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Dokumentenidentifikation DE69634699T2 04.05.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000868432
Titel METHODE ZUR REGULATION DER LIGNINZUSAMMENSETZUNG IN PFLANZEN
Anmelder Purdue Research Foundation, West Lafayette, Ind., US
Erfinder CHAPPLE, Clint, West Lafayette, US
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 69634699
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.12.1996
EP-Aktenzeichen 969444306
WO-Anmeldetag 19.12.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/US96/20094
WO-Veröffentlichungsnummer 0097023599
WO-Veröffentlichungsdatum 03.07.1997
EP-Offenlegungsdatum 07.10.1998
EP date of grant 04.05.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 04.05.2006
IPC-Hauptklasse C07K 14/415(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 9/02(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/82(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung wurde mit vom Energieministerium vergebener Regierungsunterstützung, Vertrag Nr. DE-FG02-94ER20138, gemacht. Die Regierung macht bestimmte Rechte an der Erfindung geltend.

GEBIET DER ERFINDUNG

Gegenstand der Erfindung ist das Gebiet der Molekularbiologie und der Regulation der Proteinsynthese durch die Einführung von Fremdgenen in Pflanzengenome. Das Verfahren betrifft spezifischer die Modifikation der Zusammensetzung von Pflanzenlignin in einer Pflanzenzelle durch die Einführung eines Fremdpflanzengens, das ein aktives Ferulat-5-Hydroxylase-Enzym (F5H-Enzym) kodiert. Pflanzentransformanten, die das F5H-Gen beherbergen, lassen erhöhte Konzentrationen von Syringyl-Monomerresten in ihrem Lignin erkennen, eine Eigenschaft, von der angenommen wird, dass sie das Polymer anfälliger für eine Delignifizierung macht.

HINTERGRUND

Lignin ist eines der wichtigsten Produkte des allgemeinen Phenylpropanoid-Pfades und ist eines in der Biosphäre am reichlichsten vorkommenden organischen Moleküle (Crawford, (1981) Lignin Biodegradation and Transformation, New York: John Wiley and Sons). In der Natur stellt die Lignifizierung Rigidität für Holz bereit und ist größtenteils für die strukturelle Integrität von trachealen Elementen der Pflanze verantwortlich. Lignin eignet sich aufgrund seiner physikalischen Merkmale und seiner Beständigkeit gegenüber biochemischem Abbau gut für diese Kapazitäten. Bedauerlicherweise weist diese gleiche Abbaubeständigkeit eine signifikante Auswirkung auf die Verwertung des Pflanzenmaterials aus Lignocellulose auf (Whetten et al., Forest Ecol. Management 43, 301, (1991)).

Die monomere Zusammensetzung von Lignin besitzt signifikante Effekte auf seinen chemischen Abbau während des industriellen Aufschlusses (Chiang et al., Tappi, 71, 173, (1988). Die Guaiacyl-Lignine (die sich von der Ferulasäure herleiten), die für Weichholz, wie zum Beispiel Kieferholz charakteristisch sind, erfordern im Wesentlichen mehr Alkali und längere Inkubationen während des Aufschlusses im Vergleich zu den Guaiacyl-Syringyl-Ligninen (die sich von Ferulasäure und Sinapinsäure herleiten), wie sie in Harthölzern, wie zum Beispiel Eiche, gefunden werden. Die Gründe für die Unterschiede zwischen diesen beiden Lignintypen wurden mittels Messung des Abbaus von Modellverbindungen, wie zum Beispiel Guaiacylglycerol-&bgr;-guaiacylether, Syringylglycerol-&bgr;-guaiacylether und Syringylglycerol-&bgr;-(4-methylsyringyl)ether (Kondo et al., Holzforschung, 41, 83, (1987)) unter Bedingungen, welche die nachahmen, die beim Aufschlussverfahren verwendet werden, untersucht. In diesen Experimenten wurden die Mono- und insbesondere Disyringyl-Verbindungen drei- bis fünfzehnmal schneller gespalten als ihre entsprechenden Diguaiacyl-Homologa. Diese Modellstudien stehen im Einklang mit Studien, welche den Aufschluss von Douglasien und Holz vom Amerikanischen Amberbaum vergleichen, in denen die wichtigsten Unterschiede in der Auffschlussrate bei über 150°C auftraten, wenn Arylglycerol-&bgr;-arylether-Verknüpfungen gespalten wurden (Chiang et al., Holzforschung, 44, 309, (1990)).

Bei einem anderen Faktor, der sich auf den chemischen Abbau der beiden Ligninformen auswirkt, kann es sich um die Kondensation von sich von Lignin herleitenden Guaiacyl- und Syringylresten zur Bildung von Diphenylmethan-Einheiten handeln. Die Anwesenheit von Syringylresten in Hartholz-Ligninen führt zur Bildung von Syringyl enthaltenden Diphenylmethan-Derivaten, die während des Aufschlusses löslich bleiben, während die während des Weichholzaufschlusses produzierten Diphenylmethan-Einheiten in Alkali unlöslich sind und folglich mit den Celluloseprodukten assoziiert bleiben (Chiang et al., Holzforschung, 44, 147, (1990); Chiang et al., Holzforschung, 44, 309, (1990)). Es besteht weiter die Annahme, dass die Reichhaltigkeit der 5-5'-Diaryl-Verknüpfungen, die zwischen Guaiacylresten auftreten können, zur chemischen Abbaubeständigkeit beiträgt. Diese Verknüpfung ist beständig gegen Alkalispaltung und wird aufgrund der Anwesenheit der 5-O-Methylgruppe in Syringylresten viel weniger häufiger in Lignin angetroffen, das reich an Syringylresten ist. Die Inkorporation von Syringylresten führt zu, was als „nicht kondensiertes Lignin" bekannt ist, ein Material, das signifikant leichter als kondensiertes Lignin aufzuschließen ist.

Auf ähnliche Weise stellen die Ligninzusammensetzung und der Gehalt von Lignin in Gräsern einen bedeutenden Faktor bei der Bestimmung der Verdaulichkeit von dem Vieh verfütterten Lignocellulosematerialien dar (Jung, H. G. und Deetz, D. A. (1993) Cell wall lignification and degradability in Forage Cell Wall Structure und Digestibility (H. G. Jung, D. R. Buxton, R. D. Hatfield und J. Ralph, Hrsg.), ASA/CSSA/SSSA Press, Madison, WI). Die Inkorporation des Lignin-Polymers in die Pflanzenzellwand verhindert den Zugang mikrobieller Enzyme zu Zellwandpolysacchariden, aus denen die Wand aufgebaut ist. Aufgrund dessen können diese Polysaccharide nicht abgebaut werden und ein großer Teil der in Tierfuttermitteln enthaltenen wertvollen Kohlenhydrate passieren unverdaut durch die Tiere. Folglich wird einer Zunahme der Trockensubstanz von Gräsern über die Wachstumssaison durch eine Verminderung der Verdaulichkeit entgegengewirkt, die hauptsächlich durch eine erhöhte Zellwandlignifizierung verursacht wird. Aus diesen Beispielen geht deutlich hervor, dass die Modifikation der Lignin-Monomer-Zusammensetzung ökonomisch vorteilhaft wäre.

Das Problem, dem begegnet werden muss, besteht deshalb darin, ein Verfahren zur Entwicklung von Pflanzen mit erhöhten Konzentrationen an Syringylresten in ihrem Lignin zu entwickeln, um seinen chemischen Abbau zu erleichtern. Die Modifikation des für die Herstellung von Lignin-Monomeren verantwortlichen Enzymwegs stellt eine mögliche Route zur Lösung dieses Problems dar.

Der Mechanismus/die Mechanismen, über welchen/welche Pflanzen die Lignin-Monomer-Zusammensetzung kontrollieren, gab Anlass zu viel Spekulation. Wie bereits früher erwähnt, synthetisieren Gymnospermien keine nennenswerten Syringylligninmengen. In Angiospermien ist die Syringylligninablagerung von der Entwicklung her geregelt: primäres Xylem enthält Guaiacyllignin, während das Lignin des sekundären Xylems und Sklerenchyms Guaiacyl-Syringyl-Lignin darstellt (Venverloo, Holzforschung 25, 18 (1971); Chapple et al., Plant Cell 4, 1413, (1992)). Es wurden keine Pflanzen gefunden, die lediglich Syringlyllignin enthalten. Es ist noch nicht klar, wie diese Spezifität kontrolliert wird; es sind jedoch mindestens fünf mögliche enzymatische Kontrollstellen vorhanden, nämlich Kaffeesäure/5-Hydroxyferulasäure-O-methyltransferase (OMT), F5H, (Hydroxy)cinnamoyl-CoA-Ligase (4CL), (Hydroxy)cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR) und (Hydroxy)cinnamoylalkohol-Dehydrogenase (CAD). So werden zum Beispiel die Substratspezifitäten von OMT (Shimada et al., Phytochemistry, 22, 2657, (1972); Shimada et al., Phytochemistry, 12, 2873, (1973); Gowri et al., Plant Physiol., 97, 7, (1991); Bugos et al., Plant Mol. Biol. 17, 1203, (1992)) und CAD (Sarni et al., Eur. J. Biochem., 139, 259. (1984); Goffner et al., Planta., 188, 48, (1992); O'Malley et al., Plant Physiol., 98, 1364, (1992)) mit den Unterschieden der Lignin-Monomer-Zusammensetzung, die in Gymnospermien und Angiospermien gesehen werden, korreliert, und es wurde vorgeschlagen, dass die Expression von 4CL-Isozymen (Grand et al., Physiol. Veg. 17, 433, (1979); Grand et al., Plattta., 158, 225, (1983) mit der in Angiospermien gesehenen Gewebespezifität der Lignin-Monomer-Zusammensetzung verwandt ist.

Obwohl es mindestens fünf mögliche Enzym-Targets gibt, die genutzt werden könnten, wurden kürzlich nur OMT und CAD in Versuchen untersucht, die Lignin-Monomer-Zusammensetzungen in transgenen Pflanzen zu manipulieren (Dwivedi et al., Plattt Mol. Biol. 26, 61, (1994); Halpin et al., Plant J. 6, 339, (1994); Ni et al., Trattsgett. Res. 3, 120 (1994); Atanassova et al., Plant J. 8, 465, (1995); Doorsselaere et al., Plattt J. 8, 855, (1995)). Die meisten dieser Studien haben sich auf die Sense- und Antisense-Suppression der OMT-Expression konzentriert. Dieser Ansatz hat zu verschiedenen Ergebnissen geführt, wahrscheinlich aufgrund des in den verschiedenen Studien erreichten OMT-Suppressionsgrades. Die dramatischsten Wirkungen wurden unter Verwendung homologer OMT-Konstrukte zur Suppression der OMT-Expression in Tabak (Atanassova et al., supra) und Pappeln (Doorsselaere et al., supra) gesehen. Anhand dieser beiden Studien wurde gefunden, dass aufgrund der transgenen Expression eine Verminderung des Gehalts an Syringyllignin und ein konkomittierendes Auftreten von 5-Hydroxyguaiacylresten vorhanden war. Aufgrund dieser Studien offenbaren Doorsselaere et al., (WO 9305160) ein Verfahren zur Regulation der Lignin-Biosynthese durch die genomische Inkorporation eines OMT-Gens in entweder der Sense- oder Antisense-Richtung. Im Gegensatz dazu weisen Dixon et al. (WO 9423044) eher die Reduktion des Lignin-Gehalts in Pflanzen, die mit einem OMT-Gen transformiert wurden, als eine Änderung der Lignin-Monomer-Zusammensetzung nach. Ähnliche Forschungsarbeiten haben sich auf die Suppression der CAD-Expression gerichtet. Die Umwandlung von Coniferaldehyd und Sinapinaldehyd in ihre entsprechenden Alkohole in transgenen Tabakpflanzen wurde mit der Inkorporation eines CAD-Gens von A. cordata in Antisense-Richtung modifiziert (Hibino et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 929, (1995)). Ähnliche Bemühungen richteten sich an die Antisense-Inhibition der CAD-Expression, die ein Lignin mit erhöhtem Aldehydgehalt, aber nur eine mäßige Änderung der Lignin-Monomer-Zusammensetzung herbeiführte (Halpin et al., supra). Diese Forschung hat zur Offenbarung von Verfahren zur Reduktion der CAD-Aktivität unter Verwendung von Sense- und Antisense-Expression eines klonierten CAD-Gens zur Bewirkung der Inhibition der endogenen CAD-Expression in Tabak [Boudet et al., (US 5,451,514) und Walter et al., (WO 9324638); Bridges et al., (CA 2005597)] geführt. Keine dieser Strategien erhöhte den Syringylgehalt von Lignin, eine Eigenschaft, die mit der verbesserten Verdaulichkeit und chemischen Abbaubarkeit von Lignocellulosematerial korreliert ist (Chiang et al., supra, Chiang und Funaoka, Holzforschung 44, 309 (1990); Jung et al., supra).

Obwohl F5H auch ein Schlüsselenzym bei der Biosynthese von Syringyl-Lignin-Monomeren darstellt, wurde es bisher nicht in Bemühungen zum technischen Manipulieren der Lignin-Qualität genutzt. Seit der Zeit seiner Entdeckung vor über 30 Jahren (Higuchi et al.; Can. J. Biochem. Physiol., 41, 613, (1963)) wurde tatsächlich nur ein Nachweis der F5H-Aktivität veröffentlicht (Grand, C., FEBS Lett. 169, 7, (1984)). Grand wies nach, dass F5H von der Pappel, wie anhand der klassischen Kriterien der Abhängigkeit von NADPH und der Licht-reversiblen Inhibition durch Kohlenmonoxid analysiert, eine Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenase (P450) war. Grand wies weiter nach, dass F5H mit dem endoplasmatischen Retikulum der Zelle in Zusammenhang steht. Die mangelnde Aufmerksamkeit, die F5H in den letzten Jahren geschenkt wurde, kann im Allgemeinen den Schwierigkeiten zugeschrieben werden, die mit der Handhabung der Membran-gebundenen Enzyme und spezifisch der Labilität von F5H in Verbindung stehen, wenn es mit den für die Solubilisierung notwendigen Detergenzien behandelt wird (Grand, supra). Die das F5H-Gen umgebende neueste Entdeckung wurde von Chapple et al. (supra) gemacht, der über eine Mutante von Arabidopsis thaliana L. Heynh, als fah1 bezeichnet, berichtete, die bei der Akkumulation von sich von Sinapinsäure herleitenden Metaboliten, einschließlich dem für Angiospermien typischen Guaiacyl-Synringyl-Lignin, defizient ist. Dieser als FAH1 bezeichnete Locus kodiert F5H. Das Klonieren des F5H kodierenden Gens würde die Gelegenheit zum Testen der Hypothese bereitstellen, dass F5H ein nützliches Target für die Manipulation der Lignin-Monomer-Zusammensetzung darstellt.

Trotz der spärlichen Informationen über F5H in der veröffentlichten Literatur war der Anmelder bei der Isolation, beim Klonieren und bei der Sequenzierung des F5H-Gens erfolgreich. Der Anmelder hat auch nachgewiesen, dass die stabile Integration des F5H-Gens in das Pflanzengenom, wo sich die Expression des F5H-Gens unter der Kontrolle eines Promotors mit Ausnahme des endogenen Promotors des Gens befindet, zu einer veränderten Regulation der Lignin-Biosynthese führt.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Nukleinsäurefragment, kodierend ein aktives Enzym F5H in einer Pflanze, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (1) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und (2) einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, umfassend Aminosäuresubstitutionen, -additionen und -deletionen, die nicht die Funktion des aktiven Enzyms F5H in einer Pflanze verändern.

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein isoliertes Nukleinsäurefragment, kodierend ein aktives Enzym F5H in einer Pflanze, wobei das Fragment aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus dem Nukleinsäurefragment von SEQ ID NO: 1, dem Nukleinsäurefragment von SEQ ID NO: 3 und einem Nukleinsäurefragment von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, umfassend Basenänderungen, die nicht die Funktion des kodierten Enzyms F5H in einer Pflanze verändern.

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein chimäres Gen, das veränderte Verhältnisse von Guaiacyl:Syringyl-Lignin-Monomer in einer transformierten Pflanze herbeiführt, wobei das Gen ein Nukleinsäurefragment umfasst, das ein aktives Enzym F5H in einer Pflanze kodiert, das funktionsfähig in entweder Sense- oder Antisense-Richtung mit geeigneten Regulatorsequenzen verknüpft ist. Bei den Nukleinsäurefragmenten handelt es sich um die vorstehend beschriebenen.

Auch bereitgestellt ist ein Verfahren zur Änderung der Aktivität von F5H in einer Pflanze mittels Transformation von Pflanzenzellen in einer ganzen Pflanze mit einem chimären Gen, das veränderte Verhältnisse von Guaiacyl:Syringyl-Lignin-Monomer in einer transformierten Pflanzenzelle, worin das Gen exprimiert wird, herbeiführt; Züchten der Pflanzen unter Bedingungen, die Samenentwicklung erlauben; und Screening der sich von diesen transformierten Samen herleitenden Pflanzen auf diejenigen, die ein aktives F5H-Gen oder Fragment davon exprimieren.

Es wird ein Verfahren zur Änderung der Aktivität des Enzyms F5H in einer Pflanze bereitgestellt durch: (i) Transformieren einer Zelle, eines Gewebes oder Organs aus einer geeigneten Wirtspflanze mit dem vorstehend beschriebenen chimären Gen, worin das chimäre Gen exprimiert wird; (ii) Auswählen von transformierten Zellen, Zellcallus, somatischen Embryos oder Samen, die das chimäre Gen enthalten; (iii) Regenerieren ganzer Pflanzen aus den transformierten Zellen, dem Zellcallus, den somatischen Embryos oder den in Schritt (ii) ausgewählten Samen; (iv) Auswählen von in Schritt (iii) regenerierten ganzen Pflanzen, die einen Phänotyp aufweisen, gekennzeichnet durch (1) eine Fähigkeit der ganzen Pflanze, Verbindungen zu akkumulieren, die sich von Sinapinsäure oder (2) einem veränderten Syringyl-Lignin-Monomergehalt im Vergleich zu einer nicht transformierten Wirtspflanze herleiten.

Es ist erfindungsgemäß ein zusätzliches Verfahren zur Veränderung der Zusammensetzung von Lignin in einer Pflanze mittels stabiler Inkorporation in das Genom der Wirtspflanze durch Transformation eines chimären Gens bereitgestellt, das veränderte Verhältnisse von Guaiacyl:Syringyl-Lignin-Monomer in einer transformierten Pflanze herbeiführt; Expression des inkorporierten Gens dergestalt, dass F5H exprimiert wird und worin die Verhältnisse von Guaiacyl:Syringyl-Lignin-Monomer im Vergleich zu den Verhältnissen der nicht transformierten Wirtspflanze verändert sind.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN EINES SEQUENZPROTOKOLLS

1 erläutert die Biosynthese von monomeren Lignin-Präkursoren über den allgemeinen Phenylpropanoid-Pfad;

2 stellt eine Erläuterung des pBIC20-F5H-Cosmids und des F5H-Überexpressionskonstrukts (pGA482-35S-F5H) dar, worin das F5H-Gen unter der Kontrolle des konstitutiven 35S-Promotors des Blumenkohl-Mosaikvirus exprimiert wird;

3 zeigt eine Analyse der sich von Sinapinsäure herleitenden sekundären Metaboliten im Wildtyp, die fah1-2-Mutante, und sich unabhängig herleitende transgene fah1-2-Pflanzen, welche die sich vom pBIC20-F5H-Cosmid herleitende T-DNA oder das pGA484-35S-F5H-Überexpressionskonstrukt tragen;

4 zeigt die Auswirkung der F5H-Überexpression durch Vergleich der Steady-state-Spiegel von F5H-mRNA im Wildtyp, die fah1-2-Mutante und sich unabhängig herleitende transgene fah1-2-Pflanzen, welche die sich vom 35S-F5H-Überexpressionskonstrukt herleitende T-DNA tragen;

5 zeigt eine GC-Analyse der Nitrobenzen-Oxidationsprodukte von Lignin, um die Auswirkung der F5H-Überexpression auf die Lignin-Monomer-Zusammensetzung im Wildtyp, die fah1-2-Mutante, und eine fah1-2-Mutante, die das sich von dem 35S-F5H-Überexpressionskonstrukt herleitende T-DNA trägt, zu erläutern;

6 erläutert eine Southern-Blot-Analyse, welche die Hybridisierung der F5H-cDNA mit der mit EcoRI aufgeschlossenen genomischen DNA vergleicht, die aus dem Wildtyp von Arabidopsis thaliana und einer Anzahl von fah1-Mutanten isoliert wurde;

7 stellt eine Northern-Blot-Analyse dar, welche die Hybridisierung der F5H-cDNA an RNA, die aus dem Wildtyp von Arabidopsis thaliana und einer Anzahl von fah1-Mutanten isoliert wurde, vergleicht;

8 zeigt die genomische Nukleotid- (SEQ ID NO:3) und Aminosäuresequenzen (SEQ ID NO:2) des F5H-Gens von Arabidopsis und das F5H-Enzym, das es kodiert.

Der/die Anmelder haben in Konformität mit 37 C. F. R. 1.821–1.825 und Anlagen A und B („Anforderungen für Anmeldungsoffenbarungen enthaltend Nukleotide und/oder Aminosäuresequenzen") und in Konformität mit „Regeln für die Standarddarstellung von Nukleotid- und Aminosäuresequenzen in Patentanmeldungen" und Annex I und II zur Entscheidung des Präsidenten des EPO, veröffentlicht in Supplement Nr. 2 zu OJ EPO, 12/1992, drei Sequenzprotokolle bereitgestellt.

Die Sequenz der F5H-cDNA von Arabidopsis thaliana ist in SEQ ID NO:1 angegeben, und die Sequenz des genomischen F5H-Klons von Arabidopsis thaliana ist in SEQ ID NO:3 angegeben. Die Sequenz des F5H-Proteins ist in SEQ ID NO:2 angegeben.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Gen, das F5H, ein Schlüsselenzym in der Lignin-Biosynthese, kodiert. Es ist erfindungsgemäß weiter ein Verfahren zur Veränderung der Ligninzusammensetzung in Pflanzen durch Transformation von Pflanzen mit dem F5H-Gen bereitstellt, worin das Gen exprimiert wird und eine erhöhte Umwandlung von Ferulasäure in Sinapinsäure veranlasst, wodurch der Syringylgehalt des Lignin-Polymers erhöht wird.

Die Wirkung in Pflanzen von Ligninzusammensetzungen, die einen höheren Syringyl-Monomergehalt enthalten, besteht darin, dass das Lignin für die chemische Delignifizierung empfänglicher ist. Dies ist von besonderem Nutzen in den Papier- und Zellstoffindustrien, wo beim Lignifizierungsverfahren sehr große Mengen an Energie und Zeit aufgewendet werden. Hölzerne Pflanzen, die mit einem aktiven F5H-Gen transformiert sind, würden im Vergleich zu üblichen Papiereinträgen einen signifikanten Vorteil beim Delignifizierungsverfahren darstellen. Auf ähnliche Weise bietet die Modifikation der Ligninzusammensetzung in Gräsern durch die Insertion und Expression eines heterologen F5H-Gens ein einzigartiges Verfahren zur Steigerung der Verdaulichkeit von Nutztierfutter. Die Maximierung der Verdaulichkeit von Gräsern auf diese Weise bietet ein großes Potenzial für ökonomische Vorteile für den landwirtschaftlichen Betrieb und die landwirtschaftlichen Industrien.

PFLANZEN, BEI DENEN DIE ERFINDUNG ANGEWENDET WERDEN KANN

Es wird erfindungsgemäß ein Gen und ein chimäres Genkonstrukt bereitgestellt, die zur Transformation von Pflanzengewebe zur Veränderung der Lignin-Monomer-Zusammensetzung nützlich sind. Erfindungsgemäß geeignete Pflanzen umfassen Pflanzen, denen Syringyllignin natürlich mangelt oder diejenigen, die Lignin mit einem hohen Verhältnis von Guaiacyl:Syringyl akkumulieren. Erfindungsgemäß geeignete Pflanzen umfassen auch Pflanzen, deren Lignin unter Verwendung von Antisense-Transformationskonstrukten, die den Syringylgehalt des Lignins der transgenen Pflanze reduzieren, wenn eine derartige Veränderung erwünscht wäre, modifiziert werden könnten.

Geeignete Pflanzen können folgende einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt: Alfalfa (Medicago sp.), Reis (Oryza sp.), Mais (Zea mays), Ölsamenraps (Brassica sp.), Futtergräser und auch Nutzbaumpflanzen, wie zum Beispiel Eukalyptus (Eucalyptus sp.), Kiefer (Pinus sp.), Fichte (Picea sp.) und Pappel (Populus sp.) ebenso wie Arabidopsis sp., und Tabak (Nicotiana sp.).

DEFINITIONEN

Wie hierin verwendet, können die folgenden Begriffe zur Interpretation der Ansprüche und der Beschreibung verwendet werden.

Unter dem Begriff „FAH1" versteht man den Locus oder den Chromosomenort, an dem das F5H-Gen kodiert ist. Unter dem Begriff „FAH1" versteht man das Wildtyp-Allel des Gens, kodierend das F5H-Gen. Unter dem Begriff „fah1" versteht man jedwede mutante Version dieses Gens, die zu einem veränderten Grad der Enzymaktivität, des Syringyllignin-Gehalts oder des Sinapatestergehalts führt, der mithilfe der Dünnschichtchromatographie, der Hochdruckflüssigkeitschromatographie oder mithilfe der Fluoreszenz in vivo gemessen werden kann.

Unter „Gen" versteht man ein Nukleinsäurefragment, das ein spezifisches Protein exprimiert, einschließlich Regulationssequenzen, die der Kodierungsregion vorangehen (5' nicht kodierend) und folgen (3' nicht kodierend). Unter „nativem" Gen versteht man das Gen wie es in der Natur mit seinen eigenen Regulationssequenzen, gefunden wird.

Unter einem „chimären Gen" versteht man ein Gen, das heterogene Regulations- und Kodierungssequenzen umfasst.

Unter einem „endogenen Gen" versteht man das native Gen, das in der Regel an seinem natürlichen Ort im Genom gefunden wird.

Unter „Fremdgen" oder „Transgen" versteht man ein Gen, das in der Regel nicht im Wirtsorganismus gefunden wird, sondern eines, das durch Gentransfer eingeführt wird.

Unter dem Begriff „Promotor" versteht man eine DNA-Sequenz in einem Gen, gewöhnlich oberstromig (5') zu seiner Kodierungssequenz, das die Expression der Kodierungssequenz durch Bereitstellung des Erkennungsortes für RNA-Polymerase und andere Faktoren, die zur ordnungsgemäßen Transkription erforderlich sind, kontrolliert. Ein Promotor kann auch DNA-Sequenzen enthalten, die an der Bindung der Proteinfaktoren, welche die Wirksamkeit der Transkriptionsinitüerung als Antwort auf physiologische oder entwicklungsmäßige Bedingungen kontrolliert, beteiligt sind.

Unter dem Begriff „funktionsfähig verknüpft" versteht man Nukleinsäuresequenzen an einem einzelnen Nukleinsäuremolekül, die dergestalt in Verbindung stehen, dass die Funktion der einen von der anderen beeinflusst wird.

Wie hierin verwendet, versteht man unter geeigneten „Regulationssequenzen" oberstromig (5') lokalisierte Nukleotidsequenzen, darin und/oder unterstromig (3') von einer Kodierungssequenz, welche die Transkription und/oder Expression der Kodierungssequenzen im Zusammenhang mit dem Protein-Biosyntheseapparat der Zelle kontrollieren. Diese Regulationssequenzen schließen Promotoren, Translations-Leader-Sequenzen, Transkriptionsterminierungssequenzen und Polyadenylierungssequenzen ein.

Unter dem Begriff „T-DNA" versteht man die DNA, die aus einem T-DNA-Plasmid, das von einem Stamm von Agrobacterium tumefaciens getragen wird, der zum Infizieren von Pflanzen zu Zwecken der Pflanzentransformation verwendet wird, in das Pflanzengenom transferiert wird.

Unter dem Begriff „T-DNA-Plasmid" versteht man ein Plasmid, das von Agrobacterium tumefaciens getragen wird, das einen Replikationsstartpunkt trägt, selektierbare Marker, wie zum Beispiel Antibiotika-Resistenz und DNA-Sequenzen, auf die als rechte und linke Border verwiesen wird, die zur Pflanzentransformation erforderlich sind. Die DNA-Sequenz, die während dieses Vorgangs transferiert wird, ist die, die zwischen den rechten und linken an einem T-DNA-Plasmid vorhandenen T-DNA-Bordersequenzen lokalisiert ist. Die DNA zwischen diesen Borders kann auf solche Weise manipuliert werden, dass jedwede gewünschte Sequenz in das Pflanzengenom insertiert werden kann.

Unter dem Begriff „Ferulat-5-hydroxylase" oder „F5H" versteht man ein Enzym im Phenylpropanoid-Biosynthesepfad der Pflanze, welches die Umwandlung von Ferulat in 5-Hydroxyferulat katalysiert und die Produktion von Sinapinsäure und ihren sich ergebenden Metaboliten, einschließlich Sinapoylmalat und Syringyllignin, erlaubt.

Unter den Begriffen „kodieren" und „kodieren für" versteht man den Vorgang, über den ein Gen, über die Mechanismen von Transkription und Translation, die Informationen an eine Zelle bereitstellt, von der eine Reihe von Aminosäuren in eine spezifische Aminosäuresequenz zur Herstellung eines aktiven Enzyms assembliert werden können. Es ist zur Kenntnis zu nehmen, dass der Vorgang des Kodierens einer spezifischen Aminosäuresequenz DNA-Sequenzen einschließt, die Basenänderungen beinhalten können, die zu keiner Änderung in der kodierten Aminosäure führen oder die Basenänderungen beinhalten, die eine oder mehr Aminosäure(n) ändern können, sich aber nicht auf die Funktionseigenschaften des durch die DNA-Sequenz kodierten Proteins auswirken. Es ist deshalb zur Kenntnis zu nehmen, dass die Erfindung mehr als die spezifischen erläuternden Sequenzen umfasst. Modifikationen an der Sequenz, wie zum Beispiel Deletionen, Insertionen oder Substitutionen in der Sequenz, welche stille Änderungen herbeiführen, die sich nicht weitgehend auf die Funktionseigenschaften des sich ergebenden Proteinmoleküls auswirken, werden auch in Betracht gezogen. Veränderungen in der Gensequenz, welche zum Beispiel die Degeneration des genetischen Kodes widerspiegeln oder die in der Produktion einer chemisch äquivalenten Aminosäure an einer gegebenen Stelle resultieren, werden in Betracht gezogen. Folglich kann ein Codon für die Aminosäure Alanin, eine hydrophobe Aminosäure, durch ein Codon substituiert werden, das einen anderen, weniger hydrophoben Rest, wie zum Beispiel Glycin, oder einen hydrophoberen Rest, wie zum Beispiel Valin, Leucin oder Isoleucin kodiert. Auf ähnliche Weise würde auch erwartet werden, dass Änderungen, welche zur Substitution eines negativ geladenen Restes für einen anderen, wie zum Beispiel Asparaginsäure für Glutaminsäure, oder einen positiv geladenen Rest für einen anderen, wie zum Beispiel Lysin für Arginin, ein biologisch äquivalentes Produkt herbeiführen. Es würde auch nicht erwartet werden, dass Nukleotid-Änderungen, die in einer Änderung der N-terminalen und C-terminalen Anteile des Protein-Moleküls resultieren, die Aktivität des Proteins verändern würden. In einigen Fällen könnte es tatsächlich wünschenswert sein, Mutanten von der Sequenz herzustellen, um die Änderungswirkung auf die biologische Aktivität des Proteins zu untersuchen. Jede der vorgeschlagenen Modifikationen wie auch die Bestimmung zur Beibehaltung der biologischen Aktivität in den kodierten Produkten liegt durchaus in der Fähigkeit des Durchschnittsfachmanns. Der Fachmann erkennt überdies, dass diese erfindungsgemäßen Sequenzen auch durch ihre Fähigkeit unter stringenten Bedingungen (2 × SSC, 0,1% SDS, 65°C) mit den hierin erläuterten Sequenzen zu hybridisieren, definiert sind.

Unter dem Begriff „Expression", wie hierin verwendet, versteht man die Produktion des durch ein Gen kodierten Proteinprodukts. Unter „Überexpression" versteht man die Produktion eines Genproduktes in transgenen Organismen, die Produktionsspiegel in normalen oder nicht transformierten Organismen überschreiten.

Unter „Transformation" versteht man den Transfer eines Fremdgens in das Genom eines Wirtsorganismus und seine genetisch stabile Vererbung. Beispiele von Pflanzentransformationsverfahren schließen Agrobacterium-vermittelte Transformation und teilchenbeschleunigte oder „Gen-Pistolen"-Transformationstechnologie, wie in US 5,204,253 beschrieben, ein.

Unter dem Begriff „Plasmid-Rescue" versteht man ein Verfahren zur Zirkularisierung einer durch ein Restriktionsenzym aufgeschlossenen genomischen Pflanzen-DNA, die T-DNA-Fragmente trägt, die einen bakteriellen Replikationsstartpunkt und Antibiotikaresistenz (kodiert durch das &bgr;-Lactamase-Gen von E. coli) dergestalt trägt, dass dieses zirkularisierte Fragment als ein Plasmid in einer Bakterienwirtszelle, wie zum Beispiel E. coli, propagiert werden kann.

Unter dem Begriff „Lignin-Monomer-Zusammensetzung" versteht man die relativen Verhältnisse von Guaiacyl-Monomer und Syringyl-Monomer, die in lignifiziertem Pflanzengewebe gefunden werden.

DER BIOSYNTHETISCHE PHENYLPROPANOID-PFAD

Der biosynthetische Lignin-Pfad ist gut untersucht und die wichtigsten Pfade sind in 1 erläutert. Die Lignin-Biosynthese wird durch die Umwandlung von Phenylalanin in Cinnamat mittels der Wirkung von Phenylalamin-Ammoniumlyase (PAL) initiiert. Das zweite Enzym des Pfades stellt Cinnamat-4-hydroxylase (C4H), eine Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenase (P450), dar, welche für die Umwandlung von Cinnamat in p-Coumarat verantwortlich ist. Die zweite Hydroxylierung des Pfades wird durch ein relativ schlecht charakterisiertes Enzym, p-Coumarat-3-hydroxylase (C3H), dessen Produkt Kaffeesäure ist, katalysiert. Kaffeesäure wird anschließend durch OMT zur Bildung von Ferulasäure, einem direkten Präkursor von Lignin, O-methyliert. Die letzte Hydroxylierungsreaktion des allgemeinen Phenylpropanoid-Pfades wird durch F5H katalysiert. Das durch F5H-produzierte 5-Hydroxyferulat wird dann durch OMT, das gleiche Enzym, das die O-Methylierung der Kaffeesäure durchführt, O-methyliert. Diese duale Spezifität von OMT wurde durch das Klonieren des OMT-Gens und der Expression des Proteins in E. coli bestätigt (Bugos et al., (1991) supra, Gowri et al., (1991) supra).

Die festgelegten Schritte der Lignin-Biosynthese werden durch 4CL, (Hydroxy)cinnamoyl-CoA-Reduktase (CCR) und CAD katalysiert, die letztendlich Coniferylalkohol aus Ferulasäure und Sinapoylalkohol aus Sinapinsäure bildet. Coniferylalkohl und Sinapoylalkohol werden durch extrazelluläre Oxidasen polymerisiert, um Guaiacyllignin bzw. Syringyllignin zu ergeben, obwohl Syringyllignin genauer als ein Copolymer von beiden Monomeren beschrieben ist.

Obwohl Ferulasäure, Sinapinsäure und in einigen Fällen p-Coumarinsäure der Lignin-Biosynthese zugeführt werden, stellen diese Verbindungen in einigen Pflanzen Präkursoren für andere sekundäre Metaboliten dar. Bei Arabidopsis dient die Sinapinsäure als ein Präkursor für die Lignin-Biosynthese, sie wird aber auch der Synthese von löslichen Estern der Sinapinsäure zugeführt. Auf diesem Pfad wird Sinapinsäure in Sinapoylglucose umgewandelt, die als ein Intermediärprodukt bei der Biosynthese von Sinapoylmalat dient (5). Sinapinsäure und ihre Ester sind fluoreszent und können als ein Marker von Pflanzen verwendet werden, denen diese Enzyme mangeln, die zur Herstellung von Sinapinsäure benötigt werden (Chapple et al., supra).

IDENTIFIKATION DES FAH1-LOCUS UND VON FAH1-ALLELEN

Eine Reihe von Mutanten von Arabidopsis, die kein Sinapoylmalat akkumulieren, wurden identifiziert und kollektiv als fah1-Mutanten bezeichnet. Die fluoreszente Natur von Sinapoylmalat erlaubt die leichte Identifizierung von Sinapinsäureestern mittels Dünnschichtchromatographie (DC) gefolgt von der Beobachtung unter Ultraviolett-Licht (UV-Licht). Die Fluoreszenz von Sinapoylmalat kann auch in vivo sichtbar gemacht werden, weil Sinapoylmalat in der adaxialen Blattepidermis akkumuliert wird. Der Wildtyp von Arabidopsis weist unter UV-Licht eine blassblaue Fluoreszenz auf, während fah1-Mutanten aufgrund des Mangels der blauen Fluoreszenz von Sinapoylmalat und der Fluoreszenz von Chlorophyll gegenüber Mesophyll dunkelrot aussehen (Chapple et al., supra).

Eine DC-basierende Mutantendurchsuchung von 4 200 Ethylmethansulfonat-mutagenisierten Arabidopsis-Pflanzen identifizierte eine Anzahl unabhängiger Mutantenlinien, die signifikant niedrigere Sinapoylmalat-Spiegel akkumulierten. Die Mutationen in diesen Linien wurden als fah1-1 durchweg bis fah1-5 identifiziert. Die visuelle UV-Fluoreszenz-Durchsuchung in vivo wurde zur Identifizierung von mehr Mutantenlinien, welche die fah1-Mutation tragen, verwendet. Zwei dieser Mutanten (fah1-6 und fah1-7) wurden aus EMS-mutagenisierten Populationen ausgewählt. Eine Mutantenlinie (fah1-8) wurde unter einer Mutantenpopulation ausgewählt, die durch schnelle Neutronenbombardierung herbeigeführt wurde (Nilan, R. A. Nucl. Sci. Abstr., 28 (3), 5940 (1973); Kozer et al., Genet. Pol., 26 (3), 367, (1985)). Eine endgültige Mutantenlinie, (fah1-9) wurde unter Verwendung des gleichen Verfahrens von einer mit T-DNA getaggten Pflanzenpopulation identifiziert. Vor der weiteren Analyse wurde jede Mutantenlinie mindestens zweimal in den Wildtyp rückgekreuzt, und es wurden homozygote Linien etabliert.

Zur Bestimmung, ob die neu isolierten Mutantenlinien am gleichen Locus, das heißt im F5H kodierenden Gen, defekt waren, wurden genetische Komplementierungsexperimente durchgeführt. In diesen Tests wurde jede Mutantenlinie in fah1-2 gekreuzt, von der bekannt ist, dass sie in F5H defekt ist. In jedem Fall wurde die neu isolierte Mutantenlinie als das weibliche Elternteil verwendet und wurde mit Pollen von einer homozygoten fah1-2-Mutanten befruchtet. Unter Verwendung von fah1-2 als das weibliche Elternteil und der neuen Mutantenlinie als der Pollenspender wurde auch eine reziproke Kreuzung durchgeführt. Die Samen von diesen Kreuzungen wurden mehrere Wochen später gesammelt und wurden zur sich anschließenden Analyse gepflanzt. Die Abkömmlinge wurden mittels DC, Hochdruckflüssigkeitschromatographie und mittels Beobachtung unter UV-Licht auf Sinapoylmalat-Produktion analysiert. Von diesen Kreuzungen waren alle untersuchten F1-Abkömmlinge Sinapoylmalat-defizient, was darauf hindeutete, dass alle identifizierten Mutationen allel waren.

Die fah1-9-Linie wurde in Anwesenheit der T-DNA-Insertion im F5H-Gen zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Die T-DNA-Insertion im FAH1-Locus erleichterte die Klonierung der flankierenden DNA von Arabidopsis, die dann zur Wiedergewinnung des F5H-Gens des Wildtyps aus cDNA und genomischen Bibliotheken verwendet werden konnte (Meyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93 6869 (1996)).

KLONIEREN DES FAH1-LOCUS

Ein DNA-Fragment aus dem FAH1-Locus wurde aus dem mit T-DNA getaggten fah1-9-Mutanten unter Verwendung des Plasmid-Rescue-Verfahrens isoliert (Meyer et al., supra). Das Plasmid-Rescue-Verfahren wird häufig eingesetzt und ist im Stand der Technik weithin bekannt und kann zur Isolation spezifischer Allele aus mit T-DNA transformierten Pflanzen verwendet werden (Behringer, et al., Plant Mol. Biol. Rep., 10, 190, (1992)). Der Vektor, der – um es kurz zu fassen – zur Herbeiführung der mit T-DNA getaggten Population von Arabidopsis verwendet wurde, trägt Sequenzen, die für die autonome Replikation von DNA in Bakterien erforderlich sind und Sequenzen, die Antibiotikaresistenz verleihen. Sobald diese DNA in das Pflanzengenom integriert ist, können Aufschlüsse von spezifischen Restriktionsendonukleasen eingesetzt werden, um Fragmente herbeizuführen, die zirkularisiert, ligiert und in E. coli transformiert werden können. Zirkularisierte DNA von der T-DNA bildet funktionelle Plasmide, die ihren Bakterienwirten Antibiotika-Resistenz dergestalt verleihen, dass sie durch Wachstum auf Selektivmedien identifiziert werden können. Diese Plasmide, die aus den Sequenzen, einschließlich der rechten und linken Border gebildet werden, tragen auch die Pflanzen-Genomsequenzen, die die T-DNA-Insertion flankieren, mit sich. Von einer der beiden T-DNA-Borders gebildeten Plasmide, die flankierende DNA-Sequenzen tragen, können durch Analyse der Produkte von den diagnostischen Restriktionsenzymaufschlüssen auf Agarosegelen identifiziert werden. Die Plasmide mit flankierenden Sequenzen können dann als einen Ausgangspunkt zum Klonieren von Pflanzensequenzen dienen, die die Homologie zur DNA am Punkt der T-DNA-Insertion teilen (Behringer, et al., supra).

Plasmid-Rescue wurde unter Verwendung von EcoRI-aufgeschlossener DNA, die aus homozygoten fah1-9-Pflanzen hergestellt wurde, durchgeführt. EcoRI-aufgeschlossene genomische DNA wurde ligiert und dann in kompetente DH5&agr; von E. coli elektroporiert. DNA aus geretteten Plasmiden wurde weiter mit sowohl EcoRI und SalI aufgeschlossen, und die Aufschlüsse wurden mittels Gelelektrophorese zur Identifizierung von Plasmiden, die flankierende DNA von Arabidopsis enthielten, analysiert. Ein SacII-EcoRI-Fragment von diesem geretteten Plasmid wurde zur Identifizierung eines F5H-Klons aus einer cDNA-Bibliothek von Arabidopsis verwendet (Newman, T. et al., Plant. Physiol. 106, 1241, (1994)).

DNA-SEQUENZIERUNG DER F5H-CDNA UND GENOMISCHEN KLONE

Die Sequenzanalyse der F5H-cDNA und genomischen Klone wurde an Plasmid-DNA manuell unter Verwendung eines United States Biochemical Sequenase Kit v. 2,0 an einem DuPont Genesis® 2000 Sequencer oder einem Applied Biosystems 373A DNA-Sequencer unter Verwendung von standardmäßigen Vektor-basierenden Sequenzier-Oligonukleotiden oder gegebenenfalls kundenspezifisch synthetisierten Oligonukleotiden durchgeführt. Die Sequenz F5H-cDNA von Arabidopsis thaliana ist in SEQ ID NO:1 angegeben, und die Sequenz des genomischen F5H-Clons von Arabidopsis thaliana ist in SEQ ID NO:3 angegeben.

Die F5H-cDNA enthält einen Open Reading Frame von 1560 bp, der ein Protein mit einem Molekulargewicht von 58 728 kodiert. Das putative ATG-Initiierungscodon ist von einem A bei –3 und einem G bei +4 flankiert, im Einklang mit den im Allgemeinen gefundenen Nukleotiden, die das Initiator-Methionin in Pflanzen-mRNAs flankieren (Lutcke et al., EMBO J. 6, 43, (1987)). Sofort nach dem erschlossenen Initiator-Methionin befindet sich eine aus 17 Aminosäuren bestehende Sequenz, die neun Hydroxyaminosäuren enthält (8). Die sich anschließende aus 15 Aminosäuren bestehende Sequenz ist reich an hydrophoben Aminosäuren; elf hydrophoben Resten, die aus Phenylalanin-, Isoleucin-, Leucin- und Valinresten bestehen. Dieser hydrophoben Strecke folgt unmittelbar eine putative Stoptransfersequenz von Arg-Arg-Arg-Arg. F5H teilt sich auch die signifikante Sequenzidentität mit anderen P450s. Am bemerkenswertesten ist die Strecke zwischen Pro-450 und Gly-460. Diese Region enthält acht Reste, die die Hämbindungsdomäne umfassen und unter den meisten P450s hoch konserviert sind, wobei eine Ausnahme die Allenoxid-Synthese von Linum usitatissimum bildet (Song et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 8519, (1993)). Die Pro-450- bis Gly-460-Region enthält Cys-458 in F5H, die anhand der Analogie höchst wahrscheinlich den Hämbindungsliganden in diesem Enzym darstellt.

TRANSFORMATION VON FAH1-2-ARABIDOPSIS UND WIEDERHERSTELLUNG DER SINAPOYLMALAT-AKKUMULATION

Die Identität des F5H-Gens wurde durch Komplementierung der fah1-2-Mutante mit einem genomischen Klon und einem Konstrukt bestätigt, wo die genomische F5H-Kodierungssequenz unter der Kontrolle des 35S-Promotors des Blumenkohl-Mosaikvirus exprimiert wurde. Kurzgefasst wurde die F5H-cDNA als eine Sonde zum Durchsuchen einer Transformations-kompetenten Bibliothek (Meyer et al., (1994) Science, 264, 1452–1455) für genomische Klone verwendet. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurde ein Cosmid-Klon (pBIC20-F5H) isoliert, der ein aus 17 kb bestehendes genomisches Insert trug, enthaltend die erschlossenen Start- und Stopcodons des F5H-Gens (2). Der Anteil dieses Cosmids, das den F5H Open Reading Frame trug, wurde aus dem Cosmid exzidiert und in einen Vektor subkloniert, in dem es funktionsfähig mit dem 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus (pGA482-35S-F5H) verknüpft wurde (2). Sowohl das Ausgangscosmid als auch dieses derivative Plasmidkonstrukt wurden in Agrobacterium tumefaciens elektroporiert und zum Transformieren von fah1-2-Mutanten verwendet. Der Erfolg der Transformationen wurde mittels der DC-Assays belegt, die eine Sinapoylmalat-Akkumulation in Blattgeweben der fah1-2-Transformanten nachwies, die das T-DNA aus dem pBIC20-F5H-Cosmid oder dem pGA482-35S-F5H-Plasmid trugen (3). Diese Daten zeigten deutlich an, dass das F5H kodierende Gen identifiziert wurde.

MODIFIKATION DER LIGNINZUSAMMENSETZUNG IN PFLANZEN, DIE MIT F5H UNTER DER KONTROLLE DES 35S-PROMOTORS DES BLUMENKOHL-MOSAIKVIRUS TRANSFORMIERT WURDEN

Für das fah1-2-Allel homozygote Arabidopsis-Pflanzen wurden mit Agrobacterium, welches das pGA482-35S-F5H-Plasmid trägt, transformiert, das das unter der Kontrolle des konstitutiven 35S-Promotors des Blumenkohl-Mosaikvirus chimäre F5H-Gen enthält (Odell, et al., Nature 313, 810–812, (1985)). Unabhängige homozygote Transformanten, die das F5H-Transgen an einem einzelnen genetischen Locus tragen, wurde durch Selektion auf Kanamycin enthaltendem Wachstumsmedium, die im Boden gezogen wurden, identifiziert, und das Pflanzengewebe wurde auf die Lignin-Monomer-Zusammensetzung analysiert. Die Nitrobenzen-Oxidationsanalyse des Lignins im Wildtyp, fah1-2, und Transformanten, die die T-DNA aus dem pG482-35S-F5H-Konstrukt tragen, zeigten an, dass die F5H-Überexpression, wie anhand der Northem-Blot-Analyse gemessen (4), zu einer signifikanten Zunahme des Syringylgehalts des transgenen Lignins führte (5). Das Lignin der Pflanzen mit F5H-Überexpression wiesen einen Syringylgehalt von so hoch wie 29 Mol-% im Gegensatz zu dem Syringylgehalt des Wildtyp-Lignins, der 18 Mol-% betrug, auf (Tabelle 1) (Beispiel 5). Diese Daten weisen eindeutig nach, dass die Überexpression des F5H-Gens für die Änderung der Ligninzusammensetzung in transgenen Pflanzen nützlich ist. TABELLE I AUSWIRKUNG DER 35S-PROMOTOR-GETRIEBENEN F5H-EXPRESSION AUF DIE LIGNIN-MONOMER-ZUSAMMENSETZUNG IN ARABIDOPSIS Linie Mol-% S Wildtyp 18,4 +/– 0,91 88 5,06 +– 0,17 172 13,7 +– 0,55 170 19,2 +– 0,56 122 19,9 +– 0,86 108 22,7 +– 0,82 107 25,3 +– 1,23 180 25,8 +– 0,78 117 28,8 +– 0,92 128 27,5 +– 1,80

Auf ähnliche Weise wurden die F5H-Transformanten von T1-Tabak (Nicotiana tabacum) herbeigeführt, gezogen und auf die Lignin-Monomer-Zusammensetzung analysiert. Die Nitrobenzen-Oxidationsanalyse wies nach, dass der Syringyl-Monomer-Gehalt der Blatt-Mittelrippen von 14 Mol-% im Wildtyp auf 40 Mol-% in der transgenen Linie, die sehr stark das F5H-Transgen exprimierte, gesteigert wurde (Tabelle 2). TABELLE 2 AUSWIRKUNG DER 35S-PROMOTOR-GETRIEBENEN F5H-EXPRESSION AUF DIE LIGNIN-MONOMER-ZUSAMMENSETZUNG IM XYLEM DER MITTELRIPPE DES TABAKBLATTES Linie Mol-% S Wildtyp 14,3 +/– 1,09 40 22,4 +/– 1,53 27 31,3 +/– 0,50 48 35,7 +– 6,06 33 40,0 +– 1,86

KONSTRUKTION CHIMÄRER GENE ZUR EXPRESSION VON F5H IN PFLANZEN

Die Expression von Fremdgenen in Pflanzen ist gut etabliert (De Blaere et al. (1987) Meth. Enzymol. 143: 277–291), und es ist erfindungsgemäß ein Verfahren zur Applikation dieser Technologie auf die Einführung eines chimären Gens zur Überexpression des F5H-Gens in Pflanzen zur Manipulation der Lignin-Monomer-Zusammensetzung bereitgestellt. Die Expression der F5H-mRNAs bei einem angemessenen Spiegel kann die Verwendung verschiedener chimärer Gene erforderlich machen, die sich verschiedene Promotoren zunutze machen. Eine bevorzugte Klasse heterologer Wirte zur Expression der Kodierungssequenz des F5H-Gens sind eukaryotische Wirte, insbesondere die Zellen höherer Pflanzen. Insbesondere bevorzugt unter den höheren Pflanzen und den sich von ihnen herleitenden Samen sind Alfalfa (Medicago sp.). Reis (Oryza sp.), Mais (Zea mays), Ölsamenraps (Brassica sp.), Futtergräser und auch Nutzbaumpflanzen, wie zum Beispiel Eukalyptus (Eucalyptus sp.), Kiefer (Pinus sp.), Fichte (Picea sp.) und Pappel (Populus sp.) wie auch Arabidopsis sp., und Tabak (Nicotiana sp.). Die Expression in Pflanzen verwendet in solchen Pflanzen funktionelle Regulationssequenzen.

Der Ausgangspunkt des zum Antrieb der Expression der Kodierungssequenz gewählten Promotors ist nicht kritisch, so lange er eine ausreichende transkriptionale Aktivität zum Erlangen der Erfindung durch Expression translatierbarer mRNA für das F5H-Gen im gewünschten Wirtsgewebe aufweist. Bevorzugte Promotoren targetieren wirksam die F5H-Expression auf die Gewebe, die der Lignifizierung unterzogen werden. Diese Promotoren können Promotoren von Genen, die Enzyme des Phenylpropanoid-Pfades kodieren, wie zum Beispiel den PAL-Promotor (Ohl et al., Plant Cell, 2, 837, (1990)) und den 4CL-Promotor (Hauffed et al., Plant Cell, 3, 435, (1991)) einschließen, sind aber nicht beschränkt darauf.

Abhängig von der Applikation kann es wünschenswert sein, Promotoren auszuwählen, die für die Expression in einem oder mehr Organen) der Pflanze spezifisch sind. Beispiele schließen die Licht-induzierbaren Promotoren der kleinen Subeinheit von Ribulose-1,5-bisphosphat-carboxylase ein, wenn die Expression in photosynthetischen Organen oder Promotoren, die spezifisch in Wurzeln aktiv sind, erwünscht ist.

EXPRESSION DER CHIMÄREN F5H-GENE IN PFLANZEN

Verschiedene Verfahren zum Einführen einer DNA-Sequenz (d. h. des Transformierens) in eukaryotische Zellen höherer Pflanzen stehen dem Fachmann zur Verfügung (siehe EPO-Veröffentlichungen 0 295 959 A2 und 0 138 341 A1). Solche Verfahren schließen die ein, die auf Transformationsvektoren basieren, die auf den Ti- und Ri-Plasmiden von Agrobacterium spp. basieren. Die Verwendung der binären Typen dieser Vektoren ist insbesondere bevorzugt. Ti-hergeleitete Vektoren transformieren viele verschiedene Varietäten höherer Pflanzen, einschließlich monokotyledoner und dikotyledoner Pflanzen, wie zum Beispiel die Sojabohne, Baumwolle, Tabak, Arabidopsis und Raps (Pacciotti et al., Bio/Technology 3, 241, (1985); Byrne et al., Plant Cell Tissue and Organ Culture 8, 3, (1987); Sukhapinda et al., Plant Mol. Biol. 8, 209, (1987); Lorz et al., Mol. Gen. Genet. 199, 178, (1985); Potrykus Mol. Gen. Genet. 199, 183, (1985)).

Zur Einführung in Pflanzen können die erfindungsgemäßen chimären Gene in binäre Vektoren, wie in Beispiel 5 beschrieben, insertiert werden.

Andere Transformationsverfahren stehen dem Fachmann zur Verfügung, wie zum Beispiel die direkte Aufnahme von Fremd-DNA-Konstrukten [siehe EPO-Veröffentlichung 0 295 959 A2], Verfahren zur Elektroporation [siehe Fromm et al. (1986) Nature (London) 319: 791] oder die ballistische Bombardierung bei hoher Geschwindigkeit mit Metallpartikeln, die mit den Nukleinsäure-Konstrukten beschichtet sind (siehe Kline et al., Nature (London) 327: 70 (1987) und siehe US-Patent Nr. 4,945,050). Sobald sie transformiert sind, können die Zellen vom Fachmann regeneriert werden.

Die folgenden Beispiele sind zur Erläuterung der wichtigsten erfindungsgemäßen Ausführungsformen beabsichtigt, sollten aber in keiner Weise als einschränkend ausgelegt werden.

BEISPIELE ALLGEMEINE VERFAHREN

Restriktionsenzymaufschlüsse, Phosphorylierungen, Ligationen und Transformationen wurden, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben, durchgeführt. Alle für das Wachstum und die Aufrechterhaltung von Bakterienzellen verwendeten Reagenzien und Materialien wurden, sofern nicht anderweitig angegeben, von Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI), DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) oder der Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) bezogen.

Die Bedeutung der Abkürzungen ist wie folgt: „h" bedeutet Stunde(n), „min" bedeutet Minute(n)", „sec" bedeutet Sekunde(n), „d" bedeutet Tag(e), „&mgr;l" bedeutet Mikroliter, „ml" bedeutet Milliliter, „1" bedeutet „Liter, „g" bedeutet Gramm, „mg" bedeutet Milligramm, „&mgr;g" bedeutet „Mikrogramm", „nm" bedeutet Nanometer, „m" bedeutet Meter, „E" bedeutet Einstein.

PFLANZENMATERIAL

Arabidopsis thaliana wurde unter einer Photoperiode von 16 h hell/8 h dunkel bei 100 mE m–2 s–1 bei 24°C gezogen, die in Metronix 2000 Pflanzenerdegemisch (Scotts, Marysville OH) kultiviert wurden. Die Mutantenlinien fah1-1 durchweg bis fah1-5 wurden mittels DC, wie nachstehend beschrieben, identifiziert. Unter Verwendung ihrer roten Fluoreszenz unter UV-Licht als ein Marker wurden die Mutantenlinien fah1-6, fah1-7 und fah1-8 aus Ethylmethansulfonat (fah1-6, fah1l-7) oder durch schnelle Neutronen (fah1-8) mutagenisierte Populationen von Landsberg erecta M2-Samen ausgewählt. Die mit T-DNA getaggte Linie 3590 (fah1-9) wurde auf ähnliche Weise in der mit T-DNA getaggten Population von DuPont identifiziert (Feldmann, K. A., Malmberg, R. L. und Dean, C. (1994) Mutagensis in Arabidopsis in Arabidopsis, (E. M. Meyerowitz und C. R. Somerville, Hrsg.) Cold Spring Harbor Press). Alle Linien wurden mindestens zweimal vor der experimentellen Verwendung zur Entfernung nicht verknüpfter Hintergrundmutationen zum Wildtyp rückgekreuzt.

SEKUNDÄRE METABOLIT-ANALYSE

Aus 100 mg Proben aus frischem Blattgewebe, das in 1 ml 50%igem Methanol suspendiert war, wurden Blattextrakte hergestellt. Die Proben wurden kurz gevortext, danach bei –70°C eingefroren. Die Proben wurden aufgetaut, gevortext und 5 min bei 12 000 xg zentrifugiert. Der Sinapoylmalat-Gehalt wurde nach der DC mit Silikagel, in einer mobilen Phase aus n-Butanol/Ethanol/Wasser (4:1:1) qualitativ bestimmt. Die Sinapinsäure und ihre Ester wurden unter langwelligem UV-Licht (365 nm) mittels ihrer charakteristischen Fluoreszenz sichtbar gemacht.

SOUTHERN-ANALYSE

Für die Southern-Analyse wurde DNA aus Blattmaterial extrahiert (Rogers, et al., (1985) Plant. Mol. Biol. 5, 69), mit Restriktionsendonukleasen aufgeschlossen und gemäß Standardprotokollen auf eine Hybond N+-Membran transferiert (Amersham, Cleveland, Ohio). cDNA-Sonden wurden mit 32P radioaktiv markiert und in Dehnhardt's Hybrydisierungspuffer (900 mM Natriumchlorid, 6 mM Dinatrium-EDTA, 60 mM Natriumphosphat pH 7,4, 0,5% SDS, 0,01% denaturierter Heringspermien-DNA und 0,1% von jeweils Polyvinylpyrrolidon, bovinem Serumalbumin und Ficoll 400) enthaltend 50% Formamid bei 42°C, an die Target-Membran hybridisiert. Zur Entfernung ungebundener Sonde wurden die Membranen zweimal bei Raumtemperatur und zweimal bei 65°C in 2 × SSPE (300 mM Natriumchlorid, 2 mM Dinatrium-EDTA, 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4), enthaltend 0,1% SDS, gewaschen und auf den Film aufgelegt.

NORTHERN-ANALYSE

RNA wurde zuerst gemäß dem folgenden Protokoll aus Blattmaterial extrahiert.

Zur Extraktion von RNA wurde durch Auflösen von 1% (w/v) TIPS (Triisopropyl-naphthalensulfonat, Natriumsalz), 6% (w/v) PAS (p-Aminosalicylat, Natriumsalz) in 50 mM Tris pH 8,4, enthaltend 5% (v/v) Kirby-Phenol, Covey-Extraktionspuffer hergestellt. Kirby-Phenol wurde durch Neutralisieren von verflüssigtem Phenol, enthaltend 0,1% (w/v) 8-Hydroxychinolin mit 0,1 M Tris-HCl, pH 8,8, hergestellt. Für jede RNA-Aufbereitung wurde eine Probe von 1 g aus Pflanzengewebe in flüssigem Stickstoff zerkleinert und in 5 ml Covey-Extraktionspuffer, enthaltend 10 &mgr;l &bgr;-Mercaptoethanol, extrahiert. Die Probe wurde mit 5 ml eines Gemischs von 1:1 Kirby-Phenol und Chloroform extrahiert, gevortext und 20 min bei 7 000 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Nukleinsäuren wurden mit 500 &mgr;l 3 M Natriumacetat und 5 ml Isopropanol präzipitiert und durch Zentrifugation 10 min bei 10 000 xg gesammelt. Das Pellet wurde in 500 &mgr;l Wasser erneut aufgelöst und die RNA wurde auf Eis mit 250 &mgr;l 8 M LiCl präzipitiert und durch Zentrifugation 10 min bei 10 000 xg gesammelt. Das Pellet wurde in 200 &mgr;l Wasser resuspendiert und mit einem gleichen Volumen von Chloroform:Isoamylalkohol 1:1 unter Vortexen extrahiert. Nach der Zentrifugation 2 min bei 10 000 xg wurde die obere wässrige Phase entfernt und die Nukleinsäuren wurden bei –20°C durch Zufügen von 20 &mgr;l 3 M Natriumacetat und 200 &mgr;l Isopropanol präzipitiert. Das Pellet wurde mit 1 ml kaltem 70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 100 &mgr;l Wasser resuspendiert. Der RNA-Gehalt wurde spektrophotometrisch bei 260 nm bestimmt. Proben, die 1 bis 10 &mgr;g RNA enthielten, wurden der denaturierenden Gelelektrophorese, wie anderswo beschrieben, unterworfen (Sambrook et al., supra).

Die extrahierte RNA wurde auf die Hybond N+-Membran (Amersham, Cleveland, Ohio) transferiert und mit radioaktiv markierten Sonden, die aus cDNA-Klonen hergestellt wurden, sondiert. Die Blots wurden über Nacht hybridisiert, zweimal bei Raumtemperatur und einmal bei 65°C in 3 × SSC (450 mM Natriumchlorid, 45 mM Natriumcitrat, pH 7,0), enthaltend 0,1% SDS, gewaschen und auf den Film aufgelegt.

IDENTIFIKATION VON CDNA UND GENOMISCHEN KLONEN

cDNA und genomische Klone für F5H wurden mithilfe von Standardverfahren unter Verwendung eines SacII/EcoRI-Fragmentes von 2,3 kb aus dem geretteten Plasmid (pCC1) (Beispiel 2) als eine Sonde identifiziert. Der cDNA-Klon pCC30 wurde in der &lgr;PRL2-Bibliothek identifiziert (Newman et al., (1994) supra), freundlicherweise überlassen von Dr. Thomas Newman (DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University, East Lansing, MI). Eine genomische Cosmid-Bibliothek von Arabidopsis thaliana (Ecotyp Landsberg erecta), die im binären Cosmid-Vektor pBIC20 (Beispiel 3) herbeigeführt wurde (Meyer et al., Science 264, 1452, (1994)) wurde mit dem sich von pCC30 herleitenden radioaktiv markierten cDNA-Insert durchsucht. Genomische Inserts in der pBIC20-T-DNA sind durch das Neomycin-Phosphotransferase-Gen für die Kanamycin-Selektion unmittelbar benachbart zu der rechten Border-Sequenz der T-DNA und dem &bgr;-Glucuronidase-Gen für die histochemische Selektion unmittelbar benachbart zur linken Border flankiert. Positive Klone wurden durch Restriktionsaufschluss und die Southern-Analyse im Vergleich zur genomischen DNA von Arabidopsis charakterisiert.

PFLANZENTRANSFORMATION

Die Transformation von Arabidopsis thaliana wurde mit geringfügiger Modifikation mittels Vakuum-Infiltration durchgeführt (Bent et al., Science 265, 1856, (1994)). Es wurden, um es kurz zu fassen, 500 ml Kulturen von transformiertem Agrobacterium, welches das pBIC20-F5H-Cosmid beherbergte, oder das pGA482-35S-F5H-Konstrukt bis zur stationären Phase in Luria-Bouillon, enthaltend 10 mg l–1 Rifampicin und 50 mg l–1 Kanamycin, gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und in 1 l Infiltrationsmedium, enthaltend 2,2 g MS-Salze (Murashige und Skoog, Physiol. Plat. 15, 473, (1962)), Gamborgs B5-Vitamine (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50, 151, (1968)), 0,5 g MES, 50 g Saccharose, 44 nM Benzylaminopurin und 200 &mgr;l Silwet L-77 (OSI Specialities) bei pH 5,7 resuspendiert. Vorzeitig Samen bildende Arabidopsis-Pflanzen T0-Generation), die 5 bis 10 cm hoch waren, wurden in die Bakteriensuspension invertiert und drei bis fünf Minuten einem Vakuum (> 500 mm Hg) ausgesetzt. Infiltrierte Pflanzen wurden zur Samenproduktion unter Standardwachstumsbedingungen zurückgebracht. Transformierte Sämlinge (T1) wurden durch Auswahl auf MS-Medien, enthaltend 50 mg l–1 Kanamycin und 200 mg l–1 Timentin (SmithKlineBeecham) identifiziert und wurden in den Boden transferiert.

Die Transformation von Tabak wurde unter Verwendung des Blatt-Diskverfahrens von Horsch et al. (Science 227, 1229, (1985)) erlangt.

NITROBENZEN-OXIDATION

Für die Bestimmung der Lignin-Monomer-Zusammensetzung wurde Stengelgewebe in flüssigem Stickstoff zu einem Pulver zermahlen und mit 20 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, 30 min bei 37°C, gefolgt von drei Extraktionen mit 80%igem Ethanol bei 80°C extrahiert. Das Gewebe wurde dann einmal mit Aceton extrahiert und vollkommen getrocknet. Das Gewebe wurde durch Behandlung mit 1,0 M NaOH 24 Stunden bei 37°C verseift, dreimal mit Wasser, einmal mit 80%igem Ethanol, einmal mit Aceton gewaschen und getrocknet. Die Nitrobenzen-Oxidation von Stengelgewebeproben wurde gemäß einem modifizierten Protokoll nach Iiyama et al. (J. Sci. Food Agric. 51, 481–491, (1990) durchgeführt. Proben aus Lignocellulosematerial (jeweils 5 mg) wurden mit 500 &mgr;l 2 M NaOH und 25 &mgr;l Nitrobenzen gemischt. Dieses Gemisch wurde in einem verschlossenen Glasröhrchen 3 h bei 160°C inkubiert. Die Reaktionsprodukte wurden auf Raumtemperatur abgekühlt, und 5 &mgr;l einer 20 mg ml–1 Lösung aus 3-Ethoxy-4-hydroxybenzaldehyd in Pyridin wurden als ein interner Standard zugefügt, bevor das Gemisch zweimal mit 1 ml Dichlormethan extrahiert wurde. Die wässrige Phase wurde mit HCl (pH 2) angesäuert und zweimal mit 900 &mgr;l Ether extrahiert. Die kombinierten Etherphasen wurden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und der Ether wurde in einem Stickstoffstrom verdampft. Der getrocknete Rückstand wurde in 50 &mgr;l Pyridin resuspendiert, es wurden 10 &mgr;l BSA (N,O-Bis-(trimethylsilyl)trifluoracetamid zugefügt, und 1 &mgr;l Aliquote der silylierten Produkte wurden unter Verwendung eines Hewlett-Packard 5890 Serie II Gaschromatographen, der mit einer Supelco SPB I-Säule (30 m × 0,75 mm) ausgerüstet war, analysiert. Die Lignin-Monomer-Zusammensetzung wurde aus den integrierten Bereichen der Peaks berechnet, die die trimethylsilylierten Vanillin-Derivate, Syringaldehyd, Vanillinsäure und Syringasäure darstellten. Die insgesamt für die Nitrobenzen-Oxidation anfälligen Guaiacyleinheiten (Vanillin und Vanillinsäure) und Syringyleinheiten (Syringaldehyd und Syringasäure) wurde n nach der Bereinigung für Rückgewinnuungseffizienzen von jedem der Produkte während des Extraktionsverfahrens im Vergleich zum internen Standard berechnet.

BEISPIEL 1 IDENTIFIKATION DES MIT T-DNA GETAGGTEN FAH1-ALLELS

Eine putativ mit T-DNA getaggte fah1-Mutante wurde in einer Sammlung von mit T-DNA getaggten Linien (Feldmann et al., Mol. Gen. Genet. 208, 1, (1987)) (Dr. Tim Caspar, DuPont, Wilmington, DE) durch Screening von adulten Pflanzen unter langwelligem UV-Licht identifiziert. Es wurde eine rot fluoreszierende Linie (Linie 3590) ausgewählt und ihre Abkömmlinge wurden mittels DC auf Sinapoylmalat untersucht. Die Analysen wiesen darauf hin, dass Linie 3590 kein Sinapoylmalat akkumulierte. Reziproke Kreuzungen von Linie 3590 zu einer fah1-2-Homozygote, gefolgt von der Analyse der F1-Generation auf den Sinapoylmalatgehalt wies nach, dass Linie 3590 ein neues fah1-Allel war, und es wurde als fah1-9 bezeichnet.

Vorläufige Experimente deuteten auf eine Cosegregation des Kanamycin-resistenten Phänotyps der mit T-DNA getaggten Mutante mit dem fah1-Phänotyp hin. Geselbsteter Samen von 7 Kanamycin-resistenten (fah1-9 × FAH1] F1-Pflanzen segregiert 1:3 für Kanamycin-Resistenz (kanempfindlich kanresistent) und 3:1 für Sinapoylmalat-Defizienz (FAH1:fah1). Von diesen Linien gaben fah1-Pflanzen Anlass zu lediglich den kanresistent, fah1-Abkömmlingen. Zur Bestimmung der genetischen Distanz zwischen der T-DNA-Insertion und dem FAH1-Locus wurden mehrere Testkreuzungen zwischen [fah1-9 × FAH1] F1 und einer fah1-2-Homozygoten durchgeführt. Die Distanz zwischen dem FAH1-Locus und der T-DNA-Insertion wurde mittels Bestimmung der Häufigkeit bewertet, bei der die FAH1/kanempfindlich-Abkömmlinge in der Testkreuzung F1 wiedergefunden wurden. In Abwesenheit von Crossover-Ereignissen wären die gesamten Kanamycin-resistenten F1-Abkömmlinge nicht in der Lage, Sinapoylmalat zu akkumulieren und würde folglich unter UV-Licht rot fluoreszieren. In 682 untersuchten kanresistenten F1-Abkömmlingen wurden keine Sinapoylmalat-profizienten Pflanzen identifiziert, was auf eine sehr engmaschige Verknüpfung zwischen der T-DNA-Insertionsstelle und dem FAH1-Locus hindeutete.

BEISPIEL 2 PLASMID-RESCUE UND c-DNA-KLONIERUNG DES fah1-GENS

Plasmid-Rescue wurde unter Verwendung von EcoRI-aufgeschlossener DNA durchgeführt, die aus homozygoten fah1-9-Pflanzen hergestellt wurde (Behringer et al., (1992), supra). Fünf &mgr;g EcoRI-aufgeschlossene genomische DNA wurde mit 125 U T4-DNA-Ligase über Nacht bei 14°C in einem Endvolumen von 1 ml inkubiert. Das Ligationsgemisch wurde um das ca. 4fache mittels zwei Extraktionen mit gleichen Volumina von 2-Butanol konzentriert und wurde dann mit Ethanol präzipitiert und in kompetente DH5-&agr;-Zellen, wie beschrieben, elektroporiert (Newman et al., (1994), supra).

DNA von geretteten Plasmiden wurde mit EcoRI und SalI doppelt aufgeschlossen. Die aus internen T-DNA-Sequenzen herbeigeführten Plasmide wurden anhand der Anwesenheit von Triplettbanden bei 3,8, 2,4 und 1,2 kb identifiziert und verworfen. Ein Plasmid (pCC1), das Anlass zur erwarteten 3,8-kb-Bande plus einer neuen 5,6-kb-Bande gab, wurde als putativ externes Plasmid der rechten Border identifiziert. Unter Verwendung eines SacII/EcoRI-Fragments von pCC1, das DNA von Arabidopsis darzustellen schien, wurden putative cDNA-Klone (pCC30) für F5H identifiziert. Der putative F5H-Klon trug ein SalI-NotI-Insert von 1,9 kb, dessen Sequenz bestimmt wurde. Die Blastx-Analyse (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403, (1990)) wies darauf hin, dass diese cDNA eine Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenase kodiert, was mit früheren Berichten konsistent ist, dass (i) die fah1-Mutante in F5H defekt ist (Chapple et al., supra) und (ii) F5H eine Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenase (Grand, supra) darstellt.

SOUTHERN- UND NORTHERN-BLOT-ANALYSE

Zur Bestimmung, ob die putative F5H-cDNA tatsächlich das Gen darstellte, das in der T-DNA getaggten Linie unterbrochen war, wurden die Southern- und Northern-Analyse zur Charakterisierung der verfügbaren fah1-Mutanten unter Verwendung der putativen F5H-cDNA eingesetzt.

In 6 ist ein Southern-Blot ersichtlich, das die Hybridisierung der F5H-cDNA an EcoRI-aufgeschlossene genomische DNA vergleicht, die aus dem Wildtyp (Ecotypen Columbia (Col), Landsberg, erecta (LER) und Wassilewskija (WS)) und den neun fah1-Allelen, einschließlich des T-DNA getaggten fah1-9-Allels isoliert wurde. WS stellt den Ecotyp dar, aus dem die T-DNA getaggte Linie herbeigeführt wurde.

Diese Daten wiesen auf die Anwesenheit eines Polymorphismus von Restriktionsfragmentlänge zwischen der getaggten Linie und dem Wildtyp hin. Diese Daten deuten auch auf einen Polymorphismus von Restriktionsfragmentlänge im fah1-8-Allel hin, der mit schnellen Neutronen herbeigeführt wurde, einem Verfahren, von dem berichtet wurde, dass es Deletionsmutationen veranlasst.

Wie in 6 gezeigt, wird die genomische DNA der fah1l-8- und fah1-9-Allele (der T-DNA getaggten Linie) in dem der putativen F5H-cDNA entsprechenden Bereich unterbrochen. Diese Daten deuten auch darauf hin, dass F5H durch ein einzelnes Gen in Arabidopsis wie erwartet kodiert wird, wenn man in Betracht zieht, dass die Mutation in der fah1-Mutante als ein einzelnes Mendelsches Gen segregiert. Diese Daten stellen den ersten Hinweis bereit, dass die putative F5H-cDNA dem Gen entspricht, das in den fah1l-Mutanten unterbrochen ist.

Pflanzenmaterial, das für neun sich unabhängig herleitende fah1-Allele homozygot war, wurde auf die Reichhaltigkeit von Transkripts untersucht, die der putativen F5H-cDNA unter Verwendung der Northern-Blot-Analyse entsprechen. Die Daten sind in 7 ersichtlich.

Wie aus den Daten hervorgeht, wurde die putative F5H-mRNA bei ähnlichen Spiegeln im Blattgewebe von Columbia-, Landsberg erecta- und Wassilewskija-Ecotypen und in den EMS-induzierten fah1-1, fah1-4 und fah1-5 wie auch dem durch schnelle Neutronen induzierten fah1-7 dargestellt. Die Reichhaltigkeit der Transkripte war in Blättern aus Pflanzen, die für die fah1-2, fah1-3 und fah1-6 homozygot waren, die alle EMS-induziert waren, der durch schnelle Neutronen induzieren Mutante fah1-8 und in der getaggten Linie fah1-9 reduziert. Die mRNA in der fah1-8-Mutante scheint auch trunkiert zu sein. Diese Daten stellten einen starken Hinweis bereit, dass der cDNA-Klon, der identifiziert worden war, durch den FAH1-Locus kodiert ist.

BEISPIEL 3 NACHWEIS DER IDENTITÄT DER F5H-cDNA DURCH TRANSFORMATION VON MUTANTEN fah1-PFLANZEN MIT F5H DES WILDTYPS UND WIEDERHERSTELLUNG DER SINAPOYLMALAT-AKKUMULATION

Zum Nachweis der Identität des F5H-Gens auf der funktionellen Ebene wurde die Transformations-kompetente pBIC20-Cosmidbibliothek (Meyer et al., supra) unter Verwendung der F5H-DNA der vollen Länge als eine Sonde auf entsprechende genomische Klone durchsucht. Ein Klon (pBIC20-F5H), der ein genomisches Insert von 17 kb trägt, das 2,2 kb der Sequenz oberstromig vom putariven F5H-Startcodon und 12,5 kb der Sequenz unterstromig vom Stopcodon des F5H-Gens (2) enthält, wurde durch Vakuuminfiltration in die fah1-2-Mutante transformiert. Dreißig unabhängige Infiltrationsexperimente wurden durchgeführt und 167 Kanamycin-resistente Sämlinge, die mindestens 3 Transformanten aus jeder Infiltration darstellen, wurden in den Boden transferiert und wurden in Bezug auf die sich von Sinapinsäure herleitende Metaboliten analysiert. Wie anhand der DC (3) bestimmt wurde, akkumulierten 164 von diesen Pflanzen Sinapoylmalat in ihrem Blattgewebe. Diese Komplementierungsdaten weisen darauf hin, dass das Gen, das in der fah1-Mutanten defekt ist, auf dem binären Cosmid pBIC20-F5H vorliegt.

Zur Delimitierung der DNA-Region auf dem pBIC20-F5H-Cosmid, das für die Komplementierung des mutanten Phänotyps verantwortlich ist, wurde ein 2,7-kb-Fragment der F5H-Genomsequenz unterstromig vom 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus im binären Plasmid pGA482 verwendet, und dieses Konstrukt (pGA482-35S-F5H) (2) wurde in die fah1-2-Mutante transformiert. Die Anwesenheit von Sinapoylmalat in 109 von 110 der mittels DC oder mittels In-vivo-Fluoreszenz unter UV-Licht analysierten transgenen Linien zeigte an, dass der fah1-mutante Phänotyp komplementiert wurde (3). Diese Daten stellen einen schlüssigen Hinweis bereit, dass die F5H-cDNA identifiziert wurde.

BEISPIEL 4 DNA-SEQUENZIERUNG DER F5H-cDNA UND GENOMISCHEN KLONE

Die F5H-cDNA und ein HindIII-Xhol-Fragment von 5156 bp des genomischen pBIC20-F5H-Klons wurden beide an beiden Strängen vollkommen sequenziert und die Sequenz des F5H-Proteins (SEQ ID NO:2) wurde aus der cDNA-Sequenz hergeleitet (8). Die Sequenz der F5H-cDNA ist in SEQ ID NO:1 angegeben. Die Sequenz des genomischen F5H-Klons von Arabidopsis thaliana ist in SEQ ID NO:3 angegeben.

BEISPIEL 5 MODIFIKATION DER LIGNIN-MONOMER-ZUSAMMENSETZUNG IN F5H ÜBEREXPRIMIERENDEN TRANSGENEN PFLANZEN HERBEIFÜHRUNG VON TRANSGENEN PFLANZEN, DIE DAS F5H-GEN EKTOPISCH EXPRIMIEREN

Unter Verwendung einer Adaptor-basierenden Klonierungsstrategie, wurden die Regulationssequenzen 5' der Translationsinitiierungsstelle des F5H-Gens, wie in 2 gezeigt, durch den starken konstitutiven 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus ersetzt (Odell et al., Nature 313, 810–812. (1985)). Das sich ergebende Konstrukt trägt 2719 bp der F5H-Genomsequenz, die durch den 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus, der 50 bp oberstromig vom erschlossenen ATG-Startcodon fusioniert ist, getrieben werden. Aufgrund dessen treibt der 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus die Expression des F5H-Gens durch Verwendung der Transkriptionsstartstelle des viralen Promotors und des Terminationssignals, das an der F5H-Genomsequenz vorhanden ist, an. Diese Expressionskassette für die ektopische Expression von F5H wurde in die T-DNA des binären Vektors pGA482 insertiert (An, G. (1987), Binary Ti vectors for plant transformation and promotor analysis in: Methods in enzymology. Wu, R. Hrsg. Academic Press, NY 153: 292–305) und durch Elektroporation in Agrobacterium tumefaciens eingeführt.

Transgene Arabidopsis-Pflanzen des Ecotyps Columbia, die für das fah1-2-Allel homozygot waren (Chapple et al., supra), wurden mit Agrobacterium-Kulturen transformiert, die das pGA482-35S-F5H-Konstrukt gemäß dem Verfahren Bent et al. (supra) beherbergen. Transgene Pflanzen der T2- und T3-Generation wurden durch Auswahl auf Medien, enthaltend Kanamycin, identifiziert und anschließend in den Boden transferiert.

BESTIMMUNG DER LIGNIN-MONOMER-ZUSAMMENSETZUNG VON STENGELGEWEBE VON ARABIDOPSIS

Das Gesamtstengelgewebe wurde von 4 Wochen alten Pflanzen geerntet, die bei 22°C unter einer Photoperiode von 16 h/8 h hell/dunkel im Boden gezüchtet wurden. Die Nitrobenzen-Oxidationsanalyse führte Syringyl-Werte für 9 verschiedene Transformantenlinien in Mol-% herbei (Tabelle 1), die im Bereich von 5,06 +/– 0,17 Mol-% bis 28,8 +/– 0,92 Mol-% gegenüber der Wildtyp-Kontrolle lagen, die einen Wert von 18,4 +/– 0,91 Mol-% nachwies. Dem fah1-2-Mutantenhintergrund, in dem die transgenen Linien herbeigeführt wurden, mangelt vollkommen das Syringyl-Lignin (Tabelle 1). Durch die geringe Expression des F5H-Transgens in einem genetischen Hintergrund, dem die endogene F5H-„Message" mangelt, lässt sich erklären, wie Linie 88 Syringyl-Lignin-Spiegel aufweisen kann, die niedriger als der Wildtyp sind.

Außer Arabidopsis wurden Tabakpflanzen unter Kontrolle vom 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus auf ähnliche Weise mit dem F5H-Gen transformiert. T2- und T3-positive Transformanten wurden gescreent und auf Lignin-Modifikation analysiert, und die Daten sind in Tabelle 2 ersichtlich. Die Nitrobenzen-Oxidationsanalyse der Mittelrippen der Tabakblätter führten Syringyl-Werte in Mol-% für 4 verschiedene Transformantenlinien herbei (Tabelle 2), die gegenüber der Wildtyp-Kontrolle, die einen Wert von 14,3 +/– 1,09 Mol-% aufwies, im Bereich von 22,4 +/– 1,53 Mol-% bis 40,0 +/– 1,86 Mol-% lagen.

Die Daten in Tabellen 1 und 2 weisen deutlich nach, dass eine Überexpresssion des F5H-Gens in transgenen Pflanzen zur Modifikation der Lignin-Monomer-Zusammensetzung führt. Es wird durchaus erwartet, dass die transformierte Pflanze einen Syringyl-Lignin-Monomergehalt aufweist, der im Bereich von ca. 0 Mol-% bis ca. 95 Mol-%, wie im gesamten Pflanzengewebe gemessen, liegt.

SEQUENZPROTOKOLL

Anspruch[de]
  1. Isoliertes Nukleinsäurefragment, kodierend ein aktives Enzym F5H in einer Pflanze, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (1) der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und (2) einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, umfassend Aminosäuresubstitutionen, -additionen und -deletionen, die nicht die Funktion des aktiven Enzyms F5H in einer Pflanze verändern.
  2. Isoliertes Nukleinsäurefragment, kodierend ein aktives Enzym F5H in einer Pflanze, wobei das Fragment aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus dem Nukleinsäurefragment von SEQ ID NO: 1, dem Nukleinsäurefragment von SEQ ID NO: 3 und einem Nukleinsäurefragment von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, umfassend Basenänderungen, die nicht die Funktion des kodierten Enzyms F5H in einer Pflanze verändern.
  3. Chimäres Gen, das veränderte Verhältnisse von Guaiacyl:Syringyl-Lignin-Monomer in einer mit dem chimären Gen transformierten Pflanzenzelle herbeiführt, wobei das chimäre Gen das Nukleinsäurefragment nach Ansprüchen 1 oder 2 umfasst, das funktionsfähig in entweder Sense- oder Antisense-Richtung mit mindestens einer geeigneten Regulatorsequenz verknüpft ist.
  4. Chimäres Gen nach Anspruch 3, worin das Nukleinsäurefragment funktionsfähig in der Sense-Richtung mit mindestens einer geeigneten Regulatorsequenz verknüpft ist.
  5. Chimäres Gen nach Anspruch 3, worin mindestens eine Regulatorsequenz einen Promotor umfasst, der aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus dem 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus, dem Promotor für das Phenylalanin-Ammonium-Lyase-Gen, dem Promotor für das p-Coumaroyl-CoA-Ligase-Gen und endogenen Pflanzenpromotoren, die zur Kontrolle der Expression von F5H-Genen in einer Pflanze fähig sind.
  6. Transformierte Pflanze mit veränderten Verhältnissen von Guaiacyl:Syringyl-Lignin-Monomer verglichen mit den Verhältnissen einer nicht transformierten Pflanze und umfassend eine geeignete Wirtspflanze und das chimäre Gen nach Anspruch 3.
  7. Transformierte Pflanze nach Anspruch 6, worin der Syringyl-Lignin-Monomergehalt, wie im ganzen Pflanzengewebe gemessen, von ca. 0 Mol-% bis ca. 95 Mol-% beträgt.
  8. Transformierte Pflanze nach Anspruch 7, worin die geeignete Wirtspflanze aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Alfalfa (Medicago sp.), Reis (Oryza sp.), Mais (Zea mays), Ölsamenraps (Brassica sp.), Futtergräsern (Arabidopsis sp.), Tabak (Nicotiana sp.) und Nutzbaumpflanzen, wie zum Beispiel Eukalyptus (Eucalyptus sp.), Kiefer (Pinus sp.), Fichte (Picea sp.) und Pappel (Populus sp.).
  9. Verfahren zum Verändern der Aktivität des Enzyms F5H in einer Pflanze, umfassend:

    (i) Transformieren einer Zelle, eines Gewebes oder Organs aus einer geeigneten Wirtspflanze mit dem chimären Gen nach Anspruch 3, worin das chimäre Gen exprimiert wird;

    (ii) Auswählen von transformierten Zellen, Zellcallus, somatischen Embryos oder Samen, die das chimäre Gen enthalten;

    (iii) Regenerieren ganzer Pflanzen aus den transformierten Zellen, dem Zellcallus, den somatischen Embryos oder in Schritt (ii) ausgewählten Samen;

    (iv) Auswählen von in Schritt (iii) regenerierten ganzen Pflanzen, die einen Phänotyp aufweisen, gekennzeichnet durch (1) eine Fähigkeit der ganzen Pflanze, Verbindungen zu akkumulieren, die sich von Sinapinsäure oder (2) einem veränderten Syringyl-Lignin-Monomergehalt verglichen mit einer nicht transformierten Wirtspflanze herleiten.
  10. Verfahren zum Verändern des Gehalts oder der Zusammensetzung von Lignin in einer Pflanze, umfassend stabiles Inkorporieren des chimären Gens nach Anspruch 3 in das Genom der Wirtspflanze durch Transformationsmittel, wodurch das inkorporierte chimäre Gen das Enzym F5H exprimiert und wodurch die Verhältnisse von Guaiacyl:Syringyl-Lignin-Monomer verglichen mit denen der nicht transformierten Wirtspflanze verändert sind.
Es folgen 8 Blatt Zeichnungen






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