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Dokumentenidentifikation DE102004051785A1 27.04.2006
Titel Proteinprofile mit Luft-MALDI
Anmelder Bruker Daltonik GmbH, 28359 Bremen, DE
Erfinder Franzen, Jochen, 28359 Bremen, DE
DE-Anmeldedatum 25.10.2004
DE-Aktenzeichen 102004051785
Offenlegungstag 27.04.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.04.2006
IPC-Hauptklasse G01N 27/62(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse G01N 33/68(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft die Aufnahme von Massenspektren von komplexen Proteingemischen, häufig Proteinprofile genannt, beispielsweise für die Suche nach Biomarkern, die Stresssituationen anzeigen, oder für die Identifizierung von Mikroben. Die Proteinprofile werden bisher unter Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption mit hoher Nachweisstärke in linearen Flugzeitmassenspektrometern aufgenommen, zeigen aber ein sehr schlechtes Massenauflösungsvermögen und eine sehr schlechte Reproduzierbarkeit der Massenwerte.
Die Erfindung stellt Verfahren bereit, die überraschend ähnliche Massenspektren ergeben, jedoch mit sehr viel höherer Massenauflösung und Massenrichtigkeit. Es wird die Ionisierung außerhalb des Vakuums an Umgebungsdruck vorgenommen, vorzugsweise durch Laserverdampfung und CI-Nachionisierung, und die Ionenanalyse findet in einem hoch auflösenden Massenspektrometer statt, zum Beispiel einem Reflektor-Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss.

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft die Aufnahme von Massenspektren von komplexen Proteingemischen, häufig Proteinprofile genannt, beispielsweise für die Suche nach Biomarkern, die Stresssituationen anzeigen, oder für die Identifizierung von Mikroben. Die Proteinprofile werden bisher unter Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption mit hoher Nachweisstärke in linearen Flugzeitmassenspektrometern aufgenommen, zeigen aber ein sehr schlechtes Massenauflösungsvermögen und eine sehr schlechte Reproduzierbarkeit der Massenwerte.

Die Erfindung stellt Verfahren bereit, die überraschend ähnliche Massenspektren ergeben, jedoch mit sehr viel höherer Massenauflösung und Massenrichtigkeit. Es wird die Ionisierung außerhalb des Vakuums an Umgebungsdruck vorgenommen, vorzugsweise durch Laserverdampfung und CI-Nachionisierung, und die Ionenanalyse findet in einem hoch auflösenden Massenspektrometer statt, zum Beispiel einem Reflektor-Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss.

Mikroben, insbesondere Bakterien, lassen sich nach einem jüngst gefundenen Verfahren sehr leicht und weitgehend automatisiert massenspektrometrisch identifizieren, indem zunächst von einer über Nacht auf einem Nährmedium gewachsenen Kolonie kleine Mikrobenmengen auf eine massenspektrometrischen Probenträgerplatte übertragen werden. Diese Mikrobenmenge wird dann mit einer Lösung einer fachüblichen Matrixsubstanz für eine Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) beträufelt, wobei diese Lösung in die mikrobiellen Zellen eindringt und diese während der Kristallisation des Matrixmaterials zerstört. Proteine und Peptide, möglicherweise auch andere Analytsubstanzen der Zelle, werden in die Matrixkristalle eingebaut. Die Matrixkristalle werden dann im Vakuum eines Flugzeitmassenspektrometers mit pulsförmigen Laserlichtblitzen beschossen, wobei Ionen der Analytsubstanzen entstehen, die dann im Flugzeitmassenspektrometer gemessen werden können. Das Massenspektrum ist das Profil der Messwerte dieser Peptidionen, Proteinionen und anderen Analytionen, das sehr charakteristisch für die betreffende Mikrobenart ist. Es können sogar Unterstämme von Mikroben auseinander gehalten werden, da die Ausstattung der Mikroben mit Proteinen, genetisch vorgegeben, sehr charakteristisch ist. Die Identifizierung scheint, soweit heute untersucht, sehr sicher zu sein. Sie kommt ohne eine individuelle Identifizierung der beteiligten Proteine aus.

In ähnlicher Weise werden auch Proteinprofile in der Suche nach so genannten „Biomarkern" aufgenommen. Biomarker sind Anzeiger für Stresssituationen von Lebewesen, seien es Krankheiten, chemisch-pharmakologischer Stress, Alterung, physikalischer Stress durch Hitze oder Stoß oder Stress durch andere Ursachen. Die Biomarker werden aus Massenspektren der Proteinprofilproben herausgelesen, die aus Körperflüssigkeiten oder Gewebehomogenisaten gewonnen wurden. Die Proben können alle Proteine oder auch extrahierte Untermengen der Proteine enthalten. Da die Proteinprofile selbst starke Schwankungen der Signalintensitäten zeigen, ist eine statistische Auswertung erforderlich. Dazu werden Massenspektren von Kohorten von „Normalproben" oder „gesunden Proben" anderen Kohorten von „Stressproben" oder „kranken Proben" gegenübergestellt. Die Biomarker erhält man dann durch statistische Auswertung der Ionensignale in den Massenspektren. Die Biomarker können einzelne Proteine sein, die statistisch signifikant über- oder unterexprimiert sind, es können aber auch charakteristische Muster einer größeren Anzahl von Proteinen sein.

Für diese Anwendungen werden heute aus Gründen besonders hohen Nachweisvermögens Massenspektren in linearen Flugzeitmassenspektrometern aufgenommen, obwohl die Massenauflösung und die Massenrichtigkeit der Spektren aus Flugzeitmassenspektrometern mit Reflektoren unvergleichlich besser ist. Im Reflektorbetrieb erscheinen aber nur etwa ein Zwanzigstel der Ionensignale, und das Nachweisvermögen ist um Zehnerpotenzen schlechter. Die mangelnde Qualität der Massenspektren in linear betriebenen Flugzeitmassenspektrometern beruht vor allem auf der Ionenbildung durch matrixunterstützte Laserdesorption im Vakuum, die Ionen sehr unterschiedlicher Anfangsgeschwindigkeiten, unterschiedlicher Gesamtenergien und unterschiedlicher Stabilität liefert, wobei ein lineares Flugzeitmassenspektrometer die Auswirkungen dieser Unterschiede nicht ausgleichen kann. Viele der gebildeten Ionen zerfallen auf dem Weg durch das Flugrohr des Massenspektrometers.

Im linearen Betrieb eines Flugzeitmassenspektrometers kann man aber nicht nur die stabilen Ionen nachweisen, sondern auch die Fragmentionen aus so genannten „metastabilen" Zerfällen der Ionen und sogar die Neutralteilchen, die unterwegs aus Ionenzerfällen entstanden sind. Alle diese Fragmentionen und Neutralteilchen, die aus einer Mutterionensorte entstanden sind, haben die gleiche Geschwindigkeit wie die Mutterionen und erreichen daher den Ionendetektor zur gleichen Zeit. In den oben beschriebenen Anwendungsgebieten hat man auf diese Weise ein zehn- bis hundertfaches Nachweisvermögen. Für diese Anwendungen erhöht man die Energie des desorbierenden und ionisierenden Lasers, wodurch die Ausbeute an Ionen steigt, aber auch ihre Instabilität. Dieses erhöhte Nachweisvermögen ist für viele Anwendungen so entscheidend, dass man viele der oben geschilderten Nachteile des linearen Betriebsmodus der Flugzeitmassenspektrometer in Kauf nimmt.

Die leistungsverschlechternden Einflüsse bei der Aufnahme von Massenspektren im linear betriebenen Flugzeitmassenspektrometer können zum Teil, beispielsweise durch eine verzögert einsetzende Beschleunigung, nicht aber alle gleichzeitig beseitigt werden. Die Vorgänge bei der Ionisierung der Analytsubstanzen in der laserinduzierten Verdampfungswolke sind nicht sehr reproduzierbar, sie hängen stark von strukturellen Inhomogenitäten der mikrokristallinen Probe nach ihrer Präparation ab. Die Inhomogenitäten erzwingen leicht verschiedene Einstellungen der Laserenergiedichte im Laserfokus auf der Probe, und diese wiederum führen zu verschiedenen mittleren Anfangsgeschwindigkeiten der Ionen in der sich explosionsartig ausdehnenden Verdampfungswolke. Durch die ungleichmäßige Dicke der Probe nach ihrer Präparation entstehen die Ionen außerdem auf verschieden hohen Anfangspotentialen, wodurch sie je nach Entstehungsort verschiedene Potentialdifferenzen durchlaufen und somit leicht verschiedene Energien aufnehmen. Diese Effekte wirken auf die Flugzeiten der Ionen ein und lassen sich nicht gleichzeitig korrigieren. Über die Veränderung der Flugzeiten der Ionen werden auch ihre Massenwerte verfälscht, da diese über die einmal bestimmte Kalibrierungskurve aus den Flugzeiten berechnet werden.

Die Aufnahme von Massenspektren mit Flugzeitmassenspektrometern erfordert im Allgemeinen die Aufnahme sehr vieler Einzelspektren, die üblicherweise Messpunkt für Messpunkt zu einem Summenspektrum aufaddiert werden. Die Ionen für jedes Einzelspektrum werden jeweils durch einen Laserschuss erzeugt. Dieses Vorgehen der Erzeugung von Summenspektren wird durch die geringe Messdynamik im Einzelspektrum erzwungen. Es werden dabei mindestens etwa 50, in einigen Fällen auch 1000 und mehr Einzelspektren aufgenommen; im Allgemeinen besteht ein Summenspektrum aus einigen Hundert Einzelspektren.

Die verschiedenartigen mittleren Anfangsgeschwindigkeiten und Gesamtenergien der Ionen in den Laserschüssen mit ihren Einflüssen auf die Flugzeit der Ionen führen dazu, dass eigentlich für jeden Laserschuss eine andere Umrechnung der Flugzeit der Ionen in Massenwerte vorgenommen werden müsste. Dabei könnte ein Umrechnungsalgorithmus immer gleicher Art, aber mit verschiedenen Parametersätzen verwendet werden. Da jedoch die Parameter für die Umrechnung der Einzelspektren nicht bekannt sind, kann man ein solches Verfahren nur dann anwenden, wenn in jedem Massenspektrum einige Referenzionenarten vorkommen, deren Massen genau bekannt sind.

Diese zeitaufwändige individuelle Umrechnung jedes Einzelspektrums wird in der Praxis außerordentlich selten angewandt. Stattdessen vertraut man darauf, dass die Flugzeitspektren zumindest einer Probenpräparation soweit übereinstimmen, dass sie sich Messpunkt für Messpunkt addieren lassen. Man nimmt dabei in Kauf, dass sich Massenauflösung und Signal-zu-Rausch-Verhältnis verschlechtern. Das Unterlassen dieser individuellen Umrechnung ist vielfach bedingt durch die Zeitersparnis, insbesondere auch durch die schlechte Qualität der Einzelspektren, weil zu wenige Ionen gemessen wurden; in vielen Fällen ist es aber auch grundsätzlich nicht möglich oder aus analytischen Gründen nicht angebracht, den Probenpräparationen Referenzsubstanzen für die individuelle Rekalibrierung der Einzelspektren hinzuzufügen.

Neben den geschilderten Nachteilen der Verfälschung der Massenwerte haben Massenspektren, die mit linearen Flugzeitmassenspektrometern aufgenommen wurden, stets auch schlechtere Massenauflösungsvermögen. Das hängt mit den Zerfällen der Ionen zusammen. Beim Zerfall eines Ions wird stets ein kleiner Überschuss an interner Energie frei, die den beiden Bruchstücken des Ions als kinetische Energie mitgegeben wird. Je nach der Richtung des Zerfalls in Bezug auf die Flugrichtung können die Teilchen leicht beschleunigt oder leicht verlangsamt werden. Dadurch tritt eine Verschmierung der Flugzeiten von Teilchen gleicher Mutterionenmasse auf, die zu einer Verringerung des Massenauflösungsvermögens führt. Diese Verringerung des Auflösungsvermögens hängt somit fest mit der Erhöhung des Nachweisvermögen zusammen und ist grundsätzlich nicht zu beseitigen. Die Massenauflösungen betragen etwa nur R = 400 bis R = 1000.

Die geschilderten Nachteile bringen es aber mit sich, dass man keine sauber vergleichbaren Massenspektren erhält. So ist es beispielsweise schwierig, eine gute Referenzspektrenbibliothek für die Identifizierung von Mikroben an Hand ihrer Proteinprofile zu erstellen. Spektren gleicher Mikroben aus verschiedenen Probenpräparationen stimmen nicht exakt überein, sondern zeigen scheinbar unterschiedliche Massenwerte für an sich gleiche Proteine. Es sind Abweichungen bis zu einem Prozent des Massenwertes beobachtet worden.

In den oben geschilderten Anwendungsgebieten werden Massenspektren bis in hohe Massenbereiche von beispielsweise 20 000 Dalton gemessen. Aus den genannten Gründen geringer Massenauflösung können in überwiegenden Teilen des Massenspektrums die Isotopengruppen, die aus Ionensignalen bestehen, die sich jeweils um ein Dalton unterscheiden, nicht mehr aufgelöst werden. Es werden daher nur die Einhüllenden der Isotopengruppen gemessen, ein Faktum, das die Massenbestimmung und eine entsprechende Kalibrierung erschwert. Hinzu kommt, dass insbesondere die Proteinprofilspektren sehr signalreich sind, mit vielen Ionensignalüberlappungen, was einen Mustervergleich sehr erschwert. Die Proteinprofilspektren enthalten durchaus die Ionensignale einiger Hundert verschiedener Proteine.

Flugzeitmassenspektrometer mit Reflektoren haben ein sehr viel besseres Massenauflösungsvermögen, vor allem auch deshalb, weil hier keine Fragmentionen zum Massenspektrum beitragen. Leider ist es dadurch so, dass die Proteinprofilspektren, gleich ob für die Suche nach Biomarkern oder für die Identifizierung von Mikroben, nicht mit Reflektorbetrieb aufgenommen werden können. Die Massenspektren im Reflektormodus besitzen nur noch etwa ein Zwanzigstel der Ionensignale, wenn auch mit weit verbesserter Massenauflösung, aber der Reichtum der Massenspektren aus dem Linearmodus und damit deren Identifizierungskraft ist verloren. Außerdem ist das Nachweisvermögen drastisch herabgesetzt, obwohl im Allgemeinen massenaufgelöste Massenspektren wegen des besseren Verhältnisses von Signal zu Rauschen ein höheres Nachweisvermögen zeigen.

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem die MALDI-Massenspektren komplexer Analytgemische aus dem Linearmodus von Flugzeitmassenspektrometern mit ihrem Reichtum an Ionensignalen mit wesentlich besserer Massenauflösung und Massenrichtigkeit reproduziert werden können.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung beruht auf der überraschenden Beobachtung, dass die Massenspektren von Proteinionen, die aus komplexen Proteingemischen unter Laserbeschuss an Atmosphärendruck hergestellt und in einem Reflektor-Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss gemessen werden, den ganzen Reichtum an Ionensignalen widerspiegeln, den man in Massenspektren dieser Proben bei herkömmlichem Verfahren im Linearmodus sieht. Das steht ganz im Gegensatz zu den eher ärmlichen Massenspektren, die man von diesen Proben im Reflektor-Flugzeitmassenspektrometer erhält, wenn man den Prozess der Ionisation durch matrixunterstützte Laserdesorption im Vakuum verwendet.

Eine Erklärung für diesen verblüffenden Unterschied kann eigentlich nur darin gesehen werden, dass die Ionen und Neutralmoleküle, die bei Atmosphärendruck aus der Probe gebildet oder freigesetzt werden, vom Umgebungsgas unmittelbar und sehr schnell gekühlt werden, wobei die Kühlung nicht nur die thermische Bewegung im aufgeheizten Plasma der Verdampfungswolke betrifft, sondern auch die inneren Energien der Ionen und Moleküle, die dadurch nicht mehr instabil sind und daher nicht mehr zerfallen.

Dabei ist es nicht unbedingt notwendig, die Desorption durch einen Laserschuss zu bewirken. Es sind auch andere Formen der Desorption bekannt, beispielsweise eine Desorption durch Schockwellen im Probenträger, oder auch Desorption durch Ultraschall. Obwohl die Ionen in diesen Desorptionsarten die Oberfläche mit hoher Geschwindigkeit verlassen, ist zu erwarten, dass auch hier eine schnelle Kühlung stattfindet. Auch eine Desorption durch den Beschuss mit geladenen Mikrotröpfchen („Clusterionisierung") ist bekannt geworden.

Der Desorptionsprozess kann dabei selbst ionisierend wirken, es kann aber auch eine nachfolgende Ionisierung durch chemische Ionisierung oder Photoionisierung erfolgen. Beide Ionisierungsarten sind für Ionenquellen an Atmosphärendruck bereits bekannt. Auch eine Ionisierung der desorbierten Moleküle durch eine Elektrosprüh-Wolke ist bekannt.

Die Erfindung stellt also für die Aufnahme der Massenspektren von komplexen Analytgemischen ein Messverfahren bereit, das eine Desorption fester Proben an Atmosphärendruck mit einer Spektrenaufnahme in einem hochauflösenden Massenspektrometer verbindet, beispielsweise in einem Reflektor-Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss (OTOF). Die Desorption sollte in einer Umgebung aus Schutzgas, vorzugsweise Reinststickstoff, vorgenommen werden.

Die Ionisierung an Atmosphärendruck muss dabei nicht, wie für MALDI im Vakuum üblich, durch die protonierende Wirkung einer mitverdampften Matrixsubstanz vorgenommen werden, sondern kann, wie in DE 196 08 963 C2 (J. Franzen und C. Köster, entsprechend US 5,663,561), auch durch chemische Ionisierung an Atmosphärendruck, durch Photoionisation oder durch andere Ionisierungsverfahren hergestellt werden. Die Reaktantgasionen für die chemische Ionisierung können in bekannter Weise durch Elektronen aus einer Corona-Entladung oder aus einem Betastrahler hergestellt werden, wobei dem Umgebungsgas eine kleine Menge an Reaktantgas zugegeben wird. Die Probenpräparation auf einem Probenträger braucht dabei nicht einmal eine Matrixsubstanz zu enthalten, wenn der Desorptionsvorgang nicht eine solche benötigt. Als Matrixsubstanz kann beispielsweise auch eine zersetzliche Substanz, etwa ein Sprengstoff, verwendet werden, die sich zu leichten Gasen zersetzt und keine verunreinigenden Matrixionen liefert, wie in DE 196 17 011 C2 (C. Köster und J. Franzen, entsprechend US 5,828,063 A). „Normales" MALDI an Atmosphärendruck mit Protonierung durch die Matrixsubtanz wird in den Patenten US 5,965,884 (V. V. Laiko und A. L. Burlingame) und EP 0 964 427 A2 (J. Bai et al.) wiedergegeben. Eine Desorption von Substanzmolekülen durch Schockwellen wird in DE 42 02 123 (J. Franzen, entsprechend US 5,373,156) beschrieben. Die Clusterionisierung durch Beschuss mit geladenen Mikrotröpfchen („Clustern") ist in DE 199 34 173 A1 (C. R. Gebhardt) veröffentlicht. Die Ionisierung der durch Lichtblitze desorbierten Analytmoleküle in einer Elektrosprühwolke ist in DE 10 2004 002 729.3 wiedergegeben.

Neben der Erzeugung hochaufgelöster und massenrichtiger Massenspektren haben die Ionisierung der Analytgemische an Atmosphärendruck und die Analyse in einem hochauflösenden Massenspektrometer beträchtliche weitere Vorteile: Erstens, Massenspektrometer mit externer Ionenerzeugung durch Elektrosprühen und hoher Massenauflösung sind fertig entwickelt als kommerziell vertriebene Systeme vorhanden, und zweitens, die Laserdesorption an Atmosphärendruck ist einfach, sie braucht keine Einschleusung der Probenträgerplatten ins Vakuum. Die Probenträgerplatten werden einfach auf eine Bewegungsvorrichtung aufgelegt, und die Analyse kann beginnen. Das ist besonders von Vorteil in medizinischen und mikrobiologischen Kreisen, die den Umgang mit Vakuumapparaturen nicht gewohnt sind.

Bevorzugte Ausführungsformen

Eine Ausführungsform der Erfindung besteht bereits darin, eine Ionisierung des Proteingemischs, oder allgemeiner: des Analytsubstanzgemischs, durch matrixunterstützte Laserdesorption nicht im Vakuum, sondern in einem Schutzgas, vorzugsweise Reinststickstoff, bei Atmosphärendruck vorzunehmen, und die Ionen, ähnlich wie das bei Elektrosprühionen getan wird, in einem Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss zu analysieren. Die Ionen werden dabei über eine Einlasskapillare zusammen mit umgebenden Schutzgas in das Vakuumsystem des Massenspektrometers eingesaugt, in einem differentiellen Pumpsystem mit geeigneten Mitteln wie Abstreifern oder Hochfrequenz-Ionentrichtern vom Gas getrennt und dem Massenanalysator zugeführt.

Die Ionisierung kann dabei wie im Vakuum durch eine Protonierung durch Matrixsubstanzionen erfolgen, die im Plasma der Laserverdampfungswolke entstehen. Diese Ionisierung an Atmosphärendruck hat allem Anschein nach eine höhere Ausbeute an Analytionen, weil die Analytmoleküle und die Matrixsubstanzionen durch das Schutzgas länger zusammensperrt sind als im Vakuum und so eine bessere Protonierungsausbeute zeigen. Andererseits geht durch die Einführung der Ionen ins Vakuum ein weit überwiegender Teil der Ionen verloren, so dass dieses Verfahren insgesamt eine geringere Nachweisstärke hat als die Erzeugung von MALDI-Ionen im Vakuum. Die Ausbeute an Analytionen im Vakuum beträgt etwa ein Zehntausendstel der verdampften Analytmoleküle, an Atmosphärendruck mag die Ausbeute etwa ein Tausendstel betragen.

Eine bevorzugte Ausführungsform besteht nun darin, die Ausbeute an Analytionen bei Atmosphärendruck durch eine Nachionisierung der noch nicht protonierten Analytmoleküle kräftig zu steigern. Da nur etwa ein Tausendstel der Analytmoleküle ionisiert wurden, besteht hier ein großes Potential zur Erhöhung des Nachweisvermögen. Die Nachionisierung kann durch Photoionisierung, etwa durch eine UV-Lampe, oder mit besonders hoher Ausbeute und daher vorzugsweise durch chemische Ionisierung erfolgen.

Die chemische Ionisierung kann dadurch bewirkt werden, dass durch eine Elektronenquelle sehr viele Elektronen erzeugt werden, die im Schutzgas viele Ionen des Schutzgases erzeugen. Dem Schutzgas, beispielsweise Stickstoff, werden geeignete Reaktantsubstanzen zugesetzt, beispielsweise je ein Prozent Wasser und Xylol. Die Schutzgasionen reagieren dann sofort mit den Wassermolekülen unter Bildung von OH3+, O2H5+ und höherer protonierter Wassercluster. Diese protonieren ebenfalls im Mikrosekundenmaßstab die Xylolmoleküle, die dann als Reaktantgasionen für die Protonierung der Analytmoleküle bereitstehen. Durch diese Reaktionskette wird erreicht, dass bei der Protonierung der Analytmoleküle praktisch keine Fragmentionen entstehen, diese Ionisierungsart wird daher als sehr „weich" bezeichnet. Durch sehr starke Elektronenquellen, beispielsweise Corona-Entladungen oder 63Ni-Betastrahler, entsteht ein hoher Überschuss an Xylolionen, der den überwiegenden Teil der Analytmoleküle ionisiert. Der 63Ni-Betastrahler kann als ringförmige Folie mit etwa einem Zentimeter Durchmesser bei zwei Millimeter Breite leicht um die Probe herum aufgespannt werden, so dass nach Verdampfung eines Teils der Probe die chemische Ionisierung sofort einsetzen kann.

Die Reaktantgasionen können aber auch bereits dem Schutzgas beigefügt sein, wenn dieses als Spülstrom der Probe zugeleitet wird, wie das im oben beschrieben Patent DE 196 08 963 C2 beschrieben wird.

Es lassen sich Elektronenstrahlen auch durch Photonenbeschuss von geeigneten Oberflächen genügend geringer Austrittsarbeit erzeugen. Die Oberfläche kann dabei kontinuierlich oder in Pulsen mit einer UV-Strahlung aus einer UV-Lampe oder einem UV-Laser beschossen werden. Ein Abzugspotential von einigen Kilovolt saugt die Elektronen und beschleunigt sie soweit, dass sie hohe Anzahlen an Schutzgasionen erzeugen können. Diese können die Kette der Reaktantionen aufbauen.

Werden die Analytmoleküle im Nachhinein ionisiert, so ist gar keine ionisierende Matrixsubstanz in der Probenpräparation notwendig. Die Wahl der Matrixsubstanz kann dabei allein durch die Aufgabe der Verdampfung der Probe mit einer Vereinzelung der Analytmoleküle bestimmt sein. Die Analytmoleküle müssen beim Verdampfungsvorgang voneinander getrennt sein, da sie sonst sofort Molekülcluster bilden, weil ihr geringer Dampfdruck es nicht anders erlaubt. Die Matrixsubstanz soll also in der Lage sein, die Analytmoleküle getrennt voneinander aufzunehmen, so dass sie beim Verdampfungsprozess nicht sofort aneinander geraten. Die Matrixsubstanz muss des Weiteren in der Lage sein, genügend Energie des eingeschossenen Lichtpulses zu absorbieren. Es wäre weiterhin von Vorteil, wenn die Matrixsubstanz nicht auch selbst viele Ionen im schwereren Massenbereich der Analytmoleküle bilden würde, wie dies herkömmliche Matrixsubstanzen durch die Bildung von Dimerionen, Trimerionen und höheren Clusterionen tun.

Eine besonders vorteilhafte Klasse von nicht ionisierenden Matrixsubstanzen ist die Klasse der Sprengstoffe, weil diese sich unter der Wirkung des Laserlichtblitzes in kleine Moleküle wie Wasser, Stickstoff und Kohlendioxid zersetzen. So ist beispielsweise Zellulosedinitrit (Dinitrozellulose) in der Lage, Proteinmoleküle fest zu adsorbieren, Energie aus UV-Lasern aufzunehmen, und die Proteinmoleküle in das umgebende Schutzgas zu blasen. Es explodiert dabei keineswegs die ganze Probe, sondern in jedem Laserschuss immer nur ein kleiner Teil unter der bestrahlten Fläche.

Wird kein Lichtpuls zur Desorption verwendet, so ist eine Matrixsubstanz prinzipiell gar nicht notwendig. Es können die Analytmoleküle auch direkt von einer geeigneten Oberfläche desorbiert werden. So können beispielsweise adsorbierte Analytmoleküle durch eine Schockwelle direkt von der Oberfläche abgeschüttelt werden. Sie sind dabei, abhängig von der Elektronenaustrittsarbeit der Oberfläche, zu mehr oder weniger großen Teilen bereits ionisiert. Sie haben beim Abschütteln sehr hohe Geschwindigkeiten, die aber sofort im Umgebungsgas abgebremst werden.

Eine weitere Ionisierungsart für die Analytmoleküle verwendet die Sprühwolke des Elektrosprühens. Wird das Elektrosprühen mit reinen Sprühflüssigkeiten ausgeführt, zum Beispiel mit einem Gemisch aus Methanol und Wasser, so kann die Sprühwolke zur Ionisierung verwendet werden. So können die Mikrotröpfchen direkt auf eine Adsorptionsschicht von Analytmolekülen aufgeschossen werden („Clusterionisierung", DE 199 34 173 A1); es können die Analytmoleküle aber auch, beispielsweise durch einen Lichtblitz, erst desorbiert und dann durch die Sprühwolke ionisiert werden (DE 10 2004 002 729.3). Die Ionisierung durch die Sprühwolke ist im Sinne der Erfindung jedoch weniger interessant, da hier ganz überwiegend mehrfach ionisierte Teilchen entstehen, die das Massenspektrum dem einer MALDI-Ionisierung im Vakuum unähnlich machen.

Die thermisch wie auch intern gekühlten Ionen aus Desorption und Ionisierung an Atmosphärendruck werden dann in an sich üblicher Weise zusammen mit Schutzgas durch eine Kapillare in die erste Pumpstufe eines hochauflösenden Massenspektrometers geleitet. Hier wird der größte Teil des eingeströmten Schutzgases entfernt, und die Ionen werden, entweder durch einen einfachen Abstreifer oder durch einen Hochfrequenz-Trichter („ion funnel") mit nur noch sehr wenig Schutzgas in die nächste Pumpstufe geleitet. Sie werden dann über bekannte Hochfrequenz-Ionenleitsysteme dem Massenanalysator zugeführt und dort als Massenspektrum gemessen.

Als hochauflösendes Massenspektrometer kann vorzugsweise ein Reflektor-Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss verwendet werden. Dieses Massenspektrometer zeigt eine hohe Massenauflösung in der Größenordnung von R = 10 000 bis 20 000, eine stabile Kalibrierung und daher eine hohe Massenrichtigkeit in der Größenordnung einiger weniger Millionstel (ppm) des Massenwers, und eine hohe Messdynamik, mit der neben sehr starken Ionensignalen auch sehr schwache Ionensignale noch zuverlässig gemessen werden können. Die Messdynamik hat einen Umfang von fünf bis sechs Zehnerpotenzen.

Auch ein Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer (auch Fourier-Transform-Massenspektrometer FTMS genannt) kann für diesen Zweck eingesetzt werden. Dieses Massenspektrometer hat eine extrem hohe Massengenauigkeit von unter einem Millionstel des Massenwerts, aber eine sehr viel kleinere Messdynamik.

Wie oben ausgeführt, hat die Erfindung die Aufgabe, die schlecht aufgelösten, massenunrichtigen, aber informationsreichen Proteinprofilspektren aus linear betriebenen Flugzeitmassenspektrometern durch ähnlich informationsreiche Massenspektren hoher Massenauflösung und hoher Massenrichtigkeit zu ersetzen. Das folgende Verfahren ist eine besonders vorteilhafte Ausführungsform zur Lösung dieser Aufgabe:

  • – Präparation von Proben des Proteingemisches mit Sprengstoff als Matrixsubstanz,
  • – Desorption der Proteingemischproben mit Lichtblitzen aus einem Pulslaser in Reinststickstoff an Atmosphärendruck,
  • – Nachionisierung der Proteinmoleküle durch chemische Ionisierung mit Elektronenerzeugung durch Corona-Entladung oder Betastrahler, wobei dem Reinststickstoff Reaktantgase zugegeben sind,
  • – Einführung der Ionen mit Stickstoff zusammen in ein Vakuumsystem, und
  • – Analyse der Ionen mit einem Reflektor-Flugzeitmassenspektrometer, das einen orthogonalen Ioneneinschuss aufweist.

Dieses besonders bevorzugte Verfahren kann aber vom einschlägigen Fachmann in Kenntnis der Erfindung in vielfältiger Weise abgeändert werden. Einige dieser Abänderungen sind bereits oben geschildert; es gibt aber durchaus weitere Verfahren, die auf der grundlegenden Basis der Desorption und Ionisation von Analytgemischen an Atmosphärendruck die gewünschten informationsreichen Massenspektren der Analytgemische erzeugen können.


Anspruch[de]
  1. Verfahren für die Aufnahme von Massenspektren komplexer Analytgemische, bestehend aus folgenden Schritten:

    (a) Präparation einer Probe des Analytgemisches auf einem Probenträger,

    (b) Desorption und Ionisierung von Analytmolekülen aus der Probe in einem Schutzgas bei Atmosphärendruck,

    (c) Einsaugen von Schutzgas mit darin enthaltenen Ionen in das Vakuumsystem eines hochauflösenden Massenspektrometers, und

    (d) Aufnahme des Massenspektrums des Ionengemisches.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Analytgemisch um ein Proteingemisch handelt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Schutzgas um Reinststickstoff handelt.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem hochauflösenden Massenspektrometer um ein Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Ioneneinschuss handelt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Desorption der Analytmoleküle durch einen Beschuss mit einem Lichtpuls bewirkt wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Präparation der Probe neben den Analytmolekülen eine Matrixsubstanz enthält, die sich beim Beschuss mit dem Lichtpuls in kleine Moleküle zersetzt.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Desorption der Analytmoleküle durch den Beschuss mit geladenen Mikrotröpfchen bewirkt wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Desorption der Analytmoleküle durch eine Schockwelle im Probenträger bewirkt wird.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionisierung der Analytmoleküle durch chemische Ionisierung an Atmosphärendruck bewirkt wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktantgasionen für die chemische Ionisierung durch Elektronen aus einer Corona-Entladung oder aus einem Betastrahler erzeugt werden.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionisierung der Analytmoleküle durch die Sprühwolke aus dem Elektrosprühen einer Flüssigkeit bewirkt wird.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionisierung der Analytmoleküle durch Photoionisation bewirkt wird.
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