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Dokumentenidentifikation DE69434470T2 22.06.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000684955
Titel ZELLKERNMATRIXPROTEINE
Anmelder The Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, Md., US
Erfinder COFFEY, S., Donald, Lutherville, US;
PARTIN, W., Alan, Baltimore, US;
GETZENBERG, H., Robert, Branford, US
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69434470
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, ES, FR, GB, IT, LI, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 08.02.1994
EP-Aktenzeichen 949074355
WO-Anmeldetag 08.02.1994
PCT-Aktenzeichen PCT/US94/01360
WO-Veröffentlichungsnummer 0094018222
WO-Veröffentlichungsdatum 18.08.1994
EP-Offenlegungsdatum 06.12.1995
EP date of grant 24.08.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.06.2006
IPC-Hauptklasse C07H 21/04(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C07H 21/02(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12Q 1/68(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 14/47(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung unter NIH SPORE Grant P50 CA 58236-01, zuerkannt von den National Institutes of Health, DK-19300, National Institute of Arthritis, Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, und CA 15416, National Cancer Institute, hervorgebracht.

Hintergrund der Erfindung 1. Fachgebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen ein Verfahren zum Nachweis von Zellproliferationsstörungen unter Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch an bestimmte Kernmatrix-Proteine mit definierten Gewebe-Expressionsmustern in normalen Zellen und in Zellen, die mit Zellproliferationsstörungen assoziiert sind, bindet.

2. Beschreibung des verwandten Fachgebiets

Fortschritte in der rekombinanten DNA-Technologie führten zur Entdeckung von normalen zellulären Genen (Proto-Onkogene und Tumor-Suppressorgene), die das Wachstum, die Entwicklung und die Differenzierung kontrollieren. Unter bestimmten Bedingungen wird die Regulation dieser Gene verändert und normale Zellen nehmen ein neoplastisches Wachstumsverhalten an. In einigen Fällen kann der normale zelluläre Phänotyp durch verschiedene Manipulationen, die mit diesen Genen assoziiert sind, wiederhergestellt werden. Es existieren zur Zeit über 40 bekannte Proto-Onkogene und Suppressorgene, die in Abhängigkeit von ihren funktionalen Kennzeichen in verschiedene Kategorien unterteilt werden. Diese schließen 1) Wachstumsfaktoren und Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, 2) Botenstoffe der intrazellulären Signaltransduktionswege wie zum Beispiel zwischen dem Cytoplasma und dem Nucleus und 3) regulatorische Proteine, welche die Genexpression und die DNA-Replikation beeinflussen und die sowohl innerhalb als auch außerhalb des Nucleus lokalisiert sind, ein.

Während ihrer Lebensspanne starten normale Zellen in einem unreifen Zustand mit proliferativen Potential, durchlaufen sequentielle Stadien der Differenzierung und enden schließlich im Zelltod. Auf der anderen Seite ist Krebs ein aus vielen Stufen bestehender Verlauf, der anhand der Stadien seiner Bösartigkeit definiert werden kann, wobei die normale geordnete Progression anormal ist, wahrscheinlich aufgrund von Veränderungen in Onkogenen, Tumor-Suppressorgenen und anderen Genen. Die Erforschung von Onkogenen und ihrer Produkte führte zu einem grundlegenderen Verständnis der Mechanismen der Ursachen und Erhaltung von Krebs und erlaubten rationalere Mittel zur Diagnose und zur Behandlung von bösartigen Erkrankungen.

Gene, die mit der Kontrolle des normalen Wachstums und der normalen Differenzierung von Zellen assoziiert sind, schließen Gene ein, die regulatorische Proteine codieren, welche die Genexpression und die DNA-Replikation beeinflussen. Die Genprodukte von vielen dieser Gene sind im Nucleus lokalisiert und viele sind DNA bindende Proteine. Der Nucleus einer tierischen Zelle enthält zelluläre DNA, die einen Komplex mit Proteinen bildet, der als Chromatin bezeichnet wird. Das Chromatin ist durch das interne Skelett des Nucleus, das Kernmatrix genannt wird, organisiert. Kernmatrix-Proteine (NMP), die mit DNA assoziiert sind, können regulatorische Proteine für Wachstum/Differenzierung sein, die eine Rolle in der Regulierung der Genexpression in einer Zelle spielen. Man kann sich vorstellen, dass in Zellen, welche die Mechanismen verloren haben, die ihr Wachstum regulieren, ein Nucleus spezifisches Protein kontinuierlich eine transkriptionelle Promotorregion eines Gens aktivieren kann, was zu einer Überexpression dieses Gens führt. Auf ähnliche Weise kann ein nucleäres Protein, das als ein Suppressor arbeitet, um die Expression von verschiedenen Proto-Onkogenen zu kontrollieren oder zu unterdrücken, unterexprimiert oder als eine mutierte Form exprimiert werden, wodurch eine anormale Expression eines Gens ermöglicht wird, das ansonsten unterdrückt werden würde.

Übliche Krebstests sind im Allgemeinen nicht spezifisch, intensiv und daraus folgend nur von begrenzter klinischer Anwendung. Ein biochemischer Test, der im hohen Maße sowohl für die Diagnostik als auch für die Überwachung von Krebs verwendet wird, misst zum Beispiel die Mengen des carcinoembryonalen Antigens (CEA). CEA ist ein onkofötales Antigen, das in großen Mengen im embryonalem Gewebe, aber nur in geringen Mengen in normalen erwachsenen Geweben detektiert werden kann. Das Serum von Patienten mit bestimmten gastrointestinalen Krebsarten enthält erhöhte Mengen an CEA, die durch immunologische Verfahren bestimmt werden können. Die Menge an CEA im Serum korreliert mit einer Remission oder mit einem Rezidiv dieser Tumore, wobei die Mengen nach der chirurgischen Entfernung des Tumors abrupt sinken. Die Rückkehr von erhöhten Mengen an CEA bedeutet eine Rückkehr der bösartigen Zellen. CEA ist jedoch auch ein normales Glycoprotein, das in niedrigen Mengen in fast allen erwachsenen Zellen gefunden wird. Des weiteren kann dieses Protein unter verschiedenen, nicht bösartigen Bedingungen erhöht sein und es ist in der Gegenwart von vielen Krebsarten nicht erhöht. Daher ist es weit davon entfernt, ein idealer Marker für Krebs zu sein.

Ein ähnlicher onkofötaler Tumormarker ist das alpha-Fetoprotein, eine embryonale Form von Albumin. Auch dieses Antigen wird in hohen Mengen im embryonalen Gewebe und in niedrigen Mengen in normalen erwachsenen Geweben detektiert. Es ist bei einer Anzahl von bösartigen gastrointestinalen Erkrankungen einschließlich des Lebertumors erhöht. Ähnlich wie bei CEA korreliert eine Abnahme mit der Remission des Krebses und eine erneute Erhöhung mit einem Rezidiv. Die Sensitivität und die Spezifität sind nicht ausreichend, um diesen Marker für das Absuchen nach bösartigen Veränderungen oder für das Überwachen einer zuvor diagnostizierten Krebsart außer für einige wenige ausgewählte Fälle zu verwenden.

Getzenberg et al., Cancer Research 51, 6514-6520 (1991), beschreiben Muster von Kernmatrix-Proteinen (NMP) in Ratten. Es werden NMPs beschrieben, die spezifisch verschiedene Lappen der Prostata der Ratten identifizieren. Des weiteren offenbaren Anderson et al., The Prostate 6, 315-323 (1985), 2-dimensionale Gele mit einem normalen, einem gutartigen hypertrophen und einem adenokarzinogenen, menschlichen Prostatagewebe und die Verwendung von Mustern in der Proteinexpression für die Diagnose von menschlichem Prostatakrebs.

In Hinsicht auf das vorstehend Beschriebene bleibt ein Bedarf für neue Krebsmarker bestehen, die eine effizientere Diagnose, Prognose und Behandlungssysteme ermöglichen würden. Die Identifizierung von NMPs, die mit der Regulierung der Genexpression oder der zellulären Struktur in normalen Zellen und in Krebszellen assoziiert sind, würden ideale Marker zur Identifizierung des Stadiums der Bösartigkeit einer Zelle zur Verfügung stellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung von neuen Kernmatrix-Proteinen (NMP), die definierte Muster der Gewebe-Expression in verschiedenen Stadien des abnormalen Wachstums und der Bösartigkeit einer Zelle besitzen. Die NMPs der Erfindung werden durch ein Gewebe-Expressionsmuster definiert, das für jedes der Proteine NPB-1, NPB-2, NPB-3, NPB-4, NPB-5, NPB-6, NPB-7, NP-1, NP-2, NP-3, BPC-1, BPC-2, BPC-3 und PC-1 charakteristisch ist. Diese Proteine wurden ursprünglich dadurch identifiziert, dass sie mit normalem Prostatagewebe (NP), sowohl mit normalem als auch mit gutartigem hyperplastischem Prostatagewebe (NBP), mit gutartigen Hyperplasie- und kanzerösem Prostatagewebe (BPC) oder mit Prostatakrebsgewebe (PC) assoziiert sind.

Die identifizierten NMPs stellen die Basis für ein Verfahren zum Nachweis einer Zellproliferationsstörung in einem Individuum zur Verfügung, das das Inkontaktbringen einer zellulären Komponente mit einem Antikörper, der spezifisch an das NMP bindet, umfasst. Das Verfahren ist besonders zum Nachweis einer Zellproliferationsstörung in einem Gewebe des Urogenitalsystems und im Speziellem in der Prostata nützlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1 zeigt die Zusammensetzung der Kernmatrix-Proteine einer normalen menschlichen Prostata (A), einer gutartigen Prostata-Hyperplasie (B) und eines Prostatakrebses (C). Großer Pfeil Bild A, veränderliche Gruppe von Proteinen, die in verschiedenen Gewebetypen nicht gleichbleibend vorhanden waren. Kleine Pfeile, Proteine, die gleichbleibend in allen Geweben verändert waren und die durch das Molekulargewicht und den isoelektrischen Punkt in Tabelle 1 identifiziert wurden. Abkürzungen: LA – Lamin A, LB – Lamin B, LC – Lamin C, A – Aktin, NP – normale Prostata, NPB – normale Prostata und BPH, BPC – BPH und Prostatakrebs, PC – Prostatakrebs, kD – Molekulargewicht in Tausend, SDS-PAGE – Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und pI – isoelektrischer Punkt.

2 zeigt spezifische Kernmatrix-Proteine in BPH und Prostatakrebs. Schematische Darstellung der wichtigsten gewebespezifischen Kernmatrix-Proteine von einer normalen Prostata, von BPH und von Prostatakrebs. Abkürzungen: kD – Molekulargewicht in Tausend, SDS-PAGE – Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und pI – isoelektrischer Punkt und BPH – gutartige Prostata-Hyperplasie.

3 zeigt zwei Modelle einer aus mehreren Stufen bestehenden Progression von einer normalen Prostata (Normal) zu einer gutartigen Prostata-Hyperplasie (BPH) oder zu Prostatakrebs (Krebs). Modell I sagt vorher, dass ähnliche Ereignisse in beiden Wegen erfolgen. Modell II sagt vorher, dass verschiedene Ereignisse stattfinden, wenn die Progression von normal zu BPH fortschreitet, als wenn sie zum Krebs fortschreitet.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Beschreibung stellt ein Verfahren zum Nachweis einer Zellproliferationsstörung zur Verfügung, wobei ein Antikörper verwendet wird, der spezifisch an Kernmatrix-Proteine (NMP) bindet, wobei das Protein ein Gewebe-Expressionsmuster besitzt, das für ein Protein charakteristisch ist, das aus der Gruppe ausgewählt wurde, die NPB-1, NPB-2, NPB-3, NPB-4, NPB-5, NPB-6, NPB-7, NP-1, NP-2, NP-3, BPC-1, BPC-2, BPC-3 und PC-1 umfasst. Die identifizierten NMPs können im Allgemeinen durch ihre Anwesenheit in einer Zelle während eines spezifischen Stadiums einer Zellproliferationsstörung charakterisiert werden.

Der Ausdruck „Zellproliferationsstörung" bezeichnet sowohl bösartige als auch nicht bösartige Zellpopulationen, die häufig den Anschein erwecken, dass sie sich von dem umgebenen Gewebe sowohl morphologisch als auch genotypisch unterscheiden. Eine bösartige Veränderung (das heißt Krebs) ist ein aus mehreren Stufen bestehender Verlauf und die durch die Erfindung identifizierten Proteine sind mit den drei großen Stufen des Übergangs von einer normalen Zelle zu einer Krebszelle assoziiert. In großen Stufen kann normales Gewebe (Stadium 1) anfangen, Zeichen einer Hyperplasie (Stadium 2) zu zeigen oder es kann Zeichen einer Neoplasie (Stadium 3) zeigen. Die „Hyperplasie", wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die eine abnormale Vermehrung oder eine abnormale Anordnung in einem Gewebe zeigen. Gutartige Zellproliferationsstörungen einschließlich gutartiger Tumore sind in dem Ausdruck Hyperplasie eingeschlossen. Die Proteine der Erfindung, die ein Gewebe-Expressionsmuster sowohl im normalen Gewebe als auch im Gewebe einer gutartigen Hyperplasie (NPB) (nicht bösartig) zeigen, schließen NPB-1, NPB-2, NPB-3, NPB-4, NPB-5, NPB-6 und NPB-7 ein. Der Ausdruck „Gewebe-Expressionsmuster" bezieht sich auf die Synthese eines Genprodukts eines NMP-Gens in einer Menge, die durch die Verfahren, die im Allgemeinen durch den Fachmann verwendet werden (z.B. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese), nachweisbar ist. Der Ausdruck „Neoplasie", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein abnormales neues Wachstum, das zu einem Tumor führt. Anders als bei der Hyperplasie besteht die neoplastische Proliferation auch bei Abwesenheit des ursprünglichen Stimulus weiter und ist als unkontrolliert und progressiv gekennzeichnet. Bösartige Neoplasien oder bösartige Tumore unterscheiden sich von gutartigen Tumoren dahingehend, dass die zuerst genannten einen höheren Grad der Anaplasie zeigen und die Eigenschaften der Invasion und der Metastasenbildung besitzen. Ein durch die Erfindung identifiziertes Protein, PC-1, ist ein Beispiel eines Proteins, das ein Expressionsmuster besitzt, das in bösartigen Neoplasien gefunden wird. Die durch die Erfindung identifizierten Proteine BPC-1, BPC-2 und BPC-3 sind Beispiele von Proteinen, die sowohl in einem gutartigen hyperplastischen Gewebe oder in gutartigen Tumoren als auch in neoplastischen Geweben oder Tumoren exprimiert werden. Andererseits besitzen die Proteine NP-1, NP-2 und NP-3 Gewebe-Expressionsmuster in normalem (nicht tumorösen), in nicht hyperplastischem und in nicht neoplastischem Gewebe. Daher schließt die Anwesenheit dieser zuletzt aufgeführten Proteine im Wesentlichen die Anwesenheit einer Zellproliferationsstörung aus.

Zusammenfassend sind BPC-1, BPC-2 und BPC-3 und PC-1 mit Tumorzellen assoziiert; NPB-1, NPB-2, NPB-3, NPB-4, NPB-5, NPB-6 und NPB-7 sind mit normalen und nicht bösartigen hyperplastischen Zellen oder nicht bösartigen Tumorzellen assoziiert; PC-1 ist mit bösartigen Zellen assoziiert; und NP-1, NP-2 und NP-3 sind mit Nicht-Tumorzellen assoziiert. Der Ausdruck „assoziiert mit" bezieht sich auf die Wechselbeziehung zwischen dem Expressionsmuster des Proteins und des Stadiums der Progression zu Krebs.

Verfahren, die verwendet werden können, um die durch die Erfindung identifizierten Proteine zu isolieren, schließen solche ein, die im Allgemeinen zur Trennung von Proteinsubstanzen verwendet werden, einschließlich zum Beispiel der Behandlung einer Probe, die NMP enthält, mit üblichen Fällungsmitteln für Proteine, gefolgt von Fraktionierungstechniken wie z.B. die Ionen-Austausch-Chromatographie, Affinitätschromatographie, molekulare Siebchromatographie, Adsorptionschromatographie, Ultrafiltration und verschiedene Kombinationen davon. Die NMPs können aus einer Zellsuspension durch Verfahren gereinigt werden, die zum Beispiel im US-Patent Nr. 4,885,236 und 4,882,268 beschrieben wurden. Andere Verfahren zur Reinigung der durch die Erfindung identifizierte Polypeptide werden dem Fachmann bekannt sein (vergl. zum Beispiel Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Hrsg., 1992).

Die NMP enthaltenen Fraktionen können einer SDS-PAGE unter geeigneten Bedingungen unterzogen werden und die Gelschnitte, welche die NMP-Aktivität enthalten oder die dem Molekulargewicht des NMP des Interesses entsprechen, werden gewonnen. Die SDS-PAGE wird gemäß dem Verfahren von Laemmli et al. (Nature 227: 680, 1970) durchgeführt und sie ist eine Technik, die dem Fachmann gut bekannt ist. Es sollte selbstverständlich sein, dass Veränderungen der Bedingungen, die innerhalb eines geeigneten Bereichs liegen, innerhalb des Reinigungsverfahrens eingeschlossen sind.

Die NMP enthaltende Fraktion aus der SDS-PAGE wird einer Umkehrphasen-HPLC unterzogen und zum Beispiel mit Acetonitril eluiert. Das NMP, das erhalten wird, ist im Wesentlichen so rein, dass die N-terminale Aminosäuresequenzierung möglich ist. Die Lösung wird unter Vakuum getrocknet und in einem kleinen Volumen Acetonitril 95% + TFA (0,08%) wieder gelöst. Die konzentrierte Probe wird anschließend in ein Sequenziergerät eingeführt, das an ein Phenylthiohydantoin (PTH)-Analysegerät angeschlossen ist.

Polyclonale Antikörper werden durch die Immunisierung eines Tiers, z.B. eines Kaninchens, mit einer immunogenen Probe von NMP immunisiert, gefolgt von einer Reinigung des Antikörpers durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind.

Die Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt werden, sind mit dem durch die Erfindung identifizierten NMP immunreaktiv. Die Antikörper, die im Wesentlichen aus vereinigten monoclonalen Antikörpern mit verschiedenen epitopischen Spezifitäten bestehen, sowie getrennte monoclonale Antikörperherstellungen werden zur Verfügung gestellt. Monoclonale Antikörper werden von Antigen enthaltenden Fragmenten des Proteins durch Verfahren hergestellt, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (Köhler et al., Nature 256 : 495, 1975; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., 1989).

Die Antikörper der Erfindung können in der Immunaffinitätschromatographie zur Isolation von Sequenzen verwendet werden, die ein NMP der vorliegenden Erfindung enthalten. Eine Möglichkeit, in der eine solche Immunaffinitätschromatographie verwendet werden kann, ist durch die Bindung des Antikörpers der Erfindung an CNBr-Sepharose-4B oder Tresyl aktivierte Sepharose (Pharmacia). Diese Festphasen gebundenen Antikörper können anschließend dazu verwendet werden, um spezifisch an Sequenzen zu binden, die NMP von Gemischen von anderen Proteinen enthalten, um deren Isolation und die Reinigung zu ermöglichen. Gebundene NMP-Sequenzen können vom Affinitätschromatographiematerial eluiert werden, wobei Techniken verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie zum Beispiel chaotrope Wirkstoffe, niedriger pH-Wert oder Harnstoff.

Das diagnostische Verfahren der Erfindung verwendet polyclonale und monoclonale Antikörper, die mit dem NMP-Polypeptid immunreaktiv sind. Wenn es erwünscht ist, können polyclonale Antikörper weiter gereinigt werden, zum Beispiel durch die Bindung an und die Elution von einer Matrix, an der das NMP-Polypeptid gebunden ist. Der Fachmann wird verschiedene andere Techniken kennen, die auf dem immunologischen Fachgebiet für die Reinigung und/oder für die Konzentration von polyclonalen Antikörpern sowie von monoclonalen Antikörpern üblich sind. Antikörper, die im Wesentlichen aus vereinigten monoclonalen Antikörpern mit unterschiedlichen epitopischen Spezifitäten bestehen, sowie getrennte monoclonale Antikörperherstellungen werden zur Verfügung gestellt. Der Ausdruck Antikörper oder Immunglobulin, wie er in dieser Erfindung verwendet wird, schließt intakte Moleküle sowie Fragmente davon ein, wie z.B. Fab und F(ab')2, die funktionell an einer epitopischen Determinante auf NMP binden können.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Identifizierung und Isolation einer Antikörper bindenden Domäne, welche die Bindung an NMP zeigt, ist das Bakteriophage &lgr;-Vektorsystem. Dieses Vektorsystem wurde verwendet, um eine kombinatorische Bibliothek von Fab-Fragmenten des Antikörperrepertoires der Maus in Escherichia coli (Huse et al., Science 246: 1275-1281, 1989) und des menschlichen Antikörperrepertoires (Mullinax, et al., Proc Natl Acad Sci 87: 8095 – 8099, 1990) zu exprimieren. Wie darin beschrieben wurde, wurden Rezeptoren (Fab-Moleküle), die eine Bindung an einem zuvor ausgewählten Liganden zeigten, von diesen Antikörper exprimierenden Bibliotheken identifiziert und isoliert. Dieses Verfahren kann auch bei Hybridomzelllinien angewendet werden, die monoclonale Antikörper exprimieren, die an einem zuvor ausgewählten Liganden binden. Hybridome, die einen gewünschten monoclonalen Antikörper sezernieren, können auf verschiedene Wege hergestellt werden, wobei Techniken verwendet werden, die dem Fachmann gut bekannt sind und die hierin nicht wiederholt werden. Einzelheiten dieser Techniken sind in solchen Dokumenten wie z.B. Monoclonal Antibodies-Hybridomas: A new Dimension in Biological Analysis, herausgegeben von Roger H. Kennett et al., Plenum Press, 1980; und US-Patent Nr.: 4,172,124 beschrieben.

Der Ausdruck „Zellproliferationsstörung", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet bösartige sowie nicht bösartige (oder gutartige) Störungen. Des weiteren umfasst dieser Ausdruck hyperplastische Störungen. Die Zellen, die diese proliferativen Störungen umfassen, erscheinen häufig morphologisch und genotypisch unterschiedlich zu dem sie umgebenden normalen Gewebe. Wie zuvor beschrieben wurde, können Zellproliferationsstörungen zum Beispiel mit der Expression oder der Abwesenheit der Expression der durch die Erfindung identifizierten NMPs assoziiert zu sein. Die Expression von NMP zu einem ungeeigneten Zeitpunkt während des Zellzyklus oder in einem falschen Zelltyp kann zu einer Zellproliferationsstörung führen.

Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Nachweis einer Zellproliferationsstörung, die mit NMP assoziiert ist, in einem Individuum zur Verfügung, wobei eine Zellkomponente, von der angenommen wird, dass sie NMP exprimiert oder eine NMP assoziierte Störung besitzt, mit einem Antikörper, der spezifisch an die Komponente bindet, in Kontakt gebracht wird. Die Zellkomponente ist ein Protein. Die Antikörper sind direkt oder indirekt nachweisbar markiert, zum Beispiel mit einem Radioisotop, mit einer fluoreszierenden Verbindung, mit einer biolumineszenten Verbindung, mit einer chemilumineszenten Verbindung, mit einem Metallchelat oder mit einem Enzym. Der Fachmann wird andere geeignete Markierungen zur Bindung an die Sonde kennen oder er wird sie unter Verwendung von Routineuntersuchungen ermitteln können.

Für die Ziele der Erfindung kann ein Antikörper, der spezifisch für NMP ist, verwendet werden, um die Anwesenheit eines NMP-Polypeptids in biologischen Flüssigkeiten oder Geweben nachzuweisen. Jede Probe, die eine nachweisbare Menge des Antigens besitzt, kann verwendet werden. Eine bevorzugte Probe dieser Erfindung, besonders für den Nachweis von Prostatakrebs, ist Gewebe, das vom Urogenitalsystem stammt, besonders das Gewebe der Prostata. In einer anderen Ausführungsform können biologische Flüssigkeiten, die Zellen enthalten können, die bezeichnend für eine NMP assoziierte Zellproliferationsstörung sind, wie z.B. Ejakulat oder Urin, verwendet werden. Vorzugsweise ist das Individuum ein Mensch.

Eine weitere Technik, die ebenfalls zu einer größeren Sensitivität führen kann, besteht aus der Bindung der Sonde an Haptene mit niedrigem Molekulargewicht. Diese Haptene können anschließend mittels einer sekundären Reaktion spezifisch nachgewiesen werden. Zum Beispiel ist es üblich, solche Haptene wie Biotin, das mit Avidin reagiert, oder wie Dinitrophenol, Pyridoxal und Fluorescein, die mit spezifische Antihapten-Antikörper reagieren können, zu verwenden.

Das Verfahren zum Nachweis einer Zelle, die ein bestimmtes NMP der Erfindung exprimiert, oder einer Zellproliferationsstörung, die mit einem NMP assoziiert ist, wie vorstehend beschrieben wurde, kann zum Nachweis eines Residualprostatakrebses oder anderer bösartiger Veränderungen oder gutartiger Hyperplasiezustände in einem Individuum, das sich im Zustand der klinischen Remission befindet, verwendet werden. Zusätzlich ist das Verfahren zum Nachweis eines NMP-Polypeptids in Zellen für den Nachweis einer Zellproliferationsstörung durch die Identifizierung von Zellen, die spezifische NMPs exprimieren, im Vergleich mit NMPs, die in normalen Zellen exprimiert werden, nützlich. Durch die Verwendung des Verfahrens der Erfindung kann die Expression von NMP in einer Zelle identifiziert werden. Weil die Expressionsmuster der durch die Erfindung identifizierten NMPs mit dem Stadium der Bösartigkeit einer Zelle variieren, kann eine Probe wie z.B. ein Prostatagewebe mit einer Gruppe von NMP spezifischen Antikörpern abgesucht werden, um die Expression von NMP nachzuweisen und das Stadium der Bösartigkeit der Zelle zu diagnostizieren.

Die monoclonalen Antikörper der Erfindung sind zum Beispiel für die Verwendung in Immunanalysen geeignet, in denen sie in einer flüssigen Phase oder gebunden an einem Festphasenträger verwendet werden können. Zusätzlich können die monoclonalen Antikörper in diesen Immunanalysen auf verschiedenen Wegen nachweisbar markiert werden. Beispiele von Arten der Immunanalysen, welche die monoclonalen Antikörper der Erfindung verwenden können, sind kompetitive und nicht kompetitive Immunanalysen, entweder in einem direkten oder einem indirekten Format. Beispiele solcher Immunanalysen sind die Radioimmunanalyse (RIA) und die (immunometrische) Sandwich-Analyse. Der Nachweis der Antigene unter Verwendung der monoclonalen Antikörper der Erfindung kann durch die Verwendung von Immunanalysen, die entweder im Vorwärts-, Rückwärts- oder Simultanmodus durchgeführt werden, einschließlich immunhistochemischer Analysen, an physiologischen Proben durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper der Erfindung verwendet werden, um NMPs nachzuweisen, die in elektrophoretisch aufgetrennten Gelprotokollen wie z.B. Western-Blots und 2-dimensionalen Gelen vorhanden sind. Der Fachmann wird andere Formate von Immunanalysen kennen oder er kann diese ohne übermäßiges Experimentieren leicht erkennen.

Die monoclonalen Antikörper der Erfindung können an vielen verschiedenen Trägern gebunden sein und sie können dazu verwendet werden, die Anwesenheit von NMP nachzuweisen. Beispiele von gut bekannten Trägern schließen Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit ein. Die Natur der Träger kann für die Ziele der Erfindung entweder löslich oder unlöslich sein. Der Fachmann wird andere geeignete Träger zur Bindung von monoclonalen Antikörpern kennen oder wird diese durch die Verwendung von Routineexperimenten bestimmen können.

Bei der Durchführung der Analysen kann es wünschenswert sein, bestimmte „Blockierungsmittel" in das Inkubationsmedium einzuschließen (die meistens zusammen mit dem markierten löslichen Antikörper zugegeben werden). Die „Blockierungsmittel" werden zugegeben, um sicherzustellen, dass unspezifische Proteine, Proteasen oder anti-heterophile Immunglobuline gegen anti-NMP-Immunglobuline, die in der experimentellen Probe vorhanden sind, die Antikörper auf dem Festphasenträger oder die radiomarkierten Indikator-Antikörper nicht vernetzen oder zerstören, um falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse ergeben. Die Auswahl der „Blockierungsmittel" kann daher im Wesentlichen zu der Spezifität der Analyse beitragen, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird.

Man hat herausgefunden, dass eine Anzahl von nicht relevanten (das heißt unspezifischen) Antikörpern der gleichen Klasse oder Unterklasse (Isotyp) wie die, die in den Analysen verwendet werden (z.B. IgG1, IgG2a, IgM, etc.), als „Blockierungsmittel" verwendet werden können. Die Konzentration dieser „Blockierungsmittel" (normalerweise 1-100 &mgr;g/&mgr;l) ist wichtig, um die richtige Sensitivität zu erhalten, aber jede ungewollte Störung durch eine wechselseitig auftretende Vernetzung von Proteinen in der Probe zu hemmen.

Der Ausdruck „Epitop", wie er in dieser Erfindung verwendet wird, schließt jede Determinante ein, die eine spezifische Interaktion mit den monoclonalen Antikörpern der Erfindung eingehen kann. Epitopische Determinanten bestehen im Allgemeinen aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen wie z.B. Aminosäuren oder Zuckerseitenketten und besitzen im Allgemeinen spezifische dreidimensionale Strukturkennzeichen sowie spezifische Ladungskennzeichen.

Bei der Verwendung der monoclonalen Antikörper der Erfindung für den Nachweis eines Antigens in einer Probe, die von einem menschlichen Individuum erhalten wurde, wird der nachweisbar markierte monoclonale Antikörper in einer Dosis gegeben, die diagnostisch effizient ist. Der Ausdruck „diagnostisch effizient" bedeutet, dass die Menge des nachweisbar markierten, monoclonalen Antikörpers in einer ausreichenden Quantität verabreicht wird, um den Nachweis der Stelle, die das NMP-Antigen besitzt, für das der monoclonale Antikörper spezifisch ist, zu ermöglichen.

Die Konzentration des nachweisbar markierten monoclonalen Antikörpers, der verabreicht wird, sollte ausreichend sein, so dass die Bindung an solchen Zellen, die das NMP besitzen, im Vergleich zum Hintergrund nachweisbar ist.

Die monoclonalen Antikörper der Erfindung können verwendet werden, um den Verlauf der Verbesserung einer NMP assoziierten Zellproliferationsstörung zu beobachten. Durch die Bestimmung des Anstiegs oder der Abnahme der Anzahl von Zellen, die ein NMP exprimieren, oder der Veränderungen beim NMP, die in verschiedenen Körperflüssigkeiten wie z.B. im Ejakulat oder im Urin vorhanden ist, würde es möglich sein, zu bestimmen, ob ein bestimmter therapeutischer Behandlungsplan, der die Verbesserung der Störung anstrebt, effizient ist.

Die Antikörper zur Verwendung in den Analysen der Erfindung sind idealerweise für die Herstellung eines Kits geeignet. Ein solcher Kit kann ein Trägermittel umfassen, das in verschiedene Fächer unterteilt ist, um in engen Grenzen einen oder mehrere Behälter wie z.B. Glasfläschchen, Röhren und dergleichen zu erhalten, wobei jeder der Behälter eines der getrennten Elemente umfasst, die in dem Verfahren zu verwenden sind.

Zum Beispiel kann einer der Behälter einen Antikörper umfassen, der nachweisbar markiert ist oder werden kann. Dieser Antikörper ist für ein Zielprotein spezifisch, wobei das Ziel bezeichnend für die Anwesenheit eines erfindungsgemäß identifizierten NMP ist oder damit korreliert.

BEISPIEL 1 IDENTIFIZIERUNG UND REINIGUNG VON KERNMATRIX-PROTEINEN Patienten.

Frisch präpariertes Gewebe der Prostata wurde von 21 Männern untersucht, die einer radikalen retropubischen Prostataentfernung aufgrund eines klinisch lokalisierten (Stadium B, T2) Prostatakrebses (N = 19) (Gleason-Grad 5-9) oder einer offenen Prostataentfernung aufgrund einer gutartigen Hyperplasie der Prostata (BPH, N = 2) unterzogen wurden.

Herstellung des Gewebes.

Frisch präpariertes Gewebe wurde innerhalb von 15 Minuten nach der chirurgischen Entfernung erhalten. Ungefähr ein Gramm des makroskopischen Tumors wurde von einem fühlbaren Tumorknoten von 14 Proben entnommen. Ein Gramm normales Prostatagewebe wurde von dem Prostatalappen, der kontralateral zum Tumorknoten gelegen war, von 13 Proben entnommen. Ein Gramm des BPH-Gewebes wurde von der periurethralen Region des kontralateralen Lappens von 12 Proben und 25-30 Gramm von jeder der Proben der zwei offenen Prostataentfernungen erhalten. Alle entfernten Gewebe wurden histologisch mit Hämatoxylin- und Eosinschnitten sowohl am proximalen als auch am distalen Ende des Schnittes bestätigt.

Reinigung von Kernmatrix-Proteinen.

Die Kernmatrix-Proteine wurden gemäß dem Verfahren von Fey und Penman (Proc Natl Acad Sci USA 85: 121-125, 1988) isoliert. Kurz zusammengefasst wurde frisch präpariertes, menschliches Prostatagewebe in kleine (1 mm3) Stücke zerkleinert und auf Eis mit einem Stößel aus Teflon mit 0,5% Triton X-100 in einer Lösung, die 2mM Vanadylribonucleosid (RNase-Hemmstoff) enthielt und die 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (Serin-Protease-Hemmstoff) enthielt, homogenisiert, um die Lipide und die löslichen Proteine freizugeben. Anschließend wurden die Extrakte durch ein 350 Micron-Nylonnetz filtriert und mit 0,25 M Ammoniumsulfat extrahiert, um die löslichen Elemente des Cytoskeletts freizusetzen. Eine Behandlung mit DNase bei 25°C wurde verwendet, um das lösliche Chromatin zu entfernen. Die verbleibende Fraktion enthielt die Intermediärfilamente und die Kernmatrix-Proteine. Diese Fraktion wurde anschließend mit 8 M Harnstoff abgebaut und die unlöslichen Komponenten, die hauptsächlich aus Kohlenhydraten und extrazellulären Matrixkomponenten bestanden, wurden pelletiert. Der Harnstoff wurde mittels Dialyse entfernt, die Intermediärfilamente konnten sich wieder zusammenlagern und wurden durch Zentrifugation entfernt. Anschließend wurden die Kernmatrix-Proteine mittels Ethanol präzipitiert. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem Coomassie®-Plus-Proteintest-Reagenzkit (Pierce, Rockfort, IL) mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Zur Vorbereitung für die Gelelektrophorese wurden die Kernmatrix-Proteine in einem Probenpuffer, der aus 9 M Harnstoff, 65 mM 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylamin]-1-propansulfonat, 2,2% Ampholyte und 140 mM Dithiothreit bestand, wieder gelöst.

Zweidimensionale Elektrophorese.

Eine zweidimensionale Gelelektrophorese mit hoher Auflösung wurde durchgeführt, wobei das Investigator 2-D-Gelsystem (Milligan/Biosearch, Bedford, MA) (Patton WF et al., BioTechniques 8: 518-527, 1990) verwendet wurde. Eine eindimensionale isoelektrische Fokussierung wurde bei 18.000 V-h durchgeführt, wobei auf 1 nm × 18 auf Röhrengelen nach 1,5 Stunden Vorfokussierung verwendet wurden. Die Röhrengele wurden extrudiert und auf vorgegossene 10%ige Tris-Acetat-Natriumdodecylsulfat-DuracrylTM (Millipore, Co., Bedford, MA)-Polyacrylamid-Elekrophorese-Plattengele von 1 mm mit hoher Zugfestigkeit (HTS) platziert und die Gele wurden mit einer konstanten Temperaturregulierung von 12°C für ungefähr 5 Stunden einer Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden mit 50% Methanol und 10% Essigsäure fixiert. Nach dem gründlichen Waschen und einer Rehydratisierung wurden die Gele mit 5% Glutaraldehyd und 5 mM Dithiothreit behandelt, nachdem sie mit 50 mM Phosphat (pH-Wert 7,2) gepuffert wurden. Die Gele wurden mit Silberfarbstoff gefärbt, wobei das Verfahren von Wray (Wray W et al., Anal Biochem 118: 197-203, 1981) (Accurate Chemical Co., Inc., Westbury, NY) verwendet wurde. 50 Mikrogramm der Kernmatrix-Proteine wurden auf jedes Gel aufgetragen. Die Protein-Molekulargewichtsstandards wurden mit dem GELCODE (Dacheng H et al., J Cell Biol 110: 569-580, 1990), Protein-Molekulargewichtsmarker-Kit (MG 12.400-97.400), (Pierce, Rockford, IL) bestimmt. Die isoelektrischen Punkte wurden unter Verwendung von carbamylierten Kreatin-Kinase-Standards (pH-Wert 7,0-4,950, BDH Limited, England)) bestimmt. Nur Proteinpunkte, die deutlich und reproduzierbar beobachtet wurden oder die in allen Proben der verschiedenen Geweben abwesend waren, wurden berücksichtigt, wenn Unterschiede von Kernmatrix-Proteinen zwischen den Geweben bestimmt wurden.

Es bestand eine auffallende Ähnlichkeit, die in den Mustern von Kernmatrix-Proteinen zwischen den Patienten beobachtet wurden, bei ungefähr 120 von 150 Proteinpunkten, die gleichbleibend von Patient zu Patient beobachtet wurden. 14 Kernmatrix-Proteine wurden identifiziert, die gleichbleibend vorhanden oder nicht vorhanden waren, wenn normale Prostata-BPH und Prostatakrebs verglichen wurden. Ein Protein (PC-1) mit einem Molekulargewicht von 56 Kd und einem pI = 6,58 stellte ein Kernmatrix-Protein dar, das in allen untersuchten (14/14) Proben von menschlichem Prostatakrebs erschien, das aber in keiner normalen Prostata (0/13) oder im BPH-Gewebe (0/14) nachgewiesen wurde.

1 zeigt die Zusammensetzung der Kernmatrix-Proteine einer normalen menschlichen Prostata (A), einer gutartigen Prostata-Hyperplasie (B) und eines Prostatakrebses (C). Vier Proteine, von denen bekannt ist, dass sie in den meisten Herstellungen der Kernmatrix vorhanden sind, Lamin A, Lamin B, Lamin C und Aktin, wurden basierend auf den zuvor veröffentlichten Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten identifiziert (Fey EG et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 121-125, 1988) und wurden in 1A als LA, LB, LC bzw. A bezeichnet.

1 zeigt die typischen Muster einer zweidimensionalen Gelelektrophorese mit hoher Auflösung von Kernmatrixproteinen einer normalen menschlichen Prostata (1A), einer menschlichen BPH (1B) und eines menschlichen Prostatakrebses (1C). Gelpunkte, die sich zwischen der normalen Prostata, der BPH und dem Prostatakrebs (in allen untersuchten Proben) unterschieden, wurden mit Pfeilen markiert und mit Bezeichnungen, die denen in Tabelle 1 entsprechen, identifiziert. Tabelle 1 zeigt das Molekulargewicht und die isoelektrischen Punkte der 14 verschiedenen Proteinpunkte, die gleichbleibend vorhanden oder nicht vorhanden waren, wenn die Kernmatrix-Proteine des Gewebes einer normalen Prostata, einer BPH und eines Prostatakrebses für diese Gruppe von 21 Patienten verglichen wurden.

2 fasst die Orte der Proteinpunkte zusammen, die sich zwischen den verschiedenen Geweben unterscheiden, und zeigt spezifische Kernmatrix-Proteine bei BPH und Prostatakrebs. Schematische Darstellung der wichtigsten, gewebespezifischen Kernmatrix-Proteine der normalen Prostata, der BPH und des Prostatakrebses. Abkürzungen: kD – Molekulargewicht in Tausend, SDS-PAGE – Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und pI – isoelektrischer Punkt und BPH – gutartige Prostata-Hyperplasie.

Es wurden keine NMPs nachgewiesen, die nur in BPH vorhanden waren und die in der normalen Prostata und im Prostatakrebs nicht vorhanden waren. Es waren genauso keine NMPs sowohl in der normalen Prostata als auch im Prostatakrebs vorhanden, jedoch in BPH nicht vorhanden. PC-1 (Molekulargewicht 56 Kd und isoelektrischer Punkt 6,58) ist ein NMP, das nur im Gewebe von menschlichem Prostatakrebs gefunden wurde und das gleichbleibend in allen Proben der normalen Prostata und BPH nicht vorhanden war. In zusätzlichen Untersuchungen wurde PC-1 in Proben von Nieren- und Blasenkrebs nachgewiesen, wurde aber nicht im normalen Nieren- oder Blasengewebe nachgewiesen.

Die Abwesenheit von NMB-1-7 und NP-1-3 in bösartigen Zellen deutet darauf hin, dass Gene, die diese NMPs codieren, als Krebs-Suppressorgene arbeiten. Dies gilt im besonderen Maße für NP-1-3, das ebenfalls im gutartigen hyperplastischen Gewebe nicht vorhanden war.

TABELLE 1 KERNMATRIX-PROTEINE AUS FRISCH PRÄPARIERTEN GEWEBE VON NORMALER PROSTATA, BPH UND PROSTATAKREBS
NP
normale Prostata
B
BPH
PC
Prostatakrebs

Die Bezeichnung jedes Proteins entspricht den in 1 identifizierten Proteinen.

BEISPIEL 2 MODELLE FÜR DIE PROGRESSION VON NORMALEN PROSTATAZELLEN ZUM PROSTATAKREBS

Obwohl die genauen molekularen und/oder umweltbedingten Ereignisse, die für die Entwicklung einer Prostatastörung notwendig sind, größtenteils unbekannt sind, ist jedoch die Tatsache gut etabliert, dass die Entwicklung eines Prostatakrebs ein aus mehreren Schritten bestehender Prozess ist (Carter HB et al., J Urol 143: 742-746, 1990). Epidemiologische Untersuchungen, die auf der ursprünglichen Arbeit von Ashley (Ashley DFB, J Path Bact 90: 217-225, 1965) und Armitage und Doll (Armitage P und Doll R, Brit J Cancer 8: 1-15, 1954) basierten und welche die altersspezifischen Häufigkeitsraten für Prostatakrebs und BPH in den Vereinigten Staaten verwendeten, zeigen, dass die Entwicklung von BPH sehr wahrscheinlich ein aus zwei Schritten bestehender Prozess ist, während die Entwicklung eines offenkundigen klinischen Prostatakrebses sehr wahrscheinlich ein aus mehreren Schritten (mehr als zwei Ereignisse) bestehender Prozess ist (Carter HB et al., J Urol 143: 742-746, 1990).

Zwei verschiedene Modelle können für die Progression einer normalen epithelialen Prostatazelle entweder zur BPH oder zum Prostatakrebs postuliert werden. 3 zeigt zwei Modelle einer aus mehreren Schritten bestehenden Progression einer normalen Prostata (Normal) zur einer gutartigen Prostatahyperplasie (BPH) oder zum Prostatakrebs (Krebs). Model I sagt vorher, dass ähnliche Ereignisse in beiden Signalwegen stattfinden. Modell II sagt vorher, dass verschiedene Ereignisse stattfinden, wenn eine Progression von normal zu BPH stattfindet, als wenn eine Progression zum Krebs stattfindet. Das erste Modell (Model I) sagt vorher, dass die frühen Ereignisse einer Progression entweder von normal zur BPH oder von normal zum Prostatakrebs ähnlich sind (Ereignisse A-B in Modell I). Das zweite Model (Model II) sagt vorher, dass in der Progression zur BPH und zum Krebs verschiedene Ereignisse stattfinden (Ereignisse A-B gegen Ereignisse E-H). Unter Verwendung der Anwesenheit oder der Abwesenheit der Kernmatrix-Proteine als einen phänotypischen Marker, um diese Modelle zu testen, würde vorhergesagt werden, dass Modell 1 genügt würde, wenn eine spezifische Gruppe von Proteinpunkten sowohl in BPH als auch Prostatakrebs entweder nicht vorhanden oder vorhanden (NP1-3, BPC 1-3) sind und wenn zusätzliche Proteinpunkte nur im Prostatakrebs vorhanden oder nicht vorhanden sind (NMB1-7 oder PC-1). Daher stellen alle der beobachteten Unterschiede in den Kernmatrix-Proteinen Modell I zufrieden. Um Modell II zu genügen, müsste(n) ein Protein oder mehrere Proteine nur in BPH vorhanden oder nicht vorhanden sein, und dieses wurde in keiner der Proben beobachtet. Daher unterstützen diese Daten Modell I, in dem ähnliche phänotypische Merkmale in der Kernmatrix von Zellen auftauchen, die zu BPH fortschreiten, wie in solchen Zellen, die zum Prostatakrebs fortschreiten. Als ein Ergebnis können die NMPs der Erfindung verwendet werden, um das Stadium und die Progression einer Zellproliferationsstörung wie z.B. Prostatakrebs von der Normalität zu einer gutartigen Störung zu einer bösartigen Veränderung zu beobachten und nachzuweisen. Diese Information kann wiederum dazu verwendet werden, um eine geeignete Therapie zu initiieren.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zum Nachweis einer Zellproliferationsstörung in einem menschlichen Individuum, umfassend das Inkontaktbringen von Zellen einer Probe, die von dem Individuum erhalten wurde, mit einem Antikörper, der spezifisch an das Kernmatrix-Protein des Individuums bindet, und das Nachweisen des Bindens des Antikörpers an das Kernmatrix-Protein, wobei das Kernmatrix-Protein ein menschliches Kernmatrix-Protein ist, wobei das Protein ein Gewebe-Expressionsmuster hat, das charakteristisch ist für normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-1 (NPB-1), Mr von etwa 17 kD, pI-Wert etwa 6,91; normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-2 (NPB-2), Mr etwa 17 kD, pI-Wert etwa 8,30; normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-3 (NPB-3), Mr etwa 12 kD, pI-Wert etwa 8,40; normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-4 (NPB-4), Mr etwa 12 kD, pI-Wert etwa 6,91; normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-5 (NPB-5), Mr etwa 43 kD, pI-Wert etwa 6,27; normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-6 (NPB-6), Mr etwa 43 kD, pI-Wert etwa 6,22; normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-7 (NPB-7), Mr etwa 43 kD, pI-Wert etwa 6,14; normales Prostatagewebe-1 (NP-1), Mr etwa 12 kD, pI-Wert etwa 7,50; normales Prostatagewebe-2 (NP-2), Mr etwa 11,5 kD, pI-Wert etwa 7,62; normales Prostatagewebe-3 (NP-3), Mr etwa 11 kD, pI-Wert etwa 8,30; gutartige Hyperplasie- und kanzeröses Prostatagewebe-1 (BPC-1), Mr etwa 42,5 kD, pI-Wert etwa 5,80; gutartige Hyperplasie- und kanzeröses Prostatagewebe-2 (BPC-2), Mr etwa 42 kD, pI-Wert etwa 5,73; gutartige Hyperplasie- und kanzeröses Prostatagewebe-3 (BPC-3), Mr etwa 41 kD, pI-Wert etwa 5,64; oder Prostatakrebs-1 (PC-1), Mr etwa 56 kD, pI-Wert etwa 6,58, wobei Mr durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen ermittelt wird.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zell-proliferative Störung in der Prostata ist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Antikörper nachweisbar markiert ist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Markierung aus einem Radioisotop, einer biolumineszenten Verbindung, einer chemilumineszenten Verbindung, einer fluoreszierenden Verbindung, einem Metallchelat oder einem Enzym ausgewählt ist.
  5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Nachweis von NPB-1, NPB-2, NPB-3, NPB-4, NPB-5, NPB-6 und/oder NPB-7 anzeigt, dass die Zellen normal oder hyperplastisch sind.
  6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Nachweis von NP-1, NP-2 und/oder NP-3 anzeigt, dass die Zellen normal und nicht-hyperplastisch sind.
  7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Nachweis von BPC-1, BPC-2 und/oder BPC-3 anzeigt, dass die Zellen neoplastisch sind.
  8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Antikörper polyclonal ist.
  9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Antikörper monoclonal ist.
  10. Kit, verwendbar für den Nachweis eines Proteins, das eine Zell-proliferative Störung anzeigt, die mit einem Kernmatrix-Protein zusammenhängt, wobei der Kit eine Trägervorrichtung umfasst, die aufgeteilt ist, so dass sie eng aneinandergepackt darin einen oder mehrere Behälter enthält, umfassend einen Behälter, enthaltend einen Antikörper, der spezifisch das Kernmatrix-Protein bindet, wobei das Kernmatrix-Protein ein menschliches Kernmatrix-Protein ist, wobei das Protein ein Gewebe-Expressionsmuster hat, das charakteristisch ist für normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-1 (NPB-1), Mr von etwa 17 kD, pI-Wert etwa 6,91; normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-2 (NPB-2), Mr etwa 17 kD, pI-Wert etwa 8,30; normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-3 (NPB-3), Mr etwa 12 kD, pI-Wert etwa 8,40; normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-4 (NPB-4), Mr etwa 12 kD, pI-Wert etwa 6,91; normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-5 (NPB-5), Mr etwa 43 kD, pI-Wert etwa 6,27; normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-6 (NPB-6), Mr etwa 43 kD, pI-Wert etwa 6,22; normales und gutartige Hyperplasie-Prostatagewebe-7 (NPB-7), Mr etwa 43 kD, pI-Wert etwa 6,14; normales Prostatagewebe-1 (NP-1), Mr etwa 12 kD, pI-Wert etwa 7,50; normales Prostatagewebe-2 (NP-2), Mr etwa 11,5 kD, pI-Wert etwa 7,62; normales Prostatagewebe-3 (NP-3), Mr etwa 11 kD, pI-Wert etwa 8,30; gutartige Hyperplasie- und kanzeröses Prostatagewebe-1 (BPC-1), Mr etwa 42,5 kD, pI-Wert etwa 5,80; und gutartige Hyperplasie- und kanzeröses Prostatagewebe-2 (BPC-2), Mr etwa 42 kD, pI-Wert etwa 5,73; gutartige Hyperplasie- und kanzeröses Prostatagewebe-3 (BPC-3), Mr etwa 41 kD, pI-Wert etwa 5,64; oder Prostatakrebs-1 (PC-1), Mr etwa 56 kD, pI-Wert etwa 6,58, wobei Mr durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen ermittelt wird.
Es folgen 4 Blatt Zeichnungen






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