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Dokumentenidentifikation DE69924105T2 13.04.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001080723
Titel IGA PRODUKTIONSINHIBITOREN
Anmelder TAKARA BIO INC., Otsu, Shiga, JP
Erfinder TAKESAKO, Kazutoh, Otsu-shi, JP;
SAITO, Hideharu, Kusatsu-shi, Shiga 525-0025, JP;
KATO, Ikunoshin, Uji-shi, JP
Vertreter Dr. Volker Vossius, Corinna Vossius, Tilman Vossius, Dr. Martin Grund, Dr. Georg Schnappauf, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69924105
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 11.05.1999
EP-Aktenzeichen 999195258
WO-Anmeldetag 11.05.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/JP99/02414
WO-Veröffentlichungsnummer 0099059567
WO-Veröffentlichungsdatum 25.11.1999
EP-Offenlegungsdatum 07.03.2001
EP date of grant 09.03.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.04.2006
IPC-Hauptklasse A61K 31/16(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Suppression der IgA-Produktion, insbesondere die selektive Suppression der IgA-Produktion zur Vorbeugung und Behandlung von immunologischen Krankheiten, die durch eine Überproduktion von IgA-Antikörpern in einem Menschen und einem Tier hervorgerufen werden.

STAND DER TECHNIK

Immunglobuline, die einen Antikörper und ein damit strukturell und funktionell verwandtes Protein einschließen, werden basierend auf deren funktionellen Eigenschaften in fünf Klassen klassifiziert (IgA, IgD, IgE, IgM und IgG). Unter diesen werden IgAs in zwei Unterklassen aufgeteilt, nämlich Serum-IgA und sekretorisches IgA (IgA1 und IgA2). Die L-Ketten des IgA1 sind kovalent an H-Ketten gebunden. Die L-Ketten des IgA2 wiederum sind über S-S-Bindungen miteinander verbunden und sind nicht an H-Ketten gebunden. 90% des Serum-IgA ist IgA1, wohingegen 60% des sekretorischen IgA IgA2 ist.

Die Orte der IgA-Produktion befinden sich in submukosalen Plasmazellen, beispielsweise in einer Tunica Propria einer Schleimhautmembran eines Verdauungstraktes, in einer Speicheldrüse, in einer Brustdrüse und dergleichen. In einer Tunica Propria einer Schleimhautmembran eines Verdauungstraktes in einem Menschen ist die Anzahl der IgA-produzierenden Zellen viel größer als die der IgG-produzierenden Zellen, d.h. in einem Verhältnis von ungefähr 20:1 im Gegensatz zu einem Verhältnis von 1:3 (IgA:IgG) in einem Lymphknoten oder einer Milz. Das IgA in Schleimhautsekreten wird als ein Dimer hergestellt, das einen J-Ketten-Bestandteil besitzt, zusammen mit einem sekretorischen Stück (SC), das nur wenig in dem Serum-IgA vorhanden ist. Das sekretorische Stück wird an das dimere IgA-Molekül angeheftet, wenn es aus submukosalen Plasmazellen von einem Darm oder einem Atmungstrakt in die Schleimhautsekrete hervortritt.

Die Herstellung eines Antikörpers in einem Organismus wird durch die Stimulation mit einem bestimmten Antigen induziert. Zum Beispiel wurde bei einer oralen Verabreichung von einem Stamm eines Enterobakteriums, Bifidobacterium longum, berichtet, dass sie die Gesamt-IgA-Menge im Kot erhöht.

Eine Substanz, die in der Lage ist, Antikörper-produzierende Zellen nicht-spezifisch zu stimulieren, um mit einem Antigen in effektiverer Weise fertig zu werden, wird oft als ein Adjuvans bezeichnet. Zum Beispiel ist Choleratoxin, das ein kausales Toxin von Diarrhoe darstellt, die durch Vibrio cholerae verursacht wird, dafür bekannt, dass es auf einer Schleimhautmembran eines Dünndarms wirkt und die Ionenpermeabilität der Membran verändert. Die Veränderung verursacht eine Exkretion einer großen Menge von Elektrolyten und Wasser aus dem Dünndarm und löst die Diarrhoe-typischen Bedingungen aus. Die Choleratoxin-B-Untereinheit, die einen entgifteten Bestandteil darstellt, der erzeugt wird, indem der substantielle Teil des Toxins entfernt wird, ist dafür bekannt, dass sie in der Lage ist eine Immunantwort auszulösen, die eine IgA-Antikörperproduktion nach einer Penetration in eine Schleimhautmembran eines Dünndarmes fördert (bzw. ist in der Lage IgA zu induzieren) und kann daher als ein Adjuvans dienen.

IgG, das ungefähr 65% der Serum-Immunglobuline (Ig) in Menschen ausmacht, besteht aus Antikörpern gegen beinahe alle Antigene und spielt eine wichtige Rolle beim systemischen Immunitätsschutz. Auf der anderen Seite spielt IgA eine wichtige Rolle bei der lokalen Immunreaktion. Das sekretorische IgA in Schleimhautsekreten inhibiert die Bindung eines hochpathogenen Mikroorganismus oder eines Allergens an eine Schleimhautmembran. Daher verhindert IgA nicht nur eine Infektion sondern verhindert auch, dass ein Bestandteil in Nahrungsmittel, der als ein Allergen wirken kann, durch die Wand des Verdauungstraktes passieren kann, indem er daran bindet.

Beispielsweise hängt im Falle, in dem ein extrazelluläres Toxin von mikrobiellen Zellen sekretiert wird, die biologische Abwehr durch Antikörper von der direkten Wirkung der Antikörper ab, die an der Oberfläche des Mikroorganismus gebunden sind. Daher können Antikörper verschiedene Wirkungen ausüben, indem sie direkt an einen Mikroorganismus binden.

Jedoch ist IgA auch dafür bekannt, dass es pathologisch auf einen lebenden Körper wirkt. Zum Beispiel ist die IgA-Nephropathie eine immunologische Krankheit, die durch überschüssige Immunreaktionen von IgA als Antwort auf ein Antigen und durch Ablagerung von Immunkomplexen, die hauptsächlich IgA enthalten, auf den Glomerulus einer Niere verursacht wird. Es wird daher angenommen, dass das Einsetzen der Nephropathie durch langanhaltende hohe IgA-Antikörpertiter hervorgerufen wird. Der Titer von IgA-Antikörper im Blut von einem Patienten mit IgA-Nephropathie ist um einiges höher als der in einem gesunden und normalen Individuum. Jedoch wurde nicht gezeigt, ob das IgA, das bei der Bildung des Immunkomplexes beteiligt ist, dem Serumtyp von anderen Stellen als denen einer Schleimhautmembran (Milz, Knochenmark, peripheres Blut, etc.) oder dem sekretorischen Typ von einer Schleimhautmembran entspricht (Verdauungstrakt, Respirationsapparat, etc.).

Es wird angenommen, dass das kausale Agens der Immunreaktion ein antigener Stimulus ist, der hauptsächlich im oberen Luftweg und Verdauungstrakt vorkommt. Kandidaten-Antigene umfassen Nahrungsmittel (z.B. Gluten, Milch, Sojabohne), Bakterien (z.B. Haemophilus parainfluenzae), Viren (z.B. Cytomegalovirus, Adenovirus, Epstein-Barr-(EB)-Virus)[Tomino, Y., Bio. Clinica, 12(6): 375–379 (1997)]. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass ein Bestandteil von Haemophilus parainfluenzae (HP) und ein Anti-HP-Antikörper des IgA-Typs im Glomerulus und Serum in einem Patienten mit IgA-Nephropathie vorhanden ist [Suzuki, S., Nakatomi, Y., Sato, H. et al., Journal of Allergy Clinical Immunology, 96: 1152–1160 (1995)].

Obwohl Hypothesen bezüglich der Ursache der IgA-Nephropathie in deren Entwicklungsmechanismus wie oben beschrieben vorgeschlagen worden sind, sind viele von ihnen noch unklar. Es gibt gegenwärtig keine spezifische Therapie für die IgA-Nephropathie. Es kommt daher eine Diät-Therapie oder eine Pharmakotherapie zum Einsatz. Bei der Diät-Therapie wird eine Niedrigsalzdiät oder eine Niedrigproteindiät verwendet. Die Pharmakotherapie verwendet ein Antiblutplättchen zur Suppression der Blutkoagulation im Glomerulus, einen Angiotensin-konvergierenden Enzym-Inhibitor oder einen Kalzium-Antagonisten zur Suppression eines Anstieges des Blutdrucks oder ein Adrenocorticoid [Sakai, H., Bio. Clinica, 16: 372–274 (1997)].

Die Wirkungen von mehreren immunsuppressiven Mitteln werden gegenwärtig durch eine parenterale Verabreichung untersucht. Jedoch besteht das hohe Risiko einer Auslösung von schweren Nebenwirkungen, da viele von diesen die immunologischen Mechanismen, wie die IgG-Produktion und die zelluläre Immunität neben der Suppression der Überproduktion von IgA in systemischer Weise supprimieren.

Aus diesem Grund wurden solche immunsuppressiven Mittel für den klinischen Einsatz noch nicht im breiten Umfang verwendet.

Beispiele von immunsuppressiven Mitteln umfassen 15-Desoxyspergualin (hier als DSG bezeichnet) mit der Formel 1: Gu-(CH2)6-CONHCH(OH)CONH(CH2)4NH(CH2)3-NH2 worin Gu eine Guanidino-Gruppe darstellt. DSG wird klinisch als ein immunsuppressives Mittel in injizierbarer Form für eine Nierentransplantation verwendet.

Alternativ wurde eine Wirkung einer supprimierenden Antikörperproduktion durch eine parenterale Verabreichung von DSG in JP-A 8-40887, JP-A 5-238932, Okubo, M. et al., Nephron, 60: 336–341 (1992), Makino, M. et al., Immunopharmacology, 14: 107–114 (1987), Inoue, K. et al., Proceedings Japanese Society Nephrology 30th Annual Meeting, Seiten 191 (1987) berichtet. Die Suppression der Produktion von IgE-, IgG-, IgM-Antikörpern und dergleichen wurde darin bestätigt. US-Patent Nr. 4,847,299, EP 0673646 und der Datenbankeintrag WPI (XP-062242039) beschreiben im Allgemeinen eine orale Verabreichung von Desoxyspergualin.

AU 660504 offenbart die allgemeine Behandlung von Glomerulonephritis mit Desoxyspergualin.

Der Datenbankeintrag Medline Online XP 002242038 (Takao T. et al.) beschreibt die Verabreichung von Desoxyspergualin durch Injektion. Die Antwort auf diese Behandlung wurde als sehr schwach bezeichnet.

Okubo et al., Nephron 1991, Band 57, Seiten 99–105 und Okubo et al., Kidney International 1988, Seiten 467–473 offenbaren die subkutane Verabreichung von DSG. Jedoch wurde von DSG noch nicht berichtet, dass es selektiv IgA supprimiert.

Auf der anderen Seite wurde die Verwendung von DSG in einer oralen Zusammensetzung in dem japanischen Patent 2610621 und JP-A 8-40887 beschrieben. Jedoch wurde die selektive Suppression einer bestimmten Antikörperklasse nicht offenbart.

AUFGABE DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der Erfindung ist es ein nützliches und neues Mittel zur Vorbeugung und Behandlung von immunologischen Krankheiten bereitzustellen, die durch eine Überproduktion von IgA-Antikörpern in einem Menschen und einem Tier verursacht werden.

Die anderen Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der unten folgenden Beschreibung ersichtlich.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bestätigt, dass eine orale Verabreichung von DSG die Produktion von sekretorischem IgA und Serum-IgA in effektiver Weise supprimieren kann, indem ein experimentelles Tiermodell verwendet wird, das dazu gebracht wird IgA in Schleimhautgeweben durch eine von einem Antigen ausgelöste Stimulation zu produzieren. Überraschenderweise hat sich weiter bestätigt, dass starke systemische immunsuppressive Wirkungen, die nach einer parenteralen Verabreichung (z.B. intravenöse Verabreichung) von DSG beobachtet werden, wie signifikante Wirkungen der Suppression der IgG-Produktion bei dem selben Spiegel wie die Wirkungen der Suppression der IgA-Produktion nicht festgestellt werden. Zusätzlich haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass die orale Verabreichung von DSG an ein Tier, in dem die IgA-Produktion erhöht ist, unter den von DSG supprimierten Antikörpern vornehmlich IgA supprimiert.

Daher wird in der vorliegenden Erfindung DSG oder ein pharmakologisch annehmbares Salz davon, das für einen Patienten verwendet wird, der einen Bedarf an eine selektive Suppression der IgA-Antikörperproduktion hat, durch eine orale Verabreichung gegeben, was sicherer für den lebenden Körper ist als konventionelle Verfahren.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von DSG oder eines pharmakologisch annehmbaren Salzes davon für die Herstellung einer Zusammensetzung zur oralen Verabreichung an einen Menschen oder ein Tier zur selektiven Suppression der IgA-Produktion.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Immunantworten, insbesondere eine IgA-Antikörperproduktion als Antwort auf ein oral verabreichtes Antigen supprimiert, was eine kleine oder schwache systemische Immunsuppression und eine selektive Suppression der IgA-Produktion bewirkt. Daher ist die vorliegende Erfindung zur Vorbeugung und Behandlung einer IgA-assoziierten immunologischen Krankheit, d.h. einer IgA-Nephropathie, verwendbar.

Wie hier verwendet, bezeichnet „selektive Suppression" einer IgA-Produktion, dass eine IgA-Antikörperproduktion in signifikanter Weise supprimiert ist und dass eine IgG-Antikörperproduktion und/oder eine Spät-Typ-Hypersensitivität nicht signifikant supprimiert sind.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Der Wirkstoff, der in der Zusammensetzung zur oralen Verabreichung für eine selektive Suppression der IgA-Produktion gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ist, kann entweder DSG oder ein pharmakologisch annehmbares Salz von DSG sein. DSG bildet ein Salz mit einer Säure. Die Säure zur Bildung des Salzes kann eine anorganische oder eine organische Säure sein, solange sie pharmakologisch annehmbar ist. Bevorzugte anorganische Säuren umfassen zum Beispiel Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und Phosphorsäure. Bevorzugte organische Säuren umfassen zum Beispiel Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Glutarsäure, Zitronensäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Propansulfonsäure, Asparaginsäure und Glutaminsäure. Ein Verfahren zur Herstellung von DSG der Formel 1 ist in den Publikationen wie JP-B 61-23183 offenbart.

DSG oder ein pharmakologisch annehmbares Salz davon, das als ein Wirkstoff in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur oralen Verabreichung enthalten ist, kann entsprechend den oben beschriebenen bekannten Verfahren oder Modifikationen davon hergestellt werden.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung zur oralen Verabreichung wird entsprechend einem bekannten Verfahren formuliert, indem DSG oder ein pharmakologisch annehmbares Salz davon alleine oder als Gemisch mit einem Arzneistoffträger oder einem Träger verwendet wird. DSG kann als ein aktives Stereoisomer oder als eine Racemat-Verbindung vorliegen.

Es kann eine beliebige pharmakologisch annehmbare Substanz als ein Arzneistoffträger oder als Träger verwendet werden. Zum Beispiel wird Wasser, ein Alkohol, ein Tier- oder Pflanzenöl wie Sojabohnenöl, Erdnussöl, Sesamöl und Mineralöl oder synthetisches Öl als ein Flüssigkeitsträger verwendet. Ein Saccharid wie Laktose, Maltose und Saccharose, eine Aminosäure, ein Cellulosederivat wie Hydroxycellulose, ein organisches Salz wie Magnesiumstearat, Dextran, Dextransulfat, Chondroitinsulfat, Heparin, Gelatine und dergleichen werden als ein Festträger verwendet. Diese Festträger oder Flüssigkeitsträger können verwendet werden, um eine Formulierung zur oralen Verabreichung herzustellen, beispielsweise eine Tablette, eine Kapsel, ein Pulver, ein Granulat, eine Lösung, ein Trockensirup oder eine Mikrosphärenformulierung. Eine Formulierung in einer Einzel-Dosierungsform ist bevorzugt.

Zusätzlich können eine Säure oder ein Alkali oder eine geeignete Puffermenge zu der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zugegeben werden, um den pH-Wert einzustellen.

Es ist weiterhin wünschenswert, ein oberflächenaktives Mittel wie Natriumlaurat oder Glykocholsäure oder &bgr;-Cyclodextrin zu der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur oralen Verabreichung zuzugeben, um die orale Absorbierbarkeit von DSG oder einem pharmakologisch annehmbaren Salz davon, das als Wirkstoff enthalten ist, zu erhöhen. Es ist auch wünschenswert, eine Mikrosphärenformulierung unter Verwendung von bioabbaubaren Laktatpolymer, Laktatglykolatcopolymer oder dergleichen herzustellen und die Aufnahme aus einer Schleimhautmembran des Verdauungstraktes zu fördern und die Absorbierbarkeit zu erhöhen.

Obwohl die Menge von DSG oder eines pharmakologisch annehmbaren Salzes davon in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur oralen Verabreichung in Abhängigkeit von der Formulierung variiert, beträgt die Menge gewöhnlicher Weise 0,1 bis 100% pro Gewichtseinheit, vorzugsweise 1 bis 98% pro Gewichtseinheit. Im Allgemeinen enthält eine Tablette, eine Kapsel, ein Pulver oder ein Granulat 5 bis 100% pro Gewichtseinheit, vorzugsweise 25 bis 98% pro Gewichtseinheit des Wirkstoffes.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur selektiven Suppression der IgA-Produktion wird eine wirksame Menge von DSG oder eines pharmakologisch annehmbaren Salzes davon zur Suppression der IgA-Produktion oral an einen Menschen oder ein Tier, das einen Bedarf an einer solchen selektiven Suppression der IgA-Produktion hat, verabreicht.

Die Dosis wird in Abhängigkeit von dem Alter, dem Körpergewicht, den Krankheitsbedingungen, dem Therapiezweck oder dergleichen von einem Menschen oder einem Tier als Subjekt, beispielsweise einem Säugetier, einschließlich einem Haustier wie einem Hund oder einer Katze und einem Nutztier bestimmt. Die therapeutische Dosis zur oralen Verabreichung beträgt vorzugsweise 0,01 bis 5 mg/kg/Tag oder 3 bis 300 mg pro erwachsenem Mensch (bei einem Gewicht von 65 kg) pro Tag. Mehr bevorzugt wird die Dosis so bestimmt, dass die IgG-Produktion zumindest nicht in signifikanter Weise supprimiert ist. Daher ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung zur oralen Verabreichung dadurch charakterisiert, dass sie in signifikanter Weise die IgA-Produktion selbst mit einer Dosis supprimiert, die nicht in signifikanter Weise zumindest die IgG-Produktion supprimiert.

Bestimmte Labortiere wie Mäuse, die in einer speziellen Umgebung aufwachsen, sind nicht immunologisch sensibilisiert, um IgA herzustellen. Die Wirkung einer selektiven Suppression der IgA-Produktion der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur oralen Verabreichung kann bestätigt werden, indem ein experimentelles Modell verwendet wird, das entworfen wurde, um mukosales IgA und Serum-IgA durch eine orale Verabreichung von einem Antigen für eine immunologische Mukosa-Sensibilisierung herzustellen. Auf der anderen Seite ist ein Mensch oder ein Haustier bereits einer immunologischen Mukosa-Sensibilisierung aufgrund von oral aufgenommenen heterologen Antigenen, beispielsweise in Nahrungsmitteln, ausgesetzt worden und stellt IgA her. Daher besitzt die erfindungsgemäße Zusammensetzung zur oralen Verabreichung genauso eine Wirkung der selektiven Suppression der Herstellung von mukosalen IgA und Serum-IgA gegen ein oral aufgenommenes Antigen in einem Menschen oder einem Haustier, wie es bei dem experimentellen Modell der Fall ist.

Beispielhafte Krankheiten, die auf mukosales IgA und/oder Serum-IgA zurückzuführen sind, sind beispielsweise die IgA-Nephropathie. Die erfindungsgemäße orale Zusammensetzung ist zur Behandlung einer IgA-Nephropathie verwendbar.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung genauer, sollen jedoch nicht deren Umfang beschränken. Das in den Beispielen verwendete DSG ist eine Verbindung der Formel 1 wie oben beschrieben.

BEISPIEL 1 Wirkung der Suppression der sekretorischen IgA-Produktion als Antwort auf ein oral verabreichtes Antigen durch DSG

Eine Wirkung auf die Suppression der sekretorischen IgA-Produktion durch oral verabreichtes DSG wurde nachgewiesen, indem Titer von Anticholeratoxin-IgA-Antikörpern im Kot von Mäusen, denen das Choleratoxin oral verabreicht worden ist, gemessen wurden.

Als erstes wurde eine Choleratoxinlösung und eine DSG-Lösung hergestellt. Choleratoxin (Sigma) wurde in 0,2 M NaHCO3 bei einer Konzentration von 50 &mgr;g/ml gelöst, um die Choleratoxinlösung zu erhalten. DSG (Takara Shuzo, lyophylisiertes Original-Arzneimittel) wurde in Saline bei einer Konzentration von 5 mg/ml oder 1,25 mg/ml gelöst, um die DSG-Lösung zu erhalten.

Als nächstes wurden 0,2 ml der Choleratoxinlösung (am Tag 0 und Tag 7) an drei Gruppen von C57BL/6-Mäusen (sieben Wochen alt, weiblich, fünf Mäuse pro Gruppe) zweimal oral verabreicht. Hier in diesem Beispiel wird die Anzahl von Tagen von dem Tag 0 gerechnet, an dem das Choleratoxin zum ersten Mal verabreicht worden ist. 0,2 ml/Dosis der DSG-Lösung bei 5 mg/ml, die DSG-Lösung bei 1,25 mg/ml oder Saline wurden 5 mal (einmal pro Tag von Tag 7 bis zum Tag 11) an die drei Gruppen von Mäusen oral verabreicht. Die Dosen von DSG, die oral an die betreffenden Gruppen verabreicht wurden, betrugen 50 mg/kg, 12,5 mg/kg bzw. 0 mg/kg. Der Kot von den Mäusen der betreffenden Gruppen wurde am Tag 7 und Tag 14 gesammelt. Antikörper, die in 0,1 g des Kots vorlagen, wurden mit 1 ml Phosphat-gepufferter Saline (PBS) extrahiert. Der Extrakt wird im Folgenden als Kot-Antikörper-Extrakt bezeichnet. Der Kot am Tag 7 wurde vor der Verabreichung von DSG gesammelt.

Der Titer von IgA-Antikörpern in den Kot-Antikörper-Extrakten wurde durch ein ELISA-Verfahren gemessen. 50 &mgr;l jeder Choleratoxinlösung bei 10 &mgr;g/ml in 0,2 M NaHCO3 wurde zu Immuno Modules (Nunc) zugegeben und wurden bei 4°C für 16 Stunden stehen gelassen, um das Choleratoxin zu beschichten, um dadurch eine Festphase für das ELISA-Verfahren zu erhalten. Nachdem die Festphase mit einer BSA-Lösung, die 1% (w/v) Kälberserumalbumin (Sigma), gelöst in PBS, blockiert worden ist, wurden 50 &mgr;l von jedem der Kot-Antikörper-Extrakte dazu zugegeben und dann bei 37°C für eine Stunde reagieren gelassen. 50 &mgr;l von Meerrettichperoxidase (HRP)-markierten Kaninchen-Anti-Maus-IgA-Antikörper (Zymed) wurden zugegeben und bei 37°C für eine Stunde reagieren gelassen. 50 &mgr;l einer ABTS-Lösung, die 2,75 mg/ml Azino-bis-ethylbenzothizolin-Sulfonsäure (ABTS, ein Substrat für HRP, Nacalai Tesque) enthielt und in Citratphosphat-Puffer gelöst war, wurde dann dazu zugegeben, bei Raumtemperatur für 15 Minuten reagieren gelassen und es wurde dann die Absorption bei einer Wellenlänge von 405 nm (OD405) gemessen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. In Tabelle 1 bedeutet die erhöhte Menge der sekretorischen IgA-Antikörperproduktion der Unterschied zwischen der Menge der IgA-Produktion am Tag 7 und der Menge am Tag 14. Der Unterschied wird als Unterschied zwischen dem OD405-Wert mit dem Kot-Antikörper-Extrakt am Tag 7 und dem OD405-Wert mit dem Kot-Antikörper-Extrakt am Tag 14 ausgedrückt (Durchschnittswert ± Standardabweichung).

TABELLE 1

Wie aus den Ergebnissen der Tabelle 1 hervorgeht, ergab die orale Verabreichung von DSG bei 50 mg/kg und 12,5 mg/kg einen signifikanten Abfall bei der erhöhten Menge der sekretorischen IgA-Produktion als Antwort auf das oral verabreichte Antigen im Vergleich zu der Menge, wie sie bei der Gruppe, die kein DSG erhalten hat, zu beobachten war. Diese Ergebnisse bestätigen die Wirkung der Suppression der IgA-Produktion durch das oral verabreichte DSG.

BEISPIEL 2 Wirkung der selektiven Suppression der IgA-Produktion als Antwort auf ein oral verabreichtes Antigen durch DSG

Die Wirkung der Suppression der Antikörperproduktion durch oral verabreichtes DSG wurde festgestellt, indem sowohl der Titer von Anticholeratoxin-IgA-Antikörper im Kot gemessen wurde, als auch der Titer von Anticholeratoxin-IgA-Antikörper und Anticholeratoxin-IgG-Antikörper im Blut einer Maus, die Choleratoxin oral empfangen hatte.

Choleratoxin wurde an fünf Gruppen von C57BL/6-Mäusen (sieben Wochen alt, weiblich, fünf Mäuse pro Gruppe) wie im Beispiel 1 beschrieben oral verabreicht. 0,2 ml/Dosis von einer der drei DSG-Lösungen oder Saline wurde zehnmal (einmal pro Tag, von Tag 7 bis Tag 17, ohne Tag 13) an vier Gruppen von Mäusen zur Choleratoxin-Verabreichung oral verabreicht. Die Lösungen enthielten 5 mg/ml, 1,25 mg/ml oder 0,313 mg/ml DSG, das in Saline gelöst war. Die Dosen von DSG, die an die betreffenden Gruppen oral verabreicht wurden, betrugen 50 mg/kg, 12,5 mg/kg, 3,13 mg/kg bzw. 0 mg/kg. 0,2 ml/Dosis von einer DSG-Lösung wurde bei 0,313 mg/ml zehnmal (einmal pro Tag, von Tag 7 bis Tag 17, ohne Tag 13) an die verbleibende eine Gruppe von Mäusen zur Choleratoxin-Verabreichung intraperitoneal verabreicht. Die Dosis von intraperitoneal verabreichtem DSG betrug 3,13 mg/kg.

Der Kot von den Mäusen von den betreffenden Gruppen wurde am Tag 7 und Tag 18 gesammelt. Die Antikörper wurden mit 1 ml PBS von 0,1 g des Kots extrahiert. Der Extrakt wird hier als ein Kot-Antikörper-Extrakt bezeichnet. Der Kot am Tag 7 wurde vor der Verabreichung von DSG gesammelt.

Auf der anderen Seite wurde Blut partiell am Tag 7 vom Orbital-Venen-Plexus einer Maus von jeder Gruppe unter Etherbetäubung gesammelt und das gesamte Körperblut wurde am Tag 18 gesammelt. Die Seren wurden von dem so erhaltenen Blut abgetrennt und 50-fach verdünnt. Die Verdünnung wird hier als eine Blut-Antikörperprobe bezeichnet. Das Blut am Tag 7 wurde vor der Verabreichung von DSG gesammelt.

Der Titer der IgA-Antikörper gegen das Choleratoxin in dem Kot-Antikörper-Extrakt oder der Blut-Antikörperprobe wurde durch ein ELISA-Verfahren gemessen. Die Messung wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Die Blut-Antikörperprobe wurde auch verwendet, um die Menge der im Blut erzeugten IgG-Antikörpern gegen Choleratoxin zu bestimmen. Die Festphase, die für die Titration von Antikörpern durch das ELISA-Verfahren verwendet wurde, ist die selbe, wie sie für die Titration von IgA-Antikörpern durch das in Beispiel 1 beschriebene ELISA-Verfahren verwendet wurde.

Nachdem die Festphase mit einer BSA-Lösung, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, blockiert wurde, wurden 50 &mgr;l von den Antikörperproben dazu zugegeben und dann bei 37°C für eine Stunde reagieren gelassen. Es wurden 50 &mgr;l von HRP-markiertem Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Antikörper (Zymed) zugegeben und bei 37°C für eine Stunde reagieren gelassen. 50 &mgr;l einer 2,75/ml ABTS-Lösung wurde dann dazu zugegeben, bei Raumtemperatur für 15 Minuten reagieren gelassen und die Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 405 nm (OD405) gemessen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 zeigt eine Vielzahl der Unterschiede zwischen der Menge von Antikörpern, die am Tag 7 produziert wurden und der Menge am Tag 18. Der Unterschied wird als Unterschied zwischen dem OD405-Wert des Kot-Antikörper-Extrakts oder der Blut-Antikörperprobe am Tag 7 und dem OD405-Wert des Kot-Antikörper-Extrakts oder der Blut-Antikörperprobe am Tag 18 ausgedrückt (Durchschnittswert ± Standardabweichung).

TABELLE 2

In Tabelle 2 bezeichnen die hochgestellten Symbole rechts von der Zahl, *, ** und ***, signifikante Unterschiede von P < 0,05, P < 0,001 bzw. P < 0,0001. Darüber hinaus bezeichnet p.o. eine Gruppe, der DSG oral verabreicht wurde und i.p. bezeichnet eine Gruppe, der DSG intraperitoneal verabreicht wurde.

Die Wirkung der Suppression der Antikörperproduktion durch intraperitoneal verabreichtes DSG im Kot und Blut ist sehr stark. Die Produktion einer der Antikörper, sekretorisches IgA, Blut-IgA oder Blut-IgG war vollständig supprimiert, was die Erzeugung einer systemischen Immunsuppression nahe legt. Die orale Verabreichung supprimierte die Antikörperproduktion von sekretorischem IgA und Blut-IgA in einer Dosis-abhängigen Weise. Der niedrige Suppressionsgrad der Antikörperproduktion durch die orale Verabreichung im Vergleich zu dem bei der intraperitonealen Verabreichung und in der Abwesenheit der Suppression der IgG-Produktion im Blut legt nahe, dass die systemische Immunsuppression durch die Verabreichung nur gering war.

BEISPIEL 3 Suppression der Antikörperproduktion und Spät-Typ-Hypersensibilität als Antwort auf subkutan verabreichtes Antigen durch DSG

Im Gegensatz zu Beispiel 1 und 2 wurde die Wirkung von oral verabreichtem DSG auf die Antikörperproduktion als Antwort auf ein subkutan verabreichtes Antigen bestätigt. Kurz gesagt wurde, nachdem Ovalbumin an eine Maus subkutan verabreicht wurde, DSG oral verabreicht. Der Titer von Anti-Ovalbumin-IgA-Antikörpern im Kot der Maus als auch der Titer von Anti-Ovalbumin-IgA-Antikörpern und der Titer von Anti-Ovalbumin-IgG-Antikörpern wurden im Blut gemessen, um die Wirkung zu bestätigen. Zusätzlich wurde die Wirkung von DSG auf eine Spät-Typ-Hypersensitivität gegen Ovalbumin bestätigt.

(1) Suppression der Antikörperproduktion: Eine Ovalbumin-Suspension zur subkutanen Verabreichung wurde hergestellt, indem Ovalbumin (Sigma) mit vollständigen Freund-Adjuvans bei einer Konzentration von 200 &mgr;g/ml gemischt wurde. Eine DSG-Lösung wurde hergestellt, indem DSG in Saline bei einer Konzentration von 5 mg/ml, 1,25 mg/ml oder 0,313 mg/ml, wie in Beispiel 1 beschrieben, gelöst wurde.

0,1 ml der Ovalbumin-Suspension wurde dann zweimal (am Tag 0 und Tag 14) an drei Gruppen von C57BL-6-Mäusen (sieben Wochen alt, weiblich, fünf Mäuse pro Gruppe) subkutan verabreicht. Hier in diesem Beispiel wird die Anzahl von Tagen vom Tag 0, an dem Ovalbumin zum ersten Mal verabreicht worden ist, gezählt. 0,2 ml/Dosis der DSG-Lösung oder Saline wurde dann zehnmal (einmal pro Tag, von Tag 14 bis Tag 24, ohne Tag 20) an die drei Gruppen von Mäusen zur Ovalbumin-Verabreichung oral verabreicht. Die Dosen von DSG, die an die betreffenden Gruppen oral verabreicht wurden, betrugen 50 mg/kg, 12,5 mg/kg bzw. 0 mg/kg. 0,2 ml/Dosis einer DSG-Lösung wurde bei 0,313 mg/ml zehnmal (einmal pro Tag, von Tag 14 bis Tag 25, ohne Tag 20) an die verbleibende eine Gruppe von Mäusen zur Ovalbumin-Verabreichung intraperitoneal verabreicht. Die Dosis von intraperitoneal verabreichtem DSG betrug 3,13 mg/kg.

Der Kot wurde von den Mäusen von den betreffenden Gruppen am Tag 14 und Tag 25 gesammelt. Die Antikörper in 0,1 g des Kots wurden mit 1 ml PBS extrahiert. Der Extrakt wird hier als Kot-Antikörper-Extrakt bezeichnet. Der Kot am Tag 14 wurde vor der Verabreichung von DSG gesammelt.

Auf der anderen Seite wurde Blut partiell am Tag 14 vom Orbital-Venen-Plexus einer Maus von jeder Gruppe unter Etherbetäubung gesammelt und das gesamte Körperblut wurde am Tag 25 gesammelt. Die Seren wurden von dem so erhaltenen Blut abgetrennt und 50- oder 250-fach verdünnt. Die Verdünnung wird hier als eine Blut-Antikörperprobe bezeichnet. Das Blut am Tag 14 wurde vor der Verabreichung von DSG gesammelt.

Die Antikörper-Titer gegen Ovalbumin in dem Kot-Antikörper-Extrakt oder der Blut-Antikörperprobe wurde durch ein ELISA-Verfahren gemessen. Die Messung wurde, wie in Beispiel 2 für das ELISA-Verfahren beschrieben, durchgeführt, außer dass das verwendete Antigen für die Festphase von Choleratoxin zu Ovalbumin ausgetauscht wurde.

Die subkutane Verabreichung von Ovalbumin erhöhte nicht die Menge von IgA-Antikörper im Kot oder dem Blut. Auf der anderen Seite erhöhte die subkutane Verabreichung von Ovalbumin die Menge von IgG-Antikörper im Blut. Die Ergebnisse der Veränderung der Menge von IgG-Antikörper, der im Blut hergestellt wird, ist in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 zeigt den Unterschied zwischen der Menge einer Vielzahl von Antikörpern, die am Tag 14 hergestellt wurden und der Menge am Tag 25. Der Unterschied wird als Unterschied zwischen dem OD405-Wert mit der Blut-Antikörperprobe am Tag 14, die 250-fach verdünnt war, und dem OD405-Wert mit der Blut-Antikörperprobe am Tag 25, die 250-fach verdünnt war, ausgedrückt (Durchschnittswert ± Standardabweichung).

TABELLE 3

In Tabelle 3 bezeichnet p.o. eine Gruppe, der DSG oral verabreicht wurde, und i.p. bezeichnet eine Gruppe, der DSG intraperitoneal verabreicht wurde.

Die Verabreichung von DSG bei 50 mg/kg supprimierte die IgG-Antikörperproduktion im Blut in signifikanter Weise, wohingegen die Verabreichung von DSG bei 12,5 mg/kg diese nicht signifikant supprimierte. Auf der anderen Seite supprimierte die intraperitoneale Verabreichung von DSG bei 3,13 mg/kg die Antikörperproduktion im Blut stärker als die orale Verabreichung von DSG bei 50 mg/kg.

Die oben genannten Ergebnisse zeigen, dass die orale Verabreichung von DSG die Antikörperproduktion als Antwort auf ein oral aufgenommenes Antigen im Vergleich zu einer als Antwort auf ein parenteral aufgenommenes Antigen selektiv supprimiert.

(2) Suppression der Spät-Typ-Hypersensitivität: 25 &mgr;l einer wässrigen Lösung von Ovalbumin (400 &mgr;g/ml) wurde subkutan an einem Fußballen einer Maus in jeder der experimentellen Gruppen im Beispiel 3 (1) 24 Tage nach der Ovalbumin-Verabreichung subkutan verabreicht. Das Anschwellen des Fußballens wurde 24 Stunden nach der subkutanen Verabreichung von Ovalbumin gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4 Dosis von DSG (mg/kg) Anschwellen des Fußballens (× 10–2 mm) 0 88,6 ± 57,2 12,5 (p.o.) 83,2 ± 41,4 50 (p.o.) 62,0 ± 24,8 3,13 (i.p.) 22,8 ± 35,3

Es wurde kein Unterschied zwischen dem Anschwellen des Fußballens für eine Gruppe festgestellt, der DSG bei 50 mg/kg oral verabreicht wurde, im Vergleich zu einer Gruppe ohne einer Verabreichung. Auf der anderen Seite war das Anschwellen des Fußballens, das für eine Gruppe festgestellt wurde, der DSG bei 3,13 mg/kg intraperitoneal verabreicht wurde, verringert, im Vergleich zu dem Anschwellen bei einer Gruppe, der kein DSG verabreicht wurde. Es wurde daher nahegelegt, dass eine orale Verabreichung von DSG nicht die Spät-Typ-Hypersensitivität supprimiert und die systemische Immunsuppression aufgrund von DSG nicht verursacht.

BEISPIEL 4 Herstellung einer oralen Zusammensetzung zur Suppression der IgA-Antikörperproduktion Granulat

50 Gewichtsteile von DSG, 600 Gewichtsteile von Laktose, 330 Gewichtsteile von kristallisierter Cellulose und 20 Gewichtsteile von Hydroxypropylcellulose wurden gut vermischt, unter Verwendung eines Roll-Typ-Verdichters verdichtet (Roller CompactorTM), durch ein Sieb mit 16-Maschen bis 60-Maschen durchlaufen gelassen, um Granulate zu erhalten.

Tablette

30 Gewichtsteile von DSG, 120 Gewichtsteile von kristallisierter Laktose, 147 Gewichtsteile von kristallisierter Cellulose und 3 Gewichtsteile Magnesiumstearat wurden unter Verwendung eines V-Typ-Mischers vermischt und komprimiert, um Tabletten zu erhalten (300 mg/Tablette).

Wie oben beschrieben, supprimiert die erfindungsgemäße orale Zusammensetzung, die DSG oder ein pharmakologisch annehmbares Salz davon enthält, die Immunreaktion als Antwort auf ein oral aufgenommenes Antigen, insbesondere eine IgA-Antikörperproduktion, wobei eine geringe oder eine schwache systemische Immunsuppression beobachtet wird. Daher kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung die DSG oder ein pharmakologisch annehmbares Salz davon enthält, verwendet werden, um IgA-assoziierte immunologische Krankheiten, d.h. eine IgA-Nephropathie, zu behandeln und vorzubeugen.


Anspruch[de]
  1. Verwendung von 15-Desoxyspergualin oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Herstellung einer Zusammensetzung zur oralen Verabreichung an einen Menschen oder ein Tier zur Vorbeugung oder Behandlung von IgA-Nephropathie.
Es folgt kein Blatt Zeichnungen






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