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Dokumentenidentifikation DE69924009T2 13.04.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001141294
Titel METHODE ZUR VERSTÄRKUNG DER BIOLOGISCHEN AKTIVITÄT VON LIGANDEN
Anmelder Regeneron Pharmaceuticals, Inc., Tarrytown, N.Y., US
Erfinder DAVIS, J., Samuel, New York, US;
GALE, W., Nicholas, Tarrytown, US;
YANCOPOULOS, D., George, Yorktown Heigths, US;
STAHL, Neil, Carmel, US
Vertreter Rechts- und Patentanwälte Lorenz Seidler Gossel, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69924009
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 23.12.1999
EP-Aktenzeichen 999689565
WO-Anmeldetag 23.12.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/30900
WO-Veröffentlichungsnummer 0000037642
WO-Veröffentlichungsdatum 29.06.2000
EP-Offenlegungsdatum 10.10.2001
EP date of grant 02.03.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.04.2006
IPC-Hauptklasse C12N 15/62(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 5/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 14/515(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 14/52(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
EINFÜHRUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Methoden zur Erzeugung neuer Fusionspolypeptidliganden, die eine erhöhte biologische Aktivität im Vergleich zu Polypeptidliganden in ihrer nativen Form aufweisen. Die Erfindung betrifft auch Nukleinsäuren, die zur Erzeugung biologisch aktiver Fusionspolypeptidliganden nützlich sind, als auch die Fusionspolypeptidliganden selbst.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Fähigkeit von Polypeptidliganden, an Zellen zu binden und dabei eine phänotypische Reaktion auszulösen, wie etwa Zellwachstum, -überleben oder -differenzierung, wird oftmals durch Transmembran-Tyrosinkinasen vermittelt. Der extrazelluläre Abschnitt jeder Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) ist allgemein der charakteristischste Abschnitt des Moleküls, da er dem Protein seine Ligand-erkennende Eigenschaft verleiht. Die Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne führt zur Signaltransduktion über eine intrazelluläre Tyrosinkinasen-katalytische Domäne, welche ein biologisches Signal auf intrazelluläre Zielproteine überträgt. Die spezielle Anordnung der Sequenzmotive dieser zytoplasmatischen, katalytischen Domäne bestimmt ihren Zugang zu potentiellen Kinase-Substraten (Mohammadi, et al., 1990, Mol. Cell. Biol., 11: 5068–5078; Fantl, et al., 1992, Cell, 69: 413–413).

RTKs scheinen auf die Ligandenbindung hin eine Dimerisation oder irgendeine verwandte Konformationsveränderung zu vollziehen (Schlessinger, J., 1988, Trend Biochem. Sci. 13: 443–447; Ullrich und Schlessinger, 1990, Cell, 61: 203–212; Schlessinger und Ullrich, 1992, Neuron 9: 383–391); molekulare Wechselwirkungen zwischen den dimerisierenden zytoplasmatischen Domänen führen zur Aktivierung der Kinasefunktion. In einigen Fällen wie etwa dem von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) ist der Ligand ein Dimer, der zwei Rezeptormoleküle bindet (Hart, et al., 1988, Science, 240: 1529–1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264: 8905–8912), wohingegen zum Beispiel im Falle von EGF der Ligand ein Monomer ist (Weber, et al., 1984, J. Biol. Chem, 259: 14631–14636).

Im Laufe der Geschichte der biotechnologischen Industrie sind viele neue Gene und damit verbundene Proteine dank ihrer Sequenzhomologie mit bekannten Genen identifiziert worden. Von vielen dieser Proteine wird behauptet, dass sie Rezeptoren seien, doch da ihre kognaten Liganden nicht identifiziert worden sind, werden sie als Waisenrezeptoren bezeichnet. Das Screening von vielen dieser Waisenrezeptoren führt oftmals zur Identifikation von Liganden, die zur Bindung an den Rezeptor fähig sind, obschon die Bindung oftmals nicht mit der Aktivierung irgendwelcher intrazellulärer Kinasen oder einer anderen phänotypischen Veränderung verbunden ist. Dies war bei Mitgliedern der Eph-Rezeptorfamilie der Fall. Zu Zwecken der Klarheit nehmen die Anmelder hierin durch Bezugnahme einen Brief mit auf, zitiert als Eph-Nomenclature Committee, 1997, und veröffentlicht in Cell, Band 90, 403–403 (1997), welcher eine Nomenklatur für den Eph-Rezeptor und die Eph-Ligandenfamilien angibt.

Wenig, sofern überhaupt, biologische Aktivität war als Reaktion auf die Bindung eines Liganden an einen Rezeptor der Eph-Familie vor der Entdeckung beobachtet worden, die in US-Patent Nr. 5.747.033, ausgegeben am 5. Mai 1998, wiedergegeben ist. In diesem Patent wird das Konzept des "Clustering" beschrieben, wobei die löslichen Domänen von Liganden kombiniert wurden, um Multimere zu schaffen, die zur Aktivierung der verwandten Rezeptoren fähig sind. Die Anmelder haben nun das Konzept des Clusterns auf zusätzliche Liganden außerhalb der Eph-Familie ausgeweitet, zum Beispiel die Tie-2-Rezeptorliganden, die als Angiopoetine bekannt sind, und haben außerdem entdeckt, dass diese Methode zur Erzeugung von homogenen Formen der geclusterten Liganden breit anwendbar ist, um die Affinität und/oder die Zunahme der Aktivität eines Liganden im Vergleich zur nativen Form des Liganden zu verbessern.

Angiopoetin-1 (Ang) ist einer von zwei bekannten Liganden für den Tie-2-Rezeptor und wurde als ein Agonist für Tie-2 nachgewiesen (Davis, et al., 1996, Cell 87: 1161–1169), wohingegen der zweite bekannte Ligand, Angiopioietin-2, als ein natürlich vorkommender Antagonist des Tie-2-Rezeptors nachgewiesen wurde (Maisonpierre, et al., 1997, Science, 277: 55–60). Ang1* ist eine mutierte Form von Angiopoetin-1, die die N-terminale Domäne von Angiopoetin-2, fusioniert an eine Coiled-Coil-Domäne, und die Fibrinogen-Domäne von Angiopoetin-1 umfasst und die eine Cys- zu Ser-Mutation bei Aminosäure 245 aufweist. Ang1* wurde als ein potenter Agonist für den Tie-2-Rezeptor nachgewiesen.

Experimente mit Mutanten von Angiopoetin-1 und Angiopoetin-2 haben gezeigt, dass die Fibrinogen-Domänen (FD) die Rezeptor-bindenden Domänen sind und dass dimerisierte Versionen zum Beispiel von Ang-1-FD-Fc (d.h. der Fibrinogen-Domäne von Ang-1 in Fusion an eine Fc-Domäne) an den Tie-2-Rezeptor bei viel höherer Affinität binden kann als monomere Ang-1-FD (die Dimerisation erfolgt aufgrund der Wechselwirkung zwischen den Fc-Komponenten von benachbarten Molekülen). Allerdings ist Ang-1-FD-Fc nicht zum Induzieren einer Phosphorylierung (Aktivieren) des Tie-2-Rezeptors auf Endothelzellen fähig, sofern es nicht weiter mit Ziege-Anti-Human-Fc-Antikörpern geclustert wird (Jackson Immunoresearch). Aus diesem Grunde wurden mutierte Versionen von Ang-1-FD und Ang-2-FD (d.h. der Fibrinogen-Domäne von Ang-2) entworfen, die intrinsisch höher verclustert sind.

In WO 96/37621 sind multimere Proteine beschrieben, die durch eine DNA-Sequenz codiert sind, welche erste und zweite funktionale Domänen und erste und zweite Linkersequenzen und ein Multimerisationselement von nicht mehr als 110 Aminosäuren in der Länge umfasst, welches zum Selbstzusammenbau zu einem Trimer oder einem Oligomer einer höheren Ordnung fähig ist. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Multimerisationselement mindestens einen Teil von humanem p53, PF4, TSP-4, COMP, Thrombospondin, dTAFII42, dTAFII 31, dTAFII62, dTAFII80, Histon 3 oder Histon 4.

In WO 92/03569 sind Proteinpolyliganden beschrieben, die zu einem stabilen Protein-Core zusammengelagert sind. Diese werden durch Herstellung von fusionierten Proteinen erhalten, welche einen Liganden an einem Terminus und eine Untereinheit oder multimere Einheit eines Proteins am anderen Terminus umfassen, wobei das fusionierte Protein zur Assemblierung zu dem Polyliganden fähig ist. In einer speziellen Ausführungsform ist die Untereinheit eine Immunglobulin-&mgr;-Kette.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Mit der vorliegenden Erfindung werden neue, biologisch aktive, lösliche Formen von Polypeptidliganden bereitgestellt, die an Rezeptoren auf Zellen bilden. Solche Polypeptidliganden sind zum Fördern einer differentiellen Funktion und/oder Beeinflussen des Phänotyps nützlich, wie etwa das Wachstum und/oder die Vermehrung von Rezeptor-tragenden Zellen. Mit der Erfindung werden auch Nukleinsäuren bereitgestellt, die solche Polypeptidliganden codieren, ebenso wie prokaryontische und eukaryontische Expressionssysteme zur Erzeugung solcher Polypeptidliganden. Gemäß der Erfindung können lösliche Formen der hierin beschriebenen Polypeptidliganden zur Förderung der biologischen Reaktionen in Rezeptor-exprimierenden Zellen verwendet werden. Insbesondere wird hierin eine allgemeine Methode beschrieben, mit welcher Fusionspolypeptidliganden erzeugt werden, die dann geclustert werden können, was der Verwandlung von ansonsten inaktiven löslichen Polypeptidliganden zu biologisch aktiven Formen dienlich oder der biologischen Aktivität der Polypeptidliganden förderlich ist, die bei Abwesenheit des Clustering geringere Höhen der biologischen Aktivität zeigen würden. Diese Methode kann zum Clustern einer Vielzahl von (mehr als einer) Rezeptor-bindenden Domänen von irgendeinem Liganden verwendet werden, der eine verbesserte Affinität und/oder erhöhte Aktivität (d.h. Signalübertragungsfähigkeit) in der geclusterten Form im Vergleich zur nativen Form des Liganden aufweist.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

1A1E – Nukleinsäuresequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von Ang-1-FD-FD-Fc.

2A2E – Nukleinsäuresequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von Ang-2-FD-FD-Fc.

3A3E – Nukleinsäuresequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von Ang-1-FD-Fc-FD.

4A4E – Nukleinsäuresequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von Ang-2-FD-Fc-FD.

5 – Molekulargewichtsanalyse von Ang-1-FD-Fc-FD-Protein. SDS-PAGE-Analysen, die eine Bande zeigen, die bei etwa 210 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen (Spur 3) abläuft, und eine Bande, die bei etwa 85 kD unter reduzierenden Bedingungen (Spur 7) abäuft.

6 – Lichtstreuungsanalyse zur Bestätigung des Molekulargewichts von Ang-1-FD-Fc-FD und zur Bestimmung, ob das Protein eine homogene Spezies ist oder nicht. Die Lichtstreuung ist eine Funktion der Masse und Konzentration eines Makromoleküls. Zur Bestimmung des Molekulargewichts wurde die Proteinprobe auf eine Gelfiltrationssäule injiziert und der Ablauf mit einem On-line-Lichtstreuungsdetektor und einem Refraktionsindex- und/oder einem UV-Detektor überwacht. Der On-line-Refraktionsindex-Detektor oder UV-Detektor dient zur Messung der Proteinkonzentration. Astra 4.7 Software (Wyatt Technology Corporation, Santa Barabara, CA) wird zur Berechnung der Proteinkonzentration verwendet. Das Molekulargewicht des Proteins wird dann aus der Winkelabhängigkeit der Lichtstreuung errechnet. Das Molekulargewicht des dimeren Proteins erscheint als etwa 200 kD und das Vorhandensein eines einzelnen Peaks legt nahe, dass die Proteinlösung homogen ist.

7 – Molekulargewichtsanalyse von Ang-2-FD-Fc-FD. SDS-PAGE-Analysen, die eine Bande zeigen, die bei etwa 200 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen abläuft (Spuren 7 und 8), und eine Bande, die bei etwa 88 kD unter reduzierenden Bedingungen abläuft (Spuren 3 und 4).

8 – Lichtstreuungsanalyse zur Bestätigung des Molekulargewichts von Ang-2-FD-Fc-FD und zur Bestimmung, ob das Protein eine homogene Spezies ist oder nicht. Die Lichtstreuung ist eine Funktion der Masse und Konzentration eines Makromoleküls. Zur Bestimmung des Molekulargewichts wurde die Proteinprobe auf eine Gelfiltrationssäule injiziert und der Ablauf mit einem On-line-Lichtstreuungsdetektor und einem Refraktionsindex- und/oder einem UV-Detektor überwacht. Der On-line-Refraktionsindex-Detektor oder UV-Detektor dient zur Messung der Proteinkonzentration. Astra 4.7 Software (Wyatt Technology Corporation, Santa Barabara, CA) wird zur Berechnung der Proteinkonzentration verwendet. Das Molekulargewicht des Proteins wird dann aus der Winkelabhängigkeit der Lichtstreuung errechnet. Das Molekulargewicht des dimeren Proteins scheint etwa 171 kD zu betragen und das Vorhandensein eines einzelnen Peaks legt nahe, dass die Proteinlösung homogen ist.

9 – Ang1*-vermittelte gg. Ang-1-FD-Fc-FD-vermittelte Tie-2-Rezeptorphosphorylierung in EAhy926-Zellen. Ein standardmäßiger Phosphorylierungs-Assay ergab, dass Ang-1-FD-Fc-FD äquivalent zu Ang1* in seiner Fähigkeit war, die Phosphorylierung des Tie-2-Rezeptors in EAhy926 zu stimulieren.

10 – Fähigkeit von Ang-2-FD-Fc-FD zur Blockierung der Ang1*-vermittelten Tie-2-Rezeptorphosphorylierung in EAhy926-Zellen. In einem standardmäßigen Phosphorylierungs-Assay ist Ang-2-FD-Fc-FD zur Blockierung der Ang1*-Stimulierung des Tie-2-Rezeptors fähig, wenn er in einem mindestens 10- bis 15-fachen Überschuss von Ang1* vorhanden ist.

11 – Fähigkeit von Angiopoetin-2- zur Blockierung der Ang1*-vermittelten Tie-2-Rezeptorphosphorylierung in EAhy926-Zellen. In einem standardmäßigen Phosphorylierungs-Assay ist Angiopoetin-2 in einem 20-fachen molaren Überschuss zur Verminderung der Ang1*-vermittelten Phosphorylierungsmenge auf 50% nicht fähig. Dieses Ergebnis, verknüpft mit den in 10 beschriebenen Ergebnissen, legt nahe, dass Ang-2-FD-Fc-FD ein potenterer Inhibitor der Ang1*-vermittelten Tie-2-Rezeptorphosphorylierung als Angiopoetin-2 ist.

12 – Fähigkeit von Ang-2-FD-Fc-FD zur Blockierung der Angiopoetin-1-vermittelten Phosphorylierung des Tie-2-Rezeptors in EAhy926-Zellen. In einem standardmäßigen Phosphorylierungs-Assay wird gezeigt, dass, obschon eine Neigung zum Blockieren der Angiopoetin-1-vermittelten Phosphorylierung des Tie-2-Rezeptors in diesen Zellen vorliegt, Ang-2-FD-Fc-FD beim Blockieren der Ang1*-vermittelten Phosphorylierung von Tie-2 wirksamer zu sein scheint, wie in 10 gezeigt.

13 – Fähigkeit von Angiopoetin-2 zur Blockierung der Angiopoetin-1-vermittelten Phosphorylierung des Tie-2-Rezeptors in EAhy926-Zellen. In einem standardmäßigen Phosphorylierungs-Assay wird gezeigt, dass eine Neigung zum Blockierung der Angiopoetin-1-vermittelten Phosphorylierung des Tie-2-Rezeptors in diesen Zellen vorliegt, doch das Angiopoetin-2, ebenso wie Ang-2-FD-Fc-FD, beim Blockieren der Ang1*-vermittelten Phosophorylierung von Tie-2 wirksamer zu sein scheint, wie in 11 gezeigt.

14 – Ang1*-vermittelte gg. stabiler CHO-Klon-abgeleitete Ang-1-FD-Fc-FD-vermittelte Tie-2-Rezeptor-Phosophorylierung in EAhy926-Zellen. EAhy926-Zellen wurden mit 0,4 &mgr;g/ml Ang1* oder 0,2 &mgr;g/ml oder 0,4 &mgr;l/ml stabilem CHO-Klon-abgeleitetem Ang-1-FD-Fc-FD-Protein stimuliert. Ein standardmäßiger Phosphorylierungsassay ergab, dass stabiles CHO-Klon-abgeleitetes Ang-1-Fd-Fc-FD dem Ang1* in seiner Fähigkeit äquivalent war, die Phosphorylierung des Tie-2-Rezeptors in EAhy926-Zellen zu stimulieren.

15 – Fähigkeit des stabilen CHO-Klon-abgeleiteten Ang-2-FD-Fc-FD, die stabile CHO-Klon-abgeleitete Ang-1-FD-Fc-FD-vermittelte Tie-2-Rezeptor-Phosphorylierung in EAhy926-Zellen zu blockieren. EAhy926-Zellen wurden mit 0,2 &mgr;g/mol des Tie-2-Agonisten Ang1-FD-Fc-FD und 2 &mgr;g/mol, 4 &mgr;g/mol, 8 &mgr;g/mol oder 16 &mgr;g/mol des stabilen CHO-Klon-abgeleiteten Ang-2-FD-Fc-FD behandelt. Ang-2-FD-Fc-FD ist zur Blockierung der stabilen CHO-Klon-abgeleiteten Ang-1-FD-Fc-FD-Stimulierung des Tie-2-Rezeptors fähig, wenn es in einem mindestens 40-fachen molaren Überschuss von stabilem CHO-Klon-abgeleiteten Ang-1-FD-Fc-FD vorhanden ist.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Wie nachstehend ausführlicher beschrieben, haben die Anmelder eine Methode für das "Clustering" von Polypeptidliganden entdeckt, die dahingehend wirkt, ansonsten inaktive lösliche Polypeptidliganden biologisch aktiv zu machen oder die biologische Aktivität von Polypeptidliganden zu erhöhen, welche in Abwesenheit des Clustering geringere Höhen an biologischer Aktivität zeigen würden. Diese Methode kann zum Clustern einer Vielzahl von (mehr als einer) Rezeptor-bindenden Domänen von einem beliebigen Liganden angewendet werden, der eine verbesserte Affinität und/oder erhöhte Aktivität (d.h. Signalübertragungsfähigkeit) im geclusterten Zustand im Vergleich zur nativen Form des Liganden aufweist.

Die vorliegende Erfindung stellt eine Nukleinsäure bereit, die für ein Fusionspolypeptid codiert, wobei das Fusionspolypeptid eine erste Untereinheit umfasst, die mindestens eine Kopie einer Fibrinogen-Domäne von Angiopoetin1 oder Angiopoetin-2 umfasst, wobei die erste Untereinheit an das N-terminale Ende einer multimerisierenden Komponente fusioniert ist, welche multimerisierende Komponente an ihrem C-terminalen Ende an eine zweite Untereinheit fusioniert ist, die mindestens eine Kopie derselben Fibrinogen-Domäne des Angiopoetin-1 oder Angiopoetin-2 umfasst.

Mit "Rezeptor-bindender Domäne" ist der minimale Abschnitt des Liganden gemeint, der zur Bindung seines Rezeptors erforderlich ist.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die multimerisierende Komponente eine von Immunglobulin abgeleitete Domäne. Genauer gesagt kann die von Immunglobulin abstammende Domäne ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus der Fc-Domäne von IgG, der Schwerkette von IgG und der Leichtkette von IgG. In einer anderen Ausführungsform kann die multimerisierende Komponente eine Fc-Domäne sein, von der die ersten fünf Aminosäuren (einschließlich eines Cysteins) entfernt wurden, um eine multimerisierende Komponente zu erzeugen, bezeichnet als Fc(&Dgr;C1).

Die vorliegende Erfindung stellt auch Fusionspolypeptide bereit, die durch die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung codiert sind. Vorzugsweise liegen die Fusionspolypeptide in multimerer Form aufgrund der Funktion der multimerisierenden Komponente vor. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Multimer ein Dimer. Geeignete multimerisierende Komponenten sind beschrieben in der Europäischen Patentanmeldung von ZymoGenetics, Inc., Veröffentlichungsnummer EP 0 721 983 A1, veröffentlicht am 17. Juli 1996, und umfassen S. cerevisiae-unterdrückbare Säurephosphatase (Mizunaga et al., 1988, J. Biochem. (Tokyo) 103: 321–326); das S. cerevisiae-Typ 1-Killerpreprotoxin (Sturley et al., 1986, EMBO J. 5: 3381–3390); die S. calsbergensis-Alpha-Galactosidasemelibiase (Sumner-Smith, et al., 1985, Gene 36: 333–340); und die Neurosgora crassa-Ornithindecarboxylase (Digangi, et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 7889–7893), Sequenzen, die eine Immunglobulin-Schwerketten-Gelenkregion codieren (Takahashi et al., 1982, Cell. 29: 671–679); das S. cerevisiae SUC2-Gen (Carlson et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 439–447); Immunglobulin-Gensequenzen und Abschnitte davon. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Immunglobulin-Gensequenzen, insbesondere solche, die die Fc-Domäne codieren, zum Codieren der multimerisierenden Komponente verwendet.

Die vorliegende Erfindung zieht auch einen Vektor in Betracht, welcher das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst, wie hierin beschrieben.

Ebenfalls bereitgestellt wird ein Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung wie hierin beschrieben umfasst, wobei das Nukleinsäuremolekül funktionsfähig an eine Expressions-Kontrollsequenz geknüpft ist. Ebenfalls bereitgestellt wird ein Wirts-Vektorsystem zur Erzeugung eines Fusionspolypeptids, welches den Expressionsvektor der Erfindung umfasst, der in eine geeignete Wirtszelle zur Expression des Fusionspolypeptids eingeführt worden ist. Die geeignete Wirtszelle kann eine Bakterienzelle wie E. coli, eine Hefezelle wie Pichia pastoris, eine Insektenzelle wie Spodoptera frugiperda oder eine Säugerzelle wie eine COS- oder CHO-Zelle sein.

Die vorliegende Erfindung stellt auch Methoden zur Erzeugung der Fusionspolypeptide der Erfindung bereit, indem Zellen der hierin beschriebenen Wirts-Vektorsysteme unter Bedingungen gezüchtet werden, die die Produktion des Fusionspolypeptids und die Gewinnung des derart produzierten Fusionspolypeptids erlauben.

Die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlichen Fusionspolypeptide können durch Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystem hergestellt werden. Das rekombinante Gen kann unter Anwendung einer Vielzahl von Methoden exprimiert und das Polypeptid ausgereinigt werden. Das Gen kann in einen bakteriellen Expressionsvektor subkloniert werden, wie zum Beispiel, ohne darauf beschränkt zu sein, pCP110.

Die Fusionspolypeptide können mittels einer Technik ausgereinigt werden, welche die anschließende Bildung eines stabilen, biologisch aktiven Proteins erlaubt. Als Beispiel, und nicht als Beschränkung, können die Faktoren aus Zellen entweder als lösliche Proteine oder als Einschlusskörper rückgewonnen werden, aus denen sie quantitativ mittels 8 M Guanidinhydrochlorid und Dialyse extrahiert werden können. Um die Faktoren weiter zu reinigen, kann eine herkömmliche Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie oder Gelfiltration angewendet werden.

Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Nukleinsäure bereit, die ein Fusionspolypeptid codiert, worin das Fusionspolypeptid mehr als eine Kopie einer Fibrinogen-Bindungsdomäne von Angiopoetin-1 oder Angiopoetin-2 hintereinander geschaltet umfasst, und worin entweder die N-terminale oder die C-terminale Rezeptor-Bindungsdomäne auch an eine multimerisierende Komponente fusioniert ist. In einer Ausführungsform der Erfindung sind die Rezeptor-Bindungsdomänen aneinander angrenzend fusioniert.

Mit "Rezeptor-bindender Domäne" ist der minimale Abschnitt des Liganden gemeint, der zur Bindung seines Rezeptors erforderlich ist.

In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung umfasst die multimerisierende Komponente eine von Immunglobulin abgeleitete Domäne. Genauer gesagt kann die von Immunglobulin abstammende Domäne ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus der Fc-Domäne von IgG, der Schwerkette von IgG und der Leichtkette von IgG. In einer anderen Ausführungsform kann die multimerisierende Komponente eine Fc-Domäne sein, von der die ersten fünf Aminosäuren (einschließlich eines Cysteins) entfernt wurden, um eine multimerisierende Komponente zu erzeugen, bezeichnet als Fc(&Dgr;C1).

Die vorliegende Erfindung stellt auch Fusionspolypeptide bereit, die durch die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung codiert sind. Vorzugsweise liegen die Fusionspolypeptide in multimerer Form aufgrund der Funktion der multimerisierenden Komponente vor. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Multimer ein Dimer. Geeignete multimerisierende Komponenten sind beschrieben in der Europäischen Patentanmeldung von ZymoGenetics, Inc., Veröffentlichungsnummer EP 0 721 983 A1, veröffentlicht am 17. Juli 1996, und umfassen S. cerevisiae-unterdrückbare Säurephosphatase (Mizunaga et al., 1988, J. Biochem. (Tokyo) 103: 321–326); das S. cerevisiae-Typ 1-Killerpreprotoxin (Sturley et al., 1986, EMBO J. 5: 3381–3390); die S. calsbergensis-Alpha-Galactosidasemelibiase (Sumner-Smith, et al., 1985, Gene 36: 333–340); und die Neurospora crassa-Ornithindecarboxylase (Digangi, et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 7889–7893), Sequenzen, die eine Immunglobulin-Schwerketten-Gelenkregion codieren (Takahashi et al., 1982, Cell. 29: 671–679); das S. cerevisiae SUC2-Gen (Carlson et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 439–447); Immunglobulin-Gensequenzen und Abschnitte davon. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Immunglobulin-Gensequenzen, insbesondere solche, die die Fc-Domäne codieren, zum Codieren der multimerisierenden Komponente verwendet.

Die vorliegende Erfindung zieht auch einen Vektor in Betracht, welcher das Nukleinsäuremolekül der Erfindung umfasst, wie hierin beschrieben.

Ebenfalls bereitgestellt wird ein Expressionsvektor, der ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung wie hierin beschrieben umfasst, wobei das Nukleinsäuremolekül funktionsfähig an eine Expressions-Kontrollsequenz geknüpft ist. Ebenfalls bereitgestellt wird ein Wirts-Vektorsystem zur Erzeugung eines Fusionspolypeptids, welches den Expressionsvektor der Erfindung umfasst, der in eine geeignete Wirtszelle zur Expression des Fusionspolypeptids eingeführt worden ist. Die geeignete Wirtszelle kann eine Bakterienzelle wie E. coli, eine Hefezelle wie Pichia pastoris, eine Insektenzelle wie Spodoptera frugiperda oder eine Säugerzelle wie eine COS- oder CHO-Zelle sein.

Die vorliegende Erfindung stellt auch Methoden zur Erzeugung der Fusionspolypeptide der Erfindung bereit, indem Zellen der hierin beschriebenen Wirts-Vektorsysteme unter Bedingungen gezüchtet werden, die die Produktion des Fusionspolypeptids und die Gewinnung des derart produzierten Fusionspolypeptids erlauben.

Die für die Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlichen Fusionspolypeptide können durch Expression in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystem hergestellt werden. Das rekombinante Gen kann unter Anwendung einer Vielzahl von Methoden exprimiert und das Polypeptid ausgereinigt werden. Das Gen kann in einen bakteriellen Expressionsvektor subkloniert werden, wie zum Beispiel, ohne darauf beschränkt zu sein, pCP110.

Die Fusionspolypeptide können mittels einer Technik ausgereinigt werden, welche die anschließende Bildung eines stabilen, biologisch aktiven Proteins erlaubt. Als Beispiel, und nicht als Beschränkung, können die Faktoren aus Zellen entweder als lösliche Proteine oder als Einschlusskörper rückgewonnen werden, aus denen sie quantitativ mittels 8 M Guanidinhydrochlorid und Dialyse extrahiert werden können. Um die Faktoren weiter zu reinigen, kann eine herkömmliche Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Interaktionschromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie oder Gelfiltration angewendet werden.

In den Beispielen wird die Präparierung der neuartigen Polypeptidliganden beschrieben, die eine Rezeptor-Bindungsdomäne eines Mitglieds der Angiopoetin-Familie der Liganden umfassen, die den Tie-2-Rezeptor binden können.

Wie zuvor berichtet worden ist, wurde eine Familie von Liganden des Tie-2-Rezeptors entdeckt und als Angiopoetine bezeichnet. Diese Familie, bestehend aus dem Tie-2-Liganden 1 (Ang-1); TIE-2-Liganden 2 (Ang-2); TIE-Liganden 3 (Ang-3); und TIE-Liganden 4 (Ang-4) ist umfassend charakterisiert worden. Für eine Beschreibung der Klonierung, Sequenzierung und Charakterisierung der Angiopoetine, als auch für Methoden zu deren Herstellung und Verwendung, einschließlich der Produktion und Charakterisierung modifizierter und chimärer Liganden davon, wird hiermit Bezug genommen auf die folgenden Veröffentlichungen: US-Patent Nr. 5.521.073, ausgegeben am 28. Mai 1996; US-Patent Nr. 5.643.755, ausgegeben am 1. Juli 1997; US-Patent Nr. 5.650.490, ausgegeben am 22. Juli 1997; US-Patent Nr. 5.814.464, ausgegeben am 29. September 1998; US-Patent Nr. 5.879.672, ausgegeben am 9. März 1999; US-Patent Nr. 5.851.797, ausgegeben am 22. Dezember 1998; Internationale PCT-Anmeldung mit dem Titel "TIE-2 Ligands Methods of Making and Uses Thereof", veröffentlicht als WO 96/11269 am 18. April 1996 im Namen von Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; Internationale PCT-Anmeldung mit dem Titel "TIE-2 Ligands Methods of Making and Uses Thereof", veröffentlicht als WO 96/31598 am 10. Oktober im Namen von Regeneron Pharmaceuticals, Inc; Internationale PCT-Anmeldung mit dem Titel "TIE-2 Receptor Ligands (TIE Ligand-3; TIE Ligand-4) And Their Uses", veröffentlicht als WO 97/48804 am 24. Dezember 1997 in Namen von Regeneron Pharmaceuticals, Inc.; und Internationale PCT-Anmeldung mit dem Titel "Modified TIE-2 Receptor Ligands", veröffentlicht als WO 98/05779 am 12. Februar 1998 im Namen von Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Wie hierin verwendet, umfasst Fusionspolypeptid funktional äquivalente Moleküle, worin die Aminosäure-Reste durch Reste innerhalb der Sequenz ersetzt sind, was eine stumme oder konservative Mutation ergibt. Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäure-Reste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure einer ähnlichen Polarität ersetzt werden, welche als ein funktionelles Äquivalent agiert, was eine stumme oder konservative Alteration ergibt. Substitute für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse ausgewählt werden, zu der die Aminosäure gehört. Zum Beispiel zählen zu den nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Zu den polaren neutralen Aminosäuren zählen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Zu den positiv geladenen (basischen) Aminosäuren zählen Arginin, Lysin und Histidin. Zu den negativ geladenen (sauren) Aminosäuren zählen Aspartinsäure und Glutaminsäure. Ebenfalls umfasst vom Rahmen der Erfindung sind Proteine oder Fragmente oder Derivate davon, welche dieselbe oder ähnliche biologische Aktivität zeigen, und Derivate, die während oder nach der Translation differentiell modifiziert werden, z.B. durch Glykosylierung, proteolytische Spaltung, Knüpfung an ein Antikörpermolekül oder einen anderen zellulären Liganden etc.

Zellen, die die Fusionspolypeptide der Erfindung exprimieren, werden gentechnisch verändert und zum Beispiel durch Transfektion, Transduktion, Elektroporation oder Mikroinjektion erzeugt.

Die vorliegende Erfindung umfasst die durch die Fusionspolypeptide der Erfindung codierten Nukleinsäuresequenzen, ebenso wie Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen an Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, die zu den Nukleinsäuresequenzen der Erfindung komplementär sind. Stringente Bedingungen sind dargestellt zum Beispiel bei Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Band 1, S. 101–104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Außerdem umfasst die vorliegende Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die von den Nukleinsäuresequenzen der Erfindung verschieden sind, doch die nichtsdestotrotz die Fusionspolypeptide der Erfindung aufgrund der Degeneration des genetischen Codes codieren.

Außerdem zieht die vorliegende Erfindung die Verwendung der hierin beschriebenen Fusionspolypeptide in markierten Formen in Erwägung.

Jegliche der Methoden, die den Fachleuten des Gebiets zur Einführung von DNA-Fragmenten in einen Vektor bekannt sind, können zur Konstruktion des Expressionsvektoren verwendet werden, die die Fusionspolypeptide der Erfindung unter Verwendung geeigneter Transkriptions/Translations-Kontrollsignale und der Protein-codierenden Sequenzen codieren. Zu diesen Methoden können in vitro rekombinante DNA- und Synthesemethoden und in vivo Rekombinationen (genetische Rekombination) zählen. Die Expression der Nukleinsäuresequenz, die die Fusionspolypeptide der Erfindung codiert, kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz reguliert werden, so dass das Fusionspolypeptid in einem Wirt exprimiert wird, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist. Zum Beispiel kann die Expression der hierin beschriebenen Fusionspolypeptide mittels jeglichen, im Fachgebiet bekannten Promotor/Enhancer-Elements, kontrolliert werden. Zu den Promotoren, die zur Kontrolle der Expression des Fusionspolypeptids verwendet werden können, zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, die Lange Terminale Wiederholung, wie beschrieben bei Squinto et al., (1991, Cell 65: 1–20); die SV40 frühe Promotor-Region (Bernoist und Chambon, 1981, Nature, 290: 304–310), der CMV-Promotor, die M-MuLV 5'-Terminale Wiederholung des Promotors, die in der 3'-Langen Terminalen Wiederholung des Rous-Sarkomvirus enthalten ist (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787–797), der Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 144–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster et al., 1982, Nature, 296: 39–42); prokaryontische Expressionsvektoren wie der b-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 3727–3731) oder der tac-Promotor (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21–25), siehe auch "Nützliche Proteine von rekombinanten Bakterien" in Scientific American, 1980, 242: 74–94; Promotorelemente von Hefe oder anderen Pilzen, wie zum Beispiel der Gal 4-Promotor, der ADH-(Alkoholdehydrogenase)-Promotor, der PGK-(Phosphoglycerolkinase)-Promotor, der alkalische Phosphatase-Promotor und die folgenden animalen Transkriptions-Kontrollregionen, die Gewebespezifität aufweisen und in transgenen Tieren verwendet worden sind: Elastase 1-Genkontrollregion, die in pankreatischen Acinuszellen aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38: 639–646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399–409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425–515); die Insulin-Genkontrollregion, die in pankreatischen Beta-Zellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315: 115–122), die Immunglobulin-Genkontrollregion, die in lymphoiden Zellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647–658; Adames et al., 1985, Nature, 318: 533–538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436–1444), Mäuse-Mammatumorvirus-Kontrollregion, die in Hoden-, Brust-, Lymph- und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45: 485–495), Albumin-Genkontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268–276), Alpha-Fetoprotein-Genkontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639–1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53–58), Alpha-1-Antitrypsin-Genkontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161–171), Beta-Globin-Genkontrollregion, die in myeloiden Zellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338–340; Kollias et al. 1986, Cell 46: 89–94); Myelin-Grundprotein-Genkontrollregion, die in Oligodendrozytenzellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703–712); Myosin-Leichtketten-2-Genkontrollregion, die in Skelettmuskel aktiv ist (Shani, 1985, Nature 314: 283–286), und Gonadotropin-freisetzendes Hormon-Genkontrollregion, die im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234: 1372–1378).

Daher werden gemäß der Erfindung Expressionsvektoren, die in einem bakteriellen oder eukaryontischen Wirt replizierbar sind, umfassend ein Angiopoetin-Fusionspolypeptid, das die hierin beschriebenen Nukleinsäuren codiert, zum Transfizieren des Wirts und dabei Steuern der Expression der Nukleinsäure verwendet, um Fusionspolypeptide zu erzeugen, die dann in biologisch aktiver Form rückgewonnen werden können. Wie hierin verwendet, umfasst eine biologisch aktive Form eine Form, die zum Binden des relevanten Rezeptors und Bewirken einer differentiellen Funktion und/oder Beeinflussen des Phänotyps der Zelle, die den Rezeptor exprimiert, fähig ist. Solche biologisch aktive Formen würden zum Beispiel die Phosphorylierung der Tyrosinkinase-Domäne des Tie-2-Rezeptors oder die Stimulierung der Synthese von zellulärer DNA induzieren.

Expressionsvektoren, die die Nukleinsäure-Inserte enthalten, können anhand dreier allgemeiner Ansätze identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisation, (b) Vorhandensein oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen, und (c) Expression der inserierten Sequenzen. Beim ersten Ansatz kann das Vorhandensein einer Fremdnukleinsäure, die in einen Expressionsvektor eingeführt ist, durch DNA-DNA-Hybridisation unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden, die Sequenzen umfassen, die zu eingeführten Nukleinsäuresequenzen homolog sind. Im zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirtssystem identifiziert und auf der Grundlage des Vorhandenseins oder der Abwesenheit bestimmter "Marker"-Genfunktionen ausgewählt werden (z.B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegenüber Antibiotika, Transformations-Phänotyp, Einschlusskörperbildung in Baculovirus, etc.), wie durch die Insertion von Fremd-Nukleinsäuresequenzen in den Vektor bewirkt. Wird zum Beispiel eine efl-Nukleinsäuresequenz in die Markergensequenz des Vektors eingebaut, so können Rekombinante, die das Insert enthalten, durch die Abwesenheit der Markergen-Funktion identifiziert werden. Beim dritten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren durch Untersuchen des Fremd-Nukleinsäureprodukts, das durch die Rekombinante exprimiert wird, identifiziert werden. Solche Assays können zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionalen Eigenschaften des Nukleinsäureprodukts von Interesse basieren, zum Beispiel durch Bindung eines Liganden an einen Rezeptor oder Abschnitt davon, der zum Beispiel mit einem nachweisbaren Antikörper oder Abschnitt davon markiert werden kann, oder durch Bindung an Antikörper, die gegen das Protein von Interesse oder einen Abschnitt davon produziert werden.

Die Zellen der vorliegenden Erfindung können das Angiopoetin-Fusionspolypeptid, wie hierin beschrieben, vorübergehend oder vorzugsweise konstitutiv oder permanent exprimieren.

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem die Entwicklung eines Fusionspolypeptids als einem Therapeutikum für die Behandlung von Patienten bereit, die an Störungen leiden, an denen Zellen, Gewebe oder Organe, welche den Tie-2-Rezeptor exprimieren, beteiligt sind. Diese Moleküle können bei einer Methode zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers oder bei einer Diagnosemethode verwendet werden.

Da Tie-2-Rezeptor in Verbindung mit Endothelzellen identifiziert worden ist, und, wie früher nachgewiesen wurde, von der Blockierung von Agonisten des Rezeptors, wie etwa dem Tie-2-Liganden 1 (Ang-1), gezeigt wurde, dass sie die Vaskularisation verhindert, erwarten die Anmelder, dass die Tie-2-Agonist-Fusionspolypeptide der Erfindung für die Induktion der Vaskularisation bei Krankheiten oder Störungen nützlich sein können, bei denen eine solche Vaskularisation angezeigt ist. Zu diesen Erkrankungen oder Störungen zählt die Wundheilung, Ischämie und Diabetes. Die Liganden können in Tiermodellen getestet und therapeutisch eingesetzt werden, wie für andere Agenzien, zum Beispiel den Gefäßendothel-Wachstumsfaktor (VEGF), einen anderen Endothelzell-spezifischen Faktor, der angingen ist, beschrieben. Ferrara, et al., US-Patent Nr. 5.332.671, ausgegeben am 26. Juli 1994. Die Ferrara-Referenz beschreibt, ebenso wie andere Studien, in vitro- und in vivo-Studien, die zum Nachweis der Wirkung eines angiogenen Faktors zur Erhöhung des Blutstroms in ischämisches Myokard, zur Verbesserung der Wundheilung und bei anderen therapeutischen Ansätzen, bei denen eine Neoangiogenese erwünscht ist, verwendet werden können. [Siehe Sudo et al., Europäische Patentanmeldung 0 550 296 A2 veröffentlicht am 7. Juli 1993; Banai, et al., Circulation 90: 2183–2189 (1994); Unger et al., Am. J. Physiol. 266: H1588–H1595 (1994); Lazarous et al., Circulation 91: 145–153 (1995)]. Gemäß der Erfindung können Agonist-Fusionspolypeptide einzeln oder in Kombination mit ein oder mehreren zusätzlichen pharmazeutisch aktiven Verbindungen verwendet werden, wie z.B. VEGF oder basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF).

Im Gegensatz dazu wurde von Antagonisten des Tie-2-Rezeptors, wie etwa Tie-2-Rezeptorkörper oder Tie-2-Ligand 2 (Ang-2), wie in Beispiel 9 der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 96/31598, veröffentlicht am 10. Oktober 1996, beschrieben, die Verhinderung oder Verzögerung der Vaskularisation gezeigt, weshalb erwartet wird, dass sie beim Verhindern oder Verzögern beispielsweise des Tumorwachstums nützlich sind. In ähnlicher Weise wären dann Tie-2-Antagonist-Fusionspolypeptide der Erfindung ebenfalls für diese Zwecke nützlich. Diese Antagonisten können einzeln oder in Kombination mit anderen Zusammensetzungen verwendet werden, wie etwa Anti-VEGF-Antikörper, die als nützlich in der Behandlung von Zuständen gezeigt wurden, bei welchen die therapeutische Absicht im Blockieren einer Angiogenese besteht.

Die Anmelder haben zum Beispiel bestimmt, dass Tie-2-Liganden in Zellen innerhalb oder in enger Verbindung von Tumoren exprimiert werden. Zum Beispiel erscheint Tie-2-Ligand 2 (Ang-2) mit Tumor-Endothelzellen eng verbunden zu sein. Dementsprechend können Tie-2-Antagonist-Fusionspolypeptide der Erfindung auch in der Verhinderung oder Verzögerung zum Beispiel des Tumorwachstums nützlich sein.

In anderen Ausführungsformen können die hierin beschriebenen Tie-2-Agonist-Fusionspolypeptide der Erfindung als hämopoetische Faktoren verwendet werden. Eine Vielfalt hämopoetischer Faktoren und ihre Rezeptoren sind an der Vermehrung und/oder Differenzierung und/oder Migration der verschiedenen, im Blut enthaltenen Zelltypen beteiligt. Da die Tie-2-Rezeptoren in frühen hämopoetischen Zellen exprimiert werden, wird von den Tie-2-Liganden erwartet, dass sie eine vergleichbare Rolle in der Vermehrung oder Differenzierung oder Migration dieser Zellen spielen. So können zum Beispiel Tie-2-Agonist-Fusionspolypeptid-Zusammensetzungen zubereitet, analysiert, in in vitro- und in vivo-biologischen Systemen untersucht und therapeutisch verwendet werden, wie beschrieben in einer der folgenden Quellen: Sousa, US-Patent Nr. 4.810.643, Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4360–4363 (1985), Wong et al., Science, 228: 810–814 (1985); Yokota, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81: 1070 (1984); Bosselman, et al., WO 9105795, veröffentlicht am 2. Mai 1991 mit dem Titel "Stem Cell Factor", und Kirkness, et al. WO 95/19985 veröffentlicht am 27. Juli 1995 mit dem Titel "Haemopoietic Maturation Factor". Demgemäß können die Fusionspolypeptide zur Diagnose oder Behandlung von Bedingungen verwendet werden, bei denen die normale Hämopoese unterdrückt ist, einschließlich, doch nicht beschränkt auf Anämie, Thrombozytopenie, Leukopenie und Granulozytopenie. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Fusionspolypeptide zur Stimulierung der Differenzierung von Blutzell-Vorläufern in Situationen verwendet werden, bei denen ein Patient an einer Krankheit leidet, wie etwa dem erworbenen Immunschwäche-Syndrom (AIDS), die eine Verminderung der normalen Blutzellmengen bewirkt hat, oder in einer klinischen Situation, in der eine Erhöhung der hämopoetischen Populationen erwünscht ist, wie etwa in Verbindung mit einer Knochenmarks-Transplantation oder bei der Behandlung von Aplasie oder durch Bestrahlung, chemische Behandlung oder Chemotherapie bewirkte Myelosuppression.

Die Fusionspolypeptide der vorliegenden Erfindung können einzeln oder in Kombination mit anderen pharmazeutisch aktiven Agenzien verwendet werden, wie zum Beispiel Zytokinen, Neurotrophinen, Interleukinen, etc. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Fusionspolypeptide in Verbindung mit einer Vielzahl von Faktoren verwendet werden, die für das Induzieren von Stammzellen oder einer anderen hämopoetischen Vorläufervermehrung bekannt sind, oder Faktoren, die an späteren Zellen im hämopoetischen Weg wirken, einschließlich, doch nicht beschränkt auf hämopoetischen Wachstumsfaktor, Thrombopoetin, Stammzellfaktor, Erythropoetin, G-CSF, GM-CSF, etc.

In einer alternativen Ausführungsform werden Tie-2-Rezeptorantagonist-Fusionspolypeptide für die Diagnose oder Behandlung von Patienten verwendet, bei denen das gewünschte Ergebnis die Hemmung eines hämopoetischen Wegs wäre, wie etwa zur Behandlung von myeoloproliferativen oder anderen proliferativen Störungen von blutbildenden Organen, wie etwa Thrombozythämien, Polyzythämien und Leukämien. In solchen Ausführungsformen kann die Behandlung die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge der Fusionspolypeptide, wie hierin beschrieben, umfassen.

Die zur Behandlung dieser und anderer Erkrankungen oder Störungen sinnvollen wirksamen Dosen können unter Anwendung von Methoden bestimmt werden, wie sie einem Fachmann des Gebiets bekannt sind [siehe zum Beispiel Fingl, et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, Hrg. Macmillan Publishing Co., New York, S. 1–46 (1975)]. Zu pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der Erfindung zählen die oben beschriebenen Fusionspolypeptide in einem pharmakologisch akzeptablen flüssigen, festen oder halbfesten Träger, geknüpft an einen Träger oder ein Zielmolekül (z.B. Antikörper, Hormon, Wachstumsfaktor, etc.) und/oder aufgenommen in Liposome, Mikrokapseln und kontrolliert freisetzende Präparate vor der Verabreichung in vivo. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zum Beispiel ein Fusionspolypeptid in einer wässrigen Lösung, wie etwa steriles Wasser, Salzlösung, Phosphatpuffer oder Dextroselösung, umfassen. Alternativ können die aktiven Agenzien in einer festen (z.B. Wachs) oder halbfesten (z.B. gelatineartigen) Formulierung enthalten sein, die einem Patienten implantiert wird, der einer solchen Behandlung bedarf. Der Verabreichungsweg kann in jeglichem im Fachgebiet bekannten Verabreichungsweg bestehen, einschließlich, doch nicht beschränkt auf intravenös, intrathekal, subkutan, durch Injektion in beteiligte Gewebe, intraarteriell, intranasal, oral oder über ein implantiertes Element.

Die Verabreichung kann zur Verteilung des aktiven Agens der Erfindung im ganzen Körper oder in einem lokalisierten Gebiet führen. Zum Beispiel kann unter einigen Bedingungen, die entfernte Regionen des Nervensystems einbeziehen, eine intravenöse oder intrathekale Verabreichung des Agens erwünscht sein. In einigen Situationen kann ein Implantat, das aktives Agens enthält, in oder nahe des Läsionsbereichs platziert werden. Zu geeigneten Implantaten zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, Gelschaum, Wachs oder Implantate auf Mikropartikel-Basis.

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die die hierin beschriebenen Fusionspolypeptide in einem pharmakologisch akzeptablen Vehikel umfassen. Die Zusammensetzungen können systemisch oder lokal verabreicht werden. Ein im Fachgebiet bekannter geeigneter Verabreichungsweg kann angewendet werden, einschließlich, doch nicht beschränkt auf intravenös, intrathekal, intraarteriell, intranasal, oral, subkutan, intraperitoneal oder durch lokale Injektion oder operative Implantation. Formulierungen mit verzögerter Freisetzung werden ebenfalls bereitgestellt.

Die vorliegende Erfindung soll durch die hierin beschriebenen spezifischen Ausführungsformen nicht in ihrem Rahmen eingeschränkt werden. Tatsächlich werden verschiedene Modifikationen der Erfindung über die hierin beschriebenen hinaus für Fachleute des Gebiets aus der vorangegangenen Beschreibung und den begleitenden Figuren erkennbar sein. Diese Modifikationen sollen in den Umfang der anhängenden Ansprüche fallen.

BEISPIELE Angiopoetin-Liganden:

Wie oben beschrieben, haben Experimente mit Mutanten von Ang-1 und Ang-2 gezeigt, dass die Fibrinogen-Domänen (FD) die Rezeptor-Bindungsdomänen sind und dass dimerisierte Versionen (die Dimerisation erfolgt aufgrund der Wechselwirkung zwischen den Fc-Komponenten benachbarter Moleküle), zum Beispiel Ang-1-FD-Fc, an den Tie-2-Rezeptor bei viel höherer Affinität binden kann als monomeres Ang-1-FD. Allerdings ist Ang-1-FD-Fc nicht zur Induzierung der Phosphorylierung (Aktivierung) des Tie-2-Rezeptors auf Endothelzellen fähig, sofern es nicht mit Ziege-Anti-Human-Fc-Antikörpern weiter geclustert ist (Jackson Immunoresearch). Aus diesem Grunde wurden mutierte Versionen von Ang-1-FD und Ang-2-FD designed, die intrinsisch höher geclustert waren.

Zwei allgemeine Typen von Nukleinsäure-Molekülen wurden konstruiert. Der erste Typ bestand aus zwei Tandem-Kopien von Ang-1-FD in Fusion an Fc-tag, was zu einem sekretierten Polypeptid-Molekül führte, das bezüglich des Fc-tags dimer ist, doch bezogen auf Ang-1-FD tetramer ist. In ähnlicher Weise stellten zwei Tandem-Kopien von Ang-2-FD in Fusion an ein Fc-tag die Angiopoetin-2-Version dieser Art von Konstrukt dar. Diese Molekülen wurden als Ang-1-FD-FD-Fc bzw. Ang-2-FD-FD-Fc bezeichnet.

Beim zweiten Konstruktionstyp des Nukleinsäuremoleküls wurden zwei Kopien von Ang-1-FD durch eine Fc-tag-Brücke zwischen ihnen verbunden, wodurch die Struktur Ang-1-FD-Fc-FD geschaffen wurde, die nach wie vor dimer bezüglich des Fc ist, als auch tetramer bezüglich der Ang-1-FD. Eine Angiopoetin-2-Version wurde ebenfalls konstruiert, und diese beiden Moleküle wurden als Ang-1-FD-Fc-FD bzw. Ang-2-FD-Fc-FD bezeichnet.

Für beide Arten von Konstrukt wurden ähnliche Eigenschaften beobachtet: anders als dimeres Ang-1-FD-Fc, welches darin versagt, Tie-2 in Endothelzellen zu aktivieren, konnten sowohl Ang-1-FD-FD-Fc als auch Ang-1-FD-Fc-FD Tie-2 in Endothelzellen bei einer dem nativen Liganden vergleichbaren Potenz ohne weiteres aktivieren. Auch konnte Ang-2-FD-Fc-FD, ebenso wie natives Angiopoetin-2, die Angiopoetin-1-Aktivität bei einer Potenz antagonisieren, die der von nativem Angiopoetin-2 vergleichbar ist, und bei viel größerer Potenz als die maginal antagonistische Aktivität des Ang-2-FD-Fc-Dimers.

Konstruktion von mutierten Angiopoetin-Nukleinsäuremolekülen.

Alle der folgenden Nukleinsäuremoleküle wurden mittels standardmäßigen rekombinanten DNA-Techniken konstruiert (siehe z.B. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), Current Protocols in Molecular Biology (Hrg. Ausubel, et al.; Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY), Sequenz-verifiziert mittels standardmäßigen Techniken unter Verwendung eines ABI 373A DNA-Sequenzierers und eines Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), und in den Säuger-Expressionsvektor pMT21 subkloniert (Genetics Institute, Inc.) mit einer Kozak-Sequenz (Kozak, M., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 8125–8148) am 5'-Ende zum Vorantreiben der Proteintranslation. Die unten beschriebenen Brückensequenzen wurden zur Bereitstellung bequem geeigneter Restriktionsstellen und zur Verleihung von Flexibilität an den Junktionen zwischen den Domänen eingeführt, doch gibt es keinen Hinweis darauf, dass diese Brückensequenzen über eine sehr entscheidende Natur verfügen (obschon eine Variierung der Länge des Linkers bei einigen dieser Konstrukten zu einer gewissen Abweichung bei der Menge an erzeugtem Protein führte).

Beispiel 1: Konstruktion der Ang-1-FD-FD-Fc-, Ang-2-FD-FD-Fc-, Ang-1-FD-Fc-FD- und Ang-2-FD-Fc-FD-Nukleinsäuremoleküle.

Ang-1-FD-FD-Fc: Ang-1-FD-FD-Fc besteht aus einer Trypsin-Signalsequenz an seinem Amino-Terminus, um die Sekretion zu ermöglichen (Basen 1–45 der 1A), gefolgt von der Angiopoetin-1-Fibrinogen-Domäne (FD) (Basen 45–690 der 1A1B), einer kurzen Brückensequenz, bestehend aus den Aminosäuren Gly-Pro-Ala-Pro (Basen 691–702 der 1B), einer zweiten Angiopoetin-1-FD (Basen 703–1750 der 1B1D), einer weiteren Brückensequenz, bestehend aus den Aminosäuren Gly-Pro-Gly (Basen 1351–1359 der 1D) und der Codierungssequenz für den Fc-Abschnitt des humanen IgG1 (Basen 1360–2058 der 1D1E).

Ang-2-FD-FD-Fc: Das Ang-2-FD-FD-Fc-Nukleinsäuremolekül wurde in ähnlicher Weise konstruiert. Es besteht aus einer Trypsin-Signalsequenz (Basen 1–45 der 2A), einer Angiopoetin-2-FD (Basen 46–690 der 2A2B), einer brückenbildenden Aminosäuresequenz Gly-Gly-Pro-Ala-Pro (Basen 691–705 der 2B), einer zweiten Angiopoetin-2-FD (Basen 706–1353 der 2B2D), einer anderen brückenbildenden Aminosäuresequenz Gly-Pro-Gly (Basen 1354–1362 der 2D) und der Codierungssequenz für den Fc-Abschnitt des humanen IgG1 (Basen 1363–2061 der 2D2E).

Ang-1-FD-Fc-FD: Das Ang-1-FD-Fc-FD besteht aus einer Trypsin-Signalsequenz (Basen 1–45 der 3A), einer Angiopoetin-1-FD (Basen 46–690 der 3A3B), der brückenbildenden Aminosäuresequenz Gly-Pro-Gly (Basen 691–699 der 3B), der Codierungssequenz für den Fc-Abschnitt von humanem IgG1 (Basen 700–1395 der 3B3D), einer weiteren brückenbildenden Aminosäuresequenz Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Pro (Basen 1396–1419 der 3D) und einer zweiten Angiopoetin-1-FD (Basen 1420–2067 der 3D3E).

Ang-2-FD-Fc-FD: Das Ang-2-FD-Fc-FD-Nukleinsäuremolekül besteht aus einer Trypsin-Signalsequenz (Basen 1–45 der 4A), einer Angiopoetin-2-FD-Domäne (Basen 46–690 der 4A4B), der brückenbildenden Aminosäuresequenz Gly-Gly-Pro-Gly (Basen 691–702 der 4B), der Codierungssequenz für den Fc-Abschnitt von humanem IgG1 (Basen 703–1398 der 4B4D), der brückenbildenden Aminosäuresequenz Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Pro (Basen 1399–1422 von 4D) und einer zweiten Angiopoetin-2-FD (Basen 1423–2067 von 4D4E).

Beispiel 2: Charakterisierung des Ang-1-FD-Fc-FD-Proteins.

Molekulargewichtsanalyse: Das vorhergesagte Molekulargewicht für Ang-1-FD-Fc-FD-Protein wurde unter Verwendung des McVector-Programms (Kodak, Scientific Imaging System, New Haven, CT) bestimmt. Die monomere Form (bezüglich des Fc) weist ein vorhergesagtes Gewicht von 76.349 auf. Außerdem liegen drei vorhergesagte N-verknüpfte Glykosylierungsstellen von etwa 2500 MG/Stelle vor, die potentiell das Molekulargewicht des monomeren Proteins von 83.849 anheben könnten. Aufgrund der Interaktion zwischen den Fc-Komponenten der benachbarten Moleküle liegt das Protein tatsächlich als ein Dimer mit einem vorhergesagten Molekulargewicht, einschließlich einer möglichen N-verknüpften Glykosylierung, von 167.698 vor. Unten beschriebene nachfolgende SDS-PAGE-Analysen von COS-Zell-abgeleitetem Protein bestätigten diese angenäherten Molekulargewichte mit einer bei etwa 210 kD unter nichtreduzierenden Bedingungen ablaufenden Bande und einer bei etwa 85 kD unter reduzierenden Bedingungen ablaufenden Bande (5). Eine Lichtstreuungsanalyse wurde zur weiteren Bestätigung des Molekulargewichts, und bedeutsamerweise zur Bestimmung vorgenommen, ob das Protein eine homogene Spezies war oder nicht. Die Lichtstreuung stellt eine Funktion der Masse und Konzentration eines Makromoleküls dar. Zur Bestimmung des Molekulargewichts wurde die Proteinprobe auf eine Gelfiltrationssäule gespritzt und der Ablauf mit einem On-line-Lichtstreuungs-Detektor und einem Refraktionsindex- und/oder einem UV-Detektor überwacht. Der Lichtstreuungs-Detektor ist ein MiniDawn Laserlichtstreuungs-Detektor von Wyatt Technology Corporation (Santa Barbara, CA). Dieses Instrument misst das statische Licht in drei unterschiedlichen Winkeln. Der On-line-Refraktionsindex-Detektor oder UV-Detektor dient zur Messung der Proteinkonzentration. Astra 4.7 Software (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) wurde zur Berechnung der Proteinkonzentration auf der Basis von entweder dn/dc (dn = Veränderung des Refraktionsindex; dc = Konzentration) oder des Extinktionskoeffizienten des Proteins verwendet. Das Molekulargewicht des Proteins wird dann aus der Winkelabhängigkeit der Lichtstreuung errechnet. 6 zeigt die Ergebnisse dieser Analyse unter Verwendung von COS-Zell-abstammendem Protein. Das Molekulargewicht des dimeren Proteins scheint etwa 200 kD zu sein, und das Vorhandensein eines einzelnen Peaks legt nahe, dass die Proteinlösung tatsächlich homogen ist.

Expressionsmenge in COS-Zellen: COS-Zellüberstände, die rekombinantes Ang-1-FD-Fc-FD-Protein enthielten, wurden durch vorübergehendes Transfizieren von COS-Zellen mit dem oben beschriebenen Ang-1-FD-Fc-FD-DNA-Konstrukt erzeugt. Alle Transfektionen wurden unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten standardmäßigen Techniken durchgeführt. Der COS-Zellüberstand wurde unter Verwendung von Biacore-Technologie (Pharmacia, Inc.) zum Quantifizieren der Menge an im Überstand vorhandenem Ang-1-FD-Fc-FD-Protein analysiert. Diese Analyse ergab einen RU-Wert von 765, was äquivalent zu 0,9 mg an rekombinantem Protein/Liter von COS-Zellüberstand ist. Diese Werte stellen sehr hohe Expressionsmengen dar.

Reinigung von COS-Überständen: Da das Ang-1-FD-Fc-FD-Protein eine Fc-Domäne enthält, ist die Reinigung relativ einfach und unter Anwendung einer standardmäßigen Protein A-Säulenchromatographie (Pharmacia, Inc.), gefolgt von einer standardmäßigen Größenausschluss-Chromatographie (Pharmacia, Inc.), unkompliziert machbar. In der Tat verleiht die relative Einfachheit der Reinigung dem Ang-1-FD-Fc-FD-Protein einen klaren Vorteil gegenüber dem Stammprotein, Angiopoetin-1, von dem es abgeleitet ist, und der mutierten Version des Angiopoetin-1, bezeichnet als Ang1*, die aus dem N-Terminus von Angiopoetin-2 in Fusion an die Coiled-Coil-Domäne und Fibrinogen-Domäne von Angiopoetin-1 besteht und die eine Cys zu Ser-Mutation bei Aminosäure 245 aufweist. (Siehe Internationale PCT-Anmeldung mit dem Titel "Modified TIE-2-Receptor Ligands", veröffentlicht als WO 98/05779 am 12. Februar 1998 im Namen von Regeneron Pharmaceuticals, Inc., insbesondere 27, welche hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen ist).

Sowohl Angiopoetin-1 als auch Ang1* erfordern umfangreiche, kostspielige und arbeitsintensive Reinigungsschemata, die zu relativ schlechten Ausbeuten an rekombinantem Protein führen. Der Bedarf an kostenwirksamen, einfachen Reingiungsschemata für biologische Materialien, die für die klinische Anwendung vorgesehen sind, kann nicht stark genug betont werden.

Der COS-Zellüberstand wurde wie oben beschrieben gereinigt und ergab etwa 1 mg an gereinigtem Ang-1-FD-Fc-FD-Protein, das in unten beschriebenen Studien zur weiteren Charakterisierung des Proteins verwendet wurde.

N-terminale Sequenzierung von COS-Zell-abgeleitetem Ang-1-FD-Fc-FD-Protein:

Gereinigtes Ang-1-FD-Fc-FD-Protein wurde einer standardmäßigen N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen, um zu bestimmen, ob irgendeine verkürzte Spezies des Proteins erzeugt worden war. Dies war von Belang, da das mutierte Molekül Ang1* als zwischen 10–20% N-terminal verkürzte Spezies enthaltend bekannt ist. Die Analyse ergab lediglich eine N-terminale Sequenz, Arg-Asp-X-Ala-Asp, worin X Cys ist. Diese Sequenz kann bei Aminosäuren 16–20 der 3A gefunden werden und folgt der Signalsequenz des Proteins entsprechend den Aminosäuren 1–15 der 3A unmittelbar.

Rezeptor-Bindungsanalyse von COS-Zell-abgeleitetem Ang-1-FD-Fc-FD:

In früheren Studien wurde bestimmt, dass die Fibrinogen-Domäne (FD) der Angiopoetin-Moleküle für die Ligand/Rezeptor-Interaktion erforderlich ist. Weiterhin müssen, damit eine hochaffine Bindung an den Tie-2-Rezeptor erfolgt, natives Angiopoetin-1, Angiopoetin-2 und das mutierte Ang1* zumindest Tetramere, und möglichst Multimere einer höheren Ordnung bilden. Um zu bestimmen, ob das COS-Zell-abgeleitete Ang-1-FD-Fc-FD-Protein, welches bezüglich der FD-Domäne tetramer ist, an TIE-2 bei höherer Affinität binden könnte, wurde eine standardmäßige Biacore-Analyse durchgeführt. Kurz gesagt wurde das Tie-2-Fc-Rezeptor-Körperprotein, welches ein Fusionsprotein ist, das die Ectodomäne von Tie-2 in Fusion an die Fc-Domäne von humanem IgG1 umfasst, an einem Biacore-Chip immobilisiert. Eine Ang-1-FD-Fc-FD-enthaltende Lösung wurde über den Chip geleitet, wobei die Bindung zwischen der Tie-2-Ectodomäne und Ang-1-FD-Fc-FD erfolgen durfte. Dem Bindungsschritt folgte eine Hochsalzspülung mit 0,5 M NaCl. Die Hochsalzspülung war nicht in der Lage, die Interaktion zwischen dem Ang-1-FD-Fc-FD-Protein und der Tie-2-Rezeptor-Ectodomäne zu zerstören, was nahelegt, dass eine starke Interaktion zwischen dem mutierten Liganden und dem Rezeptor vorliegt. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Biacore-Ergebnissen überein, in denen sowohl Ang-1-FD-Fc-FD-Stammmolekül, Angiopoetin-1, als auch das mutierte Ang1*-Molekül nachgewiesenermaßen eine starke Interaktion mit dem Tie-2-Fc-Rezeptor zeigen und dass diese Interaktion nicht durch Hochsalz zerstört wird. Im Gegensatz dazu dissoziieren verschiedene mutierte Moleküle, die vom Stamm-Angiopoetin-1-Molekül abgeleitet sind, ohne weiteres vom Tie-2-Fc-Rezeptor bei Behandlung mit Hochsalz. Die mutierten Moleküle, bezeichnet als Ang-1/FD (ein Monomer bezüglich des FD), Ang-1/FD-Fc (ebenfalls ein Monomer bezüglich der FD, welches aber aufgrund des Vorhandenseins der Fc-Domäne ein Dimer bilden kann) und Ang1/C/FD (ein Monomer bezüglich der FD, welches aber außerdem die Coiled-Coil-Domäne von Angiopoetin-1 enthält), liegen nicht in ausreichend multimeren Formen für eine hochaffine Bindung an den Tie-2-Rezeptor vor.

Beispiel 3: Charakterisierung von COS-Zell-abgeleitetem Ang-2-FD-Fc-FD-Protein.

Molekulargewichtsanalyse: Wie für Ang-1-FD-Fc-FD oben beschrieben, wurde das vorhergesagte Molekulargewicht für Ang-2-FD-Fc-FD-Protein unter Verwendung des MacVector-Programms (Kodak, Scientific Imaging Systems, New Haven, CT) bestimmt. Die monomere Form von Ang-2-FD-Fc-FD weist ein vorhergesagtes Gewicht von 76.052 bei drei vorhergesagten N-verknüpften Glykosylierungsstellen auf, die potentiell das Molekulargewicht des monomeren Proteins auf 83.552 erhöhen könnten. Ebenso wie Ang-1-FD-Fc-FD, existiert das Protein als ein Dimer mit einem vorhergesagten Molekulargewicht, einschließlich einer möglichen N-verknüpften Glykosylierung, von 167.104. SDS-PAGE-Analysen von COS-Zell-abgeleitetem Protein bestätigten diese angenäherten Molekulargewichte bei einer bei etwa 200 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen ablaufenden Bande und einer bei etwa 88 kD unter reduzierenden Bedingungen ablaufenden Bande (7). Die Lichtstreuungsanalyse bestätigte das Molekulargewicht (171 kD) und ergab, dass das Ang-2-FD-Fc-FD-Protein, ähnlich dem Ang-1-FD-Fc-FD, als eine homogene Spezies existiert (8).

Expressionsmenge in COS-Zellen: Ein rekombinantes Ang-2-FD-Fc-FD-Protein enthaltender COS-Zellüberstand wurde durch vorübergehendes Transfizieren von COS-Zellen mit dem oben beschriebenen Ang-2-FD-Fc-FD-DNA-Konstrukt erzeugt. Der COS-Zellüberstand wurde mittels Biacore zur Quantifizierung der Menge an im Überstand vorhandenem Ang-2-FD-Fc-FD-Protein analysiert. Diese Analyse ergab einen RU-Wert von 606, was äquivalent zu 0,7 mg an rekombinantem Protein/Liter des COS-Zellüberstands ist. Diese Werte verkörpern relativ hohe Expressionsmengen.

Reinigung der COS-Überstände: Wie bei Ang-1-FD-Fc-FD enthält auch Ang-2-FD-Fc-FD-Protein eine Fc-Domäne, so dass die Reinigung unter Anwendung einer standardmäßigen Protein A-Säulenchromatographie, gefolgt von standardmäßiger Größenausschluss-Chromatographie, relativ einfach und unkompliziert ist. Der COS-Zellüberstand wurde wie oben für Ang-1-FD-Fc-FD beschrieben gereinigt und ergab etwa 2 mg an gereinigtem Ang-2-FD-Fc-FD-Protein, das in den unten beschriebenen Studien zur weiteren Charakterisierung dieses Proteins verwendet wurde.

N-terminale Sequenzierung Gereinigtes COS-Zell-abgeleitetes Ang-2-FD-Fc-FD-Protein wurde einer standardmäßigen N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen, um zu bestimmen, ob irgendeine verkürzte Spezies des Proteins erzeugt worden war. Die Analyse ergab lediglich eine N-terminate Sequenz, Arg-Asp-X-Ala-Glu, worin X Cys ist. Diese Sequenz ist bei Aminosäuren 16–20 der 4A zu finden und folgt der Signalsequenz des Proteins entsprechend den Aminosäuren 1–15 der 4A unmittelbar nach.

Rezeptor-Bindungsanalyse von COS-Zell-abgeleitetem Protein: Um zu bestimmen, ob das COS-Zell-abgeleitete Ang-2-FD-Fc-FD-Protein an den Tie-2-Rezeptor binden könnte, wurde eine standardmäßige Biacore-Analyse vorgenommen, wie für Ang-1-FD-Fc-FD oben beschrieben. Wie bei Ang-1-FD-Fc-FD war eine Hochsalzspülung nicht dazu in der Lage, die Wechselwirkung zwischen dem Ang-2-FD-Fc-FD-Protein und dem Tie-2-Fc-Rezeptor zu zerstören, was nochmals nahelegt, dass eine starke Interaktion zwischen dem mutierten Liganden und dem Rezeptor vorlag.

Beispiel 4: Wirkungen von COS-Zell-abgeleitetem Ang-1-FD-Fc-FD und Ang-2-FD-Fc-FD auf die Tie-2-Rezeptor-Phosphorylierung in EAhy926-Zellen.

Da Ang-1-FD-Fc-FD ein mutiertes Molekül ist, das vom agonistischen Angiopoetin-1 abstammt, und Ang-2-FD-Fc-FD ein mutiertes Molekül ist, das vom antagonistischen Angiopoetin-2 abstammt, wollten wir bestimmen, ob diese beiden mutierten Moleküle die mit dem Stammmolekül, von dem sie abstammten, verbundene Aktivität beibehalten würden.

Assaysystem: Alle der unten beschriebenen Experimente verwendeten die Zelllinie EAhy926 (Edgell, C. J., et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3734–3737) und standardmäßige Phosophorylierungs-Assays und Reagenzien, wie sie den Fachleuten des Gebiets vertraut sind.

  • (A) Ang1*-vermittelte gg. Ang-1-FD-Fc-FD-vermittelte Tie-2-Rezeptor-Phosphorylierung in EAhy926-Zellen: EAhy926-Zellen wurden entweder mit 0,1 &mgr;g/mol, 0,2 &mgr;g/mol oder 0,8 &mgr;g/mol Ang1* oder Ang-1-FD-Fc-FD-Protein stimuliert. Ein standardmäßiger Phosophorylierungsassay ergab, dass Ang-1-FD-Fc-FD dem Ang1* in seiner Stimulationsfähigkeit der Phosophorylierung des Tie-2-Rezeptors in EAhy926-Zellen gleichwertig war (9).
  • (B) Fähigkeit von Ang-2-FD-Fc-FD, die Ang1*-vermittelte Tie-2-Rezeptor-Phosphorylierung in EAhy926-Zellen zu blockieren: EAhy926-Zellen wurden mit 0,4 &mgr;g/ml des Tie-2-Agonisten Ang1* und 1 &mgr;g/ml, 2 &mgr;g/ml, 4 &mgr;g/ml, 6 &mgr;g/ml oder 8 &mgr;g/ml an Ang-2-FD-Fc-FD behandelt. Wie in 10 gezeigt, ist Ang-2-FD-Fc-FD zum Blockieren der Ang1*-Stimulation des Tie-2-Rezeptors fähig, wenn er in mindestens 10- bis 15-fachem molarem Überschuss gegenüber dem Ang1* vorhanden ist.
  • (C) Fähigkeit von Angiopoetin-2, die Ang1*-vermittelte Tie-2-Rezeptor-Phosphorylierung in EAhy926-Zellen zu blockieren: Um die blockierenden Wirkungen des natürlich vorkommenden antagonistischen Angiopoetin-2 mit dem von Ang-2-FD-Fc-FD zu vergleichen, wurde dasselbe Experiment wie oben in (B) beschrieben vorgenommen, bei dem Angiopoetin-2 durch Ang-2-FD-Fc-FD ersetzt wurde. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 11 gezeigt. Bei einem 20-fachen molaren Überschuss reduziert das Angiopoetin-2 die Phosphorylierungsmenge nicht auf 50%. Dieses Ergebnis, gekoppelt mit den oben in (B) beschriebenen Ergebnissen, legt nahe, dass Ang-2-FD-Fc-FD ein potenterer Inhibitor der Ang1*-vermittelten Tie-2-Rezeptor-Phosphorylierung ist als Angiopoetin-2.
  • (D) Fähigkeit von Ang-2-FD-Fc-FD, die Angiopoetin-1-vermittelte Phosphorylierung des Tie-2-Rezeptors in EAhy926-Zellen zu blockieren: EAhy926-Zellen wurden mit 0,2 &mgr;g/ml des natürlich vorkommenden Tie-2-Agonisten Angiopoetin-1 und 1 &mgr;g/mol, 2 &mgr;g/mol, 4 &mgr;g/mol, 6 &mgr;g/mol oder 8 &mgr;g/mol von Ang-2-FD-Fc-FD behandelt. Die in 12 gezeigten Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass, obschon eine Tendenz zur Blockierung der Angiopoetin-1-vermittelten Phosphorylierung des Tie-2-Rezeptors in diesen Zellen vorliegt, Ang-2-FD-Fc-FD beim Blockieren der Ang1*-vermittelten Phosphorylierung von Tie-2 wirksamer zu sein scheint, wie in 10 gezeigt und oben in (B) beschrieben.
  • (E) Fähigkeit von Angiopoetin-2, die Angiopoetin-1-vermittelte Phosphorylierung des Tie-2-Rezeptors in EAhy926-Zellen zu blockieren: EAhy926-Zellen wurden mit 0,2 &mgr;g/mol von Angiopoetin-1 und 1 &mgr;g/mol, 2 &mgr;g/mol, 4 &mgr;g/mol, 6 &mgr;g/mol oder 8 &mgr;g/mol von Angiopoetin-2 behandelt. Die Ergebnisse dieses Experiments, wie in 13 gezeigt, zeigen, dass eine Tendenz zum Blockieren der Angiopoetin-1-vermittelten Phosphorylierung des Tie-2-Rezeptors in diesen Zellen vorliegt, doch dass Angiopoetin-2, ebenso wie Ang-2-FD-Fc-FD, beim Blockieren der Ang1*-vermittelten Phosphorylierung von Tie-2 wirksamer zu sein scheint, wie in 11 gezeigt und oben in (C) beschrieben.

Beispiel 5: Konstruktion des Ang-1-FD-Fc-FD-CHO-Zell-Expressionsvektors pRG763/Ang-1-FD-Fc-FD.

Der pRG763/Ang-1-FD-Fc-FD-CHO-Zell-Expressionsvektor wurde durch Isolieren aus dem Plasmid pCDNA3.1/Ang-1-FD-Fc-FD eines EcoRI-NotI-Fragments von 2115 Basenpaaren, das Ang-1-FD-Fc-FD enthielt, und Ligieren dieses Fragments in den mit EcoRI und NotI verdauten pRG763-Vektor konstruiert. Eine großmaßstäbliche (2 L) Kultur von E. coli-DH10B-Zellen, die das pRG763/Ang-1-FD-Fc-FD-Plasmid trugen, wurde über Nacht in TB + Ampicillin gezüchtet und die Plasmid-DNA unter Verwendung eines Promega Wizard Plus Maxiprep-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Die Konzentration der gereinigten Plasmid-DNA wurde in einem UV-Spektrophotometer und Fluorometer bestimmt. Die Plasmid-DNA wurde durch Verdau von Aliquoten mit NcoI und HincII-Restriktionsenzymen verifiziert. Alle Fragmente aus dem Restriktionsenzymverdau entsprachen den vorhergesagten Größen in einem 1% Agarosegel.

Beispiel 6: Expression von Ang-1-FD-Fc-FD in CHO-Zellen.

Vierzig 15-cm-Petrischalen wurden mit CHO-K1/E1A-Zellen bei einer Dichte von 4 × 106 Zellen/Schale besät. Das Plattenmedium war Gibco Ham's F-12 w/10% Hyclone Fetal Bovine Serum (FBS) + Penicillin/Streptomycin und ergänzt mit Glutamin. Am folgenden Tag wurde jede Schale mit 6 &mgr;g an pRG763/Ang-1-FD-Fc-FD unter Verwendung von Gibco Optimem und Gibco Lipofectamin in 12 ml-Volumen gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert. Vier Stunden nach Zugabe des Transfektionsgemischs zu den Zellen wurden 12 ml/Schale Optimem w/10% FBS zugesetzt. Die Platten wurden bei 37°C in einem 5% CO2-Inkubator über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Medium von jeder Schale entfernt und wurden 25 ml Expressionsmedium (Gibco CHO-S-SFM II w/Glutamin + 1 mM Natriumbutyrat) zugesetzt. Die Platten wurden bei 37°C für 3 Tage inkubiert. Nach 3-tägiger Inkubation wurde das Medium aus jeder Schale abgesaugt und bei 400 UpM in einem Schwingkorbrotor zum Pelettieren der Zellen zentrifugiert. Der Überstand wurde in sterile 1 L-Flaschen abgegossen und wie unten beschrieben gereinigt.

Beispiel 7: Konstruktion des Ang-2-FD-Fc-FD-CHO-Zell-Expressionsvektors pRG763/Ang-2-FD-Fc-FD.

Das Plasmid pRG763/Ang-2-FD-Fc-FD wurde durch Isolieren aus dem Plasmid pCDNA3.1/Ang-2-FD-Fc-FD eines EcoRI-NotI-Fragments von 2097 Basenpaaren, das Ang-2-FD-Fc-FD enthielt, und Ligieren dieses Fragments in den pRG763-Vektor, verdaut mit EcoRI und NotI, ligiert. Eine großmaßstäbliche (1 L) Kultur von E. coli DH10B-Zellen, die das pRG763/Ang-2-FD-Fc-FD-Plasmid trugen, wurde über Nacht in TB + Ampicillin gezüchtet, und die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines Promega Wizard Plus Maxiprep-Kits gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert. Die Konzentration der gereinigten Plasmid-DNA wurde in einem UV-Spektrophotometer und Fluorometer bestimmt. Die Plasmid-DNA wurde ebenso durch Verdau der Plasmid-DNA mit NcoI und Ppu10I-Restriktionsenzymen verifiziert. Alle Fragmente aus dem Restriktionsenzymverdau entsprachen den vorhergesagten Größen in einem 1% Agarosegel.

Beispiel 8: Expression von Ang-2-FD-Fc-FD in CHO-Zellen.

Vierzig 15-cm-Petrischalen wurden mit CHO-K1/E1A-Zellen bei einer Dichte von 4 × 106 Zellen/Schale besät. Das Plattenmedium war Gibco Ham's F-12 w/10% Hyclone Fetal Bovine Serum (FBS) + Penicillin/Streptomycin und ergänzt mit Glutamin. Am folgenden Tag wurde jede Schale mit 6 &mgr;g an pRG763/Ang-2-FD-Fc-FD unter Verwendung von Gibco Optimem und Gibco Lipofectamin in 12 ml-Volumen gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert. Vier Stunden nach Zugabe des Transfektionsgemischs zu den Zellen wurden 12 ml/Schale an Optimem w/10% FBS zugesetzt. Die Platten wurden bei 37°C in einem 5% CO2-Inkubator über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Medium von jeder Schale entfernt und wurden 25 ml Expressionsmedium (Gibco CHO-S-SFM II w/Glutamin + 1 mM Natriumbutyrat) zugesetzt. Die Platten wurden bei 37°C für 3 Tage inkubiert. Nach 3-tägiger Inkubation wurde das Medium aus jeder Schale abgesaugt und bei 400 UpM in einem Schwingkorbrotor zum Pelettieren der Zellen zentrifugiert. Der Überstand wurde in sterile 1 L-Flaschen abgegossen und wie unten beschrieben gereinigt.

Beispiel 9: Charakterisierung von stabilem CHO-Klon-abgeleitetem Ang-1-FD-Fc-FD-Protein.

Molekulargewichtsanalyse: Das vorhergesagte Molekulargewicht für stabiles CHO-Klon-abgeleitetes Ang-1-FD-Fc-FD-Protein wurde unter Verwendung des MacVector-Programms (Kodak, Scientific Imaging Systems, New Haven, CT) bestimmt. Die monomere Form (bezüglich des Fc) weist ein vorhergesagtes Gewicht von 76.349 auf. Außerdem liegen drei vorhergesagte N-verknüpfte Glykosylierungsstellen von etwa 2500 MG/Stelle vor, die das Molekulargewicht des monomeren Proteins potentiell auf 83.849 erhöhen könnten. Aufgrund der Interaktion zwischen den Fc-Komponenten der benachbarten Moleküle existiert das Protein tatsächlich als ein Dimer mit einem vorhergesagten Molekulargewicht, einschließlich einer möglichen N-verknüpften Glykosylierung, von 167.698. Anschließende SDS-PAGE-Analysen bestätigten diese angenäherten Molekulargewichte mit einer bei etwa 210 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen ablaufenden Bande und einer bei etwa 85 kD unter reduzierenden Bedingungen ablaufenden Bande. Eine Lichtstreuungsanalyse wurde zur weiteren Bestätigung des Molekulargewichts und bedeutsamererweise zur Bestimmung, ob das Protein eine homogene Spezies war oder nicht, vorgenommen. Die Lichtstreuung ist eine Funktion der Masse und Konzentration eines Makromoleküls. Zur Bestimmung des Molekulargewichts wurde die Proteinprobe auf eine Gelfiltrationssäule injiziert und der Ablauf mit einem On-line-Lichtstreuungs-Detektor und einem Refraktionsindex- und/oder einem UV-Detektor überwacht. Der Lichtstreuungs-Detektor ist ein MiniDawn-Laserlichtstreuungs-Detektor von Wyatt Technology Corporation (Santa Barabara, CA). Dieses Instrument misst das statische Licht in drei unterschiedlichen Winkeln. Der On-line-Refraktionsindex-Detektor oder UV-Detektor dient zur Messung der Proteinkonzentration. Astra 4.7 Software (Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA) wurde zur Berechnung der Proteinkonzentration auf der Basis entweder von dn/dc (dn = Veränderung des Refraktionsindex; dc = Konzentration) oder des Extinktionskoeffizienten des Proteins verwendet. Das Molekulargewicht des Proteins wird dann aus der Winkelabhängigkeit der Lichtstreuung errechnet. Die Ergebnisse dieser Analyse zeigen, dass das dimere Protein etwa 173,9 kD zu sein scheint, und das Vorhandensein eines einzelnen Peaks legt nahe, dass die Proteinlösung homogen ist.

Expressionsmenge von Ang-1-FD-Fc-FD in stabilen CHO-Klonen: COS-Zellüberstand, der rekombinantes Ang-1-FD-Fc-FD-Protein enthielt, wurde durch stabiles Transfizieren von CHO-Zellen mit dem oben beschriebenen Ang-1-FD-Fc-FD-DNA-Konstrukt erzeugt. Der CHO-Zellüberstand wurde mittels standardmäßigem ELISA unter Verwendung eines Anti-Human-IgG-Antikörpers als einem Einfang-Antikörper und eines Anti-Human-IgG-Antikörper in Konjugation an alkalische Phosphatase als einem Reporter-Antikörper zur Quantifizierung der im Überstand vorhandenen Menge an Ang-1-FD-Fc-FD-Protein analysiert. Diese Analyse ergab Expressionsmengen von 2–3 pg/Zelle/Tag.

Reinigung von Ang-1-FD-Fc-FD-Protein, abgeleitet von stabilen CHO-Klon-Überständen: Da das Ang-1-FD-Fc-FD-Protein eine Fc-Domäne enthält, ist die Reinigung unter Anwendung einer standardmäßigen Protein A-Säulenchromatographie (Pharmacia, Inc.), gefolgt von einer standardmäßigen Größenausschluss-Chromatographie (Pharmacia, Inc.) relativ einfach und unkompliziert. Der CHO-Zellüberstand wurde wie oben beschrieben gereinigt, und das gereinigte Ang-1-FD-Fc-FD-Protein wurde in den unten beschriebenen Studien zur weiteren Charakterisierung des Proteins verwendet.

N-terminale Sequenzierung von stabilem CHO-Klon-abgeleitetem Ang-1-FD-Fc-FD-Protein: Gereinigtes Ang-1-FD-Fc-FD-Protein wurde einer standardmäßigen N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen, um zu bestimmen, ob irgendeine verkürzte Spezies des Proteins erzeugt wurde. Die Analyse ergab lediglich eine N-terminate Sequenz, Arg-Asp-X-Ala-Asp, worin X Cys ist. Diese Sequenz ist bei Aminosäuren 16–20 der 3A zu finden und folgt der Signalsequenz des Proteins entsprechend den Aminosäuren 1–15 der 3A unmittelbar nach.

Beispiel 10: Charakterisierung des stabilen CHO-Klon-abgeleiteten Ang-2-FD-Fc-FD-Proteins.

Molekulargewichtsanalyse: Wie oben für stabile CHO-Klon-abgeleitetes Ang-1-FD-Fc-FD beschrieben, wurde das vorhergesagte Molekulargewicht für stabiles CHO-Klon-abgeleitetes Ang-2-FD-Fc-FD-Protein unter Anwendung des MacVector-Programms (Kodak, Scientific Imaging Systems, New Haven, CT) bestimmt. Die monomere Form des Ang-2-FD-Fc-FD weist ein vorhergesagtes Gewicht von 76.052 bei drei vorhergesagten N-verknüpften Glykosylierungsstellen auf, die potentiell das Molekulargewicht des monomeren Proteins auf 83.552 erhöhen könnten. Ebenso wie Ang-1-FD-Fc-FD liegt das Protein als ein Dimer mit einem vorhergesagten Molekulargewicht, einschließlich einer möglichen N-verknüpften Glykosylierung, von 167.104 vor. SDS-PAGE-Analysen bestätigten diese angenäherten Molekulargewichte mit einer bei etwa 200 kD unter nicht-reduzierenden Bedingungen ablaufenden Bande und einer bei etwa 85 kD unter reduzierenden Bedingungen ablaufenden Bande. Die Lichtstreuungsanalyse bestätigte das Molekulargewicht (176,6 kD) und zeigte auf, dass das stabile CHO-Klon-abgeleitete Ang-2-FD-Fc-FD-Protein, ebenso wie stabiles CHO-Klon-abgeleitetes Ang-1-FD-Fc-FD, als eine homogene Spezies vorliegt.

Expressionsmenge von Ang-2-FD-Fc-FD, abgeleitet von stabilen CHO-Klonen: CHO-Zellüberstand, der rekombinantes Ang-2-FD-Fc-FD-Protein enthielt, wurde durch stabiles Transfizieren von CHO-Zellen mit dem oben beschriebenen Ang-2-FD-Fc-FD-DNA-Konstrukt erzeugt. Der CHO-Zellüberstand wurde mittels standardmäßigem ELISA unter Verwendung eines Anti-Human-IgG-Antikörpers als einem Einfang-Antikörper und eines Anti-Human-IgG-Antikörpers in Konjugation an alkalische Phosphatase als einem Reporter-Antikörper zur Quantifizierung der im Überstand vorhandenen Menge an Ang-2-FD-Fc-FD-Protein analysiert. Diese Analyse ergab Expressionsmengen von etwa 1–2 pg/Zelle/Tag.

Reinigung von stabilem CHO-Klon-abgeleitetem Ang-2-FD-Fc-FD aus Zellüberständen: Ebenso wie Ang-1-FD-Fc-FD enthält auch Ang-2-FD-Fc-FD-Protein eine Fc-Domäne, so dass die Reinigung unter Anwendung einer standardmäßigen Protein A-Säulenchromatographie, gefolgt von einer standardmäßigen Größenausschluss-Chromatographie, relativ einfach und unkompliziert ist. Der CHO-Zellüberstand wurde wie oben für stabile CHO-Klon-abgeleitete Ang-1-FD-Fc-FD beschrieben gereinigt und wurde in den unten zur weiteren Charakterisierung dieses Proteins beschriebenen Studien verwendet.

N-terminate Sequenzierung von stabilem CHO-Klon-abgeleitetem Ang-2-FD-Fc-FD-Protein: Gereinigtes stabiles CHO-Klon-abgeleitetes Ang-2-FD-Fc-FD-Protein wurde einer standardmäßigen N-terminalen Sequenzanalyse unterzogen, um zu bestimmen, ob irgendeine verkürzte Spezies des Proteins erzeugt wurde. Die Analyse ergab lediglich eine N-terminate Sequenz, Asp-X-Ala-Glu-Val, worin X Cys ist. Diese Sequenz kann bei Aminosäuren 17–21 der 4A gefunden werden und folgt der Signalsequenz des Proteins entsprechend den Aminosäuren 1–15 der 4A unmittelbar nach.

Beispiel 11: Auswirkungen einer stabilen CHO-Klon-abgeleiteten Ang-1-FD-Fc-FD und Ang-2-FD-Fc-FD auf die Tie-2-Rezeptor-Phosphorylierung in EAhy926-Zellen.

Assaysystem: Alle der unten beschriebenen Experimente verwendeten die Zelllinie EAhy926 (Edgell, C. J., et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3734–3737) und standardmäßige Phosphorylierungs-Assays und Reagenzien, die den Fachleuten des Gebiets vertraut sind.

  • (A) Ang1*-vermittelte gg. stabile CHO-Klon-abgeleitete Ang-1-FD-Fc-FD-vermittelte Tie-2-Rezeptor-Phosphorylierung in EAhy926-Zellen: EAhy926-Zellen wurden mit 0,4 &mgr;g/mol Ang1* oder 0,2 &mgr;g/mol oder 0,4 &mgr;g/mol stabilem CHO-Klon-abgeleitetem Ang-1-FD-Fc-FD-Protein stimuliert. Ein standardmäßiger Phosphorylierungsassay zeigte auf, dass die stabile CHO-Klon-abgeleitete Ang-1-FD-Fc-FD in ihrer Fähigkeit äquivalent zu Ang1* war, die Phosophorylierung des Tie-2-Rezeptors in EAhy926-Zellen zu stimulieren (14).
  • (B) Fähigkeit von stabilem CHO-Klon-abgeleitetem Ang-2-FD-Fc-FD eine stabile CHO-Klon-abgeleitete Ang-1-FD-Fc-FD-vermittelte Tie-2-Rezeptor-Phosphorylierung in EAhy926-Zellen zu blockieren: EAhy926-Zellen wurden mit 0,2 &mgr;g/mol des Tie-2-Agonisten Ang-1-FD-Fc-FD und 2 &mgr;g/mol, 4 &mgr;g/mol, 8 &mgr;g/mol oder 16 &mgr;g/mol von stabilem CHO-Klon-abgeleitetem Ang-2-FD-Fc-FD behandelt. Wie in 15 gezeigt, ist Ang-2-FD-Fc-FD zum Blockieren der stabilen CHO-Klon-abgeleiteten Ang1-FD-Fc-FD-Stimulation des Tie-2-Rezeptors fähig, wenn es in mindestens 40-fachem molarem Überschuss gegenüber der stabilen CHO-Klon-abgeleiteten Ang-1-FD-Fc-FD vorhanden ist.

SEQUENZLISTE

Anspruch[de]
  1. Nukleinsäure, die für ein Fusionspolypeptid codiert, wobei das Fusionspolypeptid eine erste Untereinheit umfasst, die mindestens eine Kopie einer Fibrinogen-Domäne von Angiopoetin-1 oder Angiopoetin-2 umfasst, wobei die erste Untereinheit an das N-terminale Ende einer multimerisierenden Komponente fusioniert ist, welche multimerisierende Komponente an ihrem C-terminalen Ende an eine zweite Untereinheit fusioniert ist, die mindestens eine Kopie derselben Fibrinogen-Domäne des Angiopoetin-1 oder Angiopoetin-2 umfasst.
  2. Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei die multimerisierende Komponente eine von Immunglobulin abstammende Domäne umfasst.
  3. Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 2, wobei die von Immunglobulin abstammende Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Fc-Domäne von IgG, der Schwerkette von IgG und der Leichtkette von IgG.
  4. Fusionspolypeptid, das durch das Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 1 bis 3 codiert ist.
  5. Zusammensetzung, welche ein Multimer des Fusionspolypeptids nach Anspruch 4 umfasst.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei das Multimer ein Dimer ist.
  7. Vektor, welcher das Nukleinsäure-Molekül nach Ansprüchen 1 bis 3 umfasst.
  8. Expressionsvektor, welcher ein Nukleinsäure-Molekül nach Ansprüchen 1 bis 3 umfasst, wobei das Nukleinsäure-Molekül funktionsfähig an eine Expressions-Kontrollsequenz geknüpft ist.
  9. Wirts-Vektorsystem für die Erzeugung eines Fusionspolypeptids, welches den Expressionsvektor nach Anspruch 8 umfasst, in einer geeigneten Wirtszelle.
  10. Wirts-Vektorsystem nach Anspruch 9, wobei die geeignete Wirtszelle eine Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder Säugerzelle ist.
  11. Wirts-Vektorsystem nach Anspruch 10, wobei die geeignete Wirtszelle E. coli ist.
  12. Wirts-Vektorsystem nach Anspruch 10, wobei die geeignete Wirtszelle eine COS-Zelle ist.
  13. Wirts-Vektorsystem nach Anspruch 10, wobei die geeignete Wirtszelle eine CHO-Zelle ist.
  14. Verfahren zur Erzeugung eines Fusionspolypeptids, welches das Züchten von Zellen des Wirts-Vektorsystems nach Ansprüchen 9 bis 13 unter Bedingungen umfasst, welche die Erzeugung des Fusionspolypeptids und die Gewinnung des derart erzeugten Polypeptids erlauben.
  15. Nukleinsäure, die für ein Fusionspolypeptid codiert, wobei das Fusionspolypeptid mehr als eine Kopie einer Fibrinogen-Domäne von Angiopoetin-1 oder Angiopoetin-2 hintereinander gekoppelt umfasst, und wobei entweder die N-terminale oder die C-terminale Fibrinogen-Domäne außerdem an eine multimerisierende Komponente fusioniert ist.
  16. Nukleinsäure nach Anspruch 15, wobei die Fibrinogen-Domänen aneinander angrenzend fusioniert sind.
  17. Nukleinsäure nach Anspruch 15 oder 16, wobei die multimerisierende Komponente eine von Immunglobulin abstammende Domäne umfasst.
  18. Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 17, wobei die von Immunglobulin abstammende Domäne ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus der Fc-Domäne von IgG, der Schwerkette von IgG und der Leichtkette von IgG.
  19. Fusionspolypeptid, das durch das Nukleinsäure-Molekül nach Ansprüchen 15 bis 18 codiert ist.
  20. Zusammensetzung, welche ein Multimer des Fusionspolypeptids nach Anspruch 19 umfasst.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei das Multimer ein Dimer ist.
  22. Vektor, welcher das Nukleinsäure-Molekül nach Ansprüchen 15 bis 18 umfasst.
  23. Expressionsvektor, welcher ein Nukleinsäure-Molekül nach Ansprüchen 15 bis 18 umfasst, wobei das Nukleinsäure-Molekül funktionsfähig an eine Expressions-Kontrollsequenz geknüpft ist.
  24. Wirts-Vektorsystem für die Erzeugung eines Fusionspolypeptids, welches den Expressionsvektor nach Anspruch 23 umfasst, in einer geeigneten Wirtszelle.
  25. Wirts-Vektorsystem nach Anspruch 24, wobei die geeignete Wirtszelle eine Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder Säugerzelle ist.
  26. Wirts-Vektorsystem nach Anspruch 25, wobei die geeignete Wirtszelle E. coli ist.
  27. Wirts-Vektorsystem nach Anspruch 25, wobei die geeignete Wirtszelle eine COS-Zelle ist.
  28. Wirts-Vektorsystem nach Anspruch 25, wobei die geeignete Wirtszelle eine CHO-Zelle ist.
  29. Verfahren zur Erzeugung eines Fusionspolypeptids, welches das Züchten von Zellen des Wirts-Vektorsystems nach Ansprüchen 24 bis 28 unter Bedingungen umfasst, welche die Erzeugung des Fusionspolypeptids und die Gewinnung des derart erzeugten Polypeptids erlauben.
Es folgen 27 Blatt Zeichnungen






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