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Dokumentenidentifikation DE60110822T2 11.05.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001326635
Titel ZUBEREITUNG ZUR IMMUNISIERUNG GEGEN DEN AIDS-VIRUS
Anmelder Sanofi Pasteur, Lyon, FR
Erfinder HAENSLER, Jean, F-69290 St Genis les Ollières, FR;
DALENCON, François, F-69004 Lyon, FR
Vertreter Zumstein & Klingseisen, 80331 München
DE-Aktenzeichen 60110822
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, TR
Sprache des Dokument FR
EP-Anmeldetag 08.10.2001
EP-Aktenzeichen 019763788
WO-Anmeldetag 08.10.2001
PCT-Aktenzeichen PCT/FR01/03096
WO-Veröffentlichungsnummer 0002028427
WO-Veröffentlichungsdatum 11.04.2002
EP-Offenlegungsdatum 16.07.2003
EP date of grant 11.05.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.05.2006
IPC-Hauptklasse A61K 39/21(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für die Immunisierung gegen die mit HIV verbundenen Infektionen verwendbar ist.

Das acquired immunodeficiency syndrome oder AIDS ist eine Krankheit, gegen die über einen Impfstoff verfügen zu können sehr wünschenswert wäre und insbesondere über einen Impfstoff, der prophylaktisch verwendbar ist. Nun ist man aber bis heute bei der Entwicklung eines solchen Impfstoffs auf zahlreiche Probleme gestoßen, darunter insbesondere die verschiedenen Formen, die das HIV-Virus einnehmen kann, sowie die Schwierigkeiten, die Zusammenhänge der Immunität gegen HIV zu erkennen, das heißt die Immunfaktoren, die gegen die Viren schützen können. Der Fall von Personen, die [dem Virus] ausgesetzt waren und nicht infiziert wurden, sowie die Untersuchungen an "Nonprogressoren" geben jedoch Hinweise und richten die Forschungen auf die Induktion von 2 Immunreaktionstypen: die Reaktion über die Antikörper (humoral) und die Zellreaktion.

Die humorale Reaktion, die man hervorrufen möchte, ist nicht nur eine systemische humorale Reaktion, sondern auch eine Reaktion in den Schleimhäuten, weil es wünschenswert ist, eine Immunschranke gegen das Virus am Ort seines Eintretens in den Organismus zu errichten.

Die Strategien bei der Erforschung eines Impfstoffs gegen AIDS gehen folglich in Richtung der Erforschung von Impfzusammensetzungen, die das Immunsystem dazu anregen können, insbesondere eine große Menge an Ig G und Ig A, die für das AIDS-Virus spezifisch sind, insbesondere in den Schleimhäuten zu produzieren.

Dieses Ziel stößt jedoch auf zahlreiche Schwierigkeiten, weil die HIV-Antigene, die in einer Impfzusammensetzung verwendet werden können, nicht immer allein eine ausreichende Reaktion induzieren können, und die Formulierungen, die im Stand der Technik für ihr Vermögen bekannt sind, eine solche Reaktion zu induzieren, wie die Formulierungen, die das Choleratoxin umfassen, weisen bisweilen nicht vernachlässigbare Toxizitätsrisiken auf.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist folglich, eine neue pharmazeutische Zusammensetzung vorzuschlagen, die prophylaktisch oder therapeutisch für die Immunisierung gegen die mit HIV verbundenen Infektionen verwendet werden kann.

Überraschenderweise wurde gezeigt, dass es die erfindungsgemäße Zusammensetzung ermöglicht, eine bedeutende Produktion von Ig G und Ig A, die für ein HIV-Antigen spezifisch sind, zu induzieren.

Um dieses Ziel zu erreichen, schlägt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung, die wenigstens ein HIV-Antigen und DCchol umfasst, zur Herstellung eines Medikaments für die Immunisierung gegen die mit HIV verbundenen Infektionen vor, das dazu bestimmt ist, über die Schleimhäute verabreicht zu werden.

Gemäß einem Merkmal der Erfindung ist das Medikament zur Induktion von Ig G- und Ig A-Antikörpern, die für ein HIV-Antigen spezifisch sind, in den Schleimhautgeweben eines Säugers bestimmt.

Weitere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der folgenden Beschreibung unter Bezug auf die Zeichnungen, die die erhaltenen Ergebnisse veranschaulichen, hervortreten.

Die 1 bis 3 veranschaulichen die in Beispiel 5 erhaltenen Ergebnisse.

Die 4 veranschaulicht die in Beispiel 6 erhaltenen Ergebnisse.

Die 5 und 6 veranschaulichen die in Beispiel 7 erhaltenen Ergebnisse.

Die 7 bis 13 veranschaulichen die in Beispiel 8 erhaltenen Ergebnisse.

Unter HIV-Antigen versteht man jedes Antigen, das von HIV 1 oder 2 stammt, vorzugsweise von HIV 1 stammt, das neutralisierende Antikörper induzieren kann, einschließlich der Laborstämme und der Primärisolate. Dieser Begriff umfasst folglich insbesondere die Oberflächenantigene des Virus, wie das Glykoprotein 160 oder gp160, oder die sich daraus ableitenden Proteine, d.h. gp120 und gp41, die aus internen Proteinen bestehenden Antigene, wie das Protein Gag, und die sich daraus ableitenden Proteine, wie p24, p17, oder auch die Antigene, die aus Regulationsproteinen stammen, wie das Protein Tat. Die oben angegebene Liste ist nicht beschränkend. Unter HIV-Antigen im Sinne der Erfindung versteht man auch die wie oben definierten Antigene, die durch chemische oder genetische Behandlung modifiziert wurden, sofern die angewandte Behandlung die immunologischen Eigenschaften des Antigens nicht wesentlich verändert.

Als Beispiel kann man die HIV-Regulationsproteine anführen, die wie in den folgenden Patenten oder Patentanmeldungen beschrieben chemisch detoxifiziert wurden: US6200575, US6132721, WO99/33346; das durch Mutation detoxifizierte Protein Tat, wie von Golstein in der Anmeldung WO95/31999 und Nature Medicine, 1, 960, (1996) und von Loret in der Anmeldung WO00/61067 beschrieben. Vorzugsweise ist das im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Protein Tat ein Protein, das von seiner Transaktivierungsaktivität und seiner immunsuppressiven Aktivität befreit ist.

Die Suppression der Transaktivierungsaktivität kann leicht durch den CAT-Test kontrolliert werden, wie von G. Tosi et al in Eur. J. Immuno. (2000) 30, S. 1120-1126 beschrieben. Die Suppression der immunsuppressiven Aktivität des Proteins Tat kann leicht durch den Immunosuppressionstest bestimmt werden, wie von Zagury in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95: 3851-6 beschrieben.

Unter HIV-Antigen im Sinne der Erfindung versteht man folglich das Antigen selbst, aber auch die DNA, die nach Verabreichung mittels eines Vektors, wie ein Canarypox, vom Organismus exprimiert werden und folglich zur in situ-Produktion des Antigens führen kann, gegen das man eine Immunreaktion induzieren möchte. Die vorliegende Erfindung umfasst folglich außer den oben definierten Proteinantigenen die vorzugsweise viralen Vektoren, die diese Antigene exprimieren. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendeten viralen Vektoren sind die Vektoren ALVAC und NYVAC, die im Einzelnen in den Patenten US5364773, US5756103, US5990091 beschrieben sind, auf die man sich für eine vollständige Beschreibung dieser Vektoren und ihres Verfahrens zum Erhalt beziehen kann. Das erfindungsgemäße Peptidantigen kann durch chemische Synthese oder gentechnisch hergestellt werden. Die DNA- und Proteinsequenzen einer großen Anzahl von HIV-Antigenen sind auf der Seite: http://hiv-web.lanl.gov/ und in den entsprechenden Kompendien von Los Adamos verfügbar.

Wenn das Antigen durch chemische Synthese hergestellt wird, kann das erfindungsgemäße Antigen in der Form einer einzigen Sequenz oder in der Form mehrerer Sequenzen, die dann aneinander gebunden werden, synthetisiert werden. Die chemische Synthese kann in fester Phase oder in Lösung durchgeführt werden, wobei diese beiden Syntheseverfahren dem Fachmann gut bekannt sind. Diese Verfahren sind insbesondere von Atherton und Shepard in "solid phase peptide synthesis" (IRL press Oxford, 1989) und von Houben-Weyl in "Methoden der organischen Chemie", herausgegeben von E. Wunsch, Band 15-I und II, Thieme, Stuttgart, 1974, Dawson PE et al (Science 1994; 266(5186): 776-9); Kochendoerfer GG et al (Curr Opin Chem Biol 1999; 3(6): 665-71); und Dawson PE et al (Annu Rev Biochem 2000; 69: 923-60) beschrieben, auf die man sich für eine vollständige Beschreibung der Syntheseverfahren beziehen kann.

Das erfindungsgemäße Antigen kann auch durch die dem Fachmann gut bekannten Gentechnikverfahren hergestellt werden. Diese Verfahren sind im Einzelnen beschrieben in Molecular Cloning: a molecular manual von Maniatis et al, Cold Spring Habor, 1989. Herkömmlicherweise kann die DNA-Sequenz, die für das erfindungsgemäße Polypeptid kodiert, durch die PCR-Technik hergestellt werden, bei der die N- und C-Sequenzen zuerst unabhängig voneinander vervielfältigt werden, dann danach gepaart und erneut vervielfältigt werden. Die so erhaltene DNA-Sequenz wird dann in einen Expressionsvektor inseriert. Der Expressionsvektor, der die interessierende Sequenz einschließt, wird dann verwendet, um eine Wirtszelle zu transformieren, was die Expression der interessierenden Sequenz ermöglicht. Das produzierte Polypeptid wird dann aus dem Kulturmedium durch dem Fachmann gut bekannte Verfahren isoliert, wie Ausfällen mit Ethanol oder Ammoniumsulfat, Extraktion mit Säure, Anion/Kation-Austauschchromatographie, Chromatographie über Phosphocellulose, Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung, Affinitätschromatographie, Chromatographie über Hydroxyapatit und Chromatographie über Lectin. Vorzugsweise wird die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bei der Reinigung angewandt.

Um die Synthese des Antigens durchzuführen, kann jeder Expressionsvektor, der herkömmlicherweise für die Expression eines rekombinanten Proteins verwendet wird, im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Dieser Begriff umfasst folglich sowohl die sogenannten "lebenden" Expressionsvektoren, wie die Viren und Bakterien, als auch die Expressionsvektoren vom Plasmidtyp.

Man verwendet vorzugsweise Vektoren, worin die DNA-Sequenz des erfindungsgemäßen Antigens unter der Abhängigkeit eines induzierbaren oder nicht induzierbaren starken Promoters steht. Man kann als Beispiel für einen verwendbaren Promoter den Promoter der T7-RNA-Polymerase anführen.

Die Expressionsvektoren schließen vorzugsweise wenigstens einen Selektionsmarker ein. Solche Marker schließen beispielsweise das Dihydrofolatreduktasegen oder das Neomycinresistenzgen für die Kultur der Eukaryotenzellen und die Kanamycin-, Tetracyclin- oder Ampicillinresistenzgene für die Kultur in E. coli und anderen Bakterien ein.

Als im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren Expressionsvektor kann man die Plasmide anführen, wie beispielsweise pET28 (Novagen) oder pBAD (Invitrogen).

Um die Expression und die Reinigung des Antigens zu fördern, kann dieses Letztere in einer modifizierten Form, wie ein Fusionsprotein, exprimiert werden und kann nicht nur Sekretionssignale, sondern auch zusätzliche heterologe funktionelle Regionen einschließen. Beispielsweise kann eine Region zusätzlicher Aminosäuren, insbesondere geladene Aminosäuren, N-terminal an das Antigen angefügt werden, um die Stabilität und den Fortbestand in der Wirtszelle zu verbessern.

Für die Expression des Antigens kann jede herkömmlicherweise in Kombination mit den oben beschriebenen Expressionsvektoren verwendete Wirtszelle verwendet werden.

Man kann als nicht beschränkendes Beispiel die Zellen von E. coli, BL21 (&lgr;DE3), HB101, Top 10, CAG 1139, Bacillus, die Eukaryotenzellen, wie CHO oder Vero, anführen.

Vorzugsweise verwendet man im Rahmen der vorliegenden Erfindung das folgende System Expressionsvektor/Zelle: pET(Cer)/BL21LamdaDE3 oder BL21lamdaDE3(RIL).

Es wurden pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt, die für eine Immunisierung gegen das menschliche Immunschwächevirus vom Typ 1 (HIV-1) geeignet sind, worin das Antigen das Hüllglykoprotein gp160 MN/LAI-2 ist. Dieses Antigen enthält den Teil gp120 des Isolats HIV-1 MN und den Teil gp41 des Isolats HIV-1 LAI. Bei gp41 wurden seine Spaltungsstelle mit gp120 und sein Transmembranteil deletiert, um ein nicht gespaltenes und im Wesentlichen sekretiertes Glykoprotein zu erhalten. Das Antigen wird aus der Hamsterzelllinie BHK-21 hergestellt, die infiziert ist mit dem rekombinanten Virus des Impfstoffs VVTG.9150, abgeleitet aus der vorhergehenden Konstruktion VVTG.1163 (Kieny, M.-P. et al., 1988, Protein Eng, 2(3): 219-255), wird dann mit Ionenaustauschchromatographie und anschließend einer Immunoaffinitätschromatographie gereinigt.

Es wurden auch pharmazeutische Zusammensetzungen mit dem Antigen p24 hergestellt.

Dieses Antigen p24 wurde in der folgenden Veröffentlichung beschrieben: Diagnostic value of HIV-Ag testing and anti-p24 titers in HIV carriers and AIDS patients. Roumeliotou A, Nestoridou E, Economidou I, Psarra E, Sidiri E, Choremi E, Kallinikos G, Papaevangelou G, AIDS 1988 Feb; 2(1): 64.

Außerdem wurden pharmazeutische Zusammensetzungen hergestellt, die als Antigen ein detoxifiziertes Protein Tat IIIB enthalten. Das Protein Tat wurde durch eine Alkylierungsreaktion in alkalischem Medium durch Verwendung von Iodacetamid unter den folgenden Bedingungen detoxifiziert: Anzahl an Mikromolen Iodacetamid = 200 × Anzahl an Mikromolen Tat + Anzahl an Mikromolen DTT. Dieses detoxifizierte Protein und sein Herstellungsverfahren sind im Einzelnen in der Anmeldung WO99133346 beschrieben, wo es mit dem Begriff carboxymethyliertes Tat gekennzeichnet ist.

Unter DCchol versteht man das Produkt, das gemäß dem in dem Patent US 5283185 beschriebenen Verfahren oder bevorzugt gemäß dem in Beispiel 8 der Patentanmeldung WO 96/40067 beschriebenen Verfahren aus Cholesterylchlorformiat und N,N-Dimethylethylendiamin erhalten werden kann. Es ist auch möglich, ein Produkt zu verwenden, das durch Reaktion von Cholesterylchlorformiat und N,N,N-Trimethylethylendiamin erhalten wird.

Die erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen können in verschiedenen Formen formuliert werden und insbesondere in Form von Emulsionen, Liposomen, Liposomen in Emulsionen, Micellen.... usw. Besonders gute Ergebnisse wurden mit Emulsionen erhalten, insbesondere mikroemulgierte Emulsionen, die Squalen und ein Tensid wie Tween® 80 umfassen.

Gemäß einem Merkmal der Erfindung kann DCchol auch mit einem immunstimulierenden Oligonukleotid kombiniert werden; es wurde nämlich festgestellt, dass man in diesem Fall eine Synergie zwischen den 2 Zusätzen erhielt. Man kann insbesondere Oligonukleotide verwenden wie diejenigen, die in der Anmeldung WO 96/02555 beschrieben sind, diejenigen, die in der Anmeldung EP0468520 beschrieben sind, diejenigen, die in der Anmeldung WO0075304 beschrieben sind, oder jedes andere, für seine Aktivität als Immunoadjuvans bekannte Qligonukleotid.

Speziell kann man das Oligonukleotid 3Db(S) verwenden, dessen Sequenz unter SEQ ID NO 15 in der Anmeldung WO96102555 beschrieben ist.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sind dazu bestimmt, auf allen herkömmlicherweise bei der Impfung verwendeten Wegen verabreicht zu werden und insbesondere parenteral, aber auch über die Schleimhäute, insbesondere oral, nasal, rektal, vaginal. Sie können gemäß unterschiedlichen Protokollen, die einen einzigen oder mehrere Verabreichungsschritte umfassen, verabreicht werden.

Im Fall eines Protokolls in mehreren Schritten ist es möglich, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bei jedem Schritt verabreicht werden oder einfach nur bei einigen von ihnen. Es ist nämlich möglich, dass ein Verabreichungsprotokoll, das einen Schritt zur Erstimmunisierung, gefolgt von einem Schritt zur Auffrischung vorsieht, den Schritt zur Erstimmunisierung mit einer Zusammensetzung vorsieht, die sich von derjenigen der Erfindung unterscheidet, während die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung nur für den Schritt zur Auffrischung verwendet wird.

Jedoch ist es wegen der Eigenschaften der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen auch möglich, sie bei jedem der vorgeschlagenen Schritte zu verwenden.

Die Menge an Antigen in der Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung hängt, wie der Fachmann versteht, von zahlreichen Parametern ab, wie die Art des Antigens, der verwendete Vektor oder der Verabreichungsweg. Eine geeignete Menge ist eine solche Menge, dass nach Verabreichung dieser Letzteren eine humorale Immunreaktion, die die Primärisolate von HIV neutralisieren kann, induziert wird. Die zu verabreichende Menge an Proteinantigen liegt in der Größenordnung von 10 bis 100 Mikrogramm. Im Fall, wo das verwendete Antigen ein viraler Vektor ist, liegt die zu verabreichende Menge an Vektor in der Größenordnung von 104 bis 108 TCID50.

Die Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung können durch jedes dem Fachmann bekannte herkömmliche Verfahren hergestellt werden. Herkömmlicherweise werden die erfindungsgemäßen Antigene mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Verdünnungsmittel, wie Wasser oder phosphatgepufferte Salzlösung, gemischt. Der Träger oder das Verdünnungsmittel wird in Abhängigkeit von der gewählten galenischen Form, der Art und dem Weg der Verabreichung sowie der pharmazeutischen Praxis ausgewählt. Die geeigneten Träger oder Verdünnungsmittel sowie die Erfordernisse hinsichtlich der pharmazeutischen Formulierung sind im Einzelnen in Remington's Pharmaceutical Sciences, das auf diesem Gebiet ein Referenzwerk darstellt, beschrieben.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen spezielle Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1

Es wurde DC-Chol Hydrochlorid (erhalten gemäß der in Beispiel 8 der Patentanmeldung WO 96/40067 beschriebenen Herstellungsweise) verwendet, das zu 20 mg/ml in TRIS-NaCl-Puffer (20 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 6,8) suspendiert wurde. Nach 8 Stunden unter Rühren bei 35 – 40 °C unter Argon wurde die Suspension mit einem Mikrofluidizer M-110S von Microfluidics (10 Durchgänge bei 500 kPa) mikroemulgiert, um eine homogene DC-Chol-Suspension zu erzeugen, die über einen Filter Millex 0,45 &mgr;m filtriert wurde.

Beispiel 2

Mit einem von Applied Biosystems gelieferten Syntheseautomat, der das chemische Standardverfahren mit Phosphoramidit einsetzt und der bei jedem Durchgang einen Oxidationsschritt umfasst, wurden Oligonukleotide hergestellt.

Dieser Oxidationsschritt wurde mit einer Lösung Iod/Wasser/Tetrahydrofuran/Acetonitril, um eine Phosphodiesterbindung zu erhalten, und mit einer Lösung Tetraethylthiuram/Acetonitril, um eine Phosphorothioatbindung zu erhalten, durchgeführt.

So wurde ein Oligonukleotid 3 Db(S) hergestellt, dessen Sequenz in der Patentanmeldung WO96/02555 unter SEQ ID NO 15 wiedergegeben ist und das Phosphorothioatbindungen auf seiner gesamten Länge umfasst.

Es wurde auch ein Oligonukleotid MGC (S) hergestellt, dessen Sequenz in der Patentanmeldung WO00/15256 mit SEQ ID NO 2 wiedergegeben ist, das zugleich Phophodiesterbindungen und Phosphorothioatbindungen umfasst. Die Phosphorothioatbindungen liegen an jedem Ende; es gibt 2 Phosphorothioatbindungen in 3' und 5 Phosphorothioatbindungen in 5'. Dieses Oligonukleotid besitzt keine CG-Sequenz und wird als negative Kontrolle verwendet.

Beispiel 3: ap160 + immunstimulierendes Oligonukleotid bei der Maus

Es wurden pharmazeutische Zusammensetzungen für die Immunisierung gegen das menschliche Immunschwächevirus vom Typ 1 (HIV-1) hergestellt, worin das Antigen das Hüllglykoprotein gp160 MN/LAI-2 ist. Dieses Antigen enthält den Teil gp120 des Isolats HIV-1 MN und den Teil gp41 des Isolats HIV-1 LAI. Bei gp41 wurden seine Spaltungsstelle mit gp120 und sein Transmembranteil deletiert, um ein nicht gespaltenes und im Wesentlichen sekretiertes Glykoprotein zu erhalten. Das Antigen wird aus der Hamsterzelllinie BHK-21 hergestellt, die infiziert ist mit dem rekombinanten Virus des Impfstoffs VVTG.9150, abgeleitet aus der vorhergehenden Konstruktion VVTG.1163 (Kieny, M.-P. et al., 1988, Protein Eng, 2(3): 219-255), wird dann mit Ionenaustauschchromatographie und anschließend einer Immunoaffinitätschromatographie gereinigt.

Die Immunisierungsdosen von 20 &mgr;l entsprachen einer der folgenden Formulierungen:

  • – 25 &mgr;g nur gp160,
  • – 25 &mgr;g gp160 + 50 &mgr;g Oligonukleotid 3Db(S), hergestellt in Beispiel 2,
  • – 25 &mgr;g gp160 + 50 &mgr;g Oligonukleotid MGC, hergestellt in Beispiel 2, + 200 &mgr;g DCchol, hergestellt in Beispiel 1,
  • – 25 &mgr;g gp160 + 50 &mgr;g Oligonukleotid 3Db(S), hergestellt in Beispiel 2, + 200 &mgr;g DCchol, hergestellt in Beispiel 1.

Die hergestellten Dosen wurden 4 Gruppen zu 6 Mäusen (1 Formulierung pro Gruppe) rektal unter Betäubung in einer Menge von 4 Injektionen, jede im Abstand von 2 Wochen {also J1, J15, J29 und J44) injiziert.

Am J57 wurde Serum entnommen, wurde der Kot gewonnen und wurden rektale Spülungen durchgeführt, um die folgenden Bestimmungen auszuführen:

  • – Bestimmung durch ELISA der Anti-gp 160-IgG im Serum,
  • – Bestimmung durch ELISA der Gesamt-IgA und -IgG sowie der spezifischen Antigp160-IgA und -IgG in den rektalen Spülungen,
  • – Bestimmung durch ELISA der Gesamt-IgA und -IgG sowie der spezifischen Antigp160-IgA und -IgG im Kot.

Die das Oligonukleotid MGC enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung wurde als eine negative Kontrolle im Vergleich mit dem Oligonukleotid 3Db(S) betrachtet. Das Oligonukleotid MGC hatte sich bei vorhergehenden Experimenten nämlich als nicht immunstimulierend erwiesen. Die erhaltenen Ergebnisse werden folglich als äquivalent mit denjenigen betrachtet, die erhalten werden, wenn man DCchol als einzigen Zusatz verwendet.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst; es sind lediglich die Mittelwerte pro Mäusegruppe, die die gleiche Zusammensetzung erhalten haben, angegeben.

Tabelle 1: Bestimmung der spezifischen IgG im Serum:

Diese Ergebnisse zeigen die von den 2 Zusätzen ausgeübte Synergie für die Produktion von IgG gegen das Antigen gp160 bei einer Verabreichung über die Schleimhäute.

Tabelle 2: Bestimmung der IgA und der IgG in den rektalen Spülungen:
Tabelle 3: Bestimmung der IgA und der IgG im Kot:

Diese Ergebnisse zeigen den Synergieeffekt, den man, wenn zugleich DCchol und immunstimulierende Oligonukleotide verwendet werden, bezüglich der lokalen Produktion von spezifischen Immunoglobulinen G und Immunoglobulinen A erzielt.

Dieses Vermögen, die Produktion von spezifischen IgA lokal zu stimulieren, ist bei der Immunisierung gegen die mit HIV verbundenen Infektionen besonders gefragt und bestätigt die Bedeutung des Gegenstands der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 4: ap160 bei Mäusen

Man verfügt über gp160, wie in Beispiel 3 beschrieben, DCchol, wie in Beispiel 1 beschrieben, und Choleratoxin CT, geliefert von der Firma Sigma unter der Artikelnummer #C-8052.

Aus diesen Produkten stellt man immunisierende Zusammensetzungen her, die entweder gp160 allein oder gp160 und DCchol oder gp160 und CT umfassen.

Die immunisierenden Zusammensetzungen werden weiblichen Mäusen BALB/c By J Ico nasal verabreicht. Die intranasalen Immunisierungen werden 4 Mal in einer Menge von 2 × 5 &mgr;l in jedes Nasenloch (d.h. 2 × 5 &mgr;l morgens und 2 × 5 &mgr;l nachmittags) ausgeführt.

Die verabreichten Mengen pro Dosis sind die folgenden: 25 &mgr;g gp160, 200 &mgr;g DCchol und 5 &mgr;g CT.

Die Immunisierungen finden an den Tagen 1, 13, 30 und 59 statt.

Die Blutentnahmen wurden am retroorbitären Sinus an den Tagen 42 und 75, also jeweils nach 3 und 4 Immunisierungen ausgeführt.

Die Vaginalsekrete wurden nach der 3. und nach der 4. Immunisierung entnommen.

Die Rektalsekrete wurden nach Tötung der Mäuse entnommen.

Die Nasensekrete wurden am Ende des Tests durch eine Nasen-Rachen-Spülung entnommen.

Die Bestimmungen der gesamten und der für gp160 spezifischen IgA und IgG wurden durch ELISA in den Seren, den Nasen-, Vaginal- und Rektalsekreten ausgeführt.

Zusammengefasst wurden NUNC Maxisorp F96-Platten mit Anti-IgA- oder Anti-IgG Antikörpern von Mäusen oder mit gp160 MN/LAI-2 sensibilisiert und mit Serienverdünnungen von Serum oder Sekret inkubiert. Die gesamten und spezifischen IgA oder IgG wurden durch ein Anti-IgA- oder Anti-IgG-Peroxidasekonjugat von der Maus nach Zugabe von OPD (O-Phenylendiamin Dihydrochlorid) aufgezeigt.

Für jedes Sekret wurden die Anti-gp160-IgA- oder -IgG-Titer durch die Titer an Gesamt-IgA oder -IgG dividiert (normierte spezifische Aktivitäten, ASN, genannte Verhältnisse), um die Entnahmen untereinander vergleichen zu können.

Die erhaltenen Ergebnisse bezüglich der Serumantikörper sind in der folgenden Tabelle 4 wiedergegeben, worin man sieht, dass DCchol ein guter Zusatz ist, ohne jedoch die Aktivität von CT zu erreichen, aber dieses führte zur Beobachtung von Vergiftungsanzeichen.

Tabelle 4

Die Ergebnisse bezüglich der bei den Nasen-Rachen-Entnahmen bestimmten Antikörper sind in der folgenden Tabelle 5 wiedergegeben. Es sind nur die Mittelwerte der erhaltenen Ergebnisse nach 4 Immunisierungen angegeben. Die Analyse der normierten spezifischen Aktivitäten (ASN) zeigt trotz der großen individuellen Schwankung der Verhältnisse eine ausgeprägte Wirkung von DCchol als Zusatz auf die IgA-Reaktionen. Bezogen auf gp160 allein waren die ASN im Mittel um einen Faktor 12 erhöht. So erwies sich bei einer bestimmten Anzahl von Mäusen eine Mehrheit der geernteten IgA in den Nasen-Rachen-Spülungen als spezifisch für das verabreichte Antigen.

Dagegen ermöglichte es der Zusatz des Stands der Technik, CT, trotz seiner starken positiven Wirkung beim Serum nicht, die lokalen IgA-Reaktionen zu erhöhen.

Tabelle 5

Die Ergebnisse bezüglich der bei den Vaginalentnahmen gemessenen Reaktionen sind in der folgenden Tabelle 6A (für die IgG) und 6B (für die IgA) wiedergegeben, worin nur die Mittelwerte der Ergebnisse angegeben sind. Wie für die Nasen-Rachen-Entnahmen stellt man auch hier eine gute Reaktion bei den IgG und den IgA, die mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erzielt wird, fest, wenn auch die ASN der IgA geringer als zuvor sind, wobei die ASN der IgG in der gleichen Größenordnung liegen.

Diese Ergebnisse zeigen, dass man durch eine Verabreichung über die Schleimhäute unter Verwendung der erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen eine Reaktion in einem anderen, von der Immunisierungsstelle sehr entfernten Schleimhautgebiet induzieren kann.

Tabelle 6A
Tabelle 6B

Die Ergebnisse bezüglich der Rektalentnahmen sind in der folgenden Tabelle 7 wiedergegeben, worin man sieht, dass die IgA-Reaktionen relativ gering sind, worin man aber dagegen die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen bezüglich der produzierten IgG feststellt.

Tabelle 7
Beispiel 5: gp160 beim Makaken

Man verfügt auf die gleiche Weise wie im vorhergehenden Beispiel über gp160, DCchol und Choleratoxin CT und man stellt aus diesen Produkten immunisierende Zusammensetzungen her, die entweder gp160 allein oder gp160 und DCchol oder gp160 und CT umfassen.

Man möchte die Wirksamkeit dieser Zusammensetzungen bei den Primaten in einem vollständig über die Schleimhäute gehenden Verabreichungsprotokoll insbesondere auf die in den Schleimhäuten, aber auch im Serum ausgelöste Reaktion untersuchen.

Dazu teilt man 12 weibliche Rhesusaffen in 3 Gruppen auf, die man gleichzeitig nasal, vaginal und rektal 5 Mal hintereinander (nämlich an den Tagen 1, 29, 57, 85 und 190) mit den folgenden Impfzusammensetzungen immunisiert:

  • – nur gp160 in einer Menge von 50 &mgr;g pro Verabreichungsweg und Tier,
  • – gp160 und DCchol in einer Menge von 50 &mgr;g gp160 und 400 &mgr;g DCchol pro Weg und Tier,
  • – gp160 und CT in einer Menge von 50 &mgr;g gp160 und 50 &mgr;g CT pro Weg und Tier.

Die verabreichten Volumina sind die folgenden:

  • – nasal: 100 &mgr;l in jedes Nasenloch,
  • – vaginal: 200 &mgr;l,
  • – rektal: 1000 &mgr;l.

Die Entnahmen wurden zu den folgenden Zeiten ausgeführt:

  • – Seren: J-11/-4, 1, 29, 57, 71, 99, 184 und 203
  • – Vaginalsekrete: J-11, 71/78, 99/106, 184 und 203/212
  • – Nasensekrete: J-11, 71, 99, 184 und 203

Die Vaginalentnahmen wurden zweifach mit 7 oder 9 Tagen Abstand ausgeführt, um eine etwaige Verunreinigung durch die Menstruationen zu vermeiden.

Die Bestimmungen der IgG und IgA wurden durch ELISA ausgeführt.

Um sich von dem Verdünnungsfaktor, der in die Schleimhautsekrete bei den Entnahmen durch Spülung eingeführt wird, freizumachen, wurden die Anti-gp160-IgA- und -IgG Titer jeweils durch die Titer an Gesamt-IgA und -IgG normiert (normierte spezifische Aktivitäten genannte Verhältnisse).

Die in den Seren gemessenen Ergebnisse bezüglich der Anti-gp160-IgG-Reaktionen sind in der 1 angegeben, worin man klar die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen insbesondere nach den 4. und 5. Immunisierungen sieht.

Die Ergebnisse bezüglich der in den Vaginalsekreten erzielten Reaktionen sind in der 2 dargestellt, worin man die Verbesserung der mit den erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen induzierten Immunreaktion im Vergleich zu den bei der Verabreichung von gp160 allein erzielten Reaktionen feststellen kann.

Die Ergebnisse bezüglich der in den Nasensekreten erhaltenen Reaktionen sind in der 3 dargestellt, worin man ebenfalls eine Verbesserung der mit den erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen erzielten Reaktionen im Vergleich zu den mit dem Antigen allein erzielten Reaktionen feststellt.

Beispiel 6: Protein Tat bei Meerschweinchen

Man verfügt über carboxymethyliertes Tat-Protein, erhalten durch Expression bei E. choli und Reinigung durch verschiedene Chromatographieschritte, dann chemische Deaktivierung, so wie dies in der Anmeldung WO99/33346 beschrieben ist.

Man stellt immunisierende Zusammensetzungen her, die entweder das Protein Tat allein in PBS-Puffer oder das Protein Tat in Gegenwart von DCchol in einer Menge von 500 &mgr;g DCchol pro Dosis umfassen. Die Impfdosen von 1 ml umfassen 50 &mgr;g Protein Tat.

Man verfügt dann über Dunkin-Hartley-Albinomeerschweinchen, die man in 2 Gruppen mit 5 Meerschweinchen aufteilt, die man intramuskulär in den Oberschenkel mit 0,5 ml pro Injektion in jeden Oberschenkel immunisiert.

Die Injektionen werden an den Tagen 1, 14, 29 und 43 ausgeführt.

Die Serumentnahmen werden an den Tagen 11, 27, 39 und 56 ausgeführt.

Die produzierten Antikörper werden durch das ELISA-Verfahren bestimmt.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der 4 dargestellt, worin man klar sieht, dass die Menge an produzierten Anti-Tat-Antikörpern mit einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eindeutig höher ist als mit einer Zusammensetzung, die nur das Antigen allein umfasst.

Beispiel 7: Protein Tat bei Mäusen

Man verfügt über carboxymethyliertes Tat-Protein, erhalten durch Expression bei E. choli und Reinigung durch verschiedene Chromatographieschritte, dann chemische Deaktivierung, so wie dies in der Anmeldung WO99/33346 beschrieben ist.

Man stellt immunisierende Zusammensetzungen her, die umfassen:

  • – Protein Tat in einer Menge von 200 &mgr;g/ml in TRIS/NaCl-Puffer,
  • – Protein Tat in einer Menge von 200 &mgr;g/ml und Aluminiumhydroxid in TRIS/NaCl-Puffer,
  • – Protein Tat in einer Menge von 200 &mgr;g/ml und DCchol, erhalten in Beispiel 1, in TRIS/NaCl-Puffer.

Man verfügt über Sprague-Dawley-Ratten, denen man die immunisierenden Zubereitungen intramuskulär an den Tagen 1, 8, 15, 29 und 43 injiziert.

Bei jeder Verabreichung führt man 2 Injektionen von 0,25 ml pro Tier aus.

An den Tagen 45 und 58 wird Blut entnommen, um durch ELISA die IgG-Antikörper gegen detoxifiziertes rekombinantes Tat zu bestimmen.

Die erhaltenen Ergebnisse, ausgedrückt als log IgG, sind in der 5 für die Ergebnisse am J45 und in der 6 für die Ergebnisse am J58 dargestellt.

Diese Ergebnisse veranschaulichen die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen im Vergleich zu Impfzusammensetzungen, die nur das Tat-Antigen umfassen.

Beispiel 8: p24 bei der Maus

Man verfügt über das Protein p24, das ein Antigen ist, das in der folgenden Veröffentlichung beschrieben wurde: Diagnostic value of HIV-Ag testing and anti-p24 titers in HIV carriers and AIDS patients. Roumeliotou A, Nestoridou E, Economidou I, Psarra E, Sidiri E, Choremi E, Kallinikos G, Papaevangelou G, AIDS 1988 Feb; 2(1): 64.

Dieses Antigen liegt mit einer Konzentration von 1 mg/ml in einer Lösung von 20 mM Natriumphosphat, 50 mM NaCl mit pH 7,5 vor.

Man verfügt auch über eine Lösung von TRIS/NaCl mit 20 mM TRIS und 150 mM NaCl mit pH 8 sowie über DCchol, erhalten gemäß Beispiel 1.

Man stellt so immunisierende Zusammensetzungen mit den folgenden Zusammensetzungen her:

  • – Gruppe 1: p24 (20 &mgr;g/Dosis)
  • – Gruppe 2: p24 (1 &mgr;g/Dosis)
  • – Gruppe 3: p24 (0,1 &mgr;g/Dosis)
  • – Gruppe 4: p24 (0,01 &mgr;g/Dosis)
  • - Gruppe 5: Kontrolle, bestehend nur aus einer Salzlösung
  • – Gruppe 6: p24 (1 &mgr;g/Dosis) + DCchol (25 &mgr;g/Dosis) in Form einer Liposomensuspension
  • – Gruppe 7: p24 (1 &mgr;g/Dosis) + DCchol (25 &mgr;g/Dosis) in Squalen/Tween®80-Emulsion, worin die Menge an Squalen 5 mg/Dosis beträgt und die Menge an Tween®80 600 &mgr;g/Dosis beträgt. Die Emulsion wird durch Mischen von 1 g Squalen in 20 ml TRIS/NaCl, das Tween®80 und DCchol enthält, erhalten, mit dem Ultraturrax 1 min lang bei 13500 Umdr./min. homogenisiert, dann vor dem Filtrieren mikroemulgiert. Die Tropfen der so erhaltenen Emulsion haben eine mittlere Größe um 150 nm.

Die verschiedenen immunisierenden Zusammensetzungen werden BALB/c-Mäusen, die in 6er-Gruppen aufgeteilt sind, verabreicht, wobei jede Gruppe eine andere Zusammensetzung erhält.

Jede der Mäuse erhält subkutan eine Dosis von 200 &mgr;l am J1 und am J21.

Am J14 und 35 werden Entnahmen ausgeführt, um die Bestimmungen von Serumantikörpern auszuführen. Am J37 werden die Tiere getötet.

5-tägige Tests zur Proliferation als Reaktion auf rekombinantes Protein p24 (5 &mgr;g/ml) werden ausgeführt.

Man führt auch Bestimmungen bezüglich der Produktion von IL5 und IFN&ggr; im Überstand von Milzzellen aus, die 5 Tage lang in vitro mit 10 mg/ml rekombinantem p24 stimuliert werden oder nicht.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in den 7 bis 13 illustriert.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die Titer an IgG1-Antikörpern am J14 und am J35 (7 und 9) mit den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen besser sind als mit Impfzusammensetzungen, die bei gleicher Antigenkonzentration nur das Antigen umfassen, und dass am J35 eine der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auch die Produktion von IgG2a-Antikörpern induzieren kann (10), was für die Induktion einer Reaktion vom TH1-Typ charakteristisch ist.

Außerdem führen die erfindungsgemäßen Impfzusammensetzungen zu einem größeren Proliferationsindex als die Zusammensetzungen, die nur das Antigen enthalten (11).

Die Ergebnisse der Bestimmungen der Cytokine IFN&ggr; und IL5 (12 und 13) zeigen, dass, wenn man eine erfindungsgemäße Impfzusammensetzung verwendet, die Mengen an produzierten Cytokinen ebenfalls erhöht sind.


Anspruch[de]
  1. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die wenigstens ein HIV-Antigen und DCchol umfasst, für die Herstellung eines Medikaments für die Immunisierung gegen die mit HIV verbundenen Infektionen, das über die Schleimhäute verabreicht werden soll.
  2. Verwendung gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament zur Induktion von Ig G- oder Ig A-Antikörpern, die für ein HIV-Antigen spezifisch sind, in den Schleimhautgeweben eines Säugers bestimmt ist.
  3. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das HIV Antigen gp160 ist.
  4. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das HIV Antigen p24 ist.
  5. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das HIV Antigen das Protein Tat ist.
  6. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung außerdem ein immunstimulierendes Oligonukleotid umfasst.
  7. Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die pharmazeutische Zusammensetzung in Form einer Emulsion vorliegt.
Es folgen 10 Blatt Zeichnungen






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