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Dokumentenidentifikation DE60018541T2 13.04.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001113264
Titel Biosensor
Anmelder Matsushita Electric Industrial Co., Ltd., Kadoma, Osaka, JP
Erfinder Taniike, Yuko, Osaka-shi, Osaka 542-0066, JP;
Ikeda, Shin, Katano-shi, Osaka 576-0022, JP;
Nankai, Shiro, Hirakata-shi, Osaka 573-0071, JP
Vertreter TBK-Patent, 80336 München
DE-Aktenzeichen 60018541
Vertragsstaaten DE, ES, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 22.12.2000
EP-Aktenzeichen 003116423
EP-Offenlegungsdatum 04.07.2001
EP date of grant 09.03.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.04.2006
IPC-Hauptklasse G01N 27/327(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12Q 1/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor zur schnellen mengenmäßigen Erfassung bzw. Quantifizierung eines Substrats, das in einer Probe enthalten ist, mit hoher Genauigkeit.

Herkömmlicher Weise sind Verfahren unter Verwendung von Polarimetrie, Colorimetrie, Reduktimetrie und eine Reihe von Chromatographieverfahren als Mittel zur quantitativen Analyse von Zuckern, wie etwa Sucrose und Glucose entwickelt worden. Jedoch sind diese herkömmlichen Verfahren alle auf Zucker wenig spezifisch und besitzen somit eine schlechte Genauigkeit. Unter diesen ist die Polarimetrie einfach handhabbar, aber wird durch die Temperatur während der Behandlung stark beeinträchtigt. Daher ist dieses Verfahren nicht für die einfache mengenmäßige Erfassung von Zuckern zuhause bei Jedermann geeignet.

In den letzten Jahren ist eine Reihe von Biosensoren entwickelt worden, welche am besten eine spezifische katalytische Wirkung von Enzymen verwenden.

In dem folgenden wird ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Glukose als ein Beispiel für das Verfahren zur Quantifizierung bzw. mengenmäßigen Erfassung eines Substrats, das in einer Probe enthalten ist, erläutert werden. Herkömmlicher Weise beinhaltet eine bekannte elektrochemische Quantifizierung von Glukose ein Verfahren unter Verwendung einer Kombination von Glukoseoxidase (EC 1.1.3.4: nachstehend als „GOD" bezeichnet) als ein Enzym mit einer Sauerstoffelektrode oder eine Wasserstoffperoxidelektrode (siehe „Biosensor", herausgegeben von Shuichi Suzuki, Kodansha, beispielsweise).

GOD oxidiert selektiv &bgr;-D-Glukose als ein Substrat zu D-Glukono-&dgr;-Lacton unter Verwendung von Sauerstoff als einen Elektronenmediator. Sauerstoff wird zu Wasserstoffperoxid während der Oxidationsreaktion durch GOD in der Gegenwart von Sauerstoff reduziert. Ein verringertes Volumen von Sauerstoff wird durch die Sauerstoffelektrode gemessen, oder ein vergrößertes Volumen von Wasserstoffperoxid wird durch die Wasserstoffperoxidelektrode gemessen. Das verringerte Volumen von Sauerstoff oder andererseits das vergrößerte Volumen von Wasserstoffperoxid ist zu dem Gehalt an Glukose in der Probe proportional. Es ist daher möglich, Glukose basierend auf dem verringerten Volumen von Sauerstoff oder dem vergrößerten Volumen von Wasserstoffperoxid mengenmäßig zu bestimmen.

In dem vorstehenden Verfahren ist es möglich, Glukose in der Probe genau unter Verwendung der Spezifizität der Enzymreaktion zu quantifizieren. Jedoch, wie aus der Reaktion angenommen wird, besitzt dieses Verfahren des Stands der Technik den Nachteil, dass das Messergebnis erheblich durch die Sauerstoffkonzentration in der Probe beeinträchtigt wird. Somit ist, wenn kein Sauerstoff in der Probe vorhanden ist, die Messung nicht durchführbar.

Unter derartigen Umständen ist ein Glukosesensor eines neuen Typs entwickelt worden, welcher als Elektronenmediator eine organische Verbindung oder einen Metallkomplex, wie etwa Kaliumferricyanid, ein Ferrocenderivat und ein Chinonderivat anstelle von Sauerstoff in der Probe verwendet. Der Sensor dieses Typs oxidiert den reduzierten Elektronenmediator, der aus der Enzymreaktion hervorgeht, auf eine Arbeitselektrode, um so die Glukosekonzentration in der Probe, basierend auf einem Oxidationsstrom, der durch die Oxidationsreaktion hergestellt wird, zu bestimmen. Zu dieser Zeit wird auf einer Gegenelektrode der oxidierte Elektronenmediator reduziert, und eine Reaktion zum Erzeugen des reduzierten Elektronenmediators schreitet voran. Mit der Verwendung einer derartigen organischen Verbindung oder Metallkomplexes als der Elektronenmediator anstelle von Sauerstoff, ist es möglich, eine Reagenzschicht auszubilden, indem eine bekannte Menge an GOD zusammen mit dem Elektronenmediator in deren stabilen Zustand auf Elektrode platziert wird, wodurch eine genaue Quantifizierung von Glukose ermöglicht wird, ohne durch die Sauerstoffkonzentration in der Probe beeinträchtigt zu werden. In diesem Fall ist es zudem möglich, die Reagenzschicht, die das Enzym und den Elektronenmediator enthält, mit einem Elektrodensystem zu integrieren, während die Reagenzschicht in einem fast trockenen Zustand gehalten wird, und daher ist in letzter Zeit ein wegwerfbarer Glukosesensor, basierend auf dieser Technologie in erheblichem Umfang in Erscheinung getreten. Ein typisches Beispiel für einen derartigen Glukosesensor ist ein Biosensor, der in der Japanischen veröffentlichten Patentanmeldung Hei 3-202764 offenbart ist. Mit einem derartigen wegwerfbaren Glukosesensor ist es möglich, die Glukosekonzentration leicht mit einer Messvorrichtung durch einfaches Einführen einer Probe in den Sensor zu messen, der abnehmbar mit der Messvorrichtung verbunden ist. Die Anwendung einer derartigen Technik ist nicht auf die Quantifizierung von Glukose begrenzt und kann auf die Quantifizierung eines beliebigen anderen Substrats erstreckt werden, das in der Probe enthalten ist.

In den letzten Jahren bestand ein Bedarf nach einem Biosensor mit einer höheren Stromreaktionsempfindlichkeit und einem Biosensor, der eine niedrigere Reaktion zeigt, wenn die Substratkonzentration null beträgt und eine herausragende Lagerungsstabilität besitzt. Die Reaktion, wenn die Substratkonzentration null beträgt, wird nachstehend als „Leerreaktion" bezeichnet.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt einen Biosensor bereit, der umfasst: ein Elektrodensystem, das eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode einschließt, zum Ausbilden eines elektrochemischen Messsystems, in dem dieses in Kontakt mit einer zugeführten Probenlösung kommt; ein elektrisch isolierendes Unterstützungselement, zum Unterstützen des Elektrodensystems; eine erste Reagenzschicht, die auf der Arbeitselektrode ausgebildet wird; und eine zweite Reagenzschicht, die auf der Gegenelektrode ausgebildet wird; wobei die erste Reagenzschicht kein Enzym enthält, aber dieses wenigstens ein Elektronenmediator enthält, und die zweite Reagenzschicht keinen Elektronenmediator enhält, aber diese wenigstens ein Enzym enthält.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Unterstützungselement eine elektrisch isolierende Basisplatte, auf welcher die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode ausgebildet sind.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Unterstützungselement eine elektrisch isolierende Basisplatte und ein elektrisch isolierendes Deckelement zum Ausbilden eines Probenlösungszuführungswegs oder eines Probenlösungslagerungsabschnitts zwischen dem Deckelement und der Basisplatte, die Arbeitselektrode wird auf der Basisplatte ausgebildet, und die Gegenelektrode wird auf einer inneren Oberfläche des Deckelements ausgebildet, um so die Arbeitselektrode abzudecken.

Es ist bevorzugt, dass das Deckelement ein Plattelement umfasst, das einen auswärts expandierten gekrümmten Abschnitt aufweist, zum Ausbilden eines Probenlösungszuführungswegs oder eines Probenlösungslagerungsabschnitts zwischen dem Deckelement und der Basisplatte.

Ein weiter bevorzugtes Deckelement umfasst einen Platzhalter mit einem Schlitz zum Ausbilden des Probenlösungszuführungswegs und eine Bedeckung zum Abdecken des Platzhalters.

Es ist bevorzugt, dass die erste Reagenzschicht ein hydrophiles Polymer enthält.

Während die neuen Merkmale der Erfindung in den beigefügten Ansprüchen insbesondere dargelegt werden, wird die Erfindung sowohl bezüglich der Organisation als auch des Gehalts besser verstanden und gewürdigt werden, zusammen mit anderen Aufgaben und Merkmalen davon, aus der folgenden detaillierten Beschreibung zusammengenommen mit den Zeichnungen.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

1 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors gemäß einem Beispiel der vorliegenden Erfindung.

2 ist eine perspektivische Explosionsansicht des Glukosesensors, der die Reagenzschichten und die oberflächenaktive Mittelschicht davon weglässt.

3 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors gemäß einem anderen Beispiel der vorliegenden Erfindung.

4 ist eine perspektivische Ansicht des Glukosesensors, der die Reagenzschichten und die oberflächeaktive Mittelschicht davon weglässt.

5 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors gemäß einem anderen Beispiel der vorliegenden Erfindung.

6 ist eine explodierte perspektivische Ansicht des Glukosesensors, der die Reagenzschichten und die oberflächenaktive Mittelschicht davon weglässt.

7 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors eines Vergleichsbeispiels.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Ein Biosensor gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst eine elektrisch isolierende Basisplatte; eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode, die auf der Basisplatte ausgebildet ist; eine erste Reagenzschicht, die auf der Arbeitselektrode ausgebildet ist; und eine zweite Reagenzschicht, die auf der Gegenelektrode ausgebildet ist, wobei die erste Reagenzschicht kein Enzym enthält, aber diese wenigstens einen Elektronenmediator enthält, und die zweite Reagenzschicht keinen ELektronenmediator enthält, aber diese wenigstens ein Enzym enthält.

In diesem Biosensor kann, da ein Enzym auf der Arbeitselektrode nicht vorhanden ist, die Elektrodenreaktion auf der Arbeitselektrode niemals durch Adsorption des Enzyms an die Arbeitselektrode gehindert sein und die Oxidationsreaktion des reduzierten Elektronenmediators auf der Arbeitselektrode schreitet glatt voran, wodurch die Stromreaktionsempfindlichkeit verbessert wird. Da darüber hinaus das Enzym und der Elektronenmediator voneinander separiert sind, ist es möglich, Kontakt und Wechselwirkung zwischen dem Enzym und dem Elektronenmediator zu verhindern, wodurch eine Zunahme der Leerantwort und eine Abschwächung der Enzymaktivität während der Langzeitlagerung unterdrückt wird.

Ein Biosensor gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst eine elektrisch isolierende Basisplatte; ein elektrisch isolierendes Deckelement zum Ausbilden eines Probelösungszuführungswegs oder einen Probenlösungslagerungsabschnitt zwischen dem Deckelement und der Basisplatte; eine Arbeitselektrode, die auf der Basisplatte ausgebildet ist; eine Gegenelektrode, die auf einer inneren Oberfläche des Deckelements ausgebildet ist, um so die Arbeitselektrode abzudecken; eine erste Reagenzschicht, die auf der Arbeitselektrode ausgebildet ist; und eine zweite Reagenzschicht, die auf der Gegenelektrode ausgebildet ist, wobei die erste Reagenzschicht kein Enzym enthält, aber diese wenigstens einen Elektronenmediator enthält, und die zweite Reagenzschicht keinen Elektronenmediator enthält, aber diese wenigstens ein Enzym enthält.

Das Deckelement umfasst ein Blattelement mit einem auswärts expandierten gekrümmten Abschnitt, zum Beispiel einen Probelösungszuführungsweg oder einen Probenlösungslagerungsabschnitt zwischen dem Deckelement und der Basisplatte.

Ein weiter bevorzugtes Deckelement umfasst einen Platzhalter mit einem Schlitz zum Ausbilden des Probenlösungszuführungswegs und eine Bedeckung zum Abdecken des Platzhalters.

In einem derartigen Biosensor können, da die erste Reagenzschicht und die zweite Reagenzschicht jeweils auf separaten Elementen ausgebildet werden, die erste Reagenzschicht und die zweite Reagenzschicht, die unterschiedliche Zusammensetzungen besitzen, leicht voneinander separiert werden. Da darüber hinaus die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode an entgegengesetzten Positionen ausgebildet werden, wird der Ionentransfer zwischen den Elektroden erleichtert, wodurch ferner die Stromantwort vergrößert wird.

In einem Biosensor, dessen Deckelement den Platzhalter und die Bedeckung umfasst, werden, seit die physikalische Festigkeit der Bedeckung verstärkt wird, die erste Reagenzschicht und die zweite Reagenzschicht nicht miteinander durch externen physikalischen Druck in Kontakt gebracht, wodurch eine Abschwächung der Enzymaktivität aufgrund des Kontakts zwischen dem Enzym und dem Elektronenmediator verhindert wird.

In jedem der Biosensoren der zuvor beschriebenen Ausführungsformen ist es bevorzugt, dass wenigstens die erste Reagenzschicht ein hydrophiles Polymer enthält. Da das hydrophile Polymer die Absorption von Proteinen etc. auf die Arbeitselektrode verhindert, wird die Stromreaktionsempfindlichkeit weiter verbessert. Daneben werden, da die Viskosität einer Probenlösung durch das hydrophile Polymer, das in der Probenlösung aufgelistet ist, vergrößert wird, die Effekte eines physikalischen Stoßes etc. auf die Stromreaktion verringert, wodurch die Stabilität der Stromreaktion verbessert wird.

In der vorliegenden Erfindung ist es für die Basisplatte, dem Platzhalter und die Bedeckung möglich, ein beliebiges Material mit einer isolierenden Eigenschaft und ausreichender Steifigkeit während der Lagerung und Nässung zu verwenden. Beispiele für ein derartiges Material beinhalten thermoplastische Harze, wie etwa Polyethylen, Polystyrol, Polyvenylchlorid, Polyamid und gesättigtes Polyesterharz, oder thermisch härtende Harze, wie etwa Harnstoffharz, Melaminharz, Phenolharz, Epoxidharz und ungesättigtes Polyesterharz. Unter diesen Harzen ist Polyethylenterephthalat angesichts des Klebevermögens an die Elektrode bevorzugt.

Für die Arbeitselektrode ist es möglich, ein beliebiges leitendes Material zu verwenden, wenn dieses beim Oxidieren des Elektronenmediators nicht selbst oxidiert. Für die Gegenelektrode ist es möglich, ein im Allgemeinen verwendetes leitendes Material, wie etwa Palladium, Silber, Platin, Kohlenstoff zu verwenden.

Als das Enzym ist es möglich, dasjenige zu verwenden, das für den Typ eines Substrats in der Probe geeignet ist, welche Gegenstand der Messung ist. Beispiele für das Enzym beinhalten Fruktosedehydrogenase, Glukoseoxidase, Alkoholoxidase, Lactatoxidase, Cholesteroloxidase, Xanthinoxidase, und Aminosäureoxidase.

Beispiele für den Elektronenmediator beinhalten Kaliumferricyanin, p-Benzochinon, Phenazinmethosulfat, Methylenblau, und Ferrocenderivate. Daneben wird, sogar wenn Sauerstoff als der Elektronenmediator verwendet wird, eine Stromreaktion erhalten. Diese Elektronenmediatoren werden allein oder in Kombinationen von zwei oder mehreren verwendet.

Eine Reihe von hydrophilen Polymeren sind anwendbar. Beispiele für das hydrophile Polymer beinhalten Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Polyaminosäure, wie etwa Polylysin, Polystyrolsulfonat, Gelatine und dessen Derivate, Polyacrylsäure und dessen Salze, Polymethacrylsäure und dessen Salze, Stärke und dessen Derivate, und ein Polymer aus Maleinsäureanhydrid oder einem Maleat. Unter diesen sind Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose und Hydroxypropylcellulose insbesondere bevorzugt.

Die folgende Beschreibung wird die vorliegende Erfindung im größeren Detail anhand der Beispiele erläutern.

Beispiel 1

Ein Glukosesensor wird als ein Beispiel für einen Biosensor erläutert.

1 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors dieses Beispiels, 2 ist eine explodierte perspektivische Ansicht des Glukosesensors, der die Reagenzschichten und die oberflächenaktive Mittelschicht davon weglässt.

Zunächst wurde eine Silberpaste auf eine elektrisch isolierende Basisplatte 1 aus Polyethylenterephthalat durch Siebdrucken gedruckt, um Führungen 2 und 3 und die Basis der später beschriebenen Elektroden auszubilden. Dann wurde eine leitende Kohlenstoffpaste, die ein Harzbindemittel enthielt, auf die Basisplatte 1 gedruckt, um eine Arbeitselektrode 4 auszubilden. Diese Arbeitselektrode 4 war in Kontakt mit der Führung 2. Ferner wurde eine isolierende Paste auf die Basisplatte 1 gedruckt, um eine isolierende Schicht 6 auszubilden. Die isolierende Schicht 6 bedeckte den peripheren Teil der Arbeitselektrode 4, so dass ein fixierter Bereich der Arbeitselektrode 4 ausgesetzt wurde. Als nächstes wurde eine Gegenelektrode 5 ausgebildet, indem eine leitende Kohlenstoffpaste, die ein Harzbindemittel enthielt, gedruckt wurde, um so in Kontakt mit der Führung 3 zu sein.

Eine erste wässrige Lösung, die Kaliumferricyanid als einen Elektronenmediator und kein Enzym enthielt, wurde auf die Arbeitselektrode 4 der Basisplatte 1 getropft, und dann getrocknet, um eine erste Reagenzschicht 7 auszubilden. Daneben wurde eine zweite wässrige Lösung, die GOD als ein Enzym und keinen Elektrodenmediator enthielt, auf die Gegenelektrode 5 der Basisplatte 1 getropft, und dann getrocknet, um eine zweite Reagenzschicht 8 auszubilden. Um ferner eine glatte Zuführung einer Probe zu erreichen, wurde eine Schicht 9, die Lecithin als ein oberflächenaktives Mittel enthielt, ausgebildet, um so die erste Reagenzschicht 7 und eine zweite Reagenzschicht 8 zu bedecken.

Schließlich wurden die Basisplatte 1, eine Bedeckung 12 und ein Platzhalter 10 zueinander in einen Positionszusammenhang gebracht, wie er durch die gestrichelten Linien in 2 gezeigt wird, um den Glukosesensor herzustellen.

Der Platzhalter 10, der zwischen die Basisplatte 1 und die Bedeckung 12 eingeschoben wird, besitzt einen Schlitz 11 zum Ausbilden eines Probenzuführungswegs zwischen der Basisplatte 1 und der Bedeckung 12.

Da ein Luftventil 14 der Bedeckung 12 mit diesem Probenlösungszuführungsweg kommuniziert, wenn die Probe in Kontakt mit einer Probenzuführungsöffnung 13 gebracht wird, die an einem offenen Ende des Schlitzes 11 ausgebildet ist, erreicht die Probe leicht die erste Reagenzschicht 7 und die zweite Reagenzschicht 8 in dem Probenzuführungsweg wegen dem Kapillarphänomen.

Als ein Vergleichsbeispiel wurde ein Glukosesensor, der auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 hergestellt war, mit der Ausnahme des Verfahrens zum Ausbilden der Reagenzschichten hergestellt. 7 ist eine vertikale Querschnittsansicht des Glukosesensors des Vergleichsbeispiels. Eine Reagenzschicht 30 wurde ausgebildet, indem eine wässrige Lösung, die GOD und Kaliumferricyanid enthielt, auf die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 aufgetropft wurde, und dann die wässrige Lösung getrocknet wurde. Darüber hinaus wurde eine Schicht 9, die Lecithin als ein oberflächenaktives Mittel enthielt, auf der Reagenzschicht 30 ausgebildet.

Als nächstes wurde mit den Glukosesensoren von Beispiel 1 und dem Vergleichsbeispiel die Konzentration von Glukose unter Verwendung einer Lösung gemessen, die eine bestimmte Menge an Glukose als eine Probe enthielt. Die Probe wurde dem Probenlösungszuführungsweg aus der Probenzuführungsöffnung 13 zugeführt und nach einiger Zeit wurde eine Spannung von 500 mV an die Arbeitselektrode 4 unter Verwendung der Gegenelektrode 5 als Referenz angelegt. Da der Platzhalter 10 zwischen der Bedeckung 12 und der Basisplatte 1 eingefügt ist, wird die Festigkeit des Sensors bzw. Messfühlers gegen einen externen physikalischen Druck erhöht. Als Konsequenz wird das Volumen des Probenlösungszuführungswegs leicht konstant gehalten, und die Effekte des physikalischen Drucks etc. auf die Stromreaktion werden verringert.

Der Wert eines Stroms, welcher über die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 bei Anlegung dieser Spannung strömt, wurde gemessen. Folglich wurde sowohl in Beispiel 1 als auch dem Vergleichsbeispiel eine Stromreaktion beobachtet, die proportional zur Glukosekonzentration in der Probe war. Wenn die Probe in Kontakt mit der ersten Reagenzschicht 7 kommt, dissoziiert Kaliumferricyanid als die oxidierte Form des Elektrodenmediators in Ferricyanidion und Kaliumion. Die Glukose in der Probe, das Ferricyanidion, das in der Probe von der ersten Reagenzschicht 7 gelöst ist und das GOD, das in der Probe von der zweiten Reagenzschicht 8 gelöst ist, reagieren. Folglich wird die Glukose in Glukonolacton oxidiert, und die oxidierte Form Ferricyanidion wird zu der reduzierten Form Ferrocyanidion reduziert. Eine Reaktion zum Oxidieren von Ferrocyanidion in Ferricyanidion schreitet auf der Arbeitselektrode 4 voran, während eine Reaktion zum Reduzieren von Ferricyanidion in Ferrocyanidion auf der Gegenelektrode 5 voranschreitet. Da die Konzentration des Ferrocyanidions proportional zu der Konzentration der Glukose ist, ist es möglich, die Konzentration von Glukose, basierend auf dem Oxidationsstrom des Ferrocyanidions zu messen.

Im Vergleich mit dem Glukosesensor des Vergleichsbeispiels, der GOD als ein Enzym in der Reagenzschicht 30 auf der Arbeitselektrode 4 enthält, wurde die Stromreaktion in dem Glukosesensor vom Beispiel 1 aus dem folgenden Grund erhöht. Da die erste Reagenzschicht 7 kein GOD enthielt, war es möglich, ein Herabsetzen der Stromreaktion aufgrund der Adsorption von GOD auf die Arbeitselektrode 4 zu verhindern.

Darüber hinaus wurde im Vergleich mit dem Vergleichsbeispiel die Leerreaktion herabgesetzt und die Stromreaktion wurde nicht so sehr, sogar nach einer Langzeitspeicherung aus dem folgenden Grund geändert. Da das GOD und Kaliumferricyanid voneinander separiert waren, war es möglich, Kontakt und Wechselwirkung zwischen dem GOD und Kaliumferricyanid zu verhindern. Somit war es möglich, eine Zunahme der Leerreaktion und Abschwächung der Enzymaktivität während einer Langzeitlagerung zu unterdrücken.

Beispiel 2

3 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors dieses Beispiels, und 4 ist eine perspektivische Ansicht des Glukosesensors, wobei die Reagenzschichten und die oberflächeaktive Mittelschicht davon weggelassen werden.

Eine Arbeitselektrode 4 und eine Führung 2 wurden ausgebildet, indem Palladium auf einer elektrisch isolierenden Basisplatte 21 gesputtert wurden. Als nächstes wurden, indem ein Isolierungsblatt 23 auf die Basisplatte 21 geklebt wurde, die Arbeitselektrode 4 und ein Endabschnitt, der in eine Messvorrichtung eingeschoben wird, definiert.

Während dessen wurde eine Gegenelektrode 5 ausgebildet, indem Palladium auf die innere Wandoberfläche eines auswärts expandierten gekrümmten Abschnitts 24 eines elektrisch isolierenden Deckelements 22 gesputtert wurde. Ein Endteil des gekrümmten Abschnitts 24 wurde mit einem Luftventil 14 ausgestattet.

Eine erste wässrige Lösung, die Kaliumferricyanid als einen Elektronenmediator und kein Enzym enthielt, wurde auf die Arbeitselektrode 4 der Basisplatte 21 aufgetropft und dann getrocknet, um eine erste Reagenzschicht 7 auszubilden. Daneben wurde eine zweite wässrige Lösung, die GOD als ein Enzym und keinen Elektronenmediator enthielt, auf die Gegenelektrode 5 des Deckelements 22 aufgetropft, um eine zweite Reagenzschicht 8 auszubilden. Ferner wurde eine Schicht 9, die Lecithin als ein oberflächenaktives Mittel enthielt, auf der ersten Reagenzschicht 7 ausgebildet.

Schließlich wurden die Basisplatte 21 und die Bedeckung 22 aneinander angehaftet, um den Glukosesensor herzustellen. Demgemäß werden die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 positioniert, um einander mit einen Platz, der zwischen der Basisplatte 21 und dem gekrümmten Abschnitt 24 des Deckelements 22 dazwischen ausgebildet ist, gegenüber zu stehen. Dieser Platz dient als ein Probenspeicherungsabschnitt und, wenn eine Probe in Kontakt mit einem offenen Ende des Raums gebracht wird, bewegt sich die Probe leicht zu dem Luftventil 14 aufgrund des Kapillarphänomens und kommt mit der ersten Reagenzschicht 7 und der zweiten Reagenzschicht 8 in Kontakt.

Als nächstes wurde die Konzentration von Glukose gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 gemessen. Folglich wurde eine Stromreaktion, die proportional zu der Konzentration von Glukose in der Probe war, beobachtet. Die Gegenelektrode 5 wurde elektrisch verbunden, indem der Endteil des gekrümmten Abschnitts 24 mit einer Klammer, die mit einem Gleitdraht verbunden war, gehalten wurde.

Im Vergleich mit dem Glukosesensor vom Beispiel 1 wurde eine weitere Zunahme des Reaktionswerts in dem Glukosesensor vom Beispiel 2 aus dem folgenden Grund beobachtet. Da die erste Reagenzschicht 7 kein GOD wie Beispiel 1 enthielt und die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 an entgegen gesetzten Positionen ausgebildet wurden, wurde ein Ionentransfer zwischen der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5 erleichtert.

Da darüber hinaus das GOD und Kaliumferricyanid voneinander separiert wurden, wie in Beispiel 1, wurde die Leerreaktion herabgesetzt und die Stromreaktion wurde nicht so sehr nach einer Langzeitlagerung im Vergleich mit dem Vergleichsbeispiel geändert.

Beispiel 3

5 ist eine vertikale Querschnittsansicht eines Glukosesensors dieses Beispiels, und 6 ist eine explodierte perspektivische Ansicht des Glukosesensors, wobei die Reagenzschichten und die oberflächenaktive Mittelschicht davon weggelassen werden.

Zunächst wurde eine Silberpaste auf eine elektrisch isolierende Basisplatte 31 aus Polyethylenterephthalat durch Siebdrucken aufgedruckt, um eine Führung 2 auszubilden. Dann wurde eine leitende Kohlenstoffpaste, die ein Harzbindemittel enthielt, auf die Basisplatte 31 gedruckt, um eine Arbeitselektrode 4 auszubilden. Diese Arbeitselektrode 4 war in Kontakt mit der Führung 2. Ferner wurde eine isolierende Paste auf die Basisplatte 31 gedruckt, um eine isolierende Schicht 6 auszubilden. Die isolierende Schicht 6 bedeckte den peripheren Teil der Arbeitselektrode 4, so dass ein fixierter Bereich der Arbeitselektrode 4 ausgesetzt wurde.

Als nächstes wurde eine Silberpaste auf die innere Oberfläche einer elektrisch isolierenden Bedeckung 32 gedruckt, um eine Führung 3 auszubilden, und dann wurde eine leitende Kohlenstoffpaste aufgedruckt, um eine Gegenelektrode 5 auszubilden. Ferner wurde eine isolierende Paste gedruckt, um eine isolierende Schicht 6 auszubilden. Die Bedeckung 32 wurde mit einem Luftventil 14 ausgestattet.

Eine erste wässrige Lösung, die Kaliumferricyanid als einen Elektronenmediator und kein Enzym enthielt, wurde auf die Arbeitselektrode 4 der Basisplatte 31 aufgetropft, und dann getrocknet, um eine erste Reagenzschicht 7 auszubilden, während eine zweite wässrige Lösung, die GOD als ein Enzym und keinen Elektronenmediator enthielt, auf die Gegenelektrode 5 der Bedeckung 32 aufgetropft wurde und dann getrocknet wurde, um eine zweite Reagenzschicht 8 auszubilden. Ferner wurde eine Schicht 9, die Lecithin als ein oberflächenaktives Mittel enthielt, auf der ersten Reagenzschicht 7 ausgebildet.

Schließlich wurden die Basisplatte 31, die Bedeckung 32 und ein Platzhalter 10 aufeinander in einem Positionszusammenhang angebracht, wie er durch die gestrichelten Linien von 6 gezeigt wird, um den Glukosesensor herzustellen.

Der Platzhalter 10, der zwischen die Basisplatte 31 und die Bedeckung 32 eingefügt ist, besitzt einen Schlitz 11 zum Ausbilden eines Probenlösungszuführungswegs zwischen der Basisplatte 31 und der Bedeckung 32. Die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 stehen einander in dem Probenlösungszuführungsweg gegenüber, der in dem Schlitz 11 des Platzhalters 10 ausgebildet ist.

Da das Luftventil 14 der Bedeckung 32 mit diesem Probenlösungszuführungsweg kommuniziert, wenn eine Probe in Kontakt mit einer Probenzuführungsöffnung 13 gebracht wird, die an einem offenen Ende des Schlitzes 11 ausgebildet ist, erreicht die Probe leicht die erste Reagenzschicht 7 und die zweite Reagenzschicht 8 in dem Probenlösungszuführungsweg aufgrund des Kapillarphänomens.

Als nächstes wurde die Konzentration von Glukose gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 gemessen. Als Folge der Messung wurde eine Stromreaktion, die proportional zur Konzentration von Glukose in der Probe war, beobachtet.

In dem Glukosesensor von Beispiel 1 enthielt die erste Reagenzschicht 7 kein GOD, und die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 wurden an entgegen gesetzten Positionen ausgebildet. Daher wurde ähnlich wie in Beispiel 2 der Reaktionswert im Vergleich mit dem Glukosesensor vom Beispiel 1 erhöht.

Da darüber hinaus das GOD und Kaliumferricyanid voneinander separiert wurden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1, wurde die Leerreaktion herabgesetzt und die Stromreaktion wurde nicht so sehr nach einer Langzeitlagerung im Vergleich mit dem Vergleichsbeispiel geändert.

Da darüber hinaus der Platzhalter 10 zwischen der Basisplatte 31 und der Bedeckung 32 eingefügt wurde, wurde die Festigkeit des Sensors gegen einen externen physikalischen Druck verstärkt. Als Folge wurden die erste Reagenzschicht 7 und die zweite Reagenzschicht 8 niemals miteinander durch den physikalischen Druck in Kontakt gebracht, wodurch verhindert wurde, dass die Stromreaktion durch die Abschwächung der Enzymaktivität sich veränderte. Da zudem das Volumen des Probenlösungszuführungswegs leicht konstant gehalten wurde, wurde die Stabilität der Stromreaktion im Vergleich mit Beispiel 2 verbessert.

Beispiel 4

In dieser Ausführungsform wurde ein Glukosesensor auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3 hergestellt, mit der Ausnahme des Verfahrens zum Ausbilden der ersten Reagenzschicht 7 und der zweiten Reagenzschicht 8.

Eine erste wässrige Lösung, die Kaliumferricyanid als einen Elektronenmediator, Carboxymethylcellulose als hydrophiles Polymer und kein Enzym enthielt, wurde auf die Arbeitselektrode 4 auf der Basisplatte 31 aufgetropft und dann getrocknet, um die erste Reagenzschicht 7 auszubilden, während eine zweite wässrige Lösung, die GOD als ein Enzym, Carboxymethylcellulose und keinen Elektronenmediator enthielt, auf die Gegenelektrode 5 der Bedeckung 32 aufgetropft wurde, und dann getrocknet wurde, um die zweite Reagenzschicht 8 auszubilden. Darüber hinaus wurde die Schicht 9, die Lecithin als ein oberflächenaktives Mittel enthielt, auf der ersten Reagenzschicht 7 ausgebildet.

Als nächstes wurde die Konzentration von Glukose gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 gemessen. Als Folge der Messung wurde eine Stromreaktion beobachtet, die proportional zur Konzentration von Glukose in dem Beispiel war.

In dem Glukosesensor von Beispiel 4 enthielt die erste Reagenzschicht 7 kein GOD, und die Arbeitselektrode 4 und die Gegenelektrode 5 wurden an entgegengesetzten Positionen ausgebildet. Daher wurde wie in Beispiel 2 die Stromreaktion im Vergleich mit dem Glukosesensor vom Beispiel 1 erhöht.

Da darüber hinaus das GOD und Kaliumferricyanid voneinander separiert wurden auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1, wurde die Leerreaktion herabgesetzt und die Stromreaktion wurde nicht so sehr, sogar nach einer Langzeitlagerung, im Vergleich mit dem Vergleichsbeispiel geändert.

Da darüber hinaus der Platzhalter 10 zwischen der Basisplatte 31 und der Bedeckung 32 eingefügt war, wie in Beispiel 3, war es möglich, zu verhindern, dass die Stromreaktion sich durch die Abschwächung der Enzymaktivität, die durch den Kontakt zwischen GOD und Kaliumferricyanid verursacht wurde, veränderte. Da zudem das Volumen des Probenlösungszuführungswegs leicht konstant gehalten wurde, wie in Beispiel 3, wurde die Stabilität der Stromreaktion im Vergleich mit Beispiel 2 verbessert.

Daneben wurde im Vergleich mit Beispielen 2 und 3 die Stromreaktion weiter aus dem folgenden Grund vergrößert. Das Vorhandensein von Carboxymethylcellulose in der ersten Reagenzschicht 7 behinderte die Adsorption von Proteinen an die Oberfläche der Arbeitselektrode 4, und somit schritt die Elektronenreaktion auf der Arbeitselektrode 4 glatt voran. Da darüber hinaus die Viskosität der Probe während der Messung erhöht wurde, wurden die Effekte des physikalischen Stoßes etc. auf den Sensor verringert und Variationen der Sensorreaktion wurden abgeschwächt.

In den vorstehend beschriebenen Beispielen ist, während eine Spannung von 500 mV an die Arbeitselektrode 4 unter Verwendung der Gegenelektrode 5 als Referenz angelegt wurde, die Spannung nicht notwendiger Weise auf 500 mV begrenzt. Eine beliebige Spannung, die die Oxidation des Elektronenmediators ermöglicht, der mit der Enzymreaktion reduziert wird, kann angelegt werden.

Während in den vorstehend beschriebenen Beispielen die erste Reagenzschicht 7 eine Art von Elektronenmediator enthielt, kann diese zwei oder mehr Arten von Elektronenmediatoren enthalten.

Die erste Reagenzschicht 7 und die zweite Reagenzschicht 8 können auf der Arbeitselektrode 4 oder der Gegenelektrode 5 immobilisiert werden, um so das Enzym oder den Elektronenmediator unlöslich zu machen. Wenn die erste Reagenzschicht 7 und die zweite Reagenzschicht 8 immobilisiert werden, ist es bevorzugt, ein Vernetzungsimmobilisierungsverfahren oder ein Adsorptionsverfahren zu verwenden. Alternativ können der Elektronenmediator und das Enzym jeweils in der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode vermischt werden.

Als das oberflächenaktive Mittel ist es möglich, ein Material zu verwenden, dass sich von Lecithin unterscheidet. Daneben ist, obwohl die oberflächenaktive Mittelschicht 9 nur auf der ersten Reagenzschicht 7 ausgebildet wurde, oder auf der ersten Reagenzschicht 7 und der zweiten Reagenzschicht 8 ausgebildet wurde, die Bildung der oberflächenaktiven Mittelschicht 9 nicht notwendiger Weise auf diese Beispiele begrenzt, und die aktive Mittelschicht 9 kann an einer Position ausgebildet werden, die dem Probenlösungszuführungsweg gegenübersteht, wie etwa einer Seitenfläche des Schlitzes 11 des Platzhalters 10.

In den vorstehend beschriebenen Beispielen wird ein Zweielektrodensystem beschrieben, das nur aus der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode besteht. Wenn jedoch ein Dreielektrodensystem einschließlich einer zusätzlichen Referenzelektrode angewendet wird, ist es möglich, eine genauere Messung durchzuführen.

Es ist bevorzugt, dass die erste Reagenzschicht und die zweite Reagenzschicht nicht miteinander in Kontakt sind und voneinander mit einem Raum dazwischen separiert sind. Dem gemäß ist es möglich, den Effekt des Unterdrückens einer Zunahme der Leerreaktion und den Effekt des Verbesserns der Speicherstabilität zu verstärken.

Wie vorstehend beschrieben ist es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, einen Biosensor mit einer hohen Stromreaktion, einer geringen Leerreaktion und einer hohen Speicherstabilität zu erhalten.

Obwohl die vorliegende Erfindung im Bezug auf die gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, sollte diese so verstanden werden, dass eine derartige Offenbarung nicht als begrenzend interpretiert wird. Verschiedene von der Erfindung eingeschlossene Änderungen und Modifikationen werden ohne Zweifel den Fachleuten nach Kenntnis der vorstehenden Offenbarung offensichtlich sein.


Anspruch[de]
  1. Biosensor, der umfasst:

    ein Elektrodensystem, das eine Arbeitselektrode (4) und eine Gegenelektrode (5) einschließt, zum Ausbilden eines elektrochemischen Meßsystems durch in Kontakt kommen mit einer zugeführten Probenlösung;

    ein elektrisch isolierendes Trägerelement (1, 21, 22, 31, 32) zum Unterstützen des Elektrodensystems;

    eine erste Reagenzschicht (7), die auf der Arbeitselektrode (4) gebildet ist; und

    eine zweite Reagenzschicht (8), die auf der Gegenelektrode (5) gebildet ist,

    wobei die erste Reagenzschicht (7) kein Enzym enthält, aber diese wenigstens einen Elektronenvermittler enthält, und

    die zweite Reagenzschicht (8) keinen Elektronenvermittler enthält, aber diese wenigstens ein Enzym enthält.
  2. Biosensor gemäß Anspruch 1, wobei das Trägerelement eine elektrisch isolierende Basisplatte (1) umfasst, auf welcher die Arbeitselektrode (4) und die Gegenelektrode (5) gebildet sind.
  3. Biosensor gemäß Anspruch 1,

    wobei das Trägerelement eine elektrisch isolierende Basisplatte (21, 31) und ein elektrisch isolierendes Deckelement (22, 32) zum Ausbilden eines Probenlösungszuführungswegs oder eines Probenlösungsspeicherungsabschnittes zwischen dem Deckelement (22, 32) und der Basisplatte (21, 31) umfasst,

    die Arbeitselektrode (4) auf der Basisplatte (21, 31) gebildet ist, und

    die Gegenelektrode (5) auf einer inneren Oberfläche des Deckelementes (22, 32) gebildet ist, um der Arbeitselektrode (4) gegenüber zu stehen.
  4. Biosensor gemäß Anspruch 3, wobei das Deckelement (22) ein Blattelement mit einem nach außen erweiterten gekrümmten Abschnitt (24) umfasst, zum Ausbilden des Probenlösungszuführungswegs oder des Probenlösungsspeicherungsabschnittes zwischen dem Deckelement (22) und der Basisplatte (21).
  5. Biosensor gemäß Anspruch 3, wobei das Deckelement einen Platzhalter (10) mit einem Schlitz (11) zum Ausbilden des Probenlösungszuführungswegs und eine Abdeckung (32) zum Abdecken des Platzhalters (10) umfasst.
  6. Biosensor gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei die erste Reagenzschicht ein hydrophiles Polymer enthält.
Es folgen 7 Blatt Zeichnungen






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