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Dokumentenidentifikation DE69634820T2 23.03.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000848615
Titel IMPFSTOFF GEGEN MEHRERE FIV-SUBTYPEN
Anmelder University of Florida Research Foundation, Inc., Gainesville, Fla., US;
Regents of the University of California, Oakland, Calif., US
Erfinder YAMAMOTO, K., Janet, Gainesville, US
Vertreter Barz, P., Dipl.-Chem. Dr.rer.nat., Pat.-Anw., 80803 München
DE-Aktenzeichen 69634820
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.08.1996
EP-Aktenzeichen 969289891
WO-Anmeldetag 23.08.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/US96/13580
WO-Veröffentlichungsnummer 0097007817
WO-Veröffentlichungsdatum 06.03.1997
EP-Offenlegungsdatum 24.06.1998
EP date of grant 08.06.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 23.03.2006
IPC-Hauptklasse A61K 39/21(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 5/06(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/569(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung

Bei Hauskatzen treten Infektionen durch mehrere Retroviren auf, einschließlich felines Leukämie-Virus (FeLV), felines Sarcoma-Virus (FeSV), endogenes Typ C-Oncoronavirus (RD-114) und felines Syncytia-bildendes Virus (FeSFV). Darunter stellt FeLV das wichtigste Pathogen dar, das verschiedene Symptome hervorruft, einschließlich lymphoretikuläre und myeloide Neoplasmen, Anämien, immunvermittelte Störungen und ein Immunschwächesyndrom, das Ähnlichkeiten mit dem humanen erworbenen Immunschwächesyndrom (AIDS) aufweist. Kürzlich wurde eine spezielle replikationsdefektive FeLV-Mutante mit der Bezeichnung FeLV-AIDS in spezieller Weise mit immunosuppressiven Eigenschaften in Verbindung gebracht.

Über die Entdeckung des felinen T-lymphotropen Lentivirus (jetzt als feliner Immunschwächevirus, FIV bezeichnet) berichteten zunächst Pedersen et al. (1987). Über die Eigenschaften von FIV berichteten Yamamoto et al. (1988a); Yamamoto et al (1988b); und Ackley et al. (1990). Seroepidemiologische Daten haben gezeigt, dass FIV-Infektionen bei Hauskatzen und Wildkatzen in der gesamten Welt angeboren sind. Eine große Vielzahl von Symptomen tritt bei Infektionen mit FIV auf, einschließlich Abort, Alopezie, Anämie, Konjunktivitis, chronische Rhinitis, Enteritis, Gingivitis, Hämatochezie, neurologische Abnormalitäten, Periodontitis und seborrhoische Dermatitis. Das immunologische Kennzeichen von Hauskatzen, die mit FIV infiziert sind, ist eine chronische und progressive Verarmung an felinen peripheren CD4+-Blutlymphozyten, eine Verringerung des CD4:CD8-Zellverhältnisses und in einigen Fällen eine Zunahme von CD8 aufweisenden Lymphozyten. Auf der Grundlage der molekularen, biochemischen und immunopathologischen Eigenschaften wird eine FIV-Infektion von Katzen nunmehr als ein AIDS-Katzenmodell angesehen, das besser ist als FeLV-FAIDS.

Über eine Klonierung und Sequenzanalyse von FIV berichten Olmsted et al. (1989a); Olmsted et al. (1989b); und Talbott et al. (1989). Hosie und Jarret (1990) beschreiben die serologische Reaktion von mit FIV infizierten Katzen. FIV-Virus-Subtypen lassen sich entsprechend dem Immunotyp auf der Grundlage der Konzentration an kreuzneutralisierenden Antikörpern, die durch jeden Stamm hervorgerufen werden, klassifizieren (Murphy und Kingsbury, 1990). Neuerdings werden Viren in Subtypen gemäß dem Genotyp auf der Grundlage der Nucleotidsequenzhomologie klassifiziert. Obgleich die HIV- und FIV-Subtypisierung auf dem Genotyp beruht (Sodora et al., 1994; Rigby et al., 1993; und Louwagie et al., 1993), ist wenig über den Zusammenhang zwischen dem Genotyp und dem Immunotyp von Subtypen bekannt. Virale FIV-Isolate werden derzeit in vier FIV-Subtypen eingeteilt: A, B, C und D. (Kakinuma et al., 1995). Infektiöse Isolate und infektiöse molekulare Klone wurden für sämtliche FIV-Subtypen beschrieben, ausgenommen der Subtyp C (Sodora et al., 1994). Der Subtyp C-FIV wurde nur aus zellulärer DNA von Katzen aus Kanada identifiziert (Sodora et al., 1994; Rigby et al., 1993; Kakinuma et al., 1995).

Eine Hauptschwierigkeit bei der Entwicklung eines FIV-Impfstoffes besteht in der Identifizierung eines Impfweges, der gegen einen breiten Bereich von FIV-Stämmen wirksam ist, einschließlich Feldisolaten aus verschiedenen Subtypen oder Stämmen. Eine Impfstoffprophylaxe für FIV wurden gegen homologe und leicht heterologe Stämme unter Verwendung eines Einzelstamm-Impfstoffes erreicht, jedoch nicht gegen eine Belastung durch mäßig bis stark heterologe Stämme (Johnson et al., 1994; Yamamoto et al., 1993). Somit bleibt ein Bedürfnis nach einem Impfstoff bestehen, der gegen multiple FIV-Subtypen schützt.

Kurze zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Impfstoff, der eine breitgefächerte Schutzimmunität gegen FIV-Infektionen in einem Wirtstier hervorruft. Speziell betrifft die vorliegende Erfindung einen Multi-Subtyp-FIV-Impfstoff, der unter Verwendung von zellfreien Virusisolaten aus verschiedenen FIV-Subtypen oder einer Kombination von Zelllinien, die jeweils mit einem unterschiedlichen Prototyp-FIV-Virus aus einem unterschiedlichen Subtyp infiziert worden sind, hergestellt wird. Mit den erfindungsgemäßen FIV-Impfstoffen geimpfte Katzen entwickeln humorale und zelluläre Immunreaktionen gegen homologe und heterologe FIV-Stämme.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner neuartige feline Zelllinien, die gegen eine Infektion durch multiple FIV-Subtypen empfindlich sind. Die erfindungsgemäßen Zelllinien eignen sich zur Vermehrung und Erzeugung multipler FIV-Subtypen sowie zur Verwendung in FIV-Impfstoffen gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren. Ferner können die Zelllinien auch anstelle von felinen, peripheren, mononuklearen Blutzellen (PBMC) in viralen FIV-Neutralisationstests von felinen Antiseren verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 zeigt die reversen Transkriptase (RT)-Konzentrationen von FIVBang und FIVShi, die nach Infektion von FeT-1C- und FeT-J-Zelllinien mit diesen FIV-Stämmen gebildet worden sind.

2 zeigt die Immunoreaktion von anti-FIV-Antikörpern von Zweifach-Subtyp-geimpften Katzen mit FIV-Proteinen gemäß Nachweis durch Immunoblot. Die Zahl über jedem Blot gibt die Anzahl der Impfungen wieder, die das Tier beim Testen des Serums erhalten hat.

3 zeigt die Immunoreaktion von anti-FIV-Antikörpern von Dreifach-Subtyp-geimpften Katzen mit FIV-Proteinen gemäß Nachweis durch Immunoblot. Die Zahl über jedem Blot gibt die Anzahl von Impfungen wieder, die das Tier beim Testen des Serums erhalten hat.

4 zeigt die Immunoreaktivität von anti-FIV-Antikörpern von Dreifach-Subtyp-geimpften Katzen mit FIV SU-V3-2-Peptid gemäß Nachweis durch ELISA.

5 zeigt die Immunoreaktivität von anti-FIV-Antikörpern aus Dreifach-Subtyp-geimpften Katzen mit FIV TM-C1-Peptid gemäß Nachweis durch ELISA.

6 zeigt Kreuzneutralisations-Antikörpertiter von Seren aus Katzen, die mit FIVPet (Ap), FIVDix (AD), FIVUK8 (AU), FIVBang (BB), FIVAom1 (BA) und FIVShi (DS) infiziert sind. Seren vor der Infektion (Spalte 1), 6 Monate nach der Infektion (Spalte 2) und 12 Monate nach der Infektion (Spalte 3) wurden gegen Subtyp A FIVPet, Subtyp B FIVBang und Subtyp D FIVShi in der FeT-1C-Zelllinie getestet. Es wurden mindestens drei Katzen pro Stamm getestet. Die Ergebnisse zeigen VN-Titer einer repräsentativen Katze aus jedem Stamm. Ähnliche Ergebnisse wurden unter Verwendung von primären PBMC für den VN-Test erhalten.

Kurze Beschreibung der Sequenzen

SEQ ID NO. 1 ist eine Aminosäuresequenz eines FIV-Oberflächenhüllpeptids mit der Bezeichnung SV-V3-2.

SEQ ID NO. 2 ist eine Aminosäuresequenz eines FIV-Transmembranpeptids mit der Bezeichnung TM-C1.

SEQ ID NO. 3 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 4 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 5 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 6 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 7 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 8 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 9 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 10 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 11 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 12 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 13 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 14 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 15 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

SEQ ID NO. 16 ist eine Nucleotidsequenz eines FIV-PCR-Primers.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren und Impfstoffzusammensetzungen, die sich zum Induzieren einer schützenden Immunität gegen FIV-Infektionen bei einem empfindlichen Wirtstier eignen. Die hier beschriebenen Impfstoffzusammensetzungen rufen bei Verabreichung an ein Wirtstier schützende humorale und zelluläre Immunreaktionen gegen Infektionen durch homologe und heterologe Stämme von FIV hervor. Die Impfstoffzusammensetzungen können entweder zellfreie, virale FIV-Isolate oder FIV-infizierte Zelllinien umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung FIV-Stämme aus zwei verschiedenen FIV-Subtypen. Vorzugsweise umfasst die Impfstoffzusammensetzung drei FIV-Stämme, wobei jeder Stamm aus einem unterschiedlichen FIV-Subtyp stammt. Insbesondere ist in der Impfstoffzusammensetzung mindestens ein FIV-Stamm aus jedem FIV-Subtyp A, Subtyp B und Subtyp D enthalten.

In einer speziellen Ausführungsform umfasst die Impfstoffzusammensetzung FIVPet- und FIVShi-infizierte Zelllinien. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Impfstoffzusammensetzung FIVPet-, FIVBang- und FIVShi-infizierte Zelllinien. Die Verwendung von anderen FIV-Stämmen, die für die Gesamtheit oder einen Teil von FIV-Subtypen repräsentativ sind, kommt erfindungsgemäß speziell in Frage. Beispielsweise können FIVDix oder FIVUK8 in die Impfstoffzusammensetzungen zusätzlich oder anstelle von FIVPet aufgenommen werden, um einen FIV-Subtyp A-Prototyp-Virus bereitzustellen. Ähnliche Zusätze oder Austauschvorgänge mit anderen FIV-Stämmen können für FIV-Subtyp B und D-Prototyp-Viren vorgenommen werden.

Wie hier ausgeführt, können die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen zellfreies FIV-Virus oder Portionen des Virus, FIV-Proteine und -Polypeptide sowie FIV-infizierte Zelllinien oder eine Kombination von zellfreiem Virus und infizierten Zelllinien umfassen. Impfstoffzusammensetzungen mit einem Gehalt an FIV-infizierten Zelllinien können multiple Zelllinien, die jeweils mit einem unterschiedlichen FIV-Subtyp infiziert sind, umfassen. Die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen können auch rekombinante, virale FIV-Konstrukte auf Vektorbasis umfassen, die beispielsweise FIV env, gag/pro oder env-gag/pro enthalten können. Beliebige geeignete virale Vektoren, die zur Herstellung von rekombinanten Vektor/FIV-Konstrukten verwendet werden können, kommen zur erfindungsgemäßen Verwendung in Betracht. Beispielsweise können virale Vektoren, die sich von Adenovirus, Avipox, felinem Herpesvirus, Vaccinia, Canarypox, Entomopox, Schweinepocken und anderen bekannten Arten ableiten, im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren verwendet werden. Rekombinante Polynucleotid-Vektoren, die für FIV-Komponenten kodieren und diese exprimieren, können unter Einsatz üblicher gentechnischer Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, konstruiert werden. Ferner können die hier beschriebenen verschiedenen Impfstoffzusammensetzungen getrennt und in Kombination miteinander verwendet werden. Beispielsweise kann man sich für primäre Immunisierungen eines Tiers rekombinanter FIV-Konstrukte auf Vektorbasis, die einfache oder multiple Subtyp-Komponenten aufweisen, bedienen, wonach sekundäre Auffrischungen mit Impfstoffzusammensetzungen folgen, die inaktivierte, FIV-infizierte Zelllinien umfassen. Weitere Immunisierungsverfahren mit den erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen ergeben sich für den Fachmann und fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.

Die hier speziell beschriebenen Multi-Subtyp-FIV-Impfstoffe wurden auf ihre Immunogenizität und Wirksamkeit an Katzen getestet. Spezifische pathogenfreie (SPF) Katzen, die mit den erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen geimpft worden waren, wurden auf ihre humoralen und zellulären Immunreaktionen vor und nach Belastung mit homologen und heterologen FIV-Stämmen überwacht. Die humoralen Reaktionen wurden durch Messen der viralen neutralisierenden (VN) Antikörperaktivität überwacht und die zellulären Reaktionen wurden durch Messen der zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL)-Aktivität überwacht. Seren und Immunozyten von geimpften Katzen wurden in vitro auf VN- bzw. CTL-Aktivitäten gegen homologe und heterologe FIV-Stämme getestet. Dabei wurde nachgewiesen, dass die Impfstoffe einen breit gefächerten Schutz gegen FIV-Infektionen hervorrufen. Gemäß der Lehre der vorliegenden Erfindung lässt sich durch Kombination von Prototyp-Virus-Isolaten aus verschiedenen FIV-Subtypen oder durch Kombination individueller Zellen, die mit Prototyp-Virus verschiedener Subtypen infiziert sind, ein wirksamer Multi-Subtyp-FIV-Impfstoff herstellen.

Sämtliche FIV-Stämme kommen neben den hier speziell durch Beispiele belegten Stämmen für die erfindungsgemäße Verwendung in Frage. Zahlreiche FIV-Isolate sind in der Literatur beschrieben und sind dem Fachmann geläufig. FIVPet wird im US-Patent 5 037 753 beschrieben. Andere FIV-Isolate, die beschrieben worden sind, lassen sich leicht vom Fachmann unter Anwendung üblicher Techniken aus infizierten Katzen isolieren. Verfahren zum Isolieren und Züchten von FIV werden in den US-Patenten 5 037 753 und 5 118 602 beschrieben.

Die hier durch Beispiele belegten neuen Zelllinien können in den erfindungsgemäßen Impfverfahren und Impfstoffzusammensetzungen verwendet werden. Weitere Zellen oder Zelllinien, die gegenüber Infektionen durch FIV-Stämme empfindlich sind, einschließlich periphere mononukleare Blutzellen, kommen ebenfalls für die erfindungsgemäße Verwendung in Betracht.

Natürliche, rekombinante oder synthetische Polypeptide von viralen FIV-Proteinen und Peptidfragmente davon können ebenfalls gemäß den vorliegenden Verfahren als Impfstoffzusammensetzungen eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden FIV-Polypeptide, die sich von multiplen FIV-Untertypen ableiten, in einer Impfstoffzusammensetzung kombiniert und zum Impfen eines Wirtstiers verwendet. Beispielsweise können Polypeptide auf der Grundlage des FIV-Hüllglycoproteins von mindestens zwei Prototyp-FIV-Stämmen unterschiedlicher Subtypen im Impfstoff kombiniert werden. Die Polypeptide können zu einem Stamm homolog sein oder sie können "hybride" oder "chimäre" Polypeptide umfassen, deren Aminosäuresequenz sich durch eine Verbindung oder Verknüpfung von Polypeptiden von mindestens zwei unterschiedlichen FIV-Subtypen ableitet. Verfahren zur Herstellung von FIV-Polypeptiden sind aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielsweise lassen sich FIV-Polypeptide unter Anwendung von Festphasen-Syntheseverfahren herstellen (Merrifield, 1963). FIV-Polypeptide können auch unter Anwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden, wobei ein Polynucleotidmolekül, das für ein FIV-Protein oder -Peptid kodiert, in einer Wirtszelle, wie Bakterien, Hefe oder Säugetierzelllinien, exprimiert wird und das exprimierte Protein unter Anwendung üblicher Techniken gereinigt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner neue feline T-Zelllinien, die gegenüber FIV-Infektionen empfindlich sind. Sowohl von Interleukin-2 (IL-2) abhängige als auch unabhängige Zellen werden speziell durch Beispiele belegt. Die Zelllinien mit den Bezeichnungen FeT-1C und FeT-J werden hier beschrieben. Die FeT-1C-Zellinie ist von IL-2 abhängig, während die FeT-J-Zelllinie von IL-2 unabhängig ist. Die erfindungsgemäßen Zelllinien eignen sich zur Bereitstellung eines Vehikels für die FIV-Immunisierung von Katzen sowie zur in vitro-Vermehrung und -Erzeugung von viralen FIV-Stämmen. Sowohl die von IL-2 abhängige nicht-infizierte Zelllinie als auch die von IL-2 unabhängige, nicht-infizierte FeT-J-Zelllinie wurden 20-mal auf ihre reverse Transkriptase (RT) – Aktivität in Kulturflüssigkeiten und auf die provirale FIV-Sequenz durch PCR getestet. Ihre FIV-negative Beschaffenheit wurde bestätigt. Die FeT-J-Zelllinie war hochgradig mit sämtlichen getesteten FIV-Stämmen infizierbar, einschließlich FIVShi, FIVDix, FIVUK8, FIVPet und FIVBang, war aber schwieriger direkt mit FIVShi zu infizieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner zelluläre Produkte, die durch die erfindungsgemäßen Zelllinien erzeugt worden sind. Die zellulären Produkte lassen sich unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren isolieren und nachweisen. Antikörper gegen die Zelllinien können ferner unter Anwendung bekannter Verfahren erzeugt werden und fallen unter die vorliegende Erfindung.

Die nicht-infizierten FIV-Zelllinien mit den Bezeichnungen FeT-IC (ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11968) und FeT-J (ATCC-Hinterlegungsnummer CRL 11967) wurden beide bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, am 24. August 1995 hinterlegt. Infizierte FIVBang- (ATCC-Hinterlegungsnummer 11975) und FIVShi- (ATCC-Hinterlegungsnummer 11976)-Zelllinien wurden bei der American Type Culture Collection am 25. August 1995 hinterlegt.

Nach den erfindungsgemäßen Verfahren werden die hier beschriebenen FIV-Impfstoffzusammensetzungen an empfindliche Wirte, typischerweise Hauskatzen, in einer wirksamen Menge und auf eine solche Art verabreicht, dass eine schützende Immunität gegen eine anschließende Belastung oder Infektion des Wirts durch FIV herbeigeführt wird. Die Impfstoffe werden typischerweise parenteral durch Injektion, beispielsweise subkutan, intraperitoneal oder intramuskulär, verabreicht. Zu weiteren geeigneten Verabreichungsarten gehören eine orale oder nasale Verabreichung. Üblicherweise werden die Impfstoffe einem Wirt mindestens 2-mal verabreicht, mit einem Abstand von einer oder mehreren Wochen zwischen den einzelnen Verabreichungen. Jedoch kommen auch andere Dosierungsschemata für die anfängliche Verabreichung und die Auffrischungsverabreichung des Impfstoffes in Frage, was von der Beurteilung durch den Praktiker und dem speziellen, zu behandelnden Wirtstier abhängen kann.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen lassen sich gemäß aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren herstellen. Beispielsweise werden die Impfstoffe typischerweise in Form von Injektionspräparaten, z. B. flüssigen Lösungen oder Suspensionen, hergestellt. Die Impfstoffe werden in einer Art und Weise, die mit der Dosierungsformulierung verträglich ist, und in einer Menge, die therapeutisch wirksam ist und beim Empfänger immunogen wirkt, verabreicht. Die optimalen Dosierungen und Verabreichungsmuster für eine spezielle Impfstoffzubereitung lassen sich vom Fachmann leicht bestimmen.

Virus und Zellen in einer Impfstoffzubereitung lassen sich unter Anwendung bekannter Verfahren inaktivieren oder abschwächen. Beispielsweise können das gesamte Virus und infizierte Zellen durch Einwirkung von Paraformaldehyd, Formalin, Phenol, UV-Licht, erhöhten Temperaturen und dergl. inaktiviert oder abgeschwächt werden. Die Menge des zellfreien, vollständigen FIV-Virus in einer Impfstoffdosis liegt üblicherweise im Bereich von etwa 0,1 mg bis etwa 5 mg und insbesondere im Bereich von etwa 0,2 mg bis etwa 2 mg. Die Dosierung für Impfstoffzubereitungen mit einem Gehalt an FIV-infizierten Zelllinien beträgt üblicherweise etwa 106 bis etwa 108 Zellen pro Dosis und insbesondere etwa 5 × 106 bis etwa 7,5 × 107 Zellen pro Dosis.

Virus oder Zellen werden typischerweise unmittelbar vor der Verabreichung mit einem Adjuvans vereinigt. Bei Adjuvantien, die in Impfstoffzubereitungen verwendet werden, handelt es sich typischerweise um Threonylmuramyl-dipeptid (MDP) (Byars et al., 1987) oder um eine Kombination von komplettem und inkomplettem Freund-Adjuvans. Eine Vielzahl anderer Adjuvantien, die sich zur Anwendung im Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Verfahren und Impfstoffen eignen, wie Alaun, sind aus dem Stand der Technik bekannt und kommen für die vorliegende Erfindung in Frage.

Die Erfindung betrifft ferner ein neues Verfahren zur Bestimmung von Virus-neutralisierenden (VN) Antikörpern in einer Probe unter Verwendung der erfindungsgemäßen nicht-infizierten Zelllinien. Im Gegensatz zu PBMC, die nach einer begrenzten Anzahl von Passagen ihre Lebensfähigkeit verlieren und sich nicht so bereitwillig wie FeT-1C- oder FeT-J-Zellen vermehren, handelt es sich bei FeT-1C- und FeT-J-Zellen um eingeführte Zelllinien, die für die zukünftige Verwendung leicht kryokonserviert werden können. Ergebnisse von VN-Tests unter Verwendung von FeT-1C-Zellen sind in höherem Maße reproduzierbar als VN-Tests unter Verwendung von PBMC, da PBMC aus verschiedenen SPF-Katzen eine unterschiedliche Variabilität in Bezug auf die Zellwachstumsgeschwindigkeit und die FIV-Infizierbarkeit aufweisen. Ferner müssen PBMC für VN-Tests aus SPF-Katzen gewonnen werden, bei denen eine keimfreie Haltung erforderlich ist, um mögliche in vivo-Infektionen ausschalten zu können, die einen in vitro-VN-Test unter Verwendung von PBMC beeinträchtigen könnten. Somit kann eine feline Zelllinie, wie FeT-1C, die leicht mit FIV von verschiedenen Subtypen infiziert werden kann, in vorteilhafter Weise anstelle von PBMC in VN-Tests verwendet werden.

Die folgenden Abkürzungen für FIV-Stämme werden hier verwendet: Stamm (Subtyp) Abkürzung Petaluma (A) FIVPet
Dixon (A) FIVDix UK8 (A) FIVUK8 Bangston (B) FIVBang Aomori-1 (B) FIVAom1 Aomori-2 (B) FIVAom2 Shizuoka (D) FIVShi

Materialien und Methoden

Zellkulturen. Sämtliche Suspensionszelllinien wurden in RPMI 1640 mit einem Gehalt an 10% wärmeinaktiviertem, fötalem Kälberserum (FCS) gezüchtet.

10 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), 2 mM L-Glutamin, 50 &mgr;g/ml Gentamicin und 5 × 10–5 M 2-Mercaptoethanol. IL-2-abhängige Zellen wurden mit 100 U/ml rekombinantem humanem IL-2 (Cetus Corporation, Emeryville, Kalifornien) ergänzt. Die Suspensionszellen wurden einer Passage in einer Zellkonzentration von 0,5 – 4 × 106 Zellen/ml unterzogen und erneut 2-mal wöchentlich in frischem Kulturmedium gezüchtet. Sämtliche Monolayer-Zellen wurden 2-mal wöchentlich einer Passage bei einer anfänglichen Zellkonzentration von 2 × 106 Zellen/ml unterzogen. Die Gewebekulturflüssigkeiten (TCF) von FIV-infizierten Zellen wurden 2-mal wöchentlich geerntet, zur Entfernung von restlichen Zellen 1 Stunde mit 3 000 U/min zentrifugiert und bei –20°C oder bei –70°C für die TCF, die für eine sofortige Verwendung beim Test vorgesehen waren, aufbewahrt. FIV-empfindliche Zellen (1 × 106 Zellen/ml) wurden mit FIV mit einer Aktivität an reverser Transkriptase (RT) von etwa 30 000 cpm/ml infiziert.

FIV-Reinigung. Gewebekulturflüssigkeiten von FIV-infizierten Zelllinien wurden zur Entfernung von Zellen individuell 1 Stunde mit 2 000 bis 3 000 U/min zentrifugiert. Virus in TCF wurde durch 2-stündige Ultrazentrifugation mit 16 000 U/min pelletisiert und durch Ultrazentrifugation zunächst mit einem 10/50% (Gew./Vol.) diskontinuierlichen Saccharosegradienten und anschließend mit einem 10/50% kontinuierlichen Saccharosegradienten gereinigt (Pederson et al., 1987; Yamamoto et al., 1988). Die einzelnen viralen Isolate wurden 18 Stunden mit 1,25% sterilem Paraformaldehyd (0,22 &mgr;m sterilfiltriert) inaktiviert und anschließend gründlich gegen sterile PBS dialysiert. Die inaktivierten Viren wurden mit steriler PBS auf eine Konzentration von 500 &mgr;g/ml verdünnt.

250 &mgr;g/0,5 ml der einzelnen Stämme wurden in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und bei –70°C aufbewahrt. Die inaktivierten FIV-Stämme wurden auf Raumtemperatur aufgetaut. 250 &mgr;g inaktiviertes Virus in 0,5 ml steriler PBS wurde unmittelbar vor der Immunisierung mit 0,5 ml Adjuvans vereinigt. FIV-infizierte Zelllinien wurden getrennt 18 Stunden mit 1,25% sterilem Paraformaldehyd inaktiviert, 3-mal mit steriler PBS gewaschen, in frischer steriler PBS in einer Konzentration von etwa 5,0 × 107 Zellen/ml in sterilen Röhrchen resuspendiert und bei 4°C aufbewahrt. Typischerweise wurden etwa 2,5 × 107 inaktivierte, infizierte Zellen in 0,5 ml steriler PBS mit 0,5 ml Adjuvans unmittelbar vor der Immunisierung vereinigt. 250 &mgr;g/0,5 ml Threonylmuramyl-dipeptid (MDP MF75.2 Adjuvans; Chiron Corporation, Emeryville, CA) wurde als Adjuvans verwendet.

CTL-Test. Periphere mononukleare Blutzellen (PBMC) wurden mit Concanavalin A (Con A) 3 Tage vor der 10-tägigen Infektion mit FIV stimuliert (Song et al., 1992). Diese Zellen dienten als Zielzellen für den CTL-Test. Die CTL-Aktivität wurde durch 5-tägige gemeinsame Züchtung von Con A-stimulierten PBMC mit autologen, durch UV-Strahlung inaktivierten, FIV-infizierten PBMC erzeugt. Diese Zellen dienten als stimulierte Effektorzellen. Am Testtag wurden die Zielzellen mit 50 &mgr;Ci Na51CrO4 1 bis 3 Stunden markiert und 3-mal gewaschen. Sodann wurde eine feststehende Anzahl von markierten Zielzellen (5 × 104 Zellen/Vertiefung) in Mikrotiterplatten gegeben. Die Effektorzellen wurden im Dreifachversuch in verschiedenen Verhältnissen von Effektor/Zielzellen (d. h. 100:1, 50:1 und 10:1) zugegeben. Die Platten wurden 1 Minute mit 400 U/min zentrifugiert und 4 Stunden bei 37°C inkubiert. 51Cr-markierte Kontrollzielzellen wurden mit Detergens lysiert, um maximale Freisetzungswerte zu erzielen. Die Überstände der Testprobenvertiefungen wurden gewonnen. Die Strahlung wurde quantitativ unter Verwendung eines gamma-Zählers bestimmt. Eine spontane Freisetzung wurde durch Inkubation von 51Cr-markierten Zielzellen in Abwesenheit von Effektorzellen bestimmt. Der prozentuale Anteil der spezifischen Zytotoxizität wurde folgendermaßen berechnet:

Immunoblot- und enzymgebundene Immunosorbenstests (ELISA). Mit einem Saccharosegradienten gereinigtes Virus wurde als Substrat für einen Immunoblot-Test gemäß den Angaben von Yamamoto et al., 1993, verwendet. FIVPet aus Gewebekulturflüssigkeit von infizierten Zellen wurde durch Zentrifugation bei niedriger Drehzahl (45 Minuten mit 2 000 U/min) geklärt, durch Ultrazentrifugation eingeengt (2 Stunden mit 16 000 U/min) und durch Ultrazentrifugation an einem 10/50% (Gew./Vol.) kontinuierlichen Saccharosegradienten gereinigt. Das durch dieses Verfahren gereinigte Virus wurde als Substrat für den immunoblot-Test verwendet.

Eine Modifikation einer in der Literatur beschriebenen Immunoblot-Technik wurde verwendet (Yamamoto et al., 1991 a). Virus-Blotstreifen wurden durch Lösen von Virus in 0,1 % SDS zubereitet, wonach eine Elektrophorese an 10% SDS-Polyacrylamidgel und eine elektrophoretische Übertragung auf eine Nitrocellulosemembran vorgenommen wurden. Serumproben von geimpften Katzen wurden in Puffer 3 (0,15 M Natriumchlorid, 0,001 M Ethylendiamintetraessigsäure, 0,05 M Tris-Base, 0,05% Tween 20 und 0,1% Rinderserumalbumin) auf 1:50 verdünnt und mit Virus-Blotstreifen in getrennten Vertiefungen einer Immunoblot-Platte 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Blotstreifen wurden individuell mit Waschlösung (0,15 M NaCl und 0,05% Tween 20 in entionisiertem H2O) gewaschen, mit biotinyliertem anti-Katzen-IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 1 Stunde bei 37°C inkubiert und 3-mal mit Waschlösung gewaschen. Die Streifen wurden sodann individuell mit Streptavidin, das mit Meerrettich-peroxidase konjugiert war (Vector Laboratories) 30 Minuten inkubiert. Nach gründlichem Waschen wurden die einzelnen Streifen mit einer frischen Substratlösung (0,05% Diaminobenzidin, 400 &mgr;g/ml NiCl2 und 0,01% H2O2 in 0,1 M Tris-Puffer, pH-Wert 7,4) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde bei Feststellung von sichtbaren Banden mit überschüssigem destilliertem H2O gestoppt. Die Streifen wurden durch Abtupfen getrocknet. Die Molekulargewichte der Banden auf den Immunoblots wurden sodann durch Vergleich mit der Wanderungsstrecke von Molekulargewichtstandards auf einem vorher mit Amidoschwarz gefärbten Streifen bestimmt. Positive und negative Kontrollseren wurden bei jeder Immunoblot-Analyse als interne Kontrollen für die diagnostische Bewertung mitgeführt.

Der virale, antigenspezifische ELISA-Test ist in der Literatur beschrieben (Yamamoto et al., 1991a; Yamamoto et al., 1993). Mit einem Saccharosegradienten gereinigtes FIVPet und Oberflächenhüllpeptide (SU) und Transmembranpeptide (TM) sowohl von konservierten (C) als auch von variablen (V) Regionen von FIVPet wurden schichtförmig auf Immunolon-Platten mit 96 Vertiefungen (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA) in einer Menge von 250 ng/Vertiefung mit Bicarbonatpuffer (pH-Wert 9,6) 12 bis 18 Stunden bei 37°C aufgebracht und als Substrate für den ELISA-Test verwendet. Die Aminosäuresequenz des SU-V3-2-Peptids lautet: Gly Ser Trp Phe Arg Ala Ile Ser Ser Trp Lys Gln Arg Asn Arg Trp Glu Trp Arg Pro Asp Phe (SEQ ID NO. 1); und die Aminosäuresequenz des TM-C1-Peptids lautet: Gln Glu Leu Gly Cys Asn Gln Asn Gln Phe Phe Cys Lys Ile (SEQ ID NO. 2). Die synthetischen Peptide wurden an einem Biosearch 9500-Peptidsynthesegerät (Biosearch, San Rafael, CA) unter Anwendung einer FMOC-Peptidsynthesechemie (Magazine et al., 1988) synthetisiert. Die Reinheit der synthetisierten Peptide wurde durch das Vorliegen eines einzelnen Peaks bei Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigchromatographie bestimmt und durch eine Aminosäure-Sequenzanalyse, die an der Peakprobe durchgeführt wurde, bestätigt.

Die peptidbeschichteten Platten wurden unmittelbar vor der Verwendung 1-mal mit Puffer 3 gewaschen. Die Serumproben wurden in Puffer 3 1:200 verdünnt und 1 Stunde bei 37°C in den mit dem FIV-Antigen beschichteten Vertiefungen inkubiert und sodann 6-mal gewaschen. Die Vertiefungen wurden mit Waschlösung gewaschen, mit biotinyliertem anti-Katzen-IgG (Vector Laboratories, Burlingame, CA) 1 Stunde bei 37°C inkubiert, 6-mal gewaschen und mit Streptavidin, das mit Meerrettich-peroxidase konjugiert war (Vector Laboratories) 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Sodann wurden die Vertiefungen 6-mal mit Waschlösung gewaschen und mit ELISA-Substratlösung (0,005% Tetramethylbenzidin und 0,015% H2O2 in 0,96%iger Citratlösung) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde bei Auftreten einer sichtbaren Reaktionsfarbe in den sequenziell verdünnten Standards, die aus bekannten, FIV-positivem Katzenserum bestanden, mit 0,1 M Fluorwasserstoffsäure gestoppt. Die Lichtabsorption wurde mit einem BioRad-ELISA-Lesegerät (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) bei einer optischen Dichte von 414 nm gemessen.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die proviralen DNA-Konzentrationen von infizierten Zellen wurden durch differentielle PCR überwacht, die kürzlich zur Unterscheidung von multiplen FIV-Stämmen für gleiche oder verschiedene Subtypen entwickelt wurde (Okada et al., 1994). Als Mittel zur Steigerung der Empfindlichkeit der PCR wurden die in Tabeile 1 aufgeführten gebündelten PCR-Primersets verwendet. Die PCR wurde in einer 2-stufigen Reaktion durchgeführt, zunächst mit einem Paar von äußeren Primern (für alle FIV-Stämme gemeinsam) unter Bedingungen gemäß den Angaben von Okada et al., 1994. In der zweiten PCR-Stufe wurden 1/25 des Produkts der ersten Stufe unter Verwendung der inneren Primer (spezifisch für jeden FIV-Stamm) amplifiziert. Unter Anwendung von kombinierter PCR lassen sich Zellen, die mit FIVPet, FIVUK8, FIVBang, FIVAom1, FIVAom2 und FIVShi infiziert sind, voneinander unterscheiden.

Die ungefähre Menge an proviraler DNA pro Zelle wurde durch halbquantitative PCR bestimmt, bei der verschiedene Verdünnungen von DNA, die aus einer bekannten Anzahl von Zellen extrahiert worden war, hergestellt wurden. Wenn beispielsweise 105 Zellen für die DNA-Extraktion verwendet wurden, entspricht eine 105-Verdünnung des DNA-Präparats in etwa der in einer einzigen Zelle vorhandenen DNA. Die PCR wurde an diesen verschiedenen DNA-Verdünnungen durchgeführt. Die endgültige Verdünnung, die zu einem positiven PCR-Ergebnis führt, wird als die Endpunktverdünnung angesehen. Die Anzahl der Zeilen, die der Endpunktverdünnung entsprechen, wird zur Bestimmung des prozentualen Anteils von mit Virus infizierten Zellen in einem gegebenen Zellpräparat gemäß der nachstehenden Formel herangezogen:

wobei Z = Anzahl der der Endpunktverdünnung entsprechenden Zellen.

Test auf reverse Transkriptase (RT). Die Anwesenheit von RNA-abhängiger DNA-Polymerase (RT) wurde in Zellkulturüberständen im wesentlichen gemäß den Angaben von Rey et al. bestimmt. Der RT-Test zum Nachweis von FIV verwendete poly(rA)-oligo(dT12-18) als einen exogenen Matrizenprimer, vier verschiedene Desoxyribonucleotidtriphosphate, 20 mM KCl mit Mg++ als zweiwertiges Kation und 5 &mgr;Ci [3H]-markiertes Thymidintriphosphat (TTP) pro Probe. 5 &mgr;Ci [3H] TTP ergab ein durchschnittliches Gesamtzählergebnis von 1 200 000 cpm unter Verwendung eines Szintiflationsflüssigkeitsgemisches (1 Teil Xylol auf 9 Teile biologisch abbaubares Szintillationszählmittel der Fa. Research Products International) an einem Beckman LS250-Szintillationszähler (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA). Im Ergebnis liegen die RT-Werte für getestete Proben unter 1 200 000 cpm/ml.

Viraler Neutralisationstest. Eine Strategie zur Entwicklung von stamm- und subtypspezifischen VN-Tests ist in der Literatur beschrieben (Okada et al., 1994). Reihenverdünnungen von hitzeinaktivierten Seren wurden mit 100 TCID50 eines jeden FIV-Stammes 45 Minuten bei 37°C in einer Platte mit 24 Vertiefungen inkubiert, bevor die Zugabe von felinen, peripheren, mononuklearen Blutzellen (PBMC) (4 × 105 Zellen/ml) oder von FIV-empfindlichen FeT-1C-Zellen (2 × 105 Zellen/ml) erfolgte. Nach 3-tägiger Züchtung wurden die Zellen 1-mal mit ausgewogener Hank-Salzlösung gewaschen, um restliches Virus aus der Kultur zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen in frischem Kulturmedium (RPMI-1640 mit einem Gehalt an 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 10 mM HEPES-Puffer, 50 &mgr;g/ml Gentamicin, 5 × 10–5 M 2-Mercaptoethanol und 100 Einheiten/ml humanes rekombinantes IL-2) resuspendiert. Die Virusinfektion von Zellen wurde durch Mg++-abhängige RT-Tests der Kulturflüssigkeiten, die nach einer Züchtungszeit von 9, 12, 15 und 18 Tagen geerntet worden war, bestimmt. Seren wurden als positiv auf VN-Antikörper angesehen, wenn die RT-Aktivität ≤ 25% der infizierten Kontrollkulturen, die aus SPF-Serum bestanden, betrug.

Nachstehend finden sich Beispiele zur Erläuterung der Verfahren (einschließlich der besten Ausführungsform) zur praktischen Durchführung der Erfindung. Diese Beispiele sind nicht als beschränkend anzusehen. Sämtliche Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht und sämtliche Verhältnisangaben für Lösungsmittelgemische beziehen sich auf das Volumen, sofern nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1 – FIV-infizierte Zelllinien

Eine neue, von Interleukin-2 (IL-2) abhängige, feline T-Zelllinie mit der Bezeichnung FeT-1C, bei der es sich um eine Mutterlinie eines IL 2-abhängigen FeT-1M Klons handelt, wurde zur Bereitstellung von individuellen Zelllinien, die chronisch mit FIVPet, FIVDix, FIVUK8, FIVBang, FIVAom2 oder FIVShi infiziert waren, verwendet. Der FeT1M-Klon (auch als FIV-Fet1M bezeichnet) ist im US-Patent 5 275 813 (durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht) beschrieben. Er wurde zur Herstellung einer IL-2-unabhängigen Zelllinie, nämlich FL-4 (ebenfalls im US-Patent 5 275 813 beschrieben), verwendet, die chronisch FIVPet bildet. Die FeT-1C-Zelllinie ist hochgradig mit verschiedenen Isolaten von FIV-Subtypen A, B und D infizierbar. Eine Langzeitpassage der FeT-1C-Zelllinie verringert deren Infizierbarkeit, insbesondere beim FIV-Subtyp D. Daher soll zur Erzielung optimaler FIV-Infektionsraten oder für die Verwendung bei VN-Tests die Anzahl der Passagen weniger als etwa 35 betragen. Eine halbquantitative PCR und Viruskern-Antigenanalysen zeigten, dass sämtliche mit FIV belasteten Zelllinien signifikant mit individuellen FIV-Stämmen infiziert waren.

Eine IL-2-unabhängige feline Zelllinie, die gegenüber einer FIV-Infektion empfindlich ist, wurde ebenfalls aus FeT-1C-Zellen entwickelt. Diese Zelllinie mit der Bezeichnung FeT-J kann mit FIV durch gemeinsame Züchtung unter Verwendung von FIV-infizierten Medien oder Zellen infiziert werden. Beispielsweise wurde eine FIVBang-infizierte Fet-1C-Zelllinie in Abwesenheit von IL-2 gemeinsam mit nicht-infizierten FeT-J-Zellen gezüchtet, um eine IL-2-unabhängige FIVBang-infizierte FeT-J-Zelllinie (mit der Bezeichnung Bang/FeT-J) bereitzustellen. Beim Infektionsverfahren unter gemeinsamer Züchtung wurden Bang/FeT-1C-Zellen mit nicht-infizierten FeT-J-Zellen in einem Verhältnis von etwa 2:1 bis etwa 10:1 (infiziert:nicht-infiziert) vereinigt. Das Zellgemisch wurde im Medium in Abwesenheit von IL-2 mehrere Tage gezüchtet. Man ließ die Fet-1C-Zellen absterben. Die verbleibenden Zellen bestanden aus FIVBang-infizierten FeT-J-Zellen. Somit können FIV-infizierte FeT-1C-Zellen zur Infektion von FeT-J-Zellen und zur Bereitstellung von IL-2-unabhängigen FeT-J-Zelllinien, die mit verschiedenen FIV-Subtypen infiziert sind, verwendet werden. Das Verfahren zur gemeinsamen Züchtung mit FIV-infizierten FeT-1C-Zellen führte zu IL-2-unabhängigen FeT-J-Zelllinien, die mäßige bis hohe Konzentrationen an verschiedenen FIV-Subtypen erzeugen.

Die FeT-1C-Zelllinie wurde auch mit FIVShi infiziert und einer ausgedehnten Passagierung zur Erzeugung einer IL-2-abhängigen Zelllinie mit der Bezeichnung Shi/FeT-1C unterzogen. Die Shi/FeT-1C-Zelllinie wurde später gemeinsam mit FeT-J in Abwesenheit von IL-2 gezüchtet. Die erhaltene IL-2-unabhängige FIVShi-infizierte Zelllinie erhielt die Bezeichnung Shi/FeT-J. Die IL-2-unabhängige Shi/FeT-J-Zelllinie erzeugt höhere Konzentrationen an FIVShi als die IL-2-abhängige Shi/FeT-1C-Zelllinie (1).

Die Entwicklung einer FeT-J-Zelllinie, die mit FIVBang infiziert ist, wurde auch ohne die Verwendung der FeT-1C-Zelllinie durchgeführt. Die FeT-J-Zelllinie wurde direkt mit zellfreiem FIVBang-Inokulum infiziert und eingehend mit IL-2 passagiert. Die erhaltene IL-2-unabhängige FIVBang-Erzeuger-Zelllinie erhielt die Bezeichnung Bang/FeT-J. Die Bang/FeT-J-Zelllinie erzeugte höhere Konzentrationen an FIVBang als die IL-2-abhängige Bang/FeT-1C-Zelllinie, die durch Infektion der FeT-1C-Zelllinie mit FIVBang entwickelt wurde (1).

Beispiel 2 – Multi-Subtyp-FIV-Impfstoffe

FIV-infizierte Zellen wurden aus Überständen durch Zentrifugation entfernt, inaktiviert und als Impfstoff verwendet. Gleichermaßen wurde vollständiges FIV-Virus aus infizierten, zellfreien Überständen durch Ultrazentrifugation pelletisiert und inaktiviert. Sowohl infizierte Zellen als auch Virus wurden durch 24-stündige Behandlung mit 1,25% Paraformaldehyd bei 5°C inaktiviert, wonach sich ein gründliches Waschen bzw. eine Dialyse gegen PBS anschlossen. Dieses Verfahren inaktiviert in wirksamer Weise FIV ohne Verlust an Immunogenizität. FIV-Immunogene, die nach dem vorliegenden Verfahren hergestellt worden sind, erweisen sich als hochgradig wirksam in Bezug auf eine Herbeiführung einer Schutzimmunität (Yamamoto et al., 1993; Yamamoto et al.,1991a; Yamamoto et al., 1991b). Es kommt in Betracht, dass abgeschwächte virale Isolate ebenfalls in den vorliegenden Impfstoffzusammensetzungen verwendet werden können.

Obgleich eine FIVShi-infizierte Fet-1C-Zelllinie mit dem FIVPet-Stamm superinfiziert wurde, um eine einzelne Zelllinie zu erzeugen, die mit multiplen Subtypen von FIV infiziert war (d. h. eine Multi-Subtyp A/D-FeT-1C-Zelllinie), nahmen nach 2-monatiger Coinfektion des FIVShi die proviralen Konzentrationen von 50% auf weniger als 5% ab, während provirale FIVPet-Konzentrationen gleichzeitig auf etwa 50% stiegen. Somit ist die Aufrechterhaltung einer einzigen Zelllinie, die mit multiplen Subtypen von FIV infiziert ist, zur Verwendung als FIV-Impfstoff keine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.

Infolgedessen wurden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Impfstoffzusammensetzungen aus zwei individuellen Zelllinien entwickelt, die jeweils mit einem unterschiedlichen FIV-Subtyp infiziert sind. In einer speziellen Ausführungsform umfasste die Dual-Subtyp-FIV-Impfstoffzusammensetzung eine Kombination aus einer FIV-Subtyp A-infizierten Zelllinie (Pet/FL-4) mit einer FIV-Subtyp D-infizierten Zelllinie (Shi/FeT-1C). Die A-Subtyp- und D-Subtyp-infizierten Zelllinien wurden gemäß den beschriebenen Angaben inaktiviert, in gleichen Zellzahlen (2,5 × 107 Zellen jeweils in 250 &mgr;g MDP) vereinigt und zur Immunisierung von Katzen verwendet. Drei SPF-Katzen wurden mit inaktivierten Pet/FL-4-Zellen und vier weitere Katzen mit inaktivierten Shi/FeT-1C-Zellen (2,5 × 107-Zellen/Dosis) geimpft. Nach einer Reihe von vier Impfungen erzeugte der Dual-Subtyp Impfstoff (Pet/FL-4 und Shi/FeT-1C) anti-FIV-Antikörper, einschließlich signifikante VN-Antikörpertiter, gegen die beiden getesteten FIV-Stämme (2 und Tabelle 2, Versuch 1). Vier Dual-Subtyp geimpfte (Pet/FL-4 und Shi/Fet-1C) Katzen wurden mit FIVBang (50 CID50) belastet. Sämtliche drei Pet/FL-4-geimpften und zwei der Shi/FeT-1C-geimpften Katzen wurden mit 50 CID50 FIVBang belastet. Die beiden verbleibenden, Shi/FeT-1C-geimpften Katzen wurden mit 50 CID50 FIVShi belastet.

Sämtliche mit dem 2-fachen Subtyp geimpften Katzen waren in Bezug auf FIVBang gemäß Virus-Isolierung und PCR von PBMC 6 Wochen nach der Infektion (pi) negativ, während sämtliche zum Schein immunisierte Katzen entweder in Bezug auf FIVBang oder FIVShi gemäß Virus-Isolation und PCR 6 Wochen nach der Infektion positiv waren (Tabelle 2, Versuch 1). Im Gegensatz dazu war jeweils eine Katze von Pet/FL-4-geimpften Gruppen und Shi/FeT-1C-geimpften Gruppen, die mit FIVBang belastet worden waren, in Bezug auf FIVBang positiv. Wie erwartet, waren sämtliche Katzen, die mit FIVShi geimpft und anschließend mit FIVShi belastet worden waren, 6 Wochen nach der Infektion in Bezug auf FIVShi negativ. Somit führte der speziell als Beispiel vorgestellte 2-fache Subtyp-Impfstoff zu einer Verhinderung oder Verzögerung der Infektion sowohl bei homologer FIVShi-Belastung als auch bei heterologer FIVBang-Belastung.

Die mit dem 2-fachen Subtyp geimpften Katzen (Pet/FL-4-Zellen und Shi/FeT-1C-Zellen) entwickelten FIV-Antikörper spezifisch für das virale Kernprotein p25 (auch als FIV p28 bezeichnet) nach der zweiten Immunisierung (2). Höhere Antikörpertiter gegen andere virale Antigene wurden nach der dritten bis vierten Immunisierung nachgewiesen. VN-Antikörper gegen FIVPet entwickelten sich nach der zweiten Immunisierung, während VN-Antikörper gegen FIVShi sich nach der vierten Immunisierung entwickelten (Tabelle 4). CTL-Reaktionen gegen FIVPet und FIVShi wurden bereits bei der dritten Immunisierung bei sämtlichen getesteten Katzen (Tabelle 3) nachgewiesen und es entwickelten sich stärkere CTL-Reaktionen gegen beide Stämme nach der vierten Immunisierung. Ferner entwickelten zwei der drei getesteten Katzen CTL-Reaktionen gegen FIVBang nach der vierten Immunisierung. Die Ergebnisse zeigen, dass nach vier Impfungen der 2-fache Subtyp-Impfstoff starke CTL-Reaktionen gegen FIVPet und FIVShi (Tabelle 3) und hohe FIV-Antikörpertiter, einschließlich VN-Antikörpertiter, gegen beide FIV-Stämme hervorrief (Tabelle 4).

Die mit inaktivierten Shi/Fet-1C-Zellen immunisierten Katzen entwickelten FIV-Antikörper, die für das virale Kernprotein p25 spezifisch waren, nach der zweiten Immunisierung und Antikörper gegen andere virale Antigene nach der dritten Immunisierung (2). VN-Antikörper gegen FIVShi entwickelten sich in diesen Katzen nach der vierten Immunisierung, während VN-Antikörper gegen FIVPet im Verlauf der Immunisierungen nicht nachgewiesen wurden. Beide mit Shi/FeT-1C geimpften Katzen entwickelten CTL-Reaktionen gegen FIVShi erst nach der vierten Immunisierung, entwickelten aber keine CTL-Reaktionen gegen FIVPet, selbst nach der vierten Immunisierung (Tabelle 3).

Mit inaktivierten Pet/FL-4-Zellen immunisierte Katzen entwickelten Antikörper gegen p25 nach der zweiten Immunisierung (2) und gegen andere virale Antigene, einschließlich VN-Antikörper gegen FIVPet, nach der zweiten bis dritten Immunisierung (Tabelle 4). Die einzigen CTL-Reaktionen, die bei mit Pet/FL-4-Zellen immunisierten Katzen nachgewiesen wurden, waren FIVPet. Insgesamt bewirkte der 2-fache Subtyp-FIV-Impfstoff raschere und höhere VN-Antikörpertiter und CTL-Reaktionen gegen beide FIV-Stämme, verglichen mit dem einfachen Subtyp-Impfstoff. Zum Schein immunisierte SPF-Katzen entwickelten keine viralen Antikörper, VN-Antikörper oder anti-FIV-CTL-Reaktionen.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Impfstoffzusammensetzung einen Dreifach-Subtyp-FIV-Impfstoff, der aus drei Zelllinien hergestellt worden ist, wobei jede Zelllinie mit einem viralen Stamm eines unterschiedlichen FIV-Subtyps (A oder B oder D) infiziert worden ist. Drei spezifische pathogenfreie Katzen wurden mit einem Dreifach-Subtyp-Impfstoff (FIVPet + FIVBang + FIVShi) immunisiert. Andere Katzen wurden mit Einfach-Subtyp FIVBang-Impfstoffen immunisiert, um die Immunogenizität von Makrophagentropem FIVBang als eine Komponente des Impfstoffes zu bewerten. Die VN-Antikörpertiter-Ergebnisse zeigen, dass sowohl Dreifach-Subtyp-Impfstoffe (FIVPet + FIVBang + FIVShi) als auch Einfach-Subtyp-FIVBang-Impfstoffe hohe antivirale Antikörpertiter selbst nach der zweiten Immunisierung hervorriefen (Tabelle 2, Versuch II und Tabelle 5). Somit können sowohl lymphotrope als auch Makrophagen-trope FIV als Komponenten der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen verwendet werden.

Die drei SPF-Katzen, die mit einer Kombination von inaktivierten Pet/FL4-Zellen, inaktivierten Bang/Fet-J-Zellen und inaktivierten Shi/FeT-IC-Zellen immunisiert worden waren (jeweils 2,5 × 107-Zellen in insgesamt 250 &mgr;g MDP) entwickelten FIV-Antikörper, die spezifisch für das vitale Kernprotein p25 und andere vitale Antigene, einschließlich FIV SU und TM-Hüllprotein, waren, und zwar nach der zweiten Immunisierung (3, 4, 5). VN-Antikörper gegen FIVPet, FIVBang und FIVShi entwickelten sich bei der Mehrzahl der Katzen bald nach der zweiten Immunisierung und in sämtlichen Katzen durch die dritte Immunisierung (Tabelle 5). Ferner wies eine Katze VN-Antikörper auf, die nach der dritten Immunisierung eine Kreuzreaktion mit FIVUK8 zeigten. Vier SPF-Katzen, die nur mit inaktivierten Bang/FeT-J-Zellen immunisiert worden waren, entwickelten nach der zweiten Immunisierung FIV-Antikörper, die spezifisch für das virale Kernprotein p25 und andere virale Antigene waren (3). VN-Antikörper gegen FIVBang entwickelten sich in diesen Katzen nach der zweiten Immunisierung (Tabelle 5), während VN-Antikörper gegen FIVPet und FIVUK8 im Verlauf der Immunisierungen nicht nachgewiesen wurden. Die CTL-Reaktionen von Katzen, die 3-mal mit dem Dreifach-Subtyp-FIV-Impfstoff (Pet/FL-4, Bang/FeT-J und Shi/FeT-1C-Zellen) gegen FIV A-, B- und D- Subtyp-Zielzellen immunisiert worden sind, sind in Tabelle 6 angegeben. CTL-Reaktionen gegen alle drei getesteten FIV-Subtypen wurden nachgewiesen. Somit induzierte der Dreifach-Subtyp-Impfstoff eine breite CTL-Reaktion und raschere und höhere VN- und SU-Hüllantikörptertiter als der Einfach-Subtyp-Impfstoff. Weder nicht-infizierte FeT-J-Katzen noch scheinimmunisierte SPF-Katzen entwickelten virale Antikörper oder VN-Antikörper.

Tabelle 6 – CTL-Reaktionen von mit dem Dreifach-Subtyp geimpften Katzen nach der dritten Immunisierung
Beispiel 3 – VN-Antikörper gegen FIV-Subtypen.

Ferner wurde ein Test auf VN-Antikörper gegen FIV unter Verwendung der erfindungsgemäßen FeT-1C-Zellen entwickelt. Serum aus FIVPet-infizierten Katzen und SPF-Katzen, die mit inaktivierten Pet/FL-4-Zellen oder inaktiviertem FIVPet-Virus geimpft worden waren, wurden auf den VN-Antikörpertiter getestet, wobei entweder FeT-1C-Zellen oder PBMC gemäß dem hier beschriebenen VN-Testverfahren verwendet wurden. Seren von zwei SPF-Katzen, die ungeimpft und nicht mit FIV infiziert waren, wurden als Kontrollseren verwendet. Seren von geimpften und FIV-infizierten Katzen wiesen einen hohen VN-Antikörpertiter von 1 000 oder mehr auf, während Seren von nicht-geimpften SPF-Katzen keinen nachweisbaren VN-Antikörpertiter zeigten. Der VN-Test auf der Basis von FeT-1C führt zu VN-Antikörpertiter-Ergebnissen, die mit den Ergebnissen vergleichbar sind, die bei Verwendung von primären PBMC aus Katzen erhalten werden (Tabelle 6). Dieser Befund belegt, dass VN-Antikörpertiter in einem VN-Test unter Verwendung von FeT-1C-Zellen mit den Ergebnissen korrelieren, die mit einem VN-Test unter Verwendung von PBMC erhalten werden. Daher lassen sich FeT-1C-Zellen in vorteilhafter Weise anstelle von PBMC beim üblichen VN-Test auf FIV verwenden, da FeT-1C-Zellen mit sämtlichen FIV-Subtypen infiziert werden können und leicht in Gewebekultur vermehrt werden können.

Tabelle 7 – An FeT-1C und PBMC getestete VN-Titer
  • 1 – Seren von mit inaktiviertem PeT/FL-4-Zellen geimpften Katzen
  • 2 – Seren von mit FIVPet infizierten Katzen
  • 3 – Seren von mit inaktiviertem, nicht-infiziertem FeT-J immunisierten Katzen

Beispiel 4 – Immunotypisierung von FIV-Stämmen

In vitro-Studien wurden unter Verwendung von FeT-1C-Zellen durchgeführt, um festzustellen, ob der FIV-Subtyp den FIV-Immunotyp wiederspiegelt. Eine Immunotypisierung ist für das Verständnis der Rolle von VN-Antikörpern beim Impfstoffschutz von Bedeutung. Antiseren von mit FIV-Subtyp A-Stämmen (FIVPet, FIVDix, FIVUK8), Subtyp B (FIVBang, FiVAom1) und Subtyp D (FIVShi) infizierten Katzen wurden auf ihre Fähigkeit zur in vitro-Neutralisation dieser Stämme unter Verwendung von FeT-1C-Zellen im VN-Test getestet (6). Sämtliche Test-Antiseren wiesen eine neutralisierende Aktivität gegen den entsprechenden homologen FIV-Stamm auf. FIVPet, ein Subtyp A-Stamm, unterlag einer erheblichen Kreuzneutralisation durch Antiseren von mit FIVDix infizierten Katzen. FIVPet unterscheidet sich von FIVDix an den Oberflächen-Hüllglycoprotein (Env)-Regionen um etwa 9%. Antiseren von mit FIV-Subtyp A-Stämmen infizierten Katzen führten zur Kreuzneutralisation von Subtyp B-FIVBang, neutralisierten jedoch Subtyp D-FIVShi nicht. Antiseren von mit Subtyp B- und D-Stämmen infizierten Katzen bewirkten nur eine Kreuzneutralisation anderer FIV-Stämme innerhalb des homologen Subtyps. Ferner neutralisierten Antiseren von mit FIVUK8 infizierten Katzen FIVBang, neutralisierten jedoch nicht FIV-Stämme innerhalb des Subtyps A. Obgleich FIVUK8 als Subtyp A klassifiziert wird (Sodora et al., 1994; Rigby et al., 1993; Kakinuma et al., 1995), lassen diese Ergebnisse darauf schließen, dass Antiseren gegen FIVUK8 Subtyp B-Stämme erkennen, jedoch nicht Subtyp A-Stämme. Diese Ergebnisse erklären möglicherweise, warum inaktivierte FIVPet-Impfstoffe gegen FIVUK8 und FIVShi unwirksam waren (Johnson et al., 1994). Somit besteht eine lose Beziehung zwischen dem Genotyp und dem Immunotyp. Obgleich genotypische Analysen eine FIV-Stamm-Klassifizierung ermöglichen, spiegeln Kreuzneutralisations-Antikörperstudien die Immunogenizität von FIV-Stämmen wieder, die einen wichtigen Parameter bei dem durch Impfstoffe hervorgerufenen breit gefächerten humoralen Schutz darstellt.

Beispiel 5 – FIV-Zelltropismus

Der Zelltropismus der FIV-Stämme, die aus infizierten FeT-1C- und infizierten FeT-J-Zelllinien erhalten wurden, wurde mit dem der FIV-Stämme, die aus primärem PBMC erhalten wurden, verglichen (Tabelle 8). Zwei FIV-Isolate, nämlich FIVUK8 und FIVBang, sind beide gleichermaßen lymphotrop und Makrophagen-trop, während FIVShi hochgradig lymphotrop ist. FIVPet war stärker lymphotrop als Makrophagen-trop. Sein Zelltropismus wurde durch seine Zellquelle nicht signifikant beeinflusst. Der Makrophagen-Tropismus von FIVBang wurde durch die Zellquelle des Virus nicht beeinflusst. Da der Zelltropismus der FIV-Stämme aus einer infizierten FeT-1C-Zellinie vergleichbar mit dem Zelltropismus von primären PBMC ist, kann das in FeT-1C-Zellen gezüchtete Virus als Inokulum für VN-Tests und auch als in vivo-Inokulum für Studien zur Bewertung therapeutischer und prophylaktischer Ansätze verwendet werden.

Tabelle 8 – Zelltropismus von FIV-Isolaten
  • a – Sämtliche Virus-Inokula wurden vor der Titration an 5 × 105-Zellen/ml felinen T-Zellen (FeT-1C) oder primären felinen Zellen auf 120 000 cpm/ml RT-Aktivität eingestellt. Die Ergebnisse geben den höchsten Titer des Virus, das während einer 21-tägigen Züchtung geerntet wurde, wieder.
  • b – Gleiche Zellen wie bei den Impfstoffen mit infizierten Zellen.

Es ist darauf hinzuweisen, dass die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nur Erläuterungszwecken dienen und dass verschiedene Modifikationen oder Abänderungen für den Fachmann ersichtlich sind und von der Anmeldung erfasst werden und unter den Umfang der beigefügten Ansprüche fallen.

SEQUENZPROTOKOLL
Literaturverzeichnis
  • Pedersen, Niels C, Janet K. Yamamoto, U.S. Patent No. 5,037,753, issued August 6, 1991.
  • Pedersen, Niels C., Janet K. Yamamoto, U.S. Patent No. 5,118,602, issued June 2, 1992
  • Byars, N. E., A. C. Allison (1987) "Adjuvant formulation for use in vaccines to elicit both cellmediated and humoral immunity," Vaccine 5: 223–228.
  • Pedersen, N. C., E. W. Ho, M. L. Brown, J. K. Yamamoto (1987) "Isolation of a T-lymphotropic virus from domestic cats with an immunodeficiency-like syndrome," Science 235: 790–793. Yamamoto, J. K., N. C. Pedersen, E. W. Ho, T. Okuda, G. H. Theilen (1988a) "Feline immunodeficiency syndrome – a comparison between feline T lymphotropic lentivirus and feline leukemia virus," Leukemia, December Supplement 2: 204S–215S.
  • Yamamoto, J. K., E. Sparger, E. W. Ho, P. H. Andersen, T. P. O'Connor, C. P. Mandell, L. Lowenstine, N. C. Pedersen (1988) "Pathogenesis of experimentally induced feline immunodeficiency virus infection in cats," Am. J. Ver. Res. 49: 1246–1258.
  • Ackley, C. D., J. K. Yamamoto, N. B. Levy, N. C. Pedersen, M. D. Cooper (1990) "Immunologie abnormalities in pathogen-free cats experimentally infected with feline immunodeficiency virus," J. Virol. 64: 5652–5655.
  • Olmsted, R. A., A. K. Barnes, J. K. Yamamoto, V. M. Hirsch, R. H. Purcell, P. R. Johnson (1989) "Molecular cloning of feline immunodeficiency virus," Proc. Nat. Acad. Sci. 86: 2448–2452
  • Olmsted, R. A., V. M. Hirsch, R. H. Purcell, P. R. Johnson (1989) "Nucleotide sequence analysis of feline immunodeficiency virus: Genome organization and relationship to other lentivirus," Proc. Natl. Acad Sci. USA 86: 8088–8092.
  • Talbott, R. L., E. E. Sparger, K. M. Lovelace, W. M. Fitch, N. C. Pedersen, P. A. Luciw, J. H. Elder (1989) "Nucleotide sequence and genomic organization of feline immunodeficiency virus," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5743–5747.
  • Hosie, M. J., O. Jarrett (1990) "Serological responses of cats to feline immunodeficiency virus," AIDS 4: 215–220.
  • Sodora, D. L., E. G. Shpaer, B. E. Kitchel, S. W. Dow, E. A. Hoover, J. I. Mnullins (1994) "Identification of three feline immunodeficiency virus (FIV) env gene subtype and comparison of the FIV and human immunodeficiency virus type 1 evolutionary patterns," J. Virol. 68: 2230–2238.
  • Rigby, M. A., E. C. Holmes, M. Pistello, A. Mackay, A. J. Leigh-Brown, J. C. Neil (1993) "Evolution of structural proteins of feline immunodeficiency virus: molecular epidemiology and evidence of selection for change," J. Gen. Virol. 74: 425–436.
  • Kakinuma, S., K. Motokawa, T. Hohdatsu, J. K. Yamamoto, H. Koyama, H. Hashimoto (1995) "Nucleotide Sequence of Feline Immunodeficiency Virus: Classifiation of Japanese Isolates into Two Subtypes Which Are Distinct from Non-Japanese Subtypes," Journal of Virology 69(6): 3639–3646.
  • Johnson, C. M., B. A. Torres, H. Koyama, J. K. Yamamoto (1994) "FIV as a model for AIDS vaccination," AIDS Res. Hum. Retroviruses 10: 225–228.
  • Yamamoto, J. K., T. Hohdatsu, R. A. Olmsted, R. Pu, H. Louie, H. Zochlinski, V. Acevedo, H. M. Johnson, G. A. Soulds, M. B. Gardner (1943) "Experimental vaccine protection against homologous and heterologous strains of feline immunodeficiency virus," I. Virol. 67: 601–605.
  • Yamamoto, J. K., T. Okuda, C. D. Ackley, H. Louie, H. Zochlinski, E. Pembroke, M. B. Gardner (1991a) "Experimental vaccine protection against feline immunodeficiency virus," AIDS Res. Hum. Retroviruses 7: 911–922.
  • Yamamoto, J. K., C. D. Ackley, H. Zochlinski, H. Louie, E. Pembroke, M. Torten, H. Hansen, R. Munn, T. Okuda (1991b) "Development of IL-2-independent feline lymphoid cell lines chronically infected with feline immunodeficiency virus: importance for diagnostic reagents and vaccines," Intervirol. 32: 361–375.
  • Murphy, F., D. W. Kingsbury (1990) "Virus Taxonomy," In Fields Virology, 2nd Ed., B. N. Fields, D. M. Knipe et al., eds, Raven Press, New York, Chapter 2, pp. 9–36.
  • Louwagie, J., F. E., McCutchan, M. Peeters, T. P. Brennan, E. Sanders-Buell G. A. Eddy, G. van den Grosen, K. Fransen, G. M. Gershy-Damet, R. Deleys, D. S. Burke (1943) "Phylogenetic analysis of gag genes from 70 international HIV-1 isolates provides evidence for multiple genotypes," AIDS 7: 769–780.
  • Rey, M. A., B. Spire, D. Dormont, F. Barre-Suinoussi, L. Montagnier, J. C. Chermann (1984) "Characterization of the RNA dependent DNA polymerase of a new human T-lymphotropic retrovirus 1(lymphadenopathy associated virus)," Biochem. Biophys. Res. Commun. 21: 1247–1253.
  • Magazine, H. I., J. M. Carter, J. K., Russell, B.A. Torres, B. M. Dunn, H. M. Johnson (1988) "Use of synthetic peptides to identify and end terminal epitope on mouse gama ifn that may be involved in function," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1237.
  • Okada, S., R. Pu, E. Young, W. Stoffs, J. K. Yamamoto (1994) "Superinfection of cats with FIV Subtypes A. and B," AIDS Res. Hum. Retroviruses 10: 1739–1746.
  • Yamamoto, Janet K., Niels C. Pedersen, U.S. Patent No. 5,275,813; issued January 4, 1994.
  • Merrifield, R. B. (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149–2156.

Anspruch[de]
  1. Multi-Subtyp-FIV-Impfstoffzusammensetzung, umfassend FIV-Immunogene, die sich von verschiedenen FIV-Subtypen ableiten, wobei die Zusammensetzung dazu befähigt ist, eine Immunreaktion gegen eine Mehrzahl von FIV-Subtypen bei einer Katze und gegen homologe und heterologe FIV-Stämme hervorzurufen.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Immunogene unter rekombinanten, viralen Vektor-FIV-Konstrukten, FIV-Polypeptiden, zellfreiem, vollständigem FIV-Virus und FIV-infizierten Zelllinien ausgewählt sind.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei das FIV-Virus oder die FIV-infizierte Zelllinie inaktiviert oder abgeschwächt sind.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 2 oder 3, umfassend mindestens zwei FIV-Stämme von verschiedenen FIV-Subtypen.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die FIV-Subtypen unter den Subtypen A, B, C und D ausgewählt sind.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei es sich um eine duale Subtyp-Zusammensetzung handelt und es sich bei den verschiedenen FIV-Subtypen um A und D handelt.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei es sich bei den Subtypen um FIVPet und FIVShi handelt.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 5, bei der es sich um eine Dreifach-Subtyp-Zusammensetzung handelt und es sich bei den verschiedenen FIV-Subtypen um A, B und D handelt.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei es sich bei den Subtypen um FIVPet, FIVBang und FIVShi handelt.
  10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, die FIV-infizierte Zelllinien umfasst, wobei es sich bei den nicht-infizierten Zelllinien um von Katzen abgeleitete T-Zelllinien handelt, die unter Zelllinien mit der Bezeichnung Fet-1C mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 11968 und FeT-J mit der ATCC-Hinterlegungs-nummer 11967 ausgewählt sind.
  11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, umfassend FIV-infizierte, von Katzen abgeleitete T-Zelllinien, die unter Zelllinien mit der Bezeichnung Shi/FeT-1C mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 11976 und Bang/FeT-J mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 11975 ausgewählt sind.
  12. Verwendung von Immunogenen gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Impfstoffes zur Verwendung bei der Herbeiführung einer schützenden Immunreaktion gegen eine Infektion durch homologe und heterologe Stämme von FIV.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Immunogene der Definition in Anspruch 2 entsprechen, zum Einsatz als Auffrischungsimpfung in einem Tier, das mit einem rekombinanten, viralen Vektor-FIV-Konstrukt immunisiert ist.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Impfstoff zellfreien, vollständigen FIV-Virus umfasst.
  15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das FIV-Virus vor der Verwendung inaktiviert wird.
  16. Verwendung nach Anspruch 14, wobei das FIV-Virus vor der Verwendung abgeschwächt wird.
Es folgen 6 Blatt Zeichnungen






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