbwertsdauer der Fluoreszenzintensitätseigenschaften der zeitaufgelösten Fluoreszenz erzeugte Fluoreszenzrauschen einer zeitaufgelösten Fluoreszenz deutlich verkürzt werden, so daß eine Interferenz mit einem benachbarten Bereich verhindert werden kann und Daten mit einem hohen S/R-Verhältnis erhalten werden.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zum Ablesen von Fluoreszenz durch Beleuchten mehrerer Punkte (2), die in vorgegebenen Intervallen angeordnet sind, mit Erregungslicht, wobei jeder Punkt eine Substanz umfaßt, die mit einer zeit-aufgelösten Fluoreszenzsubstanz markiert ist, und Ablesen der von jedem der mehreren Punkte erzeugten Fluoreszenz mit folgenden Verfahrensschritten:

    ein erster Schritt des Beleuchtens eines ersten Punktes (2) mit Erregungslicht (10) während einer vorgegebenen Zeitspanne;

    ein zweiter Schritt des Ablesens von Fluoreszenz (16), die von dem ersten Punkt (2) erzeugt wird, nach dem er mit dem Erregungslicht (10) beleuchtet wurde;

    ein dritter Schritt des Beleuchtens eines zweiten Punktes (2) mit Erregungslicht (10), wobei der zweite Punkt von dem ersten Punkt eine Strecke entfernt ist, die ein zweifaches oder mehrfaches der Strecke zwischen benachbarten Punkten beträgt; und

    ein vierter Schritt des Ablesens von Fluoreszenz (16), die von dem zweiten Punkt (2) erzeugt wird, nachdem er mit Erregungslicht (10) beleuchtet wurde,

    wobei der dritte und der vierte Schritt wiederholt werden, um die Fluoreszenz aller Punkte abzulesen.
  2. Verfahren zum Ablesen von Fluoreszenz durch Beleuchten mehrerer Punkte (2), die auf eine Linie in vorgegebenen Intervallen angeordnet sind, mit Erregungslicht, wobei jeder Punkt eine Substanz umfaßt, die mit einer zeit-aufgelösten Fluoreszenzsubstanz markiert ist, und Ablesen der von jedem der mehreren Punkte erzeugten Fluoreszenz, wobei die Schritte des Beleuchtens eines Punktes (2) mit Erregungslicht während einer vorgegebenen Zeitspanne und nachfolgendes Ablesen von Fluoreszenz (16), welche von diesem Punkt (2) erzeugt wurde, nacheinander für jeden zweiten Punkt ausgeführt werden, und dann, wenn die Schritte das Ende der Linie erreichen, das Verfahren zurück zum Anfang der Linie geht und für die verbleibenden Punkte wiederholt wird.
  3. Verfahren zum Ablesen von Fluoreszenz nach Anspruch 1 oder 2, wobei die mit der zeitaufgelösten Fluoreszenzsubstanz markierte Substanz eine biologische Substanz ist.
Es folgen 7 Blatt Zeichnungen






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