Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Corticoid-Zusammensetzungen bereitzustellen, bei denen die im Stand der Technik beobachteten Nachteile zumindest teilweise überwunden sind. Insbesondere sollten Corticoid-Zusammensetzungen bereitgestellt werden, die nach Verabreichung eine hohe Halbwertszeit im Körper aufweisen und die auch bei systemischer Gabe zu keinen oder nur geringen Nebenwirkungen führen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Corticoid-Transportprotein-Konjugate, bei denen ein Corticoid kovalent an ein Trägerprotein gebunden ist.

Durch Kopplung an Trägerproteine werden die Corticoide, welche an sich schnell aus dem Körper entfernt werden, vor den Ausscheidungs- bzw.

Abfangmechanismen des Körpers verborgen und es wird eine lange Verweilzeit im Organismus erreicht. Durch diese verlängerte Halbwertszeit im Körper ist es möglich, die erforderliche Menge an Corticoid zu verringern und somit ggf. auftretende Nebenwirkungen zurückzudrängen. Zudem kann die toxische Wirkung auf gesundes Gewebe oder auf Organe praktisch vermieden werden, da normale Zellen keine Veranlassung zur Proteinaufnahme haben. Vorteilhafterweise wird das Corticoid erst am Zielort aus dem erfindungsgemäßen Konjugat freigesetzt, so daß oftmals geringere Dosen pro kg Körpergewicht ausreichend sind. Damit wird die Belastung der Leber und der übrigen gesunden Organe weiter reduziert.

Ein Trägerprotein ist erfindungsgemäß ein Protein, das als Trägermolekül für den Corticoid-Wirkstoff fungiert. Beispiele solcher Proteine sind jene Proteine mit einem Molekulargewicht von ≥ 18 000 Da, mehr bevorzugt ≥ 50 000 Da, insbesondere ≥ 100 000 Da. Vorteilhafterweise kann durch das Trägerprotein der Corticoid-Wirkstoff gezielt an bestimmte Orte im Körper gebracht werden. Auf diese Weise wird erreicht, daß geringere Corticoid-Dosierungen ausreichend sind, um eine gewünschte Wirkung zu erzielen und die üblichen Nebenwirkungen, die bei einer systemischen Gabe von Corticoiden in hoher Dosis auftreten können, somit zurückgedrängt werden.

Gemäß der Erfindung werden bevorzugt Proteine in nativer Form als Träger verwendet, die als nicht körperfremd angesehen werden. Günstigerweise wird je nach Patient, dem das Konjugat verabreicht werden soll, ein entsprechendes natives Protein ausgewählt, also beispielsweise für die Verabreichung am Menschen ein humanes Protein.

Geeignete Proteine sind beispielsweise Transferrin und bevorzugt Albumin, weiter bevorzugt Serum-Albumin und am meisten bevorzugt humanes Albumin (HSA; humanes Serumalbumin). Albumin stellt mit einem Molekulargewicht von etwa 68 kDa das kleinste der im Plasma vorkommenden Proteine dar. Es macht jedoch ungefähr 60% der gesamten Plasma-Eiweißmenge aus. Als körpereigenes, ubiquitär verteiltes nicht immunogenes Protein erfüllt Albumin im gesunden Organismus unter anderem für viele Stoffe Transportfunktionen und dient im akuten Notfall als Reserveenergieträger, der überall und jederzeit verfügbar ist. Da Albumin von gesunden Zellen nicht aufgenommen wird, ist seine Verwendung in den erfindungsgemäßen Corticoid-Transportprotein-Konjugaten von Vorteil.

Durch die erfindungsgemäße kovalente Kopplung des Corticoids an das Trägermolekül wird erreicht, dass keine Einschränkung des nativen Charakters des Proteins erfolgt. So wird das erfindungsgemäße Konjugat nicht als körperfremd angesehen, und kann für längere Zeit im Organismus verbleiben.

Die Konjugate der Erfindung enthalten bevorzugt ein Corticoid und ein Transportprotein im Molverhältnis von 2:1 bis 0,5:1, weiter bevorzugt beträgt das Molverhältnis von Corticoid zu Transportprotein 1,1:1 bis 0,9:1. Insbesondere ist ein Molverhältnis von ungefähr 1:1 vorteilhaft. Dabei kann die Bindung entweder direkt, linkerfrei oder über einen Linker an das Transportprotein erfolgen.

Eine linkerfreie Bindung des Corticoids an den Träger bedeutet, dass das Corticoid durch direkte chemische Bindung an das Transportprotein gebunden ist. Beispielsweise kann das Corticoid über eine Estergruppe, die aus einer OH-Gruppe des Corticoids und einer Säuregruppe des Proteins gebildet ist, kovalent an das Protein gebunden sein.

Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Bindung über einen Linker bevorzugt. Linker im Sinn der Erfindung bedeutet eine Struktureinheit, über die ein Corticoid an ein Transportprotein gebunden ist. Besonders geeignete Linker-Moleküle enthalten beispielsweise 2 Säuregruppen oder 2 aktivierte Säuregruppen über die eine Kopplung zum einen an das Corticoid und zum anderen an das Protein erfolgen kann. Ein Beispiel für einen besonders geeigneten Linker ist Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA).

Wichtig bei der Art der Kopplung ist, daß die kovalente Bindung in der Zielzelle wieder spaltbar ist, damit dort das Corticoid wieder freigesetzt werden kann und seine biologische Wirksamkeit entfalten kann. Die Spaltung erfolgt durch eine chemische Veränderung an der Verbindungsstelle zum Linker. Bei einer Bindung des Corticoids und des Trägerproteins an den Linker über Estergruppen kann die Esterbindung beispielsweise durch enzymatische Esterspaltung in der Zielzelle wieder gespalten werden.

Gemäß der Erfindung können beliebige Corticoide an ein Trägerprotein gebunden sein. Die Bezeichnung „Corticoid" im Sinne der Erfindung umfasst neben natürlich auftretenden und synthetisch hergestellten Steroidhormone der Nebennierenrinde auch Verbindungen mit corticoider Struktur, insbesondere Steroidantibiotika. Bevorzugt werden erfindungsgemäß Verbindungen, die sich von dem tetrazyklischen Kohlenwaserstoff Perhydro-1H-Cyclo-Penta[A]-Phenanthren (Steran) ableiten. Bevorzugt eingesetzte Verbindungen besitzen die Formel I

Bevorzugte Reste R³ sind H, OH, Cl, F und/oder CH₃ und/oder sie können bevorzugt die Formel (II) aufweisen

Am meisten bevorzugt ist m=1.

Bevorzugte Reste R⁴, R⁶ und R⁹ sind H, OH, CH₃, Cl und/oder F und/oder sie können bevorzugt die Formel (IV) aufweisen

Wenn R⁵ und R⁶ zusammen einen zweiwertigen Rest bilden weist dieser bevorzugt die Formel (V) auf,

Am meisten bevorzugt ist r=2.

R¹⁰ ist bevorzugt H und

R¹¹ ist bevorzugt CH₃.

Bevorzugt wird ein humanes Corticoid verwendet. Beispiele für vorteilhafterweise eingesetzte Corticoide sind Hydrocortison, Cortison, Triamcinolon, Cortisonacetat, Cloprednol, Aldosteron, Prednisol, Prednisolon, Fluocortolon, Triamcinolon, Methylprednisolon, Betamethason, Desoximetason, Clobetasonbutyrat, Hydrocortisonbutyrat, Fluocinolonacetonid, Prednicarbat, Triamcinolonacetonid, Halcinoid, Betamethasondipropionat, Betamethasonvalerat, Diflorasondiacetat, Diflucortolonvalerat, Clobetasolpropionat, Corticosteron und ganz besonders bevorzugt wird Dexamethason eingesetzt. Besonders in neuerer Zeit wird synthetisch hergestelltes Dexamethason bevorzugt verwendet. Eine weitere bevorzugte Verbindung der Formel I ist der corticoidale Entzündungshemmer Fusidinsäure.

Gemäß einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Corticoid-Transportprotein-Konjugaten bereit. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden ein Corticoid und ein Transportprotein miteinander umgesetzt, und bei der Umsetzung erfolgt eine Verknüpfung über kovalente Bindungen.

Eine Möglichkeit zur Herstellung ist erfindungsgemäß die direkte Kopplung von Corticoid und Transportprotein. Beispielsweise kann durch Reaktion einer Carboxyl-Gruppe des Corticoids (z.B. Fusidinsäure) mit einer Aminogruppe einer Proteinseitenkette eine Verknüpfung unter Ausbildung einer Amidgruppe erfolgen. Bei einer direkten Kopplung ist die zeitaufwendige Herstellung und Aufarbeitung von Zwischenprodukten überflüssig.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden ein Corticoid und ein Transportprotein mit einem Linker umgesetzt, und bei der Umsetzung erfolgt eine Verknüpfung über kovalente Bindungen. In diesem Verfahren weist der Linker günstigerweise zwei funktionelle Gruppen auf, über die eine Bindung zum einen an das Corticoid und zum anderen an das Transportprotein erfolgen kann. Solche funktionellen Gruppen am Linkermolekül können beispielsweise aktivierte Carbonsäuregruppen wie Anhydridgruppen, Carbonsäurechloride und dergleichen sein. Ein besonders geeigneter Linker in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist EDTA-Dianhydrid.

Bei der Verknüpfung des Corticoids an ein Trägerprotein über einen Linker kann als Nebenreaktion eine Crosslink-Reaktion stattfinden. Unter „Crosslink-Reaktion" wird im Sinn der Erfindung die Vernetzung mehrerer Cortikoide/Proteine über Linker verstanden. Solche größeren Konjugate sind für eine medizinische Verwendung weniger geeignet, da sie aus dem Kreislauf schneller eliminiert werden und zur Antikörperbildung führen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Crosslinking vermieden werden, indem in einem weiteren Schritt eine Ammoniaklösung zugegeben wird.

Damit das in dem erfindungsgemäßen Konjugat enthaltene Corticoid seine volle Aktivität zeigt, muß in der Zielzelle eine Spaltung des Linkers und ggf. ein Abbau des noch am Linker gebundenen Proteins erfolgen. Als Linker werden daher bevorzugt solche Verbindungen ausgewählt, die in einer jeweiligen Zielzelle wieder abgespalten werden können. Dem Fachmann ist bekannt, durch welche Faktoren, z.B. Enzyme, in Zellen die Spaltung bestimmter chemischer Bindungen erfolgen kann. Beispielsweise können Estergruppen mittels enzymatischer Esterspaltung durch Esterasen gespalten werden. Säureamid-Bindungen können durch enzymatische Peptidspaltung gespalten werden.

Die erfindungsgemäßen Konjugate zeichnen sich dadurch aus, daß sie gezielt an bestimmte Orte im Körper transportiert werden können und so das Corticoid dort angereichert werden kann. Erst am Zielort kann dann das Corticoid freigesetzt werden und seine Aktivität entfalten. Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Konjugate vermehrt von Tumorzellen aufgenommen werden. Im Gegensatz dazu nehmen gesunde Zellen die Konjugate nicht oder nur in einem wesentlich geringeren Maß auf. Die erfindungsgemäßen Konjugate eignen sich daher hervorragend für therapeutische Zwecke, insbesondere zur Therapie von Tumorerkrankungen wie beispielsweise soliden Tumoren.

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen Konjugate nicht nur in Tumorzellen sondern auch in für Immunreaktionen relevanten Zellen aufgenommen werden. Somit findet auch in diesen Zellen eine Wirkstoffanreicherung statt. Corticoide besitzen eine hemmende Wirkung auf die Expression einer sehr großen Bandbreite von proinflammatorischen und immunregulatorischen Zytokinen wie Interleukin (IL), Interferon, Tumornekrosefaktor TNF-&agr; und von mehreren kostimulatorischen Faktoren. Die Konjugate der vorliegenden Erfindung eignen sich folglich auch für die Suppression von Immunreaktionen beispielsweise bei tranplantationsassoziierten Immunreaktionen. Diese Wirkung eröffnet ein breites Einsatzspektrum für die erfindungsgemäßen Konjugate zur Vermeidung immunologischer Komplikationen bei Tranplantationen, insbesondere bei allogenen oder autologen Knochenmarktransplantationen aber auch zur Vermeidung von empfängervermittelten Abstoßungsreaktionen bei Organtransplantationen, insbesondere bei Fremdspender-Organtransplantationen von beispielsweise Niere, Herz oder Leber. Die erfindungsgemäßen Konjugate können deshalb vorteilhafterweise zur Behandlung und/oder Prophylaxe von GVHD und insbesondere von akuter oder chronischer GVHD eingesetzt werden.

Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Konjugate zur Verwendung im Zusammenhang mit unerwünschten Immunreaktionen ist, daß eine lokal begrenzte Immunsuppression ermöglicht wird, da im Wesentlichen keine Aufnahme der Konjugate durch gesunde Zellen erfolgt.

Ein Vorteil der Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate ist ihre lange Verweildauer im Organismus. Sie ist im allgemeinen ≥ 15 Tage und bevorzugt ≥ 19 Tage. Dadurch wird im Vergleich zur bisher üblichen direkten Verabreichung von Corticoiden eine Verringerung der erforderlichen Dosis ermöglicht, die notwendig ist, um eine gewünschte Wirkung zu erzielen. Die Menge an verabreichtem Corticoid, insbesondere Dexamethason, kann erfindungsgemäß z.B. von 0,1 &mgr;g/kg Körpergewicht bis 0,1 g/kg Körpergewicht, insbesondere von 10 &mgr;g/kg Körpergewicht bis 001 g/kg Körpergewicht betragen.

Figuren

1 zeigt das Chromatogramm der HPLC-Untersuchung der Reaktionsprodukte des Erfindungsbeispiels. Freies Dexamethason wird nach einer Retensionszeit von 31,45 min detektiert.

2 zeigt das Chromatogramm der HPLC-Untersuchung des Erfindungsbeispiels, wobei nach 7,07 min eine dimere Albuminfraktion detektiert wird und nach 8,27 min eine monomere Albuminfraktion.