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Dokumentenidentifikation DE60205631T2 08.06.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001407006
Titel METHODE ZUR GEWINNUNG UND REINIGUNG VON POXVIREN AUS INFIZIERTEN ZELLEN
Anmelder Bavarian Nordic A/S, Kvistgaard, DK
Erfinder HELLER, Karl, D-85774 Unterföhring, DE;
KRAMER, Jutta, D-82140 Olching, DE
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 60205631
Vertragsstaaten AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE, SI, SK, TR
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 13.12.2002
EP-Aktenzeichen 027879451
WO-Anmeldetag 13.12.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/EP02/14179
WO-Veröffentlichungsnummer 0003054175
WO-Veröffentlichungsdatum 03.07.2003
EP-Offenlegungsdatum 14.04.2004
EP date of grant 17.08.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 08.06.2006
IPC-Hauptklasse C12N 7/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 15/86(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 39/275(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Pockenviren, insbesondere modifiziertem Vacciniavirus Ankara (MVA), aus infizierten Zellen. Der vorliegenden Erfindung gemäß werden die mit Pockenvirus infizierten Zellen einer Hochdruckhomogenisierung unterworfen, um ein pockenvirushaltiges Homogenisat zur erhalten. Das pockenvirushaltige Homogenisat kann mindestens einem Reinigungsschritt unterworfen werden, um eine mit Pockenvirus angereicherte Fraktion zu erhalten. Die Erfindung betrifft des Weiteren die pockenvirushaltige Fraktion und das pockenvirushaltige Homogenisat, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden.

ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK

Die Poxviridae umfassen eine große Familie komplexer DNA-Viren, die sich im Zytoplasma von Vertebraten- und Invertebratenzellen replizieren. Die Familie der Poxviridae kann in die zwei Unterfamilien der Chordopoxvirinae (Vertebratpockenviren) und Entomopoxvirinae (Insektenpockenviren) unterteilt werden.

Die Chordopoxvirinae umfassen mehrere tierische Pockenviren (die in verschieden Gattungen unterteilt sind) von beträchtlicher wirtschaftlicher Bedeutung wie beispielsweise Kamelpockenviren, das Schafspockenvirus, Ziegenpockenvirus oder die Vögelpockenviren, insbesondere das Geflügelpockenvirus. Zum Impfen von Zuchtvieh gegen Schafspocken und Ziegenpocken stehen attenuierte Lebendviren- und inaktivierte Impfstoffe zur Verfügung. Zum Impfen von Geflügel sind rekombinante Impfstoffe unter Zuhilfenahme des Geflügelpockenvirus als Vektor entwickelt worden.

Da das Geflügelpockenvirus menschliche Zellen infiziert, wird angenommen, dass es auch als Vektor zum Exprimieren heterologer Gene beim Menschen und zum Induzieren einer entsprechenden Immunantwort verwendet werden kann. Geflügelpockenviren, die HIV-Gene im Genom enthalten, sind in US 5,736,368 und US 6,051,410 offenbart.

Beim Menschen ist das Variolavirus, ein Mitglied der Gattung Orthopoxvirus, bei Weitem das wichtigste Pockenvirus gewesen. Das Vacciniavirus, ebenfalls ein Mitglied der Gattung Orthopoxvirus der Familien von Poxviridae, ist als Lebendimpfstoff zum Immunisieren gegen Blattern verwendet worden. Die erfolgreiche weltweite Impfung mit dem Vacciniavirus hat zur Ausmerzung des Variolavirus geführt (The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication [Die globale Ausmerzung der Blattern. Endgültiger Bericht der Globalkommission für die Zertifizierung der Blatternausmerzung]; History of Public Health, Nr. 4, Genf: Weltgesundheitsorganisation, 1980). Seit dieser WHO-Erklärung hat man mit dem Impfen viele Jahre lang ausgesetzt, mit Ausnahme bei Leuten, die einem hohen Risiko von Pockenvirusinfektionen (z. B. Laborpersonal) ausgesetzt sind. Impfprogramme werden angesichts des Risikos, dass das Variolavirus in biologischen Kampfmitteln oder durch Bioterroristen verwendet wird, wieder von Interesse.

In letzterer Zeit sind Vacciniaviren auch zum genetischen Engineering von Viralvektoren für die rekombinante Genexpression und zur potentiellen Verwendung als rekombinante Lebendimpfstoffe verwendet worden (Mackett, M., Smith, G.L. und Moss, B. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419; Smith, G.L., Mackett, M. und Moss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407). Das erfordert, dass DNA-Sequenzen (Gene), die für fremde Antigene kodieren, mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechniken in das Genom der Vacciniaviren eingebaut werden. Wird das Gen an einer Stelle in die virale DNA integriert, die für den Lebenszyklus des Virus nicht wesentlich ist, so ist es möglich, dass das neu hergestellte rekombinante Vacciniavirus infektiös, d.h. in der Lage ist, fremde Zellen zu infizieren und dadurch die integrierte DNA-Sequenz zu exprimieren (EP-Patentanmeldungen Nr. 83,286 und Nr. 110,385). Die auf diese Weise zubereiteten rekombinanten Vacciniaviren können einerseits als Lebendimpfstoffe für die Prophylaxe infektiöser Krankheiten, andererseits für die Zubereitung heterologer Proteine in eukaryotischen Zellen verwendet werden.

Die Verwendung des Vacciniavirus als Vektor für die Entwicklung rekombinanter Lebendimpfstoffe ist durch Sicherheitsbedenken und Vorschriften beeinflusst worden. Die meisten der in der Literatur beschriebenen rekombinanten Vacciniaviren basieren auf dem Western Reserve-Stamm des Vacciniavirus. Es ist bekannt, dass dieser Stamm eine hohe Neurovirulenz besitzt und daher zur Verwendung bei Menschen und Tieren schlecht geeignet ist (Morita et al., Vaccine (Impfstoff) 5, 65-70 [1987]). Einerseits ist das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) dafür bekannt, dass es äußerst unbedenklich ist. Das MVA ist durch Langzeit-Seriendurchgang des Ankarastamms des Vacciniavirus (CVA) auf Hühnerembryofibroblasten gebildet worden (bezüglich der Literatur, vergleiche Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. und Stickl, H. [1975] Infection (Infektion) 3, 6-14; Schweizer Patent Nr. 568,392). Beispiele der MVA-Virusstämme, die den Erfordernissen des Budapester Vertrags gemäß aufgebracht worden sind, sind die Stämme MVA 572, MVA 575 und MVA-BN, die bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (Vereinigtes Königreich) unter den Hinterlegungsnummer ECACC V94012707, ECACC V00120707 bzw. ECACC V00083008 hinterlegt worden sind. MVA zeichnet sich durch seine starke Attenuierung, d.h. die reduzierte Virulenz oder Infektiosität aus, während es eine gute Immunogenität beibehält. Das MVA-Virus ist analysiert worden, um Änderungen im Genom im Vergleich mit dem CVA-Stammvom Wildtyp zu bestimmen. Sechs Hauptdeletionen der genomischen DNA (Deletion I, II, III, IV, V und VI), die insgesamt 31.000 Basenpaare umfassen, sind identifiziert worden (Meyer, H., Sutter, G. und Mayr A. [1991] J. Gen. Virol. 72, 1031-1038). Das dabei entstehende MVA-Virus wurde stark auf Vogelzellen wirtszellenbegrenzt. Des Weiteren ist MVA durch seine extreme Attenuation gekennzeichnet. Beim Prüfen in einer Reihe verschiedener tierischer Modelle erwies sich MVA selbst in immungeschwächten Tieren als nicht virulent. Noch wichtiger ist, dass die ausgezeichneten Eigenschaften des MVA-Stamms in ausgedehnten klinischen Versuchen bewiesen worden sind (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]). Während dieser Studien an mehr als 120.000 Personen, einschließlich Patienten mit erhöhtem Risiko, sind keine Nebenwirkungen mit der Verwendung von MVA-Impfstoff in Verbindung gebracht worden. Rekombinantes MVA, das als Impfstoffe nützlich ist, ist schon konstruiert und in klinischen Versuchen verwendet worden. WO 98/13500 offenbart ein rekombinantes MVA, das eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthält und auszudrücken in der Lage ist, die Dengue-Virusantigene kodieren. Die fremden DNA-Sequenzen wurden in die virale DNA an Stellen einer natürlich vorkommenden Deletion im MVA-Genom rekombiniert.

Vor Anwendung von Pockenviren oder rekombinanten Pockenviren für Impfzwecke ist es notwendig, das Virus bis zu einem gewissen Grad zu reinigen, um den Erfordernissen bezüglich der Vorschriften zu entsprechen. Die traditionelle Art, Pockenviren, insbesondere MVA und rekombinantes MVA zu reinigen, ist wie folgt: in einem ersten Schritt werden Zellen, die für die Infektion mit dem jeweiligen Pockenvirus anfällig sind, gezüchtet. Im Falle von MVA sind die anfälligen Zellen u.a. Hühnerembryofibroblaste. Die anfälligen Zellen werden mit dem Pockenvirus infiziert und für eine Zeitspanne kultiviert, die ausreicht, um die Bildung von Virusabkömmlingen zu erlauben. Die Zellen werden dann gefroren und aufgetaut, um die Zellen von der Oberfläche der Züchtungsphiole abzulösen und die Zellen teilweise zu stören. Die Mischung intakter und gestörter Zellen wird geschleudert. Ultraschall wird zum Herstellen eines Homogenisats verwendet. Durch Saccharosedämpfzentrifugieren wird Virus aus dem Homogenisat gereinigt (Joklik WK., "The purification of four strains of poxvirus" – die Reinigung von vier Pockenvirusstämmen – Virology 1962; 18:9-18). Der Schlüsselschritt bei diesem Vorgang besteht aus dem Homogenisieren unter Anwendung von Ultraschall (Hedström, K.G und Lindberg, U., Z. Immun. Forsch. 1969, 137:421-430; Stickl, H., Korb, W. und Hochstein-Mintzel, V., Zbl. Bakt., I. Abt. Orig. (1970), 215, 38-50). Bei technischen Vorgängen wird es vorgezogen, wenn alle Verfahrensschritte leicht zu steuern und reproduzierbar sind. Jedoch besteht der Nachteil der Verwendung von Ultraschall zum Homogenisieren der Viruszellensuspension darin, dass der Ultraschallschritt auf identische Weise schwer zur reproduzieren, schwer einzustellen und es schwierig ist, das Verfahren vom Labor- auf den technischen Maßstab vergrößern.

GEGENSTAND DER ERFINDUNG

Es ist daher ein Gegenstand der Erfindung, ein Verfahren zur Gewinnung von Pockenviren, insbesondere der Vacciniaviren, wie beispielsweise des Stamms MVA, aus mit Pockenvirus infizierten Zellen bereitzustellen, wobei die Homogenisierung der infizierten Zellen reproduzierbar, leicht zu steuern ist und ein leichtes Vergrößern vom Labor- auf den technischen Maßstab erlaubt.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Pockenviren, insbesondere Vacciniaviren, wie beispielsweise Elstree-Stamm- oder modifiziertes Vacciniavirus Ankara (MVA) aus infizierten Zellen. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Pockenvirus aus infizierten Zellen weist den Schritt des Aussetzens der infizierten Zellen einer Hochdruckhomogenisierung unter Erhalt eines pockenvirushaltigen Homogenisats auf.

Es war unerwartet, dass intakte und infektiöse Pockenviren durch das erfindungsgemäße Verfahren gewonnen werden können. Die Hochdruckhomogenisierung wird allgemein für die Zerstörung von Zell- und Subzellstrukturen verwendet, um Proteine oder Lipide von eukaryotischen und prokaryotischen Zellen zu isolieren. US 3,983,008 offenbart ein Verfahren für das Extrahieren nützlicher Komponenten aus mikrobiellen Zellen durch Anwendung von Hochdruckhomogenisierungen. Die extrahierten Verbindungen waren Hefeproteine, Bakterienenzyme und Hefelipide. DE 19 918 619 offenbart die Verwendung des Hochdruckhomogenisierens zum Isolieren von HbsAg von Hefezellen. US 4,255,521 beschreibt ein Verfahren für das Extrahieren von Glukoseisomerase aus Mikroorganismenzellen durch Hochdruckfreigabe. Das Hochdruckhomogenisieren ist auch zum Isolieren von virusähnlichen Teilchen (VÄT) aus rekombinantem Saccharomyces cerevisiae (Milburn und Dunnill (1994) Biotechnology and Bioengineering 44, 736-744) und für die Herstellung und Reinigung von Adenovirusvektoren (US 6,194,191) verwendet worden. VÄT und Adenoviren sind nichtentwickelte und ziemlich kleine und einfache Viren, die deshalb Zellproteinstrukturen gleichen. Aus diesem Grund ist es nicht erstaunlich, dass das Hochdruckhomogenisieren, das sich als für das Isolieren von Proteinen von Zellen geeignet erwiesen hat, auch für das Isolieren von Adenoviren und VÄT von eukaryotischen Zellen verwendet werden kann. Im Gegensatz dazu weisen intrazelluläre reife Pockenvirusvirionen (IRV, man vergleiche unten, vergleiche Fields et al., Fields Virology, 1996, Lippincott-Raven Verlag, Philadelphia, USA, ISBN 0-7817-0253-4, Kapitel 83, Seite 2654-5) eine sehr komplexe Morphologie auf, die unter anderem Lipidmembranen aufweist. Die Morphologie und physikalischen Eigenschaften eines Pockenvirus-IRV sind in gewissen Beziehungen mit der Morphologie und den physikalischen Eigenschaften einer Zelle verwandter als mit denjenigen eines nichtumhüllten Virus. Deshalb war zu erwarten, dass die Bedingungen, die zur Disruption von Zellen unter Anwendung der Hochdruckhomogenisierung angewendet werden, auch zur Disruption von Pockenviren führen würden. Es war daher ein überraschendes Ergebnis, dass die Hochdruckhomogenisierung Zellen stört, jedoch eine ausreichende Menge von Pockenviren intakt lässt, die noch weiter gereinigt werden können. Anders ausgedrückt hätte man nicht angenommen, dass die Hochdruckhomogenisierung bei einem Verfahren zur Gewinnung von Pockenviren aus infizierten Zellen angewendet werden könnte. In der Tat wird bei dem bekannten Verfahre zur Gewinnung von Pockenviren aus infizierten Zellen Ultraschall zum Homogenisieren verwendet, wobei es sich um eine ziemlich sanfte Art der Homogenisierung handelt.

Im Gegensatz zu den Gewinnungsverfahren, bei denen Ultraschall verwendet wird, erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine reproduzierbare Homogenisierung infizierter Zellen; das Verfahren ist leicht zu steuern und der Vorgang kann ohne Weiteres vom Labor- auf den technischen Maßstab vergrößert werden.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung betrifft der Begriff "Pockenvirus" irgendein Virus, das zur Familie der Poxviridae gehört. Das erfindungsgemäße Verfahren wird bevorzugt mit Poxviridae der Unterfamilie Chordopoxviridae, noch bevorzugter der Gattung Orthopoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus und Suipoxvirus durchgeführt. Am bevorzugtesten betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von Pockenviren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vacciniavirus, Ziegenpockenvirus, Schafpockenvirus, Kanarienpockenvirus und Geflügelpockenvirus. Besonders bevorzugt ist das Vacciniavirus. Beispiele von Vacciniavirusstämmen, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, sind die Stämme Elstree, Wyeth, Copenhagen, Temple of Heaven, NYCBH, Western Reserve. Die Erfindung ist nicht auf diejenigen Vacciniavirusstämme, die spezifisch erwähnt werden, beschränkt, sondern kann statt dessen bei irgendeinem Vacciniavirusstamm verwendet werden. Ein bevorzugtes Beispiel eines Vacciniavirusstamms ist der modifizierte Vacciniavirusstamm Ankara (MVA). Ein typischer MVA-Stamm ist MVA 575, der bei der European Collection of Animal Cell Cultures unter der Hinterlegungsnummer ECACC V00120707 hinterlegt worden ist. Am bevorzugtesten ist MVA-BN oder ein Derivat desselben. MVA-BN ist in WO 02/42480 (PCT/EP01/13628) beschrieben worden. Diese internationale Anmeldung offenbart biologische Assays, die es erlauben, zu beurteilen, ob ein MVA-Stamm MVB-BN oder ein Derivat desselben ist, und Verfahren, die es erlauben, MVA-BN oder ein Derivat desselben zu erhalten. Der Inhalt dieser Anmeldung wird in die vorliegende Erfindung summarisch eingefügt. MVA-BN ist bei der European Collection of Animal Cell Cultures mit der Hinterlegungsnummer ECACC V00083008 hinterlegt worden.

Die zu gewinnenden Viren können native Viren, attenuierte Viren oder rekombinante Viren sein.

Der Begriff "rekombinantes Virus" betrifft irgendein Virus, bei dem in das Virusgenom ein heterologes Gen insertiert worden ist, das nicht auf natürliche Weise Teil des Virusgenoms ist. Ein heterologes Gen kann ein therapeutisches Gen, ein Gen, das ein Antigen kodiert, oder ein Pepsid, umfassend mindestens einen Epitop zum Induzieren einer Immunantwort, eine Antisense-Expressionskassette oder ein Ribozymgen sein. Verfahren zum Erhalten rekombinanter Viren sind einem mit dem Stand der Technik vertrauten Fachmann bekannt. Das heterologe Gen wird bevorzugt in eine nichtwesentliche Region des Virusgenoms insertiert. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die heterologe Nukleinsäuresequenz an einer natürlich vorkommenden Deletionsstelle des MVA-Genoms insertiert (in PCT/EP96/02926 offenbart).

Ein "attenuiertes Virus" ist ein Virus, das auf die Infektion des Wirtsorganismuses hin, zu einer geringeren Mortalität und/oder Morbidität im Vergleich mit dem nichattenuierten Muttervirus führt. Ein Beispiel eines attenuierten Vacciniavirus ist der Stamm MVA, insbesondere MVA-575 und MVA-BN.

Von Pockenviren, wie beispielsweise dem Vacciniavirus, ist bekannt, dass sie in zwei verschiedenen Formen existieren: dem Pockenvirus, das an Zellmembranen im Zytoplasma der infizierten Zellen (intrazelluläre reife Virionen (IRV)) anhaften und Viren, die externalisiert worden sind (extrazelluläre eingehüllte Virionen (EEV)) (Vanderplasschen A., Hollinshead M., Smith G.L. "Intracellular and extracellular vaccinia virions enter cells by different mechanisms" (Intrazelluläre und extrazelluläre Vacciniavirionen treten in Zellen durch verschiedene Mechanismen ein) J. Gen. Virol (1998), 79, 877-887). IRV und EEV sind beide infektiös, jedoch morphologisch verschieden, da EEV eine zusätzliche Lipoproteinumhüllung enthalten. Unter normalen Bedingungen sind IRV-Teilchen weitverbreiteter als EEV, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können jedoch beide Teilchentypen erhalten werden.

Die Ausgangsmaterialien für den erfindungsgemäßen Homogenisierungsschritt sind Zellen, die mit dem jeweiligen Pockenvirus infiziert sind. Der Begriff "infizierte Zellen", der zum Definieren des Ausgangsmaterials für die erfindungsgemäße Homogenisierung verwendet wird, bezieht sich auf intakte Zellen, die mit dem jeweiligen Virus infiziert sind, auf Teile und Fragmente infizierter Zellen, an denen das jeweilige Pockenvirus anhaftet, oder auf eine Mischung intakter Zellen und lysierter/gestörter Zellen. Beispiele eines Teils oder eines Fragments infizierter Zellen, sind Zellmembranen, gestörter/lysierter Zellen, an denen das jeweilige Pockenvirus anhaftet. Das Ausgangsmaterial kann auch freie Virusteilchen enthalten, die weder an der Zellmembran anhaften noch intrazellulär positioniert sind.

Um die infizierten Zellen, die das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren darstellen, zu erhalten, werden eukaryotische Zellen mit dem jeweiligen Pockenvirus infiziert. Die eukaryotischen Zellen sind Zellen, die für die Infektion mit dem jeweiligen Pockenvirus anfällig sind und eine Replikation und Bildung des infektiösen Virus erlauben. Derartige Zellen sind dem mit dem Stand der Technik aller Pockenviren vertrauten Fachmann bekannt. Für MVA und den Vacciniavirusstamm Elstree ist ein Beispiel dieses Typs von Zellen die Hühnerembryofibroblaste (HEF) (Drexler I., Heller K., Wahren B., Erfle V. und Sutter G. "Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells" (Hochattenuierte modifizierte Vaccinia-Ankara-Replikate in den Nierenzellen von Babyhamstern, einem potentiellen Wirt für die Viruspropagierung, jedoch nicht in verschiedenen menschlichen transformierten und primären Zellen) J. Gen. Virol. (1998), 79, 347-352). HEF-Zellen können unter Bedingungen, die dem mit dem Stand der Technik vertrauten Fachmann bekannt sind, gezüchtet werden. Bevorzugt werden die HEF-Zellen in einem serumfreien Medium in feststehenden Flaschen oder Rollflaschen gezüchtet. Bevorzugt findet die Inkubation für 48 bis 96 Stunden bei 37°C + 2°C statt. Für die Infizierung werden Pockenviren bevorzugt in einer Infektionsvielzahl (IV) von 0, 05 bis 1 IGKD50 verwendet und die Inkubation findet bevorzugt für 48 bis 72 Stunden bei 37°C + 2°C statt.

Der Infektionsfortschritt kann durch Beobachten der zytopatischen Auswirkungen (ZPA), die typischerweise durch signifikantes Abrunden der infizierten Zellen ersichtlich sind, beobachtet werden.

Die vorliegende Erfindung gestattet die Gewinnung von Pockenviren, wie beispielsweise Elstree oder MVA, aus infizierten Zellen. Mit dem Ausdruck "Gewinnung" ist gemeint, dass das erfindungsgemäße Verfahren es gestattet, mit Pockenviren infizierte Zellen zu stören und/oder die Pockenviren von den Zellmembranen, an die sie gewöhnlich anhaften, derart loszulösen, dass eine weitere Reinigung des Pockenvirus möglich wird. So ist das Produkt des Gewinnens von Pockenviren aus infizierten Zellen (in der vorliegenden Erfindung als "pockenvirushaltiges Homogenisat" bezeichnet) eine homogene Mischung von freiem Pockenvirus und Zelltrümmern, die nur geringe Mengen an intakten, nichtgestörten Zellen und an Zellmembranen anhaftendes Virus enthalten.

Wenn es sich bei den infizierten Zellen um Zellen handelt, die in einer Suspensionskultur gezüchtet werden können, so können die infizierten Zellen leicht durch Zentrifugieren geerntet werden.

Wenn die infizierten Zellen mehr oder weniger intakte adhärente Zellen sind, so sollten sie geerntet, d.h. von der Züchtungsphiole entfernt, werden, bevor sie der Hochdruckhomogenisierung unterworfen werden. Derartige Verfahren sind dem mit dem Stand der Technik vertrauten Fachmann bekannt. Nützliche Techniken sind mechanische Verfahren (z. B. unter Anwendung von Gummizellkratzern), physikalische Methoden (z. B. Gefrieren unter – 15°C und Auftauen der Züchtungsgefäße bei über +15°C) oder biochemische Verfahren (Behandlung mit Enzymen, z. B. Trypsin, um die Zellen von dem Züchtungsgefäß abzulösen). Werden Enzyme zu diesem Zweck verwendet, so sollte die Inkubationszeit gesteuert werden, da diese Enzyme das Virus während der Inkubation auch beschädigen können.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die infizierten Zellen, noch spezifischer die geernteten infizierten Zellen, einem Hochdruckhomogenisierungsschritt unterworfen. In der vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck "Hochdruckhomogenisierung" manchmal auch als HDH abgekürzt. Die Hochdruckhomogenisierung hat eine doppelte Wirkung. Einerseits führt die Hochdruckhomogenisierung zur Disruption intakter Zellen. So werden die IRV freigesetzt und für eine weitere Reinigung verfügbar. Andererseits bewirkt die Hochdruckhomogenisierung, dass die Pockenviren von Zellmembranen losgelöst werden oder zumindest, dass die Größe der Zellmembran-Virusansammlungen reduziert wird. Dies vereinfacht wiederum die weitere Reinigung des Pockenvirus.

Der mit dem Stand der Technik vertraute Fachmann ist mit dem allgemeinen Prinzip der Hochdruckhomogenisierung vertraut (White MD, Marcus D., "Disintegration of microorganisms" (Desintegrierung von Mikroorganismen), Adv. Biotechnol. Processes 1988; 8:51-96). HDH-Systeme basieren auf der Verwendung von Hochdruck, um eine Probe durch eine kleine unveränderliche Öffnung mit hoher Geschwindigkeit unter geregelten und wiederholbaren Bedingungen hindurchzudrücken. In der vorliegenden Beschreibung werden die Ausdrücke "Strahl", "Öffnung" und "Düse" miteinander austauschbar verwendet.

Das Herzstück jedes Zelldisruptors ist ein Disruptionskopf. Der Disruptionskopf besteht bevorzugt aus (I) einer Hochdruckkammer bzw. einem Hochdruckzylinder, (II) einem Hochdruckkolben, der sich in die Kammer bzw. den Zylinder hineinbewegt und dadurch den Druck in der Kammer/dem Zylinder erhöht und (III) einer Düse/einem Strahl, durch die bzw. den Kammerinhalt herausgestoßen wird. Der herausgestoßene Kammerinhalt wird auf eine Zielfläche wie beispielsweise ein Stück Metall gerichtet, das bevorzugt eine Wärmeaustauschoberfläche ist, die das Kühlen erlaubt. Um den gestörten Kammerinhalt aufzufangen, ist das System mit einer Vorrichtung zum Auffangen der gestörten Probe ausgestattet (was als "Kammerauffang" bezeichnet wird). Eine typische Hochdruckhomogenisierungseinheit ist die Basic Z+ von Constant Cell Disruption Systems (Low March, Daventry, Northants, NN11 4SD, Vereinigtes Königreich).

Bei einer bevorzugten Ausführungsform gibt es drei Stufen zum Ausführen der Zelldisruption unter Zuhilfenahme des Hochdruckhomogenisierungssystems. (I) Eine Probe wird in den Hochdruckzylinder bzw. die Hochdruckkammer eingeführt. Dann wird der Druck in dem Hochdruckzylinder bzw. der Hochdruckkammer erhöht. Zu diesem Zweck senkt sich der Hochdruckkolben. (II) Der Kolben drückt dann die Probe mit einer hohen Geschwindigkeit durch die Düse. Die Schnellübertragung der Probe von einer Hochdruckregion in eine von niedrigem Druck führt zur Zelldisruption. (III) Die Probe trifft auf das Ziel auf und wird radial über die gekühlte Wärmeaustauscheroberfläche ausgebreitet. Das Produkt fließt dann in eine Kammer zum Auffangen. Die Hydraulik wird neu beladen und der Zyklus fortgeführt. Am Ende des Vorgangs wird das ausgestoßene Homogenisat in einer geeignete Phiole, je nach dem Volumen, aufgefangen.

Zur Gewinnung von erfindungsgemäßen Pockenviren sollte die Düse einen Durchmessers im Bereich von 0,10 bis 0,6 mm, 0,15 bis 0,6 mm, 0,15 bis 0,50 mm, bevorzugt im Bereich von 0,15 bis 0,40 mm, 0,20 bis 0,50 mm, noch bevorzugter 0,20 bis 0,40 mm, am bevorzugtestens 0,25 mm bis 0,35 mm aufweisen. Beispiele der bevorzugtesten Durchmesser sind 0,25 mm und 0,35 mm.

Der Druck in der Druckkammer bzw. dem Druckzylinder wird auf einen Wert im Bereich von 200 bis 1000 bar, bevorzugt 400 bis 1000 bar, 200 bis 800 bar, noch bevorzugter 400 bis 800 bar, 600 bis 1000 bar, selbst noch bevorzugter 600 bis 900 bar, am bevorzugtesten 700 bis 900 bar eingestellt. Der bevorzugteste Druck ist 800 bar.

Die Temperatur des Homogenisats am Auslass sollte bevorzugt + 25°C nicht übersteigen und sollte bevorzugt unter 15°C, am bevorzugtesten unter 10°C sein.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann maßstabsmäßig fast linear vergrößert und entweder als diskontinuierliches oder kontinuierliches Verfahren durchgeführt werden.

Bei einem diskontinuierlichen Verfahren kann jede Charge von Zellen, die homogenisiert werden sollen, einmal oder mehrere Male dem Hochdruckhomogenisierungsschritt unterworfen werden. Bevorzugt wird jede Charge ein- bis dreimal, am bevorzugtesten nur einmal dem Homogenisierungsschritt unterworfen.

Der Erfolg des Homogenisierungsschritts kann bevorzugt durch Bestimmen des Virustiters (der der Anzahl infektiöser Virusteilchen entspricht, gemessen entweder in infektiöser Gewebekulturdosis (IGKD50) oder plaquebildenden Einheiten (PBE)) des Ausgangsmaterials, wie oben definiert, und des nach dem Homogenisierungsschritt erhaltenen Materials überprüft werden. Anders ausgedrückt wird der Virustiter vor und nach der Hochdruckhomogenisierung bestimmt. Das Ausgangsmaterial weist mehr oder weniger intakte Zellen und einen ziemlich hohen Prozentsatz an großen Ansammlungen, die Pockenvirusteilchen aufweisen, die an Zellmembranen gebunden sind, auf. Wird ein derartiges Material für die Bestimmung des Virustiters verwendet, so ist der erhaltene Titer niedriger als die tatsächliche Anzahl infektiöser Teilchen. Das ist der Tatsache zuzuschreiben, dass die Prüfsysteme, die für die Bestimmung des Virustiters verwendet werden, gewöhnliche Zellkultursysteme (wie beispielsweise das in Beispiel 2 offenbarte System) sind, bei denen die Anzahl infizierter Zellen oder die Anzahl von Plaques gezählt wird. Ein derartiges System ist nicht in der Lage, zwischen einem positiven Ergebnis, das der Infektion einer Zelle durch nur ein Virusteilchen zuzuschreiben ist, und der Infektion von Zellen beispielsweise durch eine große Ansammlung von Viren, die an Zellmembranen gebunden sind, zu unterscheiden. Nach dem Hochdruckhomogenisieren werden die Pockenviren von den Zellmembranen losgelöst und/oder die Größe der Zellmembranvirusansammlungen signifikant reduziert, was zu einer größeren Anzahl kleinerer Ansammlungen führt. wird dieses Material zur Bestimmung des Titers verwendet, so sind die erhaltenen Ergebnisse höher, selbst wenn die tatsächliche Menge an infektiösen Virusteilchen sich nicht geändert hat. So wird der Erfolg der Homogenisierung bevorzugt durch mindestens eine gleiche oder höhere IGKD50/ml widergespiegelt ("IGKD" ist die Abkürzung infektiöse Gewebekulturdosis) des Homogenisats im Vergleich mit dem Ausgangsmaterial. Im Abschnitt der Beispiele wird im Einzelnen gezeigt, wie der IGKD50/ml Wert bestimmt werden kann. Als Alternative können die Qualität und der Erfolg der Hochdruckhomogenisierung durch Elektronenmikroskopie bestimmt werden.

Zur weiteren Reinigung wird das erhaltene Homogenisat wenigstens einem Reinigungsschritt unterworfen, um eine mit Pockenvirus angereicherte Fraktion zu erhalten. Insbesondere können diese Schritte bei einem Vacciniavirus enthaltenden Homogenisat durchgeführt werden, wenn es beabsichtigt ist, dass Vacciniavirus noch weiter zu reinigen.

Der Reinigungsschritt kann unter anderem wie folgt sein:

  • – chargenweises Zentrifugieren (z. B. unter Anwendung von Saccharosedämpfung) oder kontinuierliche Durchflussultrazentrifugierung (Saccharosegradienten) (Hilfenhaus, J., Köhler, R. und Gruschkau, H., J. Biol. Stand. (1976)4, 285-293; Madalinski, W., Bankovski, A. und Korbecki, M., Acta Virol. (1977) 21, 104-108),
  • – Ultrafiltrierung (z. B. Querstromfiltration unter Zuhilfenahme einer Membran mit einer Porengröße von größer als 500 kDa, aber gleich oder kleiner als 0,1 &mgr;m),
  • – Säulenchromatographie (z. B. Ionenaustausch, hydrophobe Wechselwirkung, Größenexklusion oder eine Kombination) (Hedström, K.G. und Lindberg, U., Z. Immun. Forsch. 1969 137:421-430; Stickl, H., Korb, W. und Hochstein-Mintzel, V., Zbl. Bakt., I. Abt. Orig. (1970), 215, 38-50) oder
  • – eine Kombination aller der obigen (Masuda, N., Ellen, R.P. und Grove, D.A., J. Bacteriol. (1981), 147(3), 1095-1104).

Irgendwelche anderen Reinigungsverfahren, die dem mit dem Stand der Technik vertrauten Fachmann bekannt sind, liegen ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung.

Bevorzugt ist der Reinigungsschritt ein Ultrafiltrationsschritt. Am bevorzugtesten ist die Ultrafiltration, eine Querstromfiltration. Das Prinzip der Querstromfiltration ist dem mit dem Stand der Technik vertrauten Fachmann bekannt. Man vergleiche z. B. Richards, G.P. und Goldmintz, D., J. Virol. Methods (1982), 4(3), Seite 147-153. "Evaluation of a cross-flow filtration technique for extraction of polioviruses from inoculated oyster tissue Homogenates" (Beurteilung einer Querstromfiltrationstechnik für das Extrahieren von Polioviren aus geimpften Austerngewebe-Homogenisaten).

Obwohl ein Reinigungsschritt eventuell ausreicht, um die Erfordernisse der Vorschriften für biopharmazeutische Produkte zu erfüllen, können zwei oder mehr der oben erwähnten Reinigungsschritte kombiniert werden, um ein noch reineres Produkt zu erhalten.

Die bevorzugteste Ausführungsform des ersten Reinigungsschritts ist ein Querstromfiltrationsschritt, gefolgt von wenigstens einem Säulenchromatographieschritt. Am bevorzugtesten ist der Säulenchromatographieschritt ein Ionenaustausch oder eine hydrophobe Wechselwirkung.

Die so erhaltene mit Virus angereicherte Fraktion wird wahlweise gefriergetrocknet. Verfahren zum Gefriertrocknen sind dem mit dem Stand der Technik vertrauten Fachmann bekannt (Day J. und McLellan M., Methods in Molecular Biology (Methoden der Molekularbiologie) (1995), 38, Humana Press, "Cryopreservation and freeze-drying protocols" (Kältekonservierung und Gefriertrocknungsprotokolle)).

Die Erfindung betrifft des Weiteren die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion und/oder das pockenvirushaltige Homogenisat, das durch das Verfahren zur Gewinnung von Pockenviren der vorliegenden Erfindung entsprechend erhalten wird, d.h. das Verfahren, das den Schritt des Unterwerfens der infizierten Zellen einer Hochdruckhomogenisierung aufweist. Insbesondere betrifft die Erfindung die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion, die durch das erfindungsgemäße Gewinnungs/Reinigungsverfahren, d.h. das Verfahren erhalten wird, bei dem das pockenvirushaltige Homogenisat, das durch HDH erhalten, wenigstens einem Reinigungsschritt unterworfen wird. Bei dem Pockenvirus kann es sich um ein Pockenvirus wie oben definiert handeln. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Pockenvirus ein Vacciniavirus, wie beispielsweise einer der Stämme, die für die Imfung geeignet sind, insbesondere der Stamm Elstree oder das modifizierte Vacciniavirus Ankara, am bevorzugtesten MVA-BN.

Das pockenvirushaltige Homogenisat und/oder die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhalten werden, das einen HDH-Schritt aufweist, ist durch ein sehr hohes Verhältnis von freiem IRV-Pockenvirus zu EEV-Pockenvirus gekennzeichnet. Der Ausdruck "freies IRV" wird für IRV verwendet, die von den Zellmembranen nach, vor oder während der Disruption der infizierten Zellen losgelöst worden sind und die deshalb weiter gereinigt werden können. Bei allen technischen Verfahren für die Zubereitung von Pockenviren weist das Ausgangsmaterial die infizierten Zellen sowie die überstehende Kulturlösung auf. So weist das Ausgangsmaterial IRV-Pockenviren, die in den infizierten Zellen enthalten sind, sowie EEV-Pockenviren, die hauptsächlich in der überstehenden Lösung zu finden sind, auf. Die bekannten Verfahren zur Disruption von Zellen und der darauffolgenden Homogenisierung (z. B. unter Anwendung von Ultraschall) stören die Zellen und/oder lösen die IRV-Pockenviren von Zelltrümmern nicht so effizient wie die Hochdruckhomogenisierung. Anders ausgedrückt bleiben die meisten der IRV an die Zellmembranen und Trümmer gebunden. So ist das Verhältnis von freiem IRV zu EEV geringer als bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Bei dem Verfahren mit Hilfe von Ultraschall ändert sich dieses Verhältnis während der weiteren Reinigungsschritte nicht signifikant, da die Zelltrümmer, an die die IRV noch gebunden sind, gewöhnlich entfernt werden. Im Gegensatz zu den bekannten Methoden zur Gewinnung von Pockenviren, führt das erfindungsgemäße Gewinnungsverfahren zu einer sehr wirksamen Disruption der infizierten Zellen und die IRV werden wirksam von den Zellmembranen gelöst. So ist die Gesamtmenge an freien IRV, die zur weiteren Reinigung verfügbar werden, höher als bei den im Stand der Technik bekannten Verfahren und deshalb ist auch das Verhältnis von freien IRV- zu EEV-Pockenviren höher.

Das pockenvirushaltige Homogenisat und/oder die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden, sind als Impfstoffe nützlich.

Wenn das pockenvirushaltige Homogenisat und/oder die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion unmodifizierte Pockenviren oder attenuierte Pockenviren, wie beispielsweise die Vacciniavirusstämme Elstree oder MVA aufweisen, so kann es bzw. sie für das Impfen gegen Pockenvirusinfektionen angewendet werden. Beispielsweise kann ein virushaltiges Homogenisat und/oder die mit Virus angereicherte Fraktion, die Vacciniaviren wie beispielsweise den Elstree- oder MVA-, insbesondere den MVA-BN-Stamm umfassen, als Impfstoff gegen Blatterninfektionen verwendet werden.

Wenn das pockenvirushaltige Homogenisat und/oder die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion ein Pockenvirus aufweist, das ein oder mehrere heterologe(s) Gen e) enthält und exprimiert, so kann das pockenvirushaltige Homogenisat und/oder die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion des Weiteren zum Impfen von Tieren, einschließlich Menschen, gegen das durch das bzw. die heterologen Gen e) exprimierten Protein verwendet werden.

Für die Zubereitung eines Impfstoffs werden das pockenvirushaltige Homogenisat und/oder die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden, in eine physiologisch akzeptable Form umgewandelt. Das kann auf der Basis der Erfahrung bei der Zubereitung von Pockenvirusimpfstoffen, die für das Impfen gegen Blattern verwendet werden, erfolgen (wie durch Stickl, H. et al [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 beschrieben). Beispielsweise werden das pockenvirushaltige Homogenisat und/oder die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion bei – 80°C mit einem Titer von 5 × 108 IGKD50/ml formuliert in ca. 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH-Wert 7,4, gelagert. Für die Zubereitung von Impfstoffspritzen werden z. B. 103-109 IGKD50 des Virus in mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PSB) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% menschlichem Albumin in einer Ampulle, bevorzugt einer Glasampulle, lyophilisiert. Als Alternative können die Impfstoffspritzen durch schrittweises Gefriertrocknen des Virus in einer Rezeptur hergestellt werden. Diese Rezeptur kann zusätzliche Zusatzmittel wie beispielsweise Mannit, Dextran, Zucker, Glycin, Lactose oder Polyvinylpyrrolidon oder andere Zusatzmittel wie beispielsweise Antioxidantien oder inertes Gas, Stabilisiermittel oder rekombinante Proteine (z. B. menschliches Serumalbumin), die für die Verabreichung in vivo geeignet sind, enthalten. Eine typische virushaltige Rezeptur, die für das Gefriertrocknen geeignet ist, weist 10 mM Tris-Puffermittel, 140 mM NaCl, 18,9 g/l Dextran (Molmasse 36.000 – 40.000), 45 g/l Saccharose, 0,108 g/l L-Glutaminsäuremonokaliumsalzmonohydrat, pH-Wert 7,4 auf. Die Glasampulle wird daraufhin dicht geschlossen und kann bei 4°C bis Raumtemperatur mehrere Monate lang gelagert werden. Jedoch kann die Ampulle, so lange sie nicht gebraucht wird, bevorzugt bei Temperaturen von –20°C gelagert werden.

Zum Impfen kann das lyophilisierte oder gefriergetrocknetes Produkt in 0,1 bis 0,5 ml einer wässrigen Lösung, bevorzugt einer physiologischen Kochsalzlösung oder Tris-Puffermittel gelöst und entweder systemisch oder lokal, d.h. parenteral, intramuskulär oder auf irgendeinem anderen Verabreichungsweg, der dem Fachmann bekannt ist, verabreicht werden. Die Verabreichungsweise, die Dosis und die Anzahl von Verabreichungen können durch mit dem Stand der Technik vertraute Fachleute optimiert werden. Am bevorzugtesten für Pockenvirusvektoren ist die subkutane oder intramuskuläre Verabreichung.

Das Impfen von Tieren, einschließlich Menschen, umfasst das Impfen eines Tiers, einschließlich eines Menschen, der dies benötigt, mit einem pockenvirushaltigen Homogenisat oder einer mit Pockenvirus angereicherten Fraktion, das bzw. die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten worden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung umfasst unter anderem Folgendes, als solches oder in Kombination:

Ein Verfahren zur Gewinnung von Pockenvirus aus infizierten Zellen, bei dem man die infizierten Zellen einer Hochdruckhomogenisierung unter Erhalt eines pockenvirushaltigen Homogenisats aussetzt.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass das Pockenvirus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Orthopoxviren, Avipoxviren, Suipoxviren und Capripoxviren.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass das Pockenvirus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Vacciniavirus, Ziegenpockenvirus, Schafpockenvirus, Kanarienpockenvirus und Geflügelpockenvirus.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Vacciniavirus um den modifizierten Vacciniavirusstamm Ankara (MVA), insbesondere um MVA-BN mit der Hinterlegungsnummer ECACC V00083008, handelt.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Pockenvirus um ein rekombinantes Pockenvirus handelt.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Durchführung der Hochdruckhomogenisierung die infizierten Zellen in eine Hochdruckkammer gibt, den Druck in der Kammer erhöht und die infizierten Zellen durch eine Düse ausschleust.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass der Druck in der Kammer auf einen Wert im Bereich von 200 bis 1000 bar erhöht wird.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass die Düse einen Durchmesser im Bereich von 0, 10 bis 0, 6 mm aufweist.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass das pockenvirushaltige Homogenisat wenigstens einem Reinigungsschritt zur Erhaltung einer mit Pockenvirus angereicherten Fraktion unterworfen wird.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem wenigstens einen Reinigungsschritte um einen Ultrafiltrationsschritt handelt.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Ultrafiltration um eine Querstromfiltration handelt.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass im Querstromfiltrationsschritt eine Membran verwendet wird, deren Porengröße größer als 500 kDa, aber gleich oder kleiner als 0,1 &mgr;m ist.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass nach der Ultrafiltration wenigstens ein Säulenchromatographieschritt durchgeführt wird.

Ein Verfahren wie oben, dadurch gekennzeichnet, dass das pockenvirushaltige Homogenisat oder die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion gefriergetrocknet wird.

Eine mit Pockenvirus angereicherte Fraktion oder ein pockenvirushaltiges Homogenisat, erhalten durch ein wie oben definiertes Verfahren.

Eine mit Pockenvirus angereicherte Fraktion oder ein pockenvirushaltiges Homogenisat wie oben als Impfstoff.

Verwendung des pockenvirushaltigen Homogenisats oder der mit Pockenvirus angereicherten Fraktion wie oben zur Herstellung eines Impfstoffs.

Legende zu den Figuren

1: Mit MVA-BN infizierte HEF-Zellen wurden einem Gefrier-Tauzyklus unterworfen, um eine Viruszellensuspension zu erhalten. Der Virustiter der Suspension wurde wie in Beispiel 2 beschrieben ohne weitere Reinigung der Zellvirussuspension ("O-Wert") bestimmt. Die Viruszellsuspension wurde einem Homogenisierungsverfahren, das aus dem Stand der Technik bekannt ist unter Anwendung von Ultraschall ("Sonifikator") oder dem erfindungsgemäßen Homogenisierungsverfahren ("HDH"), wie in Beispiel 1 beschrieben, unterworfen. Im HDH-Schritt betrug der Druck 800 bar und die Düse hatte einen Durchmesser von 0,25 mm. Am Ende des Homogenisierungsschritts wurde der Virustiter nochmals bestimmt.

BEISPIEL(E)

Das bzw. die folgenden Beispiel (e) veranschaulicht bzw. veranschaulichen die vorliegende Erfindung noch weiter. Ein mit dem Stand der Technik vertrauter Fachmann wird sich im Klaren darüber sein, dass das bzw. die aufgeführte(n) Beispiel (e) in keiner Weise so interpretiert werden können, dass die Anwendbarkeit der durch die vorliegende Erfindung bei diesem bzw. diesen Beispiel(en) gebotenen Technologie begrenzt wird.

Beispiel 1: Homogenisierung von Pockenviruszellsuspensionen unter Zuhilfenahme eines Hochdruckhomogenisators

Hühnerembryofibroblaste (HEF), die in Rollflaschen kultiviert worden waren, sind mit MVA-BN (ECACC V00083008) infiziert worden. Die infizierten Zellen wurden Gefriertrocknen und Auftauen unterworfen, um eine Viruszellsuspension zu erhalten.

Ein Basic Z+-Homogenisator von Constant Cell Disruption Systems (Low March, Daventry, Northants, NN11 4SD, Vereinigtes Königreich) wurde mit 50 ml der rohen Viruszellsuspension bei jedem Lauf beladen. Um die optimalen Homogenisierungsbedingungen zu identifizieren, wurden Düsendurchmesser im Bereich von 0,18 bis 0,40 mm und Druckwerte von 200 bis 1000 bar getestet. Die rohe Suspension wurde der Hochdruckhomogenisierung einmal, zweimal oder dreimal unterworfen. Der Homogenisator wurde den Anweisungen des Herstellers entsprechend angewendet. Die Beurteilung des Verfahrens wurde durch Überwachen des Titers, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt.

In vorläufigen Studien wurde festgestellt, dass Düsendurchmesser von mehr als 0,4 mm keinen positiven Einfluss auf die Homogenisierungsergebnisse besitzen. Bei den Düsendurchmessern von 0,18 mm, 0,25 mm und 0,35 mm wurden die besten Ergebnisse durch einmaliges Unterwerfen der Viruszellsuspension einem Druck von 800 bar erzielt. Unter diesen Bedingungen ist kein wesentlicher Unterschied bezüglich des Titers beobachtet worden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wurde mit der aus dem Stand der Technik bekannten Direktdurchfluss-Ultraschallbehandlung verglichen. Die Ergebnisse sind in 1 zusammengestellt. Im Vergleich mit der Ultraschallbehandlung führte das erfindungsgemäße Verfahren zu einem höheren Virustiter und einer besseren Homogenität der Suspension, so dass es für das weitere Verarbeiten stromabwärts geeigneter ist.

Beispiel 2: Titration von modifiziertem Vacciniavirus Ankara (MVA)

Die Titration von modifiziertem Vacciniavirus Ankara (MVA) wird in einem Assay auf IGKD50-Basis unter Anwendung von 10-fachen Verdünnungen in einem Format von 96 Vertiefungen durchgeführt. Am Endpunkt des Assays werden infizierte Zellen durch Anwendung eines Anti-Vacciniavirus-Antikörpers und einer entsprechenden Färbelösung sichtbar gemacht.

2-3 Tage alte primäre HEF (Hühnerembryofibroblast)-Zellen werden in 7% RPMI auf 1 × 105 Zellen/ml verdünnt. 10-fache Verdünnungen werden mit 8 Replikaten pro Verdünnung hergestellt. Auf die Verdünnung hin werden 100 &mgr;l pro Vertiefung der Platten mit 96 Vertiefungen beimpft. Die Zellen werden dann über Nacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert.

Verdünnungen der virushaltigen Lösungen werden in 10-fachen Schritten (10-1 bis 10-12, je nach Eignung) unter Anwendung von RPMI ohne fötales Kalbserum hergestellt. Daraufhin werden 100 &mgr;l jeder Virusprobe in die Zellen enthaltenden Vertiefungen eingegeben.

Die Platten von 96 Vertiefungen werden bei 37°C mit 5% CO2 5 Tage inkubiert, um die Infektion und die Virusreplikation zu gestatten.

5 Tage nach der Infektion werden Zellen mit einem Vacciniavirus-spezifischen Antikörper gefärbt. Für das Erfassen des spezifischen Antikörpers wird ein mit Meerrettichperoxidase (MRP) gekoppelter sekundärer Antikörper verwendet. Der MVA-spezifische Antikörper ist ein Anti-Vacciniavirus-Antikörper, eine klonale Kaninchen-IgG-Fraktion (Quartett, Berlin, Deutschland #9503-2057). Der sekundäre Antikörper ist ein Antikaninchen-IgG-Antikörper, MRP-gekoppeltes Ziegenpolyklonal (Promega, Mannheim, Deutschland, #W4011). Die Farbreaktion wird bekannten Techniken entsprechend durchgeführt.

Jede Vertiefung mit Zellen, die eine positive Farbreaktion aufweisen, wird zur Berechnung der IGKD50 als positiv markiert.

Der Titer wird unter Anwendung der Formel von Spearman [1] und Kaerber [2] berechnet. Da alle Assayparameter konstant gehalten werden, wird die folgende vereinfachte Formel verwendet:

Virustiter [IGKD50/ml] = 10

a
= Verdünnungsfaktor der letzten Spalte, bei der alle acht Vertiefungen positiv sind
xa
= Anzahl positiver Vertiefungen in Spalte a + 1
xb
= Anzahl positiver Vertiefungen in Spalte a + 2
xc
= Anzahl positiver Vertiefungen in Spalte a + 3


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Gewinnung von Pockenvirus aus infizierten Zellen, bei dem man die infizierten Zellen einer Hochdruckhomogenisierung unter Erhalt eines pockenvirushaltigen Homogenisats aussetzt.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Pockenvirus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Orthopoxviren, Avipoxviren, Suipoxviren und Capripoxviren.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Pockenvirus ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Vacciniavirus, Ziegenpockenvirus, Schafpockenvirus, Kanarienpockenvirus und Geflügelpockenvirus.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Vacciniavirus um Elstree oder den modifizierten Vacciniavirusstamm Ankara (MVA), insbesondere um MVA-BN mit der Hinterlegungsnummer ECACC V00083008, handelt.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Pockenvirus um ein rekombinantes Pockenvirus handelt.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Durchführung der Hochdruckhomogenisierung die infizierten Zellen in eine Hochdruckkammer gibt, den Druck in der Kammer erhöht und die infizierten Zellen durch eine Düse ausschleust.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Druck in der Kammer auf einen Wert im Bereich von 200 bis 1000 bar erhöht wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Düse einen Durchmesser im Bereich von 0,10 bis 0,6 mm aufweist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das pockenvirushaltige Homogenisat wenigstens einem Reinigungsschritt zur Erhaltung einer mit Pockenvirus angereicherten Fraktion unterworfen wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei einem der wenigstens einen Reinigungsschritte um einen Ultrafiltrationsschritt handelt.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Ultrafiltration um eine Querstromfiltration handelt.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß im Querstromfiltrationsschritt eine Membran verwendet wird, deren Porengröße größer als 500 kDa, aber gleich oder kleiner 0,1 &mgr;m ist.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Ultrafiltration wenigstens ein Säulenchromatographieschritt durchgeführt wird.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das pockenvirushaltige Homogenisat oder die mit Pockenvirus angereicherte Fraktion gefriergetrocknet wird.
  15. Mit Pockenvirus angereicherte Fraktion oder pockenvirushaltiges Homogenisat, erhalten mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
  16. Mit Pockenvirus angereicherte Fraktion oder pockenvirushaltiges Homogenisat nach Anspruch 15 als Impfstoff.
  17. Verwendung der mit Pockenvirus angereicherten Fraktion oder des pockenvirushaltigen Homogenisats nach Anspruch 15 zur Herstellung eines Impfstoffs.
Es folgt ein Blatt Zeichnungen






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