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Dokumentenidentifikation DE102004032952A1 26.01.2006
Titel Rastermikroskop und Verfahren zur Untersuchung von biologischen Proben mit einem Rastermikroskop
Anmelder Leica Microsystems CMS GmbH, 35578 Wetzlar, DE
Erfinder Knebel, Werner, Dr., 76709 Kronau, DE;
Schroeder, Jan, 68199 Mannheim, DE
Vertreter Reichert, W., Dipl.-Phys.Univ. Dr.rer.nat., Pat.-Ass., 35578 Wetzlar
DE-Anmeldedatum 07.07.2004
DE-Aktenzeichen 102004032952
Offenlegungstag 26.01.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 26.01.2006
IPC-Hauptklasse G02B 21/00(2006.01)A, F, I, ,  ,  ,   
Zusammenfassung Bei einem Verfahren zur Untersuchung von biologischen Proben mit einem Scanmikroskop wird mindestens ein Rasterpunkt wiederholt nacheinander mit einem Manipulationslichtstrahl und einem Anregungslichtstrahl beleuchtet. Der zeitliche Abstand der Beleuchtung mit dem Manipulationslichtstrahl und der Beleuchtung mit dem Anregungslichtstrahl wird verändert und die Ausbeute an Fluoreszenzlicht in Abhängigkeit von dem zeitlichen Abstand gemessen.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von biologischen Proben mit einem Rastermikroskop.

Die Erfindung betrifft auch ein Rastermikroskop mit mindestens einer Lichtquelle zur Erzeugung eines Manipulationslichtstrahls und eines Anregungslichtstrahls, die nacheinander mit einem zeitlichen Abstand mindestens einen Rasterpunkt beleuchten und mit einem Detektor zum Messen der Lichtleistung von von dem mindestens einen Rasterpunkt ausgehendem Fluoreszenzlicht.

In der Scanmikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe emittierte Reflexions- oder Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahles gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.

Speziell in der konfokalen Scanmikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet.

Ein konfokales Rastermikroskop umfasst im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende – die sog. Anregungsblende – fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird über einen Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man eine Punktinformation erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führt. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatennahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealerweise einen Mäander beschreibt. (Abtasten einer Zeile in x-Richtung bei konstanter y-Position, anschließend x-Abtastung anhalten und per y-Verstellung auf die nächste abzutastende Zeile schwenken und dann, bei konstanter y-Position, diese Zeile in negativer x-Richtung abtasten u.s.w.). Um eine schichtweise Bilddatennahme zu ermöglichen, wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht verschoben und so die nächste abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.

Beim Untersuchen von biologischen Proben mit der sogenannten FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) wird das zeitliche Erholungsverhalten eines Probenbereichs nach einem Ausbleichprozess untersucht. Aus DE 102 33 549 A1 ist ein Scanmikroskop, das unter anderem für FRAP-Untersuchungen eingesetzt werden kann, bekannt. Das Scanmikroskop weist eine Lichtquelle, die einen Beleuchtungslichtstrahl zum Beleuchten einer Probe emittiert auf. Der Beleuchtungslichtstrahl verläuft entlang eines Beleuchtungsstrahlenganges und ist mit einer Strahlablenkeinrichtung über bzw. durch eine Probe führbar. Es ist eine weitere Lichtquelle, die einen Manipulationslichtstrahl emittiert vorgesehen, der entlang eines Manipulationsstrahlenganges verläuft. Sowohl der Manipulationslichtstrahl als auch der Beleuchtungslichtstrahl werden von der Strahlablenkeinrichtung über bzw. durch die Probe geführt.

Aus US 6,094,300 ist ein Laserscanningmikroskop mit mindestens zwei Lichtquellen und zwei Strahlablenkeinrichtungen bekannt. Jeder der Lichtquellen ist einer Strahlablenkeinrichtung zugeordnet. Die von den Lichtquellen emittierten Laserlichtbündel können mit den beiden Strahlablenkeinrichtungen unabhängig voneinander die Probe abscannen.

Aus US 2002/0196535 A1 ist ein Verfahren zum Abscannen eines interessierenden Bereichs einer Probe bekannt, wobei unterschiedliche Abtastlinien unter unterschiedlichen Beleuchtungsbedingungen abgetastet werden.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Untersuchung von biologischen Proben mit einem Rastermikroskop anzugeben, das es ermöglicht, anhand bislang nicht genutzter Parameter Aussagen über die Eigenschaften und/oder die Beschaffenheit einer Probe bzw. eines Probenbereichs zu machen.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist:

  • a) Beleuchten mindestens eines Rasterpunktes mit einem Manipulationslichtstrahl und in einem zeitlichen Abstand mit einem Anregungslichtstrahl,
  • b) Messen der Leistung von von dem mindestens einen Rasterpunkt ausgehenden Fluoreszenzlicht,
  • c) Zuordnen der gemessenen Leistung zu dem zeitlichen Abstand in einem Datensatz,
  • d) Beleuchten des mindestens einen Rasterpunktes und/oder mindestens eines anderen Rasterpunktes mit dem Manipulationslichtstrahl und in einem veränderten zeitlichen Abstand mit dem Anregungslichtstrahl,
  • e) Messen der Leistung von von dem mindestens einen Rasterpunkt und/oder von von dem anderen Rasterpunkt ausgehenden Fluoreszenzlicht, und
  • f) Zuordnen der gemessenen Leistung zu dem veränderten zeitlichen Abstand in dem Datensatz.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung ein Scanmikroskop anzugeben, das es ermöglicht, bislang nicht genutzte Parameter zur Beurteilung der Eigenschaften und/oder der Beschaffenheit einer Probe zu ermitteln und dem Benutzer bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch ein Scanmikroskop gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl wiederholt nacheinander auf Rasterpunkte richtbar sind und dass das Rastermikroskop ein Veränderungsmittel zur Veränderung des zeitlichen Abstandes, eine Verarbeitungseinheit, die die jeweils gemessene Leistung dem jeweiligen zeitlichen Abstand zuordnet und so einen Datensatz erzeugt, und ein Datenbankmodul zum Ablegen des Datensatzes umfasst.

Die Erfindung hat den Vorteil, dass die bei herkömmlichen Bleichexperimenten lange Zeitspanne zwischen dem Bleichen und der Aufnahme der ersten Daten nach dem Bleichen erfindungsgemäß drastisch reduziert ist. Vorteilhafterweise können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Dunkelzustände untersucht werden. Dies war bislang rastermikroskopisch nicht oder nur indirekt möglich. Bislang wurde davon ausgegangen, dass die Fluorophore im ausgebleichten Probenbereich weitgehend vollständig irreversibel zerstört werden, beispielsweise durch Bildung von Radikalen. Tatsächlich erfolgt jedoch in der Regel auch eine Anregung in längerlebige Zustände (Größenordnung: &mgr;s), was jedoch bislang mit einem Rastermikroskop nicht beobachtet werden konnte.

In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird mindestens ein Rasterpunkt wiederholt nacheinander mit einem Manipulationslichtstrahl und einem Anregungslichtstrahl beleuchtet. Der zeitliche Abstand der Beleuchtung mit dem Manipulationslichtstrahl und der Beleuchtung mit dem Anregungslichtstrahl wird verändert und die Ausbeute an Fluoreszenzlicht in Abhängigkeit von dem zeitlichen Abstand gemessen. Aus der Abhängigkeit der Ausbeute an Fluoreszenzlicht vom zeitlichen Abstand lassen sich Rückschlüsse auf die Eigenschaften und/oder die Beschaffenheit der Probe ziehen.

Beispielsweise bei FCS-Untersuchungen (Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie) spielen die langlebigen Triplet-Zustände eine sehr störende Rolle, da ein Flurorphor, das in einen Triplet-Zustand angeregt ist, lange Zeit unsichtbar erscheint. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher sinnvoll zur Auswertung von FCS-Untersuchungen verwendet werden.

Der Datensatz kann durch einfaches oder mehrfaches Wiederholen der Schritte d)–f) bei jeweils weiter verändertem zeitlichen Abstand, wobei der mindestens eine und/oder jeweils andere Rasterpunkte beleuchtet werden.

In einer bevorzugten Ausgestaltungsvariante ist der gewonnene Datensatz graphisch, beispielsweise in einem x-y-Diagramm darstellbar.

Der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl können in einer Ausgestaltungsvariante je einen Anteil gleicher Wellenlänge aufweisen. In einer anderen Ausgestaltungsvariante weist der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl zumindest je einen Anteil unterschiedlicher Wellenlänge auf.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltungsvariante bleicht der Manipulationslichtstrahl die Probe in einem zuvor ausgewählten Probenbereich aus.

In einer anderen Variante dient der Manipulationslichtstrahl zum gezielten Aktivieren von Fluoreszenzfarbstoffen und/oder zum Freisetzen von Fluoreszenzfarbstoffen. Bei den Fluoreszenzfarbstoffen kann es sich vorzugsweise um photoaktivierbare fluoreszierende Proteine und/oder um Moleküle, die durch Lichteinwirkung ein- oder ausgeschaltet werden können, handeln. Es ist in einer Variante ermöglicht, mit dem Manipulationslichtstrahl einen Fluoreszenzfarbstoff (z.B. GFP) zu aktivieren, also gewissermaßen „anzuschalten". Der Manipulationslichtstrahl kann hierfür beispielsweise eine Wellenlänge von 405 nm aufweisen. Es kommt durch diese Manipulation zu einer Änderung im Fluoreszenzfarbstoff, der dann mit dem Anregungslichtstrahl, der beispielsweise eine Wellenlänge um 480 nm aufweisen kann, anregbar ist. Die Emission von Fluoreszenzlicht erfolgt im genannten Beispiel bei etwa 520 nm. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann verfolgt werden, wie schnell eine Photoaktivierung (Konformationsänderung) stattfindet. Es ist erfindungsgemäß ermöglicht, gewissermaßen ein Messprotokoll der Photoaktivierung zu erstellen.

Vorteilhafterweise werden die Detektoren des erfindungsgemäßen Scanmikroskops durch das Licht des Manipulationslichtstrahls nicht „geblendet", weil diese erfindungsgemäß nur Licht von den Rasterpunkten empfangen können, die gerade von dem Anregungslichtstrahl beleuchtet werden. Eine Detektortotzeit gibt es bei dem erfindungsgemäßen Scanmikroskop daher nicht, so dass wie bereits erwähnt, auch die Zustände, die bei einem Bleichvorgang angeregt werden (Lebensdauer im Bereich von &mgr;s) untersucht werden können.

In einer bevorzugten Variante wird die Position des Manipulationslichtstrahls in der Probe (also die Ausrichtung auf den zu beleuchtenden Rasterpunkt) mit einer Strahlablenkeinrichtung gesteuert. Die Strahlablenkeinrichtung kann beispielsweise aus einem oder mehreren Galvanometerspiegeln gebildet sein.

In einer Variante ist eine weitere Strahlablenkeinrichtung vorgesehen, die die Position des Anregungslichtstrahls in der Probe steuert.

Besonders bevorzugt ist eine Variante, bei der die Position des Anregungslichtstrahls in der Probe mit der einen Strahlablenkeinrichtung, die auch die Position des Manipulationslichtstrahls in der Probe steuert, gesteuert wird. In dieser Variante sind sowohl der Manipulationslichtstrahls als auch der Anregungslichtstrahl über die Strahlablenkeinrichtung geführt und weisen vorzugsweise einen von Null Grad verschiedenen Winkel zueinander auf, so dass der zeitliche Abstand durch Variieren dieses Winkels veränderbar ist. Beispielsweise kann der Winkel von Zeile zu Zeile geändert werden, um für jede Zeile einen anderen zeitlichen Abstand einzustellen.

Vorzugsweise wird der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl zeilenweise über oder durch die Probe geführt. Die Scanbahn kann hierbei vorzugsweise mäanderförmig ausgebildet sein. Bei schneller Scanbewegung wird sich diese Mäanderform naturgemäß aufgrund der Trägheit der Strahlablenkeinrichtung der Form einer Sinuskurve annähern.

Durch Variieren der Ablenkgeschwindigkeit der Strahlablenkeinrichtung kann in einer besonderen Ausgestaltungsvariante der zeitliche Abstand zwischen dem Beleuchten mit dem Manipulationslichtstrahl und dem Beleuchten mit dem Anregungslichtstrahl variiert werden.

In einer anderen Ausgestaltungsform wird der Manipulationslichtstrahl über eine Strahlablenkeinrichtung und der Anregungslichtstrahl über eine weitere Strahlablenkeinrichtung geführt. Die eine Strahlablenkeinrichtung und die weitere Strahlablenkeinrichtung sind vorzugsweise aufeinander synchronisiert, so dass der zeitliche Abstand durch Variieren der Phase zwischen der einen Strahlablenkeinrichtung und der weiteren Strahlablenkeinrichtung verändert werden kann.

In einer Variante erfolgt die Beleuchtung mit dem Manipulationslichtstrahl beim Zeilenhinlauf und die Beleuchtung mit dem Anregungslichtstrahl beim Zeilenrücklauf. In dieser Variante kann der zeitliche Abstand durch Variieren des räumlichen Abstandes des zu beleuchtenden Rasterpunktes zum Umkehrpunkt zum Zeilenhinlauf und Zeilenrücklauf erfolgen. Vorzugsweise liegen die beleuchteten Rasterpunkte auf einer Bilddiagonalen.

Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Rastermikroskop einen Multibanddetektor. Kombiniert man zwei unterschiedliche Fluorchrome auf ein und demselben Protein oder Molekül-Carrier, erhält man eine einzige Diffusionsrate bei FCS-Untersuchungen in zwei Farbkanälen, jedoch gegebenenfalls unterschiedliche Aussagen über die Dunkelzustände.

Vorzugsweise ist das Rastermikroskop als konfokales Rastermikroskop ausgebildet.

In den Zeichnungen ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Bauteile mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigt:

1 Ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop,

2 ein anderes erfindungsgemäßes Rastermikroskop,

3 eine Illustration des Beleuchtungsvorgangs von Rasterpunkten gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren und

4 ein weiteres erfindungsgemäßes Rastermikroskop.

1 zeigt ein erfindungsgemäßes Rastermikroskop mit einer ersten Lichtquelle 1 und einer weiteren Lichtquelle 2, die Lichtstrahlen 3, 5 unterschiedlicher Wellenlängen emittieren die von einem dichromatischen Strahlteiler 7 zu einem Anregungslichtstrahl 9 vereinigt werden. Das Rastermikroskop beinhaltet eine dritte Lichtquelle 11, die einen Manipulationslichtstrahl 13 emittiert. Der Manipulationslichtstrahl 13 gelangt zur Strahlablenkeinrichtung 15, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 17 beinhaltet und von dieser über den Umlenkspiegel 19 und den Neutralstrahlteiler 21, über die in dieser Darstellung nicht gezeigte Scanoptik und die nicht gezeigte Tubusoptik zum Mikroskopobjektiv 22, das den Manipulationslichtstrahl 13 auf die Probe 23 fokussiert. Die Position des Manipulationslichtstrahls 13 in der Probe bzw. die Position des Fokus des Manipulationslichtstrahls 13 in der Probe 23 ist mit Hilfe der Strahlablenkeinrichtung 15 einstellbar. Der Anregungslichtstrahl 9 passiert die Beleuchtungslochblende 25 und gelangt zum Hauptstrahlteiler 27, der den Anregungslichtstrahl zur weiteren Strahlablenkeinrichtung 29, die einen weiteren kardanisch aufgehängten Scanspiegel 31 beinhaltet, lenkt. Die weitere Strahlablenkeinrichtung 29 führt den Anregungslichtstrahl durch den Neutralstrahlteiler 21, die nicht gezeigte Scanoptik und die nicht gezeigte Tubusoptik hindurch und zum Mikroskopobjektiv 21, das den Anregungslichtstrahl auf die Probe 23 fokussiert. Die Position des Fokus des Anregungslichtstrahls in der Probe 23 ist mit der weiteren Strahlablenkeinrichtung 29 einstellbar. In der gezeigten Ausgestaltungsvariante ist vorgesehen, dass der Manipulationslichtstrahl 13 und der Anregungslichtstrahl 9 zeilenweise über das abzurasternde Scanfeld geführt werden, wobei der Fokus des Manipulationslichtstrahls 13 dem Fokus des Anregungslichtstrahls 9 vorauseilt. Die Strahlablenkeinrichtung 15 und die weitere Strahlablenkeinrichtung 29 sind über die elektronische Einheit 33 aufeinander synchronisiert. Durch Einstellen der relativen Phase zwischen den beiden strahlablenkenden kardanisch aufgehängten Scanspiegeln 17 und 31 läßt sich der zeitliche Abstand des Eintreffens des Fokus des Manipulationslichtstrahls 13 und des Fokus des Anregungslichtstrahls 9 an einem zu beleuchtenden Rasterpunkt einstellen. Das von der Probe ausgehende Fluoreszenzlicht 35 gelangt durch das Mikroskopobjektiv 21, den Neutralstrahlteiler 21, über die weitere Strahlablenkeinrichtung 29 zurück zum Hauptstrahlteiler 27, passiert diesen und die nachfolgende Detektionslochblende 37 und gelangt schließlich zu dem Detektor 39, der als Multibanddetektor 41 ausgeführt ist. Im Detektor 39 werden wellenlängenspezifisch in mehreren Wellenlängenkanälen elektrische zur jeweiligen Lichtleistung der Fluoreszenzlichtanteile proportionale elektrische Signale erzeugt und an eine Verarbeitungseinheit 43 weitergegeben. Die Verarbeitungseinheit 43 ordnet die gemessenen Leistungen den jeweiligen zeitlichen Abständen zwischen Manipulationslichtstrahl 13 und Anregungslichtstrahl 9 zu und erzeugt einen Datensatz, der an einen PC 45 weitergeben wird, auf dessen Monitor 47 die Abhängigkeit der Fluoreszenzlichtausbeute vom zeitlichen Abstand graphisch dargestellt wird.

2 zeigt ein anderes erfindungsgemäßes Rastermikroskop mit einer Lichtquelle 1, die einen Anregungslichtstrahl 9 erzeugt, der nach Passieren der Beleuchtungslochblende 25 vom Hauptstrahlteiler 27 zur Strahlablenkeinrichtung 15, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 17 beinhaltet, gelenkt wird. Die Strahlablenkeinrichtung 15 führt den Anregungslichtstrahl 9 durch die Scanoptik 49, die Tubusoptik 51 und durch das Mikroskopobjektiv 21 hindurch über bzw. durch die Probe 23. Das erfindungsgemäße Rastermikroskop umfasst eine weitere Lichtquelle 11, die einen Manipulationslichtstrahl 13 emittiert, der ebenfalls von der Strahlablenkeinrichtung 15 durch die Scanoptik 49, die Tubusoptik 51 und durch das Mikroskopobjektiv 21 über bzw. durch die Probe 23 geführt wird. Vor dem Eintreffen auf der Strahlablenkeinrichtung 15 weisen der Manipulationslichtstrahl 13 und der Anregungslichtstrahl 9 einen Winkel &THgr; zueinander auf. Dieser Winkel legt den räumlichen Abstand der Fokusse des Manipulationslichtstrahl 13 und des Anregungslichtstrahls 9 in der Probe fest. Aus der Kenntnis der Strahlablenkgeschwindigkeit ergibt sich hieraus der zeitliche Abstand des Eintreffens des Manipulationsichtstrahls 13 und des Anregungslichtstrahls 9 an einem zu beleuchtenden Rasterpunkt. Dieser zeitliche Abstand läßt sich durch Verändern des Winkels einstellen. Zum Einstellen des Winkels &THgr; wird der Manipulationslichtstrahls 13 mit einem ersten einstellbaren Umlenkspiegel 53 und einem zweiten einstellbaren Umlenkspiegel 55 geführt. Der erste und der zweite einstellbare Umlenkspiegel 53, 55 werden so eingestellt, dass der Manipulationslichtstrahls 13, den kardanisch aufgehängten Scanspiegel 17 unabhängig vom Winkel &THgr; stets an der selben Stelle trifft. Das von der Probe ausgehende Fluoreszenzlicht 35 gelangt durch das Mikroskopobjektiv 21, die Tubusoptik 51, die Scanoptik 49 über die Strahlablenkeinrichtung 15 sowie zurück zum Hauptstrahlteiler 27, passiert diesen und die nachfolgende Detektionslochblende 37 und gelangt schließlich zum Detektor 39, der elektrische zur Lichtleistung des Fluoreszenzlichts proportionale Signale erzeugt und an eine Verarbeitungseinrichtung 43 weitergibt. In der Verarbeitungseinrichtung 43 werden die Detektionssignale den jeweiligen Zeitlichen Abständen zugeordnet und an einen PC 45 mit einem Monitor 47 übergeben.

In 3 sind exemplarisch die ersten drei Scanzeilen 57, 59, 61 eines abzurasternden Scanfeldes 63 dargestellt. Beim Abrastern der ersten Scanzeile 57 weist der Manipulationslichtstrahlfokus 65 einen Abstand von drei Rasterpunkten zu dem Anregungslichtstrahlfokus 67 auf. Der Manipulationslichtstrahlfokus 65 und der Anregungslichtstrahlfokus 67 werden gemeinsam in konstantem Abstand entlang der Scanzeile 57 geführt. Aus dem räumlichen Abstand des Manipulationslichtstrahlfokus 65 zu dem Anregungslichtstrahlfokus 67 (in diesem Fall drei Rasterpunkte) und aus der Scangeschwindigkeit, mit der die Fokusse über die Scanzeile 57 geführt werden, läßt sich der zeitliche Abstand des Eintreffens der beiden Fokusse am zu beleuchtenden Rasterpunkt 69 errechnen. Beim Abrastern der zweiten Scanzeile 59 ist der räumliche Abstand des Manipulationslichtstrahlfokus 65 zu dem Anregungslichtstrahlfokus 67 um einen Rasterpunkt vergrößert worden. Hierdurch vergrößert sich bei vorausgesetzt konstanter Scangeschwindigkeit auch der zeitliche Abstand des Eintreffens der Fokusse am zu beleuchtenden weiteren Rasterpunkt 71. Der Manipulationslichtstrahlfokus 65 und der Anregungslichtstrahlfokus 67 können beispielsweise mit einem Rastermikroskop, wie es in 2 dargestellt ist, von einer Strahlablenkeinrichtung 15 gemeinsam geführt werden. Bei der in 2 gezeigten Anordnung gelangt kein reflektiertes Manipulationslicht zum Detektor 39, da der Detektor stets nur das Licht empfangen kann, das von dem Rasterpunkt ausgeht, der gerade vom Anregungslichtstrahl beleuchtet wird. Woanders „schaut der Detektor nicht hin".

4 zeigt ein weiteres erfindungsgemäßes Rastermikroskop. Das Rastermikroskop weist einen UV-Laser 73 auf. Der Lichtstrahl 77 des UV-Laser 73, wird bei diesem Rastermikroskop normalerweise zum Anregen der Probe im üblichen Imaging-Modus verwendet. In dieser Ausführungsvariante wird der Lichtstrahl 77 jedoch als Manipulationslichtstrahl 13 verwendet. als Durch Verkippen der Pinholeoptik 75 im Strahlengang des Lichtstrahls 77 trifft der Lichtstrahl 77 unter einem Winkel &THgr; auf den Scanspiegel 17. Der Winkel &THgr; und damit der zeitliche Abstand lässt sich durch Verstellen (laterale Verschiebung und/oder Verkippung) der Pinholeoptik 75 variieren.

Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.

1Lichtquelle 2weitere Lichtquelle 3Lichtstrahl 5Lichtstrahl 7dichromatischer Strahlteiler 9Anregungslichtstrahl 11dritte Lichtquelle 13Manipulationslichtstrahl 15Strahlablenkeinrichtung 17Scanspiegel 19Umlenkspiegel 21Neutralstrahlteiler 22Mikroskopobjektiv 23Probe 25Beleuchtungslochblende 27Hauptstrahlteiler 29weitere Strahlablenkeinrichtung 31weiterer Scanspiegel 33elektronische Einheit 35Fluoreszenzlicht 37Detektionslochblende 39Detektor 41Multibanddetektor 43Verarbeitungseinheit 45PC 47Monitor 49Scanoptik 51Tubusoptik 53erster einstellbarer Umlenkspiegel 55zweiter einstellbarer Umlenkspiegel 57erste Scanzeile 59zweite Scanzeile 61dritte Scanzeile 63Scanfeld 65Manipulationslichtstrahlfokus 67Anregungslichtstrahlfokus 69Rasterpunkt 71weiterer Rasterpunkt 73UV-Laser 75Pinholeoptik 77Lichtstrahl

Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Untersuchung von biologischen Proben mit einem Rastermikroskop mit folgenden Schritten:

    a) Beleuchten mindestens eines Rasterpunktes mit einem Manipulationslichtstrahl und in einem zeitlichen Abstand mit einem Anregungslichtstrahl,

    b) Messen der Leistung von von dem mindestens einen Rasterpunkt ausgehenden Fluoreszenzlicht,

    c) Zuordnen der gemessenen Leistung zu dem zeitlichen Abstand in einem Datensatz,

    d) Beleuchten des mindestens einen Rasterpunktes und/oder mindestens eines anderen Rasterpunktes mit dem Manipulationslichtstrahl und in einem veränderten zeitlichen Abstand mit dem Anregungslichtstrahl,

    e) Messen der Leistung von von dem mindestens einen Rasterpunkt und/oder von von dem anderen Rasterpunkt ausgehenden Fluoreszenzlicht, und

    f) Zuordnen der gemessenen Leistung zu dem veränderten zeitlichen Abstand in dem Datensatz.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch den weiteren Schritt:

    • Erweitern des Datensatzes durch einfaches oder mehrfaches Wiederholen der Schritte d) bis f) bei jeweils weiter verändertem zeitlichen Abstand, wobei der mindestens eine und/oder jeweils andere Rasterpunkte beleuchtet werden.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl zumindest je einen Anteil gleicher Wellenlänge aufweisen.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl zumindest je einen Anteil unterschiedlicher Wellenlänge aufweisen.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl die Probe ausbleicht.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl mindestens einen Fluoreszenzfarbstoff aktiviert und/oder einen Fluoreszenzfarbstoff freisetzt.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzfarbstoff photoaktivierbare fluoreszierende Proteine, insbesondere PA-GFP und/oder KFP und/oder KAEDE, umfasst.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Position des Manipulationslichtstrahl in der Probe mit einer Strahlablenkeinrichtung gesteuert wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Position des Anregungslichtstrahles in der Probe mit einer weiteren Strahlablenkeinrichtung gesteuert wird.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Position des Anregungslichtstrahles in der Probe mit der einen Strahlablenkeinrichtung gesteuert wird.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl zeilenweise über oder durch die Probe geführt werden.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Anregungslichtstrahl und der Manipulationslichtstrahl mäanderförmig über oder durch die Probe geführt werden.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl dem Anregungslichtstrahl vorauseilt.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die eine Strahlablenkeinrichtung eine Ablenkgeschwindigkeit aufweist und dass der zeitliche Abstand durch Variieren der Ablenkgeschwindigkeit verändert wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die eine Strahlablenkeinrichtung und die weitere Strahlablenkeinrichtung aufeinander synchronisiert sind und dass der zeitliche Abstand durch Variieren der Phase zwischen der einen Strahlablenkeinrichtung und der weiteren Strahlablenkeinrichtung verändert wird.
  16. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl zueinander einen von 0 Grad verschiedenen Winkel aufweisen und dass der zeitliche Abstand durch Variieren des Winkels verändert wird.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Beleuchtung mit dem Manipulationslichtstrahl beim Zeilenhinlauf und eine Beleuchtung mit dem Anregungslichtstrahl beim Zeilenrücklauf erfolgt.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der zeitliche Abstand durch Variieren des Abstandes des zu beleuchteten Rasterpunktes zum Umkehrpunkt von Zeilenhinlauf und Zeilenrücklauf erfolgt.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die beleuchteten Rasterpunkte auf einer Bild-Diagonalen liegen.
  20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der zeitliche Abstand während des Abrasterns einer Scanzeile und/oder des Abrasterns eines Objektfeldes (frame) variiert wird.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Datensatz grafisch dargestellt wird.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, gekennzeichnet durch die Verwendung zur Untersuchung von Dunkelzuständen der Probe.
  23. Rastermikroskop zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 22.
  24. Rastermikroskop mit mindestens einer Lichtquelle zur Erzeugung eines Manipulationslichtstrahls und der Anregungslichtstrahls, die nacheinander mit einem zeitlichen Abstand mindestens einen Rasterpunkt beleuchten und mit einem Detektor zum Messen der Lichtleistung von von dem mindestens einen Rasterpunkt ausgehendem Fluoreszenzlicht, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl wiederholt nacheinander auf Rasterpunkte richtbar sind und dass das Rastermikroskop ein Veränderungsmittel zur Veränderung des zeitlichen Abstandes, eine Verarbeitungseinheit, die die jeweils gemessene Leistung dem jeweiligen zeitlichen Abstand zuordnet und so einen Datensatz erzeugt, und ein Datenbankmodul zum Ablegen des Datensatzes umfasst.
  25. Rastermikroskop nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass eine Strahlablenkeinrichtung vorgesehen ist, mit der die Position des Manipulationslichtstrahl in der Probe einstellbar ist.
  26. Rastermikroskop nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Position des Anregungslichtstrahles in der Probe mit der einen Strahlablenkeinrichtung einstellbar ist.
  27. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass eine weitere Strahlablenkeinrichtung vorgesehen ist, mit der die Position des Manipulationslichtstrahl in der Probe einstellbar ist.
  28. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl gemeinsam zeilenweise über oder durch die Probe führbar sind.
  29. Rastermikroskop nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl gemeinsam mäanderförmig über oder durch die Probe führbar sind.
  30. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 24 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl dem Anregungslichtstrahl vorauseilt.
  31. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 26 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die eine Strahlablenkeinrichtung eine Ablenkgeschwindigkeit aufweist und dass der zeitliche Abstand durch Variieren der Ablenkgeschwindigkeit veränderbar ist.
  32. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 27 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die eine Strahlablenkeinrichtung und die weitere Strahlablenkeinrichtung aufeinander synchronisiert sind und dass der zeitliche Abstand durch Variieren der Phase zwischen der einen Strahlablenkeinrichtung und der weiteren Strahlablenkeinrichtung veränderbar ist.
  33. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 24 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass der Manipulationslichtstrahl und der Anregungslichtstrahl zueinander einen von 0 Grad verschiedenen Winkel aufweisen und dass der zeitliche Abstand durch Variieren des Winkels veränderbar ist.
  34. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass eine Beleuchtung mit dem Manipulationslichtstrahl beim Zeilenhinlauf und eine Beleuchtung mit dem Anregungslichtstrahl beim Zeilenrücklauf erfolgt.
  35. Rastermikroskop nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass der zeitliche Abstand durch Variieren des Abstandes des zu beleuchtenden Rasterpunktes zum Umkehrpunkt von Zeilenhinlauf und Zeilenrücklauf veränderbar ist.
  36. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 24 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor einen Multibanddetektor umfasst.
  37. Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 24 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass das Rastermikroskop ein konfokales Rastermikroskop ist.
Es folgen 4 Blatt Zeichnungen






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