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Dokumentenidentifikation DE69831248T2 13.04.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001011710
Titel VERFAHREN UND ZUSAMMENSETZUNGEN ZUR OPTIMIERUNG DES SAUERSTOFFTRANSPORTES IN ZELLFREIEN SYSTEMEN
Anmelder The Regents of the University of California, Oakland, Calif., US
Erfinder WINSLOW, M., Robert, La Jolla, US;
INTAGLIETTA, Marcos, La Jolla, US
Vertreter Glawe, Delfs, Moll, Patentanwälte, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69831248
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 27.02.1998
EP-Aktenzeichen 989114285
WO-Anmeldetag 27.02.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/US98/03846
WO-Veröffentlichungsnummer 0098037909
WO-Veröffentlichungsdatum 03.09.1998
EP-Offenlegungsdatum 28.06.2000
EP date of grant 17.08.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.04.2006
IPC-Hauptklasse A61K 38/16(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 35/14(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 38/42(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 47/36(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 47/48(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter dem vom National Institutes of Health (NIH) verliehenen Vertrag P01 HL48018 gemacht. Die Regierung der Vereinigten Staaten von Amerika hat bestimmte Rechte an dieser Erfindung.

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert und betrifft allgemein Blutprodukte und insbesondere Zusammensetzungen, die Mischungen sauerstofftragender und nicht-sauerstofftragender Plasmaexpander enthalten, und deren Verwendung. Verfahren sind nicht Teil der Ansprüche.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG A. Der Blutkreislauf und die Beschaffenheit von Hämoglobin

Mit dem Blut werden den Geweben Nährstoffe zugeführt und Abfallprodukte zur Ausscheidung aus den Geweben entfernt. Das Blut besteht aus Plasma, in dem rote Blutkörperchen (Erythrozyten), weiße Blutkörperchen (Leukozyten) und Blutplättchen (Thrombozyten) suspendiert sind. Etwa 99% der im Blut vorhandenen Zellen sind rote Blutkörperchen, deren Hauptfunktion der Transport von Sauerstoff zu den Geweben und das Entfernen von Kohlendioxid aus diesen ist.

Die linke Kammer des Herzens pumpt das Blut durch die Arterien und die kleineren Arteriolen des Blutkreislaufs. Das Blut tritt dann in die Kapillaren ein, wo der größte Teil des Austauschs von Nährstoffen und zellulären Abfallprodukten vonstatten geht (siehe z.B. A. C. Guyton, Human Physiology And Mechanisms Of Disease (3. Aufl.; W. B. Saunders Co., Philadelphia, PA), S. 228–229 [1982]). Anschließend strömt das Blut über die Venulen und Venen zurück in den rechten Vorhof des Herzens. Obwohl das zum Herzen zurückströmende Blut verglichen mit dem aus dem Herzen gepumpten Blut sauerstoffarm ist, weist das zurückströmende Blut beim ruhenden Menschen immer noch ca. 75% des ursprünglichen Sauerstoffgehalts auf.

Die reversible Oxygenationsfunktion (d.h. die Versorgung mit Sauerstoff und der Abtransport von Kohlendioxid) der roten Blutkörperchen wird von dem Protein Hämoglobin wahrgenommen. In Säugetieren hat Hämoglobin ein Molekulargewicht von ungefähr 68.000 und besteht zu etwa 6% aus Häm und zu 94% aus Globin. In seiner nativen Form enthält es zwei Paare von Untereinheiten (d.h. es ist ein Tetramer), die jeweils eine Hämgruppe und eine Globinpolypeptidkette umfassen. In wässriger Lösung liegt Hämoglobin in einem Gleichgewicht zwischen den tetrameren (MG 68.000) und dimeren Formen (MG 34.000) vor; außerhalb der roten Blutkörperchen. Die Dimere werden vorzeitig über die Nieren ausgeschieden (Plasma-Halbwertszeit ungefähr zwei bis vier Stunden). Neben dem Hämoglobin enthalten die roten Blutkörperchen Stroma (die Membran der roten Blutkörperchen), die aus Proteinen, Cholesterin und Phospholipiden besteht.

B. Exogene Blutprodukte

Aufgrund des Bedarfs an Blutprodukten in Krankenhäusern und anderweitig gab und gibt es umfangreiche Forschungsanstrengungen zur Entwicklung von Blutersatzstoffen und Plasmaexpandern. Blutersatzstoffe sind Blutprodukte, die dazu in der Lage sind, Sauerstoff aufzunehmen und es zu den Geweben zu transportieren. Blutersatzstoffe haben eine Reihe von Anwendungen einschließlich des Ersetzens von während chirurgischer Operationen und bei akuten Blutungen verlorenem Blut sowie bei Wiederbelebungsbemühungen nach traumatischen Verletzungen. Bei den Plasmaexpandern handelt es sich um Blutprodukte, die in das Gefäßsystem verabreicht werden, jedoch typischerweise nicht dazu fähig sind, Sauerstoff aufzunehmen. Plasmaexpander können beispielsweise verwendet werden, um bei Verbrennungen verlorengegangenes Plasma zu ersetzen, auf zu geringes Blutvolumen zurückzuführenden Schock zu behandeln und Blut zu verdünnen (z.B. um Normovolämie aufrechtzuerhalten und die Viskosität des Blutes zu reduzieren). Blutprodukte können im wesentlichen für diese Zwecke oder für alle Zwecke, bei denen man gegenwärtig den Patienten Blutkonserven verabreicht, eingesetzt werden (siehe z.B. die US-Patentschriften Nr. 4,001,401 an Bonson et al. und 4,061,736 an Morris et al., die hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung werden).

Die derzeitige Versorgung mit menschlichem Blut ist mit ernsten Einschränkungen verbunden, die sich durch die Verwendung eines exogenen Blutprodukts erleichtern lassen. Zur Erläuterung: wären sichere und wirksame Blutersatzstoffe allgemein verfügbar, so würde man weniger konserviertes (allogenes) Blut benötigen. Darüber hinaus wäre bei solchen Blutersatzstoffen nach traumatischen Verletzungen eine sofortige Infusion einer Wiederbelebungslösung möglich, ohne daß man (wie das bei Blut der Fall ist) eine Kreuzprobe durchführen muß, wodurch sich beim Wiederherstellen der Sauerstoffversorgung von ischämischem Gewebe wertvolle Zeit sparen läßt. Ebenso kann man Patienten vor chirugischen Eingriffen Blutersatzstoffe verabreichen, was die Entnahme von autologem Blut aus den Patienten ermöglicht, das, falls benötigt, zu einem späteren Zeitpunkt während der Operation oder nach dem chirurgischen Eingriff wieder zurückgeführt werden könnte. Mit der Verwendung von exogenen Blutprodukten schützt man also nicht nur Patienten davor, mit nicht-autologem (allogenem) Blut in Kontakt zu kommen, sondern kann auch autologes Blut bzw. allogenes Blut (konserviertes Blut, mit dem eine Kreuzprobe durchgeführt wurde) für eine optimale Verwendung zurückhalten.

C. Nachteile der gegenwärtig verfügbaren Blutersatzstoffe

Versuche zur Herstellung von Blutersatzstoffen (die manchmal auch als "sauerstofftragende Plasmaexpander" bezeichnet werden) haben bisher nur zu Produkten geführt, bei denen die Wirksamkeit im Grenzbereich liegt oder deren Herstellung aufwendig und teuer ist, oder beides. Die Herstellungskosten für solche Produkte sind häufig so hoch, daß eine allgemeine Verwendung der Produkte effektiv ausgeschlossen ist, insbesondere auf den Märkten, bei denen der größte Bedarf besteht (z.B. in den im Aufbau befindlichen Ökonomien der Dritten Welt).

Über die bereits entwickelten Blutersatzstoffe gibt es in verschiedenen Literaturstellen Übersichtsartikel (siehe z.B. Winslow, Robert M., "Hemoglobin-based Red Cell Substitutes", John Hopkins University Press, Baltimore [1992]). Sie lassen sich in die drei folgenden Kategorien einteilen: i) Emulsionen auf Basis von Perfluorkohlenstoffverbindungen, ii) in Liposomen verkapseltes Hämoglobin und iii) modifiziertes zellfreies Hämoglobin. Wie unten erläutert war keiner dieser Stoffe gänzlich erfolgreich, man geht jedoch davon aus, daß Produkte, die modifiziertes zellfreies Hämoglobin enthalten, am vielversprechendsten sind. Zusammensetzungen auf Basis von Perfluorkohlenstoffverbindungen binden Sauerstoff nicht als Chelat, sondern lösen ihn. Für einen Einsatz in biologischen Systemen muß die Perfluorkohlenstoffverbindung mit einem Lipid, typischerweise Phospholipid aus Eigelb, emulgiert werden. Die Emulsionen von Perfluorkohlenstoffverbindungen lassen sich zwar billig herstellen, transportieren jedoch in den klinisch verträglichen Dosen nicht ausreichend Sauerstoff, um wirksam zu sein. Umgekehrt konnte zwar gezeigt werden, daß in Liposomen verkapseltes Hämoglobin wirksam ist, es ist jedoch für eine allgemeine Verwendung viel zu teuer (siehe z.B. Winslow oben). Die meisten heute in der klinischen Erprobung befindlichen Blutersatzstoffprodukte basieren auf modifiziertem Hämoglobin. Diese Produkte, die häufig auch als Sauerstoffträger auf Hämoglobinbasis (haemoglobin-based oxygen carriers, HBOCs) bezeichnet werden, umfassen im allgemeinen eine homogene wässrige Lösung eines chemisch modifizierten Hämoglobins, die im wesentlichen frei ist von anderen Rückständen roter Blutkörperchen (Stroma). Stromafreies humanes Hämoglobin ist das am häufigsten verwendete Rohmaterial für die Herstellung eines HBOC, es wurden jedoch auch andere Hämoglobinquellen verwendet. So läßt sich Hämoglobin beispielsweise aus Tierblut (z.B. Rinderhämoglobin) oder aus Bakterien oder Hefe oder transgenen Tieren, die zur Herstellung eines gewünschten Hämoglobinproduktes molekular verändert wurden, erhalten oder gewinnen (siehe allgemein Winslow, oben).

Bei der chemischen Modifikation handelt es sich im allgemeinen um ein intramolekulares Quervernetzen und/oder Oligomerisieren, bei dem das Hämoglobin so modifiziert wird, daß seine Verweilzeit im Blutkreislauf im Vergleich zu der von nicht modifiziertem Hämoglobin verlängert wird und seine Sauerstoffbindungseigenschaften ähnlich denen von Blut sind. Beim intramolekularen Quervernetzen werden Untereinheiten der tetrameren Hämoglobineinheit chemisch miteinander verbunden, um so die Bildung von Dimeren, die, wie bereits oben erwähnt, vorzeitig ausgeschieden werden, zu verhindern (siehe z.B. die US-Patentschrift Nr. 5,296,465 an Rausch et al., die hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung wird).

Durch die hohen Herstellungskosten von HBOC-Produkten ist deren kommerzielle Verwendung stark eingeschränkt. Darüber hinaus wurde von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gefunden, daß HBOCs dazu neigen, übermäßig hohe Mengen an Sauerstoff an die Gewebe der Arteriolenwände und nicht der Kapillaren abzugeben; dies kann dazu führen, daß für die Versorgung der die Kapillaren umgebenden Gewebe durch den HBOC unzureichend Sauerstoff zur Verfügung steht, obwohl die Ausgangsbeladung des HBOC mit Sauerstoff relativ hoch sein kann, sogar höher als sich dies normalerweise mit natürlichen roten Blutkörperchen erzielen läßt.

Es bedarf eines Blutprodukts, das relativ billig herzustellen ist und das die Gewebe mit ausreichenden Mengen an Sauerstoff versorgt.

KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert. Sie betrifft Zusammensetzungen, die Mischungen aus einer sauerstofftragenden Komponente und einer nicht-sauerstofftragenden Komponente enthalten, und deren Verwendung. Mit den Zusammensetzungen werden die begrenzten Sauerstofftransporteigenschaften früherer Blutersatzstoffe verbessert, und es lassen sich daher niedrigere Dosierungen verwenden. Sie stellen eine sicherere und wirksamere Alternative zu den gegenwärtig verfügbaren Blutersatzstoffen dar.

In der vorliegenden Erfindung wird als Mittel zur Verbesserung der Sauerstoffversorgungkapazität eines Sauerstoffträgers die Kombination dieses Trägers mit einer nicht-sauerstofftragenden Komponente wie einem herkömmlichen Plasmaexpander in Betracht gezogen. Bei bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Sauerstoffträger (d.h. die sauerstofftragende Komponente) um einen Sauerstoffträger auf Hämoglobinbasis. Das Hämoglobin kann entweder nativ (nicht modifiziert), anschließend durch eine chemische Reaktion wie Quervernetzung, Polymerisation oder die Addition chemischer Gruppen (d.h. Polyethylenglycoladdukte, Polyoxyethylenaddukte oder andere Addukte) modifiziert oder rekombinant oder in einem Liposom verkapselt vorliegen. Bei einem nicht-sauerstofftragenden Plasmaexpander handelt es sich um eine beliebige zum vorübergehenden Ersatz von roten Blutkörperchen verwendete Substanz mit onkotischem Druck (z.B. Stärken wie Hetastärke oder Pentastärke, Dextran wie Dextran-70 oder Dextran-90, Albumin oder eine andere kolloidale intravenöse Lösung).

Insbesondere wird in Betracht gezogen, daß die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften haben: i) die Viskosität ist wenigstens halb so groß wie die von Blut, ii) der onkotische Druck ist höher als der von Plasma, iii) die Hämoglobin-Sauerstoffaffinität ist größer als die von Blut bzw. gleich der von Blut (d.h. der P50-Wert ist gleich dem von Blut bzw. niedriger als der von Blut), und iv) die Sauerstoffkapazität ist geringer als die von Blut. Die Erfindung soll nicht darauf beschränkt sein, wie die Zusammensetzungen anzuwenden sind. Für die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden verschiedene Anwendungen in Betracht gezogen, einschließlich, jedoch nicht darauf beschränkt, die Behandlung von Blutungen oder die Verwendung zur Blutverdünnung.

Bestimmte nicht-sauerstofftragende Plasmaexpander sind seit einer Reihe von Jahren in Verwendung (z.B. zur Blutverdünnung), und ihre physiologischen Wirkungen nach der Verabreichung sind gut charakterisiert. Früher sind Forscher davon ausgegangen, daß die Verabreichung eines sauerstofftragenden Blutprodukts (z.B. eines Blutersatzstoffes wie HBOC) zu physiologischen Herzkreislaufreaktionen ähnlich denen nach der Verabreichung von nicht-sauerstofftragenden verdünnenden Materialien mit einem ähnlichen Molekulargewicht (z.B. Dextran mit einem Molekulargewicht von 70 000, Albumine und Stärken) führen sollte. Weiterhin sind auf dem Gebiet der Blutersatzstoffe tätige Forscher bei ihrer Arbeit von mehreren anderen wichtigen Annahmen ausgegangen. Insbesondere wurde vor der vorliegenden Erfindung angenommen, daß die Viskosität von Blutersatzstoffen geringer als die von Blut sein sollte, daß die Sauerstoffaffinität ähnlich oder gleich oder geringer als die von roten Blutkörperchen sein sollte, daß der kolloidosmotische (onkotische) Druck möglichst klein sein sollte und daß die Hämoglobinkonzentration möglichst hoch sein sollte. Wie unten ausführlich beschrieben laufen die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung einigen dieser Annahmen zuwider.

Bei der vorliegenden Erfindung wird eine Blutproduktlösung in Betracht gezogen, die eine sauerstofftragende Komponente und eine nicht-sauerstofftragende Komponente enthält, wobei die Blutproduktlösung einen onkotischen Druck, der höher als der von Plasma ist, und eine Viskosität, die wenigstens die Hälfte der von Blut ist, aufweist. Bei einigen Ausführungsformen hat die Blutproduktlösung weiterhin eine Sauerstoffaffinität, die gleich oder größer als die von Blut ist. In anderen Ausführungsformen hat die Blutproduktlösung weiterhin eine Sauerstoffkapazität, die geringer als die von Blut ist. Bei besonderen Ausführungsformen handelt es sich bei der sauerstofftragenden Komponente um ein Polyethylenglycol-modifiziertes Hämoglobin. Weiterhin handelt es sich bei gewissen Ausführungsformen bei der nicht-sauerstofftragenden Komponente um eine kolloidale Stärke. Handelt es sich bei der nicht-sauerstofftragenden Komponente um eine kolloidale Stärke, so weist sie in einigen Ausführungsformen ein durchschnittliches Molekulargewicht von ungefähr 200.000 Dalton bis ungefähr 400.000 Dalton auf. Bei besonderen Ausführungsformen handelt es sich bei der kolloidalen Stärke um Pentastärke.

Bei der vorliegenden Erfindung wird weiterhin eine Blutproduktlösung in Betracht gezogen, die a) eine sauerstofftragende Komponente enthält, wobei die sauerstofftragende Komponente ein Polyethylenglycol-modifiziertes Hämoglobin enthält, und b) eine nicht-sauerstofftragende Komponente enthält, wobei die nicht-sauerstofftragende Komponente eine kolloidale Stärke mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 200.000 Dalton bis etwa 400.000 Dalton enthält. In einigen Ausführungsformen enthält das Polyethylenglycol-modifizierte Hämoglobin Hämoglobin ausgewählt aus der aus Tierhämoglobin, menschlichem Hämoglobin und rekombinantem Hämoglobin bestehenden Gruppe. Bei besonderen Ausführungsformen hat die kolloidale Stärke ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 225.000 Dalton bis etwa 300.000 Dalton, und in anderen Ausführungsformen handelt es sich bei der kolloidalen Stärke um Pentastärke. In noch anderen Ausführungsformen macht die Pentastärke etwa 20 Volumenprozent bis etwa 80 Volumenprozent der Blutproduktlösung aus, während die Pentastärke in anderen Ausführungsformen etwa 40 Volumenprozent bis etwa 60 Volumenprozent des Blutprodukts ausmacht. Weiterhin hat die Blutproduktlösung in besonderen Ausführungsformen eine Viskosität von etwa 2 Centipoise bis etwa 4,5 Centipoise.

Bei der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Verbesserung des Sauerstofftransports zu den Geweben eines Säugetiers in Betracht gezogen, bei dem man a) eine Blutproduktlösung bereitstellt, die eine sauerstofftragende Komponente und eine nicht-sauerstofftragende Komponente enthält, wobei die Blutproduktlösung einen onkotischen Druck, der höher als der von Plasma ist, und eine Viskosität, die wenigstens die Hälfte der von Blut ist, aufweist; und b) dem Säugetier die Blutproduktlösung verabreicht und so die Sauerstoffversorgung der Gewebe des Säugetiers verbessert. Bei einigen Ausführungsformen hat die Blutproduktlösung weiterhin eine Sauerstoffaffinität, die größer oder gleich der von Blut ist, während die Blutproduktlösung in anderen Ausführungsformen eine Sauerstoffkapazität hat, die geringer als die von Blut ist. Bei einigen Ausführungsformen handelt es sich bei der sauerstofftragenden Komponente um ein Polyethylenglycol-modifiziertes Hämoglobin. Bei besonderen Ausführungsformen handelt es sich bei der nicht-sauerstofftragenden Komponente um eine kolloidale Stärke; bei einigen Ausführungsformen hat die kolloidale Stärke ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 200.000 Dalton bis etwa 400.000 Dalton. Bei noch weiteren Ausführungsformen ist die kolloidale Stärke Pentastärke.

Darüber hinaus wird bei der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verbesserung des Sauerstofftransports zu den Geweben eines Säugetiers in Betracht gezogen, bei dem man a) eine Blutproduktlösung bereitstellt, die i) eine sauerstofftragende Komponente enthält, wobei die sauerstofftragende Komponente ein Polyethylenglycol-modifiziertes Hämoglobin enthält, und ii) eine nicht-sauerstofftragende Komponente enthält, wobei die nicht-sauerstofftragende Komponente eine kolloidale Stärke mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 200.000 Dalton bis etwa 400.000 Dalton enthält; und b) dem Säugetier die Blutproduktlösung verabreicht und so die Sauerstoffversorgung der Gewebe des Säugetiers verbessert.

Bei einigen Ausführungsformen enthält das Polyethylenglycol-modifizierte Hämoglobin Hämoglobin ausgewählt aus der aus Tierhämoglobin, menschlichem Hämoglobin und rekombinantem Hämoglobin bestehenden Gruppe. Bei anderen Ausführungsformen hat die kolloidale Stärke ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 200.000 Dalton bis etwa 400.000 Dalton. Bei noch anderen Ausführungsformen handelt es sich bei der kolloidalen Stärke um Pentastärke. Bei besonderen Ausführungsformen macht die Pentastärke von etwa 20 Volumenprozent bis etwa 80 Volumenprozent des Blutprodukts aus.

Bei gewissen Ausführungsformen hat die Blutproduktlösung eine Viskosität von etwa 2 Centipoise bis etwa 4,5 Centipoise. Schließlich handelt es sich bei anderen Ausführungsformen bei dem Säugetier um einen Menschen.

Die vorliegende Erfindung stellt auch eine wässrige zellfreie hämoglobinhaltige Zusammensetzung bereit, wobei das Hämoglobin in einer Konzentration von 0,1 bis 4,0 g/dl und die wässrige Zusammensetzung eine Viskosität aufweist, die größer als 2,5 cP ist. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen liegt die Viskosität der wässrigen Zusammensetzung zwischen 2,5 und 4 cP. Es ist somit nicht beabsichtigt, die vorliegende Erfindung auf Viskositäten zu beschränken, die größer als etwa 2,5 cP sind. Es wird sogar in Betracht gezogen, daß die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen einschließt, deren Viskosität 6 cP oder mehr beträgt. Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen ein, deren Hämoglobinkonzentration unter 0,1 oder über 4 g/dl liegt, wenngleich die Hämoglobinkonzentration bei besonders bevorzugten Ausführungsformen zwischen 0,1 und 4 g/dl liegt. Weiterhin ist bei einigen Ausführungsformen der K* der Zusammensetzung dem bei der gleichen Hämoglobinkonzentration gemessenen Wert einer Suspension von roten Blutkörperchen etwa gleich bzw. ähnlich.

Bei anderen Ausführungsformen der Zusammensetzung hat das Hämoglobin eine im Vergleich zu roten Blutkörperchen erhöhte Affinität zu molekularem Sauerstoff. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die sich für eine Anwendung bei allen Tieren einschließlich des Menschen eignen. Bei einigen Ausführungsformen hat das Hämoglobin der Zusammensetzung somit eine im Vergleich zu den roten Blutkörperchen von Säugetieren höhere Affinität, wenngleich bei anderen Ausführungsformen in Betracht gezogen wird, daß die roten Blutkörperchen von Reptilien, Vögeln oder beliebigen anderen Tieren stammen. Bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei den bei diesem Vergleich verwendeten roten Blutkörperchen um menschliche rote Blutkörperchen. Bei bevorzugten Ausführungsformen hat die Zusammensetzung einen P50 von weniger als 28 mm Hg. Bei alternativen bevorzugten Ausführungsformen beträgt der P50 etwa 1, während er bei anderen Ausführungsformen im Bereich von 1 bis 1,5 liegt und sich bei weiteren Ausführungsformen auf etwa 10 beläuft. Die vorliegende Erfindung soll jedoch nicht auf bestimmte P50-Werte beschränkt sein, da der P50 bei einigen Ausführungsformen über 28 mm Hg liegt.

Bei anderen Ausführungsformen enthält die Zusammensetzung weiterhin ein Verdünnungsmittel ausgewählt aus der aus Proteinen, Glycoproteinen, Polysacchariden und anderen Kolloiden bestehenden Gruppe. Diese Ausführungsformen sollen nicht auf ein bestimmtes Verdünnungsmittel beschränkt sein. Es ist somit vorgesehen, daß das Verdünnungsmittel Lösungen von Albumin, anderen Kolloiden oder anderen nicht-sauerstofftragenden Komponenten umfaßt. Bei bevorzugten Ausführungsformen enthält das Verdünnungsmittel Polysaccharid. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen enthält das Polysaccharid Stärke. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen enthält die Stärke Pentastärke.

Bei anderen Ausführungsformen ist die Oberfläche des Hämoglobins in der Zusammensetzung modifiziert. Diese Ausführungsformen sollen nicht auf eine bestimmte Art von Oberflächenmodifikation beschränkt sein. Bei bevorzugten Ausführungsformen schließt die Oberflächenmodifikation die Verwendung von Polyalkylenoxidgruppen mit verschiedenen Kettenlängen und Ladungen ein. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Hämoglobin durch Polyethylenglycol mit verschiedenen Kettenlängen und Ladungen oberflächenmodifiziert. Die Oberflächenmodifikation soll nicht auf einen bestimmten Typ bzw. eine bestimmte Modifikationsart beschränkt sein. Es wird in Betracht gezogen, daß das Hämoglobin der Zusammensetzung mehrereren Arten von Oberflächenmodifikationen unterzogen wird.

Die vorliegende Erfindung stellt auch eine wässrige zellfreie Zusammensetzung bereit, die oberflächenmodifiziertes Hämoglobin enthält, wobei das oberflächenmodifizierte Hämoglobin in einer Konzentration zwischen 0,1 und 4,0 g/dl vorliegt und die wässrige Zusammensetzung eine Viskosität von mehr als 2,5 cP aufweist. Wie oben angesprochen liegt die Viskosität der wässrigen Zusammensetzung bei einigen bevorzugten Ausführungsformen zwischen 2,5 und 4 cP. Es ist somit nicht beabsichtigt, die vorliegende Erfindung auf Viskositäten zu beschränken, die größer als etwa 2,5 cP sind. Es wird sogar in Betracht gezogen, daß die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen einschließt, deren Viskosität 6 cP oder mehr beträgt. Bei weiteren Ausführungsformen liegt die Hämoglobinkonzentration unter 0,1 oder über 4 g/dl, wenngleich die Hämoglobinkonzentration bei besonders bevorzugten Ausführungsformen zwischen 0,1 und 4 g/dl liegt. Weiterhin ist bei einigen Ausführungsformen der K* der Zusammensetzung dem bei der gleichen Hämoglobinkonzentration gemessenen Wert einer Suspension von roten Blutkörperchen etwa gleich bzw. ähnlich.

Bei bevorzugten Ausführungsformen dieser Zusammensetzung hat das Hämoglobin eine im Vergleich zu roten Blutkörperchen erhöhte Affinität zu molekularem Sauerstoff. Wie oben eignen sich diese Ausführungsformen für eine Anwendung bei allen Tieren einschließlich des Menschen. Bei einigen Ausführungsformen hat das Hämoglobin somit eine im Vergleich zu den roten Blutkörperchen von Säugetieren höhere Affinität, wenngleich bei anderen Ausführungsformen in Betracht gezogen wird, daß die roten Blutkörperchen von Reptilien, Vögeln oder beliebigen anderen Tieren stammen. Bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei den bei diesem Vergleich verwendeten roten Blutkörperchen um menschliche rote Blutkörperchen. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen hat die Zusammensetzung einen P50 von weniger als 28 mm Hg. Bei alternativen bevorzugten Ausführungsformen beträgt der P50 etwa 1, während er bei anderen Ausführungsformen im Bereich von 1 bis 1,5 liegt und sich bei noch anderen Ausführungsformen auf etwa 10 beläuft. Die vorliegende Erfindung soll jedoch nicht auf bestimmte P50-Werte beschränkt sein, da der P50 bei einigen Ausführungsformen über 28 mm Hg liegt.

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung bei anderen Ausführungsformen Zusammensetzungen bereit, die weiterhin ein Verdünnungsmittel ausgewählt aus der aus Proteinen, Glycoproteinen, Polysacchariden und anderen Kolloiden bestehenden Gruppe enthalten. Diese Ausführungsformen sollen nicht auf ein bestimmtes Verdünnungsmittel beschränkt sein. Es ist somit vorgesehen, daß das Verdünnungsmittel Lösungen von Albumin, anderen Kolloiden oder anderen nicht-sauerstofftragenden Komponenten umfaßt. Bei bevorzugten Ausführungsformen enthält das Verdünnungsmittel Polysaccharid. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen enthält das Polysaccharid Stärke. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen enthält die Stärke Pentastärke. In diesen Ausführungsformen soll die vorliegende Erfindung nicht auf eine bestimmte Art von Oberflächenmodifikation beschränkt sein. Bei bevorzugten Ausführungsformen schließt die Oberflächenmodifikation die Verwendung von Polyalkylenoxidgruppen mit verschiedenen Kettenlängen und Ladungen ein. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Hämoglobin durch Polyethylenglycol mit verschiedenen Kettenlängen und Ladungen oberflächenmodifiziert.

Die vorliegende Erfindung stellt auch eine wässrige zellfreie Zusammensetzung bereit, die eine Mischung von Hämoglobin und einem Verdünnungsmittel enthält, wobei das Hämoglobin in einer Konzentration zwischen 0,1 und 4 g/dl vorliegt und wobei das Verdünnungsmittel aus der aus Proteinen, Glycoproteinen, Polysacchariden und anderen Kolloiden bestehenden Gruppe ausgewählt ist und wobei die wässrige Zusammensetzung eine Viskosität von wenigstens 2,5 cP aufweist. Wie oben angesprochen liegt die Viskosität der wässrigen Zusammensetzung bei einigen bevorzugten Ausführungsformen zwischen 2,5 und 4 cP. Es ist somit nicht beabsichtigt, diese Ausführungsformen auf Viskositäten zu beschränken, die größer als etwa 2,5 cP sind. Es wird sogar in Betracht gezogen, daß die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen einschließt, deren Viskosität 6 cP oder mehr beträgt. Weiterhin enthält das Verdünnungsmittel bei einigen Ausführungsformen ein Polysaccharid, während das Verdünnungsmittel bei bevorzugten Ausführungsformen Stärke enthält und das Verdünnungsmittel in besonders bevorzugten Ausführungsformen Pentastärke enthält. Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen ein, bei denen die Hämoglobinkonzentration unter 0,1 oder über 4 g/dl liegt, wenngleich die Hämoglobinkonzentration bei besonders bevorzugten Ausführungsformen zwischen 0,1 und 4 g/dl liegt. Bei einigen Ausführungsformen ist der K* der Zusammensetzung dem bei der gleichen Hämoglobinkonzentration gemessenen Wert einer Suspension von roten Blutkörperchen etwa gleich bzw. ähnlich.

Bei einigen Ausführungsformen enthalten die Zusammensetzungen Hämoglobin mit einer im Vergleich zu roten Blutkörperchen erhöhten Affinität zu molekularem Sauerstoff. Die vorliegende Erfindung stellt Zusammensetzungen bereit, die sich für eine Anwendung bei allen Tieren einschließlich des Menschen eignen. Bei einigen Ausführungsformen hat das Hämoglobin somit eine im Vergleich zu den roten Blutkörperchen von Säugetieren höhere Affinität, wenngleich bei anderen Ausführungsformen in Betracht gezogen wird, daß die roten Blutkörperchen von Reptilien, Vögeln oder beliebigen anderen Tieren stammen. Bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei den bei diesem Vergleich verwendeten roten Blutkörperchen um menschliche rote Blutkörperchen. Bei bevorzugten Ausführungsformen hat die Zusammensetzung einen P50 von weniger als 28 mm Hg. Bei alternativen bevorzugten Ausführungsformen beträgt der P50 etwa 1, während er bei anderen im Bereich von 1 bis 1,5 liegt und sich bei noch weiteren Ausführungsformen auf etwa 10 beläuft. Die vorliegende Erfindung soll jedoch nicht auf bestimmte P50-Werte beschränkt sein, da der P50 bei einigen Ausführungsformen über 28 mm Hg liegt.

Wie oben angegeben können diese Ausführungsformen auch oberflächenmodifiziertes Hämoglobin enthalten. Die vorliegende Erfindung soll nicht auf eine bestimmte Art von Oberflächenmodifikation beschränkt sein. Bei bevorzugten Ausführungsformen schließt die Oberflächenmodifikation die Verwendung von Polyalkylenoxidgruppen mit verschiedenen Kettenlängen und Ladungen ein. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Hämoglobin durch Polyethylenglycol mit verschiedenen Kettenlängen und Ladungen oberflächenmodifiziert.

Wie oben schließen die Verfahren der vorliegenden Erfindung eine wässrige zellfreie hämoglobinhaltige Zusammensetzung ein, wobei das Hämoglobin in einer Konzentration zwischen 0,1 und 4,0 g/dl vorliegt und die wässrige Zusammensetzung eine Viskosität von mehr als 2,5 cP aufweist. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen liegt die Viskosität der wässrigen Zusammensetzung zwischen 2,5 und 4 cP. Es ist somit nicht beabsichtigt, die vorliegende Erfindung auf Viskositäten zu beschränken, die größer als etwa 2,5 cP sind. Es wird sogar in Betracht gezogen, daß die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen einschließt, deren Viskosität 6 cP oder mehr beträgt. Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen ein, bei denen die Hämoglobinkonzentration unter 0,1 oder über 4 g/dl liegt, wenngleich die Hämoglobinkonzentration bei besonders bevorzugten Ausführungsformen zwischen 0,1 und 4 g/dl liegt. Bei einigen Ausführungsformen ist der K* der Zusammensetzung dem bei der gleichen Hämoglobinkonzentration gemessenen Wert einer Suspension von roten Blutkörperchen etwa gleich bzw. ähnlich.

Bei alternativen Ausführungsformen enthalten die Zusammensetzungen Hämoglobin mit einer im Vergleich zu roten Blutkörperchen erhöhten Affinität zu molekularem Sauerstoff. Darüber hinaus eignen sich diese Ausführungsformen für eine Anwendung bei allen Tieren einschließlich des Menschen. Bei einigen Ausführungsformen hat das Hämoglobin somit eine im Vergleich zu den roten Blutkörperchen von Säugetieren höhere Affinität, wenngleich bei anderen Ausführungsformen in Betracht gezogen wird, daß die roten Blutkörperchen von Reptilien, Vögeln oder beliebigen anderen Tieren stammen. Bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei den bei diesem Vergleich verwendeten roten Blutkörperchen um menschliche rote Blutkörperchen. Bei bevorzugten Ausführungsformen hat die Zusammensetzung einen P50 von weniger als 28 mm Hg. Bei alternativen bevorzugten Ausführungsformen beträgt der P50 etwa 1, während er bei anderen Ausführungsformen im Bereich von 1 bis 1,5 liegt und sich bei noch weiteren Ausführungsformen auf etwa 10 beläuft. Die vorliegende Erfindung soll jedoch nicht auf bestimmte P50-Werte beschränkt sein, da der P50 bei einigen Ausführungsformen über 28 mm Hg liegt.

Bei anderen Ausführungsformen enthalten die Zusammensetzungen weiterhin ein Verdünnungsmittel ausgewählt aus der aus Proteinen, Glycoproteinen, Polysacchariden und anderen Kolloiden bestehenden Gruppe. Die vorliegende Erfindung soll nicht auf ein bestimmtes Verdünnungsmittel beschränkt sein. Es ist somit vorgesehen, daß das Verdünnungsmittel Lösungen von Albumin, anderen Kolloiden oder anderen nicht-sauerstofftragenden Komponenten umfaßt. Bei bevorzugten Ausführungsformen enthält das Verdünnungsmittel Polysaccharid. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen enthält das Polysaccharid Stärke. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen enthält die Stärke Pentastärke.

Bei noch anderen Ausführungsformen ist das Hämoglobin in der Zusammensetzung oberflächenmodifiziert. Die vorliegende Erfindung soll nicht auf eine bestimmte Art von Oberflächenmodifikation beschränkt sein. Bei bevorzugten Ausführungsformen schließt die Oberflächenmodifikation die Verwendung von Polyalkylenoxidgruppen mit verschiedenen Kettenlängen und Ladungen ein. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Hämoglobin durch Polyethylenglycol mit verschiedenen Kettenlängen und Ladungen oberflächenmodifiziert.

Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen der Verfahren liegt die Viskosität der wässrigen Zusammensetzung zwischen 2,5 und 4 cP. Es ist somit nicht beabsichtigt, die vorliegende Erfindung auf Viskositäten zu beschränken, die größer als etwa 2,5 cP sind. Es wird sogar in Betracht gezogen, daß die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen einschließt, deren Viskosität 6 cP oder mehr beträgt. Darüber hinaus schließt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen ein, bei denen die Hämoglobinkonzentration unter 0,1 oder über 4 g/dl liegt, wenngleich die Hämoglobinkonzentration bei besonders bevorzugten Ausführungsformen zwischen 0,1 und 4 g/dl liegt. Bei einigen Ausführungsformen ist der K* der Zusammensetzung dem bei der gleichen Hämoglobinkonzentration gemessenen Wert einer Suspension von roten Blutkörperchen etwa gleich bzw. ähnlich.

Diese Ausführungsformen stellen auch Zusammensetzungen bereit, die Hämoglobin mit einer im Vergleich zu roten Blutkörperchen erhöhten Affinität zu molekularem Sauerstoff enthalten. Wie oben eignen sich diese Ausführungsformen für eine Anwendung bei allen Tieren einschließlich des Menschen. Bei einigen Ausführungsformen hat das Hämoglobin somit eine im Vergleich zu den roten Blutkörperchen von Säugetieren höhere Affinität, wenngleich bei anderen Ausführungsformen in Betracht gezogen wird, daß die roten Blutkörperchen von Reptilien, Vögeln oder beliebigen anderen Tieren stammen. Bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei den bei diesem Vergleich verwendeten roten Blutkörperchen um menschliche rote Blutkörperchen. Bei bevorzugten Ausführungsformen hat die Zusammensetzung einen P50 von weniger als 28 mm Hg. Bei alternativen bevorzugten Ausführungsformen beträgt der P50 etwa 1, während er bei anderen Ausführungsformen im Bereich von 1 bis 1,5 liegt und sich bei noch weiteren Ausführungsformen auf etwa 10 beläuft. Die vorliegende Erfindung soll jedoch nicht auf bestimmte P50-Werte beschränkt sein, da der P50 bei einigen Ausführungsformen über 28 mm Hg liegt.

Bei anderen Ausführungsformen enthalten die Zusammensetzungen weiterhin ein Verdünnungsmittel ausgewählt aus der aus Proteinen, Glycoproteinen, Polysacchariden und anderen Kolloiden bestehenden Gruppe. Die vorliegende Erfindung soll nicht auf ein bestimmtes Verdünnungsmittel beschränkt sein. Es ist somit vorgesehen, daß das Verdünnungsmittel Lösungen von Albumin, anderen Kolloiden oder anderen nicht-sauerstofftragenden Komponenten umfaßt. Bei bevorzugten Ausführungsformen enthält das Verdünnungsmittel Polysaccharid. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen enthält das Polysaccharid Stärke. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen enthält die Stärke Pentastärke.

Bei noch anderen Ausführungsformen ist das Hämoglobin in der Zusammensetzung oberflächenmodifiziert. Die vorliegende Erfindung soll nicht auf eine bestimmte Art von Oberflächenmodifikation beschränkt sein. Bei bevorzugten Ausführungsformen schließt die Oberflächenmodifikation die Verwendung von Polyalkylenoxidgruppen mit verschiedenen Kettenlängen und Ladungen ein. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist das Hämoglobin durch Polyethylenglycol mit verschiedenen Kettenlängen und Ladungen oberflächenmodifiziert.

Die vorliegende Erfindung soll nicht auf einen bestimmten onkotischen Druck beschränkt sein. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sollen sogar einen onkotischen Druckbereich einschließen. Bei einigen Ausführungsformen liegt der onkotische Druck im Bereich von 70 bis 80 mm Hg, während der onkotische Druck bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen etwa 90 mm Hg beträgt. Bei anderen Ausführunsgsformen kann der onkotische Druck jedoch sogar nur 60 mm Hg betragen. Weiterhin ist vorgesehen, daß die vorliegende Erfindung hypoonkotische, hyperonkotische und isoonkotische Drücke einschließt. Der Ausdruck "hyperonkotisch" bedeutet, so wie er hier verwendet wird, einen beliebigen onkotischen Druck größer als 25 mm Hg, wenngleich in bevorzugten Ausführungsformen Lösungen mit onkotischen Drücken von 20–60 mm Hg bereitgestellt werden. Bei einigen Ausführungsformen der Verfahren der vorliegenden Erfindung wird in Betracht gezogen, daß die für die Verabreichung gewählte Zusammensetzung den jeweiligen Bedürfnissen des Tieres angepaßt wird. Die vorliegende Erfindung stellt die Mittel zur Anpassung der Zusammensetzung an die Erfordernisse verschiedener klinischer und veterinärmedizinischer Anwendungen bereit.

19 ist eine graphische Darstellung, die die Hämoglobinkonzentration und Viskosität verschiedener Hämoglobinzubereitungen zeigt. Das in dieser graphischen Darstellung angeordnete Quadrat (d.h. bei etwa 2,5–4 cP und 0,1 bis 4 g/dl Hämoglobin) gibt die Eigenschaften der am meisten bevorzugten Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung an. Wie angegeben ist die einzige Hämoglobinlösung, die die Kriterien erfüllt, die nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte "Hemospan"-Lösung. Zu den anderen Proben in dieser graphischen Darstellung zählen Blut, PEG-Hb (Enzon), PHP (Apex) und áá-Hämoglobin (US Army). Wie unten ausführlicher erläutert, können die Charakteristika der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung viele bislang unbekannte und unerwartete Vorteile bieten.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren bereit, bei dem man: i) mit Liganden versehenes Hämoglobin bereitstellt, ii) Mittel zur Behandlung von Hämoglobin bereitstellt und iii) Mittel zur Oberflächendekoration von Hämoglobin bereitstellt; das mit Liganden versehene Hämoglobin unter Bedingungen, bei denen ein behandeltes Hämoglobin mit einer im Vergleich zu nicht mit Liganden versehenem Hämoglobin größeren Affinität zu molekularem Sauerstoff erzeugt wird, mit den Behandlungsmitteln behandelt; und die Oberfläche des behandelten Hämoglobins mit den Mitteln zur Oberflächendekoration dekoriert.

Bei einigen Ausführungsformen des Verfahrens ist das Behandlungsmittel aus der aus Quervernetzungsmitteln und Polymerisierungsmitteln bestehenden Gruppe ausgewählt. Bei alternativen Ausführungsformen setzt man bei der Oberflächendekoration von Schritt (c) das behandelte Hämoglobin mit einem Polyalkylenoxid um.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren bereit, bei dem man: i) mit Liganden versehenes Hämoglobin bereitstellt, ii) Mittel zur Behandlung von Hämoglobin ausgewählt aus der aus Quervernetzungsmitteln und Polymerisierungsmitteln bestehenden Gruppe bereitstellt und iii) Mittel zur Oberflächendekoration von Hämoglobin bereitstellt; das mit Liganden versehene Hämoglobin unter Bedingungen, bei denen ein behandeltes Hämoglobin mit einer im Vergleich zu nicht mit Liganden versehenem Hämoglobin größeren Affinität zu molekularem Sauerstoff erzeugt wird, mit den Behandlungsmitteln behandelt; und die Oberfläche des behandelten Hämoglobins mit den Mitteln zur Oberflächendekoration dekoriert. Bei einigen Ausführungsformen des Verfahrens setzt man bei der Oberflächendekoration von Schritt (c) das behandelte Hämoglobin mit einem Polyalkylenoxid um.

Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren bereit, bei dem man: i) Hämoglobin bereitstellt, ii) Mittel zur enzymatischen Behandlung von Hämoglobin (z.B. mit Enzymen wie Carboxypeptidase) bereitstellt und iii) Mittel zur Oberflächendekoration von Hämoglobin bereitstellt; das mit Liganden versehene Hämoglobin unter Bedingungen, bei denen ein enzymatisch behandeltes Hämoglobin mit einer im Vergleich zu Hämoglobin in roten Blutkörperchen größeren Affinität zu molekularem Sauerstoff erzeugt wird, mit den enzymatischen Behandlungsmitteln behandelt; und die Oberfläche des enzymatisch behandelten Hämoglobins mit den Mitteln zur Oberflächendekoration dekoriert.

DEFINITIONEN

Zum leichteren Verständnis der in der folgenden Offenbarung ausgeführten Erfindung sind unten eine Reihe von Ausdrücken definiert.

Der Ausdruck "eine Sauerstoffkapazität, die geringer ist als die von Blut" bedeutet, daß, wenn man die Sauerstoffkapazität der Blutproduktlösungen der vorliegenden Erfindung mit der von Blut vergleicht, die Sauerstoffkapazität der Blutproduktlösungen geringer ist. Die Sauerstoffkapazität der Blutproduktlösungen der vorliegenden Erfindung muß nicht um eine bestimmte Menge geringer sein als die von Blut. Die Sauerstoffkapazität wird im allgemeinen aus der Hämoglobinkonzentration berechnet, da bekannt ist, daß jedes Gramm Hämoglobin 1,34 ml Sauerstoff bindet. Somit ergibt die mit einem Faktor von 1,34 multiplizierte Hämoglobinkonzentration in g/dl die Sauerstoffkapazität in ml/dl. Bei der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung von geeigneten, im Handel erhältlichen Geräten einschließlich des B-Hemoglobin Photometers (Hemocue, Inc.) zum Messen der Hämoglobinkonzentration in Betracht gezogen. In ähnlicher Weise läßt sich die Sauerstoffkapazität durch die aus einer Hämoglobin- oder Blutprobe freigesetzte Menge an Sauerstoff messen, indem man beispielsweise ein Brennstoffzelleninstrument (z.B. Lex-O2-Con; Lexington Instruments) verwendet.

Der Ausdruck "eine Sauerstoffaffinität, die gleich oder größer ist als die von Blut" bedeutet, daß, wenn man die Sauerstoffaffinität der Blutproduktlösungen der vorliegenden Erfindung mit der von Blut vergleicht, die Sauerstoffaffinität der Blutproduktlösungen größer ist. Die Sauerstoffkapazität der Blutproduktlösungen der vorliegenden Erfindung muß nicht um eine bestimmte Menge größer sein als die von Blut. Die Sauerstoffaffinität von Vollblut (und Vollblutkomponenten wie roten Blutkörperchen und Hämoglobin) läßt sich durch verschiedene im Stand der Technik bekannte Verfahren messen (siehe z.B. Vandegriff und Shrager in Methods in Enzymology (Everse et al., Hrsg.) 232: 460 [1994]). Bei bevorzugten Ausführungsformen kann die Sauerstoffaffinität mit einem im Handel erhältlichen HEMOX® Analyzer (TCS Medical Products) bestimmt werden (siehe z.B. Winslow et al., J. Biol. Chem., 252(7): 2331–37 [1997]).

Der Ausdruck "ein onkotischer Druck, der höher ist als der von Plasma" bedeutet, daß, wenn man den onkotischen Druck der Blutproduktlösungen der vorliegenden Erfindung mit dem von Plasma vergleicht, der onkotische Druck der Blutproduktlösungen größer ist. Der onkotische Druck der Blutproduktlösungen der vorliegenden Erfindung muß nicht um eine bestimmte Menge größer sein als der von Blut. Der onkotische Druck kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren gemessen werden; bei bevorzugten Ausführungsformen wird der onkotische Druck mit einem Kolloidosmometer (Wesco Modell 4420) gemessen.

Der Ausdruck "eine Viskosität, die wenigstens die Hälfte der von Blut beträgt" bedeutet, daß, wenn man die Viskosität der Blutproduktlösungen der vorliegenden Erfindung mit der von Blut vergleicht, die Viskosität der Blutproduktlösungen wenigstens 50% der von Blut ist; darüber hinaus kann die Viskosität größer als die von Blut sein. Vorzugsweise wird die Viskosität bei 37°C in einem Kapillarviskosimeter unter Anwendung von Standardverfahren gemessen (siehe Reinhart et al., J. Lab. Clin. Med. 104: 921–31 [1984]). Die Viskosität läßt sich außerdem auch durch andere Verfahren messen, einschließlich eines Viskosimeters mit rotierendem Kegel und Platte, wie den im Handel von Brookfield erhältlichen. Die Viskosität von Blut beträgt etwa 4 Centipoise. Wenigstens die Hälfte des Blutwertes entspricht somit wenigstens etwa 2 Centipoise.

Der Ausdruck "Blutprodukt" bezieht sich allgemein auf Formulierungen, die in das Blutkreislaufsystem des Körpers eingebracht werden können und Sauerstoff zu den Geweben transportieren bzw. die Gewebe mit Sauerstoff versorgen können. Während der Ausdruck "Blutprodukte" herkömmliche Formulierungen einschließt (z.B. Formulierungen, die die normalerweise durch das Blutkreislaufsystem des Körpers strömende Flüssigkeit und/oder damit assoziierte zelluläre Elemente und dergleichen einschließlich – jedoch nicht darauf beschränkt – Thrombozytenmischungen, Serum und Plasma enthalten), handelt es sich bei den bevorzugten Blutprodukten der vorliegenden Erfindung um "Blutproduktmischungen". So, wie der Ausdruck hier verwendet wird, enthalten die Blutproduktmischungen eine nicht-sauerstofftragende Komponente und eine sauerstofftragende Komponente.

Der Ausdruck "sauerstofftragende Komponente" bezieht sich allgemein auf eine Substanz, die dazu in der Lage ist, Sauerstoff im Blutkreislaufsystem des Körpers zu transportieren und die Gewebe mit wenigstens einem Teil des Sauerstoffs zu versorgen. Bei bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der sauerstofftragenden Komponente um natives oder modifiziertes Hämoglobin. Der Ausdruck "Hämoglobin" bezieht sich, so wie er hier verwendet wird, auf das im allgemeinen in Erythrozyten vorhandene Protein, das dazu fähig ist, Sauerstoff zu tragen. Modifiziertes Hämoglobin schließt durch eine chemische Reaktion wie Quervernetzen, Polymerisieren oder die Addition chemischer Gruppen (z.B. Polyethylenglycol, Polyoxyethylen oder andere Addukte) verändertes Hämoglobin ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt. In ähnlicher Weise schließt modifiziertes Hämoglobin Hämoglobin ein, das in einem Liposom verkapselt ist.

Die vorliegende Erfindung ist nicht durch die Hämoglobinquelle eingeschränkt. Hämoglobin kann beispielsweise von Tieren und Menschen gewonnen sein; bevorzugte Hämoglobinquellen sind Kühe und Menschen. Darüber hinaus kann Hämoglobin durch andere Verfahren einschließlich rekombinanter Verfahren hergestellt werden. Eine am meisten bevorzugte sauerstofftragende Komponente der vorliegenden Erfindung ist "Polyethylenglycol-modifiziertes Hämoglobin".

Der Ausdruck "Polyethylenglycol-modifiziertes Hämoglobin" bezieht sich auf Hämoglobin, das so modifiziert wurde, daß es mit Polyethylenglycol (á-Hydro-ù-hydroxypoly-(oxy-1,2-ethandiyl) assoziiert ist; allgemein gesprochen beinhaltet die Modifikation eine kovalente Bindung von Polyethylenglycol (PEG) an das Hämoglobin. PEGs sind flüssige und feste Polymere der allgemeinen chemischen Formel H(OCH2CH2)nOH, wobei n größer als oder gleich 4 ist. PEG-Formulierungen folgt gewöhnlich eine dem durchschnittlichen Molekulargewicht entsprechende Nummer; PEG-200 beispielsweise hat ein Molekulargewicht von 200 und einen Molekulargewichtsbereich von 190–210. PEGs sind im Handel in einer Reihe von Formulierungen erhältlich (z.B. Carbowax, Poly-G und Solbase).

Der Ausdruck "nicht-sauerstofftragende Komponete" bezieht sich allgemein auf Substanzen wie Plasmaexpander, die beispielsweise zum vorübergehenden Ersatz von verlorengegangenen roten Blutkörperchen verabreicht werden können. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung handelt es sich bei der nicht-sauerstofftragenden Komponente um ein Kolloid (d.h. eine Substanz, die Moleküle in feinteiliger Form dispergiert in einem gasförmigen, flüssigen oder festen Medium enthält) mit einem onkotischen Druck (kolloidosmotischer Druck verhindert beispielsweise, daß die Flüssigkeit aus dem Plasma aus den Kapillaren in die interstitielle Flüssigkeit ausläuft). Kolloide sind beispielsweise Hetastärke, Pentastärke, Dextran-70, Dextran-90 und Albumin.

Zu den bevorzugten Kolloiden der vorliegenden Erfindung zählen Stärken wie Hetastärke und Pentastärke. Pentastärke (Hydroxyethylstärke) ist die bevorzugte kolloidale Stärke der vorliegenden Erfindung. Bei Pentastärke handelt es sich um ein künstliches Kolloid, das aus einer Stärke gewonnen wird, die nahezu ausschließlich aus Amylopektin besteht. Ihr molekularer Substitutionsgrad ist 0,45 (d.h. auf 100 Glucoseeinheiten kommen 45 Hydroxyethylgruppen); die Hydroxyethylgruppen sind über eine Etherbindung primär an das C-2 der Glucoseeinheit gebunden (und weniger häufig an das C-3 und C-6). Die polymerisierten Glucoseeinheiten von Pentastärke sind im allgemeinen über 1–4-Bindungen (und weniger häufig über 1–6-Bindungen) miteinander verbunden, wobei der Verzweigungsgrad etwa 1:20 beträgt (d.h. auf 20 Glucose-Monomereinheiten kommt jeweils eine Verzweigung). Das gewichtsmittlere Molekulargewicht von Pentastärke beträgt etwa 250.000 mit einem Bereich von etwa 150.000 bis 350.000. Wenn nicht anders angegeben bezieht sich ein Verweis auf das "durchschnittliche Molekulargewicht" einer Substanz auf das gewichtsmittlere Molekulargewicht. Pentastärke ist im Handel erhältlich (z.B. DuPont Merck) als eine 10%ige Lösung (d.h. 10 g/100 ml); wenn nicht anders angegeben sind Verweise auf Pentastärke (und andere nicht-sauerstofftragende Komponenten sowie sauerstofftragende Komponenten) enthaltende Blutproduktlösungen auf Volumenbasis.

Die Wendung "verbesserte Sauerstoffversorgung der Gewebe eines Säugetieres" bezieht sich auf die Fähigkeit einer in das Blutkreislaufsystem eingebrachten Flüssigkeit (z.B. eines Blutprodukts), den Geweben mehr Sauerstoff zuzuführen, als ohne die eingebrachte Flüssigkeit zugeführt würde. Zur Erläuterung: ein Patient kann infolge einer akuten Blutung einen beträchtlichen Blutverlust erlitten haben, was zu einer reduzierten Sauerstoffversorgung der Gewebe über das Blut führt. Mit der Verabreichung eines Blutprodukts an den Patienten läßt sich die Fähigkeit des eigenen Blutes des Patienten zur Sauerstoffversorgung ergänzen.

Der Ausdruck "Mischung" bezieht sich auf das Vermischen von zwei oder mehr Substanzen, ohne daß es dabei zu einer Reaktion kommt, bei der sie ihre individuellen Eigenschaften verlieren würden. Der Ausdruck "Lösung" bezieht sich auf eine flüssige Mischung. Der Ausdruck "wässrige Lösung" bezieht sich auf eine Lösung, die etwas Wasser enthält. In vielen Fällen dient Wasser als Verdünnungsmittel für feste Substanzen zum Herstellen einer Lösung, die diese Substanzen enthält. In anderen Fällen werden feste Substanzen lediglich in der wässrigen Lösung getragen (d.h. sie sind nicht darin gelöst). Der Ausdruck wässrige Lösung bezieht sich auch auf die Kombination einer oder mehrerer flüssiger Substanzen mit Wasser unter Bildung einer Mehrkomponentenlösung.

Der Ausdruck "etwa" bezieht sich darauf, daß der eigentliche Wert innerhalb eines Bereichs um den angegebenen Wert liegt. Im allgemeinen liegt der eigentliche Wert bei 10% (plus oder minus) des angegebenen Wertes.

BESCHREIBUNG DR ZEICHNUNGEN

Bei 1A–B handelt es sich um eine diagrammatische Querschnittillustration des Stroms von Vollblut (1A) und eines Sauerstoffträgers auf Hämoglobinbasis (1B) durch eine Arterie.

2 zeigt eine Auftragung der Fließgeschwindigkeit bei der Mikrozirkulation als Funktion der Hämatokritabsenkung durch die Verdünnung des Bluts mit Dextran bzw. Kochsalzlösung.

3 zeigt graphisch den mittleren arteriellen Blutdruck in Ratten vor und während einer Austauschtransfusion (Pfeil) mit HemoLink® (?), Pentastärke (?) und einer 50/50-Mischung (Volumen/Volumen) von HemoLink® und Pentastärke (V).

4 zeigt graphisch den mittleren arteriellen Blutdruck in Ratten nach einer Austauschtransfusion mit HemoLink® (?), Pentastärke (?) und einer 50/50-Mischung (Volumen/Volumen) von Hemo-Link® und Pentastärke (V) während einer Blutung mit 60% Blutvolumenverlust.

5 zeigt das Überleben von Ratten nach einer Austauschtransfusion mit Pentastärke (?), áá-Hb (|), PEG-Hb (?), Pentastärke + áá-Hb (?) und Pentastärke + PEG-Hb (?) und nach Beginn einer 60%igen Blutung.

6A–D zeigen in graphischer Darstellung den Säure-Base-Status von Kontrollratten (?) und Ratten nach einer Austauschtransfusion mit Pentastärke (?), áá-Hb (|), PEG-Hb (?), Pentastärke + áá-Hb (?) und Pentastärke + PEG-Hb (?) und nach Beginn einer 60%igen Blutung. 6A zeigt den PaO2, 6B zeigt den PaCO2, 6C zeigt den arteriellen pH-Wert und 6D zeigt den Basenüberschuß.

7 zeigt in graphischer Darstellung die Milchsäureproduktion in Kontrollratten (?) und Ratten nach einer Austauschtransfusion mit Pentastärke (?), áá-Hb (|), PEG-Hb (?), Pentastärke + áá-Hb (?) und Pentastärke + PEG-Hb (?) und nach Beginn einer 60%igen Blutung.

8A zeigt den mittleren arteriellen Blutdruck in Kontrollratten (?) und Ratten nach einer Austauschtransfusion mit Pentastärke (?), PEG-Hb (?) und Pentaspan + PEG-Hb (?) zum Zeitpunkt –30 Minuten und nach Beginn einer 60%igen Blutung zum Zeitpunkt 0 Minuten.

8B zeigt den mittleren arteriellen Blutdruck in Kontrollratten (?) und Ratten nach einer Austauschtransfusion mit Pentastärke (?, Punkt B), áá-Hb (|, Punkt B) und Pentastärke + áá-Hb (?, Punkt A) und nach Beginn einer 60%igen Blutung (Punkt C).

9 zeigt das Herzzeitvolumen in Kontrollratten (?) und Ratten nach einer Austauschtransfusion mit Pentastärke (?), áá-Hb (|), PEG-Hb (|) und Pentastärke + PEG-Hb (?) und nach Beginn einer 60%igen Blutung zum Zeitpunkt 0 Minuten.

10 zeigt den systemischen Gefäßwiderstand in Kontrollratten (?) und Ratten nach einer Austauschtransfusion mit Pentastärke (?), áá-Hb (|), PEG-Hb (?) und Pentastärke + PEG-Hb (?) und nach Beginn einer 60%igen Blutung zum Zeitpunkt 0 Minuten.

11 zeigt das Überleben der Tiere nach einer Austauschtransfusion mit Pentastärke (?), áá-Hb (|) und Pentastärke + áá-Hb (?) nach Beginn einer 60%igen Blutung.

12 zeigt das Überleben der Tiere nach einer Austauschtransfusion mit Hetastärke (x), HemoLink® (?), HemoLink® und Pentastärke (V) und Hetastärke + HemoLink® (0) und nach Beginn einer 60%igen Blutung.

13 zeigt einen Krogh-Zylinder.

14 zeigt eine schematische Darstellung eines Kapillarsystems.

Bei 15 handelt es sich um eine graphische Darstellung, die den Austritts-PO2 verglichen mit der Verweilzeit von roten Blutkörperchen, A0-Hämoglobin, áá-Hämoglobin und PEG-Hb zeigt.

Bei 16 handelt es sich um eine graphische Darstellung, die die Sättigung verglichen mit der Verweilzeit von roten Blutkörperchen, A0-Hämoglobin, áá-Hämoglobin und PEG-Hb zeigt.

Bei 17 handelt es sich um eine graphische Darstellung, die den K* verglichen mit der Verweilzeit von roten Blutkörperchen, A0-Hämoglobin, áá-Hämoglobin und PEG-Hb zeigt.

Bei 18 handelt es sich um eine graphische Darstellung, die den zeitlichen Verlauf der MAP für 0-Hämoglobin, áá-Hämoglobin und PEG-Hb zeigt.

Bei 19 handelt es sich um eine graphische Darstellung, die die Hämoglobinkonzentration und die Viskosität verschiedener Hämoglobinlösungen zeigt.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung ist in den Ansprüchen definiert. Sie betrifft allgemein Blutprodukte und insbesondere Zusammensetzungen, die Mischungen sauerstofftragender und nicht-sauerstofftragender Komponenten enthalten, und deren Verwendung. Die Zusammensetzungen und die Anwendung der vorliegenden Erfindung führen zu einer verbesserten Sauerstoffversorgungskapazität von Sauerstoffträgern auf Hämoglobinbasis. Allgemein gesagt haben die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften: i) die Viskosität ist wenigstens halb so groß wie die von Blut, ii) der onkotische Druck ist höher als der von Plasma, iii) die Hämoglobin-Sauerstoffaffinität ist größer als die von Blut bzw. gleich der von Blut (d.h. der P50-Wert ist gleich dem von Blut bzw. niedriger als der von Blut), und iv) die Sauerstoffkapazität ist geringer als die von Blut. Aufgrund der effizienteren Verwendung des vom HBOC transportierten Sauerstoffs hinsichtlich der Gewebeoxygenation haben die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einen beträchtlich reduzierten Hämoglobingehalt und sind allgemein billiger zu formulieren.

Die Beschreibung der Erfindung ist eingeteilt in: I) Sauerstoffversorgung und -verbrauch; II) Leichtere Diffusion und die Entwicklung von Sauerstoffträgern auf Hämoglobinbasis; III) Klinische und andere Anwendungen der vorliegenden Erfindung; IV) Die sauerstofftragende Komponente der Blutprodukte der vorliegenden Erfindung; V) Die nicht-sauerstofftragende Komponente der Blutprodukte der vorliegenden Erfindung; und VI) Blutproduktzusammensetzungen. Die einzelnen Abschnitte werden unten nacheinander erläutert.

I. SAUERSTOFFVERSORGUNG UND -VERBRAUCH

Wenngleich es für die erfolgreiche Anwendung der Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung ein Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen von Sauerstoffversorgung und -verbrauch nicht erforderlich ist, könnten Grundkenntnisse hinsichtlich dieser putativen Mechanismen zum Verstehen der folgenden Diskussion beitragen. Wie bereits angedeutet wurde allgemein angenommen, daß die Sauerstoffversorgung der Gewebe hauptsächlich über die Kapillaren erfolgt. Für Gewebe im Ruhezustand deuten neue Erkenntnisse jedoch darauf hin, daß die Sauerstofffreisetzung zu ungefähr gleichen Teilen über die Arteriolen und die Kapillaren stattfindet. Das heißt man geht davon aus, daß das Hämoglobin im arteriellen System etwa ein Drittel seines Sauerstoffgehalts im Arteriolennetzwerk und ein Drittel in den Kapillaren abgibt und der Rest die Mikrozirkulation über das venöse System verläßt. Die Arterien selbst benötigen auch Sauerstoff (d.h. die Arterienwand ist zur Steuerung des Blutstroms durch Kontraktion gegen den Gefäßwiderstand auf Energie angewiesen). An der Arterienwand findet somit eine beträchtliche Diffusion von Sauerstoff aus dem Blut statt. Die heutigen Zusammensetzungen für den Transport von Sauerstoff (z.B. HBOCs) könnten jedoch einen zu großen Teil ihres Sauerstoffgehalts im arteriellen System freisetzen und dadurch eine selbstregulierende Reduktion der Kapillarperfusion induzieren.

Die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs durch die Gefäßwand, d.h. die Summe des für die mechanische Arbeit benötigten Sauerstoffs und des für die biochemische Synthese erforderlichen Sauerstoffs, läßt sich bestimmen, indem man den Gradienten an der Gefäßwand mißt. Die heutige Technologie erlaubt eine genaue Bestimmung des Sauerstoffpartialdrucks in Geweben mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 50 Mikron. Der gemessene Gradient ist zur Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs durch das Gewebe in der Region, in der die Messung vorgenommen wird, direkt proportional. Aus solchen Messungen geht hervor, daß die Gefäßwand einen Sauerstoffgrundverbrauch hat, der bei Entzündungen und Gefäßverengung erhöht und bei einer Gefäßrelaxation erniedrigt ist.

Der Gradient in der Gefäßwand ist umgekehrt proportional zur Gewebeoxygenation. Durch eine Gefäßverengung erhöht sich der Sauerstoffgradient (Gewebestoffwechsel), während der Gradient durch eine Gefäßdilatation erniedrigt wird. Höhere Gradienten deuten darauf hin, daß die Gefäßwand mehr Sauerstoff verbraucht, während weniger Sauerstoff für das Gewebe zur Verfügung steht. Man geht davon aus, daß das gleiche Phänomen in der gesamten Mikrozirkulation auftritt.

Die vorliegende Erfindung zeigt, daß ein erhöhter Blut-PO2-Wert (der sich beispielsweise durch Blutverdünnung erhalten läßt) durch Verabreichung einer herkömmlichen sauerstofftragenden Lösung (z.B. einem HBOC), obwohl auf den ersten Blick von Nutzen aufgrund der veränderten Blutstromeigenschaften und der blutsauerstofftragenden Kapazität der so erhaltenen umlaufenden Flüssigkeit, beträchtliche Nachteile mit sich bringt. Das liegt darin begründet, daß, wenn das den Sauerstoff tragende Hämoglobin gleichmäßig im Blutgefäß verteilt und nicht in roten Blutkörperchen enthalten vorliegt, offensichtlich andere die Sauerstoffzufuhr beeinflussende Faktoren ins Spiel kommen. Mit der vorliegenden Erfindung lassen sich diese Nachteile beheben, indem man eine wässrige Lösung einer sauerstofftragenden Komponente (z.B. modifiziertes Hämoglobin) und einer nicht-sauerstofftragenden Komponente (z.B. einem nicht-proteinartigen Kolloid wie Dextran oder Pentastärke) bereitstellt und anwendet. Neben anderen Eigenschaften lassen sich die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu sehr viel niedrigeren Kosten herstellen als normale HBOCs, und es handelt sich bei ihnen um einen Blutersatzstoff mit erhöhter Viskosität.

Bei 1A–B handelt es sich um eine diagrammatische Querschnittsillustration einer Arteriole mit einer die hindurchgehende Durchflußpassage umhüllenden Wand (2). Die Wand wiederum ist von Muskeln (1) umgeben. Wie bereits angegeben besteht normales Vollblut im wesentlichen aus roten Blutkörperchen (3) und Plasma (4). Im wesentlichen das gesamte (ungefähr 97%) des im Blut transportierten Sauerstoffs ist mit dem Hämoglobin assoziiert und befindet sich in den roten Blutkörperchen (3); und nur etwa 3% des Sauerstoffs ist in der Plasmakomponente.

Dementsprechend ist die Verfügbarkeit von Sauerstoff an der Arterienwand (2) durch die Größe der Oberfläche der roten Blutkörperchen und die Diffusionsgeschwindigkeit des Sauerstoffs durch die Membran der roten Blutkörperchen und das umgebende, nicht in Bewegung befindliche Plasma eingeschränkt. Die Arterienwände erhalten eine Sauerstoffmenge, die dem Abstand zwischen den roten Blutkörperchen und der mittleren Entfernung für die Diffusion der roten Blutkörperchen zur Wand entspricht.

Zu Vergleichszwecken bietet 1B eine diagrammatische Darstellung der Sauerstoffversorgung bei der Perfusion einer Arterie mit einem mit Vollblut gemischten HBOC (5). In diesem Fall ist die direkt sauerstoffbindende Komponente des HBOC homogen im HBOC (5) verteilt, und der Sauerstoff steht für eine Diffusion an alle Teile der Oberfläche der Arterienwand (2) bereit. Die Verfügbarkeit von Sauerstoff an der Arterienwand (2) ist somit stark erhöht, was effektiv einen höheren PO2 im Arteriensystem zur Folge hat. Obwohl bei der vorliegenden Erfindung ein Verständnis der genauen Mechanismen nicht erforderlich ist, wird davon ausgegangen, daß Reaktionen in der Arterienwand und im Muskel (z.B. erhöhter Metabolismus der zellulären Komponenten der Gefäßwände infolge von energieverbrauchenden gefäßverengenden Wirkungen) stattfinden, mit denen versucht wird, den PO2 des Gewebes aufrechtzuerhalten; dies wird dadurch belegt, daß sich über die Arterienwand ein großer Sauerstoffpartialdruckgradient aufbaut, der darauf abzielt, den Sauerstoffpartialdruck in den Arteriolen konstant zu halten. Dies führt dazu, daß es an den Arterienwänden zu einem übermäßig hohen Verlust von Sauerstoff aus der Blut-HBOC-Mischung kommt und gleichzeitig ungenügend Sauerstoff für die Versorgung der Gewebe durch die Kapillaren zur Verfügung steht.

Ein genaues Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen ist für die Anwendung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich; jedoch beruht die vorliegende Erfindung auf der Entdeckung, daß HBOCs dazu neigen, zuviel von dem Sauerstoff, den sie tragen, an den Arterienwänden freizusetzen, was zu einer Reaktion der Arterienwände auf den Sauerstoffüberschuß und zu einem Sauerstoffmangel in den Kapillaren führt. Wie oben angedeutet sind die Forscher bislang davon ausgegangen, daß die Verabreichung eines Blutersatzstoffs (z.B. eines HBOC) physiologische kardiovaskuläre Reaktionen ähnlich den bei der Verabreichung von nicht-sauerstofftragenden Verdünnungsmaterialien mit einem ähnlichen Molekulargewicht zur Folge haben sollte. Es wurde jedoch beobachtet, daß HBOCs physiologische Reaktionen hervorrufen, die sich von den bei nicht-sauerstofftragenden Plasmaexpandern gefundenen unterscheiden. Durch die Verdünnung der roten Blutkörperchen und die damit einhergehende Aufrechterhaltung der intrinsischen Sauerstoffversorgungskapazität der Zusammensetzung (da es sich bei der Blutersatzstoffzusammensetzung selbst um einen Sauerstoffträger handelt) verändert sich die Verteilung von Sauerstoff im Kreislaufsystem und der PO2 im arteriolären Segment erhöht sich. Wie weiter unten diskutiert wird, scheint dies wiederum zu der Reaktion der die Arterienwände auskleidenden Muskeln auf die Verfügbarkeit von überschüssigem Sauerstoff zu führen. Im Gegensatz dazu kommt es bei den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu einer besseren Sauerstoffversorgung der die Kapillaren umgebenden Gewebe.

Wie in der vorherigen Diskussion ausgeführt sollte die Eignung eines Blutprodukts durch eine Analyse seiner systemischen Wirkungen und wie solche Effekte zusammen mit den veränderten Transporteigenschaften der umlaufenden Flüssigkeit die Transportfunktion in der Mikrozirkulation beeinflussen, bestimmt werden.

II. LEICHTERE DIFFUSION UND DIE ENTWICKLUNG VON SAUERSTOFFTRÄGERN AUF HÄMOGLOBINBASIS

Die Gefäßverengung ist eines der verwirrendsten Probleme bei der Entwicklung eines sicheren und wirksamen Ersatzstoffs für rote Blutkörperchen. Bei der Infusion in Tiere und Menschen führen viele Lösungen auf Hämoglobinbasis zu einem beträchtlichen Bluthochdruck, zu einem erhöhten Gefäßwiderstand und zu einem verminderten O2-Transport. Dieses Phänomen wurde sowohl bei den klinisch eingesetzten Modellen für die systemische und die pulmonale Zirkulation (Hess et al., J. Appl. Physiol., 74: 1769–78 [1993], Keipert et al., Transfusion 33: 701–8 [1993]) als auch beim Menschen (Kasper et al., Biochem., 31: 7551–9 [1992]) beobachtet.

Die Wirkung auf die Gefäße wird gewöhnlich der Begierde, mit der sich Hämoglobin mit Stickstoffmonoxid, dem "endothelium-derived relaxing factor", vereinigt, zugeschrieben. Die NO-Affinität von Modellhämoglobinen korreliert jedoch nicht mit der Wirkung auf den mittleren arteriellen Blutdruck in Ratten (Rohlfs et al., in R. M. Winslow et al., (Hrsg.), Advances in Blood Substitutes. Industrial Opportunities and Medical Challenges, Birkhauser, Boston [1997],S. 298–327 [1997]), und es ist möglich, daß ein Überangebot an O2 aufgrund der Diffusion von HbO2 oder ein Entfernen von NO aufgrund der Diffusion von HbNO auch eine weitere, wenn auch nicht alleinige Rolle spielt.

Erhöhte O2-Aufnahmeraten und erhöhte Raten bei der Freisetzung von zellfreiem Hämoglobin verglichen mit roten Blutkörperchen sind vorausgesagt worden (siehe z.B. Homer, Microvasc. Res., 22: 308–23 [1981]; Federspiel und Popel, Microvasc. Res., 32: 164–189 [1986]) und in vitro nachgewiesen worden (Page et al., in R. M. Winslow et al., (Hrsg.), Blood Substitutes: New Challenges, Birkhauser, Boston [1996],S. 132–145). Versuche, einen vermehrten Transport durch O2-Diffusion in vivo durch zellfreies Hämoglobin nachzuweisen, scheiterten jedoch (siehe Biro, Can. J. Physiol. Pharmacol., 69: 1656–1662 [1991]; Hogan et al., Adv. Exp. Med. Biol., 361: 375–378 [1994] und Hogan et al., J. Appl. Physiol., 361: 2470–5 [1992]). Wenngleich es zur Ausführung und Anwendung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, die Mechanismen zu verstehen: bei der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, wie durch Messungen in künstlichen Kapillaren gezeigt wurde, daß zellfreies Hämoglobin in der Tat die Verfügbarkeit von O2 im umgebenden Medium erhöht.

In normalem Blut gelangt O2 durch einfache Diffusion von den roten Blutkörperchen zur Gefäßwand. Ist im Plasmaraum Hämoglobin vorhanden, so kann O2 auch als an Hämoglobin gebundenes HbO2 befördert werden. Dieser zweite Prozeß wird als "vermittelte Diffusion" bezeichnet. Während der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurden die Eigenschaften von zellfreiem Hämoglobin, das diese vermittelte Diffusion moduliert, identifiziert. Mit diesen Kenntnissen wurden Hämoglobine, die durch reduzierte vermittelte Diffusion einen diffusiven O2-Transport ähnlich dem von roten Blutkörperchen zeigen, hergestellt. Es wurde weiterhin bestätigt, daß diese Beispielmoleküle in Tieren keine Gefäßverengung bewirken. Überraschenderweise wurde gefunden, daß eine erhöhte Viskosität, eine erhöhte O2-Affinität (reduzierter P50) und eine erhöhte Molekülgröße die Haupteigenschaften sind, die für ein zellfreies Hämoglobin erforderlich sind, um eine Wirkung auf die Gefäße zu vermeiden und einen Erfolg als Ersatzstoff für rote Blutkörperchen sicherzustellen.

Darüber hinaus betrifft die Lehre der vorliegenden Erfindung die optimalen Eigenschaften von Blutersatzstoffen auf Hämoglobinbasis in Bezug auf Sauerstoffaffinität, Viskosität und Molekülgröße und ein Verfahren zur Bewertung solcher Produkte mit einem Instrument auf Grundlage einer künstlichen Kapillare. Mit diesem Verfahren ist eine quantitative Bestimmung der Fähigkeit eines Blutersatzstoffes zum Transfer von O2 (oder einem beliebigen anderen Gas wie CO2, NO oder CO) über eine Kapillarmembran als Modell eines in-vivo-Gastransfers möglich.

A. Vermittelte Diffusion

Während der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, daß Arteriolen unerwarteterweise insbesondere auf der A2/A3-Ebene große Mengen an O2 verbrauchen. Dies wurde durch ein Verfahren zum Messen der O2-Konzentration in lokalisierten Regionen der Mikrozirkulation (Torres and Intaglietta, Am. J. Physiol., 265: H1434–H1438 [1993]) festgestellt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß diese Arteriolen einer erstaunlichen metabolischen Aktivität fähig sind. Die Versorgung dieser Arteriolen mit Nerven ist besonders dicht (Saltzman et al., Microvasc. Res., 44: 263–273 [1992]), was nahelegt, daß sie den Blutfluß flußabwärts in den Kapillaren steuern. Ausgehend von diesen Ergebnissen sollte man erwarten, daß eine Erhöhung des diesen Arteriolen zur Verfügung stehenden O2 ein starker Stimulus für das Inkraftsetzen von die Zufuhr von O2 zu den Kapillarbetten regulierenden Mechanismen (Autoregulation) sein sollte. Wenngleich ein Verständnis der diesen Ereignissen genau zugrundeliegenden biochemischen Mechanismen zur Anwendung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, wird in Betracht gezogen, daß sie durch O2- oder NO-empfindliche Pfade vermittelt werden könnten; es ist wahrscheinlich, daß das Vorhandensein von freiem Hämoglobin im Plasmaraum wie bei einem "Blutersatzstoff" diese Mechanismen aufgrund seiner Kapazität für eine vermittelte Diffusion in Kraft setzt.

Der Transport von O2 im Blut über zwei Pfade (O2- und HbO2-Diffusion) läßt sich mathematisch ausdrücken. Der Transport (Flux, -J) von O2 zur Gefäßwand ist die Summe der Diffusion von freiem (O2) und chemisch gebundenem (HbO2) Sauerstoff:

wobei DO2 und DHbO2 die Diffusionskonstanten für O2 bzw. zellfreies HbO2 sind, á die Löslichkeit von O2 in Plasma ist, ÄPO2 der Unterschied des O2-Partialdrucks innerhalb und außerhalb des Gefäßes ist, ÄY der Hämoglobinsättigungsgradient vom Zentrum des Blutgefäßes zu dessen Wand ist und [Hb]T die Gesamtkonzentration an zellfreiem Hämoglobin ist. DO2 und DHbO2 wurden experimentell in statischer Lösung gemessen (Tabelle 1). Der Diffusionsabstand ÄX wird für die beiden Moleküle O2 und HbO2 als gleich betrachtet. Die in Tabelle 1 angeführten Literaturstellen sind: Wittenberg, Physiol. Rev., 50(4): 559–636 [1970] und Bouwer, Biochim. Biophys. Acta 1338: 127–136 [1997]).

Tabelle 1

Aus Tabelle 1 geht hervor, daß DHbO2 etwa 1/20tel von DO2 ist. Da jedoch die Löslichkeit von O2 in Plasma gering ist (á = 1,2074 &mgr;M/Torr) und DO2 relativ groß ist, sind, wenn die Plasmahämoglobinkonzentration bei einem PO2 von 100 Torr lediglich 3 mM (4,83 g/dl) beträgt, die Produkte von Diffusion und Konzentration (die Zähler in Gleichung 1) für freies O2 und HbO2 nahezu gleich. Der O2-Beitrag des Plasmahämoglobins entspricht somit dem von gelöstem O2, wodurch sich die aus den roten Blutkörperchen verfügbare Menge an O2 effektiv verdoppelt. Diese Beziehungen sind quantitativ in Tabelle 2 gezeigt.

Um eine Strategie zur Minimierung der vermittelten Diffusion von O2 durch Plasma-HbO2 zu entwickeln, war es erforderlich, die dazu beitragenden biophysikalischen Eigenschaften zu analysieren. Da Wasser sehr viel kleiner ist als HbO2, ist DHbO2 eine Funktion der Viskosität und des Molekülradius, die durch die Stokes-Einstein-Gleichung definiert wird:

wobei k die Boltzmann-Konstante ist, çLösung die Viskosität der Lösung ist und rHbO2 der Radius des Hämoglobinmoleküls (HbO2) ist. Für molekularen Sauerstoff, bei dem der Molekülradius (rO2) ungefähr der gleiche wie der von Wasser ist, wird die Stokes-Einstein-Gleichung zu:

Die Diffusivitäten von sowohl HbO2 als auch O2 stehen somit in einer inversen Beziehung zur Viskosität der makromolekularen Lösungen. Bei zellfreiem Hämoglobin ist die Molekülgröße des Hämoglobins ein zusätzlicher Faktor, da DHbO2 umgekehrt proportional zur Molekülgröße des Hämoglobins (rHbO2 in Gleichung 2) ist. Aus dieser Analyse geht somit hervor, daß zwei mögliche Strategien zur Verminderung bzw. Eliminierung der vermittelten Diffusion durch zellfreies Hämoglobin eine Vergrößerung des Molekülradius des Moleküls und eine Erhöhung der Viskosität der Lösung sein sollten.

Eine eingehendere Analyse von Gleichung 1 führt zu einer Einsicht in eine weitere Strategie, mit der man diesen Mechanismus schlagen kann. Der Gradient, an dem HbO2 entlangdiffundiert, ist [Hb]1ÄY, und die Strecke, über die HbO2 diffundieren muß, ist (ÄXHbO2). Die Menge ÄY bei einem gegebenen PO2 ist die Steigung der Sauerstoffgleichgewichtskurve bei diesem PO2, die von der Form der Kurve (eine Eigenschaft des Hämoglobinmoleküls) und deren Position (d.h. P50) abhängt.

Zusammenfassend kann der gesamte in einen zylindrischen Abschnitt des Krogh-Zylinders (siehe 1) transferierte O2 wie folgt beschrieben werden:

In dieser Gleichung ist r der Radius der Kapillare und R die Fließgeschwindigkeit. Die Gleichung zeigt den Beitrag der HbO2-Diffusion am gesamten O2-Transport. Diese Form der O2-Transfergleichung hat die interessante Eigenschaft, daß aus ihr hervorgeht, daß der Beitrag der HbO2-Diffusion von 4 Variablen abhängt: der Diffusionskonstante (DHbO2), der Hämoglobinkonzentration ([Hb]T), der Differenz der Sättigung zwischen dem Zentrum und dem Rand der Kapillare (ÄY) und der Diffusionsstrecke von HbO2 (ÄXHbO2).

Gleichung 4 enthüllt eine Reihe von Strategien, die sich unabhängig voneinander oder gemeinsam zur Modulation des O2-Flux (ÄO2T) anwenden lassen. Die Strategien sind durch die Beziehung von ÄO2T zu den veränderlichen Eigenschaften der Lösung definiert, so daß für ÄO2T gilt.

  • (1) umgekehrt proportional zur Viskosität (ç) der Lösung, gemäß Gleichungen 2 und 3, über Änderungen sowohl bei DO2 als auch DHbO2;
  • (2) umgekehrt proportional zur Molekülgröße (rHbO2), gemäß Gleichung 2, über eine Änderung von DHbO2;
  • (3) direkt proportional zu [Hb]T und
  • (4) direkt proportional zu ÄY (ÄY läßt sich ändern, indem man die O2-Affinität und/oder die Kooperativität der O2-Bindung verändert).

Zur Minimierung der Effekte der vermittelten Diffusion auf die ÄO2T von zellfreien Sauerstoffträgern auf Hämoglobinbasis läßt sich eine gegebene ÄO2T auf Basis der Wertes für rote Blutkörperchen somit unter Anwendung der obigen Strategien unabhängig voneinander oder in Kombination erzielen. So läßt sich beispielsweise die ÄO2T auf einen gewünschten Bereich reduzieren, indem man:

  • (1) einen einzelnen Parameter unabhängig von den anderen ändert, indem man
  • – ç erhöht
  • – rHbO2 erhöht
  • – [Hb]T reduziert oder
  • – ÄY über seine O2-Affinität und/oder Kooperativität einstellt
  • (2) eine Kombination der obigen Eigenschaften so ändert, daß ÄO2T im gewünschten Bereich ist.

B. Bewertung von zellfreien Hämoglobinen

Die Bewertung von zellfreien Hämoglobinen hinsichtlich ihrer vermittelten Sauerstoffdiffusion und somit ihrer Fähigkeit zum Hervorrufen einer selbstregulierenden Wirkung auf die Arteriolen beruht auf dem Krogh-Zylinder, einem idealisierten Gefäßsegment (siehe 13). Über eine detaillierte Analyse der Form und Position der Sauerstoffgleichgewichtskurve wird die Menge an in diese sensible Region transportiertem Sauerstoff als Funktion von Diffusion, Hämoglobinkonzentration und P50 analysiert.

1. Künstliches Kapillarsystem

Das künstliche Kapillarsystem ist diagrammatisch in 14 gezeigt. Bei der Kapillare handelt es sich um Polydimethylsiloxan (z.B. Silastic, Point Medical Corporation, Crown Point, IN, USA) mit einer Wandstärke, die ungefähr so groß ist wie der Durchmesser (57 &mgr;m). Die Glaskapillare ist eine 2-&mgr;l-Pipette (z.B. Drummond Scientific, Broomall, PA, USA). Der Übergang vom Glas zum Silikon wird mit einem Silikondichtungsmaterial abgedichtet (z.B. RTV 60, General Electric). Die typische Länge der Kapillare, 100 mm, führt zu Verweilzeiten, die den in-vivo-Zeiten ähnlich sind (d.h. 0.37 sec–1,5).

Die Infusionsspritzenpumpe (z.B. KD Scientific, Boston, MA, USA) ist über einen kurzen Tygon-Schlauch, der eine geringe Durchlässigkeit aufweist, mit der Eingangs-Sauerstoffdurchflußzelle verbunden. Die Sauerstoffelektroden von Clark-Typ (z.B. Instech, Plymouth Meeting, PA, USA) werden zur Kontrolle des Systems verwendet. Die Daten werden gesammelt, indem man die abfließende Flüssigkeit mit einem Gerät für die Blutgasanalyse (ABL-5, Radiometer) analysiert. Der Ausgang der Zelle ist mit einem weiteren kurzen Stück Tygon-Schlauch verbunden, das wiederum mittels eines Mikroschlauchverbinders (z.B. Cole-Palmer, Niles, IL, USA) fest an der Glaskapillare der Silikonkapillareinheit angebracht ist. Die künstliche Kapillare ist von einer gasdichten, aus durchsichtigem Acrylkunststoff hergestellten Austauschkammer umgeben. Um eine richtige Steuerung der Temperatur auf einen konstanten Wert von 37°C sicherzustellen, sind nahe der Punkte, an denen der Flüssigkeitsstrom ein- und austritt, Bimetall-Temperatursonden (z.B. YSI 700, Yellow Springs, OH, USA) angebracht.

Die Sammelzelle wird mittels Silikondichtungsmaterial und Polypropylen-Mikroverbindungsstück (Cole-Palmer) direkt an das Ende der künstlichen Kapillareinheit angepaßt. Die Sammelzelle besteht aus einem Acrylblock mit einem dadurch gebohrten T-förmigen Kanal (Durchmesser 0,75 mm). Der erste Kanal wird über einen geeichten Meßschlauch, der als Durchflußmesser dient, geführt. Der Durchflußmesser kann zur Kontrolle der Systembedingungen von Zeit zu Zeit durch eine Sauerstoffelektrode ersetzt werden. Der zweite Durchflußkanal ist auf die Rückseite der Sammelzelle gerichtet, deren Ausgang mit einem gasdichten Septum verschlossen ist. Eine gasdichte Hamilton-Spritze (Hamilton Co., Reno, NV, USA) durchsticht das Septum und entnimmt die Probe, wenn eine Spritzenpumpe langsam mit einer Geschwindigkeit, die niedriger ist als die Fließgeschwindigkeit in der Kapillare, Flüssigkeit entnimmt. Die gesamte Apparatur ist in einem Acrylcontainer eingeschlossen, in dem die Temperatur mittels eines Heizlüfters auf 37°C gehalten wird.

2. Versuchsprotokoll für die künstliche Kapillare

Die äquilibrierten Proben werden vom Druckmesser in die gasdichte Hamilton-Spritze aspiriert, die an der Infusionspumpe angebracht ist. Damit man auf die gewünschte Verweilzeit kommt, wird eine über das gesamte System konstante Fließgeschwindigkeit eingestellt. Die Testlösungen werden mit 20% O2, wobei der Rest aus Stickstoff besteht, äquilibriert, um Luft zu simulieren. Die die Kapillare umgebende Kammer wird mit 100 N2 gefüllt. Das einströmende Gas wird über ein 37°C warmes Wasserbad und einen Durchflußmesser zum Aufrechterhalten einer konstanten Durchflußgeschwindigkeit geführt, so daß das Gasvolumen in der Kammer alle 10 Sekunden ausgetauscht wird. Das extrakapilläre Gaskompartment wird mit Sauerstoffelektroden kontrolliert.

Die aus der Kapillare ablaufende Flüssigkeit wird in einer zweiten gasdichten Hamilton-Spritze gesammelt und in das Gerät zur Blutgasanalyse (z.B. ABL-5, Radiometer, West Lake, OH, USA) injiziert. Für jede Verweilzeit werden mindestens drei Proben entnommen. Die Durchflußbedingungen werden verändert, und ein neuer Satz Proben wird getestet. Drei Durchflußgeschwindigkeiten von 10, 20 und 40 &mgr;l/min ergeben Verweilzeiten in der Kapillare von 1,56, 0,75 beziehungsweise 0,39 Sekunden.

3. Mathematische Analyse der Daten von der künstlichen Kapillare

Für die einzelnen Streckensegmente (dx, 13) entlang der Kapillare beträgt der Gesamt-O2-Wert in der Lösung:

wobei á der Löslichkeitkoeffizient von O2 im Plasma (1,2074 &mgr;M/Torr)(Winslow et al., J. Biol. Chem., 252(7): 2331–2337 [1977]) ist, Y die Hämoglobinsättigung ist und [Hb]T die Hämoglobingesamtkonzentration ist. Die Menge an im Segment dx aus der Kapillare transferiertem O2 ist
wobei K* ein zusammengefaßter Diffusionsparameter ist, der sich aus den in Gleichung 1 angegebenen Diffusionskonstanten und der Länge des Diffusionsgradienten für O2 zusammensetzt, ÄPO2 der PO2-Gradient ist (im wesentlichen der innere PO2, wenn es sich bei dem Gas außen um N2 handelt), r der Radius der Kapillare ist und R die Fließgeschwindigkeit ist. Der Gesamt-O2-Wert ist jetzt um ÄO2 verringert. An diesem Punkt bestimmt man mit den bekannten Parametern für das betreffende Hämoglobin unter Anwendung der Adair-Gleichung empirisch die Kombination aus PO2 und Y, die nach Gleichung (5) den neuen O2T liefert. Das Verfahren wird wiederholt, bis man das Ende der Kapillare erreicht, und der letzte PO2-Wert wird dem eigentlichen im Experiment gemessenen Wert zugeordnet. Diese Analyse der finiten Elemente von dx erfolgte mit Hilfe eines FORTRAN-Programms. Die Experimente wurden unter Anwendung dieser Methoden und Geräte wie unten im experimentellen Teil beschrieben durchgeführt (siehe Beispiel 16).

C. Mögliche Hämoglobinmodifikationen

Kein gegenwärtig in der Entwicklung befindliches Produkt kann alle Funktionen von Blut erfüllen. Statt dessen unterscheiden sich diese Blutproduktlösungen von anderen Plasmaexpandern dadurch, daß sie den verfügbaren Gesamtsauerstoff erhöhen. Es gibt zwei allgemeine Typen dieser Produkte: die, bei denen mehr gelöster Sauerstoff vorliegt (d.h. Perfluorkohlenstoffe), und die, die Sauerstoff chemisch an Hämoglobin gebunden tragen (O2-Träger auf Hämoglobinbasis). Zwischen den beiden Typen gibt es beträchtliche Unterschiede, und sie transportieren Sauerstoff auf fundamental verschiedene Weise.

Hämoglobin ist ein Protein, das aus 4 Polypeptid-Untereinheiten besteht, 2 á- und 2 â-Ketten. Jeweils eine von beiden bilden eng miteinander verbunden ein halbes Molekül (á,â-Dimer), und zwei Dimere sind etwas weniger eng miteinander zum voll funktionsfähigen Molekül (á2â2-Tetramer) verbunden. Die Grenzfläche zwischen den á,â-Dimeren gleitet bei der reversiblen Bindung von O2 auseinander, wodurch zwei Strukturen gebildet werden, von denen die eine der vollständig deoxygenierten (T, tense) und die andere der vollständig oxygenierten (R, relaxed) Struktur entspricht. Diese beiden Konformere haben enorm unterschiedliche O2-Affinitäten, so daß bei der aufeinanderfolgenden Bindung der O2-Moleküle und dem Übergang von Desoxy zu Oxy die O2-Affinität zunimmt. Diese Affinitätsänderung wird als "Kooperativität" bezeichnet und durch den Hill-Koeffizienten n wiedergegeben (13).

Die lose Grenzfläche zwischen den á,â-Dimeren ist bei Blutersatzstoffen auf Hämoglobinbasis von entscheidender Wichtigkeit. Die Gleichgewichtskonstante für diese Dissoziationsreaktion beträgt für HbO2 10–6 M, was bedeutet, daß der relative Anteil dimerer Moleküle mit fallender Hämoglobinkonzentration zunimmt. Diese Dimere werden in den Glomeruli der Niere schnell und effektiv herausfiltriert. Zu den Mechanismen zum Entfernen von Dimeren beim Eintreten einer milden Hämolyse zählt die Haptoglobinbindung, durch die freies Hämoglobin in Konzentrationen von bis zu 200 mg/dl entfernt werden kann. Wird diese Schwelle überschritten, ist die Clearance von Hämoglobin über die Nieren sehr hoch, und es kann zu einer renalen Toxizität kommen.

Es sind viele chemische Modifikationen von Hämoglobin entwickelt worden (siehe Tabelle 3). Die Zwecke dieser Modifikationen sind das Verhindern der Tetramer-Dimer-Dissoziation, das Modulieren der Sauerstoffaffinität und eine Verlängerung der Retention in den Gefäßen. Hierbei macht man sich die verschiedenen reaktiven Stellen an der Oberfläche des Hämoglobins, in seiner inneren Hohlraum und am Aminoterminus zunutze. Eine der für Forscher am nützlichsten Modifikationen (áá-Hämoglobin, DCLHbTM, HemAssistTM) beeinhaltet eine einzelne Quervernetzung zwischen einem Lysin-99-Rest von Desoxyhämoglobin mit dem Reagens DBBF (Walder et al., J. Mol. Biol., 141: 195–216 [1980]). Durch diese einzelne Modifikation werden die á,â-Dimere sofort miteinander verbunden und die O2-Affinität von zellfreien Molekülen wird auf ungefähr die von intakten menschlichen roten Blutkörperchen reduziert. Erfolgt die Quervernetzung mit oxygeniertem Hämoglobin, ändern sich die Dimensionen des inneren Hohlraums soweit, daß es zu einer Reaktion zwischen â 82-Lysinen kommt. In disem Fall weist das letztendlich erhaltene quervernetzte Produkt eine sehr viel höhere O2-Affinität als die des quervernetzten Desoxyprodukts auf. Dieses Material läßt sich ebenfalls leicht herstellen, wurde jedoch weniger intensiv untersucht, da man traditionell davon ausging, daß seine O2-Affinität zu hoch wäre, um von physiologischem oder klinischem Nutzen zu sein.

Tabelle 3

Eine andere einzigartige Klasse von Quervernetzern, Trimesinsäurederivate, führen zu Reaktionen an 2 oder 3 Punkten (Kluger et al., Biochem., 31: 7551–7559 [1992]). Ersten Berichten zufolge scheinen die mit diesen hergestellten Hämoglobine stabil zu sein, und die Umsetzung scheint hochspezifisch zu verlaufen.

Eine Variation dieses Hämoglobins mit einem Molekulargewicht von 64.000 kD ist das genetisch gewonnene "rHb1.1" (Looker et al., Nature 356: 258–260 [1992]), bei dem die Quervernetzung genetisch erfolgt. In diesem Fall werden 2 á-Ketten-Gene so in das E. coli-Genom eingebracht, daß bei der Transkription ein einzelnes Genprodukt entsteht, in dem die eine á-Kette benachbart zur anderen ist (Dialpha-Peptid). Das Produkt hat somit ein Molekulargewicht von 64.000 kD und dissoziiert nicht in seine Dimere. Seine physiologischen Eigenschaften ähneln denen von áá-Hämoglobin.

Andere Quervernetzungsmittel sind Analoga von 2,3-DPG. NFPLP, ein Prototyp eines solchen Quervernetzers, bindet in der 2,3-DPG-"Tasche" zwischen den â-Ketten und hat die zweifache Wirkung, daß es die Dimerisierung verhindert und die O2-Affinität reduziert. Dieses Produkt ist eingehend untersucht worden (Bleeker et al., Biomater. Artific. Cells Immobil. Biotechnol., 20: 747–750 [1992]), jedoch ist der Quervernetzer selbst schwer zu synthetisieren, und in der Praxis wurde keine Maßstabsvergrößerung erzielt.

Konjugierte Hämoglobine sind die, an deren Oberfläche ein modifizierendes Molekül angebracht wurde (siehe z.B. Nho et al., Biomat. Artif. Cells Immobil. Biotechnol., 20: 511–524 [1992]). Zu den modifizierenden Gruppen zählen Polyethylenglycol (PEG), Polyoxyethylen (POE) und Dextran. Diese Produkte haben in Abhängigkeit von der Anzahl und der Größe der modifizierenden Gruppen höhere Molekulargewichte, sind jedoch relativ einfach herzustellen. Durch ein Vergrößern der Molekülgröße läßt sich im Fall von POE und PEG auch die Hydratationsschale um das Proteinmolekül vergrößern und dadurch die Reaktion von Hämoglobin mit anderen Molekülen in der zellfreien Umgebung einschränken.

Schließlich können auch nichtspezifische Reagentien mit einer der 44 å-Aminolysingruppen auf der Oberfläche des Hämoglobins oder einer der 4 Aminoterminalengruppen reagieren. Zu diesen bifunktionellen Reagentien zählen Glutaraldehyd und o-Raffinose, die in wenigstens drei der gegenwärtig in der klinischen Erprobung befindlichen Produkte zur Anwendung gekommen sind. Während das chemische Verständnis der Modifikationsreaktionen gut ist, ist das Ausmaß der Umsetzung manchmal schwer zu kontrollieren, und man kann Produkte mit einer Reihe verschiedener Molekulargewichte erhalten (Marini et al., Biopolymers 29: 871–882 [1990]).

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verbesserung der derzeitigen auf Hämoglobin basierenden Ersatzstoffe roter Blutkörperchen bereit, bei denen es ernste Probleme gibt. Im allgemeinen läßt sich die Molekülgröße durch Polymerisieren des Hämoglobins mit polyfunktionellen Quervernetzern oder durch Oberflächenkonjugation an Polymere wie PEG, Dextran oder andere Stärken, Kohlenhydrate oder Proteine erhöhen. Die Viskosität läßt sich durch Konjugation an PEG oder dessen Analoga erhöhen. Die Viskosität der Lösung läßt sich durch Formulieren mit einem hochviskosen Material wie Pentastärke, Dextranen, Kohlenhydraten oder Proteinen, die ihrerseits zähflüssig sind, erhöhen. Schließlich läßt sich die Sauerstoffaffinität erhöhen, indem man Hämoglobin im R-Konformationszustand intramolekular quervernetzt. Dies läßt sich bewerkstelligen, indem man das Hämoglobin mit O2, CO oder einem anderen Liganden umgibt, der die R-Konformation bevorzugt. Zu den Beispielen für spezifische Veränderungen bei der Herstellung modifizierter Hämoglobine, die als zellfreie Sauerstoffträger eingesetzt werden sollen, zählen die folgenden.

1. áá-Hämoglobin

Dieses Hämoglobin, das ursprünglich als Modellverbindung für Untersuchungen durch die US-Armee entwickelt wurde, wird von Baxter Healthcare hergestellt und als Ersatz für menschliches Blut für die Zeitspanne unmittelbar nach Operationen und bei ausgewählten Traumapatienten getestet. Sowohl von der Armee als auch von Baxter wurde berichtet, daß dieses Produkt einen beträchtlichen Blutdruck- und Gefäßwiderstandsanstieg hervorruft, und präklinische Studien haben gezeigt, daß durch diese unerwünschten Eigenschaften jegliche durch die Verabreichung von Hämoglobinlösung gewonnenen Vorteile zunichte gemacht werden (siehe z.B. Hess et al., J. Appl. Physiol., 74: 1769–1778 [1993]).

In seiner derzeitigen Formulierung hat áá-Hb eine niedrige Viskosität (ungefähr 1 cP, Schergeschwindigkeit 160 s–1, 37°C), eine hohe [Hb] von ungefähr 10 g/dl, eine Molekülgröße, die der von tetramerem Hämoglobin entspricht, und seine Sauerstoffaffinität ist ähnlich der von Blut oder niedriger. Die vorliegende Erfindung stellt áá-Hämoglobin bereit, dessen Viskosität durch Formulieren in Pentastärke oder einem anderen hochviskosen Kolloid erhöht wurde. Viskosität und Molekülgröße lassen sich auch durch Oberflächenkonjugation mit PEG oder andere geeignete Methoden zur Oberflächendekoration erhöhen. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung mit einer niedrigeren [Hb] formuliert werden. Zusätzlich läßt sich die Sauerstoffaffinität durch Anwendung von Quervernetzungschemie mit DBBF erhöhen, wobei sich das Hämoglobin-Ausgangsmaterial in einem hochaffinen (z.B. mit CO- oder O2-Liganden) Konformationszustand befindet.

Die vorliegende Erfindung stellt somit Verfahren zur Verbesserung dieser Zusammensetzung durch Absenken ihres P50 bereit, beispielsweise durch Quervernetzen des Hämoglobins in einem ligandentragenden (z.B. CO oder O2) Zustand, und indem man seine Molekülgröße durch Oberflächendekoration mit PEG oder anderen Materialien, die seinen Molekülradius und seine Viskosität erhöhen, erhöht. Die Diffusion von O2 in einer áá-Hämoglobinlösung könnte durch Formulieren in Pentastärke reduziert werden.

2. rHb1.1

Rekombinantes Hämoglobin (z.B. OptroTM, Somatogen) läßt sich unter Verwendung verschiedener Wirte (z.B. Bakterien) gewinnen. Das gegenwärtig verfügbare Hämoglobin besteht hauptsächlich aus kondensierten á-Ketten und der Einführung einer Mutation (Presbyterian), durch die seine Sauerstoffaffinität reduziert wird. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verbesserung dieses Produkts durch Absenken seines P50 bereit, beispielsweise indem man die Presbyterian-Mutation eliminiert oder andere Mutationen einführt, die seine Sauerstoffaffinität erhöhen oder die Kooperativität reduzieren, und indem man seine Molekülgröße durch Oberflächendekoration mit PEG oder anderen Materialien, die seinen Molekülradius und seine Viskosität erhöhen, vergrößert. Die Diffusion von O2 in einer OptroTM-Lösung könnte durch Formulieren in Pentastärke reduziert werden.

In seiner derzeitigen Formulierung hat rHb1.1 eine niedrige Viskosität, seine Molekülgröße entspricht der von tetramerem Hämoglobin und seine Sauerstoffaffinität ist ähnlich der von Blut oder niedriger. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Erhöhen der Viskosität von rHb1.1 durch Formulieren in Pentastärke oder einem anderen hochviskosen Kolloid bereit. Darüber hinaus kann man seine Viskosität und Molekülgröße durch Oberflächenkonjugation mittels Oberflächenkonjugation mit PEG oder durch andere geeignete Methoden zur Oberflächendekoration erhöhen. Weiterhin kann es mit einer niedrigen [Hb] formuliert werden.

3. PHP (pyridoxyliertes Hämoglobinpolyoxyethylen)

PHP (pyridoxyliertes Hämoglobinpolyoxyethylen; z.B. Apex Bioscience). Dieses Hämoglobin stammt aus einer menschlichen Quelle, wird zur Erhöhung seines P50 mit Pyridoxalphosphat (PLP) umgesetzt und dann mit einer Polyethylenglycolform oberflächenmodifiziert. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verbesserung dieses Produkts durch Eliminieren der Umsetzung mit PLP, durch Quervernetzen im mit Liganden (z.B. CO oder O2) versehenen Zustand und durch umfassendere Oberflächendekoration mit PEG entweder durch Erhöhen der Anzahl von PEG-Strängen pro Molekül oder durch Verlängerung der einzelnen PEG-Stränge bereit. Die Diffusion von O2 in einer PHP-Lösung könnte durch Formulieren in Pentastärke reduziert werden.

So, wie es derzeit formuliert wird, hat PHP eine mittlere Viskosität von ungefähr 2 cP (unter den hier beschriebenen Bedingungen), eine hohe [Hb] von ungefähr 8 g/dl, seine Molekülgröße ist etwas mehr als doppelt so groß wie ein Hämoglobintetramer und seine Sauerstoffaffinität ist etwas größer als die von Blut. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Erhöhen der Viskosität dieses Produkts durch Formulieren in Pentastärke oder einem beliebigen hochviskosen Kolloid bereit. Seine Viskosität und Molekülgröße lassen sich durch umfassendere Oberflächendekoration mit PEG entweder durch Erhöhen der Anzahl von PEG-Strängen pro Molekül oder durch Verlängerung der einzelnen PEG-Stränge erhöhen. Es kann auch bei einer niedrigeren [Hb] formuliert werden und/oder seine Sauerstoffaffinität kann erhöht werden, indem man das PLP während der Hämoglobinmodifikationsreaktion eliminiert.

4. HemoLinkTM

HemoLinkTM (Hemosol Ltd.) ist ein vom Menschen gewonnenes Hämoglobinprodukt mit einem sehr hohen P50 und ist mit o-Raffinose, einem multifunktionellen Quervernetzer, polymerisiert. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verbesserung des Produkts durch Quervernetzen des mit Liganden (z.B. CO oder O2) versehenen Proteins und durch Vergrößerung seines Molekülradius und seiner Viskosität bereit. Dies ließe sich durch Oberflächendekoration mit einem beliebigen PEG-Derivat oder Konjugation an ein Polysaccharid oder ein anderes Polymer, das seine Molekülgröße erhöhen würde, erreichen. Die Diffusion von O2 in einer HemoLinkTM-Lösung könnte durch Formulieren in Pentastärke reduziert werden.

So, wie es derzeit formuliert wird, hat HemoLinkTM eine niedrige Viskosität (ca. 1,4 cP unter unseren Meßbedingungen), eine hohe [Hb] von ungefähr 10 g/dl, seine Molekülgröße ist etwa 1,7mal so groß wie die von tetramerem Hämoglobin, und es hat, verglichen mit Blut, eine niedrige Sauerstoffaffinität. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Erhöhen der Viskosität durch Formulieren in Pentastärke oder einem beliebigen hochviskosen Kolloid bereit. Seine Viskosität und Molekülgröße lassen sich durch Oberflächenkonjugation mittels Oberflächenkonjugation mit PEG oder durch andere geeignete Methoden zur Oberflächendekoration erhöhen. Darüber hinaus kann es bei einer niedrigeren [Hb] formuliert werden. Seine Sauerstoffaffinität läßt sich erhöhen, indem man seine Polymerisierungsumsetzungen mit o-Raffinose mit dem Hämoglobinausgangsmaterial in einem hochaffinen Konformationszustand (z.B. mit CO- oder O2-Liganden) durchführt.

5. HemoPureTM

HemoPureTM (Bio-Pure) ist ein von Rindern gewonnenes Hämoglobinprodukt mit einem mäßig hohen P50, und es ist mit Glutaraldehyd, einem bifunktionellen Quervernetzer, polymerisiert. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verbesserung des Produkts durch Quervernetzen des mit Liganden (z.B. CO oder O2) versehenen Proteins und durch Vergrößerung seines Molekülradius und seiner Viskosität bereit. Dies ließe sich durch Oberflächendekoration mit einem beliebigen PEG-Derivat oder Konjugation an ein Polysaccharid oder ein anderes Polymer, das seine Molekülgröße erhöhen würde, erreichen. Die Diffusion von 02 in einer HemoPureTM-Lösung könnte durch Formulieren in Pentastärke reduziert werden.

6. PolyhemeTM

PolyhemeTM (Northfield Laboratories) ist ein von Menschen gewonnenes Hämoglobinprodukt mit einem mäßig hohen P50 aufgrund einer Umsetzung mit PLP, und es ist mit Glutaraldehyd, einem bifunktionellen Quervernetzer, polymerisiert. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verbesserung des Produkts durch Quervernetzen des mit Liganden (z.B. CO oder O2) versehenen Proteins durch Eliminieren des PLP und durch Vergrößerung seines Molekülradius und seiner Viskosität bereit. Dies ließe sich durch Oberflächendekoration mit einem beliebigen PEG-Derivat oder Konjugation an ein Polysaccharid oder ein anderes Polymer, das seine Molekülgröße erhöhen würde, erreichen. Die Diffusion von O2 in einer PolyhemeTM-Lösung könnte durch Formulieren in Pentastärke reduziert werden.

So, wie es derzeit formuliert wird, hat PolyhemeTM eine hohe [Hb] von ungefähr 10 g/dl, seine Molekülgröße ist aufgrund der Polymerisierung größer als die von tetramerem Hämoglobin, und seine Sauerstoffaffinität ist durch die Umsetzung mit PLP herabgesetzt. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Erhöhen der Viskosität durch Formulieren in Pentastärke oder einem beliebigen hochviskosen Kolloid bereit. Seine Viskosität und Molekülgröße lassen sich durch Oberflächenkonjugation mittels Oberflächenkonjugation mit PEG oder mittels anderer Verfahren der Oberflächendekoration erhöhen. Auch kann es bei einer niedrigeren [Hb] formuliert werden. Seine Sauerstoffaffinität läßt sich erhöhen, indem man seine Polymerisierungsumsetzungen mit Glutaraldehyd in Abwesenheit von PLP und mit dem Hämoglobinausgangsmaterial in einem hochaffinen Konformationszustand (z.B. mit CO- oder O2-Liganden) durchführt.

7. PEG-Hb

Im Handel erhältliche PEG-Hb-Zusammensetzungen (z.B. Enzon) können unter Anwendung der vorliegenden Erfindung verbessert werden, indem man seine Konzentration herabsetzt und es in Pentastärke formuliert. Das Hämoglobin von Enzon besteht aus einem Rinderhämoglobin, das durch Konjugation an lineare 5000 MG Polyethylenglycolketten (PEG-Ketten) modifiziert ist. Polyalkylenoxid ist ein allgemeiner Ausdruck für eine Molekülgruppe, die PEG einschließt. Eine Anbindung von PAO an Hämoglobin wird durch Bildung einer kovalenten Bindung zwischen dem POA und den å-Aminogruppen von Lysinresten erzielt. Das Hämoglobin von Enzon ist mit 10–12 PAO-Ketten pro Hämoglobintetramer konjugiert. Eine 5 g/dl-Lösung des PEG-Hb von Enzon hat eine Viskosität von 3,39 cP, gemessen bei einer Schergeschwindigkeit von 160 s–1 und 37°C.

So, wie es derzeit formuliert wird, hat PEG-Hb eine Viskosität von ungefähr 3,5 cP (unter den hier beschriebenen Bedingungen) bei einer [Hb] von 5,5 g/dl, seine Molekülgröße ist viermal so groß wie die von tetramerem Hämoglobin, und es hat eine im Vergleich zu Blut hohe Sauerstoffaffinität. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Erhöhen der Viskosität dieses Produkts bei niedrigerer [Hb] durch Formulieren in Pentastärke oder einem beliebigen hochviskosen Kolloid bereit. Weiterhin lassen sich seine Viskosität und Molekülgröße durch umfassendere Oberflächendekoration mit PEG entweder durch Erhöhen der Anzahl von PEG-Strängen pro Molekül oder durch Verlängerung der einzelnen PEG-Stränge erhöhen. Es kann auch bei einer niedrigeren [Hb] formuliert werden.

Zusätzliche Verfahren zur Erhöhung der Viskositätseinheit (ç, cP) pro Konzentrationseinheit ([Hb], g/dl) einer Hämoglobinlösung schließen die folgenden ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt:

1. Erhöhen der Anzahl der mit 5000 MG PAO konjugierten Stellen pro Hämoglobintetramer

Menschliches Hämoglobin enthält 44 Lysinreste (auf jeder Kette 11). Zusammen mit den 4 N-terminalen Aminogruppen sind dies 48 Stellen, die theoretisch für eine kovalente Anbindung von PAO unter Anwendung der hier beschriebenen Chemie zur Modifikation von Aminogruppen zur Verfügung stehen. Es wurden weitere chemische Umsetzungen beschrieben (siehe beispielsweise die US-Patentschrift Nr. 5,585,484 von Acharya, die hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung wird), mit denen es möglich ist, PAO kovalent an die Sulfhydrylgruppen eines Cysteinrests anzubinden. Es gibt 6 Cysteinreste pro Hb-Tetramer (d.h. einen auf jeder á-Kette und zwei auf jeder â-Kette), wodurch sich die Anzahl theoretisch möglicher Anbindungen auf 54 erhöht. Weitere PAO-Modifikationen werden in Betracht gezogen, einschließlich der Anwendung von geeigneten Konjugationsreaktionen, die zur Anbindung an Serin-, Threonin-, Tyrosin-, Asparagin-, Glutamin-, Arginin- und Histidinreste führen. Es wird ebenfalls in Betracht gezogen, daß es über chemische Umsetzungen, die eine Konjugation an Carbonsäuregruppen erlauben, möglich sein könnte, PAO mit Asparaginsäure- und Glutamsäureresten sowie den C-terminalen Carboxygruppen von Hämoglobin zu konjugieren.

Ist die Anzahl von Konjugationsstellen pro Tetramer ausreichend groß, so wird in Betracht gezogen, daß sich selbst ohne die hier beschriebenen Modifikationen mit PAO-Molekülen einer niedrigeren Molekülmasse (d.h. MG < 5000) noch eine verglichen mit dem Produkt von Enzon erhöhte Viskosität pro Konzentrationseinheit erzielen läßt.

2. Konstanthalten der Anzahl kovalenter PAO-Anbindungen und Erhöhen der Größe der einzelnen PAO-Einheiten

Eine erhöhte Viskosität pro Hämoglobinkonzentrationseinheit wird in Situationen in Betracht gezogen, bei denen die an die 10–12 Stellen pro Tetramer gebundenen PAO-Gruppen eine größere Molekülmasse (d.h. MG > 5000) aufweisen. Dies läßt sich erzielen, indem man PAO-Ausgangsmaterial verwendet, das aus Molekülen mit längeren und/oder verzweigten PAO-Ketten besteht.

Ist die Molekülgröße der PAO-Einheiten ausreichend groß, kann es möglich sein, eine geringere Anzahl von Stellen auf dem Tetramer (d.h. < 10) zu modifizieren und dennoch eine im Vergleich zum Produkt von Enzon erhöhte Viskosität pro Konzentrationseinheit zu erzielen.

IV. DIE SAUERSTOFFTRAGENDE KOMPONENTE DER BLUTPRODUKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG

Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der sauerstofftragenden Komponente um natives oder modifiziertes Hämoglobin (z.B. einen HBOC). Modifiziertes Hämoglobin wird durch chemische Umsetzungen (z.B. Quervernetzen oder Polymerisieren) oder durch die Addition von Addukten (z.B. Polyethylenglycol, Polyoxyethylen) verändert. Weiterhin kann es sich bei der sauerstofftragenden Komponente der vorliegenden Erfindung um rekombinant hergestelltes Hämoglobin oder ein in einem Liposom verkapseltes Hämoglobinprodukt handeln. In der vorliegenden Erfindung wird auch die Verwendung anderer Mittel für den Sauerstofftransport in Betracht gezogen, bei denen es sich nicht um Hämoglobin oder modifiziertes Hämoglobin handelt.

Wenngleich bei der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer beliebigen sauerstofftragenden Komponente in Betracht gezogen wird, umfassen bevorzugte sauerstofftragende Komponenten Lösungen von menschlichem oder tierischem (z.B. Rinder-) Hämoglobin, das intramolekular quervernetzt ist, um eine Dissoziation in die dimere Form zu verhindern. Die bevorzugten sauerstofftragenden Komponenten der vorliegenden Erfindung können gegebenenfalls zu Oligomeren mit einem Molekulargewicht von bis zu 750.000 Dalton, vorzugsweise bis zu 500.000 Dalton, oligomerisiert sein. Zu den bevorzugten sauerstofftragenden Komponenten zählen auch Hämoglobinzubereitungen, die durch genetische Manipulationen und rekombinante Verfahren hergestellt wurden.

Die bevorzugten sauerstofftragenden Komponenten der vorliegenden Erfindung sollten stromafrei und endotoxinfrei sein. Repräsentative Beispiele bevorzugter sauerstofftragender Komponenten sind in einer Reihe erteilter US-Patentschriften einschließlich 4,857,636 (an Hsia), 4,600,531 (an Walder), 4,061,736 (an Morris et al.), 3,925,344 (an Mazur), 4,529,719 (an Tye), 4,473,496 (an Scannon), 4,584,130 (an Bocci et al.), 5,250,665 (an Kruger et al.), 5,028,588 (an Hoffman et al.) und 4,826,811 und 5,194,590 (an Sehgal et al.), deren Inhalte hiermit durch Verweis Bestandteil der vorliegenden Anmeldung werden, offenbart. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält die sauerstofftragende Komponente entweder quervernetztes oder nicht quervernetztes menschliches, rekombinantes oder tierisches Hämoglobin, das durch eine Umsetzung mit Polyethylenglycol (PEG) oder Polyoxyethylen (POE) modifiziert ist.

Die Kapazität der Lösung, Geweben Sauerstoff zuzuführen, läßt sich auf eine Reihe von routinemäßig von Forschern angewendeten Wegen bestimmen, einschließlich der direkten Messung der Sauerstoffspannung in Geweben, der erhöhten gemischten venösen Sauerstoffspannung und dem reduzierten Sauerstoffextraktionsverhältnis.

V. DIE NICHT-SAUERSTOFFTRAGENDE KOMPONENTE DER BLUTPRODUKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG

Wie oben angemerkt wird bei der vorliegenden Erfindung eine Mischung in Betracht gezogen, die eine sauerstofftragende Komponente und eine nicht-sauerstofftragende Komponente enthält. Bei der nicht-sauerstofftragenden Komponente der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine beliebige zum vorübergehenden Ersatz von roten Blutkörperchen verwendete Substanz, die einen onkotischen Druck hat (z.B. Dextran-70, Dextran-90, Hespan, Pentastärke, Hetastärke, Albumin oder eine andere kolloidale intravenöse Lösung).

Nicht-sauerstofftragende Plasmaexpanderprodukte zur Behandlung von Hypovolämie und anderen Leiden sind im Handel erhältlich; zu den repräsentativen Beispielen zählen (wobei diese Liste nicht erschöpfend ist) Pentaspan® (DuPont Merck, Fresenius), Hespan® (6% Hetastärke in einer 0,9%igen Natriumchlorid-Injektionslösung; DuPont Merck) und Macrodex® (6% Dextran 70 in einer 5%igen Lösung von Dextrose in Wasser für Injektionszwecke oder 6% Dextran 70 in einer 0,9%igen Natriumchlorid-Injektionslösung; Pharmacia). Für eine klinische Verwendung (z.B. eine Blutverdünnung oder eine Wiederbelebung) verfügbare nicht-sauerstofftragende Flüssigkeiten können grob in kristalloide Lösungen (d.h. Salzlösungen) und kolloide Lösungen eingeteilt werden. Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthält die nicht-sauerstofftragende Komponente der Mischung kolloide Lösungen.

Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Probleme mit den Produkten aus dem Stand der Technik durch die Formulierung und Verwendung einer Zusammensetzung (in wässriger Lösung) behoben, die sowohl eine sauerstofftragende Komponente (z.B. einen HBOC) als auch eine nicht-sauerstofftragende Komponente, die ein inertes, nicht proteinartiges Kolloid umfaßt, enthält. Solche Zusammensetzungen haben zwei Wirkungen, entweder alleine oder in Kombination. Erstens wird die Sauerstofftransportkapazität der Zusammensetzung gesenkt, während der kolloidosmotische (onkotische) Druck und die Plasmaretention aufrechterhalten werden. Die so erhaltene kolloidverdünnte sauerstofftragende Komponente hat weniger sauerstofftransportierende Kolloidpartikel pro Volumeneinheit als die sauerstofftragende Komponente alleine, und den Arterienwänden wird daher weniger Sauerstoff angeboten. Das bedeutet, daß die Sauerstoffversorgung der von Vollblut ähnlicher ist, so daß die erfindungsgemäße Kombination dazu in der Lage ist, ihre Sauerstoffladung in einer Weise zu transportieren und zu verteilen, die der von den roten Blutkörperchen erzielten stärker ähnelt.

Zweitens läßt sich durch die richtige Wahl von Art und Menge an nicht proteinartigem Kolloid (siehe unten) die Viskosität einer Kolloidzusammensetzung mit sauerstofftragender Komponente heraufsetzen, vorzugsweise auf einen Wert, der dem von Vollblut nahekommt. Hierdurch scheint auch die Arterienwandreaktion reduziert bzw. dieser entgegengewirkt zu werden. Wenngleich es für die Anwendung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, den Mechanismus dieses Effekts zu verstehen, wird angenommen, daß er auf i) eine verminderte Sauerstoffzufuhr infolge von weniger Hämoglobin und ii) einen erhöhte Scherspannung an der Gefäßwand (was eine vermehrte Freisetzung von endogenen gefäßerweiternden Mitteln wie Prostacyclin zur Folge hat) zurückzuführen ist.

Zu den für eine Verwendung in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeigneten Beispielen für nicht proteinartige Kolloide zählen Dextran und pharmazeutisch unbedenkliche Derivate davon, Stärke und pharmazeutisch unbedenkliche Derivate davon und Polyvinylpyrrolidon (PVP). Ein besonders bevorzugtes geeignetes nicht proteinartiges Kolloid ist Pentastärke. Zu den geeigneten nicht proteinartigen Kolloiden zählen im wesentlichen alle nicht proteinartigen kolloidalen Substanzen, die erfolgreich als blutverdünnende Mittel Anwendung gefunden haben. Annehmbare Kandidaten sollten wasserlöslich sein, einen onkotischen Druck aufweisen und biologisch inert und weiterhin pharmakologisch unbedenklich sein. Die Kosten für diese Materialien (z.B. onkotische, nicht proteinartige Kolloide wie Dextran und Hetastärke) auf Gewichtsbasis sind sehr viel niedriger als die von Hämoglobin und HBOCs.

III. KLINISCHE UND ANDERE ANWENDUNGEN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung findet in vielen Situationen von der Notaufnahme bis zum Operationstisch sowie bei militärischen Konflikten und veterinärmedizinischen Anwendungen Gebrauch. Diese Vielseitigkeit liegt in den optimierten Formulierungen der vorliegenden Erfindung begründet, die lagerfähig sind und bei denen die Notwendigkeit einer Kreuzprobe oder anderer Labortests zur Feststellung von Kompatibilität mit dem zu behandelnden Patienten entfällt. Durch umfangreiche Forschungsanstrengungen im Hinblick auf chemische und genetische Modifikationen von Hämoglobin ist es in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung nun in bislang unerwarteter und hocheffizienter Weise möglich, Moleküle mit nahezu allen beliebigen Kombinationen von physikalischen und physiologischen Eigenschaften zu entwickeln.

A. Klinische Anwendungen

Verschiedene klinische Anwendungen sind unten in Tabelle 4 den Eigenschaften der vorgeschlagenen Ersatzstoffe für die roten Blutkörperchen zugeordnet. In dieser Tabelle bezieht sich T1/2 auf die Halbwertszeit.

Tabelle 4

Es wird in Betracht gezogen, daß eine hohe onkotische Aktivität (COP) bei der kurzzeitigen sofortigen Wiederbelebung nach einem hypovolämischen Schock Anwendung findet. Der Nutzen von hypertonischer Kochsalzlösung/Dextran (HSD) konnte in Tierstudien gezeigt werden (Kramer et al., Surgery 100(2): 239–47 [1986]). Eine onkotische Aktivität (COP) führt zu einer sehr schnellen Expansion des Gefäßvolumens, und es wird in Betracht gezogen, daß dies zusammen mit der schnellen Wiederherstellung der O2-Kapazität nach akutem Blutverlust die Rettung von Patienten und Gewebe beträchtlich verbessern könnte. Es gibt jedoch zahlreiche Situationen, in denen die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung Anwendung finden, einschließlich der folgenden:

Blutverdünnung. Bei dieser klinischen Anwendung sucht der Patient die Arztpraxis auf und es wird ein gewisses Blutvolumen entnommen, das durch den Ersatzstoff ersetzt wird. Das Ziel ist präventiv, nicht die Korrektur eines Ungleichgewichts. Man benötigt eine Lösung, deren Leistung der von Blut recht nahe kommt. Ein etwas erhöhter COP ist wünschenswert, da hierdurch Blutvolumen und Herzzeitvolumen in Voraussicht des operativen Blutverlusts erhöht werden. Da die Ersatzflüssigkeit auf Hämoglobinbasis ist, ist ein reduzierter P50 bevorzugt, um einer vermittelten Diffusion entgegenzuwirken. Aus dem gleichen Grund sollte die Viskosität erhöht werden, und die T1/2 sollte verlängert werden, um die Notwendigkeit für eine postoperative Transfusion mit allogenen Bluteinheiten (sollten die vor der Operation entnommenen (autologen) nicht ausreichen) zu eliminieren bzw. zu reduzieren. Die Lösung für die Blutverdünnung würde die gleichen Eigenschaften wie eine bei einem kardiopulmonalen Bypass verwendete Lösung haben.

Trauma. Bei einem Trauma hat der Patient Vollblut verloren. Als Reaktion auf diesen Blutverlust strömt, in einem Versuch, das verlorene Volumen zu ersetzen, Flüssigkeit aus den interstitiellen und intrazellulären Räumen. Bei diesem Prozess sinken Hämatokrit und Viskosität und es kommt zu einer Verengung der Gefäße, um Blut von Organen mit geringer Priorität abzuzweigen. Hierzu zählen Haut und Eingeweide, während die Blutversorgung beispielsweise von Nieren, Herz und Gehirn so lange wie möglich aufrechterhalten wird. Ziel des therapeutischen Blutersatzes wäre hier ein schnellstmöglicher Ersatz des verlorengegangenen Volumens. Daher ist ein erhöhter COP wünschenswert. Da die Ersatzflüssigkeit auf Hämoglobinbasis ist, ist ein reduzierter P50 bevorzugt, um einer vermittelten Diffusion entgegenzuwirken. Aus dem gleichen Grund sollte die Visität erhöht werden.

Septischer Schock. Bei einer überwältigenden Sepsis können einige Patienten trotz einer intensiven Therapie mit Flüssigkeiten und einer Behandlung mit gefäßverengenden Arzneimitteln zu Hypertonikern werden. Der Mechanismus, der zur Blutdruckerniedrigung führt, ist in diesem Fall eine Überproduktion von Stickstoffmonoxid (NO). Aus diesem Grund ist Hämoglobin wegen der Intensität, mit der Hämoglobin NO bindet, ein nahezu ideales Mittel für die Behandlung dieser Patienten. Im allgemeinen entspricht die NO-Bindungsaffinität der O2-Bindungsaffinität, so daß ein für diese Anwendung eingesetztes Mittel eine sehr hohe O2-Affinität (einen niedrigen P50) aufweisen sollte. Da die Patienten häufig mit Flüssigkeit überladen sind, wäre ein erhöhter COP wünschenswert, aber nicht wesentlich, und eine erhöhte Viskosität würde die selbstregulierende Gefäßverengung vermindern. Die T1/2 sollte mäßig lang sein, sie muß jedoch nicht ausgeprägt stark verlängert sein, da man bei diesen Patienten Dauerinfusionen anwenden kann.

Ischämie (z.B. Schlaganfall). Ischämie bezieht sich auf den Zustand, bei dem dem Gewebe die Sauerstoffzufuhr abgeschnitten ist. Dies rührt gewöhnlich von einem eingeschränkten Blutstrom her, wie beispielsweise einem Herzanfall oder einem Hirnschlag. Das vom O2 abgeschnittene Gewebe stirbt in kleinen Arealen, die als "Infarkte" bezeichnet werden. Ziel der Blutersatztherapie wäre hier die Steigerung des Blutstroms und eine Förderung des Transports von O2 in die Kapillarbetten. Man mag daher einer Lösung mit geringerer Viskosität den Vorzug geben, um die Kapillarbetten besser mit Blut zu durchströmen. Dies kann nur dann erfolgen, wenn das Blutvolumen aufrechterhalten oder expandiert wird, und daher wäre ein erhöhter COP wünschenswert. Bei den meisten Herzinfarkt- und Schlaganfallfällen ist der Gewebeschaden akut, so daß eine Therapie nur für einige Stunden erforderlich ist. Die T1/2 ist somit weniger wichtig als bei anderen Anwendungen.

Krebs. Zur Erhöhung der Strahlenempfindlichkeit (oder der Empfindlichkeit auf Chemotherapie) ist das Ziel, dem hypoxischen Kern des Tumors so viel O2 wie möglich zukommen zu lassen. Die Mikrozirkulation von Tumoren ist ungleich der anderer Gewebe, da ihr die Auskleidung der Kapillaren mit Endothelzellen fehlt und es nicht zu einer normalen Gefäßaktivität kommt. Es sollte somit möglich sein, Lösungen mit geringer Viskosität bereitzustellen. Der P50 sollte sehr niedrig sein, so daß wenn überhaupt nur wenig O2 in Geweben abgegeben wird, bevor es den hypoxischen Kern des Tumors erreicht hat. Mit anderen Worten würden wir es gerne sehen, wenn der O2 bei einem sehr niedrigen PO2 abgegeben wird. Die Plasma-T1/2 kann so lang wie möglich sein, so daß wiederholte Strahlen- bzw. Chemotherapiedosen verabreicht werden können.

Chronische Anämie. Diese Patienten sind nicht dazu in der Lage, verlorengegangene rote Blutkörperchen zu regenerieren, oder bei ihnen kann die Produktion nicht mit der normalen (oder beschleunigten) Zerstörung Schritt halten. In dieser Situation ist es wünschenswert, daß der für die Transfusion verwendete Ersatzstoff sich möglichst genau so verhält wie native rote Blutkörperchen. Eine vermittelte Diffusion sollte so durch eine erhöhte Sauerstoffaffinität und Viskosität überwunden werden. Bei dieser Anwendung spielt die T1/2 mehr als bei jeder anderen eine wichtige Rolle, da die Patienten selbst nicht dazu in der Lage sein werden, verlorengegangenes oder metabolisiertes Hämoglobin zu ersetzen.

Sichelzellenanämie. Hierbei handelt es sich um ein einzigartiges klinisches Leiden, bei dem der Umsatz von roten Blutkörperchen sehr hoch ist, wobei die Sichelzellbildungsrate in den roten Blutkörperchen der betroffenen Person eine Funktion des PO2 ist. Das heißt, je geringer der PO2, desto größer die Geschwindigkeit der Sichelzellbildung. Die Sichelzellbildung ist darüber hinaus eine Funktion der Dichte an roten Blutkörperchen und der Viskosität, die wiederum stark vom Hämatokrit abhängt. Die ideale Lösung bei einer Sichelzellkrise wäre eine Lösung, die den Sichelzellen O2 zuführt. Man könnte somit anstelle eines niedrigen bevorzugt einen hohen P50 anwenden, so daß es zu Gunsten der Sichelzellen zu einem O2-Nettotransfer kommt. Damit es hierzu kommt, wäre es notwendig, die Diffusion auf jede mögliche Weise abzusenken, um die Gefäßaktivität zu reduzieren, die einen möglichen Nutzen durch das Oxygenieren der roten Blutkörperchen zunichte machen könnte. Gleichzeitig wird es bevorzugt, wenn die Lösung gute Fließeigenschaften hat. Man müßte somit ein Gleichgewicht zwischen P50 und Viskosität finden, so daß die roten Blutkörperchen oxygeniert werden, während die Gefäßverengung blockiert oder zumindestens nicht induziert wird.

Herzstillstand. Bei bestimmten chirurgischen Eingriffen am Herzen hält man das Herz mittels geeigneter Elektrolytlösungen an und senkt die Temperatur des Patienten. Bei einer Temperaturabsenkung reduziert sich der P50 in drastischer Weise, möglicherweise bis zu dem Punkt, an dem O2 unter normalen physiologischen Bedingungen nicht mehr abgegeben wird. Der P50 einer Lösung für diesen Zweck muß somit höher sein als der für andere Anwendungen. Die Viskosität ist ebenfalls temperaturabhängig, und man müßte entsprechende Angleichungen vornehmen, damit die in vivo-Viskosität nahe bei der von Blut unter den spezifischen Bedingungen des Patienten liegt.

Hypoxie. Bei Menschen, die in großen Höhen leben, sowie bei Weltklasseathleten und bei Soldaten unter extremen Bedingungen kann die Extraktion von O2 aus Luft in der Lunge der limitierende Faktor beim gesamten O2-Transport werden. Dieser Aspekt des O2-Transports wäre wahrscheinlich wichtiger als die Fähigkeit der Lösung, O2 in den Geweben abzugeben. In diesem Fall wäre ein niedriger P50 vorteilhaft, und die Kooperativität sollte maximal sein. Eine Wirkung auf die Gefäße wäre nicht wünschenswert, so daß die Viskosität erhöht wäre. Es wäre nicht notwendig, den COP solcher Lösungen zu erhöhen, und die Plasma-T1/2 sollte so lang wie möglich sein.

Organdurchblutung. Hier ist das Hauptziel eine Erhöhung des O2-Gehaltes der Perfusionsflüssigkeit. Die Parameter von O2-Aufnahme und -Abgabe sind weniger wichtig als unter anderen Bedingungen, da die Flüssigkeit nicht fließt. Daher ist eine nahezu vollständige Extraktion möglich. Der P50 kann relativ normal oder sogar erhöht sein, da die Lösungen mit externen Oxygenatoren oxygeniert werden können.

Zellkultur. Diese Anforderung ist mit der der Organperfusion fast identisch, wobei allerdings je nach Zellen und deren Konzentration die Geschwindigkeit, mit der der O2 verbraucht wird, höher sein kann.

Hematopoese. Hier dient das Hämoglobin als Quelle von Häm und Eisen, die wieder zu neuem Hämoglobin synthetisiert werden. Das Hämoglobin sollte also in das Monozyten-Makrophagen-System aufgenommen und so abgebaut werden, daß seine Komponenten für den Metabolismus und die Reifung der roten Blutkörperchen zur Verfügung stehen. Die COP-, P50- und Viskositätseigenschaften können die gleichen wie für die Blutverdünnungslösung sein. Die T1/2 kann relativ kurz sein, solange die Verstoffwechselung effizient ist.

Viele, die auf dem Gebiet des Sauerstofftransports arbeiten, sind davon ausgegangen, daß die Sauerstoffaffinität von modifiziertem Hämoglobin niedrig oder zumindest nicht wesentlich verschieden von der von roten Blutkörperchen sein sollte, damit die Gewebeoxygenierung maximiert wird. Während der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß dieses Konzept ungültig ist. Bei schwerer Hypoxie kann die O2-Aufnahme in den Alveolen durch die pulmonale O2-Diffusion eingeschränkt werden, wie sich bei Bergsteigern in extremen Höhen zeigt (Winslow et al., [1984]). In diesem Fall ist eine erhöhte und nicht eine verminderte O2-Affinität von Nutzen, da hierdurch die arterielle O2-Sättigung erhöht wird. Ausgehend von den in großer Höhe gewonnenen Daten wird dieser Punkt bei einer Höhe von ungefähr 6000 Metern bzw. einem PaO2 von etwa 40 Torr erreicht. Wenn man dies extrapoliert, so könnte man die Schlußfolgerung ziehen, daß Patienten, die sich in Höhe des Meeresspiegels befinden und bei denen die diffusive pulmonale O2-Aufnahme ernsthaft eingeschränkt ist, ebenfalls von einer erhöhten O2-Affinität des Hämoglobins profitieren würden. Erreicht der PO2 in den pulmonalen Kapillaren einen Maximalwert von 40 Torr (oder weniger), dann führt ein Verschieben der Sauerstoffgleichgewichtskurve nach links zu einer höheren Sättigung, was im Effekt darauf hinausläuft, daß es zur der gleichen Zunahme beim O2-Gehalt wie bei einer Transfusion kommt, ohne daß dazu die Belastung durch eine erhöhten Masse an roten Blutkörperchen und somit einer erhöhten Viskosität kommt.

Im allgemeinen sollten die Plasmaretentionszeiten so lang wie möglich sein. Es wird jedoch auch in Betracht gezogen, daß diese Eigenschaft für die O2-Versorgung bestimmter Gewebe (z.B. Tumore, Myokard, Geschwüre, Sichelzellkrankheit) nicht so wichtig sein könnte. Weiterhin wird eine kurze Retentionszeit als wünschenswert betrachtet, wenn der Grund für die Verabreichung einer Hämoglobinlösung die Stimulierung der Erythropoese ist.

In der vorliegenden Erfindung werden Daten angeführt, aus denen hervorgeht, daß man, wenn die Eigenschaften von Viskosität, onkotischem Druck, Sauerstoffaffinität und Hämoglobinkonzentration wie beschrieben optimiert werden, das Hämoglobin mit zusätzlichen Komponenten formuliert werden kann, die zusätzliche Funktionen des Blutes übernehmen. So kann man beispielsweise Gerinnungsfaktoren (z.B. die Faktoren VIII, IX und/oder II), Immunglobuline, Antioxidationsmittel, Eisen-Chelatoren, Peroxidasen, Katalase, Superoxiddismutase, Kohlensäureanhydratase und andere Enzyme mit der Hämoglobinlösung mischen und so Patienten, die solcher Zusammensetzungen bedürfen, nützen. In ähnlicher Weise kann man Arzneimittel wie Cytotoxine, Antibiotika und andere Mittel mit der Lösung mischen oder chemisch mit anderen Komponenten wie Hämoglobin oder anderen Polymeren konjugieren.

Darüber hinaus kann man das Endprodukt als eine beliebige gewünschte Elektrolyt- und Salzzusammensetzung formulieren. Es kann im flüssigen Zustand, gefroren oder lyophilisiert als Endprodukt gelagert werden, oder die Hämoglobinkomponente selbst kann anschließend mit einer beliebigen Lösung rekonstituiert werden. Bei einem solchen Rekonstitutionsmedium könnte es sich (wobei diese Aufzählung nicht erschöpfend ist) beispielsweise um Kochsalzlösung, Ringers Lactat, Albuminlösung oder PlasmaLyte handeln. Das Endprodukt kann in einem beliebigen biologisch kompatiblen Behältnis wie Glas oder Kunststoff aufbewahrt werden.

B. Anwendungen in der Veterinärmedizin

Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Anwendung in Menschen beschränkt. Zusätzlich zu den oben kurz beschriebenen klinischen Anwendungen findet die vorliegende Erfindung auf dem Gebiet der Veterinärmedizin Anwendung. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung lassen sich für domestizierte Tiere wie Nutztiere und Haustiere (z.B. Hunde, Katzen, Vögel, Reptilien) sowie für Tiere in Aquarien, Zoos, Ozeanarien und anderen Einrichtungen, in denen Tiere untergebracht sind, einsetzen. Man kann die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung beispielsweise wie beim Menschen für Notbehandlungen von domestizierten und wilden Tieren, die aufgrund eines durch Verletzungen, hämolytische Anämien usw. verursachten Blutverlusts traumatisiert sind. So wird beispielsweise in Betracht gezogen, daß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in wie infektiöse Anämie von Pferden, infektiöse Anämie bei Katzen, durch Chemikalien oder andere physikalische Mittel, bakterielle Infektionen, Faktor-IV-Fragmentierung, Milzüberfunktion und Milzvergrößerung verursachte hämolytischen Anämien, hämorrhagisches Syndrom in Geflügel, hypoplastische Anämie, aplastische Anämie, idiopathische hämolytische Immunerkrankungen, Eisenmangel, hämolytische Isoimmunanämie, mikroangiopathischer hämolytischer, Parasitismus usw.). Die vorliegende Erfindung findet insbesondere dort Anwendung, wo Blutspender für Tiere, bei denen es sich um seltene und/oder exotische Spezies handelt, schwer zu finden sind.

VI. BLUTPRODUKTZUSAMMENSETZUNGEN

Die relativen Anteile von sauerstofftragender Komponente und nicht-sauerstofftragender Komponente (d.h. einem kolloidalen Plasmaexpander), die in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung vorhanden sind, können innerhalb weiter Bereiche schwanken. Natürlich hängen die relativen Anteile in gewissem Grade von der Beschaffenheit der jeweiligen Komponenten wie dem Molekulargewicht des als nicht-sauerstofftragenden Plasmaexpander verwendeten Kolloids ab. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung von Kolloiden als nicht-sauerstofftragende Komponente beschränkt.

Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung überwiegt der blutverdünnende Effekt der nicht-sauerstofftragenden Komponente (z.B. eines nicht proteinähnlichen Kolloids), d.h. die Gesamtkapazität der sauerstofftragenden Komponente zum Transport von Sauerstoff wird durch Verdünnen vermindert, so daß die nachteiligen Wirkungen einer übermäßigen Sauerstofffreisetzung an den Arterienwänden abgeschwächt werden. Bei solchen Ausführungsformen lassen sich beträchtliche ökonomische Vorteile mit einer Zusammensetzung erzielen, die vorzugsweise wenigstens 20 Gew.-% jeder der Komponenten und besonders bevorzugt wenigstens 25 Gew.-% jeder der Komponenten enthält. Ganz besonders bevorzugt enthalten die Zusammensetzungen von etwa 30 bis etwa 70 Teilen der sauerstofftragenden Komponente (z.B. HBOC) und entsprechend von etwa 70 bis etwa 30 Teilen der nicht-sauerstofftragenden Komponente (z.B. inertes Kolloid) (pro 100 Gewichtsteile der Kombination der beiden).

Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Viskosität der Blutersatzstoffzusammensetzungen vorzugsweise ähnlich der von normalem Blut. Ist es also wünschenswert, eine Zusammensetzung zu verwenden, deren Hauptzweck es ist, die Viskosität zu erhöhen, so sind Kolloide mit hohem Molekulargewicht in Mengen von etwa 1 bis etwa 20 Gewichtsteilen pro 100 Gewichtsteile sauerstofftragender Komponente bevorzugt.

Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist der überwiegende Effekt eine erhöhte Viskosität (d.h. auf einen Wert, der dem von Vollblut nahekommt) der Zusammensetzung. In diesen Zusammensetzungen ist die Viskosität der Zusammensetzung so hoch, daß die Scherspannung an den Arterienwänden ausreicht, um endogene gefäßerweiternde Mittel freizusetzen, die den Effekten des reichlich an den Arterienwänden vorhandenen Sauerstoffs entgegenwirken. Bei solchen Ausführungsformen sollte die nicht-sauerstofftragende Komponente (z.B. ein nicht proteinähnliches Kolloid) ein wesentlich höheres Molekulargewicht aufweisen als die sauerstofftragende Komponente, sollte jedoch in kleineren Mengen verwendet werden, um übermäßig hohe Viskositäten zu vermeiden. Eine für diese Ausführungsformen besonders geeignete sauerstofftragende Komponente ist Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem Molekulargewicht von 300.000–750.000, das in Mengen von etwa 1 bis etwa 20 Gewichtsteilen pro 100 Gewichtsteile sauerstofftragender Komponente eingesetzt wird. In ähnlicher Weise sind auch hochmolekulare Stärken (z.B. mit einem Molekulargewicht von etwa 200.000–750.000) bei diesen Ausführungsformen bevorzugt. Die Mengen sind so gewählt, das man eine Lösung von sauerstofftragender Komponente und Kolloid erhält, die eine auf Vollblut (dem ein Wert von 1 zugeordnet wird) bezogene Viskosität von etwa 0,5 bis etwa 1,2 aufweist.

Bei bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung macht man sich beide der oben erwähnten Effekte zunutze. Das heißt, man wählt Menge und Art der nicht-sauerstofftragenden Komponente (z.B. nicht proteinartiger inerter kolloider Plasmaexpander) so, daß sowohl die Menge an von einer Volumeneinheit der Lösung befördertem Sauerstoff reduziert als auch seine Viskosität auf ein Niveau, das ungefähr dem von normalen Vollblut entspricht, erhöht wird. Für diesen Zweck verwendet man PVP und Stärken mit einem Molekulargewicht, das höher ist als das der sauerstofftragenden Komponente, und zwar in Mengen, die ausreichen, um die Viskosität zu erhöhen, die Menge an befördertem Sauerstoff zu reduzieren und die Kosten der Lösung zu senken. Für eine Verwendung mit der vorliegenden Erfindung werden speziell PVP und Stärken mit Molekulargewichten von etwa 200.000 bis etwa 600.000 in Betracht gezogen, die in Mengen von etwa 5 bis etwa 50 Gewichtsteilen an inertem Kolloid pro 100 Gewichtsteile sauerstofftragender Komponente eingesetzt werden.

Bei einigen Ausführungsformen wird in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen, daß die Konzentration von sauerstofftragender Komponente und nicht-sauerstofftragender Komponente (d.h. dem inerten kolloidalen Plasmaexpander) zusammen in den Zusammensetzungen in wässriger Lösung im allgemeinen im gleichen Bereich liegt wie dem, der gewöhnlich zur Anwendung kommt, wenn eine der Komponenten alleine für den gleichen Zweck verwendet wird (d.h. von etwa 5 bis etwa 15 Gramm der Kombination pro Dekaliter Lösung).

Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung bieten gegenüber den derzeitigen Blutersatzstoffen die folgenden Verbesserungen: i) der Patient wird einer geringeren Hämoglobinkonzentration ausgesetzt, wodurch sich die Toxizität und die Kosten des Blutprodukts vermindern; ii) onkotischer Druck, wodurch das Gefäßvolumen effektiver expandiert wird, als dies bei den gegenwärtig Verwendung findenden Blutprodukten der Fall ist; iii) optimale Viskosität, wodurch der Blutstrom in den Kapillaren aufrechterhalten wird; iv) optimale Sauerstoffaffinität, wodurch das Überangebot von Sauerstoff an den Wänden der Arteriolen reduziert wird; und v) optimale Sauerstofftransportkapazität. Durch alle diese Verbesserungen erhöht sich die Wirksamkeit der Blutprodukte als zellfreie Sauerstoffträger.

In mehreren Literaturstellen aus dem Stand der Technik wird die Möglichkeit angesprochen, Hämoglobinlösungen mit nicht-sauerstofftragenden Plasmaexpandern zu mischen. Beispielsweise werden in der US-Patentschrift Nr. 4,061,736 an Morris et al. und in der US-Patentschrift Nr. 4,001,401 an Bonson et al. pharmazeutische Zusammensetzungen beschrieben, die ein Hämoglobinanalogon und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger enthalten; der Träger kann beispielsweise polymere Plasmaersatzstoffe (z.B. Polyethylenoxid) enthalten. In ähnlicher Weise wird in der US-Patentschrift Nr. 5,349,054 an Bonaventura et al. eine pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben, die ein Hämoglobinanalogon enthält, das mit einem polymeren Plasmaersatzstoff (z.B. Polyvinylpyrrolidon) gemischt werden kann. Im Stand der Technik sind jedoch weder spezielle Zusammensetzungen noch die Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Verbesserung der Wirksamkeit eines Blutersatzstoffs und zur Verminderung der Toxizität solcher Lösungen beschrieben.

Beschreibung einiger bevorzugter Ausführungsformen

Allgemein gesprochen sind Zusammensetzungen, die i) eine sauerstofftragende Komponente (z.B. einen HBOC) mit hohem onkotischen Druck, hoher Sauerstoffaffinität und hoher Viskosität und ii) eine nicht-sauerstofftragende Komponente mit ähnlichem onkotischen Druck und ähnlicher Viskosität enthalten, optimale Blutprodukte. Bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthält die sauerstofftragende Komponente der Mischung ein Polyethylenglycolmodifiziertes Hämoglobin und die nicht-sauerstofftragende Komponente enthält Pentastärke.

Wie ausführlicher im Experimentellen Teil beschrieben gibt es derzeit zwei im Handel erhältliche Hämoglobinprodukte, die mit Polyethylenglycol modifiziert sind. Das erste Produkt, Pyridoxal Hemoglobin Polyoxyethylene (PHP), ist ein vom Menschen gewonnenes Produkt von Apex Bioscience. Das zweite Produkt, PEG-Hb, ist ein von Rindern gewonnenes Produkt, das von Enzon Inc. bezogen wurde. Zwar wurden die meisten experimentellen Arbeiten mit PEG-Hb durchgeführt, die beiden PEG-modifizierten Hämoglobinprodukte lieferten jedoch qualitativ die gleichen Ergebnisse. Es versteht sich, daß die bevorzugten sauerstofftragenden Komponenten der vorliegenden Erfindung nicht auf PEG-Hb und PHP beschränkt sind; für eine Verwendung mit den am meisten bevorzugten Mischungen der vorliegenden Erfindung werden sogar beliebige mit Polyethylenglycol assoziierte Hämoglobinprodukte in Betracht gezogen.

Pentastärke, die am meisten bevorzugte nicht-sauerstofftragende Komponente der vorliegenden Erfindung, ist im Handel von DuPont Merck (Pentaspan®) sowie von anderen Bezugsquellen erhältlich. Es enthält Hydroxyethylstärke und hat ein Molekulargewicht von ungefähr 250.000 Dalton. Aufgrund seines im Vergleich zu anderen Stärken (z.B. Hetastärke) niedrigeren Molekulargewichts und seines niedrigeren Hydroxyethylsubstitutionsgrades zeigt es einen höheren onkotischen Druck und unterliegt einem schnelleren enzymatischen Abbau im Blutkreislauf. Wie im Experimentellen Teil ausführlich beschrieben, wird durch Verdünnen von PEG-Hb mit einer anderen nicht-sauerstofftragenden Komponente wie Hetastärke die Viskosität und der onkotische Druck des erhaltenen Blutprodukts und die Sauerstoffkapazität der so erhaltenen Mischung reduziert. Im Gegensatz dazu haben die durch Kombinieren von PEG-modifiziertem Hämoglobin mit Pentastärke erhaltenen Mischungen Viskositätswerte und Werte für den onkotischen Druck, die denen von PEG-Hb alleine sehr nahekommen, und es wurde gezeigt, daß sie im Vergleich zu anderen Mischungen ein längeres Überleben von Tieren bewirken und die physiologischen Parameter verbessern (siehe Experimenteller Teil).

Bevorzugte Mischungen von polyethylenglycolmodifiziertem Hämoglobin und Pentastärke enthalten wenigstens 20 Gew.-% der einzelnen Komponenten und besonders bevorzugt wenigstens 25 Gew.-% der einzelnen Komponenten. Am meisten bevorzugte Zusammensetzungen enthalten von etwa 30 bis etwa 70 Teile der sauerstofftragenden Komponente PEG-modifiziertes Hämoglobin und entsprechend von etwa 70 bis etwa 30 Teile der nicht-sauerstofftragenden Komponente Pentastärke (pro 100 Gewichtsteile der Kombination der beiden).

Die unten angeführten experimentellen Ergebnisse zeigen, daß eine Mischung von PEG-Hb und Pentastärke ähnliches leistet wie eine Lösung von PEG-Hb alleine. Dies traf zu, obwohl die Hämoglobinkonzentration, der die Tiere ausgesetzt waren, und die Menge an verwendetem Hämoglobinprodukt bei der Mischung weniger als die Hälfte betrugen, wodurch sich der Vorteil einer Verminderung der den Patienten verabreichten Hämoglobinkonzentration bietet, was sowohl die Kosten als auch mögliche Nebenwirkungen reduziert.

Wie bereits angedeutet können die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung in allen Situationen zum Einsatz gelangen, bei denen man derzeit den Patienten Blutkonserven verabreicht. So kann man die Zusammensetzungen beispielsweise Patienten verabreichen, die während einer Operation oder als Folge einer traumatischen Verletzung Blut verloren haben. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind vorteilhaft, da sie den Patienten davor bewahren, möglichen Krankheitserregen wie dem Human Immunodeficiency Virus und dem Hepatitisvirus ausgesetzt zu werden.

EXPERIMENTELLER TEIL

Die folgenden Beispiele dienen dazu, bestimmte bevorzugte Ausführungsformen und Aspekte der vorliegenden Erfindung zu erläutern und sollten nicht als deren Umfang einschränkend verstanden werden.

In der folgenden experimentellen Offenbarung werden die folgenden Abkürzungen verwendet: Äq (Äquivalente); M (molar), mM (millimolar); mM (mikromolar); g (Gramm); mg (Milligramm); &mgr;g (Mikrogramm); kg (Kilogramm); l (Liter); ml (Milliliter); dl (Deciliter); &mgr;l (Mikroliter); cm (Centimeter); mm (Millimeter); &mgr;&mgr;m (Mikrometer); nm (Nanometer); min (Minuten); s (Sekunden); KG (Körpergewicht); i.p. (intraperitoneal); Da (Dalton); dP/dt (Druckänderung als Funktion der Zeit); IE (internationale Einheiten); Hg (Quecksilber); Hz (Hertz) MHz (Megahertz); COP (kolloidosmotischer Druck); CRBCv (Capillary red blood cell velocity, kapilläre Blutflußgeschwindigkeit); FCD (functional capillary density, funktionelle Kapillardichte); FDA (Food and Drug Administration der USA); Hb (Hämoglobin); MAP (mittlerer Arteriendruck); Pd (Palladium); PEG (Polyethylenglycol); PEGHb (durch Konjugation mit Polyethylenglycol modifiziertes Rinderhämoglobin); Sät. (Sättigung); sem und s.e.m. (Standardfehler des Mittelwertes); TM (Trimesinsäure); Abbott (Abbott Laboratories, Chicago, IL, USA); Beckman (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA); Bectron (NJ, USA); Dupont (Dupont Pharmaceuticals, Wilmington, DE, USA); EG&G Electro Optics (Salem, MA, USA); Enzon Inc. (Piscataway, NJ, USA); Fresenius (Walnut Creek, CA, USA); Hemocue Inc. (Mission Viejo, CA, USA); Hemosol Inc. (Etobicoke, ON, Kanada); IPM (IPM Inc., San Diego, CA, USA); Lexington Instruments (Waltham, MA, USA); Pharmacia (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, USA); Porphyrin Products Inc. (Logan, UT, USA); Sharp (Japan); Sony (Japan); TCS Medical Products (Hintingdon Valley, PA, USA); Tektronix (Tektronix Inc., Beaverton, OR, USA); Wescor (Logan, UT, USA).

Wenn nicht anders angegeben, wurden in den nachstehenden Beispielen die folgenden allgemeinen Methoden angewendet:

Tiermodell und Präparat

Die Experimente wurden (mit Ausnahme der in Beispiel 16 beschriebenen) mit 10 Syrischen Goldhamstern mit einem Körpergewicht von 40–50 g durchgeführt. Dann wurde in jedem Tier unter Anwendung eines vorbeschriebenen orerativen Eingriffs (siehe z.B. H. D. Papenfuss et al., "A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold", Microvasc. Res. 18: 311–318 [1979]; H. Kerger et al., "Systemic and subcutaneous microvascular oxygen tension in conscious Syrian golden hamsters", Am. J. Physiol., 267 (Heart. Circ. Physiol. 37): H802–810 [1995]) ein „Hamsterfensterpräparat" hergestellt. Kurz gesagt wurden die Rückenhautfalten der einzelnen Tiere, die aus 2 Lagen Haut und Muskelgewebe bestehen, mit zwei Titanrahmen mit einer 15 mm großen kreisförmigen Öffnung versehen, die operativ unter Pentobarbitalnarkose (50 mg/kg KG, i.p., Membutal®, Abbott) installiert wurden. Hautmuskellagen wurden vorsichtig von dem subkutanen Gewebe abgetrennt und entfernt, bis nur noch eine einzelne dünne Muskelschicht und eine Lage intakter Haut verblieben.

Anschließend wurde ein in dem einen Rahmen befindliches Abdeckglas auf das freipräparierte Gewebe gelegt, was eine intravitale Beobachtung des Mikrogefäßsystems ermöglichte. Der zweite Rahmen war offen und exponierte die intakte Haut. In die Halsvene und die Halsschlagader wurden PE10-Katheter eingepflanzt. Die Katheter wurden subkutan von der ventralen zur dorsalen Seite des Halses vorgeschoben und durch die Haut an der Basis der Kammer nach außen geführt. Die Durchgängigkeit der Katheter wurde durch tägliches Durchspülen der implantierten Spitze mit 0,005–0,01 ml heparinisierter Kochsalzlösung (40 IE/ml) sichergestellt. Mikrovaskuläre Beobachtungen wurden an den wachen, nicht narkotisierten Hamstern wenigstens zwei Tage nach der Kammerimplantation durchgeführt, wodurch das postoperative Trauma abgemildert wurde. Während dieser Untersuchungen wurden die Tiere in eine Röhre gesetzt, aus der die Fensterkammer herausragte, so daß die Bewegungsmöglichkeiten der Tiere auf ein Minimum eingeschränkt waren, ohne daß dadurch die Atmung behindert wurde.

Ein Präparat wurde dann als geeignet für experimentelle Untersuchungen angesehen, wenn die mikroskopische Untersuchung der Fensterkammer die folgenden Kriterien erfüllte: i) keine Anzeichen von Blutungen und/oder Ödemen; ii) systemischer mittlerer Blutdruck über 80 mm Hg; iii) Herzfrequenz über 320 Schläge/Minute (Beckman-Rekorder, R611, Spectramed-Transducer P23XL); i.v.) systemischer Hämatokrit über 45% (Readacrit®-Zentrifuge, Bectron) und v) Anzahl immobilisierter Leukozyten und mit Venulenendothelkontakt fließender Leukozyten weniger als 10% aller zu einem bestimmten Kontrollzeitpunkt vorbeiströmender Leukozyten.

Wenn nicht anders angegeben wurden die im folgenden beschriebenen Experimente ausschließlich im Hamsterfensterpräparat durchgeführt. Dieses Modell wurde gewählt, da es die Beobachtung der Mikrozirkulation über längere Zeitspannen (d.h. mehrere Tage) ohne Narkose ermöglicht; zuvor durchgeführte mikrovaskuläre Untersuchungen deuten darauf hin, daß von narkotisierten Tieren erhaltene Daten nicht für den Wachzustand repräsentativ sind. Das Hamsterfensterpräparat präsentiert darüber hinaus das beobachtete Gewebe in einem Zustand, der von der Umgebung isoliert ist, so daß man repräsentative Daten erhält.

Intravitale Mikroskopie

Die mikroskopischen Beobachtungen wurden mit einem Intravitalmikroskop (Leitz, Ortholux II) mit einem 25 × SW 0,60 n.a. Wasserimmersionsobjektiv durchgeführt. Das Präparat wurde visuell mit einem 10 × Okular bei einer optischen Gesamtvergrößerung von 250 × beobachtet. Eine Kontrastverstärkung des transilluminierten Bildes wurde durch Verwendung eines Blaufilters (420 nm) erreicht, der selektiv Licht im maximalen Absorptionsband von Hämoglobin durchläßt, wodurch die roten Blutkörperchen als dunkle Objekte vor einem ansonsten grauen Hintergrund erscheinen. Vor der Sammellinse wurde ein Hitzefilter im Lichtpfad angebracht.

Die mikroskopischen Bilder wurden über ein Videoüberwachungssystem betrachtet, das aus zwei verschiedenen Kameras, einem Videorekorder (Sharp XA-2500S) und einem Monitor (Sony, PVM 1271Q) bestand, wobei die Gesamtendvergrößerung beim Monitor 650 × betrug.

Kapilläre Blutflußgeschwindigkeit

Die kapilläre Blutflußgeschwindigkeit (CRBCv) wurde durch das Zwei-Fenster-Videoverfahren mit einem Geschwindigkeitsspurkorrelator (IPM, Modell 102B) gemessen. Bei jeder Kapillare wurde die CRBCv über eine Zeitspanne von 20 Sekunden gemessen, so daß man eine Durchschnittsgeschwindigkeit für den Beobachtungszeitraum erhielt. Alle Messungen wurden in den selben Kapillaren durchgeführt. Die von Blut durchströmten Kapillaren, bei denen der Blutstrom zu einem späteren Zeitpunkt stoppte, wurden nicht mit in die Statistik aufgenommen, mit einem Nullwert für den Zeitpunkt, an dem kein Durchfluß mehr beobachtet wurde; dies geschah, da ihrer Wirkung auf den Gewebeperfusionsindex über ihre Wirkung auf die funktionelle Kapillardichte (FCD) Rechnung getragen wird, d.h. die Anzahl von Kapillaren in einer Flächeneinheit, bei denen beobachtet wird, daß sie rote Blutkörperchen passieren lassen. Die CRBCv wurde in ein-bis-zwei Gefäßen pro Beobachtungsfeld (10–12 pro Tier) gemessen, da sich nicht alle Kapillaren in einem Feld in der selben Brennebene befinden.

Durchmesser von Arteriolen und Venulen

Die Durchmesser von Arteriolen und Venulen wurden zu den jeweiligen Zeitpunkten mit einem Image Shearing Monitor (IPM, Modell 907) während des Rückspielens des Videos gemessen.

pO2-Messung in der Mikrozirkulation

Vor der Aufnahme der Daten erhielt jedes Tier eine langsame intravenöse Injektion von Palladiumcoproporphyrin [(Pd)-Coproporphyrin] (Porphyrin Products, Inc.), das zuvor an Albumin gebunden worden war. Die verwendete Konzentration betrug 30 mg/kg Körpergewicht. Während der pO2-Messungen wurde eine ausgewählte Fläche mit einem Xenon-Stroboskoplichtbogen (EG&G Electro Optics) mit einer Abklingkonstante von 10 Mikrosekunden bei 30 Hz beleuchtet. Eine Epiillumination kam nur während der pO2-Messungen zur Anwendung, um eine durch intensive Beleuchtung verursachte mögliche Gewebeschädigung zu vermeiden. Die Phosphoreszenzemission aus der epiilluminierten Fläche tritt durch einen verstellbaren Schlitz und einen Durchlaßfilter für langwelliges Licht (Cutoff bei 630 nm) und wird dann von einem Photomultiplier (EMI, 9855B) eingefangen. Die Schlitzgröße wurde gewöhnlich auf 15 × 100 &mgr;m (entsprechend dem eigentlichen mikroskopischen Feld) gehalten und stets entlang der Längsrichtung des Gefäßes positioniert.

Wurden Messungen im interstitiellen Raum durchgeführt, so wurde der Schlitz in unterschiedlichen Entfernungen parallel zum nächstliegenden Gefäß angeordnet. Die Signale aus dem Photomultiplier wurden zu einem Digitaloszilloskop (Tektronix, 2430) geschickt. Das Oszilloskop hatte durchschnittlich 200–500 Kurven, und eine einzelne geglättete Kurve wurde dann mit einer Rate von 0,5 MHz digitalisiert (10-Bit-Auflösung) und für eine spätere Analyse gespeichert. Zur Berechung des pO2 wurden die einzelnen Kurven auch mit einem speziellen Analogprozessor bearbeitet.

Allgemeines experimentelles Protokoll

Wenn nicht unten anders angegeben kam in den folgenden Beispielen die folgende allgemeine Austauschtransfusionsvorschrift zur Anwendung. Das Kammerfenster des Fensterpräparats wurde an Tag 1 eingepflanzt. An Tag 3 wurde die Kammer daraufhin untersucht, ob die Einschlußkriterien erfüllt waren, und wenn dies der Fall war, wurden die Katheter in der Halsschlagader und der Halsvene implantiert. An Tag 5 wurde das Tier daraufhin untersucht, ob die systemischen und mikrovaskulären Einschlußkriterien erfüllt waren, und wenn dies der Fall war, wurde mit dem Austauschexperiment begonnen.

Jedes Experiment diente als seine eigene Kontrolle, und alle Daten wurden jeweils auf den Zustand des Tieres zu Beginn des Experiments bezogen. Videomikroskopische Messungen, systemischer Hämatokrit, Herzfrequenz, Blutgase (pO2, pH, pCO2) und Bluthämoglobingehalt (mit dieser Messung wurde bei den Experimenten mit Hemo-Link®/Dextran begonnen und bei den im Anschluß daran durchgeführten Experimenten fortgefahren) wurden bei der Kontrolle vor dem Blutaustausch bestimmt. Die mikroskopischen Messungen bei der Kontrolle schlossen die kapilläre Blutflußgeschwindigkeit und die Durchmesser von Arteriolen und Venulen ein. Die mikrovaskulären pO2-Messungen wurden bei der Kontrolle nicht vorgenommen, da diese Messung aufgrund der Toxizität nur einmal durchgeführt werden kann. Für die Aufnahme der Makro- und Mikrodaten bei der Kontrolle wurde eine Stunde benötigt.

Nach Durchführung der Kontrollmessungen wurde mit dem ersten Austausch begonnen. Das Ziel war die Entnahme von 40% der ursprünglichen Blutmasse und deren Ersatz mit einem Blutersatzstoff mit einer Geschwindigkeit von 100 &mgr;l/min (die Dauer dieses Vorgangs betrug 10–20 Minuten). Am Ende dieses Vorgangs wurde nach 10 Minuten zum Äquilibrieren und Stabilisieren wie oben beschrieben die Mikro- und Makromessungen vorgenommen (die Dauer dieses Vorgangs betrug eine Stunde).

Anschließend wurde ein zweiter Austausch zur Extraktion von 30% des Originalvolumens unter Anwendung der obigen Vorschrift eingelieitet. Die Mikro- und Makromessungen wurden durchgeführt und das Tier wurde, wenn dies das letzte Austauschziel war, für die pO2-Messung zum Mikroskop gegeben. Dem Tier wurde die Porphyrinverbindung injiziert, und es wurden intravaskuläre und extravaskuläre pO2-Messungen in Arteriolen, Venulen und dem Gewebe vorgenommen (die Dauer dieses Vorgangs betrug eine Stunde).

Lag das letzte Hämatokrittarget im Bereich von 20%, so wurde ein dritter Austausch durchgeführt, und während des zweiten Austauschs wurde der mikrovaskuläre pO2 nicht gemessen. Nach dem dritten Austausch wurden die Mikro- und Makromessungen vorgenommen, und das Tier wurde für die pO2-Messung zum Mikroskop gegeben.

Statistische Analyse

Die für die einzelnen Gruppen erhaltenen Daten wurden daraufhin analysiert, ob die innerhalb der Gruppen beobachteten Veränderungen statistisch signifikant waren. Die Resultate der einzelnen Gruppen werden präsentiert, indem man jeden Datenpunkt als aus einem unabhängigen Experiment erhaltenen behandelt. Auf die normierten Mittelwerte wurde der nicht-parametrische Mann-Whitney-Test angewendet, um zu beurteilen, ob die Veränderungen der Parameter sich signifikant vom Kontrollwert unterschieden. Die Ergebnisse sind als Medianwerte und interquartile Bereiche angeführt. Bei p < 0,05 wurden die Veränderungen als statistisch signifikant angesehen.

Die folgenden Beispiele sind in die folgenden Abschnitte eingeteilt: I) Mikrozirkulationsexperimente und II) Experimente mit klinischen Modellen.

I. MIKROZIRKULATIONSEXPERIMENTE BEISPIEL 1 Blutstrom und Hämatokrit während der Blutverdünnung mit Kolloid und Kochsalzlösung

Die Experimente dieses Beispiels zielen auf die Bestimmung der Wirkung eines verminderten Hämatokrit als Folge einer Blutverdünnung auf die Blutflußgeschwindigkeit ab. Die Experimente dieses Beispiels wurden unter Verwendung von Dextran 70 und Kochsalzlösung mit Hamstern durchgeführt.

Es kamen die oben beschriebenen allgemeinen experimentellen Vorschriften (z.B. Allgemeines experimentelles Protokoll und Kapilläre Blutflußgeschwindigkeit) zur Anwendung. 2 zeigt eine graphische Darstellung der Flußgeschwindigkeit in der Mikrozirkulation als Funktion von Hämatokritreduktionen mittels Blutverdünnung mit Dextran und Blutverdünnung mit Kochsalzlösung. In 2 werden die folgenden Bezeichnungen verwendet: i) Blutverdünnung mit Dextran: kleiner Kreis = Mesenterium; Quadrat = Haut; Pluszeichen = Muskel; und ii) Blutverdünnung mit Kochsalzlösung: großer Kreis = Hautfalte. Aus den Ergebnissen geht hervor, daß der Blutfluß, wie durch die Geschwindigkeit des Blutes in den Gefäßen der Mikrozirkulation belegt wird, sich beim Verdünnen des Blutes erhöht. Der Anstieg ist linear zur Absenkung des Hämatokrits, was die Tatsache widerspiegelt, daß der Viskositätsverlust im Blutkreislauf in der Mikrozirkulation, wo die Beziehung zwischen der Viskosität des Bluts und dem Hämatokrit linear ist, am stärksten ist.

Die meisten der früheren Studien haben gezeigt, daß es möglich ist, die Anzahl der roten Blutkörperchen auf bis zu 25% der ursprünglichen Menge zu reduzieren, was einem Verlust von 75% der ursprünglichen Masse an roten Blutkörperchen gleichkommt, und dabei die Kreislauffunktion und den Blutfluß aufrechtzuerhalten. Die meisten Lösungen von freiem Hämoglobin (z.B. HBOCs) zeigen bei sehr niedrigen Hämatokriten keine lineare Zunahme des Blutflusses bei einer Reduktion des Hämatokrits, was durch nicht-sauerstofftragende Verdünnungsmittel belegt wird. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß bei den Lösungen von freiem Hämoglobin noch weitere Prozesse wirken, wie die bereits erwähnten und unten ausführlicher beschriebenen Reaktionen an der Arterienwand.

BEISPIEL 2 pO2-Verteilung bei einer Blutverdünnung mit Dextran 70 und HemoLink®

Ziel der Experimente dieses Beispiels war die Bestimmung der Auswirkung einer Blutverdünnung auf den pO2 in der Mikrozirkulation durch die oben beschriebene Phosphoreszenzabklingmethode.

Blutverdünnung mit Dextran 70

Der pO2 wurde in 50-&mgr;m-Arteriolen und in dem diese Arteriolen umgebenden Gewebe gemessen. Die Ergebnisse waren wie folgt: Arteriolen-pO2 (pO2.A) = 53 mm Hg; Gewebe-pO2 (pO2.T) = 21 mm Hg. Mit der folgenden Gleichung läßt sich dann KA*, die Konstante, die den Unterschied bei der Abnahme des Sauerstoffpartialdrucks zwischen i) den Arteriolen und den Geweben und ii) den zentralen Arterien und den Geweben darstellt, berechnen: KA* = ln[(pO2.A – pO2.T)/(pO2.a – pO2.T)] wobei pO2.a die Sauerstoffspannung in einer zentralen Arterie ist. Mit einem angenommenen pO2.a = 100 mm Hg wird KA* = ln[(53 – 21)/(100 – 21)] = –0.90.

In Tabelle 5 finden sich die früher (von den Erfindern der vorliegenden Erfindung) erhaltenen pO2-Werte für verschiedene Hämatokrit-(á)-Spiegel bei einer Blutverdünnung mit Dextran 70. Das Konvektions-Diffusions-Modell ermöglicht einen Vergleich der gemessenen mit den theoretischen Werten. Die Veränderungen der Blutviskosität (a) wurden nicht direkt gemessen, sondern aus den Änderungen der Blutflußgeschwindigkeit in der Mikrozirkulation abgeleitet; die relative Viskosität a bezieht sich auf die Viskosität von Vollblut (a = 1,0). Die Sauerstofftransportkapazität wurde als direkt proportional zum Hämatokrit angenommen (d.h. der vom Plasma transportierte Sauerstoff wurde außer Betracht gelassen). In Tabelle 5 sind die gemessenen und theoretischen pO2.A-Werte nach Blutverdünnung mit Dextran 70 zusammengefaßt. Die vorausgesagten Werte für die einzelnen Blutverdünnungsniveaus wurden unter Verwendung von Modellergebnissen erhalten, bei denen KA* mit dem entsprechenden ã/á-Verhältnis multipliziert wurde.

TABELLE 5
  • * Ein dermaßen niedriger Hämatokrit wird von Tieren nicht vertragen. Der Viskositätsfaktor ã ist von dem Effekt auf die Geschwindigkeit abgeleitet.

Die in Tabelle 5 angeführten Ergebnisse zeigen, daß die Gewebeoxygenierung durch eine Absenkung des Hämatokrits auf 60% der Ausgangsmenge, d.h. einen Verlust von 40% der ursprünglichen Masse an roten Blutkörperchen, oder eine Hämoglobinkonzentration (in roten Blutkörperchen) von 9%, normalerweise nicht verändert wird. Dies trifft hinsichtlich der selbstregulierenden Reaktionen und hinsichtlich der Gewebeoxygenierung zu. Das Modell sagt voraus, daß der Blut-pO2 in den Arteriolen signifikant niedriger wäre, wenn man den Hämatokrit auf 40% und 20% des Normalwertes reduziert. Wie die Daten zeigen, war dies jedoch bei Reduktionen auf 40% nicht der Fall, was darauf hindeutet, daß die Arteriolen eine aureichend starke selbstregulierenden Reaktion bewirken, die darauf zielt, den pO2 aufrechtzuerhalten. Weitere Reduktionen des Hämatokrits verursachen eine bedeutende Abnahme des Gewebe-pO2. Darüber hinaus ist der Wandgradient bei extremer Blutverdünnung gering, was die Tatsache widerspiegelt, daß als Reaktion auf eine niedrigere Sauerstoffspannung in den Arteriolen eine Gefäßerweiterung erforderlich ist.

Blutverdünnung mit HemoLink®

Die Blutverdünnung mit HemoLink® erfolgte in einer Weise analog der oben für Dextran 70 beschriebenen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angeführt.

TABELLE 6
  • * á ist die Sauerstofftransportkapazität der Mischung aus HemoLink® (Konzentration: 10 g/100 ml) und roten Blutkörperchen. Die Zahlen sind normiert auf die Sauerstofftransportkapazität von normalem Blut.

Die Ergebnisse in Tabelle 6 zeigen, daß HemoLink® bei allen Blutverdünnungsniveaus den arteriolaren pO2 aufrechterhielt. Die Tiere tolerierten eine Blutverdünnung auf 20% der Ausgangsmasse der roten Blutkörperchen, was bei der Blutverdünnung mit Dextran nicht der Fall war. Wenngleich ein Verständnis des Mechanismus für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, scheint die Aufrechterhaltung des arteriolaren pO2 auf eine gefäßverengende Wirkung zurückzuführen sein, die den Blutstrom um etwa 25% reduziert. Dies wird durch folgendes belegt: i) einen erhöhten Gefäßwandgradienten (ein Zeichen einer Gefäßverengung); ii) arteriolare Gefäßverengung und iii) ein erhöhter Fluß aufgrund von Viskositätseffekten, der niedriger ist als der bei der Blutverdünnung mit Dextran 70 erhaltene, wie durch höhere ã-Werte bei einem gegebenen Verdünnungsniveau der Masse der roten Blutkörperchen mit HemoLink® belegt wird.

Wenn eine Verdünnung mit HemoLink® nur aufgrund der von Kolloiden herrührenden Viskositäteffekte zu einem erhöhten Blutfluß führen sollte, so würde man erwarten, pO2-Werte auf dem Niveau von 50-&mgr;m-Arteriolen zu erhalten, die sich, berechnet nach den theoretischen Vorhersagen, auf ungefähr 60 mm Hg (für einen Hämatokrit = 0,4) belaufen würden. Wenngleich es für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist, zu verstehen, warum die Werte ungefähr die gleichen sind: die Unterschiede zwischen den theoretischen Werten und den gemessenen Werten deuten darauf hin, daß eine Arterienwandreaktion stattfindet. Die Ergebnisse legen nahe, daß es einen gefäßverengenden Effekt gibt, der für einen in einer Größenordnung von 25% verminderten Blutfluß verantwortlich ist, da dies auf einen in der Größenordnung von 6% verminderten Gefäßdurchmesser zurückzuführen wäre. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen, daß die Arteriolendurchmesser bei einem Hämatokrit von 0,4 auf 93% des Kontrollwertes abnehmen und bei einem Hämatokrit von 0,2 auf 88% des Kontrollwertes abnehmen. Eine Gefäßverengung auf diesem Niveau ist auch aus der Druckzunahme bei einem Hämatokrit von 0,4 ersichtlich (wobei es bei höheren Austauschniveaus jedoch keine Abweichungen vom Kontrollwert gibt).

Aus den mit HemoLink® erhaltenen Ergebnissen geht hervor, daß nach einer isovolämischen Reduktion des Hämatokrits von 10% auf 40% die Gewebeoxygenierung (in Hinblick auf den pO2 von 50-&mgr;m-Arteriolen und Geweben auf dem gleichen Niveau) auf den unter normalen Bedingungen vorherrschenden Niveaus aufrechterhalten wird. Wenngleich ein genaues Verständnis der Methodik dieses Effekts zur Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist: es könnte sein, daß die beobachtete geringfügige Erhöhung des Blutdrucks und des Gefäßwandgradienten sowie die Abnahme der funktionellen Kapillardichte die direkte Folge von selbstregulierenden Phänomenen sind, d.h. Phänomenen, die darauf zielen, den pO2 in 50-&mgr;m-Arteriolen in Gegenwart einer potentiellen überschüssigen Sauerstofftransportkapazität aufgrund einer erniedrigten Viskosität des Blutes konstant zu halten.

Effekt der Ergebnisse auf die Blutersatzstoffformulierungen der vorliegenden Erfindung

Die Ergebnisse dieses Beispiels deuten darauf hin, daß HemoLink® in seiner derzeitigen Formulierung zuviel Sauerstoff zur Verfügung stellt und die Viskosität der so erhaltenen Blutmischung zu gering ist. Während eine Blutverdünnung mit inerten Kolloiden zur Aufrechterhaltung der Sauerstofftransportkapazität einer niedrigen Blutviskosität bedarf, muß der resultierende Anstieg des Herzzeitvolumens nicht in allen Fällen ein wünschenswerter Effekt sein. Daher sind bei einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung HemoLink® und andere sauerstofftragende Komponenten, insbesondere HBOCs, in einer Lösung formuliert, die ein inertes Kolloid enthält. Auf diese Weise erzielt man entweder eine Erhöhung der Viskosität, und/oder die Sauerstofftransportkapazität wird reduziert, während der kolloidosmotische Druck und die Plasmaretention aufrechterhalten werden.

BEISPIEL 3 Durch Blutverdünnung mit 50% HemoLink®/50% Dextran 70 herbeigeführte Gewebeoxygenierung

Ziel der Experimente dieses Beispiels ist es, zu bestimmen, ob die Gewebeoxygenierung nach der Verabreichung einer Mischung aus HemoLink® und Dextran 70 ausreichend ist.

Es wurde eine Mischung aus 50% HemoLink® und 50% Dextran 70 hergestellt, und die Gewebeoxygenierung wurde bei Hämatokritniveaus von 60% und 40% der Ausgangsniveaus bestimmt. Die Hämoglobinkonzentration in der so erhaltenen Mischung wurde direkt durch Spektrophotometrie bestimmt. Darüber hinaus wurde der Anzahl an roten Blutkörperchen und die Menge an HemoLink® direkt in Blutproben gemessen. Die Tests wurden mit vier Tieren begonnen, jedoch erfüllten nur zwei Tiere alle Kriterien für eine Aufnahme in einen Versuch; die Ergebnisse für die beiden Tiere sind in Tabelle 7 aufgeführt.

TABELLE 7

Beim Vergleich der Daten in Tabelle 7 mit den von der alleinigen Verwendung von HemoLink® (siehe Tabelle 6), beobachtet man, daß die Werte für den pO2.T (17 mm Hg gegenüber 15 mm Hg für einen Hämatokrit = 0,4) sich sehr ähneln; diese Werte sind in der Praxis akzeptabel. Daher stellen sowohl die verdünnte Mischung als auch HemoLink® selbst eine ausreichende Gewebeoxygenierung sicher, trotz der Tatsache, daß die Mischung nur halbsoviel Sauerstoff pro Gewichtseinheit trägt wie HemoLink® alleine.

BEISPIEL 4 Gewebeoxygenierung mit HemoLink®, Dextran 70 und HemoLink®/Dextran 70 bei einem Hämatokrit von 0,4

Ziel der Experimente dieses Beispiels ist die Bestimmung und der Vergleich der Gewebeoxygenierung von HemoLink®, Dextran 70 und HemoLink®/Dextran 70 (50%/50%) bei einem Hämatokrit von 0,4. Diese Experimente bauen auf den in dem vorhergehenden Beispiel angeführten auf.

Die Effizienz der Gewebeoxygenierung nach der Verabreichung der oben erwähnten Zusammensetzungen wurde aus Informationen zum arteriolären und venulären pO2, zur prozentualen Sauerstoffsättigung von Hämoglobin, zur kapillären Blutflußgeschwindigkeit (1/ã) und zur intrinsischen Sauerstofftransportkapazität (á) bewertet. Diese Parameter wurden wie bereits beschrieben bestimmt, und die Sauerstoffextraktion durch die Mikrozirkulation wurde durch die im folgenden erläuterte Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 8 aufgeführt (wo zutreffend sind relative Zahlen angegeben).

TABELLE 8

Die Daten in Tabelle 8 für die Sauerstoffextraktion sind von Messungen der pO2-Gradienten an den Gefäßwänden abgeleitet. Dieser Wert gibt zusammen mit dem Wert für die auf Blut = 1 normierte Sauerstofftransportkapazität einen Anhaltspunkt für die relative Sauerstoffmenge, die bei einem gegebenen Gewebeoxygenierungsniveau zwischen dem Arteriengefäß und dem Gewebe verlorengeht. Bei normalem (d.h. unverdünntem) Blut beträgt der Wert 32%. Ist das Blut mit Dextran 70 verdünnt, so liegt der Wert bei 9% (d.h. 22% von 40%); ist das Blut mit HemoLink® verdünnt, so beträgt der Wert 40% (50% von 80%), und ist das Blut mit einer Dextran/HemoLink®-Mischung verdünnt, so ist der Wert 14% (26% von 54%).

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß die Dextran/HemoLink®-Mischung die Gewebe wesentlich effizienter mit Sauerstoff versorgt als HemoLink® alleine. Da die Mischung sehr viel weniger ihres Sauerstoffs beim Übergang von den Arterien in die Kapillaren verliert als HemoLink® alleine, hat die Mischung in den Geweben größere Sauerstoffreserven für Oxygenierungszwecke verfügbar. Die eine nicht-sauerstofftragende Komponente und eine sauerstofftragende Komponente enthaltenden Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung stellen also größere Sauerstoffreserven für die Gewebe bereit; dieses Ergebnis stellt einen zusätzlichen, unerwarteten Vorteil der Zusammensetzungen dar.

BEISPIEL 5

Wandgradienten mit HemoLink® and HemoLink®/Dextran 70 bei einem Hämatokrit von 0,4

Mehrere der vorherigen Beispiele zielten auf die Verwendung des "Wacher Hamster"-Modells zur Bestimmung i) der Sauerstoffteildrücke in den Arterien, Venen und Geweben und ii) des Blutdrucks in normalem Blut (Kontrolle) mit HemoLink® bei einem Hämatokrit von 0,4, und 50:50 Dextran:HemoLink® bei einem Hämatokrit von 0,4. Dieses Beispiel zielt auf die Bestimmung von Wandgradienten, wobei jeweils diese Zusammensetzungen verwendet werden.

Wie bereits angedeutet ist der Gefäßwandgradient umgekehrt proportional zur Gewebeoxygenierung. Bei diesem Beispiel wurden die Wandgradienten aus den pO2-Messungen aus den vorherigen Studien abgeleitet. Bei den Blutdruckdaten handelt es sich um den mittleren arteriellen Blutdruck relativ zum Kontrollwert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt.

TABELLE 9

Aus den Daten in Tabelle 9 geht hervor, daß die HemoLink®/Dextran-Zusammensetzung beim Vergleich der gemessenen Parameter effektiv äquivalent zu HemoLink®. alleine ist. Außerdem weisen die Ergebnisse aus diesem Beispiel zusammen mit den oben angeführten Beispielen darauf hin, daß sich die wünschenswerten Eigenschaften eines durch alleinige Verwendung von HemoLink® (und, extrapoliert, anderer HBOCs) erhältlichen Blutersatzstoffes auch mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (d.h. Zusammensetzungen, die eine sauerstofftragende Komponente in Kombination mit einer nicht-sauerstofftragenden Komponente enthalten) erzielen lassen.

BEISPIEL 6 Mikrozirkulatorische Parameter bei einem Hämatokrit von 12–13%

Bei den Experimenten dieses Beispiels wurden die bereits beschriebenen Vorschriften angewendet, um verschiedene mikrozirkulatorische Parameter nach Verabreichung mehrerer verschiedener Zusammensetzungen zu beurteilen.

In getrennten Experimenten wurden Hamstern sechs verschiedene Zusammensetzungen verabreicht: 1) Kontrolle (d.h. normales Blut); 2) Dextran 70 allein; 3) HemoLink® allein; 4) HemoLink® 33 Vol.-%/Dextran 66 Vol.-%; 5) HemoLink® 50%/Dextran 50% und 6) L-Name (L-Nitrosyl-arginin-monomethyl-ether; im Handel beispielsweise von Sigma erhältlich). Bei den Experimenten 3)–5) wurde nach drei Austauschperfusionen ein Hämatokrit von ungefähr 12% der Kontrolle erzielt. Bei dem Experiment mit Dextran allein (Experiment Nummer 3) wurden nur zwei Blutverdünnungen (d.h. zwei Austauschperfusionen) durchgeführt, da die Tiere drei Verdünnungen mit dieser Zusammensetzung nicht vertrugen. Die L-Name-Zusammensetzung wurde den Tieren injiziert (d.h. sie wurde nicht verabreicht, um eine Blutverdünnung zu erreichen).

Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 10 aufgeführt. In Tabelle 10 gilt PaO2 = arterieller PO2; Grad(A) = Arteriolen/Gewebegradient und Grad(V) = Venulen/Gewebe-PO2-Gradient. Die Daten zur Gefäßverengung sind auf die Kontrolle (Experiment Nummer 1) bezogen.

Aus den Daten in Tabelle 10 geht hervor, daß durch die Blutverdünnung mit dem Sauerstoffträger auf Hämoglobinbasis (HBOC) HemoLink® der Gewebe-PO2 von ungefähr 20 auf 5 mm Hg abnahm. Hiermit ging eine Erhöhung des Arteriolen/Gewebe-PO2-Gradienten von etwa 17 auf 28 mm Hg einher, was im Einklag mit der Gefäßverengung steht, die zuvor als durch dieses Produkt verursacht bestimmt worden war. Wurde das HemoLink® mit dem nicht-sauerstofftragenden Plasmaexpander Dextran gemischt, so erhöhten sich bei den 33%- und 50%-Mischungen von Hemo-Link®/Dextran die Gewebe-PO2 auf 13 bzw. 17 mm Hg. In den Experimenten mit den HemoLink®/Dextran-Zusammensetzungen blieb der Arteriolen/Gewebe-PO2-Gradient jedoch hoch, wobei es sich hier um eine Folge der noch durch das Hämoglobin bewirkten Gefäßverengung handelte.

Diese Experimente deuten in Verbindung mit einigen der Ergebnisse aus den vorherigen Beispielen darauf hin, daß, wenn man die Verfügbarkeit von O2 durch die extrazelluläre Lokalisierung von Hämoglobin erhöht, einer oder mehrere der folgenden Ausgleiche vorgenommen werden müssen, um eine selbstregulierende Gefäßverengung auf der Ebene der Arteriolen zu verhindern: i) eine Erhöhung der Viskosität, ii) eine Absenkung der O2-Transportkapazität oder iii) eine Erhöhung der O2-Affinität.

BEISPIEL 7 Verwendung einer HemoLink® und Polyvinylpyrrolidon enthaltenden Zusammensetzung

Die Experimente dieses Beispiels belegen, daß eine erhöhte Viskosität eine selbstregulierende Gefäßverengung auf der Ebene der Arteriolen verhindert. Die Mikrogefäßsystemexperimente dieses Beispiels wurden unter Verwendung einer HemoLink® und Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem Molekulargewicht von 750.000 Dalton enthaltenden Zusammensetzung durchgeführt.

Es wurden wässrige Lösungen von i) HemoLink®, ii) 50:50 (v/v) HemoLink®:Dextran mit einem Molekulargewicht von 70.000 und iii) 100:4 (v/v) HemoLink®:PVP mit einem Molekulargewicht von 750.000 hergestellt, die jeweils eine Gesamtkonzentration an gelösten Stoffen von 10 g/100 ml aufwiesen. Die Zusammensetzungen wurden in dem oben beschriebenen "Wacher Hamster"-Modell getestet. PVP wird experimentell als Plasmaexpander verwendet und wurde auch bei Menschen für den gleichen Zweck eingesetzt; seine Haupteigenschaft ist eine Erhöhung der Plasmablutviskosität. Durch die Verwendung von PVP wird die Viskosität der Lösung beträchtlich auf einen geschätzten Wert von etwa 15 Centipoise erhöht (was im wesentlichen dem von Vollblut entspricht).

Die Tiere wurden einem isovolämischen Blutaustausch mit jeder der Zusammensetzungen unterzogen, wodurch ein Endhämatokrit von 0,20 der Kontrolle (d.h. 20% der ursprüngliche Masse an roten Blutkörperchen) oder ein effektiver Hämatokrit von etwa 10% erzielt wurde. Nach den bereits beschriebenen Vorschriften wurden der arterielle Druck, der Wandgradient, der Blutdruck und der Gewebesauerstoff gemessen. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 11 aufgeführt.

Die Ergebnisse in Tabelle 11 zeigen, daß die erhöhte Viskosität der HemoLink®:PVP-Zusammensetzung verglichen mit den beiden anderen Zusammensetzungen den Gefäßwandgradienten beträchtlich senkt, wodurch dem Gewebe mehr Sauerstoff verfügbar gemacht wird. Diese erhöhte Viskosität bewirkt eine Erweiterung der Blutgefäße und normalisiert die Sauerstoffverteilung in der Mikrozirkulation. Wenngleich ein Verständnis des zugrundeliegenden Mechanismus für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist: man nimmt an, daß der Mechanismus für die Gefäßerweiterung bei Zusammensetzungen mit einer erhöhten Viskosität ein Doppelmechanismus ist. Erstens führt durch die reduzierte Menge an Hämoglobin bedingter verminderter Sauerstofftransport des Blutes zu selbstregulierenden Effekten analog denen, die bei den bereits beschriebenen sauerstofftragenden Zusammensetzungen, die andere inerte, nicht proteinartige Kolloide enthalten, beobachtet wurden.

Zweitens wird durch eine erhöhte Scherspannung an der Gefäßwand eine vermehrte Freisetzung von endogenen Vasodilatoren wie Prostacyclin bewirkt.

Darüber hinaus wird, obwohl die O2-Kapazität der HemoLink®/PVP-Mischung niedriger ist als die von HemoLink® alleine und ihre Viskosität höher ist, der Arteriolen/Gewebe-PO2-Gradient herabgesenkt und der Gewebe-PO2 von 5 auf 16 mm Hg erhöht. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der bereits erwähnten theoretischen Formulierung. Es wird jedoch angenommen, daß sich die Mischung aus HemoLink® und PVP nicht für eine Entwicklung als Blutersatzstoff eignet, und die funktionelle Kapillardichte ist niedriger als gewünscht.

II. KLINISCHE MODELLEXPERIMENTE BEISPIEL 8 Einsatz von Pentastärke, HemoLink® und einer Mischung davon unter klinischen Bedingungen

Dieses Beispiel betrifft Experimente, die in vivo mit männlichen Sprague-Dawley-Ratten unter großem Streß durchgeführt wurden. Die Experimente dieses Beispiels liefern Informationen, die für einen klinischen Einsatz der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung (z.B. in einem Operationssaal) relevant sind.

Austauschtransfusion

Die Tiere wurden 24 Stunden vor Beginn der Experimente instrumentiert, und alle Experimente wurden im Wachzustand durchgeführt. Ein Katheter wurde in die Oberschenkelschlagader und ein anderer in die Oberschenkelvene gelegt. Das Tier wurde in einem Experimentierkäfig immobilisiert. Zunächst wurde eine Austauschtransfusion durchgeführt, bei der etwa 50% des Blutes des Tieres entnommen und durch eine Testzusammensetzung ersetzt wurden; bei den untersuchten Testzusammensetzungen handelte es sich um Pentastärke, HemoLink® und eine HemoLink®/Pentastärke-Mischung (50:50 v/v). Für die gleichzeitige Entnahme von Blut und Infusion einer der Testzusammensetzungen mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min wurde eine peristaltische Pumpe verwendet. Die Austauschdauer wurde so berechnet, daß, ausgehend von 65 ml Blut pro kg Körpergewicht als Standardblutvolumen der Ratte, ein Austausch von 50% des geschätzten Gesamblutvolumens erzielt wurde.

Mittlerer arterieller Blutdruck während des Austauschs

Mit dem Fortschreiten der Austauschtransfusionen wurden die mittleren arteriellen Drücke nach Standardvorschriften aus dem Stand der Technik über den Katheter gemessen. 3 ist eine graphische Darstellung des arteriellen Blutdrucks vor und während der Austauschtransfusion (angedeutet durch den Pfeil in 3). Bezogen auf 3 steht (?) für HemoLink®, (?) für Pentastärke und (V) für die Mischung aus HemoLink® + Pentastärke. Nach den oben beschriebenen statistischen Analysen gibt es keine signifikanten Unterschiede zwischen HemoLink® allein und der Zusammensetzung von HemoLink®/Pentastärke.

Physiologischer Status während einer Blutentnahme

Die Tiere wurden einer Prozedur analog der im vorherigen Beispiel beschriebenen unterzogen, bei der 60% des Blutes entnommen wurden. Genauer gesagt wurde mit dem oben erwähnten 65 ml/kg-Schätzwert das Volumen von 60% des gesamten Blutes berechnet. Die berechnete Blutmenge wurde dann nach einem vereinfachten exponentiellen Protokoll ähnlich dem von Hannon et al. ("Blood and Acidbase Status of Conscious Pigs subjected to Fixed-volume Hemorrhage and Resuscitated with Hypertonic Saline Dextran," Circulatory Shock 32: 19–29 [1990]) entwickelten entnommen. Zu Beginn jedes 10-Minuten-Intervalls der Blutentnahme wurde Blut unter Verwendung einer Spritzenpumpe, die mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min betrieben wurde, aus einer Arterie entnommen. Die Dauer der einzelnen Entnahmen wurde so berechnet, daß 60% des Gesamtblutvolumens innerhalb von 60 Minuten entnommen wurden.

Der mittlere arterielle Blutdruck wurde über den Katheter gemessen, und die Daten sind in 4 graphisch dargestellt; in 4 sind die Symbole für die einzelnen Zusammensetzungen die gleichen wie in 3. Es sei anzumerken, daß bei den mit der HemoLink®/Pentastärke-Zusammensetzung transfundierten Tieren die Blutentnahme mit einem höheren Blutdruck beginnt, der anfangs ziemlich steil abfällt. Sowohl die HemoLink®/Pentastärke-Zusammensetzung als auch Hemo-Link® allein halten den Blutdruck während der ersten 50 Minuten gut aufrecht.

Bei dem oben beschriebenen Blutentnahmetest handelt es sich um ein relativ drastisches Testmodell. Selbst ohne Austauschtransfusion überleben nur etwa 50% der Tiere länger als 120 Minuten von Beginn der Entnahme von 60% des Blutes an, und von den mit einer Testlösung transfundierten überleben noch weniger (Daten nicht gezeigt).

Während der Blutentnahme wurden auch andere Messungen durchgeführt, einschließlich Herzfrequenz (gemessen anhand der Druckspur bei den Messungen des mittleren arteriellen Drucks), and pH-Wert, pCO2, pO2, Lactatanreicherung und Basenüberschuß (durch Standardblutanalyse bestimmt). Die Ergebnisse (nicht gezeigt) für die Tiere, die mit HemoLink® transfundiert wurden, und für die mit der HemoLink®/Pentastärke-Zusammensetzung transfundierten waren im wesentlichen äquivalent, mit der folgenden Ausnahme. Die HemoLink®/Pentastärke-Zusammensetzung bewirkte eine stärkere Lactatanreicherung, was die Tatsache widerspiegelt, daß diese Zusammensetzung weniger Sauerstoff trägt. Die Lactatanreicherung reflektiert direkt den Gewebeoxygenierungsstatus; das heißt, wenn das Gewebe nicht mit genügend Sauerstoff versorgt wird, kommt es zu einer Laktatanreicherung.

Die Befunde aus den Experimenten dieses Beispiels deuten darauf hin, daß sich mit einer Mischung einer sauerstofftragenden Komponente und einer nicht-sauerstofftragenden Komponente ähnliche, wenn nicht bessere, Resultate erzielen lassen, als mit einer sauerstofftragenden Komponente allein.

BEISPIEL 9 Einsatz von Pentastärke, modifizierten Hämoglobinen und Mischungen davon unter klinischen Bedingungen

Mit den Experimenten dieses Beispiels werden zwei sauerstofftragende Komponenten – durch Konjugation mit Polyethylenglycol modifiziertes Rinderhämoglobin (PEGHb oder PEG) und áá-Hb – alleine und in Kombination mit einer nicht-sauerstofftragenden Komponente, dem Plasmaexpander Pentastärke (Pentaspan®; DuPont), untersucht.

Beschaffenheit der Zusammensetzungen

Die Eigenschaften mehrerer der in diesem Beispiel verwendeten Zusammensetzungen werden in Tabelle 12 verglichen. Die PEGHb+Pentastärke-Zusammensetzung und die áá-Hb+Pentastärke-Zusammensetzung enthielten jeweils 50 Vol.-% der einzelnen Zusammensetzungen. Wie in Tabelle 12 angegeben haben sowohl PEGHb als auch Pentastärke hohe kolloidosmotische Druckwerte (COP), und beide haben eine Viskosität, die ungefähr der von Blut entspricht (bei dem verwendeten Meßsystem haben Wasser und gereinigtes Hämoglobin Viskositäten von 1 Centipoise).

TABELLE 12
Austauschtransfusion

Nach der im vorherigen Beispiel beschriebenen Vorschrift wurde bei wachen Ratten eine 50%ige isovolämische Austauschtransfusion vorgenommen. Aus Tabelle 13 gehen die Wirkungen der Austauschtransfusion (± sem) auf das Blutvolumen, den Hämatokrit, das Gesamthämoglobin und das Plasmahämoglobin für mehrere der Zusammensetzungen hervor.

TABELLE 13

Im Hinblick auf Tabelle 13 zeigen die Abnahmen beim Hämatokrit und der Hämoglobinkonzentration bei den experimentellen Gruppen, daß die Austauschprozedur bei den PEGHb-, Pentaspan®- and PEGHb+Pentaspan®-Tieren zu einer signifikanten Expansion des Plasmavolumens führte.

Physiologischer Status während einer Blutentnahme

Als nächstes wurden die Ratten einer 60%igen Blutentnahme im Verlauf von 1 Stunden unterzogen; dieses Protokoll, von dem bekannt ist, daß es bei ungefähr 50% der Tiere zum Tode führt, wurde wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt.

In 510 gelten die folgenden Bezeichnungen: Pentastärke (?), áá-Hb (|), PEG-Hb (?), Pentastärke + áá-Hb (?), Pentastärke + PEG-Hb (?) und Kontrolltiere (?). 5 zeigt das Überleben der Tiere über eine Zeitspanne von 2 Stunden beginnend mit dem Anfang der Blutentnahme. Wie aus den Daten in 5 hervorgeht, führte eine Blutverdünnung mit Pentastärke allein zu einem signifikant verkürzten Überleben, während eine Blutverdünnung entweder mit PEGHb allein oder mit PEGHb + Pentastärke zu vollständigem Überleben führte; Überleben nach einer Blutverdünnung mit den áá-Hb enthaltenden Zusammensetzungen war sehr viel niedriger als bei den PEGHb enthaltenden Zusammensetzungen.

6A–D zeigt graphisch den Säure-Base-Status von Kontrollratten (?) und von Ratten nach der Austausch-PEG-Hb transfusion with Pentastärke (?), áá-Hb (|), (?), Pentastärke + áá-Hb (?) und Pentastärke + PEG-Hb (?) und nach Beginn einer 60%igen Blutentnahme. 6A zeigt den PaO2, 6B zeigt den PaCO2, 6C zeigt den arteriellen pH-Wert und 6D zeigt den Basenüberschuß.

6A–D betreffen den über einen Zeitraum von 2 Stunden vom Beginn der Blutentnahme an bestimmten Säure-Base-Status der Tiere. Genauer gesagt zeigt 6A den PaO2, 6B zeigt den PaCO2, 6C zeigt den arteriellen pH-Wert and 6D zeigt den Basenüberschuß. Wie aus 6A–C hervorgeht, hatten weder die PEGHb-noch die PEGHb + Pentastärke-Tiere eine signifikante respiratorische Alkalose verglichen mit den Pentastärke-Tieren. Außerdem entwickelten weder die PEGHb- noch die PEGHb + Pentastärke-Tiere eine signifikante Acidose, selbst nicht gegen Ende des Blutentnahmezeitraums. Der Säure-Base-Status war bei den PEGHb- und PEGHb + Pentastärke-Tieren gut konserviert (6D). Wiederum schnitt keine der áá-Hb enthaltenden Zusammensetzungen so gut ab wie die PEGHb + Pentastärke-Tiere bzw. die Pentastärke-Tiere.

7 zeigt die Produktion von Milchsäure nach Verabreichung jeder der Zusammensetzungen. Wie in 7 gezeigt produzierten die áá-Hb-Tiere (allein und in Kombination mit Pentastärke) und die Pentastärke-Tiere signifikant mehr Milchsäure während der Blutentnahme als die Tiere in den anderen Gruppen. Bemerkenswerterweise kam es bei den Kontrolltieren (keine vorherige Austauschtransfusion) und den PEGHb + Pentastärke-Tieren zu ungefähr gleichen minimalen Anstiegen bei der Milchsäure, obwohl die Gesamthämoglobinkonzentration und der Hämatokrit bei der PEGHb + Pentastärke-Gruppe signifikant geringer waren (siehe Tabelle 13).

8A zeigt den mittleren arteriellen Blutdruck von Kontrollratten (?) und von Ratten nach der Austauschtransfusion mit Pentastärke (?), PEG-Hb (?) und Pentastärke + PEG-Hb (?) zum Zeitpunt –60 Minuten und nach Beginn einer 60%igen Blutentnahme zum Zeitpunkt 0 Minuten. Wie aus den Daten in 8A hervorgeht, stieg der Blutdruck in keiner der Gruppen während der Austauschtransfusion (d.h. von –60 bis 0 Minuten) an, fiel jedoch bei den Kontrolltieren und den PentastärkeTieren während der Blutentnahme (d.h. von 0 bis 120 Minuten) beträchtlich ab. Sowohl die PEGHb- als auch die PEGHb + Pentastärke-Zusammensetzungen "schützten" die Tiere gegen einen Blutdruckabfall.

8B zeigt den mittleren arteriellen Blutdruck von Kontrollratten (?) und von Ratten nach der Austauschtransfusion mit Pentastärke (?, Punkt B), áá-Hb (|, Punkt B) und Pentastärke + áá-Hb (?, Punkt A) und nach Beginn einer 60%igen Blutentnahme (Punkt C). Wie aus 8B hervorgeht, erhielten die Kontrolltiere und die Pentastärke-Tiere den mittleren arteriellen Druck besser aufrecht als die Pentastärke + áá-Hb-Tiere.

9 und 10 zeigen das relative Herzzeitvolumen beziehungsweise den systemischen Gefäßwiderstand. Herzzeitvolumen bezieht sich auf die in einer Zeiteinheit vom Herzen gepumpte Menge an Blut (z.B. Liter pro Minute); das relative Herzzeitvolumen bezieht sich auf das Herzzeitvolumen der drei experimentellen Gruppen relativ zum Kontrollzeitraum (–30 Minuten). Wie in 9 gezeigt war das Herzzeitvolumen im Vergleich zu den anderen Gruppen bei PEGHb und PEGHb + Pentastärke höher.

Aus 10 geht hervor, daß der systemische Gefäßwiderstand sowohl bei den PEGHb- als auch bei den PEGHb + Pentastärke-Tieren im Vergleich zu den anderen Tieren niedrig blieb.

Aus den oben vorgelegten Ergebnissen geht hervor, daß die PEGHb + Pentastärke-Mischung áá-Hb enthaltenden Zusammensetzungen überlegen war. Darüber hinaus schnitt die PEGHb + Pentastärke-Mischung ähnlich ab wie die PEGHb-Zusammensetzung allein. Dies traf zu, obwohl die Hämoglobinkonzentration, der die Tiere ausgesetzt wurden, und die Menge an verwendetem Hämoglobinprodukt bei der Mischung um die Hälft geringer waren, was den Vorteil bietet, die Patienten verabreichte Hämoglobinkonzentration zu reduzieren und somit sowohl Kosten als auch mögliche Nebenwirkungen zu reduzieren. Wenngleich ein genaues Verständnis der Gründe für die Wirksamkeit der Mischung für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich ist: es wird angenommen, daß die Wirksamkeit von PEGHb + Pentastärke davon herrührt, daß alle vier zuvor angesprochenen Eigenschaften, nämlich onkotischer Druck, Viskosität, Sauerstoffaffinität und niedrige Sauerstoffkapazität, erhalten bleiben. Die Ergebnisse deuten sogar darauf hin, daß Zusammensetzungen, die i) eine sauerstofftragende Komponente (z.B. einen HBOC) mit hohem onkotischen Druck, hoher Sauerstoffaffinität und hoher Viskosität und ii) einen nicht-sauerstofftragenden Plasmaexpander mit ähnlichem onkotischen Druck und ähnlicher Viskosität enthalten, ein optimales Blutprodukt darstellen.

BEISPIEL 10 Überlebensdaten mit modifizierten Hämoglobinen, nicht-sauerstofftragenden Komponenten und Zusammensetzungen davon

Dieses Beispiel betrifft das Überleben von Tieren bei der Verwendung mehrerer modifizierter Hämoglobinprodukte (d.h. sauerstofftragender Komponenten), nicht-sauerstofftragender Komponenten und mehrerer eine sauerstofftragende Komponente und eine nicht-sauerstofftragende Komponente enthaltender Mischungen.

Experimentelles Protokoll

Allgemein gesprochen wurden die Experimente der Beispiele 10–15 wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten 24 Stunden vor der Blutverdünnung unter Narkose instrumentiert. Die Instrumentierung bestand aus einer Kannülierung der Oberschenkelarterie und -vene, wobei die Katheter so nach außen geführt wurden, daß sich die Tiere in den nächsten 24 Stunden in ihren Käfigen frei bewegen konnten. Alle Experimente wurden mit wachen Tieren durchgeführt, die leicht immobilisiert waren, um heftige Bewegungen zu verhindern. An der einen Oberschenkelarterie wurde kontinuierlich der arterielle Druck aufgezeichnet. Anschließend wurde bei einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min 50% des geschätzten Blutvolumens (60 ml/kg) gegen Testmaterial ausgetauscht. Dies geschah mit einer peristaltischen Pumpe, so daß Entnahme und Infusion gleichzeitig mit der selben Geschwindigkeit erfolgten.

Mit der Blutentnahme wurde nach der Austauschtransfusion begonnen; das berechnete Blutentnahmevolumen entsprach 60% des ursprünglichen Blutvolumens. Das Blut wurde nach einem einfachen exponentiellen Protokoll entnommen, so daß die Blutentnahme nach 60 Minuten abgeschlossen war. Genau gesagt wurde die Entnahmepumpe über kürzerwerdende Zeitspannen zu Beginn jedes 10-Minuten-Intervalls insgesamt 60 Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ml/min betrieben.

Überleben der Tiere

In Tabelle 14 sind alle in den Experimenten verwendeten Materialien zusammengefaßt. Bezogen auf Tabelle 14 sollte angemerkt werden, daß die Bezeichung "DBBF" sich auf humanes Hämoglobin bezieht, das zwischen den alpha-Ketten quervernetzt ist ("áá-Hb"); dieses wurde von der Armee der Vereinigten Staaten hergestellt und als Geschenk zur Verfügung gestellt. Es wurden zwei mit Polyethylenglycol modifizierte Hämoglobinprodukte getestet. Bei PHP-Hämoglobin handelt es sich um ein vom Menschen gewonnenes Produkt von Apex Bioscience, und PEGHb ist ein von Rindern gewonnenes Produkt, das von Enzon Inc. bezogen wurde. Die beiden PEG-modifizierten Hämoglobinprodukte (PHP und PEGHb) lieferten qualitativ die gleichen Resultate. Wenngleich bei den im folgenden beschriebenen Experimenten PEGHb verwendet wurde, werden bei der vorliegenden Erfindung auch andere PEG-modifiziertes Hämoglobin und eine nicht-sauerstofftragende Komponente enthaltende Produkte einschließlich – jedoch nicht darauf beschränkt – PHP enthaltenden Produkten in Betracht gezogen.

Eines der Hauptkriterien für einen wirksamen Blutersatzstoff ist ein längeres Überleben, und in Tabelle 15 sind mehrere Indikatoren für das Überleben der Tiere aufgeführt. Insbesondere sind in Tabelle 15 die mittleren Zeiten bis zum Eintreten des Todes angegeben; die mit "Erster Todesfall" betitelte Spalte bezieht sich auf die Anzahl an Minuten, die seit dem Beginn der Blutentnahme bis zum Tod des ersten Tieres verstrichen waren, und die mit "% Überleben" betitelte Spalte bezieht sich auf die Anzahl an Minuten, die bis zu dem Zeitpunkt, an dem 50% der Tiere gestorben waren, verstrichen.

Bei der Tabelle 15 enthielten alle der Blutproduktmischungen (d.h. Pentaspan® + HemoLink®; Hetastärke + HemoLink®; Pentaspan® + PEGHb und Pentaspan® + DBBF) in Tabelle 15 jeweils 50 Vol.-% sauerstofftragende Komponente und 50 Vol.-% nicht-sauerstofftragende Komponente. Diese Daten zeigen, daß alle modifizierten Hämoglobine (unabhängig von ihren Eigenschaften) nur mit der Ausnahme von durch Konjugation mit Polyethylenglycol (PEG) modifiziertem Hämoglobin verglichen mit den Kontrollen oder Pentaspan® ein vermindertes Überleben zeigen. Es war sogar so, daß bei den Studien mit einer Mischung aus PEGHb und einer nicht-sauerstofftragenden Komponente die meisten der Tiere nach der einstündigen Beobachtungsperiode nach der Blutentnahme noch am Leben waren.

Wie aus Tabelle 15 hervorgeht, schnitt bei den Blutproduktmischungen lediglich Pentaspan® + PEGHb genauso gut oder besser ab als die Kontrollen (bei den Kontrolltieren wurde keine Austauschtransfusion vorgenommen). Außerdem war Pentaspan® + PEGHb, was das Überleben betrifft, nahezu so effektiv wie PEGHb, was angesichts der Tatsache, daß das Gesamthämoglobin bei den Pentaspan®+PEGHb-Tieren niedriger ist und nur ungefähr 1 g/dl Plasmahämoglobin vorhanden ist, überrascht. Die Tierüberlebensdaten bei den anderen Blutproduktmischungen lagen deutlich unter denen bei den Kontrolltieren.

TABELLE 11

Wie bereits erwähnt sind bei den Pentastärke (z.B. Pentaspan®) und PEGHb enthaltenden Blutprodukten Viskosität, onkotischer Druck, Sauerstoffaffinität und Sauerstoffkapazität optimiert. Von den in Tabelle 14 aufgeführten Produkten weist lediglich PEGHb alle diese Eigenschaften auf. Ein Verdünnen von PEGHb mit einer anderen nicht-sauerstofftragenden Komponente (z.B. dem Plasmaexpander Hetastärke) würde zu einer Verminderung der Viskosität und des onkotischen Drucks des Blutprodukts führen, keine Änderungen bei der Sauerstoffaffinität bewirken, aber die Sauerstoffkapazität senken. Im Gegensatz dazu weisen die durch Kombination von PEG-modifiziertem Hämoglobin mit Pentastärke erhaltenen Mischungen eine Viskosität und einen onkotischen Druck auf, die bzw. der der bzw. dem von PEGHb allein sehr nahe kommt.

In den folgenden Beispielen werden mehrere verschiedene Blutproduktmischungen und -lösungen verglichen und die in den jeweiligen Gruppen von Experimenten gewonnenen physiologischen Daten zusammengefaßt. Aus den Daten geht hervor, daß die bevorzugten Blutersatzstoffprodukte die meisten, wenn nicht alle, der oben erwähnten Eigenschaften (d.h. onkotischer Druck, Viskosität, Sauerstoffaffinität und Sauerstoffgehalt) aufweisen.

BEISPIEL 11 Herkömmliche Plasmaexpander

In diesem Beispiel werden speziell die das Tierüberleben betreffenden Daten und die physiologischen Daten nach Austauschtransfusionen und Blutentnahme mit zwei herkömmlichen Plasmaexpandern (d.h. den nicht-sauerstofftragenden Komponenten Hetastärke (HS) und Pentastärke (PS) (siehe Tabelle 14)) verglichen. Die Experimente wurden wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt.

Produkteigenschaften

Hetastärke ist im Handel von Fresenius erhältlich, und Pentastärke wurde über den Handel von DuPont Merck bezogen. Beide Produkte enthalten Hydroxyethylstärke, wobei das niedrige Molekulargewicht von Pentastärke (250.000 Da gegenüber 480.000 Da) auf einen niedrigeren Hydroxyethylsubstitutionsgrad (0,45 verglichen mit 0,70) zurückzuführen ist. Dieser Unterschied führt zu einem höheren onkotischen Druck bei Pentastärke und ihrem schnelleren enzymatischen Abbau im Blutkreislauf. Aufgrund ihres höheren onkotischen Drucks hat Pentastärke eine größere Plasmaexpansionsfähigkeit.

Überleben der Tiere

Gesamtüberleben der Tiere bei den beiden Gruppen von Testtieren (Pentastärke und Hetastärke) und den Kontrolltieren sind in Tabelle 15 oben gezeigt. Die Daten sind im Einklang mit den Daten für den hämodynamischen Sauerstofftransport und den Säure-Base-Daten. Das heißt, die Pentastärke-Tiere überleben signifikant länger als die Hetastärke-Tiere, aber beide überleben weniger lange als die Kontrollen.

Hämatokrit and Hämoglobin

Aus den Tabellen 16, 17 und 18 gehen der Hämatokrit, das Gesamthämoglobin beziehungsweise das Plasmahämoglobin hervor. In den Tabellen 16-18 ist "n" = die Anzahl der Tiere in dem Experiment, "NB" = nicht bestimmt, "Post-AT" = unmittelbar nach der Austauschtransfusion und "60 min" = nach der 60minütigen Blutentnahme.

TABELLE 16
  • * 50-Minuten-Probe.
  • # 30-Minuten-Probe.
TABELLE 17
  • * 50-Minuten-Probe.
  • # 30-Minuten-Probe.

TABELLE 18

Aus den Daten in Tabelle 16 geht hervor, daß sowohl Pentastärke als auch Hetastärke das Blut, gemessen durch den Post-Austausch-Hämatokrit, in ähnlichem Grade verdünnen. Nach der Entnahme von 60% des Blutes war der Hämatokrit bei den Hetastärke-Tieren jedoch signifikant niedriger als bei den Pentastärke-Tieren. In ähnlicher Weise zeigt Tabelle 17, daß das Gesamthämoglobin nach der Blutverdünnung bei beiden Tiergruppen ähnlich war, die Hetastärke-Tiere nach der Blutentnahme jedoch einen signifikant niedrigeren Hämoglobinwert hatten.

Hämodynamik

Verglichen mit den Kontrollen fiel sowohl bei der Gruppe, bei der das Blut mit Pentastärke verdünnt worden war, als auch bei der Gruppe, bei der das Blut mit Hetastärke verdünnt worden war, der Blutdruck nach Beginn der Blutentnahme rapide ab (Daten nicht gezeigt). Bei den Pentastärke-Tieren kam es zu einer schnelleren Erholung, die besser aufrechterhalten wurde als bei der Hetastärkegruppe, aber nach den ersten 40 Minuten der Blutentnahme hatten beide einen signifikant niedrigeren Blutdruck als die Kontrollen.

Sowohl bei der Hetastärke- als auch bei der Pentastärkegruppe stieg als Reaktion auf den Volumenverlust die Herzfrequenz; der Anstieg in der Hetastärkegruppe war jedoch abrupter als in der Pentastärke- oder Kontrollgruppe (Daten nicht gezeigt). Obwohl für die Durchführung der vorliegenden Erfindung ein Verständnis dieses Effekts nicht erforderlich ist: er ist höchstwahrscheinlich auf die signifikantere Plasmavolumenexpansion zurückzuführen, die nach dem Austausch mit der hyperonkotischen Pentastärke zu erwarten ist. In beiden Testgruppen setzte der Blutdruckanstieg während der Blutentnahme eher ein als bei den Kontrollen, wahrscheinlich aufgrund des signifikant niedrigeren Hämoglobin und Hämatokrit in den Tieren, bei denen ein Austausch vorgenommen worden war.

Der Parameter dP/dt gibt die maximale positive Steigung der Pulsdruckkontour wieder. Dieser Parameter ist proportional zum Einsetzen der systolischen Kontraktion und spiegelt somit die Stärke bzw. inotrope Kraft des Herzens wider. Bei den Kontrolltieren stieg der dP/dt nach Beginn der Blutentnahme, da das Herz versucht, seine Leistung zu erhöhen. Der dP/dt-Wert stieg in allen drei Gruppen, aber eher in der Hetastärkegruppe, verglichen mit der Pentastärkegruppe und den Kontrollen (Daten nicht gezeigt). Die dP/dt-Zunahme in der Pentastärkegruppe war der bei den Kontrollen beobachteten sogar sehr ähnlich, was nahelegt, daß die Plasmavolumenexpansion den Pentastärke-Tieren zugute kam.

Ventilation

Die Ventilation wird durch die PO2- und PCO2-Messungen wiedergegeben. Der Anstieg beim PO2 und der Abfall des PCO2 (Daten nicht gezeigt) war bei den HetastärkeTieren im Vergleich zu den Pentastärke-Tieren ausgeprägter, aber beide waren signifikanter als bei den Kontrollen. Dies spiegelt die beeinträchtigte Sauerstoffversorgung während der Blutentnahme in der Rangordnung Hetastärke > Pentastärke > Kontrolle wider. Obwohl für die Durchführung der vorliegenden Erfindung ein Verständnis des Mechanismus nicht erforderlich ist: es ist wahrscheinlich, daß beide Stärkeprodukte das Hämoglobin im Vergleich zur Kontrolle signifikant reduzieren, was erklärt, warum beide die Tiere mehr Streß aussetzen als die Kontrollen. Von Pentastärke und Hetastärke bietet jedoch Pentastärke eine bessere Kompensation der Blutentnahme, höchstwahrscheinlich aufgrund seiner besseren Plasmaexpansionsfähigkeit.

Säure-Base-Gleichgewicht und Milchsäure

Was den pH-Wert und den Basenüberschuß betrifft, so wurde die signifikanteste Beeinträchtigung während der Blutentnahme bei den Hetastärke-Tieren beobachtet, die einen dramatischen Abfall beim pH-Wert und beim Basenüberschuß zeigten (Daten nicht gezeigt). Die Pentastärke-Tiere waren im Vergleich zu den Kontrollen etwas mehr beeinträchtigt. Es sei angemerkt, daß die Kontrollen die Entnahme von 60% des Blutes eigentlich recht angemessen zu kompensieren schienen; genau gesagt, obwohl der PCO2 fiel und der Basenüberschuß negativer wurde, waren die Tiere dazu in der Lage, ihren pH-Wert im wesentlichen konstant zu halten.

Milchsäure ist ein exakter Indikator der Gewebeoxygenierung. Die Milchsäureakkumulation war bei den Hetastärke-Tieren signifikant größer als bei den Pentastärke-Tieren, und bei beiden Gruppen sammelte sich mehr Milchsäure an als bei den Kontrollen (Daten nicht gezeigt). Es sei angemerkt, daß die Milchsäurespiegel bei den Kontrollen ein Plateau erreichten, was nahelegt, daß die Geschwindigkeiten von Produktion und Clearance gleich sind, was ein weiterer Beleg dafür ist, daß die Blutung ausreichend kompensiert wird.

Die Ergebnisse aus diesem Beispiel zeigen, daß bei dem Austrauschtransfusion/Blutentnahme-Modell, das zur Anwendung gelangt, alle Kontrolltiere ungefähr 130 Minuten nach Beginn der Blutentnahme tot waren. Störungen des Sauerstofftransportsystems spiegelten sich in einer Reihe gemessener Variablen wider. Aus den Ergebnissen geht hervor, daß man einen Verlust der Hälfte des im Kreislauf befindlichen Blutvolumens weder mit Pentastärke noch mit Hetastärke ausgleichen kann. Ein Vergleich der beiden Plasmaexpander zeigt jedoch, daß Pentastärke Hetastärke klar überlegen ist. Obwohl für die Durchführung der Erfindung eine Erklärung für diesen Befund nicht erforderlich ist: man nimmt an, daß dies auf den höheren onkotischen Druck von Pentastärke zurückzuführen ist, was dann bei den PentastärkeTieren verglichen mit der Hetastärkegruppe zu einer signifikant größeren Plasmavolumenexpansion führt.

BEISPIEL 12 Blutproduktmischungen von Pentastärke und DBBF

In diesem Beispiel werden speziell das Überleben der Tiere und die physiologischen Daten nach Austauschtransfusionen und Blutentnahme mit einer Blutproduktmischung (50:50) von Pentastärke und DBBF (áá-Hb) verglichen. Die Experimente wurden wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt.

Überleben der Tiere

Das Überleben der Tiere bei den Kontrolltieren, bei den nur mit Pentastärke (PS) behandelten Tieren, bei den nur mit DBBF (áá-Hämoglobin) behandelten Tieren und bei den Tieren, denen eine Pentastärke + áá-Hb-Mischung verabreicht wurde, ist in 11 gezeigt. In 11 bedeutet (?) Pentastärke, (|) bedeutet áá-Hb und (?) bedeutet Pentastärke + áá-Hb. Wie aus 11 hervorgeht, ist das Überleben der áá-Hb-Tiere signifikant schlechter als sowohl bei den Kontrollen als auch bei den Pentastärke-Tieren, und eine 50/50-Mischung von áá-Hb und Pentastärke war sogar noch schlechter. Auch sollte angemerkt werden, daß es keine offensichtliche Beziehung zwischen dem Überleben und dem Hämatokrit (siehe Tabelle 16, oben) oder dem Hämoglobin (siehe Tabelle 17, oben) gab, so daß das Überleben nicht linear von dem im Blut transportierten Sauerstoff abzuhängen scheint.

Mittlerer Arteriendruck

Bei den PS/áá-Hb-Tieren und den áá-Hb-Tieren (Daten nicht gezeigt) stieg der mittlere Arteriendruck. Außerdem war, obwohl die Hämoglobindosis bei den PS/áá-Hb-Tieren die Hälfte betrug, die Größe des Blutdruckanstiegs die gleiche. Das Vorhandensein von PS schwächte den hämoglobininduzierten Bluthochdruck von ungefähr 20 mm Hg also nicht ab. Der Blutdruckabfall nach Beginn der Blutentnahme war jedoch bei den PS/áá-Hb-Tieren abrupter als bei den anderen 3 Gruppen. Die Erholung erfolgte etwas schneller, möglicherweise wegen der durch das Vorhandensein von Pentastärke bewirkten Plasmaexpansion. Nichtsdestotrotz fiel der Blutdruck beim terminalen Abfall sehr schnell, und die Tiere starben schnell. Ein sich aus dem Vorhandensein von áá-Hb-Hämoglobin ergebender Blutdruckanstieg scheint somit keine Vorteile zu bieten, und diese Wirkung wurde durch das Vorhandensein von PS nicht abgeschwächt.

Herzfrequenz

Bei den Kontrolltieren nahm nach Beginn der Blutentnahme die Herzfrequenz schrittweise zu (Daten nicht gezeigt). Obwohl für die vorliegende Erfindung ein Verständnis des diesem Effekt zugrundeliegenden Mechanismus nicht erforderlich ist: er ist höchstwahrscheinlich auf einen intravaskulären Volumenverlust zurückzuführen. Diese Interpretation wird durch die bei den Pentastärke-Tieren beobachtete etwas niedrigere Herzfrequenzreaktion gestützt, bei denen die Herzfrequenz trotz einer niedrigeren Hämoglobinkonzentration nicht in dem gleichen Maße stieg (Daten nicht gezeigt). Ein anderes Herzfrequenzreaktionsmuster wurde bei den áá-Hb-Tieren beobachtet; genauer gesagt, es gab einen sofortigen Herzfrequenzabfall nach Beginn der Austauschtransfusion, gefolgt von einem schrittweisen Anstieg nach Beginn der Blutentnahme (Daten nicht gezeigt). Der Abfall läßt sich nicht durch Volumenänderungen erklären, da man bei einer Kontraktion des Plasmavolumens mit einem Anstieg der Herzfrequenz und nicht mit einer Senkung rechnen würde. Es handelt sich hierbei mit größerer Wahrscheinlichkeit um eine direkte chronotrope Wirkung auf das Myokardium. Es sei angemerkt, daß diese dämpfende Wirkung vermindert wird, wenn man áá-Hb mit Pentastärke verdünnt (Daten nicht gezeigt). Bei den PS/áá-Hb-Tieren konnte nach Beginn der Blutentnahme ein schneller Anstieg der Herzfrequenz beobachtet werden, die rapide auf ungefähr 500/min stieg, eine Frequenz, die bei den anderen Gruppen erst zu einem späteren Zeitpunkt erreicht wurde. Die PS/áá-Hb-Mischung schien somit im Vergleich zu áá-Hb alleine keine Vorteile zu bieten.

dP/dt

Wie bereits ausgeführt handelt es sich bei dP/dt um die maximale positive Steigung der Pulsdruckkontour. Dieser Parameter ist proportional zum Einsetzen der systolischen Kontraktion und spiegelt daher die Stärke bzw. inotrope Kraft des Herzens wider. Bei den Kontrolltieren stieg dP/dt nach Beginn der Blutentnahme (Daten nicht gezeigt). Die Pentastärke-Tiere zeigten das gleiche Muster, wenngleich die Größe der Reaktion geringer war, vermutlich da diese Tiere verglichen mit den Kontrollen zu Beginn der Blutentnahme ein etwas größeres Gefäßvolumen hatten. Bei den áá-Hb-Tieren war dP/dt nie erhöht (Daten nicht gezeigt); es war sogar so, daß der Wert nach Beginn der Blutentnahme radide abnahm, was nahelegt, daß einer der normalen Kompensationsmechanismen gestört ist. Die gleiche Beobachtung wurde bei den PS/áá-Hb-Tieren gemacht, obwohl bei ihnen erwartet wurde, daß sie aufgrund des Vorhandenseins von onkotisch aktiver Pentastärke ein etwas größeres Gefäßvolumen haben sollten.

Ventilation

Bei einem entweder aufgrund von Anämie oder Hypoxie verminderten Sauerstofftransport ist es eine normale physiologische Reaktion, zu hyperventilieren. Hyperventilation führt zu einem PCO2-Abfall, da die Eliminierung von CO2 über die Lunge eine direkte Funktion der Ventilation ist. Ein reziproker Effekt ist ein erhöhter PO2, wiederum aufgrund des größeren über die Lunge ausgetauschten Gasvolumens pro Minute. Bei den Kontrolltieren sank der PCO2 nach Beginn der Blutentnahme (Daten nicht gezeigt); im Vergleich dazu fiel auch bei den Pentastärke-Tieren der PCO2 (Daten nicht gezeigt), aber der Effekt hielt über einen längeren Zeitraum an und schien ausgeprägter zu sein, wahrscheinlich als Resultat der niedrigeren Hämoglobinkonzentration in den Pentastärke-Tieren verglichen mit den Kontrollen (siehe Tabelle 17). Der PCO2-Abfall war bei den áá-Hb-Tieren signifikant größer, und noch größer bei den PS/áá-Hb-Tieren. Ein Vergleich der áá-Hb- und PS/áá-Hb-Tiere ist interessant, da erstere eine höhere Gesamthämoglobinkonzentration, aber ein geringeres Blutvolumen aufweisen. Die Zugabe von PS zum áá-Hb verschaffte den Tieren somit keine Vorteile und schien sogar zu einer höheren Hyperventilation zu führen.

Die PO2-Änderungen sind ein Spiegelbild der PCO2-Reaktion; der größte Anstieg beim PO2 (und Fall beim PCO2) wurde bei den áá-Hb- und PS/áá-Hb-Tieren beobachtet, während die Kontrollen und die PentastärkeTiere den kleinsten PO2-Anstieg hatten (Daten nicht gezeigt). Die Daten stehen somit im Einklang mit der Annahme, daß eine reduzierte Sauerstoffzufuhr zu Hyperventilation führt und daß der Hyperventilationsgrad mit dem Gesamtüberleben korreliert.

Säure-Basen-Status

Mit Fortschreiten der Blutentnahme und einer zunehmenden Beeinträchtigung der Sauerstoffversorgung der Gewebe wird Milchsäure produziert, und der pH-Wert fällt. Bei den Kontrolltieren wurde der pH-Wert mit dem Fortschreiten der Blutentnahme nahezu konstant gehalten. Ein anderer Indikator für das Ausmaß der Kompensation ist der Basenüberschuß, der als die Menge an Base definiert ist, der benötigt würde, um den Plasma-pH-Wert in Gegenwart eines PCO2 von 40 Torr wieder auf 7,4 zu bringen. Sowohl bei den Kontrollen als auch den PS-Tieren war der Basenüberschuß im Vergleich zur Baseline nicht signifikant verschieden (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu verursachten áá-Hb und insbesondere PS/áá-Hb einen deutlichen Abfall des pH-Wertes, der durch die schnelle Hyperventilation nicht kompensiert wird (Daten nicht gezeigt), und das Ergebnis war ein dramatischer Abfall des Basenüberschusses (d.h. es kommt zu einem "Basendefizit"). Nach den herkömmlichen klinischen Standards ist ein Basenüberschuß von –10 mÄq/l oder weniger ein Anzeichen für eine schlechte Erholung von einem hämorrhagischen Schock.

Schließlich ist Milchsäure ein direktes Maß für das Ausmaß der unzureichenden Sauerstoffversorgung der Gewebe (d.h. die "Sauerstoffschuld"). Sowohl bei den áá-Hb-Tieren als auch bei den PS/áá-Hb-Tieren kam es zu einer singifikanten Anreicherung von Milchsäure, wobei der Anstieg bei letzteren noch steiler war als bei den erstgenannten (Daten nicht gezeigt). Von Interesse ist auch, daß es bei den Konrollen und den Pentastärke-Tieren zu einem etwas moderaterem Lactatanstieg kam, der dann ein Plateau zu erreichen schien, als die Kompensationsmechanismen der Tiere (erhöhtes Herzzeitvolumen, Ventilation) den Blutverlust zu kompensieren schienen. Der kontinuierliche lineare Milchsäureanstieg sowohl bei den áá-Hb- als auch bei den PS/áá-Hb-Tieren deutet jedoch auf eine fortschreitende, ungesteuerte Gewebeübersäuerung hin.

Die oben angesprochenen Ergebnisse zeigen, daß die Verwendung von Blutproduktmischungen, die áá-Hb als sauerstofftragende Komponente enthalten, obwohl hierdurch etwas Plasmahämoglobin bereitgestellt wird, die Tiere in einer hinsichtlich der Blutentnahme anfälligeren Position ließ, als dies bei den Kontrollen oder den Tieren, bei denen das Blut mit Pentastärke verdünnt worden war, der Fall war. Es war nicht möglich, durch Zugabe von Pentastärke zu áá-Hb die abträglichen Effekte von áá-Hb zu kompensieren; es war sogar so, daß es hinsichtlich Sauerstoffversorgung, Übersäuerung und Gesamtüberleben zu einer Verschlechterung kam.

BEISPIEL 13 Blutproduktmischungen von HemoLink®/Pentastärke und HemoLink®/Hetastärke

In Beispiel 8 werden die Wirkungen von Pentastärke, HemoLink® und Mischungen davon verglichen. In diesem Beispiel wird eine Mischung von HemoLink®/Pentastärke mit einer Mischung von HemoLink® und einer anderen nicht-sauerstofftragenden Komponente (Hetastärke) verglichen. Bei den Experimenten in diesem Beispiel, die wie in Beispiel 10 beschrieben durchgeführt wurden, wird speziell das Überleben der Tiere und die physiologischen Daten nach Austauschtransfusionen und Blutentnahme verglichen.

Wie bereits angeführt handelt es sich bei HemoLink®. (Hemosol) um ein polymerisiertes humanes Hämoglobin mit einem Molekulargewicht von ungefähr 128.000 Da. Da es sich bei HemoLink® um ein polymerisiertes Produkt handelt, sind im Endprodukt eine Menge verschiedener Molekülgrößen vorhanden. Bei Test nur für sich schnitt die Blutverdünnung mit HemoLink® nicht so gut ab wie Pentastärke, und die Tiere starben eher als die in der Kontroll- oder Pentastärkegruppe (siehe z.B. Beispiel 8). Angesichts der überraschenden und positiven Ergebnisse mit einer Mischung von Pentastärke und PEGHb wurden in diesem Beispiel zusätzliche Experimente mit Mischungen (50/50) von HemoLink® und einer nicht-sauerstofftragenden Komponente (Hetastärke oder Pentastärke) durchgeführt.

Überleben der Tiere

Wie in 12 gezeigt, war bei einer Austauschtransfusion mit HemoLink® allein das Überleben nach einer Entnahme von 60% des Blutes reduziert. Genauer gesagt geht aus 12 das Überleben der Tiere nach Austauschtransfusion mit Hetastärke (×), HemoLink® (?), HemoLink® + Pentastärke (V) und Hetastärke + HemoLink® (?) und nach Beginn einer 60%igen Blutentnahme hervor.

Der Hämatokrit nach dem Austausch in den HemoLink®-Tieren (Tabelle 16, oben) betrug etwa die Hälfte des Hämatokrits bei den Kontrollen und war etwas niedriger als der bei den Pentastärke-, DBBF (áá-Hb)- oder PS/DBBF-Tieren. Die Plasmahämoglobinwerte waren jedoch bei den HemoLink®-Tieren etwas höher als in diesen anderen Gruppen (Tabelle 16, oben). 12 zeigt, daß keine der Kombinationen von HemoLink® und entweder Pentastärke oder Hetastärke (gemessen am Kurzzeit-Überleben) so effektiv war wie die Kontrolltiere. Im Gegensatz zu der in Beispiel 12 beschriebenen Situation mit DBBF und Pentastärke führte die Verdünnung von HemoLink® entweder mit Pentastärke oder mit Hetastärke jedoch beim Überleben zu keiner Verschlimmerung.

Mittlerer Arteriendruck

Eine Austauschtransfusion mit HemoLink® führte zu einer leichten Erhöhung des mittleren arteriellen Blutdrucks (Daten nicht gezeigt), die jedoch nicht so signifikant war wie bei DBBF (áá-Hb) (Beispiel 12). Nach Beginn der arteriellen Blutentnahme fiel der Blutdruck in allen vier Tiergruppen (d.h. HemoLink® allein; HemoLink®/Pentastärke; HemoLink®/Hetastärke und Kontrolle) abrupt (Daten nicht gezeigt). Das Ausmaß des anfänglichen Blutdruckabfalls war in der HemoLink®/Hetastärke-Gruppe am stärksten (120 bis 50 mm Hg), verglichen mit 110 bis 80 mm Hg bei den Kontrollen, 120 bis 90 mm Hg bei den HemoLink®/Pentastärke-Tieren und 120 bis 80 mm Hg bei den nur mit HemoLink® behandelten Tieren. Nach dem Blutdruckabfall und dem Gesamtüberleben zu urteilen schienen die HemoLink®/Hetastärke-Tiere, die HemoLink®-Tiere und die HemoLink®/Pentaspan-Tiere (in dieser Reihenfolge) alle schlechter abzuschneiden als die Kontrollen. Nichtsdestotrotz war das Gesamtüberleben bei den HemoLink®/Hetastärke- und HemoLink®/Pentaspan-Tieren (Tabelle 15, oben) nicht anders und nur geringfügig besser als bei den nur mit HemoLink® behandelten Tieren.

Herzfrequenz

Sowohl die HemoLink®- als auch die HemoLink®/Pentaspan-Tiere erhöhten ihre Herzfrequenz als Reaktion auf die Blutentnahme, der Anstieg setzte jedoch frührer ein als bei den Kontrollen und war steiler (Daten nicht gezeigt); dies deutet auf eine geringere Herzkreislaufstabilität bei den austauschtransfundierten Tieren verglichen mit den Kontrollen hin. Überraschenderweise fiel bei den HemoLink®/Hetastärke-Tieren die Herzfrequenz nach Beginn der Blutentnahme abrupt; diese anomale Reaktion könnte auf eine verglichen mit den anderen Gruppen schwerwiegende Beeinträchtigung hindeuten.

dP/dt

Bei den HemoLink®-Tieren wurde nach der Austauschtransfusion verglichen mit den Kontrollen ein erhöhter dP/dt beobachtet (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, daß das Herzkreislaufsystem durch den Austausch selbst destabilisiert wurde. Die Pentastärke/Hemo-Link®-Tiere zeigten wenn überhaupt nur geringe dP/dt-Zunahmen, während die Reaktion bei den Hetastärke/Hemo-Link®-Tieren bemerkenswert war: hier kam es nach Beginn der Blutentnahme zu einem abrupten Anstieg, der zu einem Spitzenwert von fast 2000 mm Hg/sec führte, worauf es zu einem rapiden Abfall kam, während die Tiere schwer beeinträchtigt waren und starben (Daten nicht gezeigt).

Ventilation und Säure-Basen-Status

Der bei allen drei experimentellen Gruppen beobachtete Anstieg des PO2 und der Abfall des PCO2 war größer als die Kontrollwerte; zwischen diesen Gruppen liessen sich jedoch keine Unterschiede finden (Daten nicht gezeigt).

Alle experimentellen Gruppen wiesen während der Blutentnahme einen niedrigeren pH-Wert als die Kontrollgruppe auf. Die Säure-Base-Störung zeigte sich deutlicher am Basenüberschuß, da alle drei experimentellen Gruppen schwer azidotisch (negativer Basenüberschuß) wurden, was abrupt nach Beginn der Blutentnahme einsetzte. Schließlich kam es bei allen drei experimentellen Gruppen zu einer sehr signifikanten Milchsäurezunahme, was nochmals das Vorhandensein einer schweren Azidose bestätigt (Daten nicht gezeigt).

Es war bereits gezeigt worden, daß HemoLink® nicht so gut abschnitt wie die Kontrollen oder so gut wie Pentastärke allein; außerdem schnitten HemoLink® allein und Hetastärke allein vergleichbar ab, keines konnte jedoch so gut Schutz gewähren wie Pentastärke allein. Wie aus diesem Beispiel hervorgeht, wurden die Ergebnisse durch Versuche zur Verbesserung des Abschneidens von HemoLink® durch Mischen entweder mit Pentastärke oder mit Hetastärke nicht verbessert.

BEISPIEL 14

Blutproduktmischungen von TM-Hämoglobin/Pentastärke In diesem Beispiel werden speziell das Überleben der Tiere und die physiologischen Daten nach Austauschtransfusionen und Blutentnahme mit einer Blutproduktmischung (50:50) von Pentastärke und TM-Hämoglobin verglichen; Trimesinsäure (TM) wird zum Quervernetzen von Hämoglobin verwendet. Die Experimente wurden wie in Beispiel 10 durchgeführt.

Überleben der Tiere

TM-Hämoglobin (Hemosol) ist ein von humanem Hämoglobin abgeleitetes Produkt mit einem Molekulargewicht von ungefähr 64.000 Da. Es hat eine relativ geringe Sauerstoffaffinität (P50 etwa 35 Torr). Studien mit TM-Hämoglobin allein zeigten zu denen mit DBBF (áá-Hb) allein keine signifikanten Unterschiede (siehe Beispiel 12). Alle Tiere, die TM-Hämoglobin allein oder in Kombination mit Pentastärke erhielten, starben innerhalb von 60 Minuten nach dem Start der Blutentnahme (nur ein Tier wurde mit einer Mischung von TM-Hämoglobin und Pentastärke getestet, und es starb 60 Minuten nach Beginn der Blutentnahme).

Mitterer Arteriendruck, Herzfrequenz und dP/dt

Die Austauschtransfusion führte zu einem moderaten Anstieg des mittleren arteriellen Blutdrucks des einzelnen mit TM-Hämoglobin/Pentastärke getesteten Tieres. Nach dem Start der Blutentnahme fiel der Druck abrupt, erholte sich dann jedoch recht schnell; mit fortschreitender Blutentnahme, als der mittlere Arteriendruck wieder zu fallen begann, starb das Tier sehr plötzlich (Daten nicht gezeigt).

Sowohl bei TM-Hämoglobin als auch bei der TM-Hämoglobin/Pentastärke-Mischung kam es zu einem leichten Abfall der Herzfrequenz nach der Austauschtransfusion. Nach einer Verzögerung von 20 Minuten stieg in beiden Gruppen die Herzfrequenz während der Blutentnahme.

Was den dP/dt betrifft, so bewirkte im Gegensatz zu vielen der anderen Hämoglobinzubereitungen TM-Hämoglobin/Pentastärke oder TM-Hämoglobin allein keine Zunahme beim dP/dt. Stattdessen kam es zu einer stetigen Abnahme, die einsetzte, nachdem mit der Blutentnahme begonnen worden war (Daten nicht gezeigt).

Ventilation und Säure-Basen-Status

Wie in vorhergehenden Beispielen angemerkt ändern sich PO2 und PCO2 spiegelbildlich, was die Hyperventilation reflektiert, die mit dem verminderten Sauerstofftransport bei fortschreitender Blutentnahme einhergeht. Der bei beiden experimentellen Gruppen beobachtete Anstieg des PO2 und Abfall des PCO2 war größer als die Kontrollwerte (die Gruppen selbst unterschieden sich nicht; Daten nicht gezeigt).

Was den arteriellen pH-Wert, Säure und Base betrifft, so zeigten beide experimentellen Gruppen während der Blutentnahme einen niedrigeren pH-Wert als die Kontrollgruppe; Basenüberschußbestimmungen zeigten, daß die beiden experimentellen Gruppen nach Start der Blutentnahme abrupt schwer azidotisch wurden (negativer Basenüberschuß) (Daten nicht gezeigt). Schließlich kam es in beiden experimentellen Gruppen zu einer sehr signifikanten Zunahme bei der Milchsäure (Daten nicht gezeigt), was ebenfalls das Vorhandensein einer schweren Azidose bestätigte.

Wie bereits angedeutet (siehe Tabelle 15) schnitt TM-Hämoglobin nicht so gut ab wie die Kontrollen oder Pentastärke. TM-Hämoglobin und Pentastärke/TM-Hämoglobin schnitten vergleichbar ab, keines bot jedoch einen so guten Schutz wie Pentastärke allein. Versuche, die Leistungsfähigkeit von TM-Hämoglobin durch Mischen mit Pentastärke zu verbessern (von denen in diesem Beispiel berichtet wird), führten nicht zu besseren Ergebnissen. TM-Hämoglobin hat eine verglichen mit den anderen untersuchten Hämoglobinderivaten niedrige O2-Affinität, und die oben angeführten Ergebnisse zeigen, daß diese niedrige Affinität zu keinen Vorteilen gegenüber den anderen quervernetzten Hämoglobinen, deren andere physikalische Eigenschaften die gleichen waren (z.B. DBBF), führten.

BEISPIEL 15 Modifizierte Hämoglobine

Wie oben beschrieben ließ sich mit Mischungen von polyethylenglycolmodifiziertem Rinderhämoglobin und Pentastärke ein verglichen mit Mischungen, die andere nicht-sauerstofftragende Komponenten enthielten, längeres Überleben der Tiere erzielen. Um festzustellen, ob diese Resultate auf die Mischung oder das Rinderhämoglobin selbst zurückzuführen sind, wurde ein Experiment durchgeführt, bei dem gereinigtes Rinderhämoglobin untersucht wurde. Darüber hinaus wurden Experimente mit â82-Hämoglobin, einem Produkt mit hoher Sauerstoffaffintät, durchgeführt, um zu bestimmen, ob dieses Produkt allein den für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenen Mischungen aus einer sauerstofftragenden Komponente und einer nicht-sauerstofftragenden Komponente überlegen sein könnte. Wie bei den vorhergehenden Beispielen werden bei den Experimenten dieses Beispiels unter Anwendung des in Beispiel 10 beschriebenen experimentellen Protokolls speziell das Überleben der Tiere und die physiologischen Daten nach Austauschtransfusionen und Blutentnahme verglichen.

Rinderhämoglobin

Kurz gesagt: unterzog man das Tier einer Austauschtransfusion mit Rinderhämoglobin, so kam es nur zu einem vorübergehenden Anstieg des mittleren arteriellen Blutdrucks, gefolgt von einem stetigen Abfall (Daten nicht gezeigt). Zu Beginn der Blutentnahme fiel der mittlere Arteriendruck steil ab, und das Tier starb ungefähr 30 Minuten nach den Start der Blutentnahme (Daten nicht gezeigt).

Die Herzfrequenz in diesem Tier stieg zu Beginn der Blutentnahme nicht signifikant an, es kam jedoch zum Ende hin, einige Minuten bevor das Tier starb, zu einem mäßigen Anstieg. dP/dt blieb konstant, im Gegensatz zu den Kontrollen, bei denen dieser Parameter stets als Reaktion auf die Blutentnahme anstieg. Schließlich, was den pH-Wert und den Säure-Base-Status betrifft, hyperventilierte das Tier stark, was sich in einem Anstieg des PO2 und einem Abfall des PCO2 äußerte. Dementsprechend kam es zu einem steilen Abfallen des pH-Wertes und des Basenüberschusses und einem starken Anstieg bei der Milchsäure (Daten nicht gezeigt).

â82-Hämoglobin

â82-Hämoglobin (Hemosol) ist ein Derivat von humanem Hämoglobin, das zwischen den â-Ketten quervernetzt ist (im Gegensatz zu DBBF [áá-Hb]). Dieses Produkt hat eine hohe Sauerstoffaffinität, jedoch eine geringe Viskosität und einen geringen onkotischen Druck.

Wurden Tiere einer Austauschtransfusion mit â82-Hämoglobin unterzogen, so kam es zu einem sehr vorübergehenden, aber deutlichen, Blutdruckanstieg; die Größe des Anstiegs war ungefähr die gleiche wie die, die bei áá-Hb beobachtet wurde, aber der mittlere Arteriendruck kehrte schnell wieder auf den Wert vor der Infusion zurück (Daten nicht gezeigt). Bei Beginn der Blutentnahme fiel der Blutdruck rapide, und die Tiere waren nach ungefähr 70 Minuten tot. Das Gesamtüberleben war somit nicht besser als bei áá-Hb-Hämoglobin und weniger als bei den Kontrollen und den Pentastärke-Tieren.

Weder nach dem Austausch noch nach der Blutentnahme stieg die Herzfrequenz signifikant, und dies war auch nicht beim dP/dt der Fall. Die Tiere zeigten eine deutliche Hyperventilation (erhöhter PO2 und erniedrigter PCO2). Eine schwere Azidose äußerte sich in einem dramatischen Abfall des pH-Wertes, einem Basenüberschuß und einem Anstieg der Milchsäure (Daten nicht gezeigt).

Die Experimente mit den modifizierten Hämoglobinprodukten dieses Beispiels führten somit nicht zu besseren Ergebnissen als den beim Einsatz von Mischungen aus Pentaspan® and PEGHb erhaltenen.

BEISPIEL 16 Beurteilung verschiedener Hämoglobinlösungen

In diesem Beispiel wurden drei Hämoglobinlösungen beurteilt (siehe Tabelle 19), einschließlich: 1) gereinigtes humanes Hämoglobin Ao (Hb-Ao); 2) áá-Hämoglobin, mit Bis(3,5-dibromsalicyl)fumarat quervernetztes humanes Hämoglobin; 3) PEG-Hämoglobin, mit Polyethylenglycol oberflächenmodifiziertes Rinderhämoglobin. Die PEG-Einheiten haben ein Molekulargewicht von 5.000 Da.

Humane rote Blutkörperchen von gesunden Probanden wurden in Heparin-Antikoagulationsmittel entnommen, dreimal durch vorsichtiges Zentrifugieren mit 0,9% NaCl gewaschen und in 0,1 M Bis-tris-Cl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4 resuspendiert. Die Hämoglobinkonzentration aller Lösungen und Suspensionen der roten Blutkörperchen betrug ungefähr 3 mM (Häm). Methämoglobin war stets weniger als 2–4% des Gesamthämoglobins. Die Testlösungen wurden mit einem Tonometer (z.B. Modell 2000, Instrumentation Laboratories, Lexington, Mass., USA) auf die entsprechenden Gaskonzentrationen und 37°C äquilibriert. Humanes Serumalbumin (HSA) wurde über den Handel bezogen.

Die Testmethoden schlossen die folgenden Protokolle ein, deren Ergebnisse in Tabelle 19 gezeigt sind. Dieses Beispiel stellt Verfahren für die Bestimmung verschiedener Eigenschaften einer Testzubereitung bereit, jedoch soll die vorliegende Erfindung nicht auf diese bestimmten Protokolle beschränkt sein. Der Fachmann wird mit weiteren für die Durchführung dieser Bestimmungen geeigneten Verfahren vertraut sein.

Sauerstoffgleichgewichtbindungskurven:

Gleichgewichtskurven von zellfreiem Hämoglobin/Sauerstoff wurden gemessen, indem man Diodenarrayspektrophotometrie mit enzymatischer Desoxygenierung von Oxyhämoglobinlösungen koppelte (Vandegriff et al, Anal. Biochem., 256: 107–116 [1998]). Das Protocatechusäure (PCA)/Protocatechusäure-3,4-dioxygenase-(PCD-)Enzymsystem verbraucht ein Mol O2 für jedes in Produkt umgewandelte Mol an PCA.

Die Umsetzungen wurden in 0,1 M Bis-trispropan (Sigma), 0,1 M Cl und 1 mM EDTA bei einem pH-Wert von 7,4 und 37°C durchgeführt. Die Hämoglobinproben wurden auf eine Konzentration von ungefähr 60 ìM (in Häm) in mit Luft äquilibriertem, temperaturäquilibriertem Puffer, der etwas Katalase (z.B. 0,2 bis 0,5 ìM) enthielt, durchgeführt. Die Hämoglobinendkonzentration wurde über den Extinktionskoeffizienten bei 523 nm (å523 = 7,12–1 mM) bestimmt. Das Substrat (PCA) wurde in einer Konzentration von 1 mM zugesetzt. Vor der Zugabe des Enzyms wurde die Reaktionszelle zum Verdrängen der Gasphase vollständig mit dieser Reaktionslösung gefüllt. Die Küvette wurde mit einem gasdichten Teflonstopfen, der mit einer Mikro-Sauerstoffelektrode (Microelectrodes, Inc., Londonderry, N. H., USA) ausgestattet war, die über einen in den Stopfen eingelassenen O-Ring eingeführt wurde, verschlossen. Die Elektrode wurde bis zu einer Position unmittelbar über dem Lichtpfad eines Milton Roy 3000 Diodenarrayspektrophotometers (SLM Instruments, Inc., Urbana, Ill., USA) in die Lösung eingetaucht. Die Temperatur wurde mit einem Peltier-Kontroller im Reaktionszellenhalter kontrolliert, und die Lösung wurde mit einem Mikrorührstäbchen, das mittels eines Rührmotors im Reaktionszellenhalter gedreht wurde, durchmischt. Die Desoxygenierungsreaktion wurde durch Zugabe von Enzym (PCD) (0,05 bis 0,1 Einheiten/ml) gestartet.

Die spektrale Veränderung von Hämoglobin während der enzymatischen Desoxygenierung wurde im sichtbaren Bereich von 480 bis 650 nm alle ~0,35 nm gemessen. Die polarographische Bestimmung des PO2 erfolgte mit einer Sauerstoffelektrode vom Clark-Typ, die eine der Änderung der Sauerstoffkonzentration proportionale Spannungsänderung lieferte. Die Elektrode wurde täglich geeicht, indem man die Elektrode in Wasser eintauchte, das entweder mit Luft durchspült wurde, um die Spannung bei 100 Luft zu bestimmen, oder mit reinem N2 durchspült wurde, um den Nullpunkt zu bestimmen. Während der Hämoglobinentsättigungsreaktion wurden die Spannungen von der O2-Elektrode mit einer Probenabnahmerate von 10 Hz gesammelt.

Für die Analyse wurden die Spektraldaten und die Spannungsdaten von der O2-Elektrode mit dem MATLAB-Programm für technische Berechnungen (The Mathworks, Natick, Mass., USA) in Dateien umgewandelt. Der Spannungsoutput von der O2-Elektrode wurde, basierend auf dem barometrischen Druck und dem Wasserdampfdruck bei der Temperatur, bei der das Experiment durchgeführt wurde, in mm Hg umgewandelt. Aus jeweils 50 Datenpunkten während jedes zeitlich der Aufnahme eines Spektrums entsprechenden 5-Sekunden-Intervalls wurde ein durchschnittlicher PO2-Wert berechnet.

Die Spektralmatrix wurde mit einem Mehrkomponentenzerfallsalgorithmus berechnet. Das Programm liefert die Fraktionen aller Basisspektren (Oxy-, Desoxy- und Methämoglobin), die zusammen das untersuchte gemessene Spektrum bilden. Die fraktionelle Sättigung wurde als Verhältnis von Oxyhämoglobin zum gesamten Oxy- plus Desoxyhämoglobin berechnet. Angepaßte Werte für die Adair-Konstanten a1–a4) wurden durch Methode-derkleinsten-Quadrate-Analyse mit einheitlicher Gewichtung bestimmt. Die Werte für P50 und den/die Hill-Koeffizienten wurden aus den angepaßten Adair-Konstanten (d.h. den in Tabelle 19 gezeigten Werten) berechnet.

Die Sauerstoffgleichgewichtskurven für die Suspensionen der roten Blutkörperchen wurden bei einem pH-Wert von 7,4 und 37°C nach dem Gasaustauschverfahren mit einem Hemox-Analyzer® (TCS Medical Products, Huntingdon Valley, Pa., USA) gemessen.

COP

Der COP wurde mit einem Wescor 4420-Kolloidosmometer (Logan, Utah, USA) mit einer 30.000-MG-Cutoff-Membrane gemessen. Das Osmometer wurde, wie vom Hersteller empfohlen, vor der Messung der einzelnen Hämoglobinproben jeweils mit 5%igem Albumin geeicht. Die Messungen erfolgten bei Raumtemperatur, die im Bereich von 20–23°C lag. Die in Tabelle 19 angegebenen Werte sind für Hämoglobinkonzentrationen von 5 g/dl.

Viskosität

Viscositätsmessungen werden mit einen Kapillarviskosimeter (Reinhardt, 1984) durchgeführt. Das Betriebsprinzip des Instruments beruht auf dem Hagen-Poiseuille-Gesetz, das den Fluß (Q) über den Radius der Kapillare (r), die Druckänderung entlang der Kapillare (dP/dx) und die Viskosität (g) definiert. Q = (ð r4 dP)/(8 ç dx)

Dieser Ausdruck kann in zwei Komponenten, die Scherspannung (L ist die Länge der Kapillare) und die Schergeschwindigkeit getrennt werden, wobei für Scherspannung und Schergeschwindigkeit gilt:

Scherspannung = (r/2ÄL)ÄP

Schergeschwindigkeit = (4/ðr3)Q

Viskosität ç = Scherspannung/Schergeschwindigkeit

Alle auf der Geometrie der Kapillare basierenden Parameter waren bekannt, jedoch nicht ÄP und Q. Diese beiden Variablen wurden also gemessen. Flüssigkeit wurde in die Spritzenpumpe (Harvard Apparatus, Modell 975, S. Natick, Mass., USA) gegeben, und es wurde mit dem Durchströmen begonnen. Die Enden eines 10-cm-Glaskapillarenröhrchens mit einem Innendurchmesser von 508 im (Vitro Dynamics, Rockway, N. J., USA) wurden über ein T-Ventil mit einem Differentialdruckumwandler (Validyne Engineering, Modell MP45-14, Northridge, Calif., USA) verbunden. Wenn Flüssigkeit durch das Röhrchen strömte, nahm der Umwandler den Druck an den jeweiligen T-Ventilpunkten auf. Der Umwandler war so angeordnet, daß es sich bei dem abgenommenen Wert um den ÄP zwischen den beiden T-Ventilpunkten handelt. Das Signal wurde verstärkt (Validyne Modell CD12) und auf einem Meßstreifen aufgezeichnet.

Der Fluß (Q) wurde mittels eines geeichten Flußröhrchens gemessen. Die Viskosität wurde aus ÄP und Q berechnet. Das Kapillarviskosimeter wurde sowohl statisch als auch dynamisch kalibriert, während der Druckumwandler mit einem Kochsalzlösungskopfdruck statisch kalibriert wurde; eine dynamische Eichung erfolgte mit Wasser. Die Lösungen wurden auf 37°C erwärmt und in das Viskosimeter gegeben. Bei den Messungen in dem Beispiel wurde eine Schergeschwindigkeit von 160 s–1 verwendet. Bei den in Tabelle 19 aufgeführten Werten handelt es sich um die Meßwerte für Hämoglobinkonzentrationen von 5 g/dl.

Tabelle 19.
  • (1) Vandegriff et al., Biophys. Chem., 69: 23–30 [1997].

Experimente mit künstlichen Kapillaren

Die Exit-PO2-Werte gegen die Verweilzeiten sind in 15 gezeigt. Bei einer gegebenen Durchflußgeschwindigkeit findet man den niedrigsten Exit-PO2-Wert für Hb-Ao, gefolgt von PEG-Hb, áá-Hb und roten Blutkörperchen mit den höchsten Exit-PO2-Werten. Die Hämoglobinendsättigung in der künstlichen Kapillare (6) wurde aus den in Tabelle 19 angeführten Adairkonstanten berechnet. Bei allen Durchflußgeschwindigkeiten zeigte PEG-Hb im Verlauf die geringste Entsättigung. Das Profil für die roten Blutkörperchen schloß sich dicht hieran an. Hb-Ao und áá-Hb zeigten beide einen sehr viel größeren Entsättigungsgrad.

Bei der Analyse der finiten Elemente werden die Werte für die punktförmig verteilten Diffusionparameter, K*, angeglichen, bis der Exit-PO2 dem experimentellen Wert entspricht. Die angepaßten Endwerte für K* als eine Funktion der Verweilzeit sind in 17 gezeigt. PEG-Hb und rote Blutkörperchen lieferten ähnliche Werte für K* von 900–1200 ìM/min/Torr. Die K*-Werte für Hb-Ao und áá-Hb sind aufgrund der Abwesenheit der intraluminalen Widerstände bei zellfreien Lösungen höher als die für rote Blutkörperchen. Dieser Effekt ist in der zellfreien PEG-Hb-Lösung, die einen K*-Wert gleich dem für rote Blutkörperchen bei der schnellsten Durchflußgeschwindigkeit und einen bei der langsamsten Durchflußgeschwindigkeit nur etwas höheren K*-Wert als die roten Blutkörperchen hat, aufgehoben. Dies ist auf wenigsten zwei physikalische Eigenschaften der PEG-Hb-Lösungen zurückzuführen (siehe Gleichung 2, oben): (1) ihre verglichen mit der tetrameren Lösung höhere Viskosität aufgrund ihrer größeren Molekülgröße und (2) ihre hohe O2-Affinität.

Tierexperimente

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (210–350 g, Charles River Labs) wurden mit 250 ìl einer Mischung aus Ketamin (71 mg/ml), Acepromazin (2,85 mg/ml) und Xylazin (2,85 mg/ml) betäubt. Über die Oberschenkelarterie wurden Polyethylenkatheter (PE-50) in die Bauchschlagader gelegt, so daß eine schnelle Entnahme von arteriellem Blut möglich war. Ein zweiter Katheter wurde zur Überwachung des Blutdrucks in die Oberschenkelarterie auf der gegenüberliegenden Seite gelegt, und für die Infusion von Testmaterialien wurde ein dritter Katheter in eine der Oberschenkelvenen gelegt. Die Katheter wurden subkutan gelegt, über den Schwanz nach außen geführt und mit ca. 100 ìl normaler Kochsalzlösung gespült. Die Tiere durften sich von dem Eingriff erholen und verblieben vor dem Einsatz in den Experimenten 24 Stunden lang in ihren Käfigen. Ein Oberschenkelarterienkatheter wurde über einen Absperrhahn mit einem Druckumwandler (UFI Modell 1050, Morro, Calif., USA) verbunden, und der Arteriendruck wurde mit einem MP100WSW-Datensammelsystem (BIOPAC Systems, Inc., Goleta, Calif., USA) kontinuierlich bei 100 Hz abgenommen. Die Daten wurden für eine anschließende Off-line-Analyse in digitaler Form gespeichert.

Die mittleren arteriellen Drücke vor und nach der Austauschtransfusion sind in 18 gezeigt. Alle Lösungen mit Ausnahme von PEG-Hämoglobin, dessen K*-Wert im wesentlichen mit dem von Lösungen roter Blutkörperchen identisch ist, zeigten eine signifikante Wirkung auf die Gefäße (siehe 17).

Ausgehend von den in diesen Experimenten erhaltenen Daten wird in Betracht gezogen, daß es als Folge eines Überangebots von Sauerstoff aufgrund der vermittelten Diffusion durch zellfreie Sauerstoffträger zu einer Selbstregulierung kommt. Die Menge an bereitgestelltem O2 sollte bei den Lösungen am größten sein, die die größte Wirkung auf die Gefäße haben. In vivo-Experimente mit einer 50%igen Austauschtransfusion in einer Ratte stimmen mit dieser Theorie insoweit überein, als die Zunahme beim mittleren Arteriendruck in etwa der geschätzten Diffusionskonstante K* entspricht. Bei K* scheint es sich somit um den Schlüsselparameter für die Optimierung der Eigenschaften eines potentiellen Ersatzstoffes für rote Blutkörperchen zu handeln.

BEISPIEL 17 Andere Hämoglobinzubereitungen

In diesem Beispiel werden weitere Hämoglobinzubereitungen beschrieben. Diese Zubereitungen lassen sich so modifizieren, daß Blutersatzstoffe mit den gewünschten Eigenschaften einer hohen Sauerstoffaffinität, einem hohen onkotischen Druck und einer relativ hohen Viskosität (d.h. wenigstens die Hälfte der von Blut) bereitgestellt werden.

A. Herstellung von humanem Hämoglobin A0

In diesem Experiment wird das humane Hämoglobin A0 von Christensen et al. (Christensen et al., J. Biochem. Biophys. Meth. 17: 143–154 [1988]) hergestellt.

Eine Einheit abgelaufener, abgepackter Zellen wird in 500-ml-Kunststoffzentrifugenflaschen dreimal mit steriler 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen. Die Waschlösung und die lederartige Haut werden abgesaugt. Die gepackten Zellen werden mit 2,5 Volumina destilliertem Wasser gemischt und 1 Stunde lang bei 20.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen und über ein Mischbett-Ionenaustauscherharz (Bio-Rex RG501-X8, Bio-Rad, Richmond, Calif., USA) in einer Säule gegeben. Der isoionische Ablauf wird über 0,22-ìm-Filter (Millipore Millistack 40, Bedford, Mass., USA) in sterile Behälter gegeben.

Für größere Mengen an stromafreiem Hämoglobin: 8 Einheiten gepackter Zellen werden wie oben gewaschen, und über Nacht kommt es im Kalten zur Hämolyse. Das Lysat wird in 600-ml-Transferpackungen (Fenwal 4B2024, Deerfield, Ill., USA) überführt und 6 Stunden lang bei 3500 × g zentrifugiert. Dann wird ungefähr 1/3 des Überstands der Hämoglobinlösung mit einem Plasmaextraktor abgenommen und über das Mischbettharz gegeben, bis die Leitfähigkeit ~15 ìmhos beträgt. Für dieses Verfahren sind 1 kg Harz erforderlich, das am zweckmäßigsten in drei Säulen gepackt wird. Die Lösungen werden nochmals in Transferpackungen gegeben und 4 Stunden lang bei 3500 × g zentrifugiert. Die Überstände werden über eine 0,22-im-Einwegfiltereinheit (Millipore Millistack, MSG05CHZ) filtriert, und das Filtrat wird in sterilen Transferpackungen gesammelt und für die Chromatographie bei 4°C aufbewahrt. Eine langfristige Lagerung erfolgt am besten durch Einfrieren (in Masse) bei –80°C.

Stromafreie Hämoglobinlösungen mit 10–20 g Hämoglobin werden mit 0,05 M Tris-HCl mit einem pH-Wert von 8,5 äquilibriert. Dies kann wie gewöhnlich durch Dialyse oder Pufferaustausch und Gelausschlußsäulen erfolgen. Da diese Lösungen jedoch isoionisch sind, ist es zweckmäßiger, sie einfach mit dem gleichen Volumen an 0,1 M Tris-HCl mit einem pH-Wert von 8,5 zu verdünnen. Die Chromatographie wird mit einer präparativen HPLC (Waters Delta-Prep 3000) durchgeführt. Die Probe (250–500 ml, 4–10 g/dl) wird auf eine mit QMA-Acell (Waters) vorgepackte Edelstahlsäule aufgebracht, die zuvor bei einer Fließgeschwindigkeit von 80 ml/min mit 1–2 Litern Puffer A (0,05 M Tris-HCl, pH 8,5) äquilibriert worden war. Das Chromatogramm wird mit einem linearen Gradienten von 0,05 M Tris-HCl, pH 6,5, als Reserve (Puffer B) bei der gleichen Fließgeschwindigkeit entwickelt. Die Änderung des pH-Wertes verläuft linear von 10% bis 90% Puffer B, wobei alle Hämoglobinspezies eluiert werden. Die Trennungen sind nach 50 Minuten beendet, wobei zu diesem Zeitpunkt der pH-Wert des ablaufenden Puffers 7,2 beträgt. Es wird weitere 10 Minuten lang mit Puffer B eluiert, um sicherzustellen, daß die Proben vollständig eluiert sind, und die Säule wird in Vorbereitung für die nächste Trennung wieder mit einem Liter Puffer A äquilibriert. Es ist möglich, bis zu 20 g auf einer Säule zu verarbeiten, hierbei scheint die Säule jedoch überladen zu sein. Die Säule wird täglich mit 1 Liter 0,1 M Tris-HCl, pH 7,4, in 0,1 M NaCl, gespült. Ist die Säule nicht in Betrieb, so wird mit 70%igem Ethanol äquilibriert.

Der Peaknachweis mit der präparativen Zelle (Länge des Pfades 2,1 mm) erfolgt bei 510 nm und/oder 600 nm. Letztere Wellenlänge ist für die höheren Konzentrationen und zur Verstärkung des Signals von Methämoglobin erforderlich. Die Hauptfraktion von Hb-Ao wird so gesammelt, daß eine Aufnahme von Methämoglobin an der vorlaufenden Kante und eine Verunreinigung mit Hämoglobinnebenkomponenten an der nachlaufenden Kante vermieden wird. Die Fraktion wird in ein in einem Eiseimer befindliche sterile 2-Liter-Transferpackung gesammelt und aseptisch in einen mit einer TM10-Membrane (10.000 Da cut-off) ausgestatteten sterilen 2-Liter-Amiconkonzentrator (Modell 2000B, Danvers, Mass., USA) transferiert, und das Volumen wird bei 4°C auf etwa 10% des Eluatvolumens reduziert.

B. Quervernetzungsreaktion zur Erniedrigung des P50

In diesem Experiment werden verschiedene Quervernetzungsmethoden daraufhin untersucht, ob es mit ihnen möglich ist, den P50 zu senken. In einem Experiment wird das Verfahren von Walder et al. (Walder et al. Biochem., 18: 4265–4270 [1979]) zur Herstellung von Bis-(3,5-dibromsalicyl)fumarat (DBBF) und Bis(3,5-dibromsalicyl)succinat (DBBS) (&bgr;82–&bgr;82) angewendet. Die chemischen Modifikationen von humanem Hämoglobin werden in 6-g/dl-Lösungen von zellfreiem Oxyhämoglobin in 0,05 M Natriumphosphat oder in 0,05 M Bistris-HCl, pH 7,2, durchgeführt. Inkubationen erfolgen über 2 Stunden bei 37°C in einem Wasserbadschüttler. Die Umsetzungen werden durch Quenchen mit Glycin beendet.

In einem anderen Experiment kommt das Verfahren von Manning und Manning (Manning und Manning, Biochem., 27: 6640–6644 [1988]) zur Anwendung, bei dem Hämoglobin im R-Zustand mit Glycolaldehyd quervernetzt wird. In diesem Experiment betrug die Hämoglobinkonzentration von 45 bis 360 ìM in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,3. Man verwendete HbCO. Es wird bis zu einer Endkonzentration von 50 mM mit Glycolaldehyd versetzt. Das Quervernetzen erfolgt bei Raumtemperatur über 4,5 Stunden, und das Hämoglobinderivat wird dann intensiv gegen 50 mM Tris-acetat, pH 7,3, dialysiert.

In noch einem anderen Experiment wird Diisothiocyanatobenzolsulfonat (DIBS) nach der Methode von Manning et al. (Manning et al., PNAS 88: 3329–3333 [1991]) für das Quervernetzen von Hämoglobin verwendet. Hämoglobinlösungen (200 ìM im desoxygenierten Zustand, gewöhnlich 3–5 ìMol) werden mit einem 10fachen molaren Überschuß des Quervernetzungsmittels DIBS behandelt. Die Lösung wird 15 min bei 25°C in 0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,2, inkubiert. Die Umsetzung wird durch Zugabe eines 30molaren Überschusses an Glycylglycin beendet; dann wird eine weitere 15minütige Inkubation durchgeführt. Die Lösung wird bei 4°C gegen den für den sich anschließenden chromatographischen Schritt verwendeten Puffer dialysiert. Das quervernetzte Hämoglobin (insgesamt 200–250 mg) wird auf eine Whatman DE-52-Säule aufgebracht (2 × 30 cm) und mit einem linearen Gradienten von 50 mM Tris-acetat von pH 8,3 bis pH 6,3 (jeweils 500 ml) eluiert. Um die meisten der anhaftenden Komponenten zu entfernen, wird die Säule weiter mit 500 ml des pH-6,3-Puffers eluiert. Die Hämoglobinrückgewinnung von der Säule liegt bei 80–95%. Für präparative Zwecke wird das quervernetzte Hämoglobin über ein Mischbettharz gegeben.

In einem anderen Experiment wird das Verfahren von Kluger et al. (Kluger et al., Biochem., 31: 7551–7559 [1992]) für die Quervernetzung von Hämoglobin mit Trimesoyltris(methylphosphat) (â82–â82) angewendet. In diesem Experiment erfolgen die chemischen Modifikationen an Hämoglobin mit Hämolysat, das mit 0,1 M Bis-tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 auf eine Endkonzentration an Hämoglobintetramer von 1 mM Hb verdünnt wurde. Die Endkonzentration an Quervernetzungsmittel beträgt 2 mM in 0,1 M Puffer. Während der Anfangsphasen dieser Studie wurden die Umsetzungen über 2–3 Stunden bei 35°C durchgeführt, wobei Hämoglobin in der CO-Form verwendet wurde. Zur Verbesserung der Ausbeute und um etwaige virale Verunreinigungen zu zerstören, werden die Umsetzungen bei 60°C durchgeführt. Das Reagens wird bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 30–60 min in die 60°C warme Hämoglobinlösung infundiert, wobei die Gesamtreaktionszeit bis zu 3 Stunden beträgt. Reagentien und niedermolekulare Verunreinigungen werden dann durch Gelfiltration mit Sephadex G-25-Säulen entfernt.

In noch einem anderen Experiment verwendet man Dicarbonsäurebis(methylphosphate) (Fumaryl & Isophthalyl) (â82–â82) nach der Methode von Jones et al. (Jones et al., Biochem., 32: 215–223 [1993]). Die chemischen Modifikationen an Hämoglobin erfolgen unter Verwendung eines Hämolysats, das mit 0,1 M Bis-tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 auf 1 mM Hb (Tetramer) verdünnt ist, und zwischen 2 mM und 5 mM Quervernetzungsmittel. Die Temperatur des Ansatzes beträgt entweder 35°C oder 60°C, und die Reaktionsdauer liegt bei 2–3 Stunden. Bei der höheren Temperatur wird das Quervernetzungsmittel langsam mittels Infusion über 1/2 bis 2 Stunden zugesetzt. Die Umsetzungen werden mit Hämoglobin in der Kohlenmonoxidform (HbCO) vorgenommen. Die Quervernetzungsmittel werden durch Gelfiltration über Sephadex G-25 entfernt.

C. Hämoglobinkonjugate

In dieser Reihe von Experimenten werden Hämoglobinkonjugate nach verschiedenen Verfahren hergestellt.

1. Mit Polyoxyethylen konjugiertes Hämoglobin

Zunächst wird bei 4°C unter leichtem Rühren 1 ml einer 1,0 M dibasisches Phosphat (Na2HPO4) und 1,0 M Hydrogencarbonat (NaHCO3) enthaltenden Lösung zu 10 ml einer 9-g/dl-Hämoglobinlösung gegeben. Dann wird 1 g des N-Hydroxysuccinimidylesters von Methoxypoly(ethylenglycol)propionsäure mit einem Molekulargewicht von 5000 Da (M-SPA-5000, Shearwater Polymers, Huntsville, Ala., USA) im Verlauf von 2 Minuten unter kontinuierlichem Rühren zu der Lösung gegeben. Während der gesamten Umsetzung werden Temperatur und pH-Wert kontrolliert. Die Zugabe des aktivierten Polyoxyethylens hat ein Absinken des pH-Wertes der Lösung zur Folge. Um den pH-Wert im Bereich von 8,5–9,5 zu halten, wird festes Natriumcarbonat (Na2CO3) in Mengen von ungefähr 10 mg zu der Mischung gegeben. Nach 4 Stunden wird die Reaktionsmischung in 30.000-MG-Dialysebeutel (Spectra/Por, Spectrum Medical Industries, Houston, Tex., USA) überführt und intensiv gegen 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, dialysiert.

2. Mit Polyoxyethylen konjugiertes Hämoglobin

In diesem Experiment kommt das Verfahren von Leonard und Dellacherie (Leonard und Dellacherie, Biochim. Biophys. Acta 791: 219–225 [1984]) zur Anwendung.

Aktivierter Polyethylenglycolmonomethoxypolyoxyethylensuccinimidylester (MPSE), MG = 5000 Da, wird mit stromafreiem Oxyhämoglobin umgesetzt. 1,5 ml einer 10-g/dl-Hämoglobinlösung werden zu 2 ml 0,1-M-Phosphatpuffer, Wasser oder einer 0,1-M-NaCl-Lösung gegeben. Falls erforderlich wird der pH-Wert durch Zugabe kleiner Mengen an 0,1 M NaOH oder 0,1 M HCl auf den gewünschten Wert (5,7–7,8) gebracht. Dann wird MPSE (20–30 mol MPSE pro Mol Hämoglobintetramer) zugegeben. Die Reaktionsmischungen werden 2 Stunden lang bei 6°C gerührt und dann bei 6°C durch Gelpermeationschromatographie an AcA 44 Ultrogel (linearer Fraktionierungsbereich 10.000–130.000; Ausschlußgrenze 200.000) in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2) analysiert. Die Umsetzungen werden als vollständig angesehen, wenn der Peak vom freien Hämoglobin nicht mehr in den Gelpermeationschromatogrammen vorhanden war.

3. Hämoglobin-Polyethylenglycol-Konjugat

In diesem Experiment wird die Methode von Zalipsky et al. (Zalipsky et al., In Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems (Dumm, R. L. und Ottenbrite, R. M., Hrsg.) S. 91–100, American Chemical Society, Washington, D. C. 91–100 [1991]) angewendet.

  • A. Methoxypoly(ethylenglycol)-N-succinimidylcarbonat (SC-PEG), MG 2000–6000 Da (1 g, ~0,2 mmol), wird zu einer gerührten Lösung von Rinderoxyhämoglobin (0,1 g, ~1.5 × 10–6 mol) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,8 (60 ml), gegeben. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid (0,5 N) 30 Minuten lang auf 7,8 gehalten. Überschüssiges freies PEG wird durch Diafiltration mit 50 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung entfernt.
  • B. Methoxypoly(ethylenglycol)-N-succinimidyl carbonat (SC-PEG), MG 2000–6000 Da (1 g, ~0.2 mmol), wird zu einer gerührten Lösung von Rinderoxyhämoglobin (0,1 g, ~1,5 × 10–6 mol) in 0,1 M Natriumboratpuffer mit einem pH-Wert von 9,2 gegeben. Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxid (0,5 N) 30 Minuten lang auf 9,2 gehalten. Überschüssiges freies PEG wird durch Diafiltration mit 50 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung entfernt.

4. Hämoglobin-Polyethylenglycol-Konjugat

In diesem Experiment kommen die Methoden von Xue und Wong (Xue und Wong, Meth. Enz., 231: 308–323 [1994]) zur Herstellung von Hämoglobin-Polyethylenglycol-Konjugaten zur Anwendung.

Zunächst erfolgt die Aktivierung von PEG:

Bis(succinimidylsuccinat). PEG (200 g; 0,059 mol, durchschnittliches MG 3400; Nippon Oil and Fats Co. Ltd., Tokio, Japan) wird bei 100°C in 200 ml Dimethylformamid gelöst und mit 15 g Bernsteinsäureanhydrid (0,15 mol) versetzt. Die Mischung wird 3 Stunden lang bei 100°C gerührt. Die Dimethylformamidlösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und in 1 Liter Ethylether gegossen. Der so erhaltene PEG-Ester von Bernsteinsäure wird über einen Glasfilter filtriert und mit Ethylether gewaschen. Der Ester wird dann im Vakuum bei 40°C getrocknet. Das Gewicht des Produkts beläuft sich auf etwa 197 g (93% Ausbeute).

Zur Aktivierung der Succinylgruppen auf dem PEG werden 197 g des PEG-Esters von Bernsteinsäure (0,055 mol) in 200 ml Dimethylformamid gelöst, worauf mit 13 g N-Hydroxysuccinimid (0,11 mol) und 23 g Dicyclohexylcarbodiimid (0,22 mol) versetzt wird. Die Lösung wird über Nacht kräftig bei 30°C gerührt. Der Dicyclohexylharnstoffniederschlag wird abfiltriert und das Filtrat wird in 1 Liter Ethylether gegossen. Das gebildete Polyethylenglycolbis(succinimidylsuccinat) wird isoliert, mehrmals mit Ethylether gewaschen und bei 40°C im Vakuum getrocknet. Das Gewicht des Produkts beläuft sich auf etwa 196 g, was einer Ausbeute ausgehend von PEG von 87% entspricht.

Reinheit und Imidylierungsgrad des Polyethylenglycol-bis(succinimidylsuccinats) lassen sich durch kernmagnetische Resonanz unter Verwendung von Tetramethylsilan als Standard (0 ppm) und Chloroform-d1 als Lösungsmittel abschätzen. Ähnliche Vorschriften können bei der elektrophilen Aktivierung von Monomethoxypolyethylenglycol zur Anwendung gelangen.

Als nächstes wird das aktivierte PEG mit Hämoglobin konjugiert, wobei die folgende Vorschrift bei 4°C durchgeführt wird. Zunächst werden 0,95 g (0,25 mmol) Polyethylenglycolbis(succinimidylsuccinat) zu 100 ml einer 0,25-mM-Hb-Lösung in 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,4, gegeben, und die Umsetzung wird 1 Stunde lang weiter laufen gelassen. Die Lösung wird durch Ultrafiltrieren an einer Amicon XM100-Membrane eingeengt. Dann wird eine Elektrolytlösung zugesetzt und der Einengungsvorgang wiederholt. Durch dreimaliges Wiederholen dieses Einengungsvorgangs werden nicht umgesetztes PEG und andere niedermolekulare Verbindungen entfernt.

Das PEG-Hb wird dann stabilisiert, wobei man sich die Esterbindung zwischen PEG und Bernsteinsäure in PEG-Hb, die hydrolyselabil ist, zunutze macht. Ein Ansatz, die Stabilität der Bindung zwischen PEG und Hb zu erhöhen, ist es, die labile Esterbindung zwischen der Polyethyleneinheit und den terminalen Carboxylgruppen zu entfernen, indem man die beiden terminalen alkoholischen Gruppen von PEG unter Anwendung eines Metallkatalysators zu Carbonsäuregruppen oxidiert, wodurch man – Carboxymethyl-ù-carboxymethoxypolyoxyethylen erhält, das wie bei PEG aktiviert und an pyridoxaliertes Hb gekoppelt wird. Das so erhaltene Konjugat wird als "stabilisiertes Hämoglobin" bezeichnet.

Darüber hinaus wird Monomethoxypolyoxyethylen-Hämoglobin hergestellt. PEG hat zwei Hydroxylgruppen an den beiden Enden. Werden diese zu funktionellen Gruppen derivatisiert, die dazu in der Lage sind, mit Hb zu reagieren, so ist es durch das Vorhandensein von zwei reaktiven Gruppen an dem selben Polymer möglich, Quervernetzungsreaktionen durchzuführen. Ein solches Quervernetzen wird verhindert, wenn man eines der beiden Enden blockiert, wie dies bei Monomethoxypolyoxyethylen (MPOE) der Fall ist.

Für die Herstellung von MPOE werden 80 g (4 mmol) MPOE mit einem MG von 5000 von Aldrich (Milwaukee, Wis., USA) in Tetrahydrofuran (300 ml) gelöst und unter Stickstoff bei Raumtemperatur 3 Stunden lang mit Naphthalin-Natrium behandelt. Dann wird unter Rühren BrCH2COOC2H5 (1,4 ml; 12 mmol) zugetropft. Nach 4 Stunden Umsetzung wird der erhaltene Ethylester mit Ether ausgefällt, getrocknet, in Wasser gelöst und bei 55°C 24 Stunden lang mit 0,1 N NaOH hydrolysiert, wodurch man MPOE-Carbonsäure (MPOE-O-CH2COOH) erhält. Die Lösung wird dann mit 1 N HCl bis zu einem pH-Wert von 2,5 angesäuert, und das Polymer wird in Chloroform aufgenommen. Nach mehrmaligem Waschen mit Wasser wird die organische Phase über MgSO4 getrocknet und mit Aktivkohle behandelt. Die MPOE-Carbonsäure wird mit trockenem Ether ausgefällt, filtriert und im Vakuum getrocknet. Diese Reihenfolge von Schritten wird wiederholt, bis die potentiometrische Titration einen konstanten Wert für die Menge an fixierten COOH liefert.

Die MPOE-Carbonsäure (5 g; 1 mmol) wird in trockenem Essigsäureethylester (60 ml) gelöst und bei 30°C 15 Stunden lang mit N-Hydroxysuccinimid (0,15 g; 1,25 mmol) und Dicyclohexylcarbodiimid (0,26 g; 1,25 mmol) aktiviert. Der Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das mit trockenem Ether ausgefällte Polymer wird in Chloroform aufgenommen und aus dieser Lösung durch tropfenweise Zugabe von Ether bei 0°C kristallisiert. Diese Schritte werden mehrmals wiederholt, bis die spektrophotometrische Analyse der Succinimidylgruppen einen konstanten Wert lieferte.

Die Kupplung an Hämoglobin erfolgt bei 5°C, indem man 1,5 ml einer 10 g/dl Hämoglobinlösung mit 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 5,8, verdünnt und unter Rühren mit 300 mg MPOE-Carbonsäuresuccinimidylester versetzt. Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden lang bei 6°C gerührt und bei 6°C durch Gelpermeationschromatographie an Ultrogel AcA 34 (linearer Fraktionierungsbereich MG 20.000–350.000; Ausschlußgrenze 750.000) in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7,2) analysiert.

5. Hämoglobin-Dextran-Konjugat

In diesem Experiment werden Hämoglobin-Dextran-Konjugate nach den verschiedenen Methoden von Kue und Wong (Xue und Wong, Meth. Enz., 231: 308–323 [1994]) hergestellt.

Synthese durch Alkylierung

In diesem Verfahren wird das Dextran (Dx) zunächst mit Bromcyan und Diaminoethan derivatisiert, so daß es eine freie Aminogruppe enthält, die mit Bromacetylbromid acyliert wird. Die Bromacetylfunktion wiederum alkyliert das Sulfhydryl des â93-Cysteins in Hb: Dx + CNBR + Diaminoethan ? Aminoethyl-Dx

Aminoethyl-Dx + Bromacetylbromid ? Dx-NHCOCH2Br

Dx-NHCOCH2Br + HS-Hb ? Dx-NHCOCH2-S-Hb

Bei einer typischen Darstellung werden 1,5 g Bromcyan in 15 ml Acetonitril gelöst und zu 10 g Dextran (MG 20.000) in 375 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 1 M NaOH 5 min auf 10, 8 gehalten; der pH-Wert wird dann mit konzentrierter Salzsäure auf etwa 2,0–2,5 gesenkt. Nach 1 min Rühren werden 15 ml Diaminoethan zusammen mit soviel HCl, daß der pH-Wert 9,5 nicht übersteigt, zugesetzt. Der End-pH-Wert wird auf 9,5 eingestellt. Die Mischung wird über Nacht bei 4°C stehengelassen und dann unter Anwendung eines Pellicon-Dialysiergeräts von Millipore (Marlborough, Mass., USA) gründlich gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Das so erhaltene Aminoethyl-Dx wird in 250 ml 0,1 M Natriumphosphat, pH 7,0, gelöst und über 2 Stunden mittels einer Pasteurpipette mit fein ausgezogener Kapillarspitze mit 15 ml Bromacetylbromid versetzt, wobei kräftig gerührt wird. Während der ganzen Zeit wird der pH-Wert unter Verwendung eines pH-Stat und durch Zugabe von 1 M NaOH auf 7,0 gehalten. Anschließend wird die Mischung gründlich gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert, wodurch man etwa 7 g Dx-NHCOCH2Br (Br-Dextran) erhält. Der Bromgehalt des Br-Dextrans liegt im Bereich von 9–11 Glucoseresten pro Bromatom.

Zur Kupplung von Hämoglobin an Dextran werden 3,3 g Br-Dextran in 100 ml einer 6-g/dl-Hämoglobinlösung in 0,1 M Natriumhydrogencarbonat, pH 9,5, gelöst. Die Kupplungsreaktion wird unter ständigem Mischen bei 4°C fortschreiten gelassen. Um die Ausbeute an Dx-NHCOCH2-S-Hb (Dx-Hb) zu bestimmen, werden 0,1 ml der Reaktionsmischung auf eine mit 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,5, äquilibrierte Sephadex G-75-Säule gegeben und bei einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/h mit dem selben Puffer eluiert. Der Hämoglobingehalt der Eluatfraktionen wird über die Extinktion bei 415 nm bestimmt, und die Proportionen des schneller wandernden Dx-Hb-Peaks und des langsamer wandernden Hb-Peaks wurden als die Flächen unter diesen Peaks angegeben. Nach 2 Tagen ist die Bildung des Dx-Hb-Konjugats im wesentlichen vollständig.

Synthesis über das Dialdehyd

10 ml einer 12%igen wässrigen Lösung von Natriumperiodat werden zu 100 ml einer 10%igen wässrigen Dextranlösung gegeben, und die Mischung wird über Nacht bei 4°C im Dunkeln gelassen. Es wird mit einer 3%igen Natriumbisulfitlösung versetzt, bis die Mischung eine braune Farbe annahm und sich dann wieder entfärbte. Die Mischung wird gegen destilliertes Wasser dialysiert, wodurch man die Dextrandialdehydlösung erhielt. Diese wird dann zu 2 Volumina von stromafreiem 3 g/dl-Hämoglobin in 0,3 M Natriumhydrogencarbonatpuffer, pH 9,5 gegeben; die Kupplung des Hämoglobins an Dextran wird über Nacht bei 4°C fortschreiten gelassen. Der gebildete Dx-Hb-Komplex wird durch Chromatographie an einer Sephadex G-75-Säule von nicht gekuppeltem Hämoglobin abgetrennt.

Die Kupplung von Hb an Dx-Dialdehyd ist vom pH-Wert abhängig. Führt man die Kupplung durch, indem man 100 mg Dx-Dialdehyd in 1 ml 0,6 M Natriumboratpuffer löst und bei 6°C mit 1, 8 ml 10-g/dl-Hb mischt, werden bei einem pH-Wert < 9,6 viele labile Iminbindungen gebildet, und die Konjugate haben ein hohes Molekulargewicht im Bereich über 100.000. Bei einem höheren pH-Wert hat das Hauptprodukt einen niedrigeren Molekulargewichtsbereich (70.000 > MG > 100.000) und besteht wahrscheinlich aus einem 1:1-Komplex zwischen Dx und Hb, der sich nur langsam in Formen mit höheren Molekulargewichten umwandelt. Wird dieses Konjugat bei einem pH-Wert von 9,8 gebildet und bei einem pH-Wert von 7,2 30 min mit einem Überschuß an in 1 mM NaOH gelöstem NaBH4 (2 mol pro Mol an Ausgangsaldehyd) reduziert, so findet man, daß nur die á-Kette des Hämoglobins Dx-modifiziert ist. Die Kupplung von Hb an Dx-Dialdehyd geht bei einem höheren pH-Wert auch sehr viel schneller vonstatten, wobei bei einem pH-Wert von 10 weniger als 1 Stunde für die vollständige Umsetzung erforderlich ist und nur 1,5 Stunden bei pH 9,7, jedoch 6 Stunden bei pH 9,5 und 23 Stunden bei pH 9,1. Erfolgt die Darstellung bei einem pH-Wert von 9,75, so beträgt der Sauerstoff-P50 für Dx-Hb 10,1 mm Hg, wenn das Konjugat sich vor der Reduktion mit NaBH4 1 Stunde lang bilden kann, 9,5 mm Hg, wenn es sich 4 Stunden lang bilden kann und 8,1, wenn es sich 18 Stunden lang bilden kann.

6. Konjugation von Hämoglobin an SF-DX und P-Dx

In diesem Experiment wird Hämoglobin mit SF-DX und P-Dx konjugiert. Dextransulfat (SF-Dx) und Dextranphosphat (P-Dx) (MG 40.000) werden mit Natriumperiodat behandelt, um die Dialdehydylderivate zu bilden, die wiederum an die Aminogruppen an Hämoglobin gekuppelt und weiter durch Reduktion mit Natriumborhydrid stabilisiert werden, wie oben bei der Synthese von Dx-Hb aus Dx-Dialdehyd beschrieben.

7. Konjugation von Hämoglobin an Dextran-Benzolhexacarboxylat (Dx-BHC)

In diesem Experiment wird Hämoglobin mit Dextran-Benzolhexacarboxylat (Dx-BHC) konjugiert. Aminopropyl-Dx wird dargestellt 35, indem man 5 g Dextran in 7,5 ml 25%igem wässrigem Zn(BF4)2 und 5 ml Wasser löst. Unter kräftigem Rühren wird mit Epichlorhydrin (25 ml) versetzt; die Mischung wird 3 Stunden lang bei 80°C und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Das Polymer wird ausgefällt, indem man die Lösung in Aceton tropft, filtriert und im Vakuum trocknet. Das so erhaltene Dextranderivat hat die Struktur Dx-O-CH2CH(OH)CH2Cl. Dieses Produkt (4,1 g mit 3% Cl) wird durch wiederholtes Auflösen in Wasser und Ausfällen mit Aceton und Methanol aufgereinigt. Das Chloratom wird anschließend durch eine Aminogruppe ersetzt, indem man die Verbindung in 60 ml H2O und 20 ml 14 M wässrigem Ammoniak löst. Die Lösung wird 20 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann in 1 Liter Methanol getropft. Der so erhaltene Aminopropyl-Dx-Niederschlag (3-Amino-2-hydroxypropylether von Dextran) wird filtriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute auf dieser Stufe beträgt etwa 3,5 g.

Benzolhexacarbonsäure wird unter Verwendung von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDCI) als Kondensationsmittel an Aminopropyl-Dx gekuppelt, wobei Dx-BHC gebildet wird. Da Benzolhexacarbonsäure sechs Carbonsäuregruppen aufweist, verbleiben nach der Reaktion mit einer Aminogruppe an Aminopropyl-Dx noch bis zu fünf weitere Carbonsäuregruppen. Eine dieser kann durch die weitere Verwendung des wasserlöslichen EDCI als Kondensationsmittel an eine Aminogruppe an Hb gebunden werden.

8. Hydroxyethylstärke-Hämoglobin-Konjugat

In diesem Experiment wird das Verfahren von Xue und Wong (Xue und Wong, Meth. Enz., 231: 308–323 [1994]) zur Herstellung von Hydroxyethylstärke-Hämoglobin-Konjugaten angewendet.

Zur Vorbereitung für die Konjugation an Hämoglobin wird die Hydroxyethylstärke (Hs) zunächst in Aminoethyl-Hs umgewandelt. Bei einer typischen Darstellung werden 1,5 g Bromcyan in 15 ml Acetonitril gelöst und zu 500 ml einer 2%igen Hs-Lösung gegeben. Der pH-Wert der Lösung wird durch Zugabe einer 1 M Natronlauge 5–10 min auf 10,8 gehalten. Dann wird der pH-Wert mit konzentrierter HCl auf 2,0–2,5 gesenkt, und 10 ml Diaminoethan werden zusammen mit weiterer HCl zugesetzt, um zu verhindern, daß der pH-Wert 9,5 übersteigt. Der End-pH-Wert wird auf 9,5 eingestellt, und die Lösung wird über Nacht bei 4°C stehengelassen und dann gegen vollentsalztes Wasser dialysiert. Das Verhältnis von Bromcyan/Diaminoethan zu Hs kann variiert werden, was die Synthese von Aminoethyl-Hs ermöglicht, in dem 7 bis 20% der Glucosereste im Ausgangspolymer substituiert sind.

Aldehyd-substituierte Hs wird durch Umsetzung der Aminoethyl-Hs mit Glutaraldehyd hergestellt. In einer typischen Reaktion werden 500 ml dialysierte Aminoethyl-Hs-Lösung mit 2 g Natriumhydrogencarbonat behandelt, wodurch man eine Lösung erhält, die 2% Hs und ungefähr 0,05 M Hydrogencarbonat enthält. Dann werden 5 ml 50%ige Glutaraldehydlösung zu der Lösung gegeben, die dann vor der Dialyse 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wird.

Hämoglobin wird als gefriergetrockneter Feststoff unter Kohlenstoffmonoxid verwendet. Dieser wird bei 4°C mit desoxygeniertem, vollentsalztem Wasser unter Argon rekonstituiert, wobei man eine Lösung mit ungefähr 2,5 g Hb pro ml erhält. Bei einer typischen Reaktion werden 500 ml dialysierte Lösung der Aldehyd-substituierten Hs mit Natriumhydrogencarbonat behandelt, wodurch man 500 ml einer Lösung mit ungefähr 2% Hs und 0,1 M Hydrogencarbonat erhält. Es wird mit Hämoglobinlösung (25 ml) versetzt, und der Ansatz wird 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, worauf Gelfiltration an Sephadex G-150 zeigt, daß kein nicht modifiziertes Hämoglobin mehr übrig ist. Dann wird die Lösung mit Natriumborhydrid (1,0 g) versetzt und weitere 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Hs-Hb wird unter Verwendung einer Ultrafiltrationseinheit von Amicon (Danvers, Mass., USA) mit einer MG-100.000-Cutoff-Kartusche dialysiert, so daß alle Spuren von nicht modifiziertem Hämoglobin entfernt werden können. Glucose (10 g) wird zugesetzt, und die Lösung wird dann gefriergetrocknet und unter Kohlenstoffmonoxid bei 4°C aufbewahrt.

9. Alternatives Verfahren zur Herstellung von Hydroxyethylstärke-Hämoglobin-Konjugaten

In diesem Experiment wurde ein anderes von Xue und Wong (Xue und Wong, Meth. Enz., 231: 308–323 [1994]) beschriebenes Verfahren zur Herstellung von Hydroxyethylstärke-Hämoglobin-Konjugaten angewendet.

Hydroxyethylstärke-Hämoglobin-Konjugat (Hs-Hb) kann wie folgt aus Hs-Dialdehyd synthetisiert werden. 0,03 Äquivalente Hs werden in 250 ml Wasser gelöst und bei 5°C 12 Stunden lang mit 0,028 mol Natriumperiodat behandelt. Die Lösung wird dialysiert, bis sie ionenfrei ist. Die prozentuale Oxidation läßt sich mit einer kalorimetrischen Methode bestimmen. Die Lösung wird durch Zugabe von Natriumhydrogencarbonat auf einen pH-Wert von 8,0 gepuffert, auf 5°C abgekühlt und mit 5 g Carbonmonoxyhämoglobin versetzt. Die Umsetzung wird 18 Stunden lang bei Raumtemperatur fortschreiten gelassen, oder bis Gelfiltration eine vollständige Modifikation des Hämoglobins zeigt. Die Lösung wird gegen 1%ige Ammoniumcarbonatlösung dialysiert und in Gegenwart von Glucose gefriergetrocknet.

10. Hämoglobin-Inulin-Konjugat

In diesem Experiment wird ein von Xue und Wong (Xue und Wong, Meth. Enz., 231: 308–323 [1994]) beschriebenes Verfahren zur Herstellung von Hämoglobin-Inulin-Konjugaten angewendet.

Zur Synthese des Inulin-Hämoglobin-(In-Hb-)Konjugats wird Inulin zunächst durch 2stündige Umsetzung mit Bernsteinsäureanhydrid in N,N-Dimethylformamid bei 100°C succinyliert. Anschließend wird das succinylierte Inulin über Nacht bei Raumtemperatur an N-Hydroxysuccinimid gebunden, wobei als Kondensationsmittel Dicyclohexylcarbodiimid in N,N-Dimethylformamid verwendet wird. Hämoglobin wird bei 4°C 1 Stunde lang mit einem 10fachen molaren Überschuß des N-Hydroxysuccinimidaktivierten Inulins in 0,1 M Tris-Puffer, pH 7,0, umgesetzt, wodurch man In-Hb erhält, das mit einem Amicon PM30-Membranfilter aufgereinigt wird, bis das unumgesetzte Inulin und andere niedermolekulare Verbindungen entfernt sind.

Durch Steuerung des Bernsteinsäureanhydrid-Inulin-Verhältnisses läßt sich die Anzahl an N-Hydroxysuccinimidaktivierten Succinylgruppen an dem Inulin variieren. Eine geringe Dichte solcher Gruppen liefert ein In-Hb-Konjugat mit einem MG von 82.000, während höhere Dichten quervernetztes In-Hb mit einem MG im Bereich von bis zu über 300.000 liefern.

11. Alternatives Verfahren zur Herstellung von Hämoglobin-Inulin-Konjugaten

In diesem Experiment wird das Verfahren von Iwasaki et al. (Iwasaki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 113: 513–518 [1983]) zur Herstellung von Hämoglobin-Inulin-Konjugaten angewendet.

Der N-Hydroxysuccinimidylester von Inulin wurde bei 4°C eine Stunde lang mit Oxyhämoglobin in 0,1 M Tris-Puffer (pH 7.0) umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde mit einem mit einer TSK G3000 SW-Säule ausgestatteten JASCO Trirotor HPLC-Apparat analysiert. Die Lösung des modifizierten Hämoglobins wurde mit einem Amicon PM 30-Membranfilter aufgereinigt, bis nicht umgesetztes Inulin und andere niedermolekulare Verbindungen nicht länger nachweisbar sind.

12. Hämoglobin-Polyvinylpyrrolidon-Konjugat

In diesem Experiment wurde das Verfahren von Xue und Wong (Xue und Wong, Meth. Enz, 231: 308–323 [1994]) zur Herstellung von Hämoglobin-Polyvinylpyrrolidon-Konjugaten angewandt.

Synthese von aktiviertem PVP

Zunächst werden 50 g Polyvinylpyrrolidon (PVP) (MG 25.000–35.000) in 1 Liter 0,25N NaOH gelöst und in einem Autoklaven unter Stickstoff 42 Stunden lang auf 140°C erhitzt, um eine teilweise Hydrolyse herbeizuführen. Es wird dann mit konzentrierter HCl auf einen pH-Wert von 5 eingestellt und zum Entfernen von Salzen über eine Amicon UM10-Membrane ultrafiltriert. Wasser wird durch azeotrope Destillation mit Benzol entfernt, und das Ausmaß der Hydrolyse wird durch Titrieren der sekundären Aminogruppen bestimmt. Um diese Aminogruppen zu blockieren, werden 50 g des teilweise hydrolysierten PVP in 300 ml Dichlormethan/Dimethylformamid (1:1) gelöst und mit 0,5 M Essigsäureanhydrid gemischt. Es wird 1 Stunde lang bei Raumtemperatur belassen und 4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wird auf etwa 100 ml eingedampft und dann unter kräftigem Rühren tropfenweise zu Ethylether gegeben. Der Niederschlag an acetyliertem PVP wird abfiltriert, mit Ether gewaschen und bis zur Gewichtskonstanz im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.

Zur Aktivierung seiner Carboxylgruppen werden 50 g des acetylierten PVP in 500 ml Dichlormethan/Dimethylformamid (1:1) bei 0°C mit 15,47 g N-Hydroxysuccinimid und anschließend mit einer Lösung von 27,75 g Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Dichlormethan gemischt. Die Lösung wird 14 Stunden lang bei 0°C gerührt und dann zum Entfernen des Dicyclohexylharnstoffs zentrifugiert. Der Überstand (etwa 300 ml) wird unter kräftigem Rühren in 5 Liter kalten Ether getropft. Der weiße Niederschlag wird abfiltriert, mehrmals mit Ether gewaschen und im Kalten über Phosphorpentoxid getrocknet.

Bindung von Hämoglobin an aktiviertes PVP

Hämoglobin (27 g) wird in 1 Liter 5%iger Natriumcarbonatlösung gelöst und bei 4°C unter Rühren 24 Stunden lang mit 40 g aktiviertem PVP behandelt. Die Zubereitung wird lyophilisiert und wieder in 300 ml destilliertem Wasser gelöst. Nach einer Diafiltration mit dem 20fachen Volumen wird nochmals lyophilisiert.

Aus dem oben Gesagten sollte ersichtlich sein, daß die vorliegende Erfindung optimale Blutersatzstoffzusammensetzungen, die Mischungen aus sauerstofftragenden und nicht-sauerstofftragenden Plasmaexpandern enthalten, und Verfahren zu deren Anwendung bereitstellt. Mit diesen Zusammensetzungen und Verfahren ist die Herstellung relativ billiger Produkte möglich, die wirksamer sind als die gegenwärtig verfügbaren Zusammensetzungen.


Anspruch[de]
  1. Wässrige zellfreie Zusammensetzung, die Polyalkylenoxid-modifiziertes Hämoglobin enthält, das eine Sauerstoffaffinität gleich oder größer als die von Vollblut aufweist, wobei die wässrige Zusammensetzung eine Viskosität aufweist, die wenigstens halb so groß ist wie die von Vollblut, und eine Sauerstoffkapazität aufweist, die geringer ist als die von Vollblut.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der die Viskosität der wässrigen Zusammensetzung zwischen 2,5 und 4 cP ist.
  3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der die Zusammensetzung zusätzlich ein Verdünnungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Glycoproteinen, Polysacchariden und Kolloiden enthält.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, bei der das Verdünnungsmittel Stärke enthält.
  5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, bei der die Stärke Pentastärke enthält.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, bei der die Pentastärke ein mittleres Molekulargewicht von etwa 200.000 Dalton bis etwa 400.000 Dalton aufweist.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das Polyalkylenoxid-modifizierte Hämoglobin ein Hämoglobin ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tierhämoglobin, humanem Hämoglobin und rekombinantem Hämoglobin enthält.
  8. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das Polyalkylenoxid Polyethylenglycol ist.
  9. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der die Zusammensetzung einen onkotischen Druck aufweist, der größer als 25 mm Hg ist, vorzugsweise zwischen 70 und 80 mm Hg beträgt, weiter vorzugsweise etwa 90 mm Hg beträgt.
  10. Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung des Sauerstofftransports zu den Geweben eines Säugetiers.
Es folgen 23 Blatt Zeichnungen






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