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Verfahren zum In-Vitro-Texten der proteolytischen Aktivität von Polypeptiden mit HCV NS3 Protease-Aktivität sowie Peptidsubstrate, die in diesem Verfahren verwendet werden - Dokument DE69634406T2
 
PatentDe  


Dokumentenidentifikation DE69634406T2 13.04.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000846164
Titel Verfahren zum In-Vitro-Texten der proteolytischen Aktivität von Polypeptiden mit HCV NS3 Protease-Aktivität sowie Peptidsubstrate, die in diesem Verfahren verwendet werden
Anmelder Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P. Angeletti S.p.A., Pomezia, IT
Erfinder STEINKÜHLER, Christian, I-00061 Anguillara, IT;
PESSI, Antonello, I-00141 Roma, IT;
BIANCHI, Elisabetta, I-00195 Roma, IT;
TALIANI, Marina, I-00174 Roma, IT;
TOMEI, Licia, I-00143 Roma, IT;
URBANI, Andrea, I-00187 Roma, IT;
DE FRANCESCO, Raffaele, I-00143 Roma, IT;
NARJES, Frank, I-00040 Ariccia, IT
Vertreter Abitz & Partner, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69634406
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 20.08.1996
EP-Aktenzeichen 969265743
WO-Anmeldetag 20.08.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/IT96/00163
WO-Veröffentlichungsnummer 0097008304
WO-Veröffentlichungsdatum 06.03.1997
EP-Offenlegungsdatum 10.06.1998
EP date of grant 02.03.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.04.2006
IPC-Hauptklasse C12N 9/50(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12Q 1/37(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 7/06(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 7/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 11/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 14/18(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft die Molekularbiologie und die Virologie des Hepatitis C-Virus (HCV). Konkreter hat die Erfindung als Gegenstand einen enzymatischen Assay, welcher zur Selektion, für therapeutische Zwecke, von Verbindungen, welche die mit NS3 assoziierte Enzymaktivität inhibieren, in der Lage ist.

Bekanntermaßen ist das Hepatitis C-Virus (HCV) der hauptsächliche ätiologische Erreger von Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis (NANB). Es wird geschätzt, daß HCV mindestens 90% von posttransfusionaler NANB-Virushepatitis und 50% von sporadischer NANB-Hepatitis verursacht. Obwohl große Fortschritte bei der Auswahl von Blutspendern und bei der immunologischen Charakterisierung von Blut, das für Transfusionen verwendet wird, gemacht wurden, gibt es immer noch eine große Anzahl von HCV-Infektionen bei Empfängern von Bluttransfusionen (eine Million oder mehr Infektionen jährlich auf der ganzen Welt). Etwa 50% der HCV-infizierten Individuen entwickeln Leberzirrhose innerhalb eines Zeitraums, der im Bereich von 5 bis 40 Jahren liegen kann. Ferner legen jüngere klinische Studien nahe, daß es eine Korrelation zwischen chronischer HCV-Infektion und der Entwicklung eines hepatozellulären Karzinoms gibt.

HCV ist ein umhülltes Virus, welches ein Genom positiver RNA von etwa 9,4 kb enthält. Dieses Virus ist ein Vertreter der Flaviviridae-Familie, deren andere Vertreter die Flaviviren und die Pestiviren sind.

Das RNA-Genom von HCV wurde kürzlich kartiert. Ein Vergleich von Sequenzen der HCV-Genome, die in verschiedenen Teilen der Welt isoliert wurden, hat gezeigt, daß diese Sequenzen extrem heterogen sein können. Der Großteil des HCV-Genoms wird von einem offenen Leserahmen (ORF) eingenommen, welcher zwischen 9030 und 9099 Nukleotiden variieren kann. Dieser ORF kodiert für ein einzelnes virales Polyprotein, dessen Länge von 3010 bis 3033 Aminosäuren variieren kann. Während des Zyklus der viralen Infektion wird das Polyprotein proteolytisch in die individuellen Genprodukte prozessiert, welche zur Replikation des Virus erforderlich sind.

Die Gene, welche für HCV-Strukturproteine kodieren, befinden sich am 5'-Ende des ORF, wohingegen der Bereich, der für die Nicht-Strukturproteine kodiert, den Rest des ORF einnimmt.

Die Strukturproteine bestehen aus C (Kern, 21 kD), E1 (Hülle, gp37) und E2 (NS1, gp61). C ist ein unglycosyliertes Protein von 21 kD, welches wahrscheinlich das virale Nukleokapsid bildet. Das Protein E1 ist ein Glycoprotein von etwa 37 kD, von dem angenommen wird, daß es ein Strukturprotein für die äußere virale Hülle ist. E2, ein weiteres Membran-Glycoprotein von 61 kD, ist wahrscheinlich ein zweites Strukturprotein in der äußeren Hülle des Virus.

Der nicht-strukturelle Bereich beginnt mit NS2 (p24), einem hydrophoben Protein von 24 kD, dessen Funktion unbekannt ist.

Von NS3, einem Protein von 68 kD, welches NS2 in dem Polyprotein folgt, wird vorausgesagt, daß es zwei funktionelle Domänen aufweist: eine Serinprotease-Domäne in den ersten 200 aminoterminalen Aminosäuren und ein RNA-abhängige ATPase-Domäne am Carboxyterminus.

Der NS4-Genbereich kodiert für NS4A (p6) und NS4B (p26), zwei hydrophobe Proteine von 6 bzw. 26 kD, deren Funktionen noch nicht aufgeklärt wurden.

Der NS5-Genbereich kodiert ebenfalls für zwei Proteine, NS5A (p56) und NS5B (p65), von 56 bzw. 65 kD. Aminosäuresequenzen, die in allen RNA-abhängigen RNA-Polymerasen vorliegen, sind in der NS5-Region zu erkennen. Dies legt nahe, dass die NS5-Region Komponenten der viralen Replikationsmaschinerie enthält.

Verschiedene molekularbiologische Studien weisen darauf hin, daß die Signalpeptidase, eine Protease, welche mit dem endoplasmatischen Retikulum der Wirtszelle assoziiert ist, für die proteolytische Prozessierung in dem nicht-strukturellen Bereich verantwortlich ist, d.h. an den Stellen C/E1, E1/E2 und E2/NS2.

Die Serinprotease in NS3 ist für die Spaltung an den Verbindungsstellen zwischen NS3 und NS4A, zwischen NS4A und NS4B, zwischen NS4B und NS5A und zwischen NS5A und NS5B verantwortlich. Insbesondere wurde festgestellt, dass die von dieser Serinprotease vorgenommene Spaltung einen Cystein- oder einen Threoninrest auf der aminoterminalen Seite (Position P1) und einen Alanin- oder Serinrest auf der carboxyterminalen Seite (Position P1') der Spaltstelle zurücklässt. Es wurde gezeigt, dass die in NS3 enthaltene Protease ein heterodimeres Protein in vivo ist, welches einen Komplex mit dem Protein NS4A bildet. Die Bildung dieses Komplexes erhöht die proteolytische Aktivität an den Stellen NS4A/NS4B und NS5A/NS5B und ist eine notwendige Voraussetzung für die proteolytische Prozessierung der Stelle NS4B/NS5A.

Eine zweite Proteaseaktivität von HCV scheint für die Spaltung zwischen NS2 und NS3 verantwortlich zu sein. Diese Proteaseaktivität ist in einem Bereich enthalten, der sowohl einen Teil von NS2 als auch den Teil von NS3, der die Serinprotease-Domäne enthält, umfasst, bedient sich jedoch nicht desselben katalytischen Mechanismus wie die letztere.

Eine Substanz, welche zur Störung der mit dem Protein NS3 assoziierten proteolytischen Aktivität in der Lage ist, könnte ein neues therapeutisches Mittel darstellen. Tatsächlich würde die Inhibierung dieser Proteaseaktivität die Beendigung der proteolytischen Prozessierung des nicht-strukturellen Bereichs des HCV-Polyproteins beinhalten und folglich die virale Replikation der infizierten Zellen verhindern.

Diese Folge von Ereignissen wurde für den homologen Flavivirus verifiziert, welcher im Gegensatz zu HCV Zelllinienkulturen infiziert. In diesem Fall wurde gezeigt, dass genetische Manipulationen, welche die Bildung einer Protease, die nicht länger zur Ausübung ihrer katalytischen Aktivität in der Lage ist, beinhalten, das Vermögen des Virus zur Replikation eliminiert (1).

Ferner wurde allgemein gezeigt, sowohl in vitro als auch in klinischen Studien, dass Verbindungen, welche zur Störung der HIV-Proteaseaktivität in der Lage sind, zur Hemmung der Replikation dieses Virus in der Lage sind (2).

Die verwendeten Verfahren zur Erzeugung von Molekülen mit therapeutischem Potential sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Allgemein gesprochen, werden Kollektionen von Verbindungen, die eine große Anzahl einzelner chemischer Gruppierungen mit einer hohen molekularen Vielfalt enthalten, einem automatisierten Assay unterworfen, um einzelne aktive Agenzien zu identifizieren, welche dann weitere chemische Modifizierungen erfahren, um ihr therapeutisches Potential zu verbessern. Andere Ansätze können eine rationale Modifizierung von Substraten oder Liganden eines spezifischen Zielproteins beinhalten, mit dem Ziel, Verbindungen mit hoher Bindungsaffinität zu entwickeln, welche in der Lage sind, die biologische Aktivität des untersuchten Proteins zu verändern oder zu eliminieren. Die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur eines Zielproteins mit Hilfe von auf dem Gebiet bekannten Verfahren, wie z.B. Röntgenkristallographie oder kernmagnetische Resonanz (NMR), erlaubt ein rationales Design von Molekülen, welche zur spezifischen Bindung an das Protein in der Lage sind und als Folge davon die Fähigkeit zur Beeinträchtigung der biologischen Eigenschaften dieses Proteins aufweisen.

Die Forschung hinsichtlich Verbindungen, welche zur Störung der biologischen Aktivität der Protease, welche in dem Hepatitis C-Virus-NS3-Protein enthalten ist, in der Lage sind, wird behindert durch die Schwierigkeit bei der Herstellung ausreichender Mengen an gereinigtem Protein mit unveränderten katalytischen Eigenschaften und das Erfordernis, Cofaktoren zu verwenden, um die Aktivität des Enzyms in vitro zu erhöhen.

Deshalb besteht auf diesem speziellen Gebiet Bedarf für ein Verfahren zur Herstellung von NS3 oder ähnlichen Produkten in größeren Mengen als in der Vergangenheit möglich war und mit einer ausreichenden in vitro-Aktivität, um Inhibitoren auszuwählen.

Die vorliegende Patentbeschreibung offenbart isolierte und gereinigte Polypeptide mit der proteolytischen Aktivität des HCV-Proteins NS3, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass sie eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche aus den Sequenzen SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 4 und SEQ-ID-Nr. 5 ausgewählt sind.

Ebenfalls offenbart werden Expressionsvektoren – zur Herstellung der Polypeptide, welche durch die Sequenzen SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 4 und SEQ-ID-Nr. 5 repräsentiert werden, welche die proteolytische Aktivität von HCV-NS3 aufweisen –, umfassend

  • – ein Polynukleotid, kodierend für eines der genannten Polypeptide;
  • – funktionelle Regulations-, Transkriptions- und Translationssequenzen in der Wirtszelle, operativ mit dem Polynukleotid verbunden, welches für eines dieser Polypeptide kodiert; und
  • – gegebenenfalls einen selektierbaren Marker.

Ebenfalls offenbart wird eine Wirtszelle, entweder eukaryotisch oder prokaryotisch, welche unter Verwendung eines Expressionsvektors, der eine für SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 4 oder SEQ-ID-Nr. 5 kodierende DNA-Sequenz enthält, in einer solchen Weise transformiert wurde, um der Wirtszelle die Expression des speziellen kodierten Polypeptids in der gewählten Sequenz zu erlauben. Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden mit einer Sequenz, welche aus der Gruppe, umfassend SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 4 und SEQ-ID-Nr. 5, ausgewählt ist, dadurch gekennzeichnet, dass es in Kombination die folgenden Vorgänge umfasst:

  • – Transformation einer Wirtszelle, entweder eukaryotisch oder prokaryotisch, unter Verwendung eines der obengenannten Expressionsvektoren, und
  • – Expression der gewünschten Nukleotidsequenz zur Herstellung des gewählten Polypeptids, und
  • – Reinigung des so erhaltenen Polypeptids unter Vermeidung von Protokollen zur Resolubilisierung.

Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zur Reproduktion der proteolytischen Aktivität der HCV-NS3-Protease in vitro, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die Aktivität von gereinigten Polypeptiden mit Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, die SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 4 und SEQ-ID-Nr. 5 umfasst, ähnlich NS3, in einer Lösung, die 30–70 mM Tris, pH 6,5–8,5, 3–30 mM Dithiothreitol (DTT), 0,5–3% 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonium]-1-propansulfonat (CHAPS) und 30–70% Glycerin enthält, bei Temperaturen zwischen 20 und 25°C reproduziert wird, und die Tatsache, dass unter diesen Bedingungen die Aktivität der obengenannten Polypeptide kinetisch bestimmt und mit Peptidsubstraten sogar in Abwesenheit von Cofaktoren quantitativ bestimmt werden kann.

Die vorliegende Erfindung hat als Gegenstand einen Assay der Proteaseaktivität der Polypeptide SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 4 und SEQ-ID-Nr. 5. Der Assay kann durchgeführt werden durch Spaltung eines Substrats, welches nachweisbare Produkte ergibt. Die Spaltung wird vorzugsweise nachgewiesen unter Verwendung von Verfahren, die auf radioaktiven, colorimetrischen oder fluorimetrischen Signalen basieren. Verfahren wie HPLC und dgl. sind ebenfalls geeignet. Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die verwendeten Substrate synthetische Peptide, die der HCV-Polyprotein-NS4A/4B-Verbindungsstelle entsprechen. Erforderlichenfalls können Peptide, welche die Aminosäuresequenz SEQ-ID-Nr. 6 oder Teile davon enthalten, als Cofaktor der NS3-Protease verwendet werden.

Peptide, die zur Verwendung als Substrate geeignet sind, sind die Peptide, welche durch die Sequenz SEQ-ID-Nr. 7 repräsentiert werden, und Derivate davon mit N- und/oder C-terminalen Deletionen (SEQ-ID-Nrn. 8–12, 14, 18–20) und das durch die Sequenz SEQ-ID-Nr. 47 repräsentierte Peptid. Besonders geeignet sind die Decapeptide, welche durch die Sequenzen SEQ-ID-Nrn. 18–20 repräsentiert werden, insbesondere SEQ-ID-Nr. 18 und die davon abgeleiteten Sequenzen SEQ-ID-Nrn. 29–32, 35.

Diese Peptide können für einen Assay der NS3-Proteaseaktivität mit hohem Durchsatz bei einer Konzentration der letzteren von zwischen 100–200 nM verwendet werden.

Gemäß der Erfindung können Depsipeptid-Substrate (Peptide mit mindestens einer Esterbindung in den Sequenzen) ebenfalls vorteilhaft für einen Assay der Aktivität der NS3-Protease mit hohem Durchsatz eingesetzt werden. In der Tat ist bekannt, dass es wünschenswert ist, den Assay bei der niedrigstmöglichen Enzymkonzentration, die mit einem ausreichenden Substratumsatz vereinbar ist, durchzuführen. Dies maximiert die Sensitivität für die Inhibierung und erlaubt das Screenen hinsichtlich Inhibitoren, welche in sehr niedrigen Konzentrationen in Verbindungsmischungen oder Kombinationsbanken vorliegen. Substrate für die NS3-Protease mit einem Standard-Amid an der spaltbaren Bindung zwischen den Resten P1 und P1' haben Kcat/Km-Werte zwischen 30–100 M–1s–1. Dies gibt einen praktischen Bereich der Enzymkonzentration für einen Assay mit hohem Durchsatz von 100–200 nM. Zur Verringerung dieser Konzentration ist es erforderlich, Substrate mit höheren Kcat/Km-Werten zu verwenden. Substrate, die eine Esterbindung zwischen P1 und P1' enthalten, sind dafür ideal geeignet, da die Bildung des Acyl-Enzym-Zwischenprodukts aufgrund der thermodynamisch günstigeren Umesterungsreaktion viel leichter erreicht wird (8). Die Depsipeptid-Substrate gemäß der Erfindung haben sehr hohe Kcat/Km-Werte und dies bringt den brauchbaren Bereich der NS3-Konzentration in dem Assay mit hohem Durchsatz auf 0,5–2 nM. Diese Substrate können in hoher Ausbeute auf fester Phase nach chemischen Standardmethoden synthetisiert werden.

Herkömmliche Assays sind für das Screenen mit hohem Durchsatz geeignet, sie erfordern jedoch die Hydrolyse von mindestens 10% des Substrats, bevor das Produkt bequem nachgewiesen werden kann. Dies schließt die Bestimmung echter Anfangsgeschwindigkeiten aus, welche für genaue kinetische Studien von Bedeutung sind. Zur Bewältigung dieser Schwierigkeiten wurde ein Assay entwickelt, welcher ein kontinuierliches Überwachen der Proteaseaktivität erlaubt. Der Assay beruht auf speziell angepassten synthetischen Substraten, welche zu einer direkten kontinuierlichen Signalerzeugung, die direkt proportional zum Ausmaß der Substrat-Hydrolyse ist, in der Lage sind, und vermeidet somit die Notwendigkeit der Abtrennung des Substrats von dem Reaktionsprodukt. Die verwendeten Depsipeptide (SEQ-ID-Nrn. 45 und 46), deren chemische Formeln in 12 angegeben sind, sind intern gequenchte fluorogene Substrate auf der Grundlage von Resonanzenergietransfer (RET). Sie enthalten einen Fluoreszenzdonor, 5-[(2'-Aminoethyl)amino]naphthalinsulfonsäure (EDANS), nahe einem Ende des Peptids und eine Akzeptorgruppe, 4-[[4'-(Dimethylamino)phenyl]azo]benzoesäure (DABCYL) in der Nähe des anderen Endes. Die Fluoreszenz dieses Substrattyps wird anfangs durch intramolekulare RET zwischen dem Donor und dem Akzeptor gequencht, wenn das Enzym das Substrat spaltet, nimmt jedoch die Fluoreszenz zu. EDANS und DABCYL wurden aufgrund der ausgezeichneten spektralen Überlappung zwischen der Fluoreszenzemission des ersteren und der Absorption des letzteren (13–17) als Donor/Akzeptor-Paar ausgewählt. Die RET-Effizienz hängt von der Entfernung zwischen dem Donor und dem Akzeptor ab, d.h. je näher die beiden sind, desto höher die Quenchung. Für das EDANS/DABCYL-Paar beträgt die Förster-Distanz für einen 50%igen Energietransfer (R0) 33 Ǻ. Die maximale Distanz zwischen EDANS/DABCYL, über die in einem Substrat berichtet wurde, beträgt 11 Aminosäuren (19), welche unter der Annahme einer ausgestreckten Konformation für das Peptid R = 39,8 Ǻ entspricht, mit einer berechneten RET-Effizienz von 24,5%. Dies entspricht einer 10fachen Erhöhung der Fluoreszenz nach Substratspaltung.

Bis zu diesem Punkt wurde eine allgemeine Beschreibung der vorliegenden Erfindung gegeben. Mit Hilfe der folgenden Beispiele wird nunmehr eine detailliertere Beschreibung spezifischer Ausführungsformen davon gegeben, um ein besseres Verständnis der Ziele, charakteristischen Eigenschaften, Vorteile und Durchführungsverfahren der Erfindung zu geben.

1 zeigt den Plasmidvektor, der für den Transfer und die Expression des Polypeptids, welches durch SEQ-ID-Nr. 1 repräsentiert wird, in Spodoptera frugiperda-Klon 9-Zellen verwendet wurde.

Die 2A und 2B zeigen die Plasmidvektoren für den Transfer und die Expression der Polypeptide, welche durch die Sequenzen SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 4 bzw. SEQ-ID-Nr. 5 repräsentiert werden, in E. coli.

3 zeigt die NS3-Aktivität als Funktion der Konzentration von Glycerin.

4 zeigt die NS3-Aktivität als Funktion der Konzentration von CHAPS, 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonium]-1-propansulfonat.

5 zeigt die NS3-Aktivität als Funktion des pH-Werts.

6 zeigt die NS3-Aktivität als Funktion der Ionenstärke.

7 zeigt ein Diagramm des enzymatischen Assays zur Messung der NS3-Aktivität unter Verwendung eines Peptids Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Lys-&egr;-(3H)-Ac (SEQ-ID-Nr. 47) als Substrat.

8 zeigt das Reaktionsdiagramm für die Synthese des Depsipeptid-Substrats S1, repräsentiert durch die Sequenz SEQ-ID-Nr. 42.

9 zeigt das Reaktionsdiagramm für die Synthese des Depsipeptid-Substrats S2, repräsentiert durch die Sequenz SEQ-ID-Nr. 43.

10 zeigt das Reaktionsdiagramm für die Synthese des radioaktiven Depsipeptid-Substrats S1, repräsentiert durch die Sequenz SEQ-ID-Nr. 44.

11 zeigt einen Assay mit hohem Durchsatz auf Basis radioaktiver Signale, um die NS3-Protease-Aktivität zu bestimmen.

12 zeigt die chemische Formel der Depsipeptid-Substrate (SEQ-ID-Nr. 45 und SEQ-ID-Nr. 46) für einen kontinuierlichen Assay der NS3-Aktivität auf Basis der intramolekularen RET-Fluoreszenzquenchung.

13 zeigt das Reaktionsdiagramm für die Synthese des Depsipeptid-Substrats S3 (SEQ-ID-Nr. 45).

Die 14A bzw. 14B zeigen die kinetischen Parameter für die NS3-Protease mit dem Substrat S3 (SEQ-ID-Nr. 45) und die Fluoreszenz als Funktion der Zeit in dem relevanten Assay.

BEISPIEL 1 Verfahren zur Expression von HCV-NS3-Protease in kultivierten Spodoptera frugiperda-Klon 9-Zellen

Systeme zur Expression fremder Gene in kultivierten Insektenzellen, wie z.B. Zellen des Spodoptera frugiperda-Klons 9 (Sf9), die mit Baculovirus-Vektoren infiziert sind, sind im Stand der Technik bekannt (3). Heterologe Gene sind gewöhnlich unter die Kontrolle des starken Polyhedrin-Promoters des Autographa californica-Kern-Polyhedrosis-Virus oder des Bombix mori-Kern-Polyhedrosis-Virus gestellt. Verfahren zur Einführung heterologer DNA in die gewünschte Stelle in den Baculovirus-Vektoren durch homologe Rekombination sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt (4).

Der Plasmidvektor pBacNS3 (1039-1226) ist ein Derivat von pBlueBacIII (Invitrogen) und wurde für den Transfer eines Gens, das für ein Polypeptid mit der Aktivität von NS3 kodiert (1039-1226), konstruiert. Für diesen Zweck wurde die für dieses Polypeptid kodierende, in SEQ-ID-Nr. 1 beschriebene Nukleotidsequenz erhalten durch PCR unter Verwendung von Oligonukleotiden, welche ein ATG-Codon 5' und ein TAG-Stopcodon 3' in der Sequenz einführen. Das auf diese Weise erhaltene Fragment wurde an der BamH1-Stelle des Vektors pBlueBacIII, nach Behandlung mit dem Klenow-DNA-Polymerasefragment, eingeführt. Das Plasmid ist in 1 dargestellt.

Zellen des Spodoptera frugiperda-Klons 9 (Sf9) und Baculovirus-Rekombinationskits wurden von Invitrogen bezogen. Zellen wurden auf Schalen oder in Suspension bei 27°C in vollständigem Graces-Insektenmedium (Gibco), enthaltend 10% fötales Rinderserum (Gibco), gezüchtet. Transfektion, Rekombination und Selektion von Baculovirus-Konstrukten wurden wie vom Hersteller empfohlen durchgeführt.

Zur Proteinexpression wurden Sf9-Zellen mit dem rekombinanten Baculovirus in einer Dichte von 2 × 106-Zellen pro ml in einem Verhältnis von etwa 5 Viruspartikeln pro Zelle infiziert. Die Zellen wurden in Suspension 72 h lang bei 23°C kultiviert. Eine Erniedrigung der Temperatur von 27°C, welches normalerweise der optimalen Wachstumstemperatur entspricht, auf 23°C ist essentiell, um ein lösliches und aktives Protein zu erhalten.

Nach Ernten der Zellen durch Zentrifugation und Waschen mit PBS (20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 140 mM NaCl) wurde das Pellet in 25 mM Natriumphosphat, pH 6,5, 20% Glycerin, 0,5% 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonium]-1-propansulfonat (CHAPS), 10 mM Dithiothreit (DTT), 1 mM Ethylendiaminotetraessigsäure (EDTA) resuspendiert. Die Zellen wurden bei 4°C mittels vier Beschallungszyklen bei 10 W mit einer Dauer von jeweils 30 Sekunden unter Verwendung eines Branson 250-Instruments aufgebrochen. Das auf diese Weise erhaltene Homogenat wurde durch Zentrifugation bei 120.000 × g für 1 h pelletiert und der Überstand wurde auf eine HR26/10 S-Sepharose-Säule (Pharmacia), die mit 25 mM Natriumphosphat, pH 6,5, 10% Glycerin, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 0,1% CHAPS äquilibriert war, mit einer Flussrate von 2 ml/Min. aufgetragen. Nach Waschen mit zwei Säulenvolumina wurde die Protease mit einem NaCl-Gradienten zwischen 0 und 1 M eluiert. Die Fraktionen, welche die Protease enthielten, wurden unter Anwendung von Westernblot-Methoden mit NS3-spezifischen polyklonalen Antikörpern identifiziert, unter Verwendung einer Amicon Ultrafiltrationszelle, die mit einer Ym10-Membran ausgerüstet war, auf 3 ml konzentriert und auf einer Superdex 75 HR26/60-Säule (Pharmacia), die mit 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 10% Glycerin, 2 mM DTT, 0,1% CHAPS, 1 mM ESTA äquilibriert war, mit einer Durchflussrate von 1 ml/Min. einer Chromatographie unterworfen. Die Fraktionen, welche die Protease enthielten, wurden gepoolt und einer weiteren Chromatographie auf einer Mono-S HR5/5-Säule (Pharmacia), äquilibriert mit dem gleichen Puffer, der bei der vorherigen Säule verwendet worden war, unterworfen. Die Protease wurde in reiner Form aus dieser Säule eluiert, wobei ein linearer NaCl-Gradient zwischen 0 und 0,5 M angelegt wurde. Die Protease wurde bei –80°C in 50% Glycerin, 0,5% CHAPS, 10 mM DTT und 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, gelagert. Die Ausbeute des Verfahrens beträgt 0,5 mg/l Zellen. Das gereinigte Protein besitzt eine katalytische Aktivität Kcat/Km = 120–200 M–1s–1, gemessen in 50 mM Tris, pH 7,5, 50% Glycerin, 2% CHAPS, 30 mM DTT bei 23°C unter Verwendung des Peptidsubstrats Fmoc-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly (SEQ-ID-Nr. 7), abgeleitet von der Polyprotein-Spaltstelle zwischen NS4A und NS4B. Die aus dieser Reaktion erhaltenen Spaltprodukte wurden mittels HPLC aufgetrennt, isoliert und identifiziert mittels Massenspektroskopie, welche bestätigte, dass die proteolytische Spaltung zwischen Cystein und Alanin stattfand. Die Konzentration an Protease, welche zur Bestimmung der Aktivität erforderlich war, lag zwischen 100 nM und 1,6 &mgr;M.

BEISPIEL 2 Verfahren zur Expression von HCV-NS3-Protease in E. coli

Die Plasmide pT7-7 (NS3 1039-1226), pT7-7 (NS3 1039-1206), pT7-7 (NS3 1027-1206) und pT7-7 (NS3 1033-1206), in den 2A und 2B beschrieben, wurden konstruiert, um die Expression der in SEQ-ID-Nr. 2 und SEQ-ID-Nr. 3 und SEQ-ID-Nr. 4 bzw. SEQ-ID-Nr. 5 angegebenen Polypeptide in E. coli zu erlauben. Die Proteinfragmente enthalten Varianten der Proteasedomäne des HCV-NS3-Proteins. Die jeweiligen Fragmente von HCV-cDNA wurden stromabwärts des Bakteriophagen T7-&PHgr;10 Promoters und im Leserahmen mit dem ersten ATG-Codon des Gen 10-Proteins des Phagen T7 kloniert, unter Anwendung von Verfahren, die dem Praktiker bekannt sind. Die pT7-7-Plasmide, die NS3-Sequenzen enthalten, enthalten auch das Gen für das &bgr;-Lactamase-Enzym, welches als Marker einer Selektion von E. coli-Zellen, die mit diesen Plasmiden transformiert sind, verwendet werden kann.

Die Plasmide wurden dann in den E. coli-Stamm BL21(DE53) transformiert, welcher normalerweise für eine hohe Expression von Genen eingesetzt wird, die in Expressionsvektoren mit dem T7-Promoter kloniert sind. In diesem Stamm von E. coli wird das T7-Polymerasegen von dem Bakteriophagen &lgr; DE53 getragen, welcher in das Chromosom von BL21-Zellen integriert ist (5). Die Expression von dem Gen von Interesse wird induziert durch Zugabe von Isopropylthiogalactosid (IPTG) zu dem Wachstumsmedium gemäß einem bereits beschriebenen Verfahren (5). Über 90% der Proteine, welche unter Verwendung eines der obengenannten Plasmide exprimiert werden, werden in einer unlöslichen Form in Einschlusskörpern gefunden, woraus es möglich ist, ein lösliches und aktives Protein unter Anwendung von Rückfaltungsverfahren, die auf dem Gebiet bekannt sind (siehe beispielsweise (6)), zu erhalten. Rückfaltungsprotokolle haben oft variable Ausbeuten an katalytisch aktivem Protein und sie erfordern äußerst kontrollierte Bedingungen oder sie verursachen irreversible Modifikationen des Proteins (wie z.B. Carbamylierung in Gegenwart von Harnstoff) oder erfordern unpraktische Prozeduren, wie die Verwendung von äußerst verdünnten Proteinlösungen oder Dialyse von außerordentlich großen Probenvolumina.

Zur Vermeidung dieser Probleme wurde ein im folgenden beschriebenes Verfahren zur Produktion der HCV-Protease in einer löslichen und aktiven Form und somit unter Vermeidung von Resolubilisierungs-Protokollen entwickelt: E. coli BL21 (DE53), transformiert unter Verwendung eines der obengenannten Plasmide, wurden bei 37°C gezüchtet, bis eine Zelldichte erreicht wurde, welche eine Absorption von 0,8 OD (OD bedeutet die optische Dichte) bei 600 nm verursacht. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Temperatur in 15–20 Minuten auf 30°C abgesenkt und 400 &mgr;M IPTG wurden zugegeben, um die Expression des Proteins zu induzieren. Die Temperatur wurde dann weiter auf 22–24°C innerhalb einer Zeitspanne von 20–30 Minuten verringert. Die Kulturen wurden weitere 4 h lang bei dieser Temperatur gerührt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und unter Verwendung von PBS gewaschen.

Reinigungsverfahren

Die aus den oben beschriebenen Vorgängen resultierenden Pellets wurden 5 Minuten lang auf Eis inkubiert und in 25 mM Natriumphosphat, pH 6,5, 50% Glycerin, 0,5% CHAPS, 10 mM DTT, 1 mM EDTA (Puffer A), vorgekühlt auf 4°C, resuspendiert. 10 ml dieses Puffers wurden für jeden Liter Bakterienkultur verwendet. Nach weiteren 5–10 Minuten Inkubation auf Eis wurde die Zellsuspension mit Hilfe einer French-Presse homogenisiert. Das resultierende Homogenat wurde mit 120.000 × g zentrifugiert. Die Überstände aus dieser Zentrifugation wurden auf Eis konserviert, während die Pellets in Puffer A (1 ml auf jeden Liter Bakterienkultur) resuspendiert wurden. Nach Zugabe von 1 mM MgCl2 und DNase I wurde die Suspension 10 Minuten lang bei 20°C inkubiert und erneut 1 h lang bei 120.000 × g zentrifugiert. Der Überstand aus dieser zweiten Zentrifugation wurde mit dem ersten Überstand vereinigt und die resultierende Proteinlösung auf S-Sepharose(oder SP-Sepharose)-Harz (Pharmacia), äquilibriert mit 25 mM Natriumphosphat, pH 6,5, 10% Glycerin, 0,5% CHAPS, 3 mM DTT, 1 mM EDTA (Puffer B), adsorbiert. 10 ml Harz, suspendiert in 5 ml Puffer B, wurden für jeden Liter Bakterienkultur verwendet. Das Harz wurde 1 h lang bei 4°C gerührt, durch Filtration gewonnen, mit Puffer B gewaschen und in eine geeignete Chromatographiesäule gegossen. Die Protease wurde mit einem NaCl-Gradienten zwischen 0 und 1 M eluiert. Fraktionen, welche die Protease enthielten, wurden mittels Westernblots identifiziert, vereinigt und mittels Centriprep 10-Konzentratoren (Amicon) konzentriert, bis eine Konzentration von 6–10 mg/ml an Protein erreicht wurde, bestimmt unter Anwendung des BIORAD-Verfahrens. Bis zu 3 ml dieser Lösung wurden auf HR 26/60 Superdex 75 aufgetragen oder bis zu 20 ml wurden auf HR 60/600 Superdex 75 (beide Pharmacia), äquilibriert mit 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 10% Glycerin, 3 mM DTT, 0,5% CHAPS (Puffer C), aufgetragen und eine Chromatographie wurde mit 1 ml/Min. (HR 26/60) oder 5 ml/Min. (HR 60/600) durchgeführt. Die Fraktionen, welche die Protease enthielten, wurden vereinigt und mittels Chromatographie auf HR 5/5 Mono S (Pharmacia), äquilibriert mit Puffer C, weiter gereinigt. Die Protease wurde von dieser Säule mit einem NaCl-Gradienten zwischen 0 und 0,5 M eluiert. Eine Reinigung bis zur Homogenität war ebenfalls möglich mit der folgenden Modifikation: Nach Elution von S-Sepharose wurden die Protease enthaltenden Fraktionen 1:4 in Puffer C verdünnt und auf Heparin-Sepharose aufgetragen. Eine Elution von diesem Harz wurde mit einem NaCl-Gradienten zwischen 0 und 0,5 M erhalten. Das Protein wurde dann einer Chromatographie auf Hydroxylapatit oder Superdex 75 wie oben beschrieben unterworfen. Die Ausbeute beträgt 1–2 mg gereinigtes Protein pro Liter Bakterienkultur.

Charakterisierung des gereinigten Proteins

Das gereinigte Protein wurde mittels Gelfiltration, Umkehrphasen-HPLC, Massenspektroskopie und N-terminaler Sequenzanalyse charakterisiert.

Analytische Gelfiltrationsversuche zeigten, dass das Protein monomer ist. Das unter Verwendung von pT7-7 (NS3 1027-1026) exprimierte Protein zeigt drei Peaks nach Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie. Eine Massenspektroskopie-Analyse und Bestimmung der N-terminalen Sequenz zeigte eine Heterogenität des N-terminalen Abschnitts des Moleküls. Drei Formen wurden gefunden, mit den folgenden N-terminalen Sequenzen:

Met-Ala-Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr (Form 1)

Pro-Ile-Thr-Ala-Tyr-Ser-Gln-Gln-Thr (Form 2)

Ser-Gln-Gln-Thr (Form 3)

Zur Vermeidung dieses Problems wurden zwei experimentelle Strategien angewandt:

  • 1. Homogenisierung in Gegenwart von 100 &mgr;g/ml des Protease-Inhibitors Chymostatin. Dieser Inhibitor inhibiert nicht HCV-Protease-Aktivität, sondern inhibiert die Proteasen vom Chymotrypsin-Typ, die für aromatische Reste wie Phenylalanin und Tyrosin spezifisch sind. Auf diese Weise war es möglich, eine einzige Molekülspezies mit mehr als 95% von Form 2 aufzureinigen.
  • 2. Herstellung einer Protease, die Form 3 entspricht, mittels des Plasmids pT7-7 (NS3 1033-1206). Auf diese Weise wurde ein Protein mit mehr als 95% Form 3 aufgereinigt.

BEISPIEL 3 Verfahren zur Reproduktion der Aktivität der HCV-NS3-Protease in vitro Bestimmung der chemischen und physikalischen Bedingungen für die Reproduktion der Aktivität

Das Vermögen der gereinigten Protease zur Katalyse der Spaltung des Peptids Fmoc-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly (SEQ-ID-Nr. 7) wurde zur Bestimmung der optimalen Bedingungen für die Aktivität verwendet. Eine Spaltung wurde nachgewiesen durch Trennung des Substrats von den Hydrolyseprodukten durch Umkehrphasen-HPLC. Für diesen Zweck wurde die Mischung, welche den Puffer und das Peptid mit der Protease inkubiert enthielt, in eine Umkehrphasen-Lichrospher RP-18-Säule (Merck) eingespritzt und mit einem Acetonitril-Gradienten, enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure, eluiert. Die Spaltprodukte wurden durch Coinjektion geeigneter Standards und durch Massenspektrometrie identifiziert. Für diese Experimente wurden Proteine verwendet, die nach einem der in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Verfahren hergestellt worden waren.

Die Abhängigkeit der Aktivität von der Glycerinkonzentration wurde in einem Puffer bestimmt, der 50 mM Tris, pH 7,5, 2% CHAPS, 30 mM DTT, enthielt. Zunehmende Konzentrationen an Glycerin wurden diesem Puffer zugegeben und die relative Proteaseaktivität wurde bestimmt. 3 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments und zeigt an, dass 50% (Vol./Vol.) Glycerin das optimale Niveau ist. In einem nachfolgenden Experiment wurde diese Konzentration konstant bei 50% gehalten und die Konzentration an CHAPS wurde variiert (4). Ein Niveau von 2% CHAPS (Gew./Vol.) wurde auf diese Weise befunden, die optimale Konzentration zu sein. Es war möglich, CHAPS durch andere Detergenzien zu ersetzen, welche mit dem Erfordernis, die katalytische Aktivität in den erfindungsgemäßen Polypeptiden aufrechtzuerhalten, vereinbar waren. Einige dieser Detergenzien sind: Heptyl-&bgr;-D-glucopyranosid, Decyl-&bgr;-D-glucopyranosid, Decyl-&bgr;-D-glucomaltosid, Nonyl-&bgr;-D-glucopyranosid, N-Hexyl-&bgr;-D-glucopyranosid, Octyl-&bgr;-D-glucopyranosid, Octyl-&bgr;-D-thioglucopyranosid, Nonidet P-40, Tween-20.

Bei optimalen CHAPS- und Glycerin-Konzentrationen zeigt die Protease eine optimale Aktivität bei pH 8,5 (5). Bei diesem pH-Wert ist die Stabilität über die Zeit jedoch niedriger als die bei pH 7,5 beobachtete. Zur Bestimmung der Wirkung der Ionenstärke auf die Aktivität wurde eine Titration unter Verwendung von NaCl durchgeführt. Dieses Experiment zeigte, dass die Proteaseaktivität bei einer hohen Ionenstärke inhibiert wird (9). Eine kinetische Analyse der Daten zeigte, dass Chloridionen kompetitive Inhibitoren bei Konzentrationen bis zu 100 mM sind.

Es war somit möglich, die folgenden optimalen Bedingungen für einen in vitro-Assay von gereinigter HCV-Protease-Aktivität zu bestimmen: 50 mM Tris, pH 7,5, 3–30 mM DTT, 2% CHAPS, 50% Glycerin. Die Abhängigkeit der Aktivität von der Temperatur wurde mittels eines Arrhenius-Plots analysiert, bei dem der Logarithmus der kinetischen Konstante Kcat als inverse Funktion der Temperatur angegeben ist. Dieser Graph zeigt eine Diskontinuität bei Temperaturen oberhalb von 25°C, was Veränderungen in der Konformation parallel zur Abnahme der Aktivität anzeigt. Die optimale Temperatur wurde somit als etwa 22–23°C bestimmt.

Wie oben erwähnt, ist das Protein NS4A ein Cofaktor der HCV-Protease. N- und C-terminale Deletionsexperimente definierten das Peptid Pep4A mit der in SEQ-ID-Nr. 6 angegebenen Sequenz als die minimale Domäne, die immer noch zur Induktion einer optimalen Aktivierung in der Lage ist. Bei Transfektions- oder in vitro-Translationsexperimenten ist die Zugabe von Polypeptiden, welche die minimale NS4A-Sequenz enthalten, essentiell, um eine effektive Spaltung zu ergeben. Die Zugabe von Pep4A ist in der Lage, eine signifikante Erhöhung der Aktivität von gereinigter Protease unter den oben beschriebenen Assaybedingungen zu induzieren. Die kinetischen Eigenschaften dieser Aktivität werden im folgenden beschrieben. Mit einem Titrationsexperiment wurde eine Stöchiometrie von 1:1 für diese Wechselwirkung bei einer Konzentration von 300 nM Protease bestimmt, was einen Kd-Wert < 300 nM anzeigt.

Bestimmung des optimalen Substrats für den Aktivitäts-Assay

Zur Bestimmung des minimalen Substrats, dessen Spaltung immer noch mit Hilfe des oben beschriebenen HPLC-Verfahrens nachgewiesen werden kann, wurden Derivate des oben beschriebenen Peptids Fmoc-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly (SEQ-ID-Nr. 7) mit N- und/oder C-terminalen Deletionen synthetisiert. Diese Peptide wurden unter den Bedingungen, die im vorhergehenden Kapitel definiert wurden, in Gegenwart von 100 nM–1,6 &mgr;M Protease inkubiert. Die Nomenklatur für die Aminosäurereste der als Substrate eingesetzten Peptide, welche im folgenden verwendet wird, ist die von Schechter und Berger in (7) angegebene. Die Reste sind definiert als Pn ... P3, P2, P1, P1', P2', P3' ... Pn', wobei die hydrolysierte Bindung P1–P1' (Bindung zwischen Cys und Ala) ist. Tabelle 1 zeigt die kinetischen Daten für dieses Experiment, welche P6 und P3' oder P4' als die äußersten Grenzen eines Substrats definieren, welches immer noch effektiv gespalten wird. Deletionen jenseits P6 oder P3' verursachen eine drastische Abnahme der Wirksamkeit, gemessen als kcat/Km, mit der das jeweilige Peptid immer noch als Substrat wirken kann. Eine Deletion von P4' verursacht eine weniger ausgeprägte Abnahme von kcat/Km, jedoch ist die Trennung von Substrat und Spaltprodukt mittels HPLC für ein Decapeptid P6–P4' signifikant besser als für ein Nonapeptid P6–P3', so dass das Decapeptid P6–P4' als das optimale Substrat bestimmt wurde.

Tabelle 1: Charakterisierung von Substraten

Die kinetischen Parameter Km, kcat und kcat/Km wurden für die Decapeptide P6–P4', entsprechend den anderen beiden intermolekularen Spaltstellen NS4B/5A und NS5A/5B, bestimmt und diese Daten wurden mit den Daten verglichen, welche unter Verwendung des Peptids P6–P4', entsprechend der Stelle NS4A/4B, erhalten wurden (Tabelle 2). Diese Kinetiken wurden sowohl in Abwesenheit als auch in Anwesenheit von stöchiometrischen Konzentrationen an Pep4A erhalten. Eine Analyse der auf diese Weise erhaltenen kinetischen Daten weist darauf hin, dass Pep4A überwiegend kcat beeinflusst. Wenn die Km-Werte für die einzelnen Substrate verglichen werden, wird ersichtlich, dass die Anwesenheit von zwei negativen Ladungen in P5 und P6 die Bindungswirksamkeit eines Peptidsubstrats bestimmte. In der Tat haben Decapeptide, welche den Stellen NS4A/4B und NS5A/5B mit Asp- oder Glu-Resten in Position P6 und P5 entsprechen, ähnliche Km-Werte und signifikant niedriger als das Peptid, welches der Stelle NS4B/5A mit einer einzigen Ladung in Position P6 entspricht.

Tabelle 2: Aktivität gegenüber Peptiden, die Spaltstellen in trans entsprechen

Eine weitere Untersuchung wurde hinsichtlich der relativen Bedeutung einzelner Reste innerhalb der Sequenz P6–P4', entsprechend der Spaltstelle NS4A/4B, durchgeführt, indem jede Aminosäure einzeln zu Alanin mutiert wurde und dann die kinetischen Parameter für die auf diese Weise erhaltenen Mutantenpeptide bestimmt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 beschrieben. Dieses Experiment identifiziert die folgende Bedeutungsskala einzelner Reste für eine effektive Spaltung: P1>>P3=P5=P6>P2=P4. Eine Modifizierung des P'-Teils hat keine signifikante Wirkung auf die Spaltgeschwindigkeit. Diese Information wurde dazu verwendet, um Proteaseaktivitäts-Assayverfahren zu entwickeln, welche für die Identifizierung von Inhibitoren von Nutzen sind. Diese Verfahren werden im folgenden beschrieben werden.

Tabelle 3: Ersatz der Reste P6–P4' des Peptidsubstrats durch Alanin

Für eine detailliertere Bestimmung der Bedeutung der Reste in P6 und P1' wurde eine Reihe von Peptiden P6–P4' synthetisiert, bei denen Modifizierungen an diesen Positionen eingeführt wurden. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 4 beschrieben. Die Ergebnisse dieser Experimente unterstreichen die Bedeutung einer negativen Ladung in Position P6. In der Tat werden Asp oder Glu in dieser Position mit einem nicht unterscheidbaren Km-Wert akzeptiert. Eine Neutralisierung der Ladung durch Einführung von Asn verursacht eine signifikante Erhöhung von Km, wohingegen eine Umkehrung der Ladung durch Einführung eines Lys-Rests eine extrem ausgeprägte Zunahme von Km verursacht.

Tabelle 4: Ersatz der Reste P6 und P1' in dem Peptidsubstrat

Die Substitution von Ala in Position P1' durch Ser hat keine signifikante Auswirkung, wohingegen eine Substitution durch Phe eine Verringerung der Spaltungsgeschwindigkeit des resultierenden Substrats, gemessen als kcat/Km, verursacht.

Eine Analyse wurde mit einer Reihe von Mutationen der Position P1 durchgeführt, beschrieben in Tabelle 5. Eine Substitution von Cystein in dieser Position durch Threonin, Alylglycin, &agr;-Aminobuttersäure, Norvalin und Valin werden akzeptiert, obwohl die resultierenden Substrate mit einer Effizienz, ausgedrückt als kcat/Km, gespalten werden, welche signifikant niedriger liegt als die des unmodifizierten Substrats.

Tabelle 5: Substitution des Peptidsubstrat-Rests P1
Alg, Alylglycin; Abu, &agr;-Aminobuttersäure; Nva, Norvalin

Die Information bezüglich der Substratspezifität kann sowohl zur Entwicklung von Enzym-Assays als auch zur Synthese von Inhibitoren, die auf modifizierten Substratsequenzen basieren, verwendet werden. Beispielsweise sind Substratpeptide mit modifizierten P1-Resten kompetitive Inhibitoren von Protease mit Inhibierungskonstanten Ki von zwischen 350 und 90 &mgr;M (Tabelle 6). Diese Peptide können durch Einführung von Aldehyd-, Trifluormethylketon-, Difluormethylenketon-, Diketon-, Ketoester-, Ketoamid- oder &agr;-Ketoheterocyclen-, Boronsäure- und Monohalogenmethylketon-Gruppen weiter modifiziert werden, um ihr Inhibierungsvermögen zu erhöhen. Die Information bezüglich der Spezifität kann auch eine Synthese von Inhibitoren erlauben, welche nicht auf Peptiden basieren, wie z.B. Halogen-Enolactone, Isocumarine, &bgr;-Lactame, Succinimide, Pyrone, Bezoxyazinone, Bezoisothiazoline oder latente Isocyanate.

Tabelle 6: Inhibierungswirkung von Decapeptiden P6–P4', die an Position P1 modifiziert sind
Abu, &agr;-Aminobuttersäure; Alg, Alylglycin; Cha, Cyclohexylalanin.

BEISPIEL 4 Verfahren zum Einsatz der in vitro-Proteaseaktivität bei der Suche nach Inhibitoren Automatisierter Assay unter Verwendung eines Amid-Substrats

Das Peptid Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Lys-&egr;-(3H)Ac, (SEQ-ID-Nr. 47), abgeleitet von der Spaltstelle NS4A/NS4B, wird von der NS3-Protease mit den folgenden kinetischen Parametern gespalten: Km = 79 &mgr;M, kcat = 0,49 Min.–1 und kcat/Km = 103 M–1s–1. 400.000 CpM des markierten Peptids mit einer spezifischen Aktivität von 2–10 Ci/mmol wurden 3 h lang bei 23°C zusammen mit 40 &mgr;M (Km/2) unmarkiertem Peptid in Gegenwart von 200 nM Protease und 1 &mgr;M Pep4A in 50 mM Tris, pH 7,5, 50% Glycerin, 3% CHAPS, 10 mM DTT inkubiert. Während dieses Zeitraums wurden 20% des Peptidsubstrats gespalten. Das Spaltprodukt kann unter Befolgung des unten beschriebenen und in 7 zusammengefassten Verfahrens quantitativ bestimmt werden. Wie aus der Figur ersichtlich, wird die Mischung in Kontakt mit einem TSK-DEAE-Anionenaustauscher gebracht. Die Fraktion, welche aus dem Anionenaustauscher kommt, wird filtriert und sedimentieren gelassen oder zentrifugiert. Die Radioaktivität wird mit der klaren Fraktion gemessen, deren Menge ausschließlich in Beziehung zu dem rechten Fragment (C-terminalen Fragment) steht, vorausgesetzt, dass das Amidsubstrat und das linke Fragment an den Anionenaustauscher gebunden bleiben. Die Zugabe von Inhibitoren verursacht eine Abnahme der Freisetzungsrate des markierten gespaltenen Fragments. Je effektiver der Inhibitor ist, desto niedriger wird die Radioaktivität sein, die in der Fraktion gemessen wird, welche aus dem Anionenaustauscher austritt.

BEISPIEL 5 Synthese des Depsipeptid-Substrats S1: Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Abu-&psgr;(COO)-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Lys(N&egr;-Ac)-NH2 (SEQ-ID-Nr. 42)

Die Synthese wurde vollständig in fester Phase durchgeführt unter Anwendung des Fmoc-Polyamid-Verfahrens mit kontinuierlichem Fluss (9). Die Schutzgruppenkombination war: basenlabiles N&agr;-Fmoc für die &agr;-Aminogruppe und säurelabiler Schutz für die Seitenketten: Asp(Ot-Bu), Glu(Ot-Bu), Tyr(t-Bu) und His(trt). Das verwendete Polymer war ein Verbund von Kieselgur-Polyamid (9), derivatisiert mit einem modifizierten Rink-Amid-Linker (10), p-[(R,S)-a-[1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxyformamido]-2,4-dimethoxybenzyl]phenoxyessigsäure (11) (NovaSyn® KR 125, 0,1 mmol/g). Das Harz, Aminosäure-Derivate, Aktivierungsmittel und alle anderen Reagenzien waren vom höchsten erhältlichen Reinheitsgrad aus kommerziellen Quellen. Die Synthese wurde nach dem in 8 angegebenen Schema durchgeführt. Kopplungen wurden mit einem fünffachen Überschuss an aktivierter Aminosäure gegenüber den freien Aminogruppen des Harzes durchgeführt, unter Einsatz von Fmoc-Aminosäure/PyBOP/HOBt/DIEA(1:1:1:2)-Aktivierung, außer für L-(+)-Milchsäure, bei der Fmoc-Aminosäure/DIPC/HOBt(1:1:1:1)-Aktivierung eingesetzt wurde. Die Veresterung von Abu mit der freien Hydroxylgruppe von Milchsäure erfolgte unter Verwendung des symmetrischen Anhydrids (Fmoc-Abu)2O in Gegenwart einer katalytischen Menge (0,1 Äquivalente) DMAP für 30 Minuten bei Raumtemperatur (12): die Reaktion wurde zweimal wiederholt, um 90% Ausbeute zu erzielen; in Abwesenheit von Katalysator reagieren die verbleibenden freien Hydroxylgruppen nicht in nachfolgenden Syntheseschritten. Am Ende der Assemblierung wurde das Harz mit DMF, Methanol und CH2Cl2 gewaschen, dann 16 h lang im Vakuum getrocknet. Das trockene Peptid-Harz wurde mit TFA/Wasser/Triisopropylsilan (92,5:5:2,5) 1,5 h lang bei Raumtemperatur behandelt; das Harz wurde ausfiltriert und das Peptid mit kalten Methyl-t-Butylether präzipitiert; das Präzipitat wurde erneut in 50% Wasser/Acetonitril mit 0,1% TFA gelöst und lyophilisiert.

Eine Reinigung auf > 98% Homogenität wurde durch präparative HPLC auf einer Nucleosyl C-18-Säule (250 × 21 mm, 7 &mgr;M) erzielt, wobei als Elutionsmittel (A) Wasser und (B) Acetonitril mit 0,1% TFA und ein Stufengradient von 22% B über 5 Minuten, dann 22–27% B über 25 Minuten, mit einer Durchflussrate von 12 ml/Min. verwendet wurde. Unter diesen Bedingungen eluiert das Peptid bei 21, 9 Minuten. Die Fraktionen, welche das reine Material enthalten, wurden vereinigt und lyophilisiert: Ausbeute 35%.

BEISPIEL 6 Chemische Synthese des Depsipeptid-Substrats S2: Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Thr-&psgr;[COO]-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Lys(N&egr;-Ac)-NH2 (SEQ-ID-Nr. 43)

Die Synthese wurde durchgeführt wie im vorherigen Beispiel beschrieben. Die Veresterung von Thr mit Milchsäure erforderte drei Wiederholungen, um eine 70%ige Ausbeute zu erhalten, welche auch von 3% Racemisierung des Thr-Rests begleitet war. Das D-Thr-Diastereoisomer wurde jedoch chromatographisch gut von dem L-Isomer abgetrennt und leicht mittels präparativer HPLC abgetrennt. Der verwendete Gradient war 21% B über 5 Minuten, dann 21–22% B über 20 Minuten, wobei das gewünschte Peptid nach 19,7 Minuten eluierte: Ausbeute 24%.

BEISPIEL 7 Synthese des radioaktiven Depsipeptid-Substrats S1: Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Abu-&psgr;[COO]-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Lys(N&egr;-[3H]-CH3CO)-NH2 (SEQ-ID-Nr. 44)

Zur selektiven Markierung des Peptids S1 an der N&egr;-Aminogruppe des C-terminalen Lysins wurde der geschützte Vorläufer Ac-Asp(Ot-Bu)-Glu(Ot-Bu)-Met-Glu(Ot-Bu)-Glu(Ot-Bu)-Abu-&psgr;[COO]-Ala-Ser(t-Bu)-His(Trt)-Leu-Pro-Tyr(t-Bu)-Lys-CONH2 auf dem Harz gemäß dem Schema von 10 zusammengesetzt. Die einzige Variation bezüglich der Synthese von (N&egr;-Ac)-S1 war die Verwendung von Fmoc-Lys(Alloc)-OH anstelle von Fmoc-Lys(N&egr;-Ac)-OH. Der Alloc-Schutz ist orthogonal bezüglich Schutzgruppen auf Fmoc- und t-Bu-Basis, und wird mit einer zweistündigen Behandlung mit (0) PdP[(Ph3)4] in einer Lösung von CHCl3, enthaltend 5% Essigsäure und 2,5% N-Methylmorpholin, entfernt.

Das trockene Peptid-Harz (0,07 mmol/g, 60 mg) wurde mit [3H]-Essigsäureanhydrid (25 mCi, 5,7 mCi/mmol) 16 h lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Ein 10facher Überschuss des nicht-radioaktiven Essigsäureanhydrids wurde dann zum Abschluss der Reaktion verwendet. Das Harz wurde dann mit DMF gewaschen und wie zuvor beschrieben behandelt. Nach präparativer HPLC wurde > 98% reines Peptid Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Abu-&psgr;[COO]-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Lys(N&egr;-[3H]-CH3CO)-NH2 mit einer spezifischen Aktivität von 0,68 mCi/mmol erhalten.

Unter Verwendung des Assays auf HPLC-Basis wurden die folgenden kinetischen Parameter für das radioaktive Depsipeptid-Substrat S1 (SEQ-ID-Nr. 44) erhalten:

Kcat (Min.–1) = 9

Km (&mgr;M) = 11

Kcat/Km (M–1s–1) = 13.636

Unter Verwendung desselben Assays sind die kinetischen Parameter für das radioaktive Substrat S2

Kcat (Min.–1) = 16

Km (&mgr;M) = 96

Kcat/Km (M–1s–1) = 2.780.

Eine Synthese der radioaktiven Depsipeptid-Substrate erlaubt die Entwicklung eines Assays mit hohem Durchsatz für die Bestimmung der NS3-Proteaseaktivität wie in 11 schematisch dargestellt. Das Prinzip ist das folgende: Sowohl das intakte Substrat als auch das N-terminale Fragment, das sich aus der Enzymspaltung ergibt (Ac-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Abu-OH), sind extrem sauer, wohingegen das C-terminale Fragment [HO-CH(CH3)CO-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Lys(N&egr;-[3H]-CH3CO)-NH2] gemäß pH-Wert neutral oder basisch ist. Es ist deshalb möglich, die beiden sauren Spezies auf einer Anionenaustauschersäule festzuhalten, während das C-terminale Fragment in Lösung belassen wird. Falls das C-terminale Fragment einen radioaktiven Marker enthält (in diesem Fall das tritiierte Acetat, das kovalent an die &egr;-Aminogruppe des C-terminalen Lysins gebunden ist), wird das Harz in der Lage sein, prozessiertes Substrat von unprozessiertem Substrat zu unterscheiden, und ermöglicht es somit, eine proteolytische Aktivität durch Messung der in Lösung verbleibenden Menge an Radioaktivität nach Inkubation mit dem Enzym und Behandlung mit dem Ionenaustauscher quantitativ zu bestimmen. Das Gesamtverfahren ist im wesentlichen dasselbe, welches in dem Assay mit hohem Durchsatz angewandt wird, basierend auf dem Amid-Substrat von Beispiel 4, jedoch beträgt der angewandte pH-Wert in diesem Fall 7,0 anstatt 7,5, um eine spontane Hydrolyse der Esterbindung zu minimieren (0,6%/h bei 23°C).

BEISPIEL 8 Synthese der Depsipeptid-Substrate S3 und S4: Ac-Asp-Glu-Asp-(EDANS)-Glu-Glu-Abu-&psgr;[COO]-Ala-Ser-Lys-(DABCYL)-NH2 (SEQ-ID-Nr. 45) und Ac-Asp-Asp-(EDANS)-Met-Glu-Glu-Abu-&psgr;[COO]-Ala-Ser-Lys(DABCYL)-NH2 (SEQ-ID-Nr. 46)

Die chemische Formel der beiden Substrate S3 und S4 ist in 12 gezeigt.

Die Synthese wurde in fester Phase durchgeführt wie im Schema von 13 für S3 (SEQ-ID-Nr. 45) detailliert angegeben, wobei die beiden speziellen Derivate Fmoc-Asp-(EDANS)-OH und Fmoc-Lys-(DABCYL)-OH, hergestellt nach bekannten Verfahren (16–17), verwendet wurden. Alle Kopplungen, einschließlich Asp-(EDANS) und Lys-(DABCYL), wurden mit einem fünffachen Überschuss von aktivierter Aminosäure gegenüber den freien Aminogruppen des Harzes durchgeführt, unter Einsatz von Fmoc-Aminosäure/PyBOP/HOBt/DIEA(1:1:1:2)-Aktivierung, außer für L-(+)-Milchsäure, bei der Fmoc-Aminosäure/DIPC/HOBt(1:1:1:1)-Aktivierung eingesetzt wurde. Die Veresterung von Abu mit der freien Hydroxylgruppe von Milchsäure erfolgte unter Verwendung des symmetrischen Anhydrids (Fmoc-Abu)2O in Gegenwart einer katalytischen Menge (0–1 Äquivalente) DMAP für 30 Minuten bei Raumtemperatur (12): die Reaktion wurde zweimal wiederholt, um 92% Ausbeute zu erzielen. Am Ende der Assemblierung wurde das Peptid-Harz gewaschen und das Peptid wie für das Substrat S1 beschrieben gespalten.

Eine Reinigung auf > 98% Homogenität wurde durch präparative HPLC auf einer Nucleosyl C-18-Säule (250 × 21 mm, 7 &mgr;m) erzielt, wobei als Elutionsmittel (A) 50 mM Ammoniumacetat, pH 6, und (B) Acetonitril verwendet wurde. Der für sowohl S3 als auch S4 verwendete Gradient war 20% B über 5 Minuten, dann 20–40% B über 20 Minuten, Flussrate 20 ml/Min.; die Fraktionen, welche das reine Material enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert: Ausbeute 45% und 35% für S3 bzw. S4. Die kinetischen Parameter für dieses Substrat, mit dem HPLC-basierten Assay beurteilt (siehe 14A), waren die folgenden:

Kcat (Min.–1) = 3,51

Km (&mgr;M) = 10,95

Kcat/Km (M–1s–1) = 5.342.

Der für diesen Assay verwendete Puffer ist der folgende: 33 mM DTT, 50 mM Tris, pH 7, 50% Glycerin, 2% CHAPS. Die Inkubation wird bei pH 7,0 durchgeführt, um eine spontane Hydrolyse der Esterbindung zu minimieren. Der Assay kann in einer Küvette oder in einer (96-Mulden-)Mikrotiterplatte durchgeführt werden, wobei die Fluoreszenz als Funktion der Zeit überwacht wird (Anregungswellenlänge 355 nm, Emissionswellenlänge 495 nm). Die Erhöhung der Fluoreszenz nach Substratspaltung ist 13fach. Die Reaktion ist linear, wie in 14B gezeigt (festgelegte Substratkonzentration = 2 &mgr;M). Die Nachweisgrenze wurde als 1 nM für den Hochdurchsatz-Mikroplatten-Assay und 520 pM für den Assay auf HPLC-Basis etabliert. Wenn ein kontinuierlicher (Küvetten)-Assay durchgeführt wird, um Anfangsgeschwindigkeiten für die enzymatische Reaktion zu etablieren, ist die untere Grenze für die Enzymkonzentration 80 nM, aufgrund von Fluoreszenz-Quenchung des gespaltenen Substrats bei höheren Substratkonzentrationen als 10 &mgr;M.

HINTERLEGUNGEN

Stämme von E. coli DH1 – transformiert unter Verwendung der Plasmide pBac (1039-1226), pT7-7 (1039-1226), pT7-7 (1039-1206), pT7-7 (1027-1206) und pT7-7 (1033-1206), kodierend für die Polypeptide mit der Aminosäuresequenz SEQ-ID-Nr. 1, SEQ-ID-Nr. 2, SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 4 bzw. SEQ-ID-Nr. 5 – wurden am 14. August 1995 bei der National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), Aberdeen, Schottland, U.K., mit den Hinterlegungsnummern NCIMB 40761, NCIMB 40762, NCIMB 40763, NCIMB 40764 und NCIMB 40765 hinterlegt.

REFERENZEN
  • 1. Chambers, T. J., et al., 1990, Evidence that the N-terminal domain of non structural protein NS3 from yellow fever virus is serine protease responsible for site specific cleavages in the viral polyprotein, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8898–8902.
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IM TEXT VERWENDETE ABKÜRZUNGEN UND SYMBOLE
  • Abu
    = 2-Aminobuttersäure;
    CHAPS
    = 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonium]-1-propansulfonat;
    DABCYL
    = 4-[[4'-(Dimethylaminophenyl]aza]benzoesäure;
    Depsipeptid
    = ein Peptid, bei dem mindestens eine Peptidbindung durch die entsprechende Esterbindung ersetzt ist (wobei die Lage(n) der Esterbindung(en) innerhalb des Moleküls gewöhnlich als &psgr;[COO] – zwischen den beteiligten Aminosäureresten angezeigt ist/sind);
    DIEA
    = N,N-Diisopropylethylamin;
    DIPC
    = N,N'-Diisopropylcarbodiimid;
    DMAP
    = 4-Dimethylaminopyridin;
    DMF
    = N,N-Dimethylformamid;
    DTT
    = Dithiothreit;
    EDANS
    = 5-[(2'-Aminoethyl)amino]naphthalinsulfonsäure;
    EDTA
    = Ethylendiaminotetraessigsäure;
    HOBt
    = N-Hydroxybenzotriazol;
    HPLC
    = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie;
    PyBOP
    = Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat;
    RET
    = Resonanzenergietransfer;
    t-Bu
    = Tertiärbutyl;
    TFA
    = Trifluoressigsäure;
    Trt (Trityl)
    = Triphenylmethyl
SEQUENZVERZEICHNIS

Anspruch[de]
  1. Peptid Fmoc-Tyr-Gln-Glu-Phe-Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu-Gln-Gly und dessen Derivate durch N-terminale Deletion und/oder C-terminale Deletion und/oder Mutation, enthaltend eine Spaltstelle, die von Hepatitis C-Virus(HCV)-NS3-Serinprotease erkannt wird, und umfassend Aminosäurereste an mindestens den Positionen -P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-, wobei die Bindung zwischen dem Cys-Rest in P1 und dem Ala-Rest in P1' die Spaltstelle der Protease ist und wobei

    Asp in der Position P6 durch Asn, Glu oder Ala ersetzt sein kann,

    Glu in der Position P5, Met in der Position P4, Glu in der Position P3, Glu in der Position P2 jeweils durch Ala ersetzt sein können,

    Cys in der Position P1 durch Thr, &agr;-Aminobuttersäure, Alylglycin, Val oder Norvalin ersetzt sein kann,

    Ala in der Position P1' durch Ser oder Phe ersetzt sein kann,

    Ser in der Position P2' durch Ala ersetzt sein kann,

    His in der Position P3' durch Ala ersetzt sein kann,

    vorausgesetzt, dass das Derivat nicht die Aminosäuresequenz Asp-Glu-Met-Glu-Glu-Cys-Ala-Ser-His-Leu-Pro-Tyr-Ile-Glu ist.
  2. Peptid nach Anspruch 1, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus SEQ-ID-Nr. 8–11, 14, 18–20, 23–27, 29–33, 35–41 und 47 ausgewählt ist.
  3. Peptid Ac-Asp-Cys-Ser-Thr-Pro-Cys-Ser-Gly-Ser-Val (SEQ-ID Nr. 21) mit Resten, die entlang der Positionen P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4' angeordnet sind, enthaltend eine Spaltstelle, die von Hepatitis C-Virus(HCV)-NS3-Serinprotease erkannt wird, wobei die Bindung zwischen dem Cys-Rest in P1 und dem Ser-Rest in P1' die Spaltstelle der Protease ist.
  4. Peptid Ac-Glu-Asp-Val-Val-Cys-Cys-Ser-Met-Ser-Tyr (SEQ-ID Nr. 22) mit Resten, die entlang der Positionen P6-P5-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4' angeordnet sind, enthaltend eine Spaltstelle, die von Hepatitis C-Virus(HCV)-NS3-Serinprotease erkannt wird, wobei die Bindung zwischen dem Cys-Rest in P1 und dem Ser-Rest in P1' die Spaltstelle der Protease ist.
  5. Derivat der Polypeptide nach den Ansprüchen 1 bis 4, welches ein Depsipeptid ist, enthaltend eine Spaltstelle, die von Hepatitis C-Virus(HCV)-NS3-Serinprotease erkannt wird, und umfassend eine Esterbindung zwischen den Positionen P1 und P1'.
  6. Depsipeptid nach Anspruch 5 mit einer Aminosäuresequenz, die aus SEQ-ID-Nr. 42, 43, 44 ausgewählt ist.
  7. Peptid und Peptid-Derivat nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welches mit einem Markierung versehen ist, die ein nachweisbares radioaktives, kolorimetrisches oder fluorimetrisches Signal ergibt.
  8. Peptid und Peptid-Derivat nach Anspruch 7, welches ein Depsipeptid ist, wobei das fluorimetrische Signal durch internes fluorogenes Quenchen mittels Resonanzenergietransfer zwischen einem Fluoreszenzdonor, 5-[(2'-Aminoethyl)amino]naphtalinsulfonsäure (EDANS), in der Nähe eines Endes des Depsipeptids und einer Akzeptorgruppe, 4-[[4'-(Dimethylamino)phenyl]azo]benzoesäure (DABCYL), in der Nähe des anderen Endes des Depsipeptids verursacht wird.
  9. Depsipeptid nach Anspruch 8 mit einer aus SEQ-ID-Nr. 45 und 46 ausgewählten Sequenz.
  10. Verfahren zum Nachweis der proteolytischen Aktivität von Polypeptiden mit HCV-NS3-Protease-Aktivität in vitro, umfassend das Kontaktieren des Polypeptids mit einem Substrat, das nachweisbare Spaltprodukte ergibt, wobei das Substrat ein Peptid oder Peptid-Derivat nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 ist, und Überprüfen der gespaltenen Fragmente.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Substrat ein Peptid oder Peptid-Derivat nach den Ansprüchen 1 bis 4 ist und das Verfahren ein Assay mit hohem Durchsatz bei NS3-Protease-Konzentrationen von zwischen 100 und 200 nM ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Substrat ein Depsipeptid nach den Ansprüchen 5 bis 9 ist und das Verfahren ein Assay mit hohem Durchsatz bei NS3-Protease-Konzentrationen von 0,5 bis 2 nM ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, ferner umfassend das kontinuierliche Überprüfen der proteolytischen Aktivität von HCV-NS3-Protease mit dem Depsipeptid nach Anspruch 8.
  14. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 10 bis 13, ferner umfassend das Kontaktieren der HCV-NS3-Protease mit einem Cofaktor, welcher das Peptid mit der Sequenz Gly-Ser-Val-Val-Ile-Val-Gly-Arg-Ile-Ile-Leu-Ser-Gly-Arg (SEQ-ID-Nr. 6) ist.
Es folgen 13 Blatt Zeichnungen






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