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Dokumentenidentifikation DE69829765T2 02.03.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001018546
Titel Mikroorganismen, welche 5-Aminolävulinat herstellen und Verfahren zur Herstellung von 5-Aminolävulinat unter Verwendung derselben
Anmelder Cosmo Oil Co. Ltd., Tokio/Tokyo, JP;
Cosmo Research Institute, Tokio/Tokyo, JP
Erfinder NISHIKAWA, Seiji, Satte-shi, Saitama 340-0112, JP;
TANAKA, Tohru, Satte-shi, Saitama 340-0112, JP;
KAMINAGA, Tomomi, Satte-shi, Saitama 340-0112, JP;
WATANABE, Kikuo, Satte-shi, Saitama 340-0112, JP;
MIYACHI, Nobuya, Satte-shi, Saitama 340-0112, JP;
WATANABE, Keitaro, Satte-shi, Saitama 340-0112, JP;
HOTTA, Yasushi, Satte-shi, Saitama 340-0112, JP
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 69829765
Vertragsstaaten CH, DE, DK, FI, FR, GB, IT, LI, NL, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 27.05.1998
EP-Aktenzeichen 989218284
WO-Anmeldetag 27.05.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/JP98/02321
WO-Veröffentlichungsnummer 0098054297
WO-Veröffentlichungsdatum 03.12.1998
EP-Offenlegungsdatum 12.07.2000
EP date of grant 13.04.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 02.03.2006
IPC-Hauptklasse C12N 1/20(2006.01)A, F, I, ,  ,  ,   
IPC-Nebenklasse C12P 13/00(2006.01)A, L, I, ,  ,  ,      

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, der 5-Aminolävulinsäure in hoher Konzentration erzeugt und anhäuft und ein Verfahren zur Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure unter Verwendung desselben.

Stand der Technik

5-Aminolävulinsäure ist eine Verbindung, die in der Biosphäre als Vorläufer von Tetrapyrrolverbindungen weit verbreitet vorliegt und hat in vivo wichtige Funktionen. 5-Aminolävulinsäure ist eine natürliche Verbindung, die ausgezeichnete Funktionen z.B. als Herbizid, Insektizid, Pflanzenwachstumsregulator, Pflanzensynthese verstärkendes Mittel und ähnliches zeigt und die auch vorteilhafte Eigenschaften aufweist, wie z.B. keine Toxizität für den Menschen und Tiere und keine Restmülleigenschaften in der Umgebung aufgrund der hohen Abbaufähigkeit (siehe z.B. JP-A-61-502814, JP-A-2-138201).

5-Aminolävulinsäure weist jedoch das Problem auf, dass es bei der Verwendung bei den oben erwähnten Verwendungsarten aufgrund seiner hohen Produktionskosten schlecht verwertbar ist (CHEMICAL WEEK, Oktober, 29 (1984)).

Dementsprechend wurden viele chemische Syntheseverfahren überprüft (siehe z.B. JP-A-2-76841), jedoch wurden bis jetzt noch keine zufriedenstellenden Verfahren entwickelt.

Andererseits wurden auch Verfahren für die Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure unter Verwendung von Mikroorganismen untersucht, die zur Gattung Rhodobakterium, Propionibakterium, Methanobakterium, Methanosarcina und ähnlichen gehören. Die Verfahren unter Verwendung der Mikroorganismen, die zur Gattung Propionibakterium, Methanobakterium, Methanosarcina und ähnlichen gehören (siehe z.B. JP-A-5-184376) sind jedoch nicht zufriedenstellend, da ihr Ertrag sehr niedrig liegt. Von E. L. Neidle und S. Kaplan, Journal of Bacteriology, April 1993, Seiten 2304–2313 ist ein Rhodobacter sphaeroides-Bakterium bekannt, das 5-Aminolävulinsäure erzeugt.

Es ist bekannt, dass Nicht-Schwefel-Purpur-Bakterien, wie z.B. Mikroorganismen, die zur Gattung Rhodobakterium und zur Gattung Rhodopseudomonas und ähnlichen gehören, eine hohe Fähigkeit zur Synthese von Tetrapyrrolverbindungen unter Verwendung von 5-Aminolävulinsäure als Stoffwechselintermediat aufweisen. Die Verwendung dieser Mikroorganismen weist jedoch das Problem auf, dass die erzeugte 5-Aminolävulinsäure zu Tetrapyrrolverbindungen verstoffwechselt wird, so dass eine gewünschte Menge 5-Aminolävulinsäure nicht angehäuft wird.

Da daher die Biosynthese von 5-Aminolävulinsäure in vivo auf komplizierte Weise reguliert wird, ist es nicht einfach, einen Stamm zu erhalten, der 5-Aminolävulinsäure in hoher Konzentration anhäufen kann.

Andererseits wurde ein Verfahren unter Verwendung eines mutierten Stamms der Gattung Rhodobakterium, der 5-Aminolävulinsäure in einer maximalen Menge von 14,3 mM anhäufen kann, wobei Glukose als Kohlenstoffquelle verwendet wird, vorgeschlagen (JP-A-8-168391). Dieses Verfahren kann jedoch nicht als industriell vorteilhaftes Verfahren angesehen werden, da es notwendig ist, eine gelöste Sauerstoffkonzentration auf einem sehr niedrigen Niveau während der Kultivierung zu erhalten, so dass die Belüftung in dem Kulturgefäß durch Zufuhr einer Mischung aus Luft und Stickstoffgas durchgeführt werden muss.

Dieses Verfahren benötigt außerdem Sauerstoff, wenn 5-Aminolävulinsäure aerob unter Verwendung von Glukose als Kohlenstoffquelle angehäuft wird. Dementsprechend besteht eine Möglichkeit, dass 5-Aminolävulinsäure effizient selbst unter Bedingungen erzeugt wird, unter denen Sauerstoff ausreichend vorliegt, da die gelöste Sauerstoffkonzentration aufgrund des Verbrauchs von Sauerstoff durch den Mikroorganismus reduziert ist. Es ist jedoch nicht möglich, 5-Aminolävulinsäure effizient unter relativ hohen gelösten Sauerstoff-Konzentrationsbedingungen zu erzeugen.

Offenbarung der Erfindung

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Mikroorganismus bereitzustellen, der 5-Aminolävulinsäure effizient selbst unter solchen Bedingungen erzeugen kann, dass eine gelöste Sauerstoffkonzentration relativ hoch ist, ohne einen Bedarf einer Zufuhr von Stickstoffgas oder ähnlichem.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegende Erfindung, ein Verfahren zur Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure unter Verwendung des Mikroorganismus bereitzustellen.

Unter den oben geschilderten Bedingungen haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung intensive Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, einen Mikroorganismus zu erhalten, der 5-Aminolävulinsäure effizient erzeugen kann und haben im Ergebnis ein Verfahren zur Selektion von 5-Aminolävulinsäure anhäufenden Mikroorganismen mit hoher Produktivität gefunden und dann unter Verwendung dieses Verfahrens einen Mikroorganismus gefunden, der 5-Aminolävulinsäure in hohen Konzentrationen selbst bei einer relativ hohen gelösten Sauerstoffkonzentration anhäufen kann. So wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.

Außerdem haben die vorliegenden Erfinder ein sehr effizientes Verfahren zur Selektion von 5-Aminolävulinsäure anhäufenden Mikroorganismen gefunden, durch das eine große Anzahl von mutierten Stämmen durch geeignete Veränderung von Sacchariden, Glycin, Lävulinsäure und ähnliches bewertet werden kann und eine wiederholte Mutantenbehandlung möglich wird. So waren die vorliegenden Erfinder bei der Züchtung eines Stamms erfolgreich, der 5-Aminolävulinsäure in hoher Konzentration anhäufen kann. Daraufhin wurde die vorliegende Erfindung durch Etablieren eines Kultivierungsprozesses vervollständigt, worin Saccharide, Glycin, Lävulinsäure, Eisenbestandteile und ähnliches auf geeignete Weise zugefügt werden und der gelöste Sauerstoff und das Oxidationsreduktionspotenzial in der Kulturbrühe kontrolliert werden.

Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt einen 5-Aminolävulinsäure-erzeugenden Mikroorganismus mit einer 5-Aminolävulinsäure-Synthaseaktivität von 2 bis 7 (nmol/min/mg Protein) unter aeroben Kulturbedingungen bei einer gelösten Sauerstoffkonzentration von 0,70 bis 6,60 ppm, wobei der Mikroorganismus Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 (FERM BP-6320) oder ein mutierter Stamm davon ist, bereit.

Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure bereit, umfassend das Kultivieren von mindestens einem solchen 5-Aminolävulinsäureproduzierenden Mikroorganismen und Gewinnen der 5-Aminolävulinsäure aus der resultierenden Kultur.

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure bereit, umfassend das Kultivieren des 5-Aminolävulinsäure-erzeugenden Mikroorganismus in einem Medium, enthaltend einen Eisenbestandteil in einer Menge von 5 bis 500 &mgr;M und Gewinnen der 5-Aminolävulinsäure aus der resultierenden Kulturmischung.

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Kultivieren des 5-Aminolävulinsäure-erzeugenden Mikroorganismus bereit, umfassend das Kultivieren eines 5-Aminolävulinsäure erzeugenden Mikroorganismus in einem Medium, enthaltend einen Eisenbestandteil in einer Menge von 5 bis 500 &mgr;M.

Kurze Erklärung der Zeichnung

1 ist eine Grafik, die eine Beziehung zwischen gelöstem Sauerstoff und der 5-Aminolävulinsäure-Synthaseaktivität darstellt.

Beste Ausführungsform der Erfindung

Der 5-Aminolävulinsäure erzeugende Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung wurde z.B. unter Verwendung eines Wildtypstamms oder eines mutierten Stamms, d.h. Rhodobacter spaeroides CR-002 (FERM P-15312) als Elternstamm, durch Durchführung einer Mutationsbehandlung und Selektion eines Stammes mit einer 5-Aminolävulinat-Synthaseaktivität von 2 bis 7 (nmol/min/mg Protein) unter Bedingungen bei einer gelösten Sauerstoffkonzentration von 0,70 bis 6,60 ppm erhalten, vorzugsweise mit einer 5-Aminolävulinsäure-Synthaseaktivität von 3,5 bis 5,6 (nmol/min/mg Protein) bei einer gelösten Sauerstoffkonzentration von 1,46 bis 5,86 ppm.

Spezifisch wird das folgende Verfahren beschrieben:

Zunächst wird ein Flüssigmedium, in dem der Elternstamm wachsen kann, in einem Teströhrchen hergestellt und sterilisiert und dann wird der Elternstamm in das Medium inokuliert und unter Schütteln kultiviert. Die so gezüchteten Zellen werden mit einem Puffer gewaschen und einer Mutationsbehandlung unterzogen.

Als Mutationsbehandlung können allgemeine Mutationsmittel verwendet werden. Beispiele hierfür beinhalten ein Verfahren, wobei die Zellen des Elternstamms, die auf einem Agarmedium angezüchtet wurden, mit einem physikalischen Mutagen bestrahlt werden, wie z.B. UV-Strahlen, ionisierender Strahlung oder ähnlichen und ein Verfahren, wobei der Elternstamm in einem in Puffer kultiviert wird, dem ein chemisches Mutagen zugefügt wurde, einschließlich einem Alkylierungsmittel, wie z.B. Ethylmethansulfonat (EMS), N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), Ethylnitrosoharnstoff (ENU) oder ähnliche und einem Basenanalog, wie z.B. Bromdeoxyuridin (BrdUrd) oder ähnlichen.

Die durch das oben beschriebene Mutationsmittel derartig behandelten Zellen werden wiederum mit einem Puffer gewaschen und auf einem Agarmedium für die Kultivierung verteilt. Außerdem wird eine Selektion eines Stammes mit den oben beschriebenen Eigenschaften von den so gezüchteten, durch diese Kultivierung erhaltenen mutierten Stämme durch die folgenden Schritte durchgeführt.

Jeder der so erhaltenen mutierten Stämme wird in einem Teströhrchen oder ähnlichem kultiviert und Lävulinsäure und Glycin werden nach dem Zellwachstum hinzugefügt. Nach der Zugabe von dieser Verbindungen wird die Menge der angehäuften 5-Aminolävulinsäure in der Kulturbrühe gemessen, um einen Stamm mit einer hohen 5-Aminolävulinsäure-Produktivität zu selektieren.

Um größere Zahlen von Mikroorganismen zu kultivieren und zu beurteilen ist es effektiv und bevorzugt, eine Mikrotiterplatte zu verwenden. Zusätzlich kann die Selektion effizient durchgeführt werden, wenn die Messung der 5-Aminolävulinsäure durch die Ehrlich-Reaktion durchgeführt wird, da die angehäufte Menge 5-Aminolävulinsäure visuell erkannt werden kann.

Die Selektion wird durchgeführt, indem ungefähr 1 bis 100 Stämme mit hoher 5-Aminolävulinsäure-Produktivität aus ungefähr 15.000 mutierten Stämme selektiert werden, die durch die erste Mutationsbehandlung erhalten werden und dann wird ein Stamm mit einer stabilen Wachstumsfähigkeit und Produktivität aus den so selektierten Stämmen durch Subkultivieren in Teströhrchen oder auf Agarplatten wiederum selektiert. Es wird auch in diesem Fall bevorzugt, die Ehrlich-Reaktion und eine Mikrotiterplatte zu verwenden.

Unter Verwendung des so erhaltenen Stammes als Elternstamm wird die oben beschriebene Mutationsbehandlung und Selektion wiederholt. Wenn die Produktivität der 5-Aminolävulinsäure durch Wiederholung der Mutation ansteigt, verändert sich die optimale Konzentration der zuzufügenden Lävulinsäure in einigen Fällen, so dass es bevorzugt wird, die Konzentration von Lävulinsäure, die zugefügt werden soll, in geeigneter Weise zu verändern.

Der so durch Wiederholung der Mutationszüchtung erhaltene Stamm mit einer Fähigkeit zur Anhäufung einer beträchtlichen Menge 5-Aminolävulinsäure unter aeroben Bedingungen, weist das Merkmal auf, dass eines der mit dem 5-Aminolävulinsäure-Stoffwechsel in Beziehung stehenden Enzyme, nämlich die 5-Aminolävulinatsynthase, erhöht ist. Zusätzlich tritt, anders als im Fall von Wildtyp-Stämmen der fotosynthetischen Bakterien derselben Gattung eine Inhibition der 5-Aminolävulinat-Synthaseaktivität bei dem so erhaltenen mutierten Stamm selbst unter solchen Bedingungen kaum auf, unter denen die gelöste Sauerstoffkonzentration im Kulturmedium 2 ppm übersteigt.

Im Hinblick auf den Elternstamm zur Verwendung in dem ersten Schritt des oben beschriebenen Verfahrens wird ein Stamm verwendet, der ein gutes Wachstum auf preisgünstigen Kohlenstoffquellen zeigt, wie Glukose oder ähnlichen, unter aeroben Bedingungen und der eine gute Fähigkeit zur Synthese von Tetrapyrrolverbindungen aufweist, wie z.B. von Bakteriochlorophyll oder ähnlichen. Dieser Stamm ist Rhodobacter sphaeroides CR-002 (FERM P-15312).

Außerdem ist der durch die oben beschriebene Mutation und Selektion erhaltene Stamm ein Stamm, der Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 genannt wurde und als FERM BP-6320 am 7. April 1998 im National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of International Trade and Industry (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japan) hinterlegt wurde. Dieser Stamm, der eine beträchtliche Menge von 5-Aminolävulinsäure anhäufen kann, wurde durch wiederholte Mutation und Selektion des oben beschriebenen Rhodobacter sphaeroides CR-002 erhalten.

Da Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 ein Stamm ist, der durch Mutation von Rhodobacter sphaeroides CR-002, wie oben beschrieben, erhalten wurde, sind die meisten seiner bakteriologischen Eigenschaften zu denen des Stamms CR-002 identisch.

Die bakteriologischen Eigenschaften von Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 werden unten beschrieben.

(a) Morphologische Eigenschaften
  • • Größe und Form der Zelle:

    0,5 × 1 bis 2,5 &mgr;M, Stäbchen, etliche Zellen in Hauptachsenrichtung verbunden.
  • • Sporen: abwesend
(b) Wachstum auf Agarmedium
  • • Glänzende, rötlich braune kreisförmige Kolonie auf dem Medium der Tabelle 1
(c) Physiologische Eigenschaften
  • • Gramfärbung: –
  • • Nitratreduktion: +
  • • Oxidase: +
  • • Glukosefermentation: –
  • • Wachstumsbereich: pH 4,0 bis 9,0, 10°C bis 40°C
(d) Chemotaxonomische Eigenschaften
  • • DNA-G/C-Gehalt (mol%): 68
  • • Chinonart: Q-10
  • • Karotinoid: + (Hauptbestandteile: Chloroxanthin, Methylchloroxanthin)
  • • Bakteriochlorophyll: +
(e) Andere Wachstumsbedingungen und ähnliche
  • • Fotosynthetisches Wachstum:

    Sehr schwach im Medium von Tabelle 1. Obwohl der Ursprungsstamm ein fotosynthetisches Bakterium ist, ist seine Fähigkeit, ein fotosynthetisches Wachstum durchzuführen, reduziert.
  • • Assimilation von Glukose (aerob): +
  • • Assimilation von Natriumacetat (aerob): +
  • • 5-Aminolävulinat-Dehydratase-Aktivität:

    1/3 oder weniger im Vergleich mit dem Ursprungsstamm (CR-002) durch aerobes Kultivieren.

Die Produktionsbedingungen von 5-Aminolävulinsäure unter Verwendung von Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 werden unten beschrieben. Betreffend die Produktionsbedingungen von 5-Aminolävulinsäure können allgemeine Mikroorganismus-Kultivierungsbedingungen verwendet werden. Beispiele für die Kohlenstoffquelle beinhalten Saccharide, wie z.B. Glukose und ähnliches oder Säuren, wie z.B. Essigsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure und ähnliche und die Saccharide sind im Hinblick auf den ökonomischen Standpunkt besonders vorteilhaft. Beispiele für die Stickstoffquelle beinhalten anorganische Stickstoffquellen, z.B. Ammoniak-Stickstoffverbindungen, wie z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und ähnliche und Nitrat-Stickstoffverbindungen, wie z.B. Natriumnitrat und ähnliche; und anorganische Stickstoffquellen, wie z.B. Glycin, Harnstoff, Polypepton, Hefeextrakt, Casaminosäure und ähnliche. Unter diesen wird Glycin vorzugsweise zur Verbesserung der Produktivität der 5-Aminolävulinsäure zugefügt. Die zugefügte Glycinmenge liegt vorzugsweise in einem Bereich von 10 bis 1.000 mM, noch bevorzugter 10 bis 400 mM. Es wird auch bevorzugt, Glycin in einer Menge von 10 bis 200 mM pro Addition zu verwenden und diese Menge mehrmals zuzufügen.

Weiterhin können, falls nötig, andere Bestandteile, wie z.B. Vitamine, anorganische Salze und ähnliche dem Medium je nach Bedarf zugefügt werden.

Es ist bekannt, dass Mikroorganismen, die zu den Nicht-Schwefel-Purpur-Bakterien gehören, wie z.B. zur Gattung Rhodobakterium, Rhodopseudomonas und ähnlichen, im allgemeinen eine 5-Aminolävulinat-Dehydratase aufweisen, die die erzeugte 5-Aminolävulinsäure verstoffwechselt. Da die 5-Aminolävulinat-Dehydratase-Aktivität jedoch bei dem Stamm der vorliegenden Erfindung signifikant reduziert ist, kann 5-Aminolävulinsäure extrazellulär angehäuft werden, ohne einen 5-Aminolävulinsäure-Dehydratase-Inhibitor zuzufügen, wie z.B. Lävulinsäure, jedoch ist die Addition einer geringen Menge des Inhibitors effektiv für die Verbesserung der 5-Aminolävulinsäure-Produktivität. In dem Fall liegt die Menge des zuzufügenden Inhibitors vorzugsweise in einem Bereich von 0,01 bis 20 mM, noch bevorzugter 0,1 bis 10 mM. Alle Kultivierungsbedingungen können verwendet werden, solange Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 wachsen kann, jedoch sind allgemein bevorzugte Bedingungen Kultivierungstemperaturen von 10 bis 40°C, noch bevorzugter 20 bis 35°C bei einem pH des Mediums von 4 bis 9, noch bevorzugter 5 bis 8.

Wenn der pH des Mediums außerdem während der Kultivierung fluktuiert wird es bevorzugt, ihn in dem oben beschriebenen Bereich mit einer Alkalilösung, wie z.B. Natriumhydroxid, Ammoniak, Natriumhydroxid und ähnlichem oder mit einer Säure, wie z.B. Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und ähnlichem einzustellen.

Die Erzeugung der 5-Aminolävulinsäure kann simultan mit oder unabhängig von dem mikrobiellen Wachstum durchgeführt werden. In diesem Fall handelt es sich bei dem zu verwendenden Mikroorganismus entweder um wachsende Zellen oder um ruhende Zellen, die als solche für die Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure verwendet werden können oder nach Erhöhung der Zelldichte, z.B. durch Gewinnung der Zellen unter Verwendung eines Apparats, wie z.B. einer Zentrifuge oder ähnlichem und dann Resuspension der gewonnen Zellen in einer geeigneten Lösung, wie z.B. einem Medium, einem Phosphatpuffer oder ähnlichen.

Um die Produktivität der 5-Aminolävulinsäure weiter zu verbessern wird es bevorzugt, die gelöste Sauerstoffkonzentration und das Oxidations-Reduktions-Potenzial in der Kulturbrühe in Bereiche von 0,001 bis 2 ppm und –220 mV bis 50 mV, noch bevorzugter 0,001 bis 1 ppm bzw. –200 mV bis 0 mV einzustellen. Beispiele für das Kontrollverfahren in diesem Fall beinhalten ein Verfahren, worin die Rührgeschwindigkeit oder Belüftungsrate geändert wird, ein Verfahren, wobei die Belüftung des Mikroorganismus durch Zugabe von Sacchariden, Hefeextrakt oder ähnlichem aktiviert wird und ein Kombinationsverfahren daraus.

Um außerdem den gelösten Sauerstoff und das Oxidations-Reduktions-Potenzial stabiler zu kontrollieren ist es effektiv, einen Eisenbestandteil dem Medium zum Zweck einer Erhöhung der Wachstumsrate des Mikroorganismus zuzufügen und dadurch die Atmungsaktivität zu stabilisieren. Der verwendete Eisenbestandteil ist vorzugsweise ein Eisensalz und das Eisenvalenzeisen ist nicht besonders begrenzt. Beispiele für die Eisenverbindung beinhalten Eisenchlorid, Eisen(III)sulfat, Eisencitrat und ähnliche. Wenn eine natürliche Substanz, wie z.B. Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit oder ähnliches als Mediumbestandteil verwendet wird, die einen Eisenbestandteil in erwünschter Menge enthält, kann dies als Eisenverbindung verwendet werden. Es wird bevorzugt, den Eisenbestandteil dem Medium in einer Menge von 5 bis 500 &mgr;M als Eisen zuzufügen. Wenn die Menge geringer ist als 5 &mgr;M, kann keine Wirkung zur Beschleunigung des mikrobiellen Wachstums oder Stabilisation der Atmungsaktivität erhalten werden und wenn die Menge größer ist als 500 &mgr;M, kann das mikrobielle Wachstum inhibiert werden. Eine Konzentration des Eisenbestandteils liegt vorzugsweise bei 10 bis 300 &mgr;M, noch bevorzugter 20 bis 200 &mgr;M. Die Eisenverbindung kann auch dem Medium im Vorhinein zugefügt werden oder in einer späteren Stufe zugefügt werden.

Falls nötig, kann die so erzeugte 5-Aminolävulinsäure durch in der Regel verwendete Techniken abgetrennt und gereinigt werden, wie z.B. ein Ionenaustauschverfahren, ein Chromatographieverfahren, ein Extraktionsverfahren und ähnliche.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird unten, basierend auf den Beispielen erklärt. Diese werden jedoch nur für illustrative Zwecke dargestellt und die vorliegende Erfindung ist nicht darauf begrenzt.

Beispiel 1

In ein Teströhrchen mit einem Durchmesser von 21 mm werden 10 ml Glutamat/Glukosemedium (Medium 1), wie dargestellt in Tabelle 1 gegossen, 15 Minuten bei 121°C sterilisiert und dies läßt man dann zum Abkühlen stehen. Eine Schlaufe Rhodobacter sphaeroides CR-002 (FERM P-15312) wurde in das Medium inokuliert und unter Schütteln im Dunkeln 2 Tage bei 30°C kultiviert.

In ein weiteres Teströhrchen mit einem Durchmesser von 21 mm wurden 10 ml Medium 1 gegossen und auf dieselbe Weise wie oben beschrieben, sterilisiert. Ein 0,5 ml Teil der obigen Kulturbrühe wurde in das Medium inokuliert und unter Schütteln im Dunkeln 18 Stunden bei 32°C kultiviert.

Tabelle 1

Die Kulturbrühe wurde bei 3.000 × g 5 Minuten zum Waschen zentrifugiert, der resultierende Überstand wurde verworfen und dann wurden die Zellen in denselben Volumen eines Tris-Maleat-Puffers (pH 6,0) suspendiert. Dieser Waschschritt wurde weiterhin zweimal wiederholt.

Danach wurde die Suspension bei 3.000 × g 5 Minuten zentrifugiert, der resultierende Überstand wurde verworfen und dann wurden die Zellen in einem Tris-Maleat-Puffer (pH 6,0), enthaltend 100 &mgr;g/ml NTG, suspendiert und statisch bei Raumtemperatur 80 Minuten kultiviert.

Die so mutagenisierten Zellen wurden dreimal auf dieselbe Weise, wie oben beschrieben, gewaschen und dann in ein Teströhrchen inokuliert, das sterilisiertes Medium 1 enthielt und unter Schütteln im Dunkeln 2 Tage bei 32°C kultiviert.

Die so erhaltene Kulturbrühe wurde verdünnt und auf einem Agarplattenmedium verteilt, hergestellt durch Zugabe von 15 g/l Agar zum Medium 1 und Sterilisieren der Mischung bei 121°C für 15 Minuten und die Zellen wurden in Dunkeln für 4 Tage bei 32°C kultiviert.

Im Ergebnis wurden ungefähr 15.000 Kolonien erhalten.

Als nächstes wurde sterilisiertes Medium 1 in sterilisierte Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit 0,2 ml pro Vertiefung gegossen und jeder der oben beschriebenen, ungefähr 15.000 mutierten Stämme wurde in das Medium inokuliert.

Nach einem Kultivieren unter Schütteln im Dunkeln bei 30°C für 48 Stunden auf einer Schüttelvorrichtung für Mikrotiterplatten wurden sowohl Glycin als auch Lävulinsäure jeder Vertiefung zugefügt, um eine Endkonzentration von 30 mM zu ergeben, gefolgt von einer Kultivierung unter Rühren unter denselben Bedingungen für 24 Stunden.

5-Aminolävulinsäure in jeder Vertiefungen wurde, wie unten beschrieben, nachgewiesen (Ehrlich-Reaktion).

  • (1) Die Kulturbrühe in jeder Vertiefungen wurde in eine andere Mikrotiterplatte übertragen und mit 0,1 ml eines 1 M Acetatpuffers, enthaltend 1% Acetylaceton, vermischt und die Mikrotiterplatte wurde versiegelt, bei 100°C für 15 Minuten inkubiert und dann schnell auf Eis abgekühlt.
  • (2) Als nächstes wurden 0,1 ml einer Essigsäurelösung, enthaltend 2% p-Dimethylaminobenzaldehyd und 16% Perchlorsäure jeder Vertiefungen zugefügt und man ließ die Mischung bei Raumtemperatur 15 Minuten stehen, um eine Entwicklung einer rötlich-lila Farbe durch die Ehrlich-Reaktion zu beobachten.
  • (3) Danach wurde ein Teil von jeder Reaktionslösung als Probe genommen und einer DC-Analyse zum Ausschluss von Stämmen unterzogen, die eine rötlich-lila Farbe zeigten, die nicht von 5-Aminolävulinsäure abstammte, wodurch 6 mutierte Stämme selektiert wurden, die eine hohe Produktivität an 5-Aminolävulinsäure aufwiesen.

Jeder der so erhaltenen 6 Stämme wurde im Dunkeln bei 30°C 48 Stunden unter Verwendung eines Teströhrchens kultiviert, das Medium 1 enthielt und die resultierende Kulturbrühe wurde auf einem Agarplattenmedium mit einer Zusammensetzung von Medium 1 verteilt und zur Bildung von Kolonien kultiviert.

Als nächstes wurde sterilisiertes Medium 1 in Vertiefungen von sterilisierten Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit 0,2 ml pro Vertiefung gegossen und jede der optional selektierten 60 Kolonien, abstammend von jedem der oben beschriebenen Stämme, wurde in das Medium inokuliert.

Nach Kultivierung unter Schütteln im Dunkeln bei 32°C für 48 Stunden auf einer Schüttelvorrichtung für Mikrotiterplatten wurde Glycin jeder Vertiefung zugefügt, um eine Endkonzentration von 30 mM zu ergeben und 30, 15 oder 1 mM Lävulinsäure wurden den Vertiefungen zugefügt, korrespondierend zu 20 Kolonien der oben beschriebenen 60 Kolonien. Kultivierung unter Rühren wurde 24 Stunden unter denselben Bedingungen fortgesetzt und ein Teil der Kulturbrühe wurde von jeder Vertiefung zur Überprüfung der Produktivität an 5-Aminolävulinsäure als Probe entnommen und einer optimalen Konzentration von Lävulinsäure durch die Ehrlich-Reaktion. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt und ein mutierter Stamm mit einer stabil höheren Produktivität als CR-002 wurde unter Verwendung eines Anstiegs in der Produktivität und einer Variation der Produktivität unter den Kolonien als Indizes isoliert. Dieser Stamm wurde CR-150 genannt. Die optimale Konzentration der Lävulinsäure betrug 30 mM. Wenn die angehäufte Menge 5-Aminolävulinsäure im Fall einer Zugabe von 30 mM Lävulinsäure durch Messung der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung bestimmt wurde, zeigte der Stamm CR-002 eine Produktivität von 0,01 mM, während die des Stamms CR-150 0,1 mM betrug.

Beispiel 2

Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-150 verändert wurde, um dadurch ungefähr 15.000 mutierte Stämme zu erhalten. Indem sie den Selektiontests auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 unterzogen wurden, wurde ein mutierter Stamm CR-268 mit noch weiter verbesserter Produktivität als bei CR-150 erhalten. Wenn die angehäufte Menge 5-Aminolävulinsäure durch Messung der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung bestimmt wurde, zeigte der Stamm CR-268 eine Produktivität von 0,3 mM.

Beispiel 3

Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-268 geändert wurde, um dadurch ungefähr 15.000 mutierte Stämme zu erhalten. Indem sie denselben Selektionstests wie in Beispiel 1 unterzogen wurden, wurde ein mutierter Stamm CR-368 mit noch weiter verbesserter Produktivität als CR-268 erhalten. Wenn die angehäufte Menge 5-Aminolävulinsäure durch Messung der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung bestimmt wurde, zeigte der Stamm CR-368 eine Produktivität von 0,5 mM.

Beispiel 4

Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-368 geändert wurde, um dadurch ungefähr 15.000 mutierte Stämme zu erhalten. Indem sie denselben Selektionstests wie in Beispiel 1 unterzogen wurde, wurde ein mutierter Stamm CR-405 mit noch weiter verbesserter Produktivität als CR-368 erhalten. Wenn die angehäufte Menge 5-Aminolävulinsäure durch Messung der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung bestimmt wurde, zeigte der Stamm CR-405 eine Produktivität von 1,0 mM.

Beispiel 5

Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-405 geändert wurde, um dadurch ungefähr 15.000 mutierte Stämme zu erhalten. Indem sie denselben Selektionstests wie in Beispiel 1 unterzogen wurde, außer dass die angefügte Lävulinsäuremenge zu 15 mM geändert wurde, wurde ein mutierter Stamm CR-405 mit noch weiter verbesserter Produktivität als CR-468 erhalten. Wenn die angehäufte Menge 5-Aminolävulinsäure durch Messung der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung bestimmt wurde, zeigte der Stamm CR-405 eine Produktivität von 1,2 mM, während diejenige des Stamms CR-502 bei 2,1 mM lag.

Beispiel 6

Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-502 geändert wurde, um dadurch ungefähr 15.000 mutierte Stämme zu erhalten. Indem sie dem Selektionstest auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen wurden, außer dass die Menge an Lävulinsäure auf 1 mM geändert wurde, wurde ein mutierter Stamm CR-660 mit einer verbesserten Produktivität im Vergleich mit CR-502 erhalten. Wenn die angehäufte Menge 5-Aminolävulinsäure durch Messung der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung bestimmt wurde, zeigte der Stamm CR-502 eine Produktivität von 2,4 mM, während diejenige des Stamms CR-660 bei 3,3 mM lag.

Beispiel 7

Dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-660 geändert wurde, um dadurch ungefähr 15.000 mutierte Stämme zu erhalten. Indem sie dem Selektionstest auf dieselbe Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, unterzogen wurden, außer dass die Menge an Lävulinsäure auf 1 mM geändert wurde, wurden drei mutierte Stamm CR-0072001, CR-0072002 und CR-0072009 mit einer verbesserten Produktivität im Vergleich mit CR-660 erhalten. Wenn die angehäufte Menge 5-Aminolävulinsäure durch Messung der Absorption der Ehrlich-Reaktion bei 553 nm unter Verwendung einer Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung bestimmt wurde, zeigten die Stämme CR-0072001, CR-0072002 und CR-0072009 eine Produktivität von 5,9, 5,6 bzw. 4,6 mM.

Beispiel 8

Jeder der mutierten Stämme CR-0072001, CR-0072002 und CR-0072009, wie erhalten in Beispiel 7, wurde in einen Schüttelkolben mit einem Fassungsvermögen von 500 ml inokuliert, der 200 ml Medium 1 enthielt und unter Schütteln im Dunkeln bei 32°C 48 Stunden auf einer reziproken Schüttelvorrichtung kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die resultierenden Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 × g 10 Minuten gewonnen und im Medium 2, wie dargestellt in Tabelle 2, suspendiert, um eine Dichte von 0,5 g Feuchtzellen/10 ml zu ergeben und 3 ml der Suspension wurden in 21 mm Teströhrchen gegossen. Die Zellen in den so hergestellten Teströhrchen wurden unter Schütteln im Dunkeln 20 Stunden bei 32°C auf einer reziproken Schüttelvorrichtung kultiviert und die Menge der 5-Aminolävulinsäure in der Kulturbrühe wurde durch das Verfahren von Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Band 36, Nr. 8, Seiten 1494, 1990) gemessen. Im Ergebnis betrugen die Produktivitäten der Stämme CR-0072001, CR-0072002 und CR-0072009 19,0, 21,5 bzw. 31,0 mM.

Tabelle 2
Beispiel 9

Der mutierte Stamm CR-0072009 wurde in einen konischen Schikanen-Kolben mit einer 300 ml Kapazität, enthaltend 50 ml Medium 3, wie dargestellt in Tabelle 3, inokuliert und unter Schütteln im Dunkeln bei 32°C für 48 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde in einen 3 l Fermenter, enthaltend 1,8 l Medium 3, inokuliert und unter Schütteln bei 32°C mit einer Belüftungsrate von 0,36 l/min und 400 Upm kultiviert. Nach einer Kultivierung für 40 Stunden unter Einstellung des Medium-pHs auf 6,5 bis 6,6 unter Verwendung von Schwefelsäure und Natriumhydroxid wurden 0,210 g Lävulinsäure, 8,1 g Glycin und 18 g Hefeextrakt (D-3, hergestellt von Japan Pharmaceutical) dem Medium zugefügt und die Kultivierung wurde durch Veränderung der Rührgeschwindigkeit auf 325 Upm und Kontrolle des pHs des Mediums auf 6,3 bis 6,4 unter Verwendung von Schwefelsäure und Natriumhydroxid fortgesetzt. Ein 8,1 g Teil Glycin wurde 12, 26 und 38 Stunden später zugefügt. Die Kultivierung wurde 50 Stunden nach der Zugabe von Lävulinsäure beendet. Die 5-Aminolävulinsäuremenge in der Kulturbrühe betrug 60 mM, wenn sie durch das Verfahren von Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Band 36, Nr. 8, Seite 1494, 1990) gemessen wurde. Die durchschnittliche gelöste Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe nach Zugabe von Lävulinsäure betrug 0,01 ppm. Außerdem verlagerte sich das Oxidations-Reduktions-Potenzial in der Kulturbrühe nach Zugabe von Lävulinsäure in einen Bereich von –180 mV bis –50 mV.

Tabelle 3
Beispiel 10

Der mutierte Stamm CR-0072009 wurde in einen 300 ml konischen Schikanen-Kolben, enthaltend 50 ml Medium 3 inokuliert und unter Schütteln im Dunkeln 48 Stunden bei 32°C kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde in einen 3 l Fermenter, enthaltend 1,8 l Medium 3 inokuliert und unter Rühren bei 32°C mit einer Belüftungsrate von 0,36 l/min und 400 Upm kultiviert. Nach Kultivieren für 40 Stunden unter Kontrolle des pHs des Mediums auf 6,5 bis 6,6 unter Verwendung von Schwefelsäure und Natriumhydroxid wurden 0,210 g Lävulinsäure, 8,1 g Glycin und 18 g Hefeextrakt dem Medium zugefügt und das Kultivieren wurde durch Veränderung der Belüftungsrate und der Rührgeschwindigkeit auf 0,72 l/min bzw. 600 Upm fortgesetzt und wobei der pH des Mediums unter Verwendung von Schwefelsäure und Natriumhydroxid auf 6,3 bis 6,4 eingestellt wurde. Ein 8,1 g Teil Glycin wurde 12, 26 und 38 Stunden danach zugefügt. Die Kultivierung wurde 50 Stunden nach Zugabe von Lävulinsäure beendet. Die 5-Aminolävulinsäuremenge in der Kulturbrühe betrug 13 mM, wenn sie durch das Verfahren von Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Band 36, Nr. 8, Seite 1494, 1990) gemessen wurde. Die durchschnittliche gelöste Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe nach Zugabe von Lävulinsäure betrug 2,3 ppm. Außerdem lag das Oxidations-Reduktions-Potenzial in der Kulturbrühe nach Zugabe von Lävulinsäure verlagert in einem Bereich zu 50 mV bis 70 mV.

Beispiel 11

Der mutierte Stamm CR-0072009 wurde in einen 300 ml konischen Schikanen-Kolben, enthaltend 50 ml Medium 3 inokuliert und unter Schütteln im Dunkeln 48 Stunden bei 32°C kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde in einen 3 l Fermenter, enthaltend 1,8 l Medium 3 inokuliert und unter Rühren bei 32°C mit einer Belüftungsrate von 0,36 l/min und 400 Upm kultiviert. Nach Kultivieren für 40 Stunden unter Kontrolle des pHs des Mediums auf 6,5 bis 6,6 unter Verwendung von Schwefelsäure und Natriumhydroxid wurden 0,210 g Lävulinsäure, 8,1 g Glycin und 18 g Hefeextrakt dem Medium zugefügt und das Kultivieren wurde durch Veränderung der Belüftungsrate und der Rührgeschwindigkeit auf 0,18 l/min bzw. 200 Upm fortgesetzt und wobei der pH des Mediums unter Verwendung von Schwefelsäure und Natriumhydroxid auf 6,0 bis 6,5 eingestellt wurde. Ein 8,1 g Teil Glycin wurde 12 und 24 Stunden danach zugefügt. Die Kultivierung wurde 50 Stunden nach Zugabe von Lävulinsäure beendet. Die 5-Aminolävulinsäuremenge in der Kulturbrühe betrug 15 mM, wenn sie durch das Verfahren von Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Band 36, Nr. 8, Seite 1494, 1990) gemessen wurde. Die durchschnittliche gelöste Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe nach Zugabe von Lävulinsäure betrug weniger als die Nachweisgrenze. Außerdem lag das Oxidations-Reduktions-Potenzial in der Kulturbrühe nach Zugabe von Lävulinsäure verlagert in einem Bereich zu –220 mV bis –180 mV.

Wie in Beispiel 7 beschrieben, ist der mutierte Stamm CR-0072009, erhalten durch Wiederholung der Mutation unter Verwendung von Rhodobacter sphaeroides CR-002 als Elternstamm ein Stamm, der 5-Aminolävulinsäure in sehr hoher Konzentration unter Verwendung preisgünstiger Materialien wie Glukose, Glycin und ähnlichen erzeugen kann, so dass es möglich ist, 5-Aminolävulinsäure in industriellem Umfang unter Verwendung dieses Stamms zu erzeugen. Wie sich außerdem aus den Ergebnissen von Beispiele 10 und 11 ergibt, wird es bevorzugt, die gelöste Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe auf 2,0 ppm oder weniger nach Zugabe der Lävulinsäure einzustellen oder das Oxidations-Reduktions-Potenzial in der Kulturbrühe in einem Bereich von –220 mV bis 50 mV zu erhalten, um die Produktivität zu erhöhen und eine solche Kontrolle kann einfach durch Verminderung der Rühr-Rotationsgeschwindigkeit bewirkt werden.

Beispiel 12

Der mutierte Stamm CR-0072009 wurde in jeden von drei 300 ml konischen Schikanen-Kolben, enthaltend 50 ml Medium 3 inokuliert und unter Schütteln im Dunkeln 48 Stunden bei 32°C kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde in einen von drei 3 l Fermentern, enthaltend 1,8 l Medium 3 inokuliert und bei 32°C kultiviert. Die Kultivierung wurde 90 Stunden bei einer Belüftungsrate von 0,36 l/min fortgesetzt sowie einer Rührgeschwindigkeit von 400 Upm unter Einstellung des pHs des Mediums auf 6,5 bis 6,6 mit Schwefelsäure und Natriumhydroxid, außer dass die Rühr-Rotationsgeschwindigkeit von einem der drei Gefäße auf 250 Upm 25 Stunden nach der Kultivierung geändert wurde. Während der Kultivierung wurde die gelöste Sauerstoffkonzentration und die 5-Aminolävulinat-Synthaseaktivität gemessen. Die 5-Aminolävulinat-Synthaseaktivität wurde, wie unten beschrieben, gemessen.

Ein ungefähr 30 ml Teil der Kulturbrühe wurde genommen und zum Gewinnen von Zellen zentrifugiert. Die so gewonnenen Zellen wurden mit einem Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,2) gewaschen, in 5 ml desselben Puffers resuspendiert, durch eine French Press auf die übliche Weise aufgebrochen und dann bei 10.000 × g 30 Minuten zentrifugiert und der so erhaltene Überstand wurde als Rohenzymlösung der 5-Aminolävulinsäuresynthase verwendet.

Eine Enzymreaktionslösung wurde durch Zugabe von 50 mM Glycin, 0,1 mM Pyridoxalphosphat, 1 mM EDTA und 1,0 mg Protein/ml der oben beschriebenen Rohenzymlösung zu 1 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,2) hergestellt. Dieses wurde mit Succinyl-CoA zum Erhalt einer Endkonzentration von 0,2 mM vermischt und bei 37°C inkubiert. Nach einer Inkubation für 15 Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 ml 10 Vol% Trichloressigsäure beendet.

Die Reaktionslösung wurde bei 3.500 Upm 10 Minuten zentrifugiert, 1 ml des resultierenden Überstandes wurde mit 2 ml eines 1 M Acetatpuffers (pH 4,7) vermischt, enthaltend 1% Acetylaceton und man ließ die Mischung 15 Minuten bei 100°C reagieren und sie wurde dann schnell mit Eis abgekühlt. Ein 3,5 ml Anteil Ehrlich's-Reagenz wurde dazugefügt, um 15 Minuten danach die Menge der erzeugten Pyrrolverbindung zu messen, basierend auf der Absorption bei 553 nm, und dadurch die erzeugte Menge 5-Aminolävulinsäure (a) durch die Enzymreaktion zu berechnen.

Eine Bildungsrate der 5-Aminolävulinsäure wurde basierend auf der folgenden Formel berechnet und als 5-Aminolävulinsäure-Synthaseaktivität verwendet. Die Beziehung zwischen der gelösten Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe und der 5-Aminolävulinsäure-Synthaseaktivität während der Kultivierung ist in 1 und Tabelle 4 dargestellt.

Außerdem korrespondiert in 1 eine 10%ige gelöste Sauerstoffkonzentration zu 0,7 ppm und eine 90%ige gelöste Sauerstoffkonzentration zu 6,6 ppm.

v:
Enzymaktivität (nmol/min/mg Protein)
a:
5-Aminolävulinsäure in 1 ml Enzymreaktionslösung (nmol)
p:
Proteinmenge in 1 ml Enzymreaktionslösung (= 1 mg)
t:
Reaktionszeit (= 15 min)

Vergleichsbeispiel 1

Das Verfahren von Beispiel 10 wurde wiederholt, außer dass der Stamm zu CR-002 geändert wurde. Die Ergebnisse sind in 1 und Tabelle 4 dargestellt.

Wie aus 1 deutlich wird, tritt eine Inhibition der 5-Aminolävulinat-Synthaseaktivität, die den Wildtypstämmen der Fotosynthesebakterien gemein ist, bei dem Stamm CR-0072009 selbst unter solchen Bedingungen kaum auf, dass die gelöste Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe 2 ppm überschreitet.

Tabelle 4
Beispiel 13

Der folgende Test wurde unter Verwendung von dem in Beispiel 9 verwendeten Medium 3 durchgeführt, außer dass der Hefeextrakt des Mediums auf 5,0 g/l Hefeextrakt B, hergestellt von einem anderen Hersteller (B-2, hergestellt von Oriental Yeast) verändert wurde. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 9 wurde der mutierte Stamm CR-0072009 unter Rühren für 48 Stunden in einem 300 ml konischen Schikanen-Kolben kultiviert, die resultierende Kulturbrühe wurde in 1,8 l Medium 3 inokuliert, hergestellt unter Verwendung von Hefeextrakt B in einem 3 l Fermenter und bei 32°C mit einer Belüftungsrate von 0,36 l/min und 400 Upm kultiviert und die Kultivierung wurde durch Zugabe von 0,210 g Lävulinsäure, 8,1 g Glycin und 18 g Hefeextrakt B fortgesetzt und durch Erniedrigung der Rühr-Rotationsgeschwindigkeit auf 325 Upm. Nach Zugabe von Lävulinsäure verblieb die gelöste Sauerstoffkonzentration auf einem Niveau von 0,5 ppm für ungefähr 4 Stunden, stieg jedoch nach 5 Stunden wieder an. Nach 6 Stunden stieg sie auf 4 ppm und die Produktion von 5-Aminolävulinsäure endete bei 10 mM. Wenn Eisenchlorid zugefügt wurde, um eine Endkonzentration von 20 &mgr;M zu ergeben, reduzierte sich die gelöste Sauerstoffkonzentration wieder auf 0,5 ppm oder weniger und die Produktion von 5-Aminolävulinsäure begann wiederum innerhalb von 2 Stunden nach der Zugabe, so dass Glycin in 8,1 g Teilen 12, 26 und 38 Stunden danach zugefügt wurde. Die Kultivierung wurde 50 Stunden nach Zugabe von Lävulinsäure beendet. Die Menge der 5-Aminolävulinsäure in der Kulturbrühe betrug 40 mM, gemessen durch das Verfahren von Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Band 36, Nr. 8, Seite 1494, 1990).

Wie sich aus Beispiel 13 ergibt, hatte die Zugabe einer Eisenverbindung die Wirkung, die Respiration wieder anzukurbeln.

Referenzbeispiel 1

Wenn durch das ICP-Masseverfahren überprüft, betrugen die Eisenmengen im Hefeextrakt, wie verwendet in Beispiel 9, dem Hefeextrakt B, wie verwendet in Beispiel 13 und einem weiteren Hefeextrakt C eines anderen Herstellers (Industrial Yeast Extract, hergestellt durch Oriental Yeast), verwendet in den folgenden Beispielen 73 &mgr;g, 25 &mgr;g bzw. 155 &mgr;g pro Gramm von jedem Hefeextrakt.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Eisenmengen im Medium 3, hergestellt unter Verwendung dieser Hefeextrakte, 6,64, 2,27 bzw. 14,1 &mgr;M betrugen. So wurde festgestellt, dass 20 &mgr;M Eisen in der Kulturbrühe zum Zeitpunkt der Produktion von 5-Aminolävulinsäure in Beispiel 9 enthalten waren, und dass das Medium von Beispiel 13 6,8 &mgr;M Eisen vor Zugabe der Eisenverbindung enthält und 26,8 &mgr;M nach Eisenzugabe.

Beispiel 14

Der mutierte Stamm CR-0072009 (1 ml Kulturbrühe, erhalten durch Kultivierung des Stamms für 48 Stunden unter Verwendung von 10 ml Hefeextrakt C in einem Teströhrchen mit einem Durchmesser von 21 mm (optische Dichte bei 660 nm, 0,2)) wurde in einen 300 ml konischen Schikanen-Kolben inokuliert, enthaltend 50 ml eines Mediums, hergestellt durch Zugabe von 0,5, 10, 20, 50, 200 oder 1.000 &mgr;M Eisenchlorid zu Medium 3, worin der Hefeextrakt durch 3 g/l Hefeextrakt C ersetzt worden war und der Stamm wurde mit Rotationsrühren im Dunkeln bei 32°C kultiviert. Wenn die in dem Hefeextrakt enthaltene Eisenkomponente enthalten ist, enthält dieses Medium den in Tabelle 5 dargestellten Gesamteisengehalt. Die Ergebnisse der Messung der Zelldichte als optische Dichte bei 660 nm 30 Stunden nach Kultivierung sind ebenfalls in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5

Wie aus Tabelle 5 deutlich wird, hatte die Addition der geeigneten Menge der Eisenkomponente die Wirkung, die Wachstumsrate zu erhöhen.

Beispiel 15

Dasselbe Volumen des mutierten Stamms CR-0072009, wie beschrieben in Beispiel 14 wurde in einen 300 ml konischen Schikanen-Kolben inokuliert, enthaltend 50 ml eines Mediums, hergestellt durch Zugabe von 20 &mgr;M Eisenchlorid zu Medium 3, worin der Hefeextrakt durch 3 g/l Hefeextrakt C ersetzt worden war und der Stamm wurde unter Rotationsschütteln im Dunkeln bei 32°C für 48 Stunden kultiviert. Ein Anteil der resultierenden Kulturbrühe wurde in 1,8 l des oben beschriebenen Mediums in einen 3 l Fermenter inokuliert und unter Rühren bei 32°C mit einer Belüftungsrate von 0,36 l/min und 400 Upm kultiviert. Nach Kultivierung für 24 Stunden wurden 0,210 g Lävulinsäure, 8,1 g Glycin und 9 g Hefeextrakt C dem Medium zugefügt und das Kultivieren wurde durch Abnahme der Rühr-Rotationsgeschwindigkeit auf 325 Upm fortgesetzt und durch Einstellung des pHs des Mediums auf 6,3 bis 6,4 unter Verwendung von Schwefelsäure und Natriumhydroxid. Ein 8,1 g Anteil Glycin wurde weiterhin 12, 26 und 38 Stunden danach zugefügt. Die Kultivierung wurde 50 Stunden nach der Addition von Lävulinsäure beendet. Die Menge der 5-Aminolävulinsäure in der Kulturbrühe betrug 55 mM, gemessen durch das Verfahren von Okayama et al. (CLINICAL CHEMISTRY, Band 36, Nr. 8, Seite 1494, 1990). In diesem Fall betrug die durchschnittliche gelöste Sauerstoffkonzentration in der Kulturbrühe nach Zugabe von Lävulinsäure 0,01 ppm. Außerdem verlagerte sich das Oxidations-Reduktions-Potenzial in der Kulturbrühe nach Addition von Lävulinsäure in einen Bereich von –180 mV bis –50 mV.

Gewerbliche Anwendbarkeit

Der Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung hat eine ausgezeichnete Produktivität von 5-Aminolävulinsäure und das 5-Aminolävulinsäure-Produktionsverfahren unter Verwendung des Mikroorganismus benötigt keine spezifischen Mittel, wie z.B. die Zufuhr von Stickstoffgas oder ähnlichen, selbst unter Bedingungen, unter denen die gelöste Sauerstoffkonzentration relativ hoch ist, so dass dadurch 5-Aminolävulinsäure industriell vorteilhaft erzeugt werden kann.


Anspruch[de]
  1. 5-Aminolävulinsäure-produzierender Mikroorganismus mit einer 5-Aminolävulinsäure-Synthaseaktivität von 2 bis 7 (nmol/min/mg Protein) unter aeroben Kulturbedingungen mit einer gelösten Sauerstoffkonzentration von 0,70 bis 6,60 ppm, wobei der Mikroorganismus Rhodobacter sphaeroides CR-0072009 (FERM BP-6320) oder ein mutierter Stamm davon ist.
  2. Verfahren zur Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure, umfassend das Kultivieren von mindestens einem der 5-Aminolävulinsäure-produzierenden Mikroorganismen gemäss Anspruch 1 und Gewinnen der 5-Aminolävulinsäure aus der resultierenden Kultur.
  3. Verfahren gemäss Anspruch 2, wobei Lävulinsäure oder Glycin während der Kultivierung zugefügt wird.
  4. Verfahren gemäss Anspruch 3, wobei das Glycin in einer Menge von 10 bis 200 mM pro Zugabe zugefügt wird.
  5. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die Kultivierung bei einer gelösten Sauerstoffkonzentration von 0,001 bis 2 ppm und einem Oxidations-Reduktionspotential von –220 bis 50 mV in der Kultur durchgeführt wird.
  6. Verfahren zur Erzeugung von 5-Aminolävulinsäure, umfassend das Kultivieren eines 5-Aminolävulinsäureproduzierenden Mikroorganismus in einem Medium, enthaltend einen Eisenbestandteil in einer Menge von 5 bis 500 ?M und Gewinnen der 5-Aminolävulinsäure aus der resultierenden Kultur, wobei der 5-Aminolävulinsäure-produzierende Mikroorganismus mindestens einer der Mikroorganismen gemäss Anspruch 1 ist.
  7. Verfahren zur Kultivierung eines 5-Aminolävulinsäureproduzierenden Mikroorganismus, umfassend das Kultivieren eines 5-Aminolävulinsäure-produzierenden Mikroorganismus in einem Medium, enthaltend einen Eisenbestandteil in einer Menge von 5 bis 500 ?M, wobei der 5-Aminolävulinsäure-produzierende Mikroorganismus mindestens einer der Mikroorganismen gemäss Anspruch 1 ist.
Es folgt ein Blatt Zeichnungen






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