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Dokumentenidentifikation DE69925856T2 11.05.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001131409
Titel VERFAHREN ZUR KLONIERUNG VON SCHWEINEN
Anmelder Infigen ,Inc., Deforest, Wis., US
Erfinder DAMIANI, Philip, Madison, US;
BETTHAUSER, M., Jeffrey, Windsor, US;
FORSBERG, J., Erik, Fitchburg, US;
BISHOP, D., Michael, Rio, US
Vertreter Viering, Jentschura & Partner, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69925856
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 12.11.1999
EP-Aktenzeichen 999589005
WO-Anmeldetag 12.11.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/26710
WO-Veröffentlichungsnummer 0000031237
WO-Veröffentlichungsdatum 02.06.2000
EP-Offenlegungsdatum 12.09.2001
EP date of grant 15.06.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 11.05.2006
IPC-Hauptklasse C12N 5/06(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A01K 67/027(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Klonierung von Schweinen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die nachfolgende Diskussion des Hintergrunds der Erfindung dient allein dazu, dem Leser das Verständnis der Erfindung zu erleichtern, und ist nicht als Beschreibung oder Bestandteil des Standes der Technik der vorliegenden Erfindung zulässig.

Forscher haben während der vergangenen beiden Dekaden Verfahren zur Klonierung von Säugetieren entwickelt. Einige der publizierten Verfahren umfassen die Schritte: (1) Isolieren einer Zelle, meistens einer embryonalen Zelle; (2) Inserieren dieser Zelle oder eines Kerns, der aus der Zelle isoliert wurde, in eine entkernte Oocyte (zum Beispiel wurde der Nukleus vorher extrahiert); und (3) Maturierenlassen des Embryos in vivo.

Das erste erfolgreiche nukleäre Transferexperiment unter Verwendung von Säugetierzellen wurde 1983 publiziert, wobei Pronuklei, die aus einer murinen (Maus) Zygote isoliert wurden, in eine entkernte Oocyte inseriert wurden und lebende Nachkommen erbrachten. McGrath & Solter, 1983, Science 220: 1300–1302. Danach beschrieben andere die Herstellung chimärer muriner Embryos (zum Beispiel Embryos, die eine Untermenge an Zellen enthalten, die gegenüber anderen Zellen des Embryos eine signifikant unterschiedliche nukleäre DNA aufweisen) unter Verwendung muriner primordialer Keimzellen (PGCs). Diese Zellen sind und können zu pluripotenten Zellen führen. Matsui et al., 1992, Cell 70: 841–847 und Resnick et al., 1992, Nature 359: 550; Kato et al., 1994, Journal of Reproduction and Fertility Abstract Series, Society For the Study of Fertility, Annual Conference, Southampton, 13: 38. Forscher berichteten 1998, dass murine Kumuluszellen als nukleäre Donoren in Klonierungsverfahren zur Herstellung klonierter muriner Tiere verwendet werden können. Wakayama et al., 1998, Nature 394: 369–374.

Ein weiteres nukläres Transferexperiment wurde 1986 publiziert, wobei eine ovine (Schaf) embryonale Zelle als nukleärer Donor in einem Klonierungsverfahren verwendet wurde, aus dem ein kloniertes Lamm hervorging. Willadsen, 1986, Nature 320: 63–65. Kürzlich wurde über weitere Lämmer berichtet, die aus ovinen embryonalen Zellen, serumfreien (serum deprived) somatischen Zellen, aus embryonalen Discs isolierten Zellen und aus somatischem Brustgewebe (mammary tissue) kloniert wurden. Campbell et al., 1996, Nature 380: 64–66; PCT Publikation WO 95/20042; Wilmut et al., 1997, Nature 385: 10–813; und PCT Publikationen WO 96/07732 and WO 97/07669. Weitere Ansätze zur Klonierung oviner Tiere beinhalteten die Manipulation des Aktivierungszustandes einer in vivo maturierten Oocyte nach dem nukleärem Transfer. PCT Publikation WO 97/07668. Publikationen, die klonierte Lämmer offenbaren, berichten über eine Klonierungseffizienz, die bestenfalls bei ungefähr 0.4% liegt. Die Klonierungseffizienz, wie für die vorangegangene Abschätzung kalkuliert, entspricht einem Verhältnis aus der Anzahl der klonierten Lämmer dividiert durch die Anzahl der nukleären Transfers, die zur Herstellung dieser Anzahl klonierter Lämmer verwendet wurde.

Ein weiteres nukleäres Transferexperiment erbrachte ein kloniertes bovines Tier (Kalb), wobei das Tier unter Verwendung einer embryonalen Zelle kloniert wurde, die aus einem Embryo im 2–64 Zellstadium als nukleärem Donor stammte. Dieses bovine Tier wurde, wie berichtet wurde, mit Hilfe von Transfertechniken kloniert, wie sie in den U.S. Patenten 4,994,384 und 5,057,420 dargelegt wurden. Andere berichteten, dass klonierte bovine Embryos erzeugt wurden, wobei eine Zelle der inneren Zellmasse (inner cell mass) eines Embryos im Blastozystenstadium als nukleärer Donor in einem nuklären Transferverfahren verwendet wurde. Sims & First, 1993, Theriogenology 39: 313 und Keefer et al., 1994, Mol. Reprod. Dev. 38: 264–268. Zusätzlich berichtet eine weitere Publikation darüber, dass klonierte bovine Embryos durch nukleäre Transfertechniken erzeugt wurden, die eine PGC als nukleären Donor verwenden, welche aus fötalem Gewebe isoliert wurde. Delhaise et al., 1995, Reprod. Fert. Develop. 7: 1217–1219; Lavoir 1994, J. Reprod. Dev. 37: 413–424; und PCT Anmeldung WO 95/10599 mit dem Titel "Embryonic Stem Cell-Like Cells".

Im Hinblick auf porcine Tiere (Schwein) haben Forscher Verfahren zum Erhalt chimärer Tiere berichtet, besonders wobei ein nukleärer Donor in eine entkernte embryonalen Zelle eingebracht wurde. Prather et al., 1989, Biology of Reproduction 41: 414–418; Piedrahita et al., 1998, Biology of Reproduction 58: 1321–1329; und WO 94/26884, "Embryonic Stem Cells for Making Chimeric and Transgenic Ungulates," Wheeler, veröffentlicht am 24. November 1994.

Forscher haben ebenfalls nukleäre Transferexperimente für nukleäre Donoren aus Schweinen und Schweineoocyten publiziert. Siehe zum Beispiel Nagashima et al., 1997, Mol. Reprod. Dev. 48: 339–343; Nagashima et al., 1992, J. Reprod. Dev. 38. 73–78; Prather et al., 1989, Biol. Reprod. 41. 414–419; Prather et al., 1990, Exp. Zool. 255: 355–358; Saito et al., 1992, Assis. Reprod. Tech. Andro. 259: 257–266; und Trelouw et al., 1992, Theriogenology 37: 309.

Zusätzlich haben Forscher Verfahren zur Aktivierung von Schweineoocyten publiziert. Grocholová et al., 1997, J. Exp. Zoology 277: 49–56; Schoenbeck et al., 1993, Theriogenology 40: 257–266; Prather et al., 1991, Molecular Reproduction and Development 28: 405–409; Jolliff & Prather, 1997, Biol. Reprod. 56: 544–548; Mattioli et al., 1991, Molecular Reproduction and Development 30: 109–125; Terlouw et al., 1992, Theriogenology 37: 309; Prochazka et al., 1992, J. Reprod. Fert. 96: 725–734; Funahashi et al., 1993, Molecular Reproduction and Development 36: 361–367; Prather et al., Bio. Rep. Vol. 50 Sup 1: 282; Nussbaum et al., 1995, Molecular Reproduction and Development 41: 70–75; Funahashi et al., 1995, Zygote 3: 273–281; Wang et al., 1997, Biology of Reproduction 56: 1376–1382; Piedrahita et al., 1989, Biology of Reproduction 58: 1321–1329, Macháty et al., 1997, Biology of Reproduction 57: 85–91; und Macháty et al., 1995, Biology of Reproduction 52: 753–758.

Seit langem besteht jedoch ein Bedarf für Materialien und Verfahren, die zu einem effizienten nukleären Transfer unter Verwendung eines nukleären porcinen Donors führen. Dieser seit langem bestehende Bedarf basiert zum Teil auf einer potentiellen medizinischen Anwendung, die als Xenotransplantation bekannt ist, welche Verfahren zur Extraktion von Organen aus Schweinen und Transplantation dieser Organe in Menschen umfasst, welche derartiger Organe bedürfen. U.S. Patent Nr. 5,589,582, Hawley et al., erteilt am 31. Dezember 1991; PCT Anmeldung WO 95/28412, Baetsher et al., veröffentlicht am 26. Oktober 1995; PCT Anmeldung WO 96/06165, Sachs et al., veröffentlicht am 29. Februar 1996; PCT Anmeldung WO 93/16729, Bazin, veröffentlicht am 2. September 1993; PCT Anmeldung WO 97/12035, Diamond et al., veröffentlicht am 3. April, 1997; PCT Anmeldung WO 98/16630, Piedrahita & Bazer, veröffentlicht am 23. Apri, 1998.

ZUSAMMENFASSUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines klonierten Schweineembryos (porcine embryo; porciner Embryo), ein nicht-chirurgisches Verfahren zur Erzeugung eines klonierten Schweinefötus (porcine fetus; porciner Fötus) und ein nicht-chirurgisches Verfahren zur Erzeugung eines lebendgeborenen klonierten Schweins (porcine animal; porcines Tier).

Die vorliegende Erfindung schafft zahlreiche Vorteile gegenüber Werkzeugen und Verfahren, die gegenwärtig zur Klonierung von Schweinen verwendet werden. Derartige Merkmale und Vorteile umfassen:

Ein Verfahren zur Erzeugung eines klonierten Schweineembryos, wobei dieses Verfahren umfasst:

  • (a) Maturieren einer Schweineoocyte für einen Zeitraum von 42 bis 46 Stunden;
  • (b) Translozieren einer totipotenten nukleären Donorzelle oder eines Kerns davon in eine entkernte Schweineoocye, um eine nukleäre Transferoocyte herzustellen; und
  • (c) Aktivieren der nukleären Transferoocyte, um das Schweineembryo herzustellen.
Ein nicht-chirurgisches Verfahren zur Erzeugung eines klonierten Schweinefötus, wobei das Verfahren umfasst:
  • (a) Erzeugen eines klonierten Schweineembryos mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens; und
  • (b) Implantieren des klonierten Schweineembryos in den Uterus eines Mutterschweins, um sich zum klonierten Fötus zu entwickeln.
Ein nicht-chirurgisches Verfahren zur Erzeugung eines lebendgeborenen klonierten Schweins, wobei dieses Verfahren umfasst:
  • (a) Erzeugen eines klonierten Embryos mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens; und
  • (b) Implantieren des klonierten Schweineembryos in den Uterus des Mutterschweins, um einen Fötus zu erzeugen, der die vollständige fötale Entwicklung und die Geburt durchläuft, um das lebendgeborene Schwein zu generieren.

Die Klonierungseffizienz kann ausgedrückt werden als das Verhältnis zwischen der Anzahl an Embryos, die aus dem nukleären Transfer resultieren, und der Anzahl an nukleären Transfers, die zur Erzeugung der Embryos durchgeführt wurden.

Alternativ kann die Klonierungseffizienz ausgedrückt werden als das Verhältnis zwischen der Anzahl lebendgeborener Tiere und der Anzahl nukleärer Transfers, die zur Erzeugung dieser Tiere durchgeführt wurden.

Kultivierte Zellen

Es wird eine totipotente Schweinezelle beschrieben, wobei die totipotente Zelle selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt.

Der Begriff "porcin", wie hier verwendet, kann ein beliebiges Tier aus der Familie Suidae bezeichnen. Ein porcines Tier kann ein Schwein einer beliebigen Art bezeichnen einschließlich, aber nicht beschränkt auf Wildschwein, Hausschwein, Zwergschwein, Warzenschwein, Pekari und Barboosa. Für Zwergschweine siehe zum Beispiel Bustad & McClellan, 1968. Lab. Anim. Care. 18: 280–287 und England & Panepinto, 1986, "Conceptual and operational history of the development of miniature swine," Swine in Biomedical Research (M. E. Tubleson, Hrsg.), Plenum Press, NY S. 17–22.

Der Begriff "totipotent", wie hier verwendet, kann eine Zelle bezeichnen, die ein lebendgeborenes Tier erzeugt. Der. Begriff "totipotent" kann ebenfalls eine Zelle bezeichnen, die zu allen Zellen in einem bestimmten Tier führt. Eine totipontent Zelle kann zu allen Zellen eines Tieres führen, wenn sie in einem Verfahren zur Entwicklung eines Embryos aus einem oder mehr nukleären Transferschritten verwendet wird. Totipotente Zellen können ebenfalls verwendet werden, um unvollständige Tiere zu erzeugen, wie zum Beispiel diejenigen, die zur Organentnahme (organ harvesting) zweckdienlich sind, zum Beispiel diejenigen, die genetische Modifikationen aufweisen, um das Wachstum eines Organs oder eines Fortsatzes durch Manipulation eines homeotischen Gens zu eliminieren.

Der Begriff "lebendgeboren", wie hier verwendet, bezeichnet vorzugsweise ein Tier, das ex utero existiert. Ein "lebendgeborenes" Tier kann ein Tier sein, das mindestens eine Sekunde von dem Zeitpunkt lebt, seit dem es in seiner Mutter (maternal host) existiert. Ein "lebendgeborenes" Tier braucht für sein Überleben kein Kreislaufsystem einer in utero Umgebung. Ein "lebendgeborenes" Tier kann ein gehfähiges Tier sein. Solche Tiere können prä- und post-pubertäre Tiere umfassen. Wie oben diskutiert, kann einem lebendgeborenen Tier ein Teil dessen fehlen, was ein normales Tier seiner Art aufweist.

In bevorzugten Ausführungsformen, die keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, werden die totipotenten Zellen (1) kultiviert; (2) als Zelllinien kultiviert; und (3) als permanente Zelllinien kultiviert.

Der Begriff "kultiviert", wie hier im Zusammenhang mit Zellen verwendet, kann eine oder mehr Zellen bezeichnen, die in einer in vitro Umgebung eine Zellteilung durchlaufen oder keine Zellteilung durchlaufen. Eine in vitro Umgebung kann ein beliebiges, im Stand der Technik bekanntes Medium sein, das zum Erhalt der Zellen in vitro geeignet ist, wie zum Beispiel geeignete Flüssigmedien oder Agar. Spezifische Beispiele für geeignete in vitro Umgebungen für Zellkulturen werden beschrieben in Culture of Animal Cells: a manual of basic techniques (3. Auflage), 1994, R. I. Freshney (Hrsg.), Wile-Liss, Inc.; Cells: a laboratory manual (Vol. 1), 1998, D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand (Hrsg.), Cold Spring Habor Laboratory Press; und Animal Cells: culture and media, 1994, D. C. Darling, S. J. Morgan John Wiley and Sons, Ltd. Zellen können in Suspension und/oder in Monolayern mit einer oder mehr im wesentlichen gleichen Zellen kultiviert werden. Zellen können in Suspension und/oder in Monolayern mit einer heterogenen Population von Zellen kultiviert werden. Der Begriff "heterogen", wie im vorangegangen Satz verwendet, kann beliebige Zellcharakteristika bezeichnen, wie zum Beispiel Zelltyp und Phase des Zellzyklus. Zellen können zum Beispiel in Suspension kultiviert werden, als Monolayer angeheftet an einen festen Träger kultiviert werden und/oder auf einer Schicht aus Feeder-Zellen kultiviert werden. Der Begriff "Feeder-Zellen" wird anschließend definiert. Weiterhin können Zellen erfolgreich durch Ausplattieren der Zellen unter Bedingungen kultiviert werden, unter denen die Zellen keinen Zell/Zell-Kontakt aufweisen. Vorzugsweise durchlaufen die kultivierten Zellen eine Zellteilung und werden mindestens 5 Tage kultiviert, vorzugsweise mindestens 10 Tage oder 20 Tage und am meisten bevorzugt mindestens 30 Tage. Vorzugsweise stirbt (terminate) eine signifikante Anzahl der kultivierten Zellen nicht ab, während sie sich in Kultur befinden. Die Begriffe "absterben" und "signifikante Anzahl" werden anschließend definiert. Beinahe jeder Zelltyp kann unter Zellkulturbedingungen kultiviert werden. Kultivierte Zellen können verwendet werden, um eine Zelllinie zu erzeugen.

Der Begriff "Zelllinie", wie hier verwendet, kann kultivierte Zellen bezeichnen, die mindestens einmal ohne Absterben passagiert werden können. Es werden Zelllinien beschrieben, die mindestens ein-, zwei-, fünf-, zehn-, 15-, 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 80-, 100-, und 200-mal passagiert werden könne. Das Passagieren von Zellen wird anschließend definiert.

Der Begriff "absterbend" (terminating) und "absterben" (terminate), wie hier in Bezug auf kultivierte Zellen verwendet, kann Zellen bezeichnen, die einen Zelltod erleiden, der mit Hilfe vielfältiger, Fachleuten bekannter Verfahren gemessen werden kann. (zum Beispiel CytoTox96® Cytotoxicity Assay, Promega, Inc. Katalog Nr. G1780; Celltiter 96® Aqueous Cell Proliferatioln Assay Kit, Promega, Inc. Katalog Nr. G3580; und Trypan Blue solution for cytotoxicity assays, Sigma Katalog Nr. T6146). Ein Absterben kann ferner das Ergebnis von Apoptose sein, die mit Hilfe zahlreicher, Fachleuten bekannter Verfahren gemessen werden kann (zum Beispiel Dead EndTM Apoptosis Detection Kit, Progema, Inc. Katalog Nr. G7130). Abgestorbene Zellen können als diejenigen identifiziert werden, die Zelltod und/oder Apoptose erlitten haben, und die von einer festen Oberfläche in die Kultur freigesetzt wurden. Zusätzlich können abgestorbenen Zellen intakte Membranen fehlen, die mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren identifiziert werden könne. Abgestorbene Zellen können ebenfalls eine verminderte metabolische Aktivität aufweisen, die zum Teil durch eine verminderte mitochondriale Aktivität hervorgerufen werden kann, welche zum Beispiel durch Rhodamin 1, 2, 3 identifiziert werden kann. Weiterhin kann "absterben" Zellkulturen bezeichnen, in denen eine signifikante Zahl kultivierter Zellen abstirbt. Der Begriff "signifikante Zahl" im vorangegangenen Satz kann sich auf etwa 80% der Zellen in der Kultur beziehen, vorzugsweise auf etwa 90% der Zellen in der Kultur, noch mehr bevorzugt auf etwa 100% der Zellen in der Kultur, und am meisten bevorzugt auf 100% der Zellen in der Kultur.

Der Begriff "Suspension", wie hier verwendet, kann Zellkulturbedingungen bezeichnen, unter denen die Zellen nicht an einem festen Träger angeheftet sind. In Suspension proliferierende Zellen können während der Proliferation unter Verwendung einer Fachleuten bekannten Vorrichtung gerührt werden.

Der Begriff "Monolayer", wie hier verwendet, kann Zellen bezeichnen, die an einen festen Träger angeheftet sind, während sie unter geeigneten Kulturbedingungen proliferieren. Ein kleiner Teil der Zellen, die in einem Monolayer unter geeigneten Wachstumsbedingungen proliferieren, können an Zellen im Monolayer, nicht aber am festen Träger angeheftet sein. Vorzugsweise sind weniger als 15% dieser Zellen nicht an den festen Träger angeheftet, bevorzugt sind weniger als 10% dieser Zellen nicht an den festen Träger angeheftet, und am meisten bevorzugt sind weniger als 5% dieser Zellen nicht an den festen Träger angeheftet.

Der Begriff "im wesentlichen gleich", wie hier in Bezug auf Schweinezellen verwendet, kann sich auf Zellen des gleichen Organismus und des gleichen Gewebes beziehen. Der Begriff "im wesentlichen gleich" kann sich auch auf Zellpopulationen beziehen, die sich nicht signifikant differenziert haben. Vorzugsweise haben sich etwa weniger als 15% der Zellen in einer Population von Zellen differenziert, bevorzugt haben sich weniger als 10% der Zellpopulation differenziert, und am meisten bevorzugt haben sich weniger als 5% der Zellpopulation differenziert.

Der Begriff "plattiert" oder "plattieren", wie hier in Bezug auf Zellen verwendet, kann sich auf die Erzeugung von Zellkulturen in vitro beziehen. Beispielsweise können Zellen in Zellkulturmedien verdünnt und im Anschluss in eine Zellkulturplatte, -schale oder -flache gegeben werden. Zellkulturplatten sind Durchschnittsfachleuten üblicherweise bekannt. Zellen können in einer Vielzahl von Konzentrationen und/oder Zelldichten plattiert werden.

Der Begriff "Plattieren von Zellen" kann ferner zum Begriff "Passagieren von Zellen" ausgeweitet werden. Die Zellen der Erfindung können mit Hilfe Fachleuten bekannter Zellkulturverfahren passagiert werden. Der Begriff "Passagieren von Zellen" kann sich auf ein Verfahren beziehen, dass die Schritte umfasst: (1) Freisetzen der Zellen von einem festen Träger oder Substrat und Dissoziation dieser Zellen, und (2) Verdünnen der Zellen in Medien, die für die weitere Zellproliferation geeignet sind. Passagieren von Zellen kann sich ferner das Entfernen eines Teils des Flüssigmediums, das die kultivierten Zellen enthält, und das Hinzufügen von Flüssigmedium zum ursprünglichen Kulturgefäß bezeichnen, um die Zellen zu verdünnen und die weitere Zellproliferation zu ermöglichen. Zusätzlich können auch Zellen in ein neues Kulturgefäß überführt werden, das mit einem für die weitere Zellproliferation geeigneten Medium supplementiert wurde.

Der Begriff "Proliferation", wie hier in Bezug auf Zellen verwendet, kann sich auf eine Gruppe von Zellen beziehen, deren Zahl während einer bestimmten Zeitperiode zunehmen kann.

Der Begriff "Konfluenz", wie hier verwendet, kann sich auf eine Gruppe von Zellen beziehen, wobei ein hoher Prozentanteil der Zellen physikalisch mit mindestens einer anderen Zelle in dieser Gruppe in Kontakt steht. Konfluenz kann ebenfalls definiert werden als eine Gruppe von Zellen, die unter den bereitgestellten Bedingungen bis zu einer maximalen Zelldichte wächst. Falls zum Beispiel eine Gruppe von Zellen in einem Monolayer proliferieren kann, und diese in eine Kulturgefäß in ein geeignetes Wachstumsmedium gegeben wird, sind diese Zellen konfluent, wenn sich der Monolayer über einen signifikanten Oberflächenbereich des Kulturgefäßes ausgedehnt hat. Der mit den Zellen bedeckte Oberflächenbereich repräsentiert vorzugsweise etwa 50% des gesamten Oberflächenbereichs, noch bevorzugter repräsentiert er etwa 70% des gesamten Oberflächenbereichs und am meisten bevorzugt repräsentiert er etwa 90% des gesamten Oberflächenbereichs.

Der Begriff "permanent" oder "immortalisiert", wie hier in Bezug auf Schweinezellen verwendet, kann sich auf Zellen beziehen, die eine Zellteilung durchlaufen und sich hinsichtlich der Zellzahlen verdoppeln können, während sie in einer in vitro Umgebung viele Male kultiviert werden, bis die Zellen absterben. Eine permanente Zelllinie kann sich mehr als 10-mal verdoppeln, bevor eine signifikante Zahl an Zellen in der Kultur abstirbt. Vorzugsweise kann sich eine permanente Zelllinie mehr als 20-mal oder mehr als 30-mal verdoppeln, bevor eine signifikante Zahl an Zellen in der Kultur abstirbt. Noch bevorzugter kann sich eine permanente Zelllinie über 40-mal oder 50-mal verdoppeln, bevor eine signifikante Zahl an Zellen in der Kultur abstirbt. Am meisten bevorzugt kann sich eine permanente Zelllinie über 60-mal verdoppeln, bevor eine signifikante Zahl an Zellen in der Kultur abstirbt. Der Begriff "absterben" wurde oben beschrieben. Eine Zellverdopplung kann durch Zählen der Zellzahlen in der Kultur mit Hilfe von Durchschnittsfachleuten bekannten Verfahren bestimmt werden. Als ein Maß für die Zellkulturdauer (permanence) kann die Anzahl von Verdopplungen gemessen werden, bis eine signifikante Zahl an Zellen in der Kultur abstirbt. Der Begriff "signifikante Zahl" wurde ebenfalls oben beschrieben.

Permanente Zellen können von nicht-permanenten Zellen auf der Grundlage unterschieden werden, dass permanente Zellen in geringeren Dichten passagiert werden können als nicht-permanente Zellen. Insbesondere können permanente Zellen bis zur Konfluenz angezogen werden (anschließend beschrieben), wenn die Bedingungen der Plattierung keinen physischen Kontakt zwischen den Zellen erlauben. Daher können permanente Zellen von nicht-permanenten Zellen unterschieden werden, wenn die Zellen in Zelldichten plattiert werden, bei denen die Zellen nicht physisch in Kontakt miteinander stehen.

(1) Totipotente Zellen, wobei die totipotente Zellen selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, sind nicht positiv für alkalische Phosphatase (die Zellen zeigen zum Beispiel keine nennenswerte Färbung für alkalische Phosphatase); (2) totipotente Zellen entstehen aus mindestens einer Vorläuferzelle (precursor cell); (3) eine Vorläuferzelle wird isoliert aus und/oder entsteht aus einer beliebigen Region eine Schweins; (4) eine Vorläuferzelle wird isoliert aus und/oder entsteht aus einer beliebigen Zelle in Kultur; (5) eine Vorläuferzelle wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus einer nicht-embryonalen Zelle, einer nicht-fötalen Zelle; einer differenzierten Zelle, einer undifferenzierten Zelle, einer somatischen Zelle, einer embryonalen Zelle, einer fötalen Zelle, einer embryonalen Stammzelle, einer primordialen Keimzelle, einer Zelle der Keimleiste, einer Kumuluszelle, einer amniotischen Zelle, einer fötalen Fibroblastenzelle, einer Hepatocyte, einer embryonalen Keimzelle, einer adulten Zelle, einer aus einer asynchronen Population von Zellen isolierten Zelle und einer aus einer synchronisierten Population von Zellen isolierten Zelle besteht, wobei die synchrone Population nicht im G0 Zustand des Zellzyklus arretiert ist; (6) totipotente Zellen weisen eine Morphologie embryonaler Keimzellen auf.

Der Begriff "positiv für alkalische Phosphatase", wie hier verwendet, kann sich auf die detektierbare Präsenz zellulärer alkalischer Phosphatase beziehen. Zellen, die nicht positiv für alkalische Phosphatase sind, zeigen keine nennenswerte Färbung bei Verwendung eines Verfahrens zur Visualisierung zellulärerer alkalischer Phosphatase. Verfahren zum Detektieren der Gegenwart zellulärerer alkalischer Phosphatase sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe zum Beispiel Matsui et al., 1991, "Effect of Steel Factor and Leukemia Inhibitory Factor on Murine Primordial Germ Cells in Culture," Nature 353: 750–752. Beispiele für Zellen, die eine nennenswerte Färbung für alkalische Phosphatase zeigen, sind dem Stand der Technik bekannt. Siehe zum Beispiel das U.S. Patent 5,453,357 mit dem Titel "Pluripotent Embryonic Stem Cells and Methods of Making Same," erteilt an Hogan am 26. September 1995.

Der Begriff "Vorläuferzelle" oder "Vorläuferzellen", wie hier verwendet, kann eine Zelle oder Zellen bezeichnen, die zur Erzeugung kultivierter Schweinezellen oder einer kultivierten Schweinezelllinie verwendet werden. Eine Vorläuferzelle oder Vorläuferzellen können aus nahezu jeder zellulären Einheit isoliert werden. Beispielsweise können eine Vorläuferzelle oder Vorläuferzellen aus Blastozysten, Embryos, Föten und Zelllinien isoliert werden (zum Beispiel Zelllinien, die aus embryonalen Zellen erzeugt wurden), werden vorzugsweise aus Föten und/oder Zelllinien isoliert, die aus fötalen Zellen erzeugt wurden, und werden noch bevorzugter aus ex utero Tieren und/oder Zellkulturen und/oder Zelllinien isoliert, die aus solchen ex utero Tieren etabliert wurden. Ein ex utero Tier kann als neugeborenes Tier vorliegen (zum Beispiel 5 Tage nach der Geburt), als heranwachsendes (adolescent) Tier (zum Beispiel als präpubertierendes Tier), als pubertierendes Tier (zum Beispiel nach Ovulation oder der Produktion lebensfähiger Spermien) und als adultes Tier (zum Beispiel postpubertär). Ex utero Tiere können lebend sein oder post mortem. Vorläuferzellen können kultiviert werden oder nicht kultiviert werden. Weiterhin können Vorläuferzellen zu einem bestimmten Zeitpunkt kryokonserviert oder eingefroren sein (zum Beispiel können kryokonservierte Zellen als Vorläuferzellen zur Erzeugung einer Zellkultur verwendet werden). Diese Beispiele sind als nicht einschränkend zu verstehen, und eine weitere Beschreibung dieser beispielhaften Vorläuferzellen wird nachfolgend bereitgestellt.

Der Begriff "entstehen aus" (arise from), wie hier verwendet, kann sich auf die Umwandlung von ein oder mehr Zellen in eine oder mehr Zellen beziehen, welche mindestens eine unterschiedliche Eigenschaft aufweisen. Beispielsweise kann (1) eine nicht-totipotente Vorläuferzelle durch Verwenden der nachfolgend beschriebenen Merkmale der Erfindung in eine totipotente Zelle umgewandelt werden; (2) eine Vorläuferzelle kann eine Zellmorphologie einer embryonalen Keimzelle entwickeln; (3) eine Vorläuferzelle kann zu einer kultivierten Zelle führen; (4) eine Vorläuferzelle kann zu einer kultivierten Zelllinie führen; und (5) eine Vorläuferzelle kann zu einer kultivierten permanenten Zelllinie führen. Ein Umwandlungsverfahren kann als Reprogrammierungsschritt bezeichnet werden. Zusätzlich kann sich der Begriff "entstehen aus" auf die Erzeugung totipotenter Embryos aus totipotenten Zellen und unter Verwendung eines nukleären Transferprozesses beziehen, wie nachfolgend beschrieben.

Der Begriff "reprogrammieren" oder "reprogrammiert", wie hier verwendet, kann sich auf Materialien und Verfahren beziehen, die eine Zelle in eine andere Zelle umwandeln können, welche mindestens eine unterschiedliche Eigenschaft aufweist. Solche Materialien und Methoden können ferner eine Zelle in einen anderen Zelltyp reprogrammieren oder umwandeln, welcher typischerweise nicht während des Lebenszyklus der ursprünglichen Zelle exprimiert wird. Beispielsweise kann (1) eine nicht-totipotente Zelle in eine totipotente Zelle Reprogrammiert werden; (2) eine Vorläuferzelle kann in eine Zelle mit der Morphologie einer EG-Zelle reprogrammiert werden; und (3) eine Vorläuferzelle kann in eine totipotente Zelle reprogrammiert werden. Ein Beispiel für Materialien und Verfahren zur Umwandlung einer Vorläuferzelle in eine totipotente Zelle mit EG-Zellmorphologie wird anschließend beschrieben.

Der Begriff "isoliert", wie hier verwendet, kann sich auf eine Zelle beziehen, die mechanisch von einer weiteren Gruppe von Zellen getrennt ist. Beispiele für eine Gruppe von Zellen sind eine sich entwickelnde Zellmasse, eine Zellkultur, eine Zelllinie und ein Tier. Diese Beispiele sind als nicht einschränkend zu verstehen, und die Erfindung betrifft isolierte Zellen, die aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus einer nicht-embryonalen Zelle, einer differenzierten Zelle, einer Fibroblastenzelle, einer primordialen Keimzelle, einer Zelle der Keimleiste, einer embryonalen Zelle, einer Kumuluszelle und einer amnyotischen Zelle besteht. Verfahren zur Isolierung von einer oder mehr Zellen aus einer weiteren Gruppe von Zellen sind im Stand der Technik bekannt. Siehe zum Beispiel Culture of Animal Cells: a manual of basics techniques (3. Auflage), 1994, R. I: Freshney (Hrsg.), Wiley-Liss, Inc.; Cells: a laboratory manual (Vol. 1), 1998, D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press; und Animal Cells: culture and media, 1994, D. C. Darling, S. J. Morgan, John Wiley and Sons, Ltd.

Der Begriff "nicht-embryonale Zelle", wie hier verwendet, kann sich auch eine Zelle beziehen, die nicht aus einem Embryo isoliert wurde. Nicht-embryonale Zellen können differenziert oder nicht-differenziert sein. Nicht-embryonale Zellen können nahezu jede somatische Zelle betreffen, wie zum Beispiel Zellen, die aus einem ex utero Tier isoliert wurden. Diese Bespiele sind als nicht einschränkend zu verstehen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Embryo" oder "embryonal", wie hier verwendet, eine sich entwickelnde Zellmasse, die nicht in eine Uterusmembran eines maternalen Wirts eingesetzt wurde. Daher kann der Begriff "Embryo", wie hier verwendet, eine fertilisierte Oocyte, ein Cybrid (hierin definiert), eine sich entwickelnde Zellmasse im Präblastocystenstadium und/oder eine beliebige andere sich entwickelnde Zellmasse bezeichnen, die sich in einem Entwicklungsstadium vor der Implantation in eine Uterusmembran eines maternalen Wirts befindet. Embryos der Erfindung müssen keine Keimleiste aufweisen. Daher wird eine "embryonale Zelle" aus einem Embryo isoliert und/oder ist aus diesem entstanden.

Ein Embryo kann multiple Stadien der Zellentwicklung darstellen. Beispielsweise kann ein Zellembryo als eine Zygote bezeichnet werden, eine feste sphärische Masse aus Zellen, die aus einem geteilten Embryo stammt, kann als eine Morula bezeichnet werden, und ein Embryo, der ein Blastocoel aufweist, kann als ein Blastocyst bezeichnet werden.

Der Begriff "Fötus", wie hier verwendet, kann eine sich entwickelnde Zellmasse bezeichnen, die in die Uterusmembran eines maternalen Wirts implantiert wurde. Ein Fötus kann solch definierende Merkmale wie zum Beispiel eine Keimleiste umfassen. Eine Keimleiste ist ein für den Durchschnittsfachmann leicht zu identifizierendes Merkmal und ist in den Föten der meisten Tierarten ein wiedererkennbares Merkmal. Der Begriff "fötale Zelle", wie hier verwendet, kann eine beliebige Zelle bezeichnen, die aus einem Fötus isoliert wurde und/oder daraus entstanden ist oder aus einem Fötus abstammt, einschließlich amniotischer Zellen. Der Begriff "nicht-fötale Zelle" ist eine Zelle, die nicht aus einem Fötus abstammt oder daraus isoliert wurde.

Wenn Vorläuferzellen aus einem Fötus isoliert werden, werden solche Vorläuferzelle vorzugsweise aus Schweineföten isoliert, wobei sich das Alter des Fötus zwischen 20 Tagen und der Geburt bewegt, zwischen 30 Tagen und 100 Tagen, bevorzugter zwischen 35 Tagen und 70 Tagen und zwischen 40 Tagen und 60 Tagen, und am meisten bevorzugt wird ein etwa 55 Tage alter Fötus. Das Alter eines Fötus kann durch den Zeitpunkt bestimmt werden, an dem ein Embryo, der sich in den Fötus entwickelt, etabliert wird. Ein Zweizell-Embryo kann beispielsweise als ein Tag 1-Embryo bezeichnet werden, der sich in einen Tag 54-Fötus entwickeln kann. Der Begriff "etwa" im Hinblick auf Föten kann plus oder minus fünf Tage bedeuten.

Der Begriff "Geburt" (parturition), wie hier verwendet, kann den Zeitpunkt bezeichnen, zu dem ein Fötus vom weiblichen Empfänger entbunden wird, Ein Fötus kann vom weiblichen Empfänger durch Schwangerschaftsabbruch, Kaiserschnitt (c-section) oder natürliche Geburt entbunden werden.

Der Begriff "primordiale Keimzelle", wie hier verwendet, kann eine diploide Vorläuferzelle bezeichnen, die dazu in der Lage ist, eine Keimzelle zu werden. Primordiale Keimzellen können aus einem beliebigen Gewebe einer sich entwickelnden Zellmasse isoliert werden und werden vorzugsweise aus den Zellen der Keimleiste einer sich entwickelnden Zellmasse isoliert. Eine Keimleiste ist ein Bereich einer sich entwickelnden Zellmasse, der Durchschnittsfachleuten bekannt ist. Siehe zum Beispiel Strelchenko, 1996, Theriogenology 45: 130–141 und Lavoir 1994, J. Reprod. Dev. 37: 413–424.

Der Begriff "embryonale Stammzelle", wie hier verwendet, kann pluripotente Zellen bezeichnen, die aus einem Embryo isoliert werden, und die in in vitro Zellkultur kultiviert werden. Embryonale Stammzellen können mit oder ohne Feeder-Zellen kultiviert werden. Embryonale Stammzellen können aus embryonalen Zellen etabliert werden, welche aus Embryos in einem beliebigen Entwicklungszustand isoliert werden, einschließlich Embryos im Blastocystenstadium und Embryos im Präblastocystenstadium. Embryonale Stammzellen können eine abgerundete Zellmorphologie aufweisen und können in abgerundeten Zellklumpen auf Feeder-Schichten wachsen. Embryonale Stammzellen sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe zum Beispiel WO 97/37009 mit dem Titel "Cultured Inner Cell Mass Cell-Lines Derived from Ungulate Embryos," Stice and Golueke, veröffentlicht am 9. Oktober 1997, und Yang & Anderson, 1992, Theriogenology 38: 315–335; Piedrahita et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 1321–1329; Wianny et al., 1997, Biol. Reprod. 57: 756–764; Moore & Piedrahita, 1997, In Vitro Cell Biol. Anim. 33: 62–71; Moore, & Piedrahita, 1996, Mol. Reprod. Dev. 45: 139–144; Wheeler, 1994, Reprod. Fert. Dev. 6: 563–568; Hochereau-de Riviers & Perreau, Reprod. Nutr. Dec. 33: 475–493; Strojek et al., 1990, Theriogenology 33: 901–903; Piedrahita et al., 1990, Theriogenology 34: 879–901; und Evans et al., 1990 Theriogenology 33: 125–129.

Der Begriff "differenzierte Zelle", wie hier verwendet, kann eine Vorläuferzelle bezeichnen, die sich aus einem unspezialisierten Phänotyp in einen spezialisierten Phänotyp entwickelt hat. Beispielsweise können sich embryonale Zellen in epitheliale Zellen differenzieren, welche den Magen auskleiden. Materialien und Verfahren der Erfindung können differenzierte Zelle in totipotente Zellen reprogrammieren. Differenzierte Zellen können zum Beispiel aus einem Fötus oder einem lebend geborenen Tier isoliert werden.

Der Begriff "undifferenzierte Zelle", wie hier verwendet, kann eine Vorläuferzelle bezeichnen, die einen unspezialisierten Phänotyp aufweist und zur Differenzierung imstande ist. Ein Beispiel einer undifferenzierten Zelle ist eine Stammzelle.

Der Begriff "asynchrone Population", wie hier verwendet, kann Zellen bezeichnen, die nicht in einem beliebigen Zustand des Zellzyklus arretiert sind. Viele Zellen können den Zellzyklus durchlaufen und werden in keinem Stadium arretiert, während andere Zellen in einem Stadium des Zellzyklus für eine bestimmte Zeitdauer arretiert werden. Einige bekannte Stadien des Zellzyklus sind G1, S, G2 und M. Eine asynchrone Population von Zellen wird nicht manipuliert, um die Zellen in einer beliebigen oder vorzugsweise in einer bestimmten dieser Phasen zu synchronisieren. Die Zellen können beispielsweise mit Hilfe zahlreicher, im Stand der Technik bekannter Verfahren, wie zum Beispiel durch Einwirkung Colcemid, im M Stadium des Zellzyklus arretiert werden. Beispiele für Verfahren zur Arretierung von Zellen in einem Stadium des Zellzyklus werden in WO 97/07669 mit dem Titel "Quiescent Cell Populations for Nuclear Transfer" diskutiert.

Die Begriffe "synchrone Population" und "synchronisieren", wie hier verwendet, können eine Fraktion von Zellen in einer Population bezeichnen, die sich im selben Stadium des Zellzyklus befinden. Vorzugsweise werden etwa 50% der Zellen in einer Zellpopulation in einem Stadium des Zellzyklus arretiert, bevorzugt werden etwa 70% der Zellen einer Zellpopulation in einem Stadium des Zellzyklus arretiert, und am meisten bevorzugt werden etwa 90% der Zellen einer Zellpopulation in einem Stadium des Zellzyklus arretiert. Ein Stadium des Zellzyklus kann aufgrund der relativen Zellgröße sowie durch eine Vielzahl von Zellmarkern unterschieden werden, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Beispielsweise können Zellen anhand solcher Marker mit Hilfe von Durchflusscytometrieverfahren unterschieden werden, die Durchschnittsachleuten bekannt sind. Alternativ können die Zellen durch größenabhängige (size utilizing) Verfahren unterschieden werden, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, wie zum Beispiel durch Verwendung eines Lichtmikroskops und eines Mikrometers. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Zellen durch Arretierung in einem diskreten Zustand des Zellzyklus synchronisiert (i.e. die Zellen teilen sich nicht).

Die Begriffe "embryonale Keimzelle" und "EG-Zelle", wie hier verwendet, können eine kultivierte Zelle bezeichnen, die eine distinkte abgeflachte Morphologie aufweist und innerhalb von Monolayern in Kultur wachsen kann. Eine EG-Zelle kann verschieden sein von einer Fibroblastenzelle. Diese EG Zellmorphologie ist zu unterscheiden von Zellen, die eine sphärische Morphologie aufweisen und multizelluläre Klumpen auf Feeder-Schichten ausbilden. Embryonale Keimzellen aus Schweinen brauchen nicht notwendigerweise die Gegenwart von Feeder-Schichten oder die Gegenwart von Wachstumsfaktoren in den Zellkulturmedien. Embryonale Keimzellen aus Schweinen wachsen ebenfalls bei verminderten Verdopplungsraten, wenn sich die Zellen auf den Kulturplatte ihrer Konfluenz nähern. Embryonale Keimzellen aus Schweinen können totipotent sein. Embryonale Keimzellen aus Schweinen müssen nicht nennenswert hinsichtlich alkalischer Phosphatase gefärbt werden. Vorzugsweise werden embryonale Keimzellen aus Schweinen in Kulturmedien etabliert, die eine signifikante Konzentration an Glukose enthalten, wie hier beschrieben.

Embryonale Keimzellen aus Schweinen können aus einer Zellkultur eines nahezu jeden Typs von Schweinevorläuferzellen erzeugt werden. Beispiele für Vorläuferzellen werden hier diskutiert, und eine bevorzugte Vorläuferzelle zur Erzeugung von embryonalen Schweinekeimzellen ist eine Zelle aus der Keimleiste eines Fötus. Zellen aus der Keimleiste werden vorzugsweise aus Schweineföten isoliert, wobei das Alter des Fötus zwischen 20 Tagen und der Geburt, zwischen 30 Tagen und 100 Tagen liegt, bevorzugter zwischen 35 Tagen und 70 Tagen, bzw. zwischen 40 Tagen und 60 Tagen, und am meisten bevorzugt wird ein etwa 55 Tage alter Fötus. Das Alter eines Fötus kann wie oben beschrieben bestimmt werden. Der Begriff "etwa" im Hinblick auf Föten kann sich auf plus oder minus fünf Tage erstrecken. Wie hier beschrieben, können EG-Zellen physikalisch aus primären Zellkulturen isoliert werden, diese isolierten EG-Zellen können verwendet werden, um eine Zellkultur zu erzeugen, die eventuell eine homogene oder nahezu homogene Zelllinie aus EG-Zellen bildet.

Die Begriffe "Morphologie" und "Zellmorphologie", wie hier verwendet, können die Form, Struktur sowie die physikalischen Eigenschaften von Zellen bezeichnen. Beispielsweise betrifft eine Zellmorphologie signifikante Spiegel an alkalischer Phosphatase, und diese Zellmorphologie kann identifiziert werden, indem bestimmt wird, ob eine Zelle nennenswert im Bezug auf alkalische Phosphatase gefärbt wird. Ein weiteres Beispiel einer Zellmorphologie ist es, ob eine Zelle ein flaches oder rundes Erscheinungsbild aufweist, wenn sie auf einer Oberfläche oder in Gegenwart einer Schicht aus Feeder-Zellen kultiviert wird. Viele andere Zellmorphologien sind Durchschnittsfachleuten bekannt, und Zellmorphologien sind einfach mit Hilfe von Materialen und Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind, identifizierbar. Siehe zum Beispiel Culture of Animal Cells: a manual of basic techniqes (3. Auflage), 1994, R. I. Freshney (Hrsg.), Wiley-Liss, Inc.

Der Begriff "Kumuluszelle", wie hier verwendet, kann eine beliebige kultivierte oder nicht-kultivierte Zelle bezeichnen, die aus Zellen und/oder Geweben isoliert wird, welche eine Oocyte umgeben. Fachleute können eine Kumuluszelle einfach identifizieren. Beispiele für Verfahren zur Isolation und Kultivierung von Kumuluszellen werden diskutiert in Damiani et al., 1996, Mol. Reprod. Dev. 45: 521–534; Long et al., 1994, J. Reprod. Fert. 102: 361–369; und Wakayama et al., 1998, Nature 394: 396–373.

Der Begriff "amniotische Zelle", wie hier verwendet, kann eine kultivierte oder nicht-kultivierte Zelle bezeichnen, die aus amniotischen Fluid oder Geweben in Kontakt mit dem amniotischen Fluid isoliert wird. Fachleute können eine amniotische Zelle einfach identifizieren. Beispiele für Verfahren zur Isolierung und Kultivierung amniotischer Zellen werden diskutiert in Bellow et al., 1996, Theriogenology 45: 225; Gracia & Salaheddine, 1997, Theriogenology 47: 1003–1008; Leibo & Rail, 1990 Theriogenology 33: 531–552; und Vos et al., 1990, Vet. Rec. 127: 502–504.

Der Begriff "fötale Fibroblastenzelle", wie hier verwendet, kann eine beliebige differenzierte fötale Schweinezelle bezeichnen, die das Erscheinungsbild eines Fibroblasten aufweist. Fibroblasten können ein abgeflachtes Erscheinungsbild aufweisen, wenn sie in Kulturmedienplatten kultiviert werden. Fötale Fibroblastenzellen können ferner eine spindelähnliche Morphologie aufweisen, wobei die Dichte limitierend für das Wachstum ist, und können eine begrenzte Lebensspanne in Kultur von etwa 50 Generationen aufweisen. Zusätzlich können fötale Fibroblastenzellen rigide einen diploiden Chromosomensatz aufrechterhalten und können. Typ I Kollagen generieren. Für eine Beschreibung von Fibroblastenzellen siehe zum Beispiel Culture of Animal Cells: a manual of basic techniques (3. Auflage), 1994, R. I. Freshney (Hrsg.), Wiley-Liss, Inc.

Der Begriff "adulte Zelle", wie hier verwendet, kann eine beliebige Zelle bezeichnen, die aus einem adulten Schwein isoliert wurde. Eine derartige adulte Zelle kann aus einem beliebigen Teil des Schweins isoliert werden einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Haut von einem Ohr, die Haut von einer Abdominalregion, Niere, Leber, Herz und Lunge. Verfahren zur Kultivierung derartiger adulter Zellen sind nachfolgend dargestellt.

(1) Totipotente Schweinezellen, wobei die totipotenten Zellen selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, umfassen modifizierte nukleäre DNA; (2) eine modifizierte nukleäre DNA umfasst eine DNA-Sequenz, die ein rekombinantes Produkt kodiert; (3) ein rekombinantes Produkt ist ein Polypeptid; (4) ein rekombinantes Produkt ist ein Ribozym; (4) ein rekombinantes Produkt wird in einem biologischen Fluid oder einem Gewebe exprimiert; (5) ein rekombinantes Produkt verleiht Resistenz oder verleiht teilweise Resistenz gegenüber einer oder mehr Erkrankungen; (6) ein rekombinantes Produkt verleiht Resistenz oder teilweise Resistenz gegenüber einem oder mehr Parasiten; (7) eine modifizierte nukleäre DNA umfasst mindestens eine andere DNA Sequenz, die als regulatorisches Element fungieren kann; (8) ein regulatorisches Element wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus Promotor, Enhancer, Insulator und Repressor besteht; und (9) ein regulatorisches Element wird aus der Gruppe ausgewählt, die aus Milchproteinpomotor, Urinproteinpromotor, Blutproteinpromotor, Tränenkanalproteinpromotor, Synovialproteinpromotor, Manibulärdrüsenproteinpromotor, Caseinpromotor, &bgr;-Caseinpromoter, Melanorcortinpromotor, Milchserumproteinpromotor, dem &agr;-Lactalbuminpromotor, saurer Molkeproteinpromotor, Uroplaktipromotor und &agr;-Aktinpromotor besteht.

Der Begriff "modifizierte nukleäre DNA", wie hier verwendet, kann eine nukleäre Deoxyribonukleinsäuresequenz einer Zelle, eines Embryos, eines Fötus oder eines Tiers bezeichnen, die mit Hilfe von einem oder mehr rekombinanten DNA Verfahren manipuliert wurde. Beispiele für rekombinante DNA Verfahren sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Diese können umfassen: (1) Inserieren einer DNA-Sequenz aus eines anderen Organismus (zum Beispiel einem humanen Organismus) in eine nukleäre Ziel (target)-DNA, (2) Deletieren von einer oder mehr DNA-Sequenzen aus einer nukleären Ziel-DNA, und (3) Einführen von einer oder mehr Basenmutationen (zum Beispiel ortsgerichtete Mutationen) in eine nukleäre Ziel-DNA. Zellen mit einer modifizierten nukleären DNA können im Rahmen dieser Erfindung als "transgene Zellen" bezeichnet werden. Transgene Zellen können als Materialien für Klonierungsverfahren mittels nukleärem Transfer zweckdienlich sein, die hier bereitgestellt werden.

Verfahren und Werkzeuge zur Insertion, Deletion und Mutation nukleärer DNA aus Säugetierzellen sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Cold Spring Habor Laboratory Press; U.S. Patent 5,633,067, "Method of Producing a Transgenetic Bovine or Transgenetic Bovine Embryo," DeBoer et al., erteilt am 27. Mai 1997; U.S. Patent 5,612,205, "Homologous Recombination in Mammalian Cells," Kay et al., erteilt am 18. März, 1997; und PCT Publikation WO 93/22432, "Method of Identifying Transgenic Pre-Implantation Embryos"; WO 98/16630, Piedrahita & Bazer, veröffentlicht am 23. April 1998, "Methods for the Generation of Primorial Germ Cells and Transgenetic Animal Species,". Diese Verfahren umfassen Techniken zur Transfektion von Zellen mit fremden DNA Fragmenten und das exakte Design der fremden DNA Fragmente, sodass sie die Insertion, Deletion und/oder Mutation des Ziel DNA-Genoms bewirken.

Transgene Zellen können auf eine Vielzahl von Arten erhalten werden. Zum Beispiel können transgene Zellen aus einem transgenen Tier isoliert werden. Beispiele transgener Schweine sind im Stand der Technik bekannt. Aus einem transgenen Tier isolierte Zellen können mit Hilfe der hier bereitgestellten Materialien und Methoden in totipotente Zellen umgewandelt werden. In einem weiteren Beispiel können transgene Zellen aus totipotenten Zellen hergestellt werden. Materialen und Methoden für die Umwandlung nicht-transgener Zellen in transgene Zellen sind im Stand der Technik bekannt, wie zuvor beschrieben.

Eine beliebige der hier definierten Zelltypen kann verändert werden, um modifizierte nukleäre DNA zu enthalten. Beispielsweise können embryonale Stammzellen, embryonale Keimzellen, fötale Zellen und eine beliebige der hier definierten totipotenten Zellen verändert werden, um modifizierte nukleäre DNA zu enthalten.

Beispiele für Verfahren zur Modifikation eines Ziel DNA-Genoms durch Insertion, Deletion und/oder Mutation sind die retrovirale Insertion, artifizielle Chromosomentechniken, Gen-Insertion, Zufallsinsertion mit gewebespezifischen Promotoren, homologe Rekombination, Gen-Targeting, transposable Elemente und/oder ein beliebiges anderes Verfahren zur Einführung fremder DNA. Weitere Modifikationstechniken, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, umfassen das Deletieren von DNA Sequenzen aus einem Genom und/oder die Veränderung nuklearer DNA Sequenzen. Beispiele für Techniken zur Veränderung nukleärer DNA Sequenzen sind die ortsgerichtete Mutagenese (site directed mutagenesis) und Verfahren der Polymerasekettenreaktion. Daher sind Schweinezellen gleichzeitig totipotent und transgen. Solche transgenen und totipotenten Zellen können als nahezu unbegrenzte Quelle für Donorzellen zur Produktion klonierter transgener Schweine dienen.

Der Begriff "rekombinantes Produkt", wie hier verwendet, kann das Produkt bezeichnen, das aus einer DNA Sequenz erzeugt wurde, welche mindestens einen Teil der modifizierten nukleären DNA enthält. Dieses Produkt kann beispielsweise ein Peptid sein, ein Polypeptid, ein Protein, ein Enzym, ein Antikörper, ein Antikörperfragment, ein Polypeptid, das ein regulatorisches Element bindet (ein Begriff, der anschließend beschrieben wird), ein strukturelles Protein, ein RNA Molekül und/oder ein Ribozym. Diese Produkte sind im Stand der Technik bekannt.

Der Begriff "Ribozym", wie hier verwendet, kann Ribonukleinsäuremoleküle bezeichnen, die andere RNA Moleküle in spezifischen Regionen spalten können. Ribozyme können an diskrete Regionen in einem RNA Molekül binden und im Anschluss eine Region innerhalb dieser Binderegion oder angrenzend an die Binderegion spalten. Ribozymtechniken können dadurch die Menge an Polypeptid vermindern, die von ursprünglich intakten Messanger RNA Molekülen translatiert wird. Für spezifische Beschreibungen von Ribozymen siehe U.S. Patent 5,354,855, mit dem Titel "RNA Ribozyme which Cleaves Substrat RNA without Formation of a Colvalent Bond," Chech et al., erteilt am 11. Oktober 1994, und U.S. Patent 5,591,610, mit dem Titel "RNA Ribozyme Polymerases, Dephosphorylases, Restriction Endoribonucleases and Methods," Chech et al., erteilt am 7. Januar 1997.

Die Begriffe "biologisches Fluid" oder "Gewebe", wie hier verwendet, können ein beliebiges Fluid oder Gewebe in einem biologischen Organismus bezeichnen. Fluids können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Tränen, Speichel, Milch, Urin, amniotische Flüssigkeit, Samenflüssigkeit, Plasma, Eileiterflüssigkeit und synoviales Fluid. Gewebe können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Lunge, Herz, Blut, Leber, Muskel, Hirn, Bauchspeicherdrüse, Haut und andere.

Der Begriff "verleit Resistenz", wie hier verwendet, kann die Fähigkeit eines rekombinanten Produkts bezeichnen, die Symptome einer Erkrankung oder eines parasitären Zustands vollständig aufzuheben oder partiell zu mildern. Falls daher eine Erkrankung zum Beispiel eine Entzündung betrifft, kann ein rekombinantes Produkt Resistenz gegenüber dieser Entzündung verleihen, falls die Entzündung nach Expression des rekombinanten Produkts abnimmt. Ein rekombinantes Produkt kann Resistenz oder partielle Resistenz gegenüber einer Erkrankung oder einem parasitären Zustand verleihen, falls beispielsweise ein rekombinantes Produkt eine Antisense RNA-Molekül darstellt, das spezifisch an ein mRNA Molekül bindet, welches an Polypeptid kodiert, das für die Entzündung verantwortlich ist. Weitere Beispiele für das Verleihen von Resistenz gegenüber Erkrankungen oder Parasiten werden anschließend beschrieben. Zusätzlich werden im Anschluss Beispiel für Krankheiten beschrieben.

Beispiele für Parasiten und Strategien zu Verleihung von Resistenz gegenüber diesen Parasiten werden anschließend beschrieben. Diese Beispiele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Würmer, Nematoden, Insekten, Invertebraten, bakterielle, virale und eukaryontische Parasiten. Diese Parasiten können zu Krankheitszuständen führen, welche durch die Materialien und Methoden der Erfindung kontrolliert werden können.

Der Begriff "regulatorisches Element", wie hier verwendet, kann eine DNA Sequenz bezeichnen, welche eine Menge eines Produkts erhöht oder vermindert, das von einer anderen DNA Sequenz erzeugt wurde. Ein regulatorisches Element kann die konstitutive Produktion dieses Produkts hervorrufen (zum Beispiel kann das Produkt konstant exprimiert werden). Alternativ kann ein regulatorisches Element die Produktion eines rekombinanten Produkts in einer induzierbaren Art und Weise erhöhen oder vermindern (zum Beispiel kann das Produkt als Antwort auf ein spezifisches Signal exprimiert werden). Ein regulatorisches Element kann beispielsweise durch Nährstoffzugabe, durch Licht, oder durch Zugabe einer Substanz zum System des transgenen Organismus kontrolliert werden. Beispiele für regulatorische Elemente, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, sind Promotoren, Enhancer, Insulatoren und Repressoren. Siehe zum Beispiel, Transgenic Animals, Generation and Use, 1997, herausgegeben von L. M. Houdebine, Hardwood Academic Publishers, Australia.

Der Begriff "Promotoren" oder "Promotor", wie hier verwendet, kann eine DNA Sequenz bezeichnen, die angrenzend an eine DNA Sequenz lokalisiert ist, welche ein rekombinantes Produkt kodiert. Ein Promotor ist vorzugsweise operativ mit einer angrenzenden DNA Sequenz verknüpft. Ein Promotor erhört typischerweise eine Menge eines rekombinanten Produkts, das von einer DNA Sequenz exprimiert wird, im Vergleich zur Menge des exprimierten rekombinanten Produkts ohne Vorhandensein des Promotors. Ein Promotor aus einer Organismenspezies kann verwendet werden, um die Expression eines rekombinanten Produkts von einer DNA Sequenz zu erhöhen, welche von einer anderen Organismenspezies stammt. Zusätzlich kann ein Promotorelement eine Menge rekombinanter Produkte erhöhen, die von multiplen in tandem arrangierten DNA Sequenzen exprimiert werden. Daher kann ein Promotorelement die Expression eines oder mehrerer rekombinanter Produkte erhöhen. Multiple Promotorelemente sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Beispiele für Promotorelemente werden anschließend beschrieben.

Der Begriff "Enhancers" oder "Enhancer", wie hier verwendet, kann eine DNA Sequenz bezeichnen, die angrenzend an eine DNA Sequenz lokalisiert ist, welche ein rekombinantes Produkt kodiert. Enhancerelemente sind typischerweise oberhalb (upstream) eines Promotorelements lokalisiert oder können unterhalb (downstream) einer kodierenden DNA Sequenz lokalisiert sein (zum Beispiel eine DNA Sequenz, die in ein rekombinantes Produkt oder in rekombinante Produkte transkribiert oder translatiert wird). Ein Enhancerelement kann daher 100 Basenpaare, 200 Basenpaare oder 300 oder mehr Basenpaare oberhalb einer DNA Sequenz lokalisiert sein, welche ein rekombinantes Produkt kodiert. Enhancerelemente können eine Menge eines rekombinanten Produkt, das von einer DNA Sequenz exprimiert wird, über die erhöhte Expression, die durch ein Promotorelement hervorgerufen wird, erhöhen. Multiple Enhancerelemente sind Durchschnittsfachleuten leicht zugänglich.

Der Begriff "Insulatoren" oder "Insulator", wie hier verwendet, kann DNA Sequenzen bezeichnen, welche die DNA Sequenz flankieren, die das rekombinante Produkt kodiert. Insolatorelemente können die Expression eines rekombinanten Produkts zu spezifischen Geweben in einem Organismus dirigieren. Multiple Insulatorelemente sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe zum Beispiel Geyer, 1997, Curr. Opin. Genet. Dev. 7: 242–248.

Der Begriff "Repressor" oder "Repressorelement", wie hier verwendet, kann eine DNA Sequenz bezeichnen, die in der Nähe der DNA Sequenz lokalisiert ist, welche das rekombinante Produkt kodiert, wobei eine Repressorsequenz eine Menge des rekombinanten Produkts, das von dieser DNA Sequenz exprimiert wird, vermindern kann. Repressorelemente können durch die Bindung eines spezifischen Moleküls oder spezifischer Moleküle an eine DNA-Sequenz eines Respressorelements kontrolliert werden. Diese Moleküle können ein Repressorelement entweder aktivieren oder deaktivieren. Multiple Repressorelemente sind Durchschnittsfachleuten bekannt.

Die Begriffe "Milchproteinpromotor", "Urinproteinpromotor", "Blutproteinpromotor", "Tränengangproteinpromotor", "Synovialproteinpromotor" und "Mandibulärdrüsenpromotor" bezeichnen Promotorelemente, welche die spezifische Expression von Proteinen innerhalb des spezifizierten Fluids oder der Drüse oder des Zelltyps in einem Tier regulieren. Beispielsweise ist ein Milchproteinpromotor ein regulatorisches Element, das die Expression eines Proteins kontrollieren kann, welches in der Milch eines Tieres exprimiert wird. Weitere Promotoren, wie zum Beispiel der Caseinpromotor, der &agr;-Lactalbuminpromotor, der Promotor des sauren Molkeproteins, der Uroplaktinpromotor und der &agr;-Actinpromotor sind beispielsweise Durchschnittsfachleuten bekannt.

(1) Die totipotente Schweinezelle, wobei die totipotente Schweinezelle selbst keine Teil der vorliegende Erfindung darstellt, wird einer Manipulation unterworfen; (2) die Manipulation umfasst den Schritt der Verwendung einer totipotenten Schweinezelle in einem Verfahren eines nukleären Transfers; (3) die Manipulation umfasst den Schritt der Cryokonservierung totipotenter Zellen; (4) die Manipulation umfasst den Schritt des Auftauens totipotenter Zellen; (5) die Manipulations umfasst den Schritt des Passagierens totipotenter Zellen; (6) die Manipulation umfasst den Schritt des Synchronisierens totipotenter Zellen; (7) die Manipulation umfasst den Schritt des Transfizierens totipotenter Zellen mit fremder DNA; und (8) die Manipulation umfasst den Schritt des Dissoziierens einer Zelle von einer anderen Zelle oder von einer Gruppe von Zellen.

Der Begriff "Manipulation", wie hier verwendet, kann die übliche Verwendung dieses Begriffs bezeichnen, die das Management oder die Handhabung gegenüber bestimmten Objekten ist. Beispiele für Manipulationen werden hier beschrieben.

Der Begriff "nukleärer Transfer", wie hier verwendet, kann das Einbringen eines vollständigen Komplements nuklearer DNA von einer Zelle in eine entkernte Zelle bezeichnen. Verfahren zum nuklearen Transfer sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe zum Beispiel Nagashima et al., 1997, Mol. Reprod. Dev. 48: 339–343; Nagashima et al.; 1992, J. Reprod. Dev. 38: 73–78; Prather et al., 1989, Biol. Reprod. 41: 414–419; Prather et al., 1990, Exp. Zool. 255: 355–358; Saito et al., 1992, Assis. Reprod. Tech. Andro. 259: 57–266; and Terlouw et al., 1992, Theriogenology 37: 09. Ein nukleärer Transfer kann durch Verwendung von Oocyten erreicht werden, die nicht von einer Zona pellucida umgeben sind.

Der Begriff "Kryokonservierung", wie hier verwendet, können das Einfrieren einer Zelle, eines Embryos oder eines Tiers bezeichnen. Zellen, Embryos oder Teile von Tieren werden bei Temperaturen vorzugsweise unterhalb von 0°C, bevorzugter unterhalb von –80°C und am meisten bevorzugt bei Temperaturen unterhalb von –196°C eingefroren. Zellen und Embryos können für eine unbestimmte Zeitdauer kryokonserviert werden. Es ist bekannt, dass biologische Materialien für mehr als 50 Jahre kryokonserviert werden können und weiterhin lebensfähig bleiben. Beispielsweise kann die Verwendung boviner Samenflüssigkeit, die mehr als 50 Jahre kryokonserviert ist, zur artifiziellen Besamung einer Kuh verwendet werden und die Geburt lebender Nachkommen zur Folge haben. Verfahren und Werkzeuge zur Kryokonservierung sind Fachleuten bekannt. Siehe zum Beispiel die U.S. Patent Nr. 5,160,312, mit dem Titel "Cryopreservation Process for Direkt Transfer of Embryos," erteilt an Voekel am 3. November 1992.

Der Begriff "Auftauen", wie hier verwendet, kann ein Verfahren zur Erhöhung der Temperatur einer kryokonservierten Zelle, eines Embryos oder von Teilen eines Tiers bezeichnen. Verfahren zum Auftauen kryokonservierten Materials, sodass dieses nach dem Auftauvorgang aktiv ist, sind Durchschnittsfachleuten bekannt.

Die Begriffe "transfiziert" und "Transfektion", wie hier verwendet, bezeichnen Verfahren zur Abgabe exogener DNA in eine Zelle. Diese Verfahren beinhalten eine Vielzahl von Techniken, wie zum Beispiel die Behandlung von Zellen mit hohen Salzkonzentrationen, einem elektrischen Feld, Liposomen, polykationischen Micellen oder einem Detergenz, um die äußere Membran oder Wand einer Wirtszelle permeabel für Nukleinsäuremoleküle von Interesse zu machen. Diese spezifizierten Verfahren sind nicht einschränkend, und die Erfindung betrifft ein beliebiges Transformationsverfahren, das Durchschnittsfachleuten bekannt ist. Siehe zum Beispiel Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd Ed., 1989, Sambrool, Fritsch, and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press und Transgenic Animals, Generation and Use, 1997, herausgegeben von L. M. Houdebine, Hardwood Academic Publishers, Australia.

Der Begriff "fremde DNA", wie hier verwendet, kann DNA bezeichnen, die in eine Zielzelle transfiziert werden kann, wobei die fremde DNA mindestens eine Basenpaarmodifikation verglichen mit der nukleären DNA des Zielorganismus enthält. Fremde DNA und Transfektion können weiterhin in Verbindung mit dem Begriff "modifizierte nukleäre DNA", der zuvor beschrieben wurde, verstanden und definiert werden.

Der Begriff "dissoziieren", wie hier verwendet, kann Materialien und Methoden bezeichnen, die zur Separierung einer Zelle von anderen Zellen zweckmäßig sind, wobei die Zellen ursprünglich miteinander in Kontakt stehen. Beispielsweise kann ein Blastomer (i.e. ein zellulärer Teil eines Embryos im Morulastadium) vom Rest der sich entwickelnden Zellmasse mit Hilfe von Techniken und Vorrichtungen, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, entfernt werden. Siehe zum Beispiel das U.S. Patent 4,994,384 mit dem Titel "Multiplying Bovine Embryos", erteilt am 19. Februar 1991. Alternativ können in Kultur proliferierende Zellen voneinander separiert werden, um Prozesse zu erleichtern, wie zum Beispiel das Passagieren von Zellen und die Bildung von EG Zellen, die hier beschrieben sind. Zusätzlich kann die Dissoziation einer kultivierten Zelle aus einer Gruppe kultivierter Zellen als erster Schritt in einem Verfahren zum nuklearen Transfer zweckmäßig sein, wie er im Anschluss beschrieben wird. Wenn eine Zelle aus einem Embryo dissoziiert wird, kann eine Dissoziation für Prozesse zweckmäßig sein, wie zum Beispiel die Reklonierung, ein Prozess, der hier beschrieben wird, sowie als Schritt zur Multiplikation einer Anzahl von Embryos.

In einem weiteren Aspekt wird eine totipotente Schweinezelle beschrieben, die mit Hilfe eines Verfahrens hergestellt wird, das die Schritte umfasst: (a) Isolieren mindestens einer Vorläuferzelle (precursor cell); und (b) Kultivieren der Vorläuferzelle in einem Zellkulturmedium, wobei mindestens eine Zelle in dem Kulturmedium eine Morphologie einer embryonalen Keimzelle entwickelt. In bevorzugten Ausführungsformen (1) umfasst das Verfahren den Schritt des Einbringens eines Stimulus in die Vorläuferzelle, der die Vorläuferzelle in die totipotente Schweinezelle umwandelt; (2) umfasst das Verfahren den Schritt des Kultivierens der Vorläuferzelle in einem Zellkulturmedium, das eine signifikante Konzentration mindestens eines Kohlehydrats umfasst; (3) ist das Kohlehydrat Glukose; und (4) umfasst das Zellkulturmedium ein oder mehr Antibiotika.

Der Begriff "umwandeln", wie hier verwendet, kann das Phänomen bezeichnen, bei dem die Vorläuferzellen totipotent werden. Der Begriff "umwandeln" ist synonym mit dem Begriff "reprogrammieren", wie hier verwendet, wenn die Vorläuferzelle nicht totiotent ist. Vorläuferzellen können in variierenden Anteilen in totipotente Zellen umgewandelt werden. Beispielsweise ist es möglich, dass nur ein kleiner Teil der Vorläuferzellen in totipotente Zellen umgewandelt wird.

Der Begriff "Stimulus", wie hier verwendet, kann Materialien und/oder Verfahren bezeichnen, die für die Umwandlung von Vorläuferzellen in totipotente Zellen zweckmäßig sind. Ein Stimulus kann zum Beispiel elektrisch, mechanisch, temperaturbezogen und/oder chemisch sein. Der Stimulus kann eine Kombination aus einem oder mehr unterschiedlichen Typen an Stimuli sein, Ein Stimulus kann in die Vorläuferzellen für eine Zeitspanne eingebracht werden, welche die Umwandlung der Vorläufererzellen in die totipotenten Zellen bewerkstelligt.

Der Begriff "einbringen", wie hier in Bezug auf einen Stimulus verwendet, kann einen Schritt oder Schritte bezeichnen, bei denen die Vorläuferzellen mit einem Stimulus in Kontakt gebracht werden. Falls zum Beispiel ein Stimulus chemischer Natur ist, kann solch ein Stimulus in die Vorläuferzellen durch mischen des Stimulus mit einem Zellkulturmedium eingebracht werden.

Der Begriff "signifikante Konzentration mindestens eines Kohlehydrats", wie hier verwendet, kann ein Zellkulturmedium bezeichnen, das mindestens ein Kohlehydrat in einer Konzentration aufweist, welche die kultivierten Zellen nicht lysiert oder schrumpfen lässt. Kultivierte Zellen können lysieren oder schrumpfen, wenn der osmotische Druck eines Kulturmediums zu groß ist. Zellen können einen großen Bereich an Osmolaritäten tolerieren (zum Beispiel zwischen 260 mOsm/kg und 320 mOsm/kg). Ansteigende Konzentrationen an Kohlehydraten im Kulturmedium können den osmotischen Druck eines Kulturmediums dramatisch erhöhen, was die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen kann. Siehe zum Beispiel Cells: a laboratory manual (Vol. 1), 1998, D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Ein Kohlehydrat kann ein beliebiges Monosaccharid, Disaccharid oder Polysaccharid sein, das im Stand der Technik bekannt ist. Beispiele für Kohlehydrate umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Glukose, Mannose, Dextrose, Mannose, Idose, Galaktose, Talose, Gulose, Altrose, Allose, Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, Triose, Erytrose, Glyzerinaldehyd, Sucrose, Laktose, Maltose, Zellulose und Glykogen. Ein speziell bevorzugtes Kohlehydrat ist Glukose. Die Konzentration an Glukose im Zellkulturmedium ist größer als 10 mM Glukose. Der Begriff "etwa", wie in Verbindung mit Glukosekonzentrationen verwendet, kann sich auf plus oder minus 2 mM Glukose beziehen.

Der Begriff "Antibiotikum", wie hier verwendet, kann ein beliebiges Molekül bezeichnen, das die Wachstumsraten eines Bakteriums, einer Hefe, eines Pilzes, eines Schleimpilzes oder anderer Kontaminanten in einer Zellkultur vermindert. Antibiotika sind optionale Bestandteile eines Zellkulturmediums. Beispiele für Antibiotika sind im Stand der Technik bekannt. Siehe die Kataloge von Sigma und DIFCO.

(1) Die Vorläuferzellen, wobei die Vorläuferzellen selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen; werden mit Feeder-Zellen co-kultiviert; (2) die Vorläuferzellen werden nicht mit Feeder-Zellen co-kultiviert; (3) die Feeder-Zellen werden aus fötalen Zellen erzeugt; (4) die fötalen Zellen entstehen aus einem Fötus, wobei kein Zelltyp aus dem Fötus entfernt wurde (z.B. wird der gesamte Fötus dissoziiert und in ein Zellkultursystem gegeben); (5) die fötalen Zellen entstehen aus einem Fötus, wobei ein oder mehr Zelltypen aus dem Fötus entfernt wurden (z.B. wird die Kopfregion entfernt, und der verbleibende Fötus wird dissoziiert und in ein Zellkultursystem gegeben); (6) ein Stimulus wird durch die Feeder-Zellen in die Vorläuferzellen eingebracht; (7) die Fiederzellen sind die einzige Quelle des Stimulus; (8) der Stimulus wird auf mechanische Weise in die Vorläuferzellen eingebracht; (9) der einzige Stimulus, der in die Vorläuferzellen eingebracht wird, wird auf mechanische Weise eingebracht; (10) der Stimulus wird durch die Feeder-Zellen und auf mechanische Weise in die Vorläuferzellen eingebracht; (11) der Stimulus umfasst den Schritt des Inkubierens der Vorläuferzellen mit einem Cocktail aus Rezeptorliganden; (12) die Vorläuferzellen werden aus einem Huftier und vorzugsweise aus einem Schwein isoliert; (13) die Vorläuferzellen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus nicht-embryonalen Zellen, nicht-fötalen, differenzierten Zellen, undifferenzierten Zellen, somatischen Zellen, embryonalen Zellen, fötalen Zellen, embryonalen Stammzellen, primordialen Keimzellen, Zellen der Keimzellen, Kumuluszellen, amniotischen Zellen, fötalen Fibroblasten, Hepatocyten, embryonalen Keimzellen, adulten Zellen, Zellen, die aus einer asynchronen Population von Zellen isoliert werden, und Zellen, die aus einer synchronisierten Populationen von Zellen isoliert werden, besteht, wobei die synchrone Population nicht im G0 Zustand des Zellzyklus arretiert ist; (14) der Cocktail aus Rezeptorliganden mindestens eine Komponenten umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Cytokinen, Wachstumsfaktor, trophischer Faktor und neurotrophischer Faktor, LIF und FGF besteht; (15) der LIF eine Aminosäuresequenz aufweist, die substantiell ähnlich der Aminosäuresequenz von humanem LIF ist; und (16) der FGF eine Aminosäuresequenz aufweist, die substantiell ähnlich der Aminosäuresequenz von bovinem bFGF ist.

Die Begriffe "mechanische Weise" und "mechanischer Stimulus", wie hier verwendet, können das Einbringen eines Stimulus in Zellen bezeichnen, wobei der Stimulus nicht durch Feeder-Zellen eingebracht wird. Zum Beispiel können gereinigter LIF und bFGF (im Anschluss definiert) als ein Stimulus in Vorläuferzellen eingebracht werden, indem diese gereinigten Produkte zu einem Zellkulturmedium zugefügt werden, in welchem die Vorläuferzellen wachsen. Wie ebenfalls hier erläutert, kann eine signifikante Menge an Glukose als Stimulus für die Zellen zu einem Kulturmedium zugegeben werden.

Der Begriff "Feeder-Zellen", wie hier verwendet, kann Zellen bezeichnen, die in Kultur gehalten werden, und die mit Zielzellen co-kultiviert werden. Zielzellen können zum Beispiel Vorläuferzellen, embryonale Stammzellen, embryonale Keimzellen, kultivierte Zellen und totipotente Zellen sein. Feeder-Zellen können zum Beispiel Peptide, Polypeptide, elektrische Signale, organische Moleküle (z.B. Steroide), Nukleinsäuremoleküle, Wachstumsfaktoren (z.B. bFGF), weitere Faktoren (z.B. Cytokine, wie etwa LIF und Steel-Faktor) sowie metabolische Nahrungsstoffe für die Zielzellen bereitstellen. Bestimmte Zellen, wie z.B embryonale Keimzellen, kultivierte Zellen und totpotente Zellen, brauchen für gesundes Wachstum keine Feder-Zellen. Feeder-Zellen wachsen vorzugsweise in einem Monolayer.

Feeder-Zellen können aus multiplen Zelltypen erzeugt werden. Beispiele für diese Zelltypen sind fötale Zellen, Mauszellen, Buffalo Rattenleberzellen und Eileiterzellen. Diese Beispiel sind als nicht einschränkend zu verstehen. Gewebeproben können zur Etablierung einer Feeder-Zelllinie durch im Stand der Technik bekannte Verfahren (z.B durch Verwendung eines Mixers) aufgearbeitet werden. Feeder-Zellen können aus der gleichen oder einer anderen Tierart stammen als die Vorläuferzellen. Feeder-Zellen können aus fötalen Huftierzellen, fötalen Schweinezellen oder fötalen murinen Zellen etabliert werden. Ein oder mehr Zelltypen können aus einem Fötus entfernt werden (z.B. primordiale Keimzellen, Zellen in der Kopfregion und Zellen in der Region des Körperhohlraums), und eine Feeder-Schicht kann aus den Zellen etabliert werden, die entfernt wurden, oder den Zellen im verbliebenen unzerteilten Fötus. Wenn ein vollständiger Fötus zur Etablierung fötaler Feeder-Zellen verwendet wird, können Feeder-Zellen (z.B. Fibroblastenzellen) und Vorläuferzellen (z.B. primordiale Keimzellen) aus dem gleichen Ursprung entstehen (z.B. einem Fötus).

Der Begriff "Cocktail aus Rezeptorligandten", wie hier verwendet, kann ein Gemisch aus einem oder mehr Rezeptorliganden bezeichnen. Ein Repzeptorligand kann ein beliebiges Molekül bezeichnen, das an ein Rezeptorprotein bindet, welches an der Außenseite oder der Innenseite einer Zelle lokalisiert ist. Rezeptorliganden können aus den Molekülen der Cytokinfamilie von Liganden, der Neutrophinfamilie von Liganden, der Wachstumsfaktorfamilie von Liganden und der Mitogenfamilie von Liganden ausgewählt werden, die Durchschnittsfachleuten sämtlich bekannt sind. Beispiele für Rezeptor/Ligandenpaare sind: epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor/epidermaler Wachstumsfaktor, Indulinrezeptor/Insulin, cAMP-abhängige Proteinkinase/cAMP, Wachstumshormonrezeptor/Wachstumshormon und Steroidrezeptor/Steroid. Es wurde gezeigt, dass bestimmte Rezeptoren Kreuzreaktivität aufweisen. Zum Beispiel können heterologe Rezeptoren, wie zum Beispiel der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktorrezeptor 1 (IGFR1) und der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktorrezeptor 2 (IGFR2) beide IGF1 binden. Wenn ein Cocktail aus Rezeptorliganden einen Stimulus umfasst, kann der Cocktail aus Rezeptorliganden auf eine Vielzahl von Arten in eine Vorläuferzelle eingebracht werden, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind.

Der Begriff "Cytokin", wie hier verwendet, kann eine große Familie von Rezeptorliganden bezeichnen, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Die Cytokinfamilie von Rezeptorliganden umfasst Mitglieder wie etwa den Leukämie-Inhibitorfaktor (LIF); Cardiotrophin 1 (CT-1); den ciliären neurotrophen Faktor (CNTF); den Stammzellfaktor (SCF), der ebenfalls als Steel-Faktor bekannt ist; Oncostatin M (OSM); und alle Mitglieder der Interleukin (IL)-Familie einschließlich IL-6, IL-11 und IL-12. Die Lehren der Erfindung erfordern nicht die mechanische Zugabe von Steel-Faktor (im Stand der Technik ebenfalls als Stammzellfaktor bekannt) für die Umwandlung von Vorläuferzellen in totipotentente Zellen.

Der Begriff "Wachstumsfaktor", wie hier verwendet, kann einen beliebigen Rezeptorliganden bezeichnen, der einen Zellwachstumseffekt hervorrufen kann, einen Zellproliferationseffekt hervorrufen kann und/oder die Zellmorphologie beeinflussen kann. Beispiele für Wachstumsfaktoren sind im Stand der Technik bekannt. Der Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) ist ein Beispiel für einen-Wachstumsfaktor. Der Begriff "bFGF" kann den basischen FGF bezeichnen.

Der Begriff "substantiell ähnlich", wie hier in Bezug auf Aminosäuresequenzen verwendet, kann zwei Aminosäuresequenzen bezeichnen, die vorzugsweise 50% oder mehr Aminosäureidentität aufweisen, bevorzugter 70% oder mehr Aminosäureidentität und am meisten bevorzugt 90% oder mehr Aminosäureidentität. Aminosäureidentität ist eine Eigenschaft von Aminosäuresequenzen, die ihre Ähnlichkeit oder Verwandtschaft misst. Die Identität wird gemessen durch Dividieren der Anzahl identischer Reste in den beiden Sequenzen durch die Gesamtzahl an Resten und Multiplizieren des Produkts mit 100. Demzufolge weisen zwei Kopien der exakt gleichen Sequenz 100% Identität auf, während Sequenzen, die in geringerem Maße konserviert sind und Deletionen, Additionen oder Substitutionen aufweisen, einen geringeren Grad an Identität. Durchschnittsfachleute werden erkennen, dass mehrere Computerprogramme zur Durchführung von Sequenzvergleichen und zur Bestimmung der Sequenzidentität zur Verfügung stehen.

Wenn Vorläuferzellen in vitro kultiviert werden, wurde entdeckt, dass Vorläuferzellen ohne Einbringen eines Stimulus in die Vorläuferzellen Zellen hervorbringen können, die eine andere Zellmorphologie aufweisen als die Vorläuferzellen. Es wurde zum Beispiel entdeckt, dass sich Vorläuferzellen aus der Keimleiste ohne Inkontaktbringen der Vorläuferzellen mit Feeder-Zellen, einem Rezeptorliganden oder einem Wachstumsfaktor in Zellen entwickeln können, die eine EG-Zellmorphologie aufweisen. (1) Vorläuferzellen, wobei die Vorläuferzellen selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, werden nicht mit einem exogenen Rezeptorliganden in Kontakt gebracht; (2) Vorläuferzellen werden nicht mit einem exogenen Wachstumsfaktor in Kontakt gebracht; (3) Vorläuferzellen werden nicht mit Feeder-Zellen in Kontakt gebracht; (4) Vorläuferzellen werden nicht mit einem exogenen Rezeptorliganden in Kontakt gebracht, und werden nicht mit einem exogenen Wachstumsfaktor in Kontakt gebracht; (5) Vorläuferzellen werden nicht mit einem exogenen Rezeptorliganden in Kontakt gebracht, und werden nicht mit Feeder-Zellen in Kontakt gebracht; (6) Vorläuferzellen werden nicht mit einem exogenen Wachstumsfaktor in Kontakt gebracht, und werden nicht mit Feeder-Zellen in Kontakt gebracht; und (7) Vorläuferzellen werden nicht mit einem exogenen Rezeptorliganden in Kontakt gebracht, und werden nicht mit einem exogenen Wachstumsfaktor in Kontakt gebracht, und werden nicht mit Feeder-Zellen in Kontakt gebracht.

Der Begriff "exogen", wie hier in Bezug auf einen Wachstumsfaktor oder Rezeptorliganden verwendet, kann eine äußere Quelle eines Rezeptorliganden und/oder Wachstumsfaktor bezeichnen, die zu einem Substrat oder Medium zugegeben werden kann, das in Kontakt mit den Zielzellen steht. Zum Beispiel kann gereinigter bFGF, der Durchschnittsfachleuten kommerziell verfügbar ist, zu einem Zellkulturmedium gegeben werden, das in Kontakt mit Vorläuferzellen steht. In diesem letzteren Beispiel kann solch ein gereinigter bFGF als "exogener bFGF" bezeichnet werden. Multiple exogene Rezeptorliganden und/oder multiple exogene Wachstumsfaktoren oder Kombinationen davon können zu einem Flüssigmedium gegeben werden, das in Kontakt mit Zellen steht. Alternativ muss es nicht erforderlich sein, dass die Vorläuferzellen mit einem exogenen Wachstumsfaktor oder einem exogenen Rezeptorliganden in Kontakt stehen, wie zuvor diskutiert.

In ihrem Hauptaspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines klonierten Schweineembryos, eines klonierten Schweinefötus bzw. eines lebendgeborenen klonierten Schweins gemäß den Ansprüchen 1, 16 bzw. 17.

Klonierte Embryos

Die Erfindung betrifft nicht-chirurgische Verfahren zur Herstellung eines klonierten Schweinefötus und eines lebendgeborenen Schweins. Daher betreffen Aspekte der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines klonierten Schweineembryos, wobei (1) der Embryo totipotent ist; (2) der Embryo aus einer totipotenten Zelle entsteht; (3) der Embryo aus einer nicht-embryonalen Schweinezelle entsteht; und (4) eine beliebige Kombination des vorangegangenen.

Der Begriff "totipotent", wie hier in Bezug auf Embryos verwendet, kann Embryos bezeichnen, die sich in ein lebendgeborenes Schwein entwickeln. Der Begriff "lebendgeboren" wurde oben definiert.

Der Begriff "kloniert", wie hier verwendet, kann eine Zelle, eine embryonale Zelle, eine fötale Zelle und/oder eine tierische Zelle bezeichnen, die eine nukleäre DNA Sequenz aufweist, welche substantiell ähnlich oder identisch zu einer nukleären DNA einer anderen Zelle, einer embryonalen Zelle, einer fötalen Zelle und/oder einer tierischen Zelle ist. Die Begriffe "im wesentlichen ähnlich" und "identisch" werden hier beschrieben. Ein kloniertes Embryo kann aus einem nukleären Transferprozess entstehen oder alternativ kann ein kloniertes Embryo aus einem Klonierungsprozess entstehen, der mindestens einen Reklonierungsschritt umfasst. Falls ein klonierter Embryo aus einem Klonierungsverfahren entsteht, das mindestens einen Reklonierungsschritt umfasst, dann kann der klonierte Embryo indirekt aus einer totipotenten Zelle entstehen, da der Reklonierungsschritt embryonale Zelle verwenden kann, welche aus einem Embryo isoliert worden, das aus einer totipotenten Zelle entstand.

(1) Das klonierte Schweineembryo, wobei das klonierte Schweineembryo selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt, kann ein Mitglied einer Mehrheit von Embryos sein, wobei die Mehrheit von Embryos eine substantiell ähnliche nukleäre DNA Sequenz aufweist; (2) das klonierte Schweineembryo kann ein Mitglied einer Mehrheit von Embryos sein, und die Mehrheit von Embryos kann eine identische nukleäre DNA Sequenz aufweisen; (3) das klonierte Schweineembryo weist eine nukleäre DNA Sequenz auf, die im wesentlichen ähnlich zu einer DNA Sequenz eines lebendgeborenen Schweins ist; (4) ein oder mehr Zellen des klonierten Schweineembryos weisen eine modifizierte nukleäre DNA auf; (5) das klonierte Schweineembryo wird einer Manipulation unterworfen; (6) die Manipulation umfasst den Schritt des Kultivierens des Embryos in einem geeigneten Medium; (7) das Medium kann Feeder-Zellen umfassen; (8) die Manipulation eines Embryos umfasst den Schritt des Implantierens des Embryos in das reproduktive System eines weiblichen Tiers; (9) das weibliche Tier ist vorzugsweise ein Huftier und noch bevorzugter ein Schwein; (10) der Östrus-Zyklus des weiblichen Tiers ist synchronisiert mit dem Entwicklungszyklus des Embryos; und (11) die Manipulation umfasst den Schritt des Inkubierens des Embryos in einer künstlichen Umgebung.

Die modifizierte nukleäre DNA für totipotente Zellen erstreckt sich auf klonierte Embryos. Zusätzlich kann eine beliebige der in Verbindung mit totipotenten Zellen beschriebenen Manipulationen für klonierte Embryos angewendet werden.

Der Begriff "im wesentlichen ähnlich", wie hier in Bezug auf nukleäre DNA Sequenzen verwendet, bezeichnet zwei nukleäre DNA Sequenzen, die nahezu identisch sind. Zwei Sequenzen können sich durch Kopierfehler unterscheiden, die normalerweise während der Replikation der nukleären DNA entstehen. Im wesentlichen ähnliche DNA Sequenzen sind vorzugsweise mehr als 97% identisch, bevorzugte mehr als 98% identisch und am meisten bevorzugt mehr als 99% identisch. Der Begriff "Identität", wie hier in Bezug auf nukleäre DNA Sequenzen verwendet, kann sich auf die Verwendung des Begriffs in Bezug auf Aminosäuresequenzen beziehen, der hier zuvor beschrieben wurde. Es wird bevorzugt und erwartet, dass nukleäre DNA Sequenzen für klonierte Tiere identisch sind. Beispiele für Verfahren zur Bestimmung, ob klonierte Tiere und Zellen, aus denen sie kloniert wurden, im wesentlichen ähnliche oder identische nukleäre DNA Sequenzen aufweisen, sind die Mikrosatellitenanalyse und die DNA Fingerprinting-Analyse. Ashworth et al., 1998, Nature 394: 329 and Signer et al., 1998, Nature 394: 329.

Der Begriff "Mehrzahl", wie hier in Bezug auf Embryos verwendet, kann eine Gruppe von Embryos bezeichnen, die eine im wesentlichen ähnliche nukleäre DNA Sequenz aufweisen. In bevorzugten Ausführungsformen besteht eine Mehrzahl aus fünf oder mehr Embryos, zehn oder mehr Embryos, 15 oder mehr Embryos, 20 oder mehr Embryos, 50 oder mehr Embryos, 75 oder mehr Embryos, 100 oder mehr Embryos und 1000 oder mehr Embryos.

Der Begriff "kultivieren", wie hier in Hinblick auf Embryos verwendet, kann Laborverfahren bezeichnen, die das Einbringen eines Embryos in ein Kulturmedium beinhalten. Ein Embryo kann für eine angemessene Zeitdauer in ein Kulturmedium eingebracht werden, um die Stasis des Embryos zu ermöglichen oder das Wachstum des Embryos in dem Medium zu ermöglichen. Geeignete Kulturmedien für die Kultivierung von Embryos sind Fachleuten bekannt. Siehe zum Beispiel Nagashima et al., 1997, Mol. Reprod. Dev. 48: 339–242, Petters & Wells, 1993, J. Reprod. Fert. (Suppl) 48: 61–73; Reedd et al., 1992, Theriogenology 37: 95–109; Dobrinsky et al., 1996, Biol. Reprod. 55: 1069–1074; U.S. Patent Nr. 5,213,979, First et al., In Vitro Culture of Bovine Embryos," 25. Mai 1993; U.S. Patent Nr. 5,096,822, Rosenkrans, Jr. et al., "Bovine Embryo Medium," 17. März 1992.

Der Begriff "geeignetes Medium", wie hier verwendet, kann ein beliebiges Medium bezeichnen, das die Zellproliferation ermöglicht, oder das die Stasis eines Embryos ermöglicht. Falls ein Medium die Zellproliferation ermöglicht, braucht ein geeignetes Medium nicht die maximale Poliferation zu unterstützen, sondern nur eine messbare Zellproliferstion. Ein geeignetes Medium für die Embryonalentwicklung kann ein embryonales Kulturmedium sein, das hier beispielhaft beschrieben wird. Der Begriff "Feeder-Zellen" wurde oben definiert. Die Embryos gemäß der Erfindung können in Medien mit oder ohne Feeder-Zellen kultiviert werden. In anderen bevorzugten Ausführungsformen können die Feeder-Zellen Kumuluszellen sein.

Der Begriff "Implantieren", wie hier in Bezug auf Embryos verwendet, kann das Schwängern eines weiblichen Tieres mit einem hier beschriebenen Embryo bezeichnen. Implantationsverfahren sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe z.B. Polge & Day, 1982, "Embryo transplantation and preservation," Control of Pig Reproduction, D. J. A Cole and G. R. Foxcroft, Hrsg., London, UK, Butterworths, S. 227–291; Gordon, 1997, "Embryo transfer and associated techniques in pigs," Controlled reproduction in pigs (Gordon, Hrsg.), CAB International, Wallingford UK, S 164–182; und Kojima, 1998, "Embryo transfer," Manual of pig embryo transfer procedures, National Livestock Breeding Center, Japanese Society of Development of Swine Technology, S 76–79.

Der Embryo kann sich in utero entwickeln, oder alternativ kann der Fötus vor der Geburt aus der Uterusumgebung entfernt werden.

Der Begriff "synchronisiert", wie hier in Bezug auf den Östrus-Zyklus verwendet, kann unterstützte Reproduktionsverfahren bezeichnen, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Diese Verfahren werden vollständig in den im vorangegangenen Absatz zitierten Referenzen beschrieben. Typischerweise werden die Hormone Östrogen und Progesteron verwendet, um den Östrus-Zyklus eines weiblichen Tieres mit dem Entwicklungszyklus des Embryos zu synchronisieren. Der Begriff "Entwicklungsstadium", wie hier verwendet, kann Embryos gemäß der Erfindung und morphologische und biochemische Veränderungen während der Embryonalentwicklung bezeichnen. Dieser Entwicklungsprozess ist für Embryos von Huftieren vorhersagbar und kann mit dem Östrus-Zyklus eines Empfängertieres synchronisiert werden. Ein Verfahren zur Synchronisierung eines weiblichen Schweins wird anschließend dargestellt.

Der Begriff "artifizielle Umgebung" bezeichnet eine Umgebung, welche die Entwicklung eines Embryos oder einer anderen sich entwickelnden Zellmasse unterstützt. Eine artifizielle Umgebung kann eine Uterusumgebung oder eine Eileiterumgebung einer Spezies sein, die sich von der einer sich entwickelnden Zellmasse unterscheidet. Beispielsweise kann ein sich entwickelnder boviner Embryo in einen Uterus oder einen Eileiter eines Schafs gegeben werden. Stice & Keefer, 1993, "Multiple generational bovine embryo cloning," Biology of Reproduction 48: 715–719. Alternativ kann eine artifizielle Entwicklungsumgebung in vitro zusammengesetzt werden. Dieser Typus einer artifiziellen Uterusumgebung kann mit Hilfe biologischer und chemischer Komponenten synthetisiert werden, die im Stand der Technik bekannt sind.

In einem weiteren Aspekt wird ein klonierter Säugetierembryo beschrieben, wobei der Embryo totipotent ist und mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, welches den Schritt des nukleären Transfers umfasst. Vorzugsweise erfolgt der nukleäre Transfer zwischen (a) einem nukleären Donor und (b) eine Oocyte, wobei sich die Oocyte in einem Stadium befindet, das die Bildung des Embryos ermöglicht.

(1) Die Oocyte, wobei die Oocyte selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt, ist eine entkernte Schweineoocyte; (2) die Oocyte stammt aus einem Schwein; (3) die Oocyte wurde maturiert; (4) die Oocyte wurde für eine Zeitspanne von 42 bis 46 Stunden maturiert; (5) der nukleäre Donor wird in dem perivitellinen Raum der Oocyte gegeben; (6) der nukleäre Donor, der zum nukleären Transfer verwendet wird, kann aus einer beliebigen der zuvor beschriebenen Zellen hervorgehen (z.B. eine nicht-embryonale Zelle, eine primordiale Keimzelle, eine Zelle der Keimleiste, eine differenzierte Zelle, eine embryonale Stammzelle, eine embryonale Keimzelle, eine amniotische Zelle, eine Kumuluszelle und eine fötale Fibroplastenzelle); (7) der nukleäre Transfer umfasst den Schritt der Translokation des nukleären Donors in die Empfängeroocyte; (8) die Translokation kann den Schritt der Injektion des nukleären Donors in die Empfängeroocyte umfassen; (9) die Translokation kann den Schritt der Fusion des nukleären Donors und der Oocyte umfassen; (10) die Fusion kann den Schritt der Abgabe von einem oder mehr elektrischen Pulsen an den nukleären Donor und die Oocyte umfassen; (11) die Fusion kann den Schritt der Abgabe einer geeigneten Konzentration mindestens eines Fusionsagens an den nukleären Donor und die Oocyte umfassen; (12) der nukleäre Transfer kann den Schritt der Aktivierung des nukleären Donors und der Oocyte umfassen; (13) die Aktivierung wird erreicht durch (i) Erhöhen der intrazellulären Spiegel an divalenten Kationen in einer Zelle, und (ii) Reduzieren der Phosphorylierung zellulärer Proteine in der Zelle; (14) die Aktivierung wird erreicht durch Einführen von DMAP und Ianomycin in eine Zelle.

Der Begriff "nukleärer Donor", wie hier verwendet, kann eine Zelle oder einen Nukleus einer Zelle bezeichnen, der in einen nukleären Akzeptor transloziert wird. Ein nukleärer Donor kann eine totipotente Schweinezelle sein. Zusätzlich kann ein nukleärer Donor eine beliebige hier beschriebene Zelle sein einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine nicht-embryonale Zelle, eine differenzierte Zelle, eine embryonale Zelle, eine primordiale Keimzelle, eine Zelle der Keimleiste, eine Kumuluszelle und eine amniotische Zelle. Eine nukleäre Donorzelle kann ferner eine Zelle sein, die sich aus einer embryonalen Stammzelle differenziert hat. Siehe z.B. Piedrahita et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 1321–1329; Shim et al., 1997, Biol. Reprod. 57: 1089–1095; Tsung et al., 1995, Shih Yen Sheng Wu Hsueh Pao 28: 173–189; und Wheeler, 1994, Reprod. Fertil. Dev. 6: 563–568. Weiterhin kann ein nukleärer Donor eine Zelle sein, die zuvor eingefroren oder kryokonserviert wurde.

Der Begriff "entkernte Oocyte", wie hier verwendet, kann eine Oocyte bezeichnen, deren Nukleus entfernt wurde. Typischerweise kann eine Nadel in eine Oocyte gegeben werden, und der Kern kann in die Nadel abgesaugt werden. Die Nadel kann aus der Oocyte ohne Zerstörung der Plasmamembran entfernt werden. Dieses Entkernungsverfahren ist Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe das U.S. Patent 4,994,384; das U.S. Patent 5,057,420; und Willadsen, 1986, Nature 320: 63–65. Eine entkernte Oocyte wird aus einer Oocyte erzeugt, die für eine Zeitspanne von 42 bis 46 Stunden maturiert wurde.

Die Begriffe "Reifung" und "gereift", wie hier verwendet, können ein Verfahren bezeichnen, in dem eine Oocyte in vitro in einem Medium inkubiert wird. Maturierungsmedien können vielfältige Arten von Komponenten enthalten einschließlich Hormone und Wachstumsfaktoren. Die Maturierungszeit kann bestimmt werden von der Zeit, zu der eine Oocyte in das Maturierungsmedium gegeben wird, bis zu der Zeit, zu der die Oocyte einer Manipulation unterworfen wird (z.B. Entkernung, nukleärer Transfer, Fusion und/oder Aktivierung). Oocyten können in multiplen Medien maturiert werden, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Siehe z.B. Mattioli et al., 1989, Theriogenology 31: 1201–1207; Jolliff & Prather, 1997, Biol. Reprod. 56: 544–548; Funahashi & Day, 1993, J. Reprod. Fert. 98: 179–185; Nagashima et al., 1997, Mol. Reprod. Dev. 38: 339–343; Abeydeera et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 213–218; Funahashi et al., 1997, Biol. Reprod. 57: 49–53; und Sawai et al., 1997, Biol Reprod. 57: 1–6. Oocyten werden für eine Zeitspanne von 42 bis 46 Stunden maturiert.

Eine Oocyte kann ebenfalls in vivo gereift werden. Die Maturierungszeit kann die Zeit sein, zu der die Oocyte einen geeigneten Stimulus empfängt, um die Meiose fortzusetzen, bis zu der Zeit, zu der die Oocyte manipuliert wird. Die oben für die in vitro maturbierten Oocyten beschriebenen Maturierungszeiten können auf die in vivo maturbierten Oocyten angewandt werden.

Gemäß der Erfindung werden Oocyten aus einem peripubertären Tier isoliert (z.B. einem Schwein). Oocyten aus präpubertären Schweinen können zur spontanen Fortsetzung der Meiose in vitro nicht in der Lage sein. Gemäß der Erfindung werden die aus einem Schwein isolierten Oocyten zur Reifung und eventuell im nukleären Transferverfahren verwendet.

Der nukleäre Transfer kann durch Kombinieren eines nukleären Donors und mehr als einer entkernten Eizelle bewerkstelligt werden. Weiterhin kann der nukleäre Transfer durch Kombination eines nukleären Donors, einer oder mehr entkernter Oocyten und dem Cytoplasma von einer oder mehr entkernten Oocyten bewerkstelligt werden.

Der Begriff "Cybrid", wie hier verwendet, kann eine Oocyte bezeichnen, die einen darin inserierten nukleären Donor aufweist. Der Begriff "Cybrid" kann eine Oocyte bezeichnen, die einen nukleären Donor aufweist, der in die Oocyte transloziert wurde. Ein nukleärer Donor kann mit einer Oocyte fusioniert werden, und der Begriff "Cybrid" umfasst Oocyten, die nicht mit einem nuklearen Donor fusioniert sind.

Ebenfalls beschrieben werden klonierte Säugetierembryos, die durch nukleären Transfer eines nukleären Donors und einer nicht-entkernten Oocyte hergestellt werde. Ein klonierter Embryo kann erzeugt werden, wenn die nukleäre DNA der Donorzelle während der Zellteilungen repliziert, während die nukleäre DNA eine Eizelle nicht repliziert. Siehe z.B. Wagoner et al., 1996, "Functional enucleation of bovine oocytes: effects of centrifugation and ultraviolet light," Theriogenology 46: 279–284.

Der Begriff "ein weiteres Huftier", wie hier verwendet, kann eine Situation bezeichnen, in der ein nukleärer Donor von einem Huftier einer anderen Spezies, Gattung oder Familie abstammt als das Huftier, von dem die Empfängereizelle abstammt. Dies ist als nicht einschränkend zu verstehen, und von der Erfindung ist eine beliebige Huftierspezies/familien-Kombination aus nukleären Donoren und Empfängeroocyten vorgesehen.

Der Begriff "Translokation", wie hier in Bezug auf nukleären Transfer verwendet, kann das Kombinieren eines nuklearen Donors und einer Empfängeroocyte bezeichnen. Eine Translokation kann etwa mit Hilfe solcher Techniken wie Fusion und/oder direkte Injektion durchgeführt werden.

Der Begriff "Injektion", wie hier in Bezug auf Embryos verwendet, kann die Perforation einer Oocyte mit einer Nadel und die Insertion eines nukleären Donors in der Nadel in die Oocyte bezeichnen. In bevorzugten Ausführungsformen kann ein nukleärer Donor in das Cytoplamsa einer Oocyte oder in den perivitellinen Raum einer Oocyte injiziert werden. Dieser Ansatz einer direkten Injektion ist Durchschnittsfachleuten bekannt, wie bereits durch die Publikationen gezeigt wurde, die hier in Bezug auf nukleären Transfer beschrieben wurden. Für einen direkten Injektionsansatz zum nukleären Transfer kann eine ganze Zelle in eine Oocyte injiziert werden, oder alternativ kann ein Nukleus, der aus einer Zelle isoliert wurde, in eine Oocyte injiziert werden. Solch ein isolierter Nukleus kann nur von einer nukleären Membran umgeben werden, oder der isolierte Nukleus kann von einer nukleären Membran und einer Cytoplasmamembran in beliebigen Anteilen umgeben werden. Eine Oocyte kann vorbehandelt werden, um die Stärke ihrer Plasmamembran zu erhöhren, wie z.B. durch Inkubieren der Oocyte in Sucrose vor der Injektion eines nukleären Donors.

Verfahren zum Einbringen (placing) eines nuklearen Donors in der perivitellinen Raum einer entkernten Oocyte sind Duchschnittsfachleuten bekannt und vollständig in den Patenten und Referenzen beschrieben, die hier in Bezug auf den nukleären Transfer zitiert wurden.

Der Begriff "Fusion", wie hier verwendet, kann die Kombination von Anteilen von Lipidmembranen bezeichnen, welche einem nukleären Donor und einer Empfängeroocyte entsprechen. Lipidmembranen können z.B. Plasmamembranen von Zellen oder nukleären Membranen entsprechen. Eine Fusion kann mit Zugabe eines Fusionsstimulus zwischen einem nukleären Donor und einer Empfängeroocyte erfolgen, wenn diese beispielsweise angrenzend aneinander platziert werden, oder wenn ein nukleärer Donor in den perivitellinen Raum einer Empfängeroocyte eingebracht wird. Spezifische Beispiele für die Translokation einer Schweinezelle in eine Oocyte werden anschließend in anderen bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Diese Techniken für die Translokation sind vollständig in den Referenzen beschrieben, die vorher in Bezug auf den nukleären Transfer zitiert wurden.

Der Begriff "elektrische Pulse", wie hier verwendet, kann das Aussetzen eines nukleären Donors und einer Empfängeroocyte gegenüber elektrischem Strom bezeichnen. Für einen nukleären Transfer können ein nuklearer Donor und eine Empfängeroocyte zwischen Elektroden ausgerichtet und elektrischem Strom ausgesetzt werden. Der elektrische Strom kann Wechselstrom oder Gleichstrom sein. Der elektrische Strom kann als ein Puls oder als multiple Pulse für eine Vielzahl unterschiedlicher Zeiten an die Zellen abgegeben werden. Die Zellen werden typischerweise in einem geeigneten Medium für die Abgabe von elektrischen Pulsen kultiviert. Beispiele für elektrische Pulsbedingungen, die zum nuklearen Transfer verwendet werden, sind in den Referenzen und Patenten beschrieben, die hier zuvor in Bezug auf den nukleären Transfer zitiert wurden.

Der Begriff "Fusionsagens", wie hier verwendet, kann eine beliebige Verbindung oder einen biologischen Organismus bezeichnen, der die Wahrscheinlichkeit erhöhen kann, dass Teile von Plasmamembranen unterschiedlicher Zellen fusionieren, wenn ein nukleärer Donor angrenzend an eine Empfängeroocyte platziert wird. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Fusionsagenzien aus der Gruppe ausgewählt, die aus Polyethylenglykol (PEG), Trypsin, Dimethylsulfoxid (DMSO), Lektinen, Agglutinin, Viren und Sendai Virus besteht. Diese Beispiele sind als nicht einschränkend zu verstehen, und weitere im Stand der Technik bekannte Fusionsagenzien sind anwendbar und hierin eingeschlossen.

Der Begriff "geeignete Konzentration", wie hier in Bezug auf Fusionsagenzien verwendet, kann eine beliebige Konzentration eines Fusionsagens bezeichnen, das ein messbares Maß an Fusion liefert. Eine Fusion kann mit Hilfe vielfältiger Techniken gemessen werden, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, wie z.B. durch Verwendung eines Lichtmikroskops, von Farbstoffen und von fluoreszierenden Lipiden.

Der Begriff "Aktivierung" kann ein Material und ein Verfahren bezeichnen, die zur Stimulation einer Zelle zur Teilung vor, während und nach einem nukleären Transferschritt zweckmäßig sind. Der Begriff "Zelle", wie im vorangegangenen Satz verwendet, kann eine Oocyte, ein Cybrid, einen nukleären Donor und ein Embryo im frühen Stadium bezeichnen. Diese Zelltypen können eine Stimulation erfordern, und sich nach erfolgtem nukleären Transfer zerteilen. Die Erfindung betrifft ein Aktivierungsmaterial und ein Verfahren, wie in Anspruch 13 beschrieben.

Obwohl elektrische Pulse manchmal zur Stimulierung der Aktivierung von Zellen ausreichend sind, sind andere nicht-elektrische Mittel zur Aktivierung zweckdienlich und oftmals für eine ausreichende Aktivierung einer Zelle notwendig. Chemische Materialien und Verfahren, die zur nicht-elektrischen Aktivierung zweckdienlich sind, werden anschließend beschrieben. Wenn zwei oder mehr chemische Komponenten in eine Zelle zur Aktivierung der Zelle eingebracht werden, können die Zellen simultan oder nacheinander zugegeben werden.

Beispiele für elektrische Verfahren zur Aktivierung sind im Stand der Technik bekannt. Forscher haben ebenfalls nicht-elektrische Verfahren zur Aktivierung publiziert. Siehe z.B. Grocholová et al., 1997. J. Exp. Zoology 277: 49–56; Schoenbeck et al., 1993, Theriogenology 40: 257–266; Prather et al., 1989, Biology of Reproduction 41: 414–418; Prather et al., 1991, Molecular Reproduction and Development 28: 405–409; Mattioli et al., 1991, Molecular Reproduction and Development 30: 109–125; Terlouw et al., 1992, Theriogenology 37: 309; Prochazka et al., 1992, J. Reprod. Fert. 96: 725–734; Funahashi et al., 1993, Molecular Reproduction and Development 36: 361–367; Prather et al., Bio. Rep. Vol. 50 Sup 1: 282; Nussbaum et al., 1995, Molecular Reproduction and Development 41: 70–75; Funahashi et al., 1995, Zygote 3: 273–281; Wang et al., 1997, Biology of Reproduction 56: 1376–1382; Piedrahita et al., Biology of Reproduction 58: 1321–1329; Macháty et al., 1997, Biology of Reproduction 57: 85–91; und Macháty et al., 1995, Biology of Reproduction 52: 753–758.

Beispiele für Komponenten, die für eine nicht-elektrische Aktivierung verwendbar sind, umfassen Ethanol; Inositol Triphosphat (IP3); divalente Ionen (z.B. Zugabe von Ca2+ und/oder Sr2+); Mikrotubulus-Inhibitoren (z.B. Cytochalasin B); Ionophoren für divalente Ionen (z.B. der Ca2+ Ionophor Ionomycin); Proteinkinase-Inhibitoren (z.B. 6-Dimethylaminopurin (DMAP)); Proteinsynthese-Inhibitoren (z.B. Cyclohexamid); Phorbolesther, wie z.B. Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA); und Thapsigargin. Es ist ferner bekannt, dass Temperaturveränderungen und mechanische Verfahren ebenfalls für eine nicht-elektrische Aktivierung zweckdienlich sind. Die Erfindung umfasst beliebige Aktivierungsverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Siehe z.B. das U.S. Patent Nr. 5,496,720 mit dem Titel "Parthenogenic Oocyte Activation," erteilt am 5. März 1996, Susko-Parrish et al., und Wakayama et al., 1998, Nature 394: 369–374.

Wenn Ionamycin und DMAP für eine nicht-elektrische Aktivierung verwendet werden, können Ionomycin und DMAP in die Zellen simultan oder durch schrittweise Zugabe eingebracht werden, wobei die letztere die bevorzugte Methode ist, die hier beschrieben wird. Die bevorzugte Konzentration von Ionomycin und DMAO beträgt etwa 10 &mgr;M Ionomycin bzw. etwa 2 mM DMAP, wobei der Begriff "etwa" sich auf plus oder minus 2 &mgr;M Ionomycin und 1 mM DMAP bezieht.

Ebenfalls beschrieben werden: (1) Eine oder mehr Zellen des klonierten Schweineembryos umfassen modifizierte nukleäre DNA; (2) der klonierte Schweineembryo wird einer Manipulation unterzogen; (3) die Manipulation umfasst den Schritt der Disaggregation mindestens einer einzelnen Zelle eines klonierten Embryos; (4) die Manipulation umfasst den Schritt der Verwendung der einzelnen Zelle als nukleärer Donor in einem nukleären Transferverfahren; (5) die einzelne Zelle wird aus der inneren Zellmasse eines Embryos im Blastocystenstadium disaggregiert; (6) die einzelne Zelle wird aus einem Embryo im Präblastocystenstadium disaggregiert; (7) die Manipulation umfasst das Verfahren der Reklonierung; (8) der Reklonierungsprozess umfasst die Schritte: (a) Separieren des Embryos in eine oder mehr individuelle Zellen, und (b) Durchführen mindestens eines anschließenden nukleären Transfers zwischen (i) einer individuellen Zelle von (a) und (ii) einer Oocyte; (9) die einzelne Zelle wird in den perivitellinen Raum einer entkernten Oocyte für den anschließenden nukleären Transfer eingebracht; (10) der anschließende nukleäre Transfer umfasst mindestens einen der Schritt e. der Translokation, Injektion, Fusion und Aktivierung der individuellen Zelle und/oder der entkernten Oocyte; (11) eine oder mehr Zellen des klonierten Säugetierembryos, der aus dem nachfolgenden nuklearen Transfer entstanden ist, umfasst modifizierte nukleäre DNA; und (12) der klonierte Säugetierembryo, der aus dem anschließenden nukleären Transfer entstanden ist, kann einer nachfolgenden Manipulation unterzogen werden, wobei die nachfolgenden Manipulation ein beliebiger der Manipulationsschritte ist, die zuvor hier in. Bezug auf totipotente Zellen und/oder klonierte Embryos beschrieben wurden.

Der Begriff "individuelle Zellen", wie hier verwendet, kann Zellen bezeichnen, die aus einem klonierten Säugetierembryo gemäß der Erfindung isoliert wurden. Eine individuelle einzelne Zelle kann aus einem Embryo mit Hilfe von Techniken isoliert werden, die Fachleuten bekannt sind, wie in den zuvor hier zitierten Referenzen diskutiert wurde.

Der Begriff "nachfolgender nukleärer Transfer", wie hier beschrieben, wird ebenfalls als "Reklonierungsschritt" bezeichnet. Vorzugsweise kann ein Reklonierungsschritt verwendet werden, um die nukleäre Reprogrammierung während des nuklearen Transfers zu erhöhen, sodass ein Produkt des nukleären Transfers ein lebendgeborenes Tier ist. Eine Reihe nachfolgender nukleärer Transferschritte wird im Anschluss im Detail diskutiert.

Eine beliebige bevorzugte Ausführungsform, welche die zuvor beschriebenen Translokations-, Injektions-, Fusions- und Aktivierungsschritte betrifft, kann einen beliebigen nachfolgenden Transferschritt betreffen.

Der Begriff "innere Zellmasse", wie hier verwendet, kann Zellen bezeichnen, aus denen ein korrekter Embryo entsteht. Zellen, welche die Außenseite eines Blastocysten säumen, können als Trophoblast des Embryos bezeichnet werden. Verfahren zur Isolierung der Zellen der inneren Zellmasse eines Embryos sind Durchschnittsfachleuten bekannt, wie zuvor diskutiert. Der Begriff "Präblastocyst" ist im Stand der Technik bekannt und wurde zuvor bezeichnet.

Der Begriff "ovuliert in vivo", wie hier verwendet, kann eine Oocyte bezeichnen, die aus einem Tier eine bestimmte Anzahl von Stunden isoliert wurden, nachdem das Tier Charakteristika zeigt, die mit Östrus assoziiert sind, oder nach Injektion exogener Gonadotrophine, von denen bekannt ist, dass sie die Ovulation induzieren. Die Charakteristika eines Tiers im Östrus sind Durchschnittsfachleuten bekannt, wie in den hier offenbarten Referenzen beschrieben. Siehe z.B. Gordon, 1977, "Embryo transfer and associated techniques in pigs (Gordon, Hrsg.)," CAB International, Wallingford UK, S. 60–76 and Kojima, 1998, "Embryo transfer," Manual of pig embryo transfer procedures, National Livestock Breeding Center, Japanese Society for Development of Swine Technology, S. 7–21.

In einem weiteren Aspekt wird ein klonierter Schweineembryo beschrieben, wobei der klonierte Embryo selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt, der mit Hilfe eines Verfahrens erzeugt wurde, das die Schritte umfasst: (a) Translokation eines nukleären Donors in eine Oocyte, um eine nukleare Transferoocyte zu erzeugen; und (b) nicht-elektrische Aktivierung der nukleären Transfer-Oocyte, um den Schweineembryo zu erzeugen.

(1) Der nukleäre Donor ist eine kultivierte Zelle und wird aus der Gruppe von Zellen ausgewählt, die in Anspruch 6 definiert ist; (2) der nukleäre Donor ist eine totipotente Zelle oder wird aus einer totipotenten Zelle isoliert; (3) der nukleare Donor ist ein Zelltyp wie in Anspruch 6 definiert (z.B. eine embryonale Keimzelle, Kumuluszelle, amniotische Zelle, Fibroblastenzelle); (4) die Translokation umfasst den Schritt einer Fusion; und (5) das Verfahren umfasst den Schritt des Kultivierens des Embryos in vitro.

In ihrem Hauptaspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines klonierten Schweineembryos wie in Anspruch 1 definiert.

Klonierte Föten

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein nicht-chirurgisches Verfahren zur Herstellung eines klonierten Schweinefötus, wobei das Verfahren umfasst:

  • (a) Herstellen eines klonierten Schweineembryos mit Hilfe des Verfahrens der vorliegenden Erfindung; und
  • (b) Implantieren des klonierten Schweineembryos in den Uterus eines maternalen Huftiers, um sich in einen klonierten Fötus zu entwickeln.

Weiterhin (1) enthalten eine oder mehr Zellen des Fötus eine modifizierte nukleäre DNA (zuvor hier definiert), wie in Anspruch 7 beschrieben; und (2) der Fötus kann einer beliebigen Manipulation, die hier definiert ist, unterzogen werden. Zum Beispiel kann eine Manipulation die Schritte des Isolierens eines Fötus aus dem Uterus eines schwangeren weiblichen Tiers. das Isolieren einer Zelle aus dem Fötus (z.B. eine primordiale Keimzelle) und die Verwendung der isolierten Zelle als nukleärer Donor für einen nukleären Transfer umfassen.

Weitere Aspekte beschreiben (1) einen klonierten Schweinefötus, wobei der klonierte Schweinefötus selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt, der mit Hilfe eines Verfahrens hergestellt wurde, das die Schritte umfasst: (a) Herstellen eines klonierten Schweineembryos, wie zuvor definiert, und (b) Manipulation des klonierten Schweineembryos, sodass sich dieser in einen Fötus entwickelt; (2) ein Verfahren zur Herstellung eines klonierten Schweinefötus, das die Schritte umfasst: (a) Herstellung eines klonierten Schweineembryos, wie zuvor definiert, und (b) Manipulation des klonierten Schweineembryos, sodass sich dieser in einen Fötus entwickelt; (3) ein Verfahren zur Verwendung eines klonierten Fötus entsprechend der Erfindung, das den Schritt der Isolation mindestens eines Zelltyps aus einem Fötus umfasst (z.B. zur Etablierung einer Feeder-Zelllinie); und (4) ein Verfahren zur Verwendung eines klonierten Fötus entsprechend der Erfindung, das den Schritt des Separierens mindestens eines Teils des Fötus in einzelne Zellen umfasst (z.B. zur Etablierung einer Feeder-Zelllinie).

Klonierte Schweine

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein nicht-chirurgisches Verfahren zur Herstellung eines lebendgeborenen klonierten Schweins, wobei dieses Verfahren umfasst:

  • (a) Herstellen eines klonierten Embryos mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens; und
  • (b) Implantieren des klonierten Schweineembryos in den Uterus eines maternalen Huftiers, um einen Fötus zu erzeugen, der die vollständige fötale Entwicklung und die Geburt durchläuft, um das lebendgeborene Schwein zu generieren.

Ein kloniertes Schwein entwickelt sich aus einem klonierten Embryo, der mit Hilfe eines nuklearen Transferverfahrens zwischen einer totipotenten Schweinezelle und eine Schweineoocyte etabliert wurde. Eine totipotente Schweinezelle wird vorzugsweise durch Verwendung eines beliebigen Materials oder Verfahrens etabliert, die hier zuvor beschrieben wurden.

In einem weiteren Aspekt wird ein kloniertes Schwein beschrieben, wobei das klonierte Schwein selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt, wobei das Tier ein Mitglied einer Mehrzahl von Schweinen ist, und wobei die Mehrzahl von Tieren eine im wesentlichen ähnliche nukleäre DNA-Sequenz aufweist. Der Begriff "im wesentlichen ähnlich" in Bezug auf nukleare DNA-Sequenzen wurde zuvor definiert.

(1) die Mehrzahl besteht aus fünf oder mehr Tieren, zehn oder mehr Tieren, 100 oder mehr Tieren und 1000 oder mehr Tieren; und (2) die Mehrzahl von Tieren kann eine identische nukleäre DNA-Sequenz aufweisen. Der Begriff "identisch" in Bezug auf nukleare DNA-Sequenzen wurde zuvor beschrieben.

In einem weiteren Aspekt wird ein kloniertes Schwein beschrieben, wobei das klonierte Schwein selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellt, das eine oder mehr Zellen aufweist, die eine modifizierte nukleäre DNA umfassen.

Ebenfalls beschrieben wird ein Verfahren zu Verwendung eines klonierten Schweins, das den Schritt des Isolierens mindestens einer Komponente aus dem Schwein umfasst.

Der Begriff "Komponente", wie hier verwendet, kann einen beliebigen Teil eines Schweins betreffen. Eine Komponente kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Fluid, biologischem Fluid, Zelle, Gewebe, Organ, Gamet, Embryo und Fötus besteht. Zum Beispiel können Vorläuferzellen, wie zuvor definiert, aus Fluiden, biologischen Fluiden, Zellen, Geweben, Organen, Gameten, Embryos und Föten entstehen, die aus den klonierten Organismen der Erfindung isoliert wurden.

Der Begriff "Gamet", wie hier verwendet, kann eine beliebige Zelle bezeichnen, die direkt oder indirekt am reproduktiven System eines Tiers beteiligt ist. Ein Gamet kann ein spezialisiertes Produkt aus den Gonaden eines Organismus sein, wobei der Gamet genetisches Material transferieren kann, während er an der Fertilisation beteiligt ist. Beispiele für Gameten sind Spermatocyten, Spermatogonien, Oocyten und Oogonien. Gameten können in Fluiden, Geweben und Organen vorliegen, die Tieren entnommen werden (z.B. liegen Spermien in Samenflüssigkeit vor). Ebenfalls beschrieben wird die Entnahme eines beliebigen Typs einer Gamete aus einem Tier. Zum Beispiel sind Verfahren zur Entnahme von Samen und Oocyten Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe z.B. Gordon, 1997, "Introduction to controlled breeding in pigs, Embryo transfer and associated techniques in pigs," Controlled reproduction in pigs (Gordon, Hrsg.), CAB International, Wallingford UK, S. 1–59; Mattioli et al., 1989, Theriogenology 31: 1207–1207; Funahashi & Day, 1993, J. Reprod. Fert. 98: 179–185; Funahashi. et al., 1997, Biol. Reprod. 57: 49–53; Abeydeera et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 213–218; und Sawai et al., Biol. Reprod. 57: 1–6.

Der Begriff "Gewebe" wurde zuvor. definiert. Der Begriff "Organ" betrifft ein beliebiges Organ, das aus einem Tier isoliert wurde, oder ein beliebiges Teil eines Organs. Beispiele für Organe und Gewebe sind neuronales Gewebe, Hirngewebe, Milz, Herz, Lunge, Gallenblase, Pancreas, Testis, Ovar und Niere. Diese Beispiele sind nicht einschränkend, und die Erfindung betrifft ein beliebiges Organ und ein beliebiges Gewebe, das aus einem klonierten Tier der Erfindung isoliert wurde.

In bevorzugten Ausführungsformen, die keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, betrifft die Erfindung: (1) Fluide, biologische Fluide, Zellen, Gewebe, Organe, Gameten, Embryos und Föten können einer Manipulation unterworfen werden; (2) die Manipulation kann den Schritt der Kryokonservierung der Gameten, Embyros und/oder fötalen Gewebe umfassen; (3) die Manipulation kann den Schritt des Auftauens der kryokonservierten Gegenstände umfassen; (4) die Manipulation kann den Schritt des Separierens des Samens in X-Chromosom tragenden Samen und Y-Chromosom tragenden Samen umfassen; (5) die Manipulation umfasst Verfahren zur Herstellung von Samen für eine artifizielle Besamung; (6) die Manipulation umfasst den Schritt der Reinigung eines gewünschten Polypeptids (gewünschter Polypeptide) aus dem biologischen Fluid oder Gewebe; (7) die Manipulation umfasst eine Konzentration der biologischen Fluide oder Gewebe; (8) die Manipulation kann den Schritt des Transferierens eines oder mehrerer Fluide, klonierter Zellen, klonierter Gewebe, klonierter Organe und/oder von Teilen klonierter Organe in einen Empfängerorganismus umfassen (z.B. kann der Empfängerorganismus eine andere Spezies sein als die Donorquelle); (9) der Empfängerorganismus ist kein Mensch; und (10) der Empfängerorganismus ist ein Mensch.

Der Begriff "Separieren", wie hier in Bezug auf das Separieren von Samen verwendet, kann Verfahren zur Fraktionierung einer Samenprobe in geschlechtsspezifische Fraktionen bezeichnen, die Fachleuten bekannt sind. Dieser Typ Separierung kann durch Verwendung von Flusscytometern verwendet werden, die kommerziell verfügbar sind. Verfahren zur Verwendung von Flusscytometern zur Separierung von Sperma bezüglich des genetischen Gehalts sind im Stand der Technik bekannt. Weiterhin kann Samen durch seine geschlechtsassoziierten Charakteristika mit Hilfe anderer, Fachleuten bekannter Verfahren separiert werden. Siehe die U.S. Patente 5,439,362, 5,346,990, und 5,021,244 mit dem Titel "Sex-Associated Membrane Proteins and Methods for Increasing the Probability that Offspring Will Be of a Desired Sex," Spaulding, erteilt am 8. August 1995, 13. September 1994 bzw. 4. Juni 1991.

Der Begriff "Reinigung", wie hier verwendet, kann die Erhöhung der spezifischen Aktivität eines bestimmten Polypeptids oder bestimmter Polypeptide in eine Probe bezeichnen, Die spezifische Aktivität kann als Verhältnis zwischen der Aktivität oder Menge eines Zielpolypeptids und der Konzentration an Gesamtpolypeptid in der Probe ausgedrückt werden. Aktivität kann z.B. katalytische Aktivität und/oder Bindungsaktivität sein. Ferner kann die spezifische Aktivität als Verhältnis zwischen der Konzentration des Zielpolypeptids und der Konzentration an Gesamtpolypeptid ausgedrückt werden. Reinigungsverfahren umfassen Dialyse, Zentrifugation und Säulenchromatographieverfahren, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Siehe z.B. Young et al., 1997, "Production of biopharmaceutical proteins in the milk of transgenic dairy animals," BioPharm 10(6): 34–38.

Der Begriff "transferieren", wie hier verwendet, kann das Übertragen einer Gruppe von Zellen, Geweben, Organen und/oder von Teilen von Organen in ein Tier betreffen. Zellen, Gewebe, Organe und/oder Teile von Organen können z.B. (a) sich in vitro entwickeln und anschließend in ein Tier transferiert werden, (b) aus einem klonierten Schwein entfernt und in ein anderes Tier einer unterschiedlichen Spezies transferiert werden, (c) aus einem klonierten Schwein entfernt und in ein anderes Tier der gleichen Spezies transferiert werden, (d) aus einem Teil eines Tiers (z.B. Zellen aus dem Bein eines Tiers) entfernt werden und anschließend in ein anderes Teil des gleichen Tiers (z.B. das Gehirn des gleichen Tiers) transferiert werden und/oder (e) eine beliebige Kombination des vorangegangenen.

Der Begriff "transferieren", wie hier verwendet, kann das Zugeben von Fluiden, Zellen, Geweben und/oder Organen zu einem Tier bezeichnen und kann das Entfernen von Zellen, Geweben und/oder Organen aus einem Tier und Ersetzen dieser mit Zellen, Geweben und/oder Organen aus einer anderen Quelle bezeichnen. Beispielsweise kann neuronales Gewebe eines klonierten Schweins in einen geeigneten Bereich des Nervensystems eines Menschen transplantiert werden, um neurologische Erkrankungen zu behandeln (z.B. die Alzheimer Erkrankung). In einem weiteren Beispiel kann das Herz oder der Teil eines Herzens aus einem klonierten Schwein entfernt werden und kann chirurgisch in einen Menschen eingepflanzt werden, dem zuvor das Nerz oder ein Teil des Herzens entnommen wurde. Chirurgische Verfahren sind Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet der Chirurgie bekannt. Transferverfahren können den Schritt des Entfernens von Zellen, Geweben, Fluiden und/oder Organen aus einem Empfängerorganismus vor einem Transferschritt umfassen.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung: (1) ein nicht-chirurgisches Verfahren zur Herstellung eines lebendgeborenen klonierten Schweins, wobei dieses Verfahren umfasst: (a) Herstellen eines klonierten Embryos mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens; und (b) Implantieren des klonierten Schweineembryos in den Uterus eines maternalen Huftiers, um einen Fötus zu erzeugen, der die vollständige fötale Entwicklung und die Geburt durchläuft, um das lebendgeborene Schwein zu generieren.

(1) Die Manipulation kann den Schritt des Implantierens des Embryos in einen Uterus eines Tiers umfassen; (2) der Östrus-Zyklus des Tiers kann mit dem Entwicklungszyklus des Embryos synchronisiert werden; und (3) die Manipulation kann den Schritt des Implantierens des Embryos in eine artifizielle Umgebung umfassen.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Klonierung eines Schweins, das die Schritte umfasst: (a) Translokation eines nukleären Donors in eine Oocyte, um eine nukleäre Transferoocyte zu erzeugen; (b) nicht-elektrische Aktivierung der nukleären Transferoocyte, um einen klonierten Schweineembryo zu etablieren; und (c) Transferieren des klonierten Schweineembryos in ein Empfängerweibchen, wobei der Schweineembryo sich in ein kloniertes Schwein entwickelt.

In bevorzugten Ausführungsformen (1) ist der nukleäre Donor eine kultivierte Zelle und wird aus einem beliebigen der Zelltypen ausgewählt, die hier beschrieben sind; (2) ist der nukleäre Donor eine totipotente Zelle; (3) umfasst die Translokation eine Fusion; und (4) umfasst das Verfahren den Schritt des Kultivierens des Schweineembryos in vitro. Jede andere hier mit Bezug auf Schweineembryos, und insbesondere mit Bezug auf die Aktivierung diskutierte bevorzugte Ausführungsform betrifft diesen Aspekt der Erfindung.

Die oben beschriebene Zusammenfassung der Erfindung ist nicht einschränkend, und weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen sowie aus den Ansprüchen ersichtlich.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

1 veranschaulicht multiple Ausführungsformen der Erfindung, welche die Generierung totipotenter Zellen aus Vorläuferzellen betreffen. Die Figur zeigt, dass totipotente Zellen aus embryonalen Stammzellen, primordialen Keimzellen und aus einem Tier isolierten Zellen entstehen können. Die in 1 veranschaulichten Quellen für Vorläuferzellen sind nicht einschränkend, und weitere Quellen für Vorläuferzellen werden hier beschrieben.

2 veranschaulicht multiple Ausführungsformen der Erfindung, die Wege zur Erzeugung totipotenter Zelllinien und klonierter Tiere betreffen. Fibroblastenzellen können aus einer beliebigen hier beschriebenen Quelle isoliert werden.

3 veranschaulicht multiple Ausführungsformen der Erfindung zur Erzeugung klonierter transgener Zelllinien und klonierter transgener Tiere.

GENAUE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung betrifft Klonierungsverfahren für Schweine. Die vorliegende Erfindung schafft vielfältige Vorteile gegenüber Werkzeugen und Verfahren, die gegenwärtig auf dem Gebiet der Klonierung von Schweinen verwendet werden. Zum Beispiel werden hier totipotente Zellen beschrieben, die zur Klonierung von Schweinen zweckdienlich sind. Diese totipotenten Zellen können zu Verfahren zur Erzeugung klonierter Schweine durch Verwendung eines beinahe jeden Zelltyps führen. Beispielsweise können Zellen, die aus einem lebendgeborenen Tier isoliert wurden, in totipotente Zellen reprogrammiert werden. Dies schafft die Fähigkeit zur Beurteilung eines Phänotyps eines existierenden Schweins und zur leichten anschließenden Etablierung einer totipotenten Zelllinie zur Klonierung dieses Tiers.

Zusätzlich ermöglichen totipotente Zellen die Etablierung von Zelllinien aus nahezu jedem Zelltyp. Dieses Reprogrammierungsverfahren wurde zuvor beschrieben. Diese totipotenten Zelllinien bieten eine nahezu unlimitierte Quelle an Donorzellen für Klonierungstechniken mittels nukleärem Transfer. Außerdem schafft dieses Merkmal den Vorteil der Erhöhung der Klonierungseffizienz aufgrund geringerer Differenzierungsraten dieser Zellen gegenüber den bestehenden Zelllinien, die zur Klonierung verwendet werden. Zum Beispiel können embryonale Stammzellen multiple Kolonien von Zellen enthalten, die nicht totipotent sind. Zelllinien können einen hohen Prozentsatz an totipotenten Zellen enthalten.

Außerdem erhöhen die Verfahren und Techniken zur Erzeugung totipotenter Zellen, die totipotenten klonierten Embryos und die klonierten Tiere der Erfindung die Klonierungseffizienz. Diese erhöhte Effizienz erfüllt einen lange gehegten Bedarf im Stand der Technik.

I. Totipotente Schweinezellen A. Erzeugung totipotenter Zellen

Totipotente Zellen können aus nahezu jedem Typ an Vorläuferzelle erzeugt werden. Die folgenden Typen an Vorläuferzellen werden beschrieben, wobei die Vorläuferzellen selbst keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen: (1) Embryos, die aus der Vereinigung von zwei Gameten in vitro oder in vivo entstehen; (2) embryonale Stammzellen (ES-Zellen), die aus kultivierten embryonalen Zellen entstehen (z.B. Präblastocystenzellen und Zellen der inneren Zellmasse); (3) kultivierte und nicht-kultivierte Zellen der inneren Zellmasse, die aus Embryos isoliert werden; (4) kultivierte und nicht-kultivierte Präblastocystenzellen; (5) kultivierte und nicht-kultivierte fötale Zellen; (6) kultivierte und nicht-kultivierte primordiale Keimzellen; (7) kultivierte embryonale Keimzellen (EG-Zellen), so wie diese hier definiert werden; (8) kultivierte und nicht-kultivierte aus einem Tier isolierte Zellen; (9) kultivierte und nicht-kultivierte Kumuluszellen; (10) kultivierte und nicht-kultivierte amniotische Zellen; (11) kultivierte und nicht-kultivierte fötale Fibroblastenzellen; (12) kultivierte und nicht-kultivierte Zellen der Keimleiste; (13) kultivierte und nicht-kultivierte differenzierte Zellen; und (14) kultivierte und nicht-kultivierte nicht-differenzierte Zellen oder undifferenzierte Zellen.

Totipotente Zellen, die keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, werden vorzugsweise aus den hier spezifizierten Vorläuferzellen generiert. Zellen, die von einem Schwein abstammen, können aus nahezu jedem Gewebetyp isoliert werden. Zum Beispiel kann einem Schwein eine Ohrstanzung entnommen werden, die Zellen aus dieser Probe können dissoziiert werden, und die dissoziierten Zellen können anschließend mit Hilfe von Zellkulturtechniken, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, in vitro kultiviert werden. Beispiele für Materialien und Verfahren für die Kultivierung von primären Zellkulturen in totipotente Zellen werden exemplarisch in den anschließenden Ausführungsbeispielen beschrieben.

Im Stand der Technik existiert eine Vielzahl von Verfahren zur Kultivierung von Zellen. Siehe z.B. Culture of animal cells: a manual of basic technique (2. Auflage), Freshney, Copyright 1987, Alan R. Liss, Inc., New York. Insbesondere können Zellen, die Varläuferzellen für totipotente Zellen sind, sowie totipotente Zellen selbst auf Feeder-Schichten angezogen werden. Beispiele für Feeder-Schichten sind Durchschnittsfachleuten bekannt und können aus einer Vielzahl unterschiedlicher Zellen entstehen, die in vitro kultiviert werden. Siehe z.B. die anschließend beschriebene exemplarische Ausführungsform sowie Strelchenko, 1996, Theriogenology 45: 130–141; Piedrahita et al., 1990, Theriogenology 34: 879–901; Piedrahita et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 1321–1329; und Shim et al., 1997, Theriogenology 47: 245. Vorläuferzellen für totipotente Zellen sowie die totipotenten Zellen selbst brauchen jedoch nicht auf Feeder-Schichten angezogen werden.

Eine bevorzugte Zellkulturbedingung für diese Vorläuferzellen ist ein Zellkulturmedium, das eine signifikante Menge an Glukose enthält, und zwar in einer hier spezifizierten Menge. Die Zellkulturbedingung kann ein Kohlehydrat enthalten, das sich von Glukose unterscheidet, und kann ferner multiple Typen an Kohlehydraten und komplexen Kohlehydraten enthalten. Eine Vielzahl von Kohlehydraten ist Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe z.B. die Kataloge von Sigma und DIFCO.

Bevorzugte Zellkulturbedingungen betreffen ferner Zellkulturmedien, die ein oder mehr Antibiotika enthalten. Geeignete Antibiotika für die Verwendung in Zellkulturmedien sind im Stand der Technik bekannt. Siehe z.B. Culture of Animal Cells: a manual of basic techniques (3. Auflage), 1994, Freshney (Hrsg.), Wiley-Liss, Inc.: Cells: a laboratory manual (Vol. 1), 1998), Spector, Goldman, Leinwand (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press: und Animal Cells: culture and media, 1994, Darling & Morgan, John Wiley and Sons, Ltd.

Ein weiteres Beispiel einer Zellkulturbedingung ist ein Zellkulturmedium, das einen oder mehrere Rezeptorliganden enthält. Beispiele für Rezeptorliganden sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Cytokine und/oder Wachstumsfaktoren sind bevorzugte Rezeptorliganden der Erfindung. Siehe z.B. R&D Systems Katalog, 614 McKinley Place N. E., Minneapolis, MN 55413. In exemplarischen Ausführungsformen können verschiedene Mengen an humanem rekombinantem Leukämie Inhibitorfaktor (hrLIF) und basischem bovinem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) zum Kulturmedium gegeben werden, um die Vorläuferzellen in totipotente Zellen zu reprogrammieren. Variierende Konzentrationen dieser beiden Cytokine können zum Kulturmedium gegeben werden, vorzugsweise Konzentrationen von 1–1000 ng/ml, bevorzugter Konzentrationen zwischen 10–500 ng/ml, und am meisten bevorzugt etwa 1.00 ng/ml. Exogene lösliche und membranassoziierte Formen des Steel-Faktors sind für die Umwandlung der Vorläuferzellen in totipotente Zellen nicht erforderlich.

Diese Beispiele sind als nicht einschränkend zu verstehen, und ein beliebiges Cytokin oder eine Kombination von Cytokinen kann zu den hier in den exemplarischen Ausführungsformen beschriebenen hinzugefügt oder entfernt werden. Bevorzugte Cytokine für die Generierung totipotente Zellen können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), Leukämie Inhibitorfaktor (LIF), Cardiotrophin 1 (CT-1), ciliärem neurotrophee Faktor (CNTF), Stammzellfaktor (SCF), Oncostatin M (OSM) und jedem Mitglied der Interleukin (IL)-Familie einschließlich IL-6, IL-11 und IL-12 besteht.

Weitere Cytokine und andere Moleküle außer Cytokinen können zu dem in den anschließend beschriebenen exemplarischen Ausführungsformen beschriebenen Cocktail aus Rezeptorliganden zugegeben oder aus diesem entfernt werden, um totipotente Zellen aus einer beliebigen der im vorangegangenen Absatz beschriebenen Zellen zu erzeugen. Bezüglich jeder der Bedingungen zur Generierung totipotenter Zellen kann von den hier beschriebenen Bedingungen abgewichen werden. Die Fähigkeit dieser modifizierten Bedingungen, totipotente Zellen zu generieren, kann mit Hilfe von Verfahren überwacht werden, die im nachfolgenden Abschnitt "Identifikation totipotenter Zellen" beschrieben werden.

B. Identifikation totipotenter Zellen

Totipotente Zellen können auf eine Vielzahl von Arten identifiziert werden. Beispiele für Untersuchungen zur Totipotenz von Zellen umfassen:

  • (1) Identifizieren eines Markers, der spezifisch für totipotente Zellen ist;
  • (2) Durchführen von einem oder mehr nukleären Transferzyklen mit einer Zelle (wie anschließend beschrieben) und Entwickeln des resultierenden Embryos in ein Tier.

Marker können verwendet werden, um totipotente Zellen von nicht-totipotenten Zellen zu unterscheiden. Die Marker können aus der Gruppe niedermolekularer Marker, makromolekulare Marker, Zelloberflächenmarker und intrazellulärer Marker ausgewählt werden. Beispiele für Marker, die zur Identifizierung totipotenter Zellen geeignet sind, können aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus alkalischer Phosphatase, Cytokeratin, Vimentin, Laminin und c-kit besteht. Diese Marker sind Durchschnittsfachleuten bekannt, und diese Beispiele sind als nicht einschränkend zu verstehen.

Einige dieser Marker wurden bezüglich kultivierter boviner Zellen untersucht, die als totipotent identifiziert wurden. Wie zuvor angemerkt, können totipotente Schweinezellen gemäß der Erfindung keine nennenswerte Färbung für alkalische Phosphatase zeigen. Daher sind die Zellen der Erfindung von pluripotenten Zellen zu unterscheiden, die in den zuvor zitierten Publikationen diskutiert wurden. Es sollte angemerkt werden, dass einige der oben angegebenen exemplarischen Marker nicht spezifisch für totipotente Zellen sein könnten, da einige dieser Marker in pluripotenten Zellen sowie in totipotenten Zellen vorliegen könnten.

Es werden Marker beschrieben, die spezifisch für totipotente Zellen sind, und die Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Marker für Totipotenz, die im Stand der Technik nicht eindeutig definiert sind, können mit Hilfe von Verfahren zur Aufklärung totipotenter Zellmarker, wie Differential Display und genomische Verfahren, bestimmt werden. Totipotente Zellen können ebenfalls identifiziert werden, indem die Zellen eine Analyse des Nukleinsäuresequenzgehalts unterworfen werden (z.B. Hybridisierungstechniken mit Nukleinsäuresonden). Nukleinsäureproben aus totipotenten Zellen und Nukleinsäureproben aus nicht-totipotenten Zellen können auf bestimmte Nukleinsäuresequenzen gescreent werden. Falls Proben aus nicht-totipotenten Zellen eine Nukleinsäuresequenz fehlt, die in totipotenten Zellen vorliegt, dann könnte diese Nukleinsäuresequenz ein Marker zur Unterscheidung totipotenter Zellen von nicht-totipotenten Zellen sein. Falls in ähnlicher Weise Proben aus nicht-totipotenten Zellen eine Nukleinsäuresequenz aufweisen, welche totipotenten Zellen fehlt, könnte diese Nukleinsäuresequenz ein Marker zur Unterscheidung totipotenter Zellen von nicht-totipotenten Zellen sein. Ähnliche Verfahren können durch Verwendung analytischer Polypeptidtechniken (z.B. PAGE, SDS-PAGE, Verfahren, die Antikörper umfassen, und HPLC-Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind) Polypeptidmarker aufklären.

Ein bevorzugter Test für Zelltotipotenz ist die Bestimmung, ob Zellen zu totipotenten Embryos und eventuell klonierten Tieren führen. Dieser Test repräsentiert einen definitiven Test für zelluläre Totipotenz. Ein Beispiel für solch einen Test umfasst die folgenden Schritte: (1) Verwenden einer potentiell totipotenten Zelle für einen nukleären Transfer mit einer entkernten Oocyte; (2) Ermöglichen, dass sich das resultierende Cybrid entwickelt; (3) Separieren eines Embryos, der sich aus dem Cybrid entwickelt hat, in einzelne Zellen und Unterwerfen einer oder mehrere der einzelnen Zellen unter eine zweite Runde eines nukleären Transfers; (4) Ermöglichen, dass sich das resultierende Cybrid aus Schritt (3) in ein Embryo entwickelt; (5) Implantieren des Embryos aus Schritt (2) oder (4) in eine Uterusumgebung; und (6) Ermöglichen, dass sich der Embryo entwickelt. Falls sich der daraus resultierende Fötus nach den ersten drei Monaten der Schwangerschaft entwickelt, dann sind. die anfangs für den nukleären Transfer verwendeten Zellen höchstwahrscheinlich totipotente Zellen. Falls die für den nukleären Transfer verwendeten Zellen sich in ein lebendgeborenes kloniertes Tier entwickeln, dann sind die Zellen definitiv totipotent. Beispiele für die in diesem exemplarischen Test verwendeten Verfahren (z.B. Entkernen von Oocyten und nukleärer Transfer) werden vollständig im Stand der Technik sowie in den anschließend definierten exemplarischen Ausführungsformen beschrieben.

Bei Verwendung der Untersuchungen zur Identifizierung totipotenter Zellen können die hier beschriebenen Materialien und Verfahren von einem Durchschnittsfachmann modifiziert werden, um totipotente Zellen aus einer beliebigen Vorläuferzelle zu erzeugen.

C. Identifizieren totipotenter Zellen, die permanente Zellen darstellen

Die Materialien und Methoden, die oben beschrieben wurden (z.B. das Kultivieren der Zellen mit Cytokinen), können nicht-permanente Zellen in permanente Zellen umwandeln. Im Stand der Technik existieren weitere Verfahren zur Generierung permanenter Zelllinien aus primären Zellen und zur Identifizierung permanenter Zellen. Zum Beispiel kann die Manipulation der Aktivität von Telomerase in den Zellen diese Zellen immortalisieren. Siehe z.B. das U.S. Patent Nr. 5,645,986 mit dem Titel "Therapy and Diagnosis of Conditions Related to Telomere Length and/or Telomerase Activity", West et al., erteilt am 8. July 1997.

Permanente Zellen können identifiziert werden, indem eine Anzahl von Zeitpunkten bestimmt wird, zu denen die kultivierten Zellen eine Zellteilung durchlaufen und sich in ihren Zellzahlen verdoppeln, bevor die Zellen absterben. Wie oben diskutiert, können sich die Zellen über 10-mal, 20-mal, 30-mal, 40-mal, 50-mal und 60-mal verdoppeln, bevor die Zellen absterben. Materialien und Verfahren zur Messung des Absterbens von Zellen wurden oben gelehrt.

Weiterhin können permanente Zellen durch Detektion der Gegenwart und/oder des Fehlens niedermolekularer und makromolekularer Marker identifiziert werden, welche spezifisch für permanente Zellen sind. Die Gegenwart oder das Fehlen der Existenz eines Markers kann ein Zeichen für Zellimortalisierung sein. Weiterhin kann ein Phänomen, das mit einem Marker assoziiert ist, ein Anzeichen von Immortalität sein: Falls z.B. der Marker ein Enzym ist, kann ein Anzeichen der Gegenwart des Enzyms und/oder ein bestimmtes Niveau an katalytischer Aktivität dieses Enzyms ein geeignetes Anzeichen sein, dass eine bestimmte Zelle permanent ist.

Niedermolekulare Marker umfassen spezifische Nukleoside, lipidassoziierte Sialinsäure, Polyamine und Pseudouridin.

Makromolekulare Marker können in mehrere Klassen eingeteilt werden einschließlich Nukleinsäurepolymere, Peptide, Polypeptide, Proteine, Enzyme, Wachstumsfaktoren, Wachstumsfaktorrezeptoren, Hormone, Hormonrezeptoren, Onkogene, Onkogenprodukte und spezifische Glykoproteine. Makromolekulare Marker könnenn aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus extrazellulären Proteinen, membranassoziierten Proteinen und/oder intrazellulären Proteinen besteht, welche membranassoziiert oder löslich sein können. Ein solcher Marker für permanente Zellen ist z.B. Telomerase oder ihre assoziierte Aktivität. Siehe das U.S. Patent 5,645,986, supra. Weitere Beispiele für Marker, die spezifisch für permanente Zellen sind, können aus der nachfolgenden Liste ausgewählt werden. Diese Beispiele sind nicht einschränkend, und die Erfindung betrifft jegliche Marker, die spezifisch für permanente Zellen sind, und die im Stand der Technik bekannt sind.

  • 1) Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und sein Rezeptor (EGF-R)
  • 2) Transformierender Wachstumsfaktor-alpha (TGF-alpha) und sein Rezeptor
  • 3) c-erbB2 Rezeptor-Tyrosinkinase (HER2 Produkt)
  • 4) Hyaluronanrezeptor (möglicherweise CD44, ein integrales Membranglykoprotein)
  • 5) Carcinoembryonales Antigen (CEA)-Familie von Tumormarkern (z.B. T1, ein glykosyliertes Protein)
  • 6) Telomerase, ein Ribonukleoprotein, das die Telomerlänge in permanenten Zellen aufrechterhält
  • 7) Phosphotasen: plazentale akalische Phosphotase (PLAP), alkalische Phosphotase aus Keimzellen, saure prostale Phosphotase (PAS)
  • 8) Cathepsin D (katalysiert die Degradation von Laminin)
  • 9) Ornithindecarboxylase (ODC) (katalysiert den umsatzlimitierenden Schritt in der Polyaminsynthese)
  • 10) Beta-Glukuronidase
  • 11) Alpha-6-Integrin
  • 12) Keratin K8
  • 13) Onkogenprodukte: ras Onkogene (K-ras, Ha-ras, p21), v-src, c-myc
  • 14) Cyclin D1, Cyclin A und Retinoblastoma Genprotein (Rb)
  • 15) Veränderungen in der p53 Expression oder p53 Mutationen
  • 16) Überexpression des heterogenen Ribonukleoproteins A2 (hnRNP-A2)
  • 17) L-Plastin
  • 18) Gangliosidfukosyl-GM1
  • 19) Mob-1 Expression (mob-1) (Homologie zu proinflammatorischen Cytokinen)

Zusätzlich zu den im Stand der Technik bekannten Markern für Zellpermanenz können Marker für Zellpermanenz mit Hilfe anderer Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, identifiziert werden. Zum Beispiel können Zellpermanenzmarker durch Analyse spezifischer Moleküle (z.B. Nukleinsäuremoleküle und Polypeptidmoleküle) identifiziert werden, die einzigartig für spezifische permanente Zelltypen sind.

II. Transgene totipotente Schweinezellen

Für die Umwandlung totipotenter Schweinezellen in transgene Zellen, die gleichzeitig totipotent sind, können Materialien und Verfahren verwendet werden, die für Fachleute einfach verfügbar sind. Sobald die nukleäre DNA in den totipotenten Zellen der Erfindung modifiziert ist, können die Embryos und die Tiere, die aus diesen Zellen entstehen, ebenfalls die modifizierte nukleäre DNA umfassen. Daher können Materialien und Verfahren, die für Durchschnittsfachleute einfach verfügbar sind, auf totipotente Zellen angewandt werden, um transgene Tiere und kimere Tiere zu erzeugen. Siehe z.B. EPO 264 166 mit dem Titel "Transgenic Animals Secreting Desired Proteins Into Milk"; WO 94/19935 mit dem Titel "Isolation of Components of Interest From Milk"; WO 93/22432 mit dem Titel "Method for Identifying Transgenic Preimplantation Embryos"; WO 95/17085 mit dem Titel "Transgenic Production of Antibodies in Milk"; Hammer et al., 1985, Nature 315: 680–685; Miller et al., 1986, J. Endocrinology 120: 481–488; Williams et al., 1992, J. Ani. Sci. 74: 2207–2111; Piedrahita et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 1321–1329; Piedrahita et al., 1997, J. Reprod. Fert. (suppl.) 52: 245–254; und Nottle et al., 1997, J. Reprod. Fert. (suppl.) 52: 245–254.

Verfahren zur Generierung transgener Zellen umfassen typischerweise die Schritte: (1) Konstruieren eines geeigneten DNA Konstrukts, das zur Insertion einer spezifischen DNA Sequenz in das nukleäre Genom einer Zelle zweckdienlich ist; (2) Transfizieren des DNA Konstrukts in die Zellen; (3) Ermöglichen, dass eine Zufallsinsertion und/oder homologe Rekombination erfolgt. Die aus diesem Verfahren resultierende Modifikation kann die Insertion eines geeigneten DNA Konstrukts (geeignete DNA Konstrukte) in das Zielgenom sein, die Deletion von DNA aus dem Zielgenom und/oder die Mutation des Zielgenoms.

DNA Konstrukte können ein Gen von Interesse sowie eine Vielzahl von Elementen umfassen, einschließlich regulatorischer Promotoren, Insulatoren, Enhancern und Repressoren sowie Elemente für die ribosomale Bindung an die RNA, die von diesem DNA Konstrukt transkribiert wird. DNA Konstrukte können ebenfalls Ribozyme und Antisense DNA und/oder RNA kodieren, wie zuvor hierin identifiziert. Diese Beispiele sind Durchschnittsfachleuten bekannt und sind als nicht einschränkend zu verstehen.

Aufgrund der effektiven rekombinanten DNA Techniken, die in Verbindung mit DNA Sequenzen für regulatorische Elemente zur Verfügung stehen, und der einfachen Verfügbarkeit von Genen in Datenbanken und im kommerziellen Bereich kann ein Durchschnittsfachmann einfach ein DNA Konstrukt generieren, das zur Etablierung transgener Zellen mit Hilfe der hier beschriebenen Materialien und Verfahren geeignet ist.

Transfektionstechniken sind Durchschnittsfachleuten bekannt, und die Materialien und Verfahren zur Durchführung einer Transfektion von DNA Konstrukten in Zellen sind kommerziell verfügbar. Materialien, die zur Transfektion von Zellen mit DNA Konstrukten verwendet werden können, sind z.B. lipophile Verbindungen, wie etwa LipofektinTM, SuperfektTM, LipoTAXITM und CLONfectinTM. Spezielle lipophile Verbindungen können induziert werden, um Liposomen zur Vermittlung einer Transfektion des DNA Konstrukts in die Zellen zu bilden. Weiterhin können auf Kationen basierende Transfektionsagenzien, die im Stand der Technik bekannt sind, zur Transfektion von Zellen mit Nukleinsäuremolekülen verwendet werden (z.B. Calciumphosphatpräzipitation). Ferner können im Stand der Technik bekannte Elektroporationsverfahren verwendet werden, um Nukleinsäuremoleküle in Zellen zu translozieren. Weiterhin können Verfahren mittels Partikelbeschuss (particle bombardment techniques), die im Stand der Technik bekannt sind, zur Einführung exogener DNA in Zellen verwendet werden. Zielsequenzen eines DNA Konstrukts können in spezifische Regionen des nukleären Genoms durch rationales Design des DNA Konstrukts inseriert werden. Diese Designtechniken und Verfahren sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe das U.S. Patent 5,633,067, "Method of Producing a Transgenic Bovine or Transgenic Bovine Embryo", DeBoer et al., erteilt am 27. Mai 1997; das U.S. Patent 5,612,205, "Homologues Recombination in Mammalian Cells", Kay et al., erteilt am 18. März 1997; und die PCT Publikation WO 93/22432, "Method for Identifying Transgenic Pre-Implantation Embryos". Sobald die gewünschte DNA Sequenz in das nukleäre Genom einer Zelle inseriert ist, kann die Lokalisation der Insertionsregion sowie die Frequenz, mit der die gewünschte DNA Sequenz in das nukeäre Genom inseriert ist, mit Hilfe Fachleuten bekannter Verfahren identifiziert werden.

Sobald ein Transgen oder Transgene in das nukeäre Genom der totipotenten Zelle inseriert sind, kann diese Zelle als nukleärer Donor zur Klonierung eines transgenen Tiers verwendet werden. Eine detailliertere Beschreibung transgener Tiere wird anschließend dargelegt.

A. Erkrankungen und Parasiten

Gewünschte DNA-Sequenzen können in eine nukleäre DNA einer Zelle inseriert werden, um die Widerstandsfähigkeit eines klonierten transgenen Tiers gegenüber speziellen Parasiten, Erkrankungen und infektiösen Agenzien zu erhöhen. Beispiele für Parasiten umfassen Würmer, Fliegen, Zecken und Flöhe. Beispiele für infektiöse Agentien umfassen Bakterien, Pilze und Viren. Beispiele für Erkrankungen umfassen atrophe Rhinitis, Cholera, Leptospirose, Pseudorabien und Brucellose. Diese Beispiele sind nicht einschränkend, und die Erfindung betrifft jede Erkrankung oder jeden Parasiten oder jedes infektiöse Agenz, das im Stand der Technik bekannt ist. Siehe z.B. Hagan & Bruners Infectious Diesases of Domestic Animals (7. Auflag), Gillespie & Timoney, Copyright 1981, Cornell University Press, Ithaca NY.

Ein Transgen kann Resistenz gegenüber einem speziellen Parasiten oder einer Erkrankung durch vollständiges Aufheben oder partielles Mildern der Symptome der Erkrankung oder des parasitären Zustands verleihen oder durch Erzeugung eines Proteins, das den Parasiten oder die Erkrankung kontrolliert.

B. Elemente von DNA Konstrukten und die Erzeugung von DNA Konstrukten

Abhängig von der Art des Wirts kann eine Vielzahl transkriptioneller und translationeller regulatorische Sequenzen verwendet werden. Die transkriptionellen und translationellen regulatorischen Signale können aus viralen Quellen stammen, wie z.B. Adenovirus, boviner Papillomavirus, Cytomegalovirus, Simianvirus und dergleichen, wobei die regulatorischen Signale mit einer bestimmten Gensequenz assoziiert sind, welche Potential für hohe Expressionsniveaus besitzt. Alternativ können Promotoren von Säugetierexpressionsprodukten verwendet werden, wie z.B. Actin, Casein, Alpha-Lactalbumin, Uroplakin, Kollagen, Myosin. und dergleichen. Transkriptionelle regulatorische Signale können ausgewählt werden, welche die Repression oder Aktivierung ermöglichen, sodass die Expression eines Genprodukts moduliert werden kann. Von Interesse sind regulatorische Signale, die durch externe Faktoren, wie z.B. Chemikalien oder Arzneimittel, reprimiert oder initiert werden können. Diese Beispiele sind nicht einschränkend, und die Erfindung betrifft beliebige regulatorische Elemente. Weitere Beispiele regulatorischer Elemente werden hier beschrieben.

C. Beispiele für bevorzugte rekombinante Proteine

Eine Vielzahl von Proteinen und Polypeptiden kann von einem Gen kodiert werden, das innerhalb eines DNA Konstrukts enthalten ist, welches zur Erzeugung transgener Zellen geeignet ist. Diese Proteine oder Palypeptide umfassen Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme, Gerinnungsfaktoren, Apolipoproteine, Rezeptoren, Arzneimittel, Pharmaceutika, Bioceutika, Nutraceutika, Onkogene, Tumorantigene, Turnorsupressoren, Cytokine, virale Antigene, parasitäre Antigene, bakterielle Antigene und chemisch synthetisierte Polymere und Biopolymere, die biosynthetisiert und/oder durch chemische, zelluläre und/oder enzymatische Verfahren modifiziert wurden. Spezifische Beispiele für diese Verbindungen umfassen Proinsulin, Insulin, Wachstumshormon, Androgenrezeptoren, insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I, insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor II, Insulinwachstumsfaktor-Bindeproteine, epidermaler Wachstumsfaktor, TGF-&agr;, TGF-&bgr;, dermaler Wachstumsfaktor (PDGF), Angiogenesefaktoren (z.B. saurer Fibroblastenwachstumsfaktor, basischer Fibroblastenwachstumsfaktor und Angiogenin), Angiogeneseinhibitoren (z.B. Endostatin und Angiostatin) Matrixproteine (Typ IV Kollagen, Typ VII Kollagen, Laminin), Onkogene (ras, fos, myc, erb, src, sis, jun), E6 oder E7 transformierende Sequenz, p53 Protein, Cytokinrezeptor, IL-1, IL-6, IL-8, IL-2, &agr;-, &bgr;-, oder &ggr;-IFN, GMCSF, GCSF, virales Capsidprotein und Proteine von viralen, bakteriellen und parasitären Organsimen. Weitere spezifische Proteine oder Polypeptide, die exprimiert werden können, umfassen: Phenylalaninhydroxylase, &agr;-1-Antitrypsin, Cholesterin-7&agr;-Hydroxylase, trunkiertes Apolipoprotein B, Lipoproteinlipase, Apolipoprotein E, Apolipoprotein A1, LDL Rezeptor, Scavanger Receptor für oxidierte Lipoproteine, molekulare Varianten von jedem davon, VEGF und Kombinationen davon. Weitere Beispiele sind monoklonale Antikörper, Antkörperfragmente, Gerinnungsfaktoren, Apolipoproteine, Arzneimittel, Tumorantigene, virale Antigene, parasitäre Antigene, monoklonale Antikörper und bakterielle Antigene. Ein Fachmann wird einfach erkennen, dass diese Proteine zu einer Vielzahl von Proteinklassen gehören, und dass andere Proteine innerhalb dieser Klassen oder außerhalb dieser Klassen ebenfalls verwendet werden können. Dies sind nur Beispiele und in keiner Weise als einschränkend zu verstehen.

Es sollte ebenfalls angemerkt werden, dass das genetische Material, das aus den DNA Konstrukten in die Zellen eingebracht wird, umfasst: (1) Nukleinsäuresequenzen, die normalerweise in den Zielzellen nicht vorliegen; (2) Nukleinsäuremoleküle, die normalerweise in den Zielzellen vorliegen, nicht aber in physiologisch signifikanten Niveaus exprimiert werden; (3) Nukleinsäuresequenzen, die normalerweise in Zielzellen vorliegen, und normalerweise in physiologisch gewünschten Niveaus exprimiert werden; (4) weitere Nukleinsäuresequenzen, die zur Expression in Zielzellen modifiziert werden können; und (5) beliebige Kombinationen davon.

Zusätzlich können DNA Konstrukte in nukleäre DNA von Zellen inkorporiert werden, wobei die inkorporierte DNA in Ribonukleinsäuremoleküle transkribiert werden kann, welche andere RNA Moleküle in spezifischen Regionen spalten können. Ribonukleinsäuremoleküle, die RNA Moleküle spalten können, werden im Stand der Technik als Ribozyme bezeichnet. Ribozyme sind selbst RNA Moleküle. Ribozyme können diskrete Regionen in einem RNA Molekül binden und im Anschluss eine Region innerhalb dieser Bindungsregion oder angrenzend an die Bindungsregion spezifisch spalten. Ribozymverfahren können dadurch die Menge an Polypeptid vermindern, die von zuvor intakten messenger RNA-Molekülen translatiert wird.

Weiterhin können DNA Konstrukte in nukleäre DNA von Zellen inkorporiert werden und nach Transkription eine RNA erzeugen, die sowohl spezifische RNA- als auch DNA-Sequenzen binden kann. Die Nukleinsäuresequenzen können in Antisense-Verfahren verwendet werden, die an die messenger RNA (mRNA) binden und die Translation dieser messenger RNAs blockieren. Antisense-Verfahren können dadurch die Synthese bestimmter Polypeptide in Zellen blockieren oder partiell blockieren.

III. Nukleärer Transfer

Nukleäre Transfer (NT)-Verfahren unter Verwendung nicht-totipotenter Zellen sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe z.B. das U.S. Patent Nr. 4,664,097, "Nuclear Transplantation in the Mammalian Embryo by Microsurgey and Cell Fusion", erteilt am 12. Mai 1987, McGrath & Solter; das U.S. Patent 4,999,384 (Prather et al.); und das U.S. Patent 5,057,420 (Massey et al.). Exemplarische Ausführungsformen definieren ein NT-Verfahren, das eine effiziente Produktion totipotenter Schweineembryos bereitstellen kann.

A. Nukläre Donoren

Totipotente Zellen können als nukläre Donoren in einem NT-Verfahren zur Generierung eines klonierten Embryos verwendet werden. Wie oben beschrieben, können totipotente Zellen aus nahezu jedem Zelltyp generiert werden. Für NT-Techniken kann eine Donorzelle aus einer wachsenden Zellmasse separiert werden, aus einer primären Zellkultur isoliert werden oder aus einer Zelllinie isoliert werden. Die gesamte Zelle kann in den perivitellinen Raum einer Empfängeroocyte gegeben werden oder kann direkt durch Ansaugen des nukleären Donors in eine Nadel, Platzieren der Nadel in der Empfängeroocyte, Freisetzen des nuklären Donors und Entfernen der Nadel ohne signifikante Zerstörung der Plasmamembran der Oocyte in die Empfängeroocyte injiziert werden. Ferner kann ein Nukleus (z.B. ein Karyoplast) aus einem nuklären Donor isoliert werden und in den perivitellinen Raum einer Empfängeroocyte gegeben werden oder kann z.B. direkt in eine Empfängeroocyte injiziert werden.

B. Empfängeroocyten

Eine Empfängeroocyte ist typischerweise eine Oocyte, aus der ein Teil ihre Ooplasmas entfernt wurde, wobei das entfernte Ooplasma den Nukleos der Oocyte umfasst. Verfahren zur Entkernung sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe z.B. Nagashima et al., 1997, Mol. Reprod. Dev. 48: 339–343; Nagashima et al., 1992, J. Reprod. Dev. 38: 37–78; Prather et al., 1989, Biol. Reprod. 41: 414–418; Prather et al., 1990, J. Exp. Zool. 255: 355–358; Saito et al., 1992, Assis. Reprod. Tech. Andro. 259: 257–266; und Terlow et al., 1992, Theriogenology 37: 309.

Oocyten können aus Eileitern und/oder Ovarien lebender Tiere mit Hilfe von Verfahren zur oviductalen Oocytengewinnung oder zur transvaginalen Oocytengewinnung isoliert werden, die im Stand der Technik bekannt und hier beschrieben sind. Weiterhin können Oocyten aus getöteten Tieren isoliert werden. Zum Beispiel können Ovarien von Schlachthöfen erhalten werden, und die Oocyten können aus diesen Ovarien abgesaugt werden. Die Oocyten können ferner aus den Ovarien kürzlich getöteter Tiere isoliert werden, oder wenn das Ovar eingefroren und/oder aufgetaut wurde.

Oocyten können in einer Vielzahl von Medien maturiert werden, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Ein Beispiel für solch ein Medium, das zur Maturierung von Oocyten geeignet ist, wird in einer exemplarischer Ausführungsform dargestellt, die anschließend beschrieben wird. Oocyten können in diesem Mediumtyp in einer Umgebung mit 5% CO2 bei 39°C erfolgreich maturiert werden. Oocyten können kryokonserviert und anschließend aufgetaut werden, bevor die Oocyten in das Maturierungsmedium gegeben werden. Verfahren zur Kryokonservierung von Zellen und Embryos sind im Stand der Technik bekannt, wie hier diskutiert wurde.

Komponenten eines Mediums zur Oocytenmaturierung können Moleküle umfassen, welche die Oocytenmaturierung arretieren. Beispiele für solche Komponenten sind 6-Dimethylaminopurin (DMAP) und Isobutylmethylxanthine (IBMX). Es wurde berichtet, dass IBMX Oocyten reversibel arretiert, aber dass die Effizienzen zur Arrestaufrechterhaltung eher gering sind. Siehe z.B. Rose-Hellkant and Bavister, 1996, Mol. Reprod. Develop. 44. 241–249. Oocyten können jedoch im Keimvesikelstadium mit relativ hoher Effizienz arretiert werden, indem die Oocyten bei 31°C in einer effektiven Konzentration an IBMX inkubiert werden. Vorzugsweise werden die Oocyten die ganze Zeit inkubiert, während der Oocyten entnommen werden. Geeignete IBMX Konzentrationen zur Oocytenmaturierung liegen zwischen 0.01 mM und 20 mM IBMX, vorzugsweise 0.05 mM bis 10 mM IBMX, noch bevorzugter etwa 0.1 mM IBMX bis etwa 0.5 mM IBMX, und am meisten bevorzugt 0.1 mM IBMX bis 0.5 mM IBMX.

Eine nukleäre Donorzelle und eine Empfängeroocyte können aus der gleichen Spezies oder aus unterschiedlichen Spezies entstehen. Beispielsweise kann eine totipotente Schweinezelle in eine entkernte Schweineoocyte inseriert werden. Alternativ kann eine totipotente Wildschweinzelle in eine Oocyte eines Hausschweins injiziert werden. Eine beliebige Kombination aus nukleären Donor und Empfängeroocyte kann von der Erfindung vorgesehen werden. Vorzugsweise stammen der nukleäre Donor und die Empfängeroocyte aus der gleichen Spezies. NT-Verfahren zwischen unterschiedlichen Spezies können verwendet werden, um klonierte Tiere zu erzeugen, die gefährdet oder ausgestorben sind.

Oocyten können durch elektrische und/oder nicht-elektrische Mittel vor, während und/oder nach Einführen eines nukleären Donors in eine Empfängeroocyte aktiviert werden. Zum Beispiel kann eine Oocyte in ein Medium gegeben werden, das eine oder mehr Komponenten enthält, welche für die nicht-elektrische Aktivierung vor der Fusion mit einem nukleären Donor geeignet sind. Ferner kann ein Cybrid in ein Medium gegeben werden, das eine oder mehr Komponenten enthält, die zur nicht-elektrischen Aktivierung geeignet sind. Aktivierungsverfahren werden im Anschluss detaillierter diskutiert.

C. Injektion/Fusion

Ein nukleärer Donor kann in eine Oocyte mit Hilfe einer Vielzahl von Materialien und Methoden transloziert werden, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind. In einem Beispiel kann ein nukleärer Donor direkt in eine Empfängeroocyte injiziert werden. Diese direkte Injektion kann durch vorsichtiges Aufziehen eines nukleären Donors in eine Nadel, Durchstechen einer Empfängeroocyte mit dieser Nadel, Freisetzen des nukleären Donors in die Oocyte und Entfernen der Nadel aus der Oocyte ohne signifikante Zerstörung ihrer Membran erreicht werden. Geeignete Nadeln können aus Glaskapillarröhrchen hergestellt werden, wie im Stand der Technik und insbesondere in den hier durch Bezugnahme eingeschlossenen Publikationen definiert.

In einem weiteren Beispiel können mindestens ein Teil der Plasmamembran eines nukleären Donors und einer Empfängeroocyte durch Verwendung Fachleuten bekannter Techniken miteinander fusioniert werden. Siehe Willadsen, 1986, Nature 320: 63–65. Typischerweise können Lipidmembranen durch elektrische und chemische Mittel miteinander fusioniert werden, wie zuvor und in weiteren hierin durch Bezugnahme eingeschlossenen Publikationen definiert.

Beispiele für nicht-elektrische Mittel der Zellfusion umfassen die Inkubation von Cybriden in Lösungen, die Polyethylenglycol (PEG) und/oder Sendai Virus umfassen. Für eine Zellfusion können PEG Moleküle mit einem weiten Bereich an Molekulargewichten verwendet werden.

Verfahren zur Fusion, die hier nicht explizit diskutiert werden, können ohne übermäßiges Experimentieren bestimmt werden. Beispielsweise können Modifikationen von Zellfusionsverfahren hinsichtlich ihrer Effizienz überwacht werden, indem das Ausmaß der Zellfusion unter dem Mikroskop beobachtet wird. Der erhaltene Embryo kann anschließend kloniert und als ein totipotenter Embryo mit Hilfe der gleichen Verfahren identifiziert werden, wie sie zuvor hier zur Identifizierung totipotenter Zellen beschrieben wurden, die Untersuchungen auf selektierbare Marker und/oder Untersuchungen zur Entwicklung eines Tiers umfassen.

D. Aktivierung

Verfahren zur Aktivierung von Oocyten und Cybriden sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Siehe das U.S. Patent 5,496,720, "Parthenogenic Oocyte Activation", Susko-Parrish et al., erteilt am 5. März 1996.

Sowohl elektrische als auch nicht-elektrische Verfahren können zur Aktivierung von Zellen verwendet werden (z.B. von Oocyten und Cybriden). Obwohl die Verwendung eines nicht-elektrischen Mittels zur Aktivierung nicht immer notwendig ist, kann eine nicht-elektrische Aktivierung das Entwicklungspotential von Cybriden erhöhen, insbesondere wenn junge Oocyten als Empfänger verwendet werden.

Beispiele für elektrische Verfahren zur Aktivierung von Zellen sind im Stand der Technik bekannt. Siehe WO 98/16630, veröffentlicht am 23. April 1998, Piedraheidra and Blazerr, und die U.S. Patente 4,994,384 und 5,057,420. Nicht-elektrische Mittel zur Aktivierung von Zellen können jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren umfassen, das die Wahrscheinlichkeit einer Zellteilung erhöht. Beispiele für nicht-elektrische Mittel zur Aktivierung eines nukleären Donors und/oder Rezipienten können erreicht werden durch Einbringen der Zellen in Ethanol, Inositoltriphosphat (IP3), Ca2+ Ionophore und Proteinkinaseinhibitoren, wie z.B. 6-Dimethylaminopurin, Temperaturveränderung, Proteinsyntheseinhibitoren (z.B. Cycloheximid), Phorbolesther, wie z.B. Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA), mechanische Verfahren, Thapsigargin und Spermafaktoren. Spermafaktoren können eine beliebige Komponente eines Spermiums umfassen, welche die Wahrscheinlichkeit einer Zellteilung erhöht. Weitere nicht-elektrische Verfahren zur Aktivierung umfassen das Unterwerfen der Zelle oder der Zellen unter einen Kälteschock und/oder mechanischen Stress.

Beispiele für bevorzugte Proteinkinaseinhibitoren sind Proteinkinase A-, G- und C-Inhibitoren, wie z.B. 6-Dimethylaminpurin (DMAP), Staurosporin, 2-Aminopurin, und Sphingosin. Tyrosinkinaseinhibitoren können ebenfalls verwendet werden, um Zellen zu aktivieren.

Materialien und Verfahren für eine Aktivierung, die hier nicht explizit diskutiert werden, können durch Modifizieren der spezifischen Bedingungen identifiziert werden, welche hier sowie in den im U.S. Patent Nr. 5,496,720 beschriebenen exemplarischen Protokolle definiert sind.

Die Aktivierungseffizienz und -totipotenz, die aus jedweden Modifikationen der Aktivierungsverfahren resultieren, können durch die Methoden identifiziert werden, die zuvor im Abschnitt mit dem Titel "Identifikation totipotenter Zellen" beschrieben wurden. Verfahren zur Identifikation totipotenter Embryos können eine oder mehr Untersuchungen umfassen, wie z.B. (a) Identifizieren spezifischer Marker für totipotente Zellen in Embryos, und (b) durch Bestimmen, ob die Embryos totipotent sind, indem sie sich in ein Tier entwickeln können.

F. Manipulation von Embryos, die aus einem nukleären Transfer resultieren

Ein Embryo, das aus einem NT-Verfahren resultiert, kann auf eine Vielzahl von Arten manipuliert werden. Es werden klonierte Embryos beschrieben, die aus mindestens einem NT-Verfahren entstehen. Beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung zeigen, dass zwei oder mehr NT-Verfahren die Effizienz bei der Produktion totipotenter Embryos erhöhen können. Beispielhafte Ausführungsformen zeigen, dass das Inkorporieren von zwei oder mehr NT-Techniken in Verfahren zur Erzeugung klonierter totipotenter Embryos die plazentale Entwicklung erhöhen kann. Zusätzlich kann die Erhöhung der Zahl an NT-Zyklen, die in einem Prozess zur Erzeugung totipotenter Embryos involviert sind, einen notwendigen Faktor zur Umwandlung nicht-totipotenter Zellen in totipotente Zellen darstellen. Ein Effekt des Inkorporierens von zwei oder mehr NT-Zyklen nach der Totipotenz des resultierenden Embryos ist ein überraschendes Ergebnis, das zuvor im Stand der Technik nicht identifiziert oder untersucht wurde.

Das Inkorporieren von zwei oder mehr NT-Zyklen in Verfahren zur Klonierung totipotenter Embryos kann weitere Vorteile bereitstellen. Das Inkorporieren multipler NT-Verfahren in Techniken zur Etablierung klonierter totipotenter Embryos stellt ein Verfahren zur Multiplikation der Anzahl klonierter totipotenter Embryos bereit.

Wenn multiple NT-Verfahren für die Bildung eines klonierten totipotenten Embryos verwendet werden, können Oocyten, die für eine beliebige Zeitspanne maturiert wurden, als Rezipienten im ersten, zweiten oder einem anschließenden NT-Verfahren verwendet werden. Falls z.B. ein erster NT und im Anschluss ein zweiter NT durchgeführt werden, kann der erste NT eine Oocyte, die etwa 53 Stunden maturiert wurde, als Rezipienten verwenden, und der zweite NT kann eine Oocyte, die weniger als etwa 53 Stunden maturiert wurde, als Rezipienten verwenden. Alternativ kann der erste NT eine Oocyte, die etwa 53 Stunden maturiert wurde als Rezipienten verwenden, und der zweite NT kann eine Oocyte, die mehr als etwa 53 Stunden maturiert wurde, als Rezipienten für eine Zweizyklus NT-System (regime) verwenden. Zusätzlich können beide NT-Zyklen Oocyten als Rezipienten verwenden, die etwa 53 Stunden maturiert wurden, beide NT-Zyklen können Oocyten als Rezipienten verwenden, die weniger als etwa 53 Stunden maturiert wurden, und beide NT-Zyklen können Oocyten als Rezipienten in einem Zweizyklus NT-System verwenden, die mehr als etwa 53 Stunden maturiert wurden.

Für NT-Verfahren, die zwei oder mehr NT-Zyklen inkorporieren, können einer oder mehr der NT-Zyklen einem Aktivierungsschritt vorangehen, von einem Aktivierungsschritt gefolgt werden und/oder simultan mit einem Aktivierungsschritt durchgeführt werden. Wie zuvor definiert, kann ein Aktivierungsschritt durch elektrische und/oder nicht-elektrische Mittel, wie hier definiert, erreicht werden. Anschließend dargestellte beispielhafte Ausführungsformen beschreiben NT-Verfahren, die einen Aktivierungsschritt nach einem NT-Zyklus inkorporieren. Ein Aktivierungsschritt kann jedoch auch zur gleichen Zeit wie ein NT-Zyklus durchgeführt werden (zum Beispiel simultan mit dem NT-Zyklus) und/oder ein Aktivierungsschritt kann vor einem NT-Zyklus durchgeführt werden. Klonierte totipotente Embryos, die aus einem NT-Zyklus resultieren, können (1) disgaggregiert werden oder (2) es kann ermöglicht werden, dass sie sich weiter entwickeln.

Falls die Embryos disaggregiert werden, können die disaggregrierten vom Embryo abstammenden Zellen verwendet werden, um kultivierte Zellen zu etablieren. Ein beliebiger Typus einer embryonalen Zelle kann verwendet werden, um kultivierte Zellen zu etablieren. Diese kultivierten Zellen werden in der wissenschaftlichen Literatur manchmal als embryonale Stammzellen oder als embryonale stammzell-ähnliche Zellen bezeichnet. Die embryonalen Stammzellen können von frühen Embryos, Morulae und Embryos im Blastozystenstadium abstammen. Durchschnittsfachleuten sind multiple Verfahren zur Erzeugung kultivierter embryonaler Zellen bekannt. Diese Methoden werden in spezifischen Referenzen aufgezählt.

Falls den Embryos ermöglicht wird, sich in utero in einen Fötus zu entwickeln, können die Zellen, die aus dem sich entwickelnden Fötus isoliert werden, zur Etablierung kultivierter Zellen verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen können primordiale Keimzellen, Zellen der Keimleiste und fötale Fibroblastenzellen aus solch einem Fötus isoliert werden. Kultivierte Zellen, die eine bestimmte Morphologie aufweisen, die hierin beschrieben wird, können als embryonale Keimzellen (EG-Zellen) bezeichnet werden. Diese kultivierten Zellen können mit Hilfe von Kultivierungsverfahren etabliert werden, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind. Solche Verfahren werden hier aufgezählt und diskutiert.

Klonierte totipotente Embryos, die aus einem NT resultieren, können ferner durch Kryokonservierung und/oder Auftauen der Embryos manipuliert werden. Siehe zum Beispiel Nagashima et al., 1989, Japanese J. Anim. Reprod. 35: 130–134 und Feng et al., 1991, Theriogenelogy 35: 199. Weitere Verfahren zur Manipulation eines Embryos umfassen Verfahren zur in vitro Kultur, zur Durchführung eines Embryotransfers in einen maternalen Rezipienten, zur Disaggregation von Blastomeren für NT-Verfahren, zur Disaggregation von Blastomeren oder Zellen der inneren Zellmasse zur Etablierung von Zelllinien zur Verwendung in NT-Verfahren, Verfahren zum Embryosplitting, Verfahren zur Embryoaggregation, Verfahren zur Embryovermehrung und Verfahren zur Biopsieentnahme von Embryos. Die beispielhaften Manipulationsverfahren sind als nicht einschränkend zu verstehen, und die Erfindung betrifft beliebige Verfahren zur Embryomanipulation, welche Durchschnittsfachleuten bekannt sind.

IV. Entwicklung klonierter Embryos A. Identifizierung totipotenter Embryos

Totipotente Embryos können mit Hilfe von Verfahren identifiziert werden, die im Abschnitt "Identifikation totipotenter Zellen" beschrieben sind. Einzelne Zellen können isoliert und ähnlichen Untersuchungen unterworfen werden. Die Untersuchungen betreffen zum Beispiel die Identifikation der Gegenwart oder des Fehlens von Markern. Ein totipotenter Embryo kann ferner identifiziert werden, indem einem Embryo ermöglicht wird, sich zu entwickeln, bis er die ersten drei Monate der Schwangerschaft durchlaufen hat, oder sich vorzugsweise in ein lebendgeborenes Tier zu entwickeln. Verfahren zur Identifizierung von Markern für Totipotenz werden ebenfalls hier beschrieben.

B. Kultur von Embryos In Vitro

Die hier diskutierten Klonierungsverfahren stellen den Vorteil der Kultur von Zellen und Embryos in vitro vor der Implantation in einen weiblichen Empfänger bereit. Verfahren zur Kultur von Embryos in vitro sind im Stand der Technik bekannt. Siehe zum Beispiel Nagashima et al., 1997, Mol. Reprod. Dev. 48: 339–343 Petters & Wells, 1993, J. Reprod. Fert. (Suppl) 48: 61–73; Reed et al., 1992, Theriogenelogy 37: 95–109; und Dobrinsky et al., 1996, Biol. Reprod. 55: 1069–1074. Zusätzlich werden anschließend exemplarische Ausführungsformen für Medien beschrieben, die zur Kultur klonierter Embryos in vitro geeignet sind. Schichten aus Feeder-Zellen können oder können nicht zur Kultur klonierter Embryos verwendet werden. Feeder-Zellen wurden oben und werden in den anschließenden exemplarischen Ausführungsformen beschrieben.

C. Entwicklung von Embryos In Utero

Klonierte Embryos können nach den NT-Verfahren und den Prozessen zur in vitro Kultur der Embryos in einer artifiziellen oder natürlichen Uterusumgebung kultiviert werden. Beispiele für artifizielle Entwicklungsumgebungen wurden bereitgestellt und sind Fachleuten bekannt. Die Komponenten der artifiziellen Umgebung können modifiziert werden, zum Beispiel durch Verändern der Menge einer Komponente oder von Komponenten und durch Beobachtung der Wachstumsrate eines Embryos.

Verfahren zum Implantieren von Embryos in den Uterus eines Tieres sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt, wie zuvor diskutiert. Vorzugsweise ist das Entwicklungsstadium des Embryos (der Embryos) mit dem Östrus-Zyklus des Tieres korreliert.

Embryos aus einer Spezies können in die Uterusumgebung eines Tieres einer Spezies eingebracht werden. Es wurde zum Beispiel im Stand der Technik gezeigt, dass bovine Embryos sich in den Ovidukten von Schafen entwickeln können. Stice & Keefer, 1993, "Multiple generational bovine embryo cloning," Biology of Reproduction 48: 715–719. Die Erfindung betrifft eine beliebige Kombination eines Schweineembryos in einer Uterusumgebung eines beliebigen anderen Huftieres. Ein System zur in utero Entwicklung zwischen unterschiedlichen Spezies (cross-species in utero development regime) kann eine effiziente Erzeugung klonierter Tiere einer bedrohten Spezies ermöglichen. Zum Beispiel kann sich ein Wildschweinembryo im. Uterus eines Hausschweins entwickeln.

Sobald ein Embryo in den Uterus eines Empfängerweibchens eingebracht ist, kann sich der Embryo vollständig entwickeln. Alternativ kann es einem Embryo ermöglicht werden, sich im Uterus zu entwickeln, und anschließend kann er zu einer gewählten Zeit entfernt werden. Chirurgische Verfahren zur Entfernung von Föten aus den Uteri vor der Geburt sind im Stand der Technik bekannt.

V. Klonierte Schweine

Wie zuvor beschrieben, schafft die Erfindung Vorteile bezüglich der Fähigkeit, einen Phänotyp eines Tieres vor der Klonierung dieses Tieres zu beurteilen. Multiple Produkte können aus einem klonierten Tier isoliert werden. Zum Beispiel können Samen aus einem klonierten Schwein, wie zum Beispiel einem domestizierten Wildschwein, isoliert werden. Die Samen können kryokonserviert werden. Die Samen können ebenfalls in geschlechtsspezifische Spermafraktionen separiert werden. Siehe die U.S. Patente 5,439,362, 5,346,990 und 5,021,244 mit dem Titel "Sex-associated Membrane Proteins and Methods for Increasing the Probability that Offspring Will be of a Desired Sex," Spaulding, erteilt am 8. August 1995, 13. September 1994 bzw. 4. Juni 1991. Verfahren zur Entnahme von Samenflüssigkeit sind Fachleuten bekannt, wie zuvor beschrieben.

Ebenfalls beschrieben werden Produkte, die einem klonierten Schwein entnommen wurden. Die Produkte können beliebige Körperfluide oder Organe sein, die aus dem Tier isoliert wurden, oder beliebige Produkte, die aus den Fluiden oder Organen isoliert wurden. Produkte, wie zum Beispiel Fleisch, können aus den klonierten Schweinen entnommen werden. Es ist ferner möglich, den Phänotyp eines Schweins zu bestimmen, das ein geschlechtsloses (neutered) Tier ist, und anschließend dieses Tier zu klonieren, sodass die klonierten Tiere eine funktionelle Reproduktion aufweisen und zur Erzeugung von Samen verwendet werden können. Andere bevorzugte Ausführungsformen, die keinen Teil der vorliegenden Erfindung darstellen, betreffen solche Produkte wie Transplantatmaterialen, Sperma, Embryos, Oocyten, beliebige Zelltypen und Nachkommen, die von klonierten Tieren der Erfindung stammen.

Transplantatmaterialien, die zuvor hier beschrieben wurden, können beliebiges zelluläres Material betreffen, das aus einem Organismus entnommen und in einem anderen Organismus eingepflanzt wurde. Medizinische Verfahren zur Entnahme zellulären Materials aus einem Organismus und Transplantieren dieses Materials in einen anderen Organismus sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Beispiele für bevorzugtes zelluläres Transplantatmaterial kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus zellulärem Material von Leber, Lunge, Herz, Nerven, Gallenblase und Pankreas besteht.

Wie in einem vorangegangenen Abschnitt diskutiert, können transgene Tiere mit Hilfe der Verfahren der Erfindung unter Verwendung transgener Techniken, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, generiert werden. Vorzugsweise können klonierte transgene Schweine mit Hilfe dieser Verfahren erzeugt werden. Diese klonierten transgenen Tiere können verändert (engineered) werden, sodass sie resistent oder teilweise resistent gegenüber Krankheiten und Parasiten sind, die endemisch für solche Tiere sind. Beispiele für diese Erkrankungen und Parasiten sind in einem vorangegangenen Abschnitt dargestellt.

Außerdem können die klonierten transgenen Tiere verändert werden, sodass sie ein rekombinantes Produkt erzeugen. Beispiele für rekombinante Produkte sind in einem vorangegangenen Abschnitt dargelegt. Die Expression dieser Produkte kann von bestimmten Zellen oder Regionen innerhalb der klonierten transgenen Tiere gesteuert werden, indem ein geeignetes Promotorelement und andere regulatorische Elemente selektiv verändert werden, um dieses Ziel zu erreichen.

Zum Beispiel können humane rekombinante Produkte im Urin von Kälbern durch operative Verknüpfung eines Uroplankinpromotors mit der DNA Sequenz, die ein rekombinantes Produkt kodiert, exprimiert werden. Alternativ sind Beispiele zur selektiven Expression humaner rekombinanter Produkte in der Milch eines Rindes Fachleuten bekannt.

Sobald das rekombinante Produkt oder die rekombinanten Produkte in einem spezifischen Gewebe oder Fluid des klonierten transgenen Tiers exprimiert wurden, kann das geeignete Gewebe oder Fluid mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Verfahren entnommen werden. Die rekombinanten Produkte können aus dem Fluid oder Gewebe mit Hilfe von Standardreinigungsverfahren gereinigt werden, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind.

BEISPIELE

Die nachfolgenden Beispiele sind nicht einschränkend und lediglich repräsentativ für verschiedene Aspekte und Merkmale der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1: Herstellung einer Feeder-Schicht

Eine Schicht aus fötalen Fibroblasten-Feederzellen wurde aus Mäuseföten hergestellt, die vom Tag 10 bis 20 der Schwangerschaft stammten. Der Kopf, die Leber, das Herz und der Verdauungstrakt wurden entfernt, und das verbliebene Gewebe wurde gewaschen und bei 37°C in 0.05% Trypsin und 0.53 mM EDTA (Gibca BRL Katalog Nr. 15400-096) inkubiert. Sich ablösende Zellen wurden in Gewebekulturschalen mit MEM-Alpha kultiviert, das mit Penicillin, Streptomycin, 10% fötalem Kälberserum und 0.1 mM 2-Mercaptoethanol supplementiert war. Die Kulturen aus Feeder-Zellen wurden über eine Periode von zwei bis drei Wochen bei 37.4°C, 3.5% CO2 und befeuchteter Luft etabliert. Vor der Verwendung als Feeder-Zellen wurden Mausfibroblasten mit Mitomycin C (Calbiochem Katalog Nr. 47589) in einer Endkonzentration von 10 &mgr;g/ml für drei Stunden vorbehandelt und fünfmal mit PBS gewaschen, bevor präequilibriertes Wachstumsmedium zugegeben wurde.

Feeder-Zellen können aus Schweineföten etabliert werden, wie anschließend für die Etablierung kultivierter fötaler Schweinefibroblastenzellen beschrieben.

Beispiel 2: Etablierung kultivierter nukleärer Donorzellen aus nicht-embryonalem Gewebe

Ein Vorteil der hier definierten Materialen und Methoden ist die Fähigkeit, eine totipotente Zelle aus nahezu jedem Typ einer Vorläuferzelle zu etablieren.

1. Etablierung kultivierter Zellen aus fötalem Schweinegewebe

Zellen der Keimleiste wurden aus Schweineföten isoliert und mit proteolytischen Enzymen (Pronase E oder Trypsin) dissoziiert. Zellen mit EG Zellmorphologie bildeten sich direkt aus den verdauten Keimleisten, wuchsen aber schneller, wenn sie auf Schichten aus Mausfeeder-Zellen etabliert wurden (siehe Beispiel 1). Die Zugabe der Wachstumsfaktoren hrLIF und bFGF zum Zellkulturmedium hatte nur einen geringen Effekt auf die Etablierung und Proliferation der EG-Zellen. Die Proliferationsraten der EG Zellen erhöhten sich, wenn 17 mM D-Glucose in das Kulturmedium gegeben wurde. Zellkulturmedien enthielten &agr;-MEM, 10% fötales Rinderserum und 0.1 mM 2-Mercaptoethanol.

Föten im Alter von 33, 36, 47 und 54 Tagen wurden als Quelle für die Zellen der Keimleiste verwendet. EG Zellen aus 33, 36 und 47 Tage alten Föten waren schwieriger zu etablieren und wuchsen im allgemeinen langsamer. Die EG Zellen wurden von anderen Zelltypen überwachsen, typischerweise verlängerte Zellen, die wie Fibroblasten aussahen, wenn die Zellkulturen aus Zellen der Keimleiste etabliert wurden, welche aus 33, 36 und 47 Tage alten Föten isoliert wurden. Im Gegensatz dazu wuchsen EG Zellen aus einem 54 Tage alten Fötus relativ schnell und bildeten innerhalb von ein bis zwei Wochen große Kolonien. Die EG Zellen wurden physisch von anderen kompetierenden Zelltypen isoliert und wurden bis zur Konfluenz als Monolayer aus anscheinend einem Zelltyp mit typischer EG Zellmorphologie angezogen, einer Morphologie, die hier beschrieben wird.

2. Etablierung kultivierter Schweinekumuluszellen

Kumuluszellen wurden aus Kumulus/Oozyten-Komplexen aus Schweinen isoliert, die in vitro maturiert wurden. Die Kumukus/Oozyten-Komplexe wurden Ovarien aus Schlachthäusern entnommen und in einem Schweinematurierungsmedium (anschließend beschrieben) maturiert. Die Kumuluszellen wurden aus dem Kumulus/Oozyten-Komplexen entfernt, indem die Kumulus/Oozyten-Komplexe mit 500 &mgr;l TL HEPES in 15 ml Zentrifugenröllchen inkubiert und die Inhalte der Röhrchen unter Verwendung eines Vortex-Mischers gevortext wurden (3 Minuten bei halber Geschwindigkeit vortexen).

Eine Zellsuspension, die aus den gevortexten Kumulus/Oozyten-Komplexen resultiert, wurde in eine Petri-Schale tranferiert, nachdem sie zweimal mit 10 ml TL HEPES gewaschen wurde. Die Petri-Schale wurde unter ein Mikroskop gegeben, und die Oozyten wurden mit einer kleinen Bohrungspipette (small bore pipette) manuell aus der Zellsuspension entfernt.

Sobald die Oozyten aus der Zellsuspension entfernt wurden, wurden die verbliebenen Kumuluszellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde in eine Zentrifuge gestellt, um die Kumuluszellen zu pelletieren. Die pelletierten Kumuluszellen wurden in 5 ml Kulturmedium resuspendiert, das MEM-&agr;, 10% fötales Kälberserum und 0.1 mM &bgr;-Mercaptoethanol enthielt, und in einer Zelldichte von ungefähr 25.000 Zellen/ml in eine 60 mm Gewebekulturschale aliquotiert.

Die Kumuluszellen wurden mit Hilfe von Standardzellkulturverfahren kultiviert. Die Zellkulturmedien wurden alle drei bis vier Tage gewechselt, und die Kumuluszellen wurden passagiert, wenn sie konfluent waren.

3. Etablierung kultivierter amniotischer Schweinezellen

Einem schwangeren weiblichen Schwein wird mit Hilfe eines "guided needle"-Verfahrens amniotisches Fluid entnommen. Das amniotische Fluid wird in ein chronisches 15 ml Röhrchen transferiert und 10 Minuten bei 100 × g zentrifugiert. Die Flüssigkeit des Überstandes wird entfernt, wobei 1 ml Flüssigkeit auf dem Zellpellet gelassen wird. Das Zellpellet wird in diesem 1 ml amniotischer Flüssigkeit resuspendiert. 0.5 ml der amniotischen Zellprobe werden zu 4.5 ml vollständigem AmnioMax Medium (90 ml AmnioMax-C100 Basalmedium + 15 ml AmnioMax-C100 Supplement [Gibco BRL]) in eine T25 Zellkulturflasche gegeben und in einem Inkubator bei einer Temperatur von 39°C und einer Atmosphäre mit 5% CO2 gegeben.

Amniotische Zellen heften sich innerhalb von etwa vier Tagen an die Kulturflaschen an. Amniotische Zellkulturen waren typischerweise innerhalb von 7 bis 14 Tagen 70% konfluent. Die Zellen werden durch Entfernen des Zellkulturmediums aus den Flaschen und zweimaliges Waschen der Zellen mit EBSS Medium oder PBS Medium (ohne Calcium oder Magnesium, Gibco BRL) passagiert. Zu den Kulturflaschen werden 0.2 ml einer Trypsin/EDTA-Lösung (Gibco BRL) gegeben und bei 39°C inkubiert, bis die Zellen sich von. den Oberflächen der Kulturflaschen ablösen. Nach dem Ablösen der Zellen von den Oberflächen der Kulturflaschen wird Zellkulturmedium zu den Flaschen gegeben, um das Trypsin zu inaktivieren, und die Zellen wurden in drei neue T25 Flaschen aufgeteilt.

4. Etablierung kultivierter fötaler Schweinefibroblastenzellen

Kultivierte fötale Schweinefibroblastenzellen wurden aus Schweineföten hergestellt, die vom Tag 33 bis 54 der Schwangerschaft stammten. Der Kopf, die Leber, das Herz und der Verdauungstrakt wurden entfernt und das verbliebene Gewebe gewaschen und bei 37°C in 0.05% Trypsin und 0.53 mM EDTA (Gibco BRL Katalog Nr. 15400-096), verdünnt mit Ca2+- und Ma2+- freiem Dulbecco's PBS (Gibco BRL Katalog Nr. 14190-151), inkubiert. Abgelöste Zellen wurden in Gewebekulturschalen mit MEM-&agr; (Gibco BRL Katalog Nr. 32561-037) kultiviert, das mit Penicillin, Streptomyzin, 10% fötalem Rinderserum (Hyclone Katalog Nr. SH300070.03) und 0.1 mM 2-Mercaptoethanol (Gibco BRL Katalog Nr. 21985-023) supplementiert war. Fötale Schweinezellen wurden über einen Zeitraum von zwei bis drei Wochen bei 37.4°C, 3.5% CO2 und befeuchteter Luft etabliert.

5. Etablierung kultivierter Schweinefibroblastenzellen aus adulten Tieren

Ein erster Schritt zur Etablierung totipotenter Zellen aus Geweben ausgewachsener Tiere ist die Etablierung einer Primärkultur aus isolierten Zellen. Obwohl das nachfolgende Verfahren Proben aus einer Ohrstanzung betrifft, kann dieses Verfahren auf Zellen angewendet werden, die aus einem beliebigen Gewebetyp isoliert werden. Die nachfolgenden Schritte werden vorzugsweise unter Verwendung steriler Verfahren durchgeführt.

  • 1. Zweimaliges Waschen jeder Ohrprobe mit 2 ml Trypsin/EDTA-Lösung in zwei getrennten 35 mm Petri-Schalen. Getrenntes Weiterverarbeiten einer jeder Ohrprobe. Zerkleinern der Ohrprobe mit sterilen Scheren und Skalpellen in 35 mm Petri-Schalen, die 2 ml einer Trypsin/EDTA-Lösung enthält. Die zerkleinerten Stücke sind vorzugsweise weniger als 1 mm im Durchmesser groß.
  • 2. Inkubieren der zerkleinerten Ohrstücke in der Trypsin/EDTA-Lösung für 40 bis 50 Minuten in einem 37°C Inkubator unter gelegentlichem Mischen. Die Trypsin/EDTA-Lösung wird anschließend im Detail beschrieben. Die Schale kann mit einem dehnbaren Material, wie z.B. Parafilm, umhüllt sein, um eine CO2 Akkumulation zu verhindern.
  • 3. Transfer der verdauten Ohrstücke in ein steriles 15 ml Röhrchen, Waschen der Schale, aus der die verdauten Ohrstücke entnommen wurden, mit 2 ml der Trypsin/EDTA-Lösung und Transfer dieser Waschlösung in das sterile Röhrchen.
  • 4. Vortexen des Röhrchens für zwei Minuten bei hoher Geschwindigkeit.
  • 5. Zugabe von 5 ml Zellkulturmedium (nachfolgend definiert), um das Trypsin zu inaktivieren.
  • 6. Zentrifugieren des 15 ml Röhrchens bei 280 × g für 10 Minuten.
  • 7. Dekantieren des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in der verbliebenen Lösung durch vorsichtiges Antippen der Seite des Röhrchens.
  • 8. Zugabe von 2 ml Zellkulturmedium zum Röhrchen und anschließendes Zentrifugieren, wie in Schritt 6 beschrieben.
  • 9. Dekantieren des Überstands, Resuspendieren des Pellets, wie in Schritt 7 beschrieben, und anschließende Zugabe von 2 ml Medium.
  • 10. Aufbewahren von zwei bis drei Stücken des Ohres für eine DNA Analyse und Lagerung bei –80°C in einem 2 ml Röhrchen.
  • 11. Transfer der resuspendierten Zellen in eine 35 mm Kulturschale und Inkubation bei 37°C in einer befeuchteten 5% CO2/95% Luftatmosphäre.
  • 12. Medienwechsel alle zwei bis vier Tage.

Eine Trypsin/EDTA-Lösung wurde durch Mischen einer Trypsin/EDTA-Lösung (Gibco BRL Katalog Nr. 15400-096) mit Ca2+-freier und Mg2+-freier Dulbecco's phosphat-gepufferter Saline (PBS) (Gibco BRL Katalog Nr. 14190-151) hergestellt, sodass die Lösung 0.05% Trypsin (w/v) und 0.53 mM EDTA enthielt. Die Lösung wurde durch Filtration über einen 0.2 &mgr;m Filter sterilisiert.

Ein Zellkulturmedium wurde durch Mischen von essentiellem MEM-Alpha Minimalmedium (Gibco BRL Katalog Nr. 32561-037), 10% fötalem Rinderserum (Hyclone Nr. SH30070.03), 0.1 mM 2-Mercaptoethanol (Gibco BRL Katalog Nr. 21985-023), 100 U/ml Penicillin, 100 &mgr;g/ml Streptomycin und 0.25 &mgr;g/ml Amphotericin B (Fungizone) hergestellt.

Beispiel 3: Reprogrammieren kultivierter Schweinezellen

Falls die mit Hilfe der in Beispiel 2 gelehrten Verfahren hergestellten kultivierten Zellen nicht eindeutig totipotent sind, können die Zellen mit Hilfe des nachfolgenden Verfahrens reprogrammiert werden.

Eine Suspension aus Zellen der Keinleiste (Endkonzentration 100.000 Zellen/ml) wird in eine 35 mm Petrischale gegeben, die eine Feeder-Schicht aus murinen primären embryonalen Fibroblasten enthält. Das Kulturmedium kann essentielles MEM-Alpha Minimalmedium (Gibco BRL Katalog Nr. 32561-037), 10% fötales Rinderserum (Hyclon Katalog Nr. SH30070.03), 0.1 mM 2-Mercaptoethanol (Gibco BRL Katalog Nr. 21985-023), 100 ng/ml humaner rekombinanter Leukämie Inhibitorfaktor (hrLIF; R&D System Katalog Nr. 250-L), 100 ng/ml boviner basischer Fiboblastenwachstumsfaktor (bFGF; R&D System Katalog Nr. 133-FB) bei 37.5°C und 5% CO2 sein. Exogener Steel-Faktor (z.B. membranassoziierter Steel-Faktor und löslicher Steel-Faktor) brauchen nicht zum Kulturmedium zugegeben werden.

Kulturmedium, das mit 100 ng/ml hrLIF und 100 ng/ml bFGF supplementiert ist, wird typischerweise mit Vorläuferzellen für zehn bis vierzehn Tage inkubiert. Alle zwei bis vier Tage wird das supplementierte Medium mit frischem supplementiertem Medium ersetzt. Die EG Zellen können zu jeder Zeit in diesen Kultivierungsverfahren beobachtet werden. Diese EG Zellen können aus der Zellkultur isoliert und separat kultiviert werden, um homogenen EG Zellkulturen zu etablieren.

Um die EG Zelllinien aufrechtzuerhalten, werden Zellpopulationen mit hoher Dichte jede Woche in einer Verdünnungsrate von 1:4 bis 1:8 passagiert. Die Zellen werden durch Inkubieren mit einem 0.05 Trypsin/0.53 mM EDTA-Gemisch und Herstellen neuer Kulturen in frischem Wachstumsmedium passagiert. Die wachstumsfördernde Kapazität von MEM-Alpha Medium für totipotente Zellen kann durch Zugabe von Insulin-Transferin, Natriumselenit-Supplement, 1:100 verdünnt (Sigma Katalog Nr. 11884), zum Zellkulturmedium erhöht werden. Als eine Vorsichtsmaßnahme gegen eine Mycoplasmenkontamination kann eine kurzfristige Kultivierung mit Tylasintartrate (Sigma Katalog Nr. T3151) durchgeführt werden. Vor den NT werden die Zellen mit Hilfe einer PCR, die mit DNA Primern durchgeführt wird, welche spezifisch für Mycoplasmensequenzen sind (Stratagene Katalog Nr. 302007), auf die Anwesenheit von Mycoplasmen untersucht.

Beispiel 4: Oocyten Maturierung 1. Absaugen und Entnahme von Oocyten

Schweineovarien wurden bei 25°C in ein Labor transportiert und sofort mit 0.9% Saline gewaschen. Folikel zwischen 3 und 6 mm wurden mit Hilfe von Nadeln der Breite 18 (18 gauge needles) und 50 ml Röhrchen, die mit einem Vakuumsystem verbunden waren, abgesaugt, wobei das Vakuum auf eine Flussrate von 45 ml/min eingestellt wurde. Nach dem Absaugen ließ man die Oocyten sich für 5 bis 10 Minuten absetzen. Folikelflüssigkeit (pFF) wurde abgesaugt und für die Verwendung in Maturierungssystemen aufbewahrt, falls dies benötigt wird.

Die Oocyten wurden durch Resuspendieren in 20 ml Hepes-PVA Medium und anschließendes Sichabsetzenlassen der Oocyten gewaschen. Das Medium wurde entfernt, und der Waschschritt wurde zwei weitere Male wiederholt. Hepes-PVA Medium enthält 114 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM CaCL2, 0.5 MgCL2, 2 mM NACO3, 0.3 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES, 12 mM Sorbitol, 0.2 mM Natriumpyruvat, 0.05 &mgr;l/ml Gentamycin, 0.07 g/l Penicillin G, 0.1 g/l Polyvinylalkohol und 2 ml/l Natriumlacat und weist einen pH von 7.4 auf. Gewaschene Oocyten wurden im Anschluss in ein Maturierungsmedium gegeben.

2. In vitro Maturierung

Die Oocyten wurden dreimal in Maturierungsmedium gewaschen, und 50 Oocyten/Well wurden 20 bis 22 Stunden in 0.5 ml Maturierungsmedium in 4 Well-Platten transferiert, wobei das Maturierungsmedium Hormone enthielt. Zusätzlich wurden sechs bis acht Stücke der Folikelhülle zu den Wells gegeben, obwohl die Zugabe der Hüllstücke optional ist. Es ist bekannt, dass Stücke der Folikelhülle die cytoplasmatische Maturierung von Schweineembryos verbessern, was eine Erhöhung des Entwicklungspotentials der Oocyte zur Folge hat. Siehe z.B. Abeydeera et al., 1998, Biol. Reprod. 58: 213–218.

Das Maturierungsmedium enthält 109 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 6 mM Glucose, 1 mM Glutamin, 12 mM Sorbitol, 5 mg/l Insulin, 100 IU/l Penicillin G und 50 mg/l Streptomycin und weist einen pH von 7.4 auf. Follikelflüssigkeit (pFF) aus Schweinen kann in einer Konzentration von etwa 10% (Volumen pro Volumen) zum Maturierungsmedium gegeben werden. Ferner kann &bgr;-Mercaptoethanol in einer Konzentration von 50 &mgr;M zum Maturierungsmedium gegeben werden. Zusätzlich kann Cystein in einer Endkonzentration von 0.6 mM zum Maturierungsmedium gegeben werden. Maturierungsmedien mit Hormonen enthielten 10 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor, 10 U/ml Chriones Pferde Gonadotropin, 10 U/ml humanes choriones Gonadotropin und 1 mM db-cAMP.

Die Oocyten und die Stücke der Folikelhülle wurden anschließend in 0.5 ml frisches Maturierungsmedium transferiert und weitere 20–22 Stunden maturiert, wobei die Maturierungsmedien keine Hormone oder db-cAMP enthielten. Die Oocyten wurden insgesamt 40–44 Stunden bei 39°C in einer 5% CO2 Atmosphäre maturiert.

Beispiel 5: Nukleärer Transfer

Nach 42 bis 46 Stunden Maturierung wurden die Oocyten von den Kumuluszellen durch Vortexen der maturierten Oocyten für ungefähr 2 Minuten entfernt. Nach den Vortexen wurden die Oocyten hinsichtlich der Raten der Polarkörperbildung untersucht. Die Raten der Polarkörperbildung können durch visuelle Detektion mit einem Stereomikroskop untersucht werden. Die visuelle Evaluierung der Raten der Polarkörperbildung kann durch Anfärben der Oocyten in einem Medium mit 3 &mgr;g/ml Hoechst 33342 und 7.5 &mgr;g/ml Cytochalasin B für etwa 20 Minuten erhöht werden. Die Oocyten wurden anschließend mit einer Entkernungspipette entfernt.

NT-Verfahren wurden durchgeführt, nachdem die Oocyten entfernt waren. In jedem NT-Verfahren wurde eine nukläre Donorzelle angrenzend an eine Oocyte platziert, sodass je ein Teil der Plasmamenbran jeder Zelle einander berührten und sodass der nukleäre Donor an die Zona pellucida der Oocyte angrenzte. Als nukleäre Donoren für die NT-Verfahren wurden Schweine EG-Zellen, kultivierte Schweinezellen aus der Keimleiste, kultivierte Schweinefiboblastenzellen und kultivierte Schweine Kumuluszellen sowie Kumuluszellen verwendet, die nach 48 Stunden Maturierung aus einem Kumulus/Oocyten-Komplex assoziiert wurden.

Nachdem ein nukleärer Donor angrenzend an eine entkernte Oocyte platziert wurde, wurden die beiden Zellen fusioniert. Drei Medien können für die Fusion der Zellen verwendet werden: (1) 0.25 M Sorbitol, 0.1 mM CaOAc, 0.5 mM MgOAc und 0.1% BSA; (2) 0.3 mM Mannitol, 0.1 mM MgSO4, 0.5 mM CaCL2 und 0.1% BSA; (3) 0.3 M Mannitol, 5% TL Hepes und 0.3% BSA; und (4) Zimmerman's Medium. Nach der Fusion wurden die fusionierten Oocyten für vier Stunden kultiviert, wobei die Kultur 109 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 6 mM Glucose, 1 mM Glutamin, 7 mM Taurin, 5 mM Hypotaurin, 0.4% BSA, 100 IU/l Penicillin G und 50 mg/l Streptomycin enthielt und einen pH von 7.4 aufwies. Die fusionierten Oocyten können ferner in einem CR2 Medium kultiviert werden (CR1 Medium supplementiert mit Aminosäuren), wobei das letztere beschrieben ist im U.S. Patent Nr. 5,096,822, "Bovine embryo medium," Rosenkrans Jr. et al., 3. November 1992.

Beispiel 6: Aktivierung

Nachdem die fusionierten Oocyten nach der Fusion für 4 Stunden kultiviert wurden, wurden sie in 10 &mgr;M Ionomycin in ZI Lösung (TL-Hepes Stammlösung + 1 mg/ml BSA) für acht Minuten inkubiert und anschließend in Z30 Lösung (TL-Hepes Stammlösung + 30 mg/ml BSA) für 5 Minuten gespült. Die TL-Hepes Stammlösung enthielt 114 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM NaHCO3, 0.3 mM NaH2PO4, 10 mM Hepes, 2 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, 2 ml/l Natriumlactat und 1 ml/l Phenolrot und wies einen pH von 7.4 auf.

Die Oocyten wurden dreimal mit TL-Hepes PVA gewaschen und anschließend in einer 2 mM DMAP-Lösung in CR2 Medium mit BSA für vier Stunden bei 39°C in einer 5% CO2 Atmosphäre inkubiert. Nach der Aktivierung wurden die Oocyten dreimal mit TL-Hepes PVA gespült und in Medien zur Kultur für Schweineembryos gegeben.

Beispiel 7: In vitro Kultur aktivierter Oocyten und Embryos

Nach Entfernung der DMAP-Lösung wurden die aktivierten Oocyten und Cybride dreimal in TL-Hepes DVA gewaschen und vier Tage in eine Medium zur Kultur von Schweineembryos gegeben. Das Medium zur Kultur von Embryos enthielt 109 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3, 1 mM KH2PO4, 6 mM Glukose, 1 mM KH2PO4, 6 mM Glucose, 1 mM Glutamin, 12 mM Sorbitol, 5 mg/l Insulin, 100 IU/l Penicillin G und 50 mg/l Streptomycin und wies einen pH von 7.4 auf. Aktivierte Oocyten und Cybride können ferner in CR2 Medium kultiviert werden. Am Tag 4 werden die Embryos auf Spaltung untersucht und anschließend drei weitere Tage in frisches Embryokulturmedium transferiert, das mit 10% fötalem Kälberserum (v/v) supplementiert ist. Am Tag 7 werden die Embryos hinsichtlich der Entwicklung von Blastocysten evaluiert.

Beispiel 8: Reklonierungsverfahren

Ein oder mehr optionale Reklonierungszyklen können zur Verbesserung der Totipotenz nukleärer Donorzellen durchgeführt werden. In einem Reklonierungszyklus werden die Zellen aus dem ersten NT-Zyklus entweder durch Pronase E (1–3 mg/ml in TL HEPES) oder mechanisch nach Behandlung mit Cytochalasin B disaggregiert, wenn sich die Embryos im Morulastadium befinden. Einzele Blastomere werden in den perivitellinen Raum einer entkernten Oocyte (52–54 Stunden nach der Maturierung, wie im Beispiel 4 gelehrt) eingebracht.

Ein einzelner Blastomer wird mit der entkernten Oocyte mittels Elektrofusion in einer 500 &mgr;m Kammer mit einem elektrischen Puls von 105 Volt für 15 Sekunden in einer isotonischen Sorbitollösung (0.25 M) bei 30°C fusioniert. Es ist nicht notwendig, dass die fusionierte Oocyte für die Reklonierungszyklen einer chemischen Aktivierung unterworden wird.

Nach der Oocytenfusion werden die fusionierten Oocyten aus dem zweiten NT-Zyklus in Embryokulturmedium unter befeuchteter Luft mit 5% C&Ogr;2 bei 39°C kultiviert. Solche Embryos können in ein Empfängerweibchen transferiert werden.

Beispiel 9: Transfer von Schweineembryos in einen maternalen Empfänger und Entwicklung eines klonierten Schweins

Gonadotrophine (PG600TM) werden in 10 junge weibliche Schweine (gilts) injiziert, was etwa 2–5 Empfänger zur Folge haben sollte, die 3–5 Tage nach der Behandlung Östrus zeigen. Synchronisierte junge weibliche Schweine werden mit dem Embryotransfer entweder am Tag 3 oder Tag 5 des Östrus verwendet. Embryos im frühen Stadium (< 8 Zellen) werden am Tag 3 des Östrus in die Empfänger transferiert, und Embryos in einem späteren Stadium (> 8 Zellen) werden am Tag 5 des Östrus an weitere Empfänger transferiert. Die Tiere werden anästhetisiert, es wird eine Öffnung des mittleren Bauchbereichs (mid-ventral laparotomy) durchgeführt, und der Fortpflanzungstrakt wird entfernt. Das Embryotransferverfahren besteht aus dem Transfer 30 bis 50 Embryos im frühen Stadium, die in den Eileiter eingebracht werden, oder aus dem Transfer von Embryos in einem späteren Stadium (Embryos im Morula- oder Blastocystenstadium) in die Gebärmutterkappe (uterine horn). Die Empfänger werden hinsichtlich der Initiation der Schwangerschaft untersucht und fortlaufend mittels wöchentlicher Ultraschalluntersuchungen überwacht.

Beispiel 10: Klonierung transgener Schweine

Transgene Zellen, die zur Etablierung eines klonierten transgenen Schweins geeignet sind, können aus den Zellen hergestellt werden, die aus einem adulten Tier isoliert wurden. 3 veranschaulicht Verfahren, die zur Etablierung solcher transgener Zellen verwendet werden können. Obwohl transgene Zellen aus nahezu jedem Zelltyp mit Hilfe der Lehren der Erfindung etabliert werden können, veranschaulicht 3 Verfahren zur Etablierung transgener embryonaler Stammzellen und transgener totipotenter Zellen.

Fibroblastenzellkulturen können aus Ohrstanzungen etabliert werden, welche einem Schwein entnommen wurden, wie zuvor definiert. Zusätzlich können kultivierte Fibroblastenzellen aus Schweineföten etabliert werden. Einzelne Zellen können aus dieser Zellkultur isoliert und als nukleäre Donoren in einem nukleären Transferverfahren verwendet werden. Ein einzelner nukleärer Transferzyklus oder multiple nukleäre Transferzyklen können angewandt werden. Weitere optionale Schritte sind in den obigen Beispielen definiert.

Die Zellen können anschließend mit einem DNA Konstrukt transfiziert werden. Die Zellen können in vielen Stadien transfiziert werden, wie in 3 dargestellt. Materialien und Verfahren zur Herstellung transgener Zellen werden in den zuvor zitierten Publikationen definiert. Die totipotenten Zellen der Erfindung können mit einer DNA transfiziert werden, die (a) ein Antibiotika-Resistenzgen, (b) eine DNA Sequenz, die ein Protein oder Proteine kodiert, und (c) ein Promotorelement oder Promotorelemente umfasst. Die transfizierten Zellen werden bezüglich der transgenen Modifikation durch Selektion in einem Zellkulturmedium selektiert, das ein Antibiotikum enthält. Die transgenen Zellen werden anschließend unter Verwendung von einem oder mehr Screeningverfahren bezüglich der transgenen Modifikation gescreeent. Beispiele dieser Verfahren sind: (1) Polymerasekettenreaktion, (2) Southern-Blotting, und (3) Fiber-FISH Verfahren. Diese Verfahren sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Die letzteren beiden Verfahren können verwendet werden, um die Kopienzahl einer inserierten Gensequenz in der nukleären DNA embryonaler Keimzellen zu bestimmen.

Diese Screening Verfahren können auch bei transfizierten Zellen in einem beliebigen der in 3 angezeigten Schritte angwandt werden. Klonierte transgene Tiere werden mit Hilfe einer transgenen Zelle als nukleärer Donor in einem NT-Prozess etabliert, wie in Beispiel 5 beschrieben. Die fusionierten Oocyten, die durch ein solch ein Verfahren erzeugt werden, werden zur Erzeugung eines klonierten transgenen Schweins den Verfahren unterworfen, die in den Beispielen, 6, 7, 9 und optional 8 gelehrt werden.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Erzeugung eines klonierten Schweineembryos, das umfasst:

    (a) Maturieren einer Schweineoocyte über einen Zeitraum von 42 bis 46 Stunden;

    (b) Translozieren einer totipotenten nukleären Schweinedonorzelle oder eines Zellkerns davon in eine entkernte Schweineoocyte, um eine nukleäre Transferoocyte herzustellen; und

    (c) Aktivieren der nukleären Transferoocyte, um das Schweineembryo herzustellen.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die totipotente nukleäre Donorzelle mit Hilfe eines Verfahrens erhalten wird, das umfasst:

    (a) Isolieren von einer oder mehr Zellen aus einem Schweinefötus; und

    (b) Kultivieren der einen oder mehr Zellen in einem Zellkulturmedium, um die totipotente Schweinezelle herzustellen.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die totipotente nukleäre Donorzelle mit Hilfe eines Verfahrens erhalten wird, das umfasst:

    (a) Isolieren von einer oder mehr Zellen aus einem lebendgeborenen Schwein; und

    (b) Kultivieren der einen oder mehr Zellen in einem Zellkulturmedium, um die totipotente Schweinezelle herzustellen.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, das ferner das Einbringen eines Stimulus zu den kultivierten Zellen umfasst.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Stimulus einen Cocktail aus Repetorliganden umfasst.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei die isolierte(n) Zelle(n) aus der Gruppe ausgewählt wird (werden), die aus einer nicht-embryonalen Zelle, einer differenzierten Zelle, einer Fibroblastenzelle, einer primordialen Keimzelle, einer Zelle der Keimleiste, einer embryonalen Zelle, einer Kumuluszelle und einer amniotischen Zelle besteht.
  7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Schweinezelle modifizierte nukleäre DNA umfasst.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei die Zellkultur Feeder-Zellen umfasst.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei das Zellkulturmedium mehr als 10 mM Glukose umfasst.
  10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Translokation den Schritt der Fusion von nukleärem Donor und Oocyte umfasst.
  11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Aktivierungsschritt umfasst:

    (a) Erhöhen der intrazellulären Spiegel an divalenten Kationen in der Oocyte; und

    (b) Reduzieren der Phosphorylierung zellulärer Proteine in der Oocyte.
  12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Aktivierungsschritt das Einbringen von Ionomycin und DMAP in das nukleäre Transferembryo umfasst.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das Ionomycin bei etwa 10 &mgr;M liegt und das DMAP bei etwa 2 mM liegt.
  14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, das ferner die in vitro Kultur des klonierten Schweineembryos umfasst.
  15. Nicht-chirurgisches Verfahren zur Erzeugung eines klonierten Schweinefötus, das umfasst:

    (a) Erzeugen eines klonierten Schweineembryos mit Hilfe des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14; und

    (b) Implantieren des klonierten Schweineembryos in den Uterus eines Mutterschweins, um sich zum klonierten Fötus zu entwickeln.
  16. Nicht-chirurgisches Verfahren zur Erzeugung eines lebendgeborenen klonierten Schweins, das umfasst:

    (a) Erzeugen eines klonierten Schweineembryos mit Hilfe des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14; und

    (b) Implantieren des klonierten Schweineembryos in den Uterus eines Mutterschweins, um einen Fötus zu erzeugen, der die vollständige fötale Entwicklung und die Geburt durchläuft, um das lebendgeborene Schwein zu generieren.
Es folgen 3 Blatt Zeichnungen






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