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Dokumentenidentifikation DE69927375T2 22.06.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001094081
Titel FUSIONSPROTEIN MIT DIREKTER VERKNÜPFUNG DES IL-6-REZEPTORS MIT IL-6
Anmelder Tosoh Corp., Shinnanyo, Yamaguchi, JP
Erfinder EKIDA, Teiji, Sagamihara-shi, Kanagawa 228-0804, JP;
YAGAME, Harutaka, Kamaishi-shi, Iwate 026-0034, JP;
IIDA, Hiroshi, Zama-shi, Kanagawa 228-0015, JP;
YASUKAWA, Kiyoshi, Kawasaki-shi, Kanagawa 215-0021, JP;
TSUCHIYA, Shigeo, Yokohama-shi, Kanagawa 227-0046, JP;
IDE, Teruhiko, Hachioji-shi, Tokyo 192-0916, JP
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69927375
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 01.07.1999
EP-Aktenzeichen 999268808
WO-Anmeldetag 01.07.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/JP99/03554
WO-Veröffentlichungsnummer 0000001731
WO-Veröffentlichungsdatum 13.01.2000
EP-Offenlegungsdatum 25.04.2001
EP date of grant 21.09.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 22.06.2006
IPC-Hauptklasse C07K 19/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C07K 14/54(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 14/715(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 1/19(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12P 21/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 38/20(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 5/06(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins, das aus einem Interleukin-6-Rezeptor (nachstehend als IL-6R bezeichnet) und einem Interleukin-6 (nachstehend als IL-6 bezeichnet) besteht, die ohne Linker-Sequenz direkt verbunden sind:

Hintergrund der Erfindung

Bekanntlich übertragen IL-6, IL-11, CNTF (ciliary neurotrophic factors), LIF (Leukämieinhibierende Faktoren), Oncostatin-M und Cardiotropin-1, die zu den IL-6-Cytokinen gehören, Signale über einen Rezeptorkomplex, der mindestens ein Signal-übertragendes Protein gp130 enthält. Beispielsweise verbindet sich IL-6 mit IL-6R, und der resultierende IL-6/IL-6R-Komplex enthält gp130.

Das Blutbildungssystem ist eines der Schutzsysteme des lebenden Körpers, in dem IL-6 eine wichtige Rolle spielt. Der Vorgang der Expression von IL-6R in blutbildenden Zellen ist bei menschlichen und Maus-Zellen unterschiedlich. Undifferenzierte menschliche blutbildende Vorläuferzellen, die Granulozytenmakrophagenkolonien, Erythroblastkolonien, Megakarozytenkolonien und Mischkolonien aus diesen auf einer Methylcellulosekultur bilden können, exprimieren keine ausreichende Menge IL-6R (Tajima et al.: J. Exp. Med. 184, 1996). Daher sind undifferenzierte menschliche blutbildende Vorläuferzellen nahezu nicht reaktionsfähig mit IL-6, während sie mit einem IL-6/IL-6R-Komplex stark reaktionsfähig sind. Im Gegensatz dazu exprimieren undifferenzierte blutbildende Vorläuferzellen der Maus eine ausreichende Menge IL-6R. Nakahata und die Erfinder der vorliegenden Erfindung stellten fest, dass menschliche Megakarozyten-Vorläuferzellen keine ausreichende Menge IL-6 exprimieren (japanische Patentanmeldung Nr. 9–325847). Diese Ergebnisse stimmen mit der Tatsache überein, dass IL-6 bei Verabreichung an die Maus die Anzahl von Blutplättchen signifikant erhöht, während IL-6 bei Verabreichung an den Menschen in seiner Wirkung beschränkt ist.

Die Verbindungskonstante zwischen IL-6 und löslichem IL-6R soll laut Yasukawa et al., J. Biochem., 108, S. 673, 1990, 5 × 10–9 M betragen. Das bedeutet, dass in einem Gemisch aus 200 ng/ml (1 × 10–8 M) IL-6 (relative Molekülmasse: 20.000) mit 500 ng/ml (1 × 10–8 M) löslicher IL-6R (relative Molekülmasse: 50.000) die Hälfte der Moleküle in einem ungebundenen Zustand vorliegt. Tatsächlich muss löslicher IL-6R in einer Menge von 1000 ng/ml oder mehr vorliegen, um ihn mit Zellen, die keinen IL-6R exprimieren, zur Reaktion zu bringen.

Durch Gentechnik können zwei Arten von Proteinen, die in der Natur unabhängig vorkommen, zu einem Fusionsprotein einer einzigen Polypeptidkette fusioniert werden. Wenn zwei Arten von Proteinen, die miteinander verbunden werden können, als Fusionsprotein exprimiert werden, ist die Bindung voraussichtlich stark, und es ist weniger wahrscheinlich, dass es zu einer Dissoziation kommt, solange die einzelnen Proteine im Fusionszustand ihre inhärente Struktur (biologisch aktive Struktur) behalten können.

Damit zwei Arten von Proteinen in einem Fusionsprotein ihre inhärenten Strukturen behalten können, sollte es zwischen den beiden Proteinen nicht zu einer sterischen Hinderung kommen. Außerdem sollten die beiden Proteine im Fusionsprotein mit ihren inhärenten Strukturen einen Freiheitsgrad für eine gegenseitige Berührung haben. Daher wird herkömmlich ein Linker, und zwar eine Sequenz aus 5–20 Aminosäureresten, wie etwa Glycinreste und Serinreste, die einen hohen Freiheitsgrad zum Verbinden von zwei Proteinen haben, für die Fusion von Proteinen verwendet. Durch diese indirekte Fusion von Proteinen über einen Linker, der keinen Bezug zu den Fusionsproteinen hat, wird die sterische Hinderung zwischen den beiden Proteinen vermieden, und der Freiheitsgrad für das Verbinden wird erreicht.

Zur Expression eines Fusionsproteins durch Verbinden einer V-Domäne einer H-Kette mit einer V-Domäne einer L-Kette von Antikörpern, die eine Bindungsaffinität haben, wird beispielsweise eine Linker-Sequenz mit einer Restsequenz GGGGSGGGGSGGGGS (G: Glycinrest, S: Serinrest) beschrieben (Houston et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, S. 5879, 1988).

Fusionsproteine wurden vor kurzem aus IL-6 und IL-6R hergestellt, die miteinander mittels eines Linkers (in 1(a) gezeigt) verbunden werden können. Das eine ist ein Fusionsprotein, das so hergestellt wird, dass ein irrelevanter Linker RGGGGSGGGGSVE, der durch die Sequenz Nr. 60 dargestellt wird, die nicht in IL-6 und IL-6R enthalten ist, mit dem C-terminalen Alaninrest an Position 323 im IL-6R verbunden wird und IL-6 mit seiner C-terminalen Seite verbunden wird (Fisher et al.: Nature Biotech, 15, S. 142, 1997). Ein zweites Fusionsprotein ist ein Fusionsprotein, das so hergestellt wird, dass ein Linker EFM (E: Glutaminsäurerest, F: Phenylalaninrest und M: Methioninrest) mit dem C-terminalen Valinrest an Position 356 des IL-6R verbunden wird, und außerdem wird IL-6 mit seiner C-terminalen Seite verbunden (Chebath et al.: Eur. Cytokine Netw., 8, S. 359, 1997). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckten ein Fusionsprotein, das durch Verbinden eines Linkers SSELV (L: Leukinrest, V: Valinrest) mit dem C-terminalen Leucinrest an Position 334 des IL-6R sowie Verbinden von IL-6 mit dessen C-Terminal hergestellt wird (japanische Patentanmeldung Nr. 10–2921).

Allgemein ist bekannt, dass ein Fremdprotein, das durch genetische Rekombination exprimiert wird, durch eine natürlich exprimierte Protease in der Wirtszelle gespalten werden kann. Daher kann auch das exprimierte Fusionsprotein IL-6R/IL-6 durch Protease in der Wirtszelle gespalten werden. Insbesondere ist bekannt, dass der Hefepilz Pichia pastoris verschiedene Proteasen exprimieren kann. Das ist jedoch nicht in den vorgenannten Berichten beschrieben. Wenn das Fusionsprotein IL-6R/IL-6 von einer in der Wirtszelle exprimierten Protease gespalten wird, ermöglicht die Herstellung eines spaltungsbeständigen Fusionsproteins IL-6R/IL-6 die Produktion einer größeren Menge des Fusionsproteins IL-6R/IL-6 aus der Kultur des Hefepilzes Pichia pastoris oder eines anderen Wirts.

Es wird erwartet, dass ein Fusionsprotein wie IL-6R/IL-6, das den Fusionszustand von zwei Proteinen stabil aufrechterhalten kann, im Fusionszustand im Signalübertragungssystem des IL-6 als Arzneimittel im menschlichen Körper oder einem ähnlichen tierischen Lebewesen besonders wirksam ist.

Bei der Entwicklung eines Fusionsproteins als regelmäßig verabreichtes Arzneimittel ist die hohe Wahrscheinlichkeit der vorgenannten Immunreaktion ein Problem, da der Linker nicht in den Proteinen enthalten ist und für sie irrelevant ist und eine unabhängige sterische Struktur hat. Daher hat der Linker vorzugsweise eine Sequenz, die so kurz wie möglich ist, oder er sollte überhaupt nicht verwendet werden.

Wie vorstehend dargelegt, sollten die zwei konstitutiven Proteine für die Bildung des Fusionsproteins keine sterische Hinderung zwischen ihnen bewirken, und sie sollten sich frei miteinander verbinden können. Beispielsweise sollten für eine direkte Fusion von IL-6R und IL-6 ohne Verwendung eines Linkers, bei der es zu keiner sterischen Hinderung zwischen den Proteinen kommt und diese sich frei miteinander verbinden können, zahlreiche Faktoren entschieden werden, wie etwa die Reihenfolge der Proteine bei der Fusion, der Aminosäurerest im N-terminalen Protein und der im C-terminalen Protein.

Für das Fusionsprotein aus IL-6R und IL-6 sind nur die drei vorgenannte Beispiele berichtet worden, die einen Linker verwenden, und die Fusion erfordert unbedingt einen Linker. 1(a) zeigt ein Fusionsprotein, bei dem zwei Proteine durch einen Linker miteinander verbunden sind. Die direkte Verbindung ohne den Linker ist noch nicht berichtet worden.

Die vorliegende Erfindung will ein Verfahren zur Herstellung eines IL-6R/IL-6-Fusionsproteins zur Verfügung stellen, bei dem IL-6R und IL-6 ohne einen Linker direkt verbunden werden, wie in 1(b) gezeigt. Die vorliegende Erfindung will außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines IL-6R/IL-6-Fusionsproteins zur Verfügung stellen, das gegen die Spaltungswirkung der Protease beständig ist, die von einer Wirtszelle, insbesondere einem Hefepilz der Art Pichia pastoris, exprimiert wird.

Beschreibung der Erfindung

Um die vorgenannten Ziele zu erreichen, stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung nach umfangreichen Untersuchungen zum IL-6R/IL-6-Fusionsprotein ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins mit IL-6R am N-Terminal und IL-6 am C-Terminal fertig, die ohne Verwendung eines Linkers zwischen beiden verbunden werden.

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines IL-6-Rezeptor/IL-6-Fusionsproteins zur Verfügung, das die Gewinnung des IL-6R/IL-6-Fusionsproteins durch Behandeln einer Lösung, die das IL-6-Rezeptor/IL-6-Fusionsprotein enthält, bei dem ein Aminosäurerest des IL-6-Rezeptors und ein Aminosäurerest des IL-6 direkt verbunden werden, mit drei Chromatographie-Arten, die Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie und Gelfiltrationschromatographie umfassen, um das IL-6-Rezeptor/IL-6-Fusionsprotein zu gewinnen, umfasst.

Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das C-Terminal eines der 39 Aminosäurereste von dem N-terminalen Alaninrest an Position 323 bis zum Nterminalen Serinrest an Position 361 des IL-6-Rezeptors mit einem N-terminalen Aminosäurerest des IL-6 verbunden.

Nachstehend wird die vorliegende Erfindung näher beschrieben.

Das Fusionsprotein, das nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass sich der IL-6R am N-Terminal des Fusionsproteins befindet und sich das IL-6 am C-Terminal des Fusionsproteins befindet und die beiden Proteine direkt ohne einen Linker verbunden sind. Zum Verbessern der vorgenannten Protease-Beständigkeit können die beiden Proteine durch einen Polypeptid-Linker verbunden werden. Unter Berücksichtigung der geringeren Antigenität bei der Verabreichung als Arzneimittel wird jedoch die direkte Verbindung ohne Polypeptid-Linker bevorzugt. Wenn der geeignete Linker bekannte Linker-Sequenzen enthält (Fisher et al.: Nature Biotech, 15, S. 142, 1997; Chebath et al.: Eur. Cytokine Netw., 8, S. 142, 1997) oder wenn in einem anderen Beispiel dafür der C-terminale Leucinrest an Position 344 des IL-6R mit einem Linker verbunden wird, der aus Serinrest/Serinrest/Glutaminsäurerest/Leucinrest/Valinrest besteht, und außerdem IL-6 mit seinem C-Terminal verbunden wird, ... (?) Der IL-6R, der das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein bildet, ist ein Membranprotein mit 468 Aminosäureresten in voller Länge und weist einen Signalbereich, einen extrazellulären Bereich, einen transmembranen Bereich und einen intrazellulären Bereich auf (Yamasaki et al.: Science, 241, S. 825, 1988). Es wird vermutet, dass beim humanen IL-6R der Signalbereich vom Methioninrest an Position 1 des N-Terminals bis ungefähr zum Alaninrest an Position 19 reicht, der extrazelluläre Bereich von ungefähr dem Leucinrest an Position 20 bis ungefähr zum Asparaginsäurerest an Position 358 reicht, der transmembrane Bereich von ungefähr dem Serinrest an Position 359 bis ungefähr zum Leucinrest an Position 386 reicht und der intrazelluläre Bereich von ungefähr dem Argininrest an Position 387 bis ungefähr zum Argininrest an Position 468 reicht. Der extrazelluläre Bereich wird in eine Immunglobulin-ähnliche Domäne und eine Cytokinrezeptordomäne unterteilt, wobei die Immunglobulin-ähnliche Domäne vermutlich von ungefähr dem Leucinrest an Position 20 bis zum Asparaginsäurerest an Position 111 reicht und die Cytokinrezeptordomäne von ungefähr dem Valinrest an ungefähr Position 112 bis zum Alaninrest an Position 323 reicht.

Bekanntlich ist beim IL-6R die Domäne, die für die Verbindung mit IL-6 wichtig ist, die Cytokinrezeptordomäne, und die Immunglobulin-ähnliche Domäne ist nicht notwendig. Die Cytokinrezeptordomäne besteht aus zwei kurzen tonnenförmigen Strukturen, die jeweils aus sieben Beta-Faltblättern bestehen (Yawata et al.: EMBO J., 12, S. 1705, 1993).

In der vorliegenden Erfindung ist nicht nur der IL-6R in voller Länge geeignet, sondern auch der gesamte extrazelluläre Bereich oder die Cytokinrezeptordomäne, und zwar ein Teil des IL-6R. Das liegt daran, dass die Cytokinrezeptordomäne das Signalübertragungssystem durch Kombination mit dem IL-6 bilden kann und der extrazelluläre Bereich diese Domäne enthält.

Nach den Informationen, die den Erfindern der vorliegenden Erfindung vorliegen, sind spezielle Beispiele für das N-Terminal des IL-6R der Leucinrest an Position 20, der Valinrest an Position 112 und der Glutaminsäurerest an Position 116 vom N-Terminal.

Nach den Informationen, die den Erfindern der vorliegenden Erfindung vorliegen, sind spezielle Beispiele für das C-Terminal des IL-6R alle 39 Aminosäurereste in dem Bereich vom N-terminalen Alaninrest an Position 323 bis zum Serinrest an Position 361, vorzugsweise alle folgenden sechs Aminosäurereste: der Alaninrest an Position 323, der Alaninrest an Position 333, der Leucinrest an Position 334, der Threoninrest an Position 335, der Lysinrest an Position 338 und der Isoleucinrest an Position 343. Das N-Terminal des IL-6 ist mit dem C-Terminal der IL-6R-Fraktion verbunden. Das N-Terminal des IL-6R kann unter Berücksichtigung der Wirkungen bei der Signalübertragung des Fusionsproteins entsprechend deletiert werden.

Das IL-6, das das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein bildet, ist ein sekretorisches Protein, das aus 212 Aminosäureresten in voller Länge mit vier &agr;-Helices besteht (Hirano et al.: Nature, 324, Bd. 731, 1980. Bekanntlich sind alle vier &agr;-Helices für die Aktivität des IL-6 notwendig. Daher ist das in der vorliegenden Erfindung verwendete IL-6 nicht besonders beschränkt, wenn es alle vier Helices hat. Mit anderen Worten, nicht nur das IL-6 in voller Länge ist geeignet, sondern auch ein partielles IL-6, bei dem ein Teil der Aminosäuren am N- oder C-Terminal deletiert ist, kann geeignet sein. Ein Beispiel für das partielle IL-6 ist das IL-6, das eine Sequenz vom Nterminalen Alaninrest an Position 28 oder vom Prolinrest an Position 29 bis zum N-terminalen Methioninrest an Position 212 hat, die als Struktur des sekretorischen IL-6 bekannt ist. Andernfalls kann man sich unter Berücksichtigung der Beispiele für die Expression des IL-6 (z. B. Yasukawa et al.: Biotech. Lett., 12, S. 419, 1990) oder der Beispiele für die Expression des IL-6R/IL-6-Fusionsproteins (Fisher et al.: Nature Biotech., 15, S. 142, 1997) für eine Sequenz des partiellen IL-6 entscheiden.

Wenn das Fusionsprotein durch Verwendung einer Modifikation an der Protease-Spaltstelle in der Primärstruktur Protease-beständig gemacht wird, werden die Modifikation und ihre Stelle in geeigneter Weise so festgelegt, dass sie der Protease-Art entsprechen, die verschiedene Spaltstellen, und zwar die Stelle der Deletion der Aminosäure, die Stelle der Anlagerung eines fremden Aminosäurerests oder die Stelle der Substitution der Aminosäure, hat, um gegen die Spaltung durch die Protease beständig zu sein. Bei der Modifikation durch Substitution wird die inhärente sterische Konfiguration durch Substitution so geändert, dass keine Spaltung durch eine Protease erfolgt oder dass eine Spaltung durch eine Protease weniger wahrscheinlich ist. Bei der Substitution wird die die gewünschte Aminosäure vorzugsweise durch eine kleinere Aminosäure, wie etwa Glycin oder Serin, substituiert. Bei der Modifikation durch Deletion wird das Proteinmolekül durch Deletion der gewünschten Aminosäure modifiziert, um die Erkennung der Spaltstelle durch die Protease zu verhindern oder um die inhärente sterische Konfiguration so zu ändern, dass keine Spaltung erfolgt oder die Spaltung weniger wahrscheinlich ist.

Die Modifikation kann so erfolgen dass ein Gen zur Codierung für das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein gentechnisch verändert wird. Die Modifikation kann durch Deletion einer Aminosäure, Insertion einer Aminosäure oder Substitution einer Aminosäure erfolgen. Von den Modifikationsmöglichkeiten wird die Deletion einer Aminosäure oder Aminosäure-Sequenz an der oder um die Protease-Spaltstelle besonders bevorzugt, da das Verfahren hierfür relativ einfach ist und der Einfluss der Substitution der nicht-inhärenten Aminosäure auf die Antigenität oder andere Eigenschaften für geringer gehalten wird.

Bei der gentechnischen Herstellung des IL-6R/IL-6-Fusionsproteins ist der spezielle Maßstab für die Auswahl die Verleihung der Beständigkeit gegen die von der verwendeten Wirtszelle abgesonderte Protease. Genauer gesagt, wird das gentechnisch herzustellende IL-6R/IL-6-Fusionsprotein in einer gewählten Wirtszelle exprimiert und das exprimierte Produkt wird einer Reinigung durch herkömmliche Flüssigchromatographie oder ein anderes Reinigungsverfahren unterzogen, wie später in den Beispielen gezeigt wird. Bei der Reinigung wird die Peak-Substanz, die vermutlich das Zerfallsprodukt der Protease ist, gewonnen, oder beim SDS-PAGE-Verfahren wird die Bandensubstanz, die vermutlich das Zerfallsprodukt der Protease ist, gewonnen. Die N-terminale Aminosäure-Sequenz wird analysiert, um die Spaltstelle des IL-6R/IL-6-Fusionsproteins zu finden, das von der Protease gespalten wird, die von den gewählten Wirtszellen abgesondert wird.

Nachdem die Stelle, an der das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein von der Protease gespalten wird, in der Primärstruktur erkannt worden ist, kann das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein, das gegen die Protease beständig ist, durch Deletion der Aminosäurereste um die Spaltstelle oder ein anderes Modifikationsverfahren gewonnen werden, sodass es nicht oder weniger leicht von der Protease gespalten wird.

Das Protease-beständige IL-6R/IL-6-Fusionsprotein ist auch zum Aufrechterhalten der biologischen Aktivität des IL-6R/IL-6-Fusionsproteins in einem Arzneimittel über einen längeren Zeitraum in Gegenwart einer Protease geeignet. Um das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein zu diesem Zweck herzustellen, wird die Protease, die die Aktivität in dem Milieu so aufrechterhalten kann, dass das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein eine biologische Aktivität zeigt, gewonnen, die Spaltstelle des nicht von der Protease modifizierten IL-6R/IL-6-Fusionsproteins wird ermittelt, und die Stelle wird, wie vorstehend beschrieben, modifiziert.

Das wie vorstehend modifizierte IL-6R/IL-6-Fusionsprotein wird vorzugsweise geprüft, um die Aufrechterhaltung seiner biologischen Aktivität nach der Modifikation zu bestätigen. Für die Bestätigung wird das modifizierte IL-6R/IL-6-Fusionsprotein hergestellt und beispielsweise unter Verwendung eines BAF130-Zellstamms geprüft, wie später in den Beispielen gezeigt wird. Wenn bei dieser Bestätigung festgestellt wird, dass das modifizierte IL-6R/IL-6-Fusionsprotein nicht biologisch aktiv ist, wird eine andere Modifikation durchgeführt und die Bestätigung erfolgt erneut in der vorstehenden Weise.

Das modifizierte IL-6R/IL-6-Fusionsprotein wird vorzugsweise zur Bestätigung seiner Beständigkeit gegen die Protease geprüft. Für diese Bestätigung lässt man das modifizierte IL-6R/IL-6-Fusionsprotein eine bestimmte Zeit mit der Protease koexistieren, und dann wird das Protein beispielsweise durch eine Kombination aus SDS-PAGE und Western-Blotting analysiert. Wenn festgestellt wird, dass das Protein nicht gegen die Protease beständig ist, wird eine andere Modifikation durchgeführt, und die Bestätigung erfolgt erneut in der vorstehenden Weise. Das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein, das gegen die Protease beständig gemacht worden ist, die von den Wirtszellen abgesondert wird, wird unter Verwendung dieser Wirtszellen hergestellt, und die Bestätigungsprüfung wird mit der Zellkultur in der gleichen Weise wie vorstehend durchgeführt.

Das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein kann problemlos mit einem Gen zu seiner Codierung durch ein genetisches Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Das Gen zur Codierung für den IL-6R oder das IL-6 ist bereits isoliert worden, und die Basensequenz ist bekannt. Daher kann das Fusionsprotein durch Herstellung der erforderlichen Gensequenzen aus den Aminosäuresequenzen des IL-6R oder IL-6 und durch Verbinden des IL-6R und IL-6 unter Verwendung eines Restriktionsenzyms hergestellt werden. Anstatt die natürliche Gensequenz zu verwenden, kann ein Codon darin durch ein anderes Codon ersetzt werden, das den gleichen Aminosäurerest codiert, jedoch unter Berücksichtigung der Codon-Kondensation eine andere Basensequenz hat. Der Grund hierfür ist, dass die Verwendung eines speziellen Codons manchmal das Expressionsverhältnis oder das Translationsverhältnis bei der Expression eines Proteins durch genetische Rekombination verbessern kann.

Die Wirtszelle zur Herstellung des Fusionsproteins durch genetische Rekombination ist nicht besonders beschränkt, und Escherichia coli oder tierische Zellen, die mit CHO-Zellen typisiert sind, die normalerweise bei der genetischen Rekombination zum Einsatz kommen, können der Literatur (Yasukawa et al.: J. Biochem., 108, S. 673, 1990) zufolge verwendet werden. Von den Wirtszellen wird der Hefepilz Pichia pastoris, der in den Beispielen verwendet wird, besonders bevorzugt, da dieser Hefepilz mit Methanol als einziger Kohlenstoffquelle wachsen kann und kostengünstiger als tierische Zellen wie CHO-Zellen kultiviert werden kann.

Ein Beispiel für ein IL-6R/IL-6-Fusionsprotein, das gegen die Protease beständig ist, die vom Hefepilz der Spezies Pichia pastoris abgesondert wird, der eine geeignete Wirtszelle bei der gentechnischen Herstellung des IL-6R/IL-6-Fusionsproteins ist, ist das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein, das von einem IL-6R mit einem modifizierten IL-6 abgleitet ist, bei dem mindestens die Sequenz vom N-terminalen Alaninrest an Position 28 bis zum N-terminalen Leucinrest an Position 37 deletiert ist. Das Protease-beständige IL-6R/IL-6-Fusionsprotein kann durch Herstellen eines Gens zur Codierung für das Protease-beständige IL-6R/IL-6-Fusionsprotein, Aufstellen eines Expressionsvektors mit dem darin inserierten Gen, Transformieren der Wirtszellen und Kultivieren der transformierten Wirtszellen in Massen produziert werden. Das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein, das in der vorstehenden Weise gegen die von den Wirtszellen abgesonderte Protease beständig gemacht worden ist, wird von der Protease nicht oder kaum gespalten, nachdem es in den Wirtszellen exprimiert worden ist. Daher kann es problemlos in größeren Mengen als das nichtbeständige IL-6R/IL-6-Fusionsprotein hergestellt werden.

Das vorgenannte Gen zur Herstellung des Fusionsproteins, das durch genetische Rekombination hergestellt wird, wird in einen Expressionsvektor inseriert, um es (zur Transformation) in die Wirtszelle einzubringen. Außer dem vorgenannten Gen werden auch ein Expressionssteuerungsgen, ein Gen zum Auswählen der transformierten Wirtszelle usw. in den Expressionsvektor inseriert. Die einzubauenden Gene werden in geeigneter Weise in Abhängigkeit von der verwendeten Wirtszelle gewählt. Wenn beispielsweise der Hefepilz des Stamms Pichia pastoris als Wirtszelle verwendet wird, werden die Upstream-Sequenz und die Downstream-Sequenz eines Alkoholoxidase-Gens zum Einbau des Gens zur Codierung für das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein in eine chromosomale DNA, ein Histidinsynthese-Gen als Selektionsindikator und eine Promotorsequenz eines Alkoholoxidase-Gens zur Expressionssteuerung inseriert, und wenn E. coli als Wirtszelle verwendet wird, werden ein Ampicillin-beständiges Gen als Selektionsindikator und eine Lac-Promotor/Operator-Sequenz inseriert. Zum Einbauen des Gens kann ein handelsüblicher Expressionsvektor (z. B. pPIC9, ein Expressionsvektor für den Hefepilz des Stamms Pichia pastoris, hergestellt von Invitrogen Co.) verwendet werden.

Wenn der Hefepilz des Stamms Pichia pastoris mit einem Expressionsvektor, der ein Gen zur Codierung für das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein enthält, zur Herstellung des Fusionsproteins transformiert wird, werden in den Expressionsvektor vorzugsweise das inhärente Signalpeptid des IL-6R und ein Signalpeptid des &agr;-Faktors als Signalpeptid des Fusionsproteins, insbesondere ein Signalpeptid des &agr;-Faktors, für eine hohe Expression eingebaut.

Das Fusionsprotein kann durch Kultivieren der vorgenannten transformierten Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen und gegebenenfalls durch Herbeiführen der Expression des Fusionsproteins in Bezug auf das Expressionssteuerungsgen im Expressionsvektor hergestellt werden. In einem Beispiel kommt ein Rüttelfermenter zum Einsatz, wenn vorzugsweise der Hefepilz Pichia pastoris als Wirtszelle verwendet wird. Insbesondere werden 100 ml Kultur, die sich in einem 500-ml-Schüttelgefäß befindet, mit einem vorher hergestellten, in 20-%igem Glycerol eingefrorenen Hefepilz des Stamms Pichia pastoris beimpft, der das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein exprimieren kann. Der Hefepilz. wird 20 Stunden bei 28 bis 30 °C kultiviert. 6–9 l Kultur, die sich in einem 16-I-Rüttelfermenter befinden, werden mit den entstandenen 100 ml Flüssigkultur beimpft und unter Begasung und Rühren bei 28 bis 30 °C kultiviert. Zur Überwachung des Zustands des kultivierten Hefepilzes werden vorzugsweise der OD600, der pH, die Konzentration des gelösten Sauerstoffs, die Rührgeschwindigkeit und die Temperatur überwacht und gesteuert. Das Kulturmedium ist nicht beschränkt, vorausgesetzt, eine Kohlenstoffquelle natürlichen Ursprungs ist enthalten. Spezielle Zusammensetzungen sind in den Beispielen angegeben. Für die Kultivierung kann ein handelsüblicher Rüttelfermenter verwendet werden. Während der Kultivierung wird Methanol zugesetzt, wenn das Glycerol vollständig verbraucht worden ist. Der Methanolverbrauch wird durch Überwachen des gelösten Sauerstoffs ermittelt. Das Methanol wird vorzugsweise innerhalb von fünf Stunden nach dem vollständigen Verbrauch zugesetzt. Eine zu hohe Methanolmenge ist für den Hefepilz giftig, während ein Methanolmangel die Funktion der Promotorsequenz des Alkoholoxidase-Gens unterdrückt. Daher beträgt die Methanolmenge vorzugsweise nicht weniger als 0,5 % und nicht mehr als 5 % (Masse/Volumen).

Das durch die Kultivierung hergestellte Fusionsprotein wird mit einem geeigneten Verfahren aus der Kultur gewonnen. Wenn Escherichia coli als Wirtszelle verwendet wird, wird das exprimierte Fusionsprotein als unlösliche Granalien in den E.-coli-Zellen angesammelt, sodass die E.-coli-Masse zerstoßen und einer Rückfaltung oder Reinigung unter geeigneten Bedingungen unterzogen werden kann. Wenn der Hefepilz Pichia pastoris als Wirtszelle verwendet wird, kann das Fusionsprotein durch Reinigung aus der überstehenden Flüssigkeit der Kultur gewonnen werden. Die Stofflösung für die Reinigung ist nicht beschränkt, vorausgesetzt, sie enthält das Fusionsprotein. Ein Beispiel für die Flüssigkeit ist eine flüssige Kultur des Hefepilzes Pichia pastoris, die das Fusionsprotein enthält. Die Lösung kann unverändert verarbeitet werden, aber sie kann auch nach Verdünnung mit einer Pufferlösung oder reinem Wasser oder nach Eindickung durch Ultrafiltration oder unter Verwendung von Ammoniumsulfat verarbeitet werden. Die Reinigung erfolgt mit drei Chromatographie-Arten, die Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie und Gelfiltrationschromatographie umfassen.

Da die überstehende flüssige Kultur des Hefepilzes Pichia pastoris voluminös ist, wird sie vorzugsweise zuerst mit Ionenaustausch-Chromatographie behandelt. Die Ionenaustausch-Chromatographie umfasst Kationen-Chromatographie und Anionen-Chromatographie, und beide können in geeigneter Weise unter Berücksichtigung der Protein-Eliminationsleistung verwendet werden. Beispielsweise wird bei der Kationen-Chromatographie SP als funktionelle Kationen-Austauschgruppe verwendet, und bei der Anionen-Chromatographie wird DEAE als funktionelle Anionen-Austauschgruppe verwendet. Unter Berücksichtigung der Durchflussgeschwindigkeit von 100 ml/min oder mehr und des Charakters der Probenlösung, die nicht mit einem Filter mit einer Porengröße von 1 &mgr;m oder kleiner behandelt worden ist, ist die Kationen-Chromatographie, bei der eine Fließbettsäule Streamline SP C-50 (hergestellt von Amasham Pharmacia Co.) verwendet wird, ein bevorzugtes Beispiel. Die Fraktion, die das vorstehend gewonnene Fusionsprotein enthält, wird dann einer hydrophoben Chromatographie unterzogen, um eine Fraktion zu erhalten, die das Fusionsprotein in einer höheren Reinheit enthält. Diese Fraktion wird dann durch Kationen-Chromatographie eingedickt, um die anschließende Gelfiltrationschromatographie effizient durchzuführen, wie später in den Beispielen gezeigt wird.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchten umfassend die Stammzellen-Amplifikationswirkung des IL-6R/IL-6-Fusionsproteins, bei dem einer der Aminosäurereste des IL-6R und einer der Aminosäurereste des IL-6 direkt verbunden sind. Im Ergebnis stellten sie fest, dass bei der Kultivierung der CD34-positiven Zellen auf einer Methylcelluloseplatte in Gegenwart des Fusionsproteins und eines Stammzellenfaktors (SCF) das Koloniebildungsvermögen wesentlich höher als das Koloniebildungsvermögen ist, das für die Kultivierung in Gegenwart des IL-6, IL-6R und SCF berichtet wird.

Das Fusionsprotein ist in gewissem Umfang als ex-vivo-Verstärker für blutbildende Stammzellen allein wirksam und ist in der Praxis nützlich. Durch Zugabe einer Cytokine stimulierenden Tyrosin-Kinase, wie etwa SCF, und eines FLK2-Liganden, insbesondere SCF, wird die Wirkung beachtlich. Außerdem kann Interleukin-3 (IL-3) oder ein Thrombozytenvermehrungsfaktor (TPO) zugegeben werden. Die blutbildenden Stammzellen können aus Nabelschnurblut, peripherem Blut oder Knochenmark durch CD34-Selektion als eine die blutbildenden Stammzellen enthaltende Fraktion gewonnen werden. Das Fusionsprotein kann als Kit mit Glasfläschchen, die das Fusionsprotein und ein anderes Cytokin getrennt enthalten, geliefert werden, oder es kann als Gemisch daraus, das in einem einzigen Glasfläschchen enthalten ist, geliefert werden. Die ex-vivo-Amplifikation der blutbildenden Stammzellen kann durch 1- bis 3-wöchiges Kultivieren einer die blutbildenden Zellen enthaltenden Fraktion in einer serumfreien Kultur, die das Fusionsprotein und den SCF o. Ä. enthält, in einem Behälter, wie etwa einem Kunststoffbeutel, bei 37 °C erfolgen. Die amplifizierten blutbildenden Stammzellen können wie bei einer herkömmlichen Stammzellentransfusion mit peripherem Blut einem Patienten zurückgegeben werden.

Die Erfinder der vorliegenden Erfinder untersuchten umfassend die Thrombozytenvermehrungswirkung des IL-6R/IL-6-Fusionsproteins, bei dem einer der Aminosäurereste des IL-6R und einer der Aminosäurereste des IL-6 direkt verbunden sind. Wie in den späteren Beispielen gezeigt, stellten sie fest, dass bei Verabreichung des Fusionsproteins an Mäuse die Vermehrung von Thrombozyten wesentlich verbessert wird und dass bei Mäusen, die zuerst ein karzinostatisches Mittel und dann das Fusionsprotein erhielten, die Wiederherstellung von Thrombozyten wesentlich beschleunigt wird. Daher kann ein Thrombozytenvermehrungsmittel das Fusionsprotein als Hauptbestandteil enthalten. Das Thrombozytenvermehrungsmittel wird vorzugsweise durch parenterale Verabreichung, wie etwa intravenöse Verabreichung, intramuskuläre Verabreichung und perkutane Verabreichung, verabreicht. Die Dosis wird in Abhängigkeit von der Art der Erkrankung, die den Thrombozytenmangel verursacht, dem Zustand des Patienten usw. festgelegt und liegt in der Regel im Bereich von 1 bis 500 &mgr;g/kg/Tag. Das Mittel wird in Abhängigkeit vom Zustand der Thrombozytenvermehrung regelmäßig verabreicht. Das Thrombozytenvermehrungsmittel kann durch Mischen eines herkömmlichen Vehikels oder eines Aktivators, wie etwa physiologische Kochsalzlösung, Glucoselösung, Mannitol, Methylcellulose, Gelatine und Humanserumalbumin, formuliert werden. Das Thrombozytenvermehrungsmittel kann gefriergetrocknet werden. Das gefriergetrocknete Produkt wird vor Gebrauch in einer isotonischen Lösung, wie etwa physiologische Kochsalzlösung, Glucoselösung und Ringer-Lösung, wiederaufgelöst.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1(a) zeigt ein IL-6R/IL-6-Fusionsprotein, das durch Verbinden des IL-6R mit dem IL-6 durch eine Linker-Sequenz gebildet wird.

1(b) zeigt ein IL-6R/IL-6-Fusionsprotein, das durch Verbinden des IL-6R mit dem IL-6 direkt ohne einen Linker gebildet wird.

2 zeigt die Struktur des im Beispiel 1 hergestellten Plasmids pBS6R6S, in der "amp" ein Ampicillin-tolerantes Gen bezeichnet, „ori" eine Transkriptionsinitiationsstelle bezeichnet, „IL-6" ein IL-6-Gen bezeichnet und „IL-6R" ein IL-6R-Gen bezeichnet.

3 zeigt das Verfahren zum Inserieren von zwei Arten von reassoziierten Oligonucleotiden in das in 2 gezeigte Plasmid pBS6R6S nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren.

4 zeigt die Struktur des im Beispiel 1 hergestellten Plasmids pBS6R6L, in der „amp" ein Ampicillin-tolerantes Gen bezeichnet, „ori" eine Transkriptionsinitiationsstelle bezeichnet, „IL-6" ein IL-6-Gen bezeichnet und „IL-6R" ein IL-6R-Gen bezeichnet.

5 zeigt das Verfahren zum Inserieren von zwei Arten von reassoziierten Oligonucleotiden in das in 4 gezeigte Plasmid pBS6R6L nach dem im Beispiel 2 beschriebenen Verfahren.

6 zeigt die Struktur des Plasmids pBS6R6L zum Exprimieren eines im Beispiel 2 hergestellten Derivats 333A&Dgr;A. In 6 bezeichnet „amp" ein Ampicillin-tolerantes Gen, „ori" eine Transkriptionsinitiationsstelle, „HIS4" ein Histidinsynthese-Gen, „3'AOXTT" einen Terminator, „IL-6" ein IL-6-Gen, „IL-6R" ein IL-6R-Gen, „S" ein Gen zur Codierung für eine Signalsequenz und „5'AOX1" einen Upstream-Bereich eines Alkoholoxidase-Gens, das eine Promotorsequenz enthält.

7 zeigt (A) die Art und Anzahl der Aminosäuren am C-Terminal des IL-6R-Bereichs, (B) die Aminosäuresequenz (das Symbol „" bedeutet, dass der Linker fehlt), (C) die Art und Anzahl der Aminosäuren am N-Terminal des IL-6R-Bereichs und (D) die mittlere biologische Aktivität für die einzelnen 216 Kulturmedium-Überstände, die im Beispiel 4 gewonnen werden und nach dem im Beispiel 5 beschriebenen Verfahren gemessen werden.

8 zeigt die Änderung, die von der im Beispiel 6 beschriebenen Kultivierung verursacht wird, in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer. In 8 bedeutet „MeOH conc." Methanol-Konzentration [Einheit: % (Masse/Volumen)], EIA bedeutet Sandwich-Test, und „Bio Assay" bedeutet biologische Aktivität.

9 zeigt die biologische Aktivität von FP6, die nach dem Verfahren im Beispiel 8 gemessen wird.

10 zeigt das Ergebnis der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese von FP6, das 0 bis 180 Minuten mit Endoglycosidase N nach dem im Beispiel 10 beschriebenen Verfahren behandelt worden ist. In 10 bezeichnet die Spur des Symbols N die einfache Endoglycosidase N, und die mit den Zahlensymbolen 0 bis 180 bezeichneten Spuren geben die Ergebnisse von FP6 an, das für die Zeit (Minuten), die von den einzelnen Zahlensymbolen angegeben wird, mit Endoglycosidase N behandelt worden ist. Die Balkenmarkierungen, die mit den Zahlensymbolen 97.4 und 66.3 bezeichnet sind, geben jeweils die Position der Erkennung des Markers der relativen Molekülmasse (relative Molekülmasse von 97,4 kDa oder 66,3 kDa) an.

11 zeigt die Koloniebildungsaktivität von 500 CD34-positiven Zellen nach dem Verfahren von Beispiel 11 mit (1) der Kombination aus IL-6 (100 ng/ml) und IL-6R (100 ng/ml), (2) der Kombination aus IL-6 (100 ng/ml) und IL-6R (200 ng/ml), (3) FP6 (300 ng/ml) und (4) FP6 (600 ng/ml). In 11 bezeichnet „G" eine Granulozytenkolonie, „M" eine Makrophagenkolonie, „GM" einen Granulozyten/Makrophagen-Mischkolonie, „Blast" eine Blastenkolonie, „Mix" eine Granulozyten/Makrophagen/Erythroblasten-Mischkolonie und „BFU-E" eine Erythroblastenkolonie.

12 zeigt die Mittelwerte der Thrombozytenzahl bei C57BL6-Mäusen, die im Beispiel 12 kein FP6 erhalten haben (Gruppe 1) und die FP6 erhalten haben (Gruppen 2–5). In 12 gibt das Sternchen den signifikanten Unterschied in der Thrombozytenzahl gegenüber der Gruppe 1 an (p < 0,05).

13 zeigt die Mittelwerte der Thrombozytenzahl bei C57BL6-Mäusen, die im Beispiel 13 zuerst 5FU und dann kein FP6 erhalten haben (Gruppe 1, ausgefüllte Quadrate) und die FP6 erhalten haben (Gruppe 2, leere Quadrate). In 13 gibt das Sternchen den signifikanten Unterschied in der Thrombozytenzahl gegenüber der Gruppe 1 an (p < 0,05).

14 zeigt die relative mittlere biologische Aktivität von (1) neun muts-Stämmen, die das Fusionsprotein 112VAA exprimieren können, und von (2) elf muts-Stämmen, die das Fusionsprotein 116EAA exprimieren können. Die beiden Fusionsproteine werden im Beispiel 14 gewonnen und nach dem Verfahren von Beispiel 5 als Relativwerte (%) in Bezug auf den Stamm III–108 gemessen, der der aktivste der elf muts-Stämme beim Exprimieren von 333A&Dgr;A ist.

15 zeigt die Western-Blotting-Ergebnisse für die Kulturmedium-Überstände, die (a) 20LAA, (b) 20LAD, (c) 116EAA, (d) 116EAD, (e) 112VAA bzw. (f) 112VAD enthalten, nach dem im Beispiel 8 beschriebenen Verfahren.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert. Die vorliegende Erfindung wird jedoch nicht durch die Beispiele beschränkt.

Beispiel 1: Herstellung von Zwischenplasmiden

Die Zwischenplasmide pBS6RS und pBS6RL wurden durch Inserieren einer Oligonucleotid-Codierung für einen Linker zur Herstellung einer Gen(cDNA)-Codierung für ein IL-6R/IL-6-Fusionsprotein hergestellt, bei dem die Verbindung durch einen Linker erfolgt, wie nachstehend beschrieben.

Zunächst wurde ein Klonierungsvektor, und zwar pBluescript II KS(–) (hergestellt von Toyobo Co.), mit einem Restriktionsenzym KpnI geteilt, mit einem Klenow-Fragment behandelt und einer Ligationsreaktion unterzogen, um das Plasmid pBS mit deletierter KpnI-Stelle zu gewinnen.

Dann wurde das IL-6R-Gen (cDNA) unter Verwendung des Primers p6RAB20L (Sequenz Nr. 45) und des Primers p6RF320S (Sequenz Nr. 46) amplifiziert und mit XhoI geteilt. Das IL-6R-Gen wurde in das Plasmid pBS, das zuvor mit XhoI und EcoRV geteilt worden war, inseriert, um pBS6R zu erhalten.

Das IL-6R-Gen (cDNA) wurde unter Verwendung des Primers plL6B2 (Sequenz Nr. 47) und des Primers plL6F (Sequenz Nr. 48) amplifiziert und mit Bgl II und NotI geteilt. Das IL-6R-Gen wurde in das Plasmid pBS6R, das zuvor mit Bgl II und NotI geteilt worden war, inseriert, um pBS6R6S zu erhalten. 2 zeigt die Struktur des erhaltenen pBS6R6S.

Dann wurden die Oligomere 320S333Ab (Sequenz Nr. 49) und 320S333Af (Sequenz Nr. 50) in herkömmlicher Weise reassoziiert. Diese wurden in das Plasmid pBS6R6S, das zuvor mit Bgl II und Kpn I geteilt worden war, inseriert, um pBS6R6L zu erhalten. 4 zeigt die Struktur des erhaltenen pBS6R6L.

Beispiel 2: Herstellung von Expressionsplasmiden

In pBS6R6S, das zuvor mit Bgl II und Kpn I geteilt worden war, wurden die reassoziierten Sequenzen 1–5, die durch Reassoziieren von zwei Arten von Oligonucleotiden erhalten worden waren, entsprechend inseriert, wie nachstehend angegeben, um fünf Arten von Plasmiden zu erhalten, die als Insert ein Gen zur Codierung für das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein haben:

  • Reassoziierte Sequenz 1 (323AG4SA): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 1 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 2 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 2 (323AG4S2A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 3 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 4 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 3 (334LPA): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 5 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 6 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 4 (333A&Dgr;A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 7 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 8 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 5 (323A&Dgr;A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 9 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 10 befindet sich auf der Antisense-Seite.

Die reassoziierte Sequenz 1 (323AG4SA) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch Verbinden des N-terminalen Alaninrests an Position 323 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker GGGGS gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 2 (323AG4S2A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch Verbinden des N-terminalen Alaninrests an Position 323 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker GGGGSGGGGS gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 3 (334LPA) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch Verbinden des N-terminalen Leucinrests an Position 334 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker P gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 4 (333A&Dgr;A) exprimiert ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, das durch direktes Verbinden des N-terminalen Alaninrests an Position 333 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 ohne einen Linker gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 5 (323A&Dgr;A) exprimiert ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, das durch direktes Verbinden des N-terminalen Alaninrests an Position 323 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 ohne einen Linker gebildet wird.

In pBS6R6L, das zuvor mit Eco47 III und Kpn I geteilt worden war, wurden die reassoziierten Sequenzen 6–22, die durch Reassoziieren von zwei Arten von Oligonucleotiden erhalten worden waren, entsprechend inseriert, wie nachstehend angegeben, um 17 Arten von Plasmiden zu erhalten, die als Insert ein Gen zur Codierung für das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein haben:

  • Reassoziierte Sequenz 6 (323AG4SA): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 11 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 12 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 7 (323AG4S2A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 13 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 14 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 8 (343IG4S2A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 15 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 16 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 9 (333AG4S3A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 17 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 18 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 10 (333AG2A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 19 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 20 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 11 (333AG4A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 21 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 22 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 12 (343IG2A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 23 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 24 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 13 (343IG4A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 25 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 26 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 14 (361S&Dgr;A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 27 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 28 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 15 (358D&Dgr;A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 29 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 30 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 16 (352T&Dgr;A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 31 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 32 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 17 (346R&Dgr;A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 33 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 34 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 18 (343I&Dgr;A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 35 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 36 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 19 (338K&Dgr;A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 37 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 38 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 20 (335T&Dgr;A): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 39 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 40 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 21 (343I&Dgr;P): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 41 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 42 befindet sich auf der Antisense-Seite.
  • Reassoziierte Sequenz 22 (338I&Dgr;P): Das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 43 befindet sich auf der Sense-Seite, und das Oligonucleotid der Sequenz Nr. 44 befindet sich auf der Antisense-Seite.

Die reassoziierte Sequenz 6 (333AG4SA) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch Verbinden des N-terminalen Alaninrests an Position 333 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker GGGGS gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 7 (333AG4S2A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch Verbinden des N-terminalen Alaninrests an Position 333 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker GGGGSGGGGS gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 8 (343IG4S2A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch Verbinden des N-terminalen Isoleucinrests an Position 343 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker GGGGSGGGGS gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 9 (333AG4S3A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch Verbinden des N-terminalen Alaninrests an Position 333 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker GGGGSGGGGSGGGGS gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 10 (333AG2A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch Verbinden des N-terminalen Alaninrests an Position 333 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker GG gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 11 (333AG4A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch Verbinden des N-terminalen Alaninrests an Position 333 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker GGGG gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 12 (343IG2A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch Verbinden des N-terminalen Isoleucinrests an Position 343 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker GG gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 13 (343IG4A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch Verbinden des N-terminalen Isoleucinrests an Position 343 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker GGGG gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 14 (361S&Dgr;A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch direktes Verbinden des N-terminalen Serinrests an Position 361 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 ohne einen Linker gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 15 (358D&Dgr;A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch direktes Verbinden des N-terminalen Asparaginsäurerests an Position 358 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 ohne einen Linker gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 16 (352T&Dgr;A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch direktes Verbinden des N-terminalen Threoninrests an Position 352 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 ohne einen Linker gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 17 (346R&Dgr;A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch direktes Verbinden des N-terminalen Argininrests an Position 346 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 ohne einen Linker gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 18 (343I&Dgr;A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch direktes Verbinden des N-terminalen Isoleucinrests an Position 343 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 ohne einen Linker gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 19 (338K&Dgr;A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch direktes Verbinden des N-terminalen Lysinrests an Position 338 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 ohne einen Linker gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 20 (335T&Dgr;A) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch direktes Verbinden des N-terminalen Threoninrests an Position 335 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 ohne einen Linker gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 21 (343I&Dgr;P) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch direktes Verbinden des N-terminalen Isoleucinrests an Position 343 des IL-6R und des N-terminalen Prolinrests an Position 29 des IL-6 ohne einen Linker gebildet wird. Die reassoziierte Sequenz 22 (338K&Dgr;P) exprimiert ein Fusionsprotein, das durch direktes Verbinden des N-terminalen Lysinrests an Position 338 des IL-6R und des N-terminalen Prolinrests an Position 29 des IL-6 ohne einen Linker gebildet wird.

Das pBS6R6S selbst hat ein Gen zur Codierung für das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein als Insert. Das durch dieses Gen exprimierte Fusionsprotein (334L&Dgr;V) ist ein Fusionsprotein, das durch direktes Verbinden des N-terminalen Leucinrests an Position 334 des IL-6R und des N-terminalen Valinrests an Position 30 des IL-6 ohne einen Linker gebildet wird.

Schließlich wurden die vorstehend erhaltenen 23 Plasmid-Arten und pBS6R6L mit XhoI bzw. NotI geteilt, um Gene zur Codierung für das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein zu erhalten. Die Gene wurden einzeln in pPIC9 inseriert, das zuvor mit XhoI und NotI geteilt worden war, um 24 Arten von Expressionsplasmiden zu erhalten. 6 zeigt die Struktur des Expressionsplasmids 333A&Dgr;A als Beispiel.

Beispiel 3: Herstellung von Transformanten

Aus dem Pichia-pastoris-Stamm GS115 (Invitrogen Co.) wurden kompetente Zellen unter Verwendung des Transformationskits EasyComp (Invitrogen Co.) hergestellt, und in diese wurden die entsprechenden Expressionsplasmide, die mit Bgl II linearisiert worden waren, inseriert. Die transformierten Zellen wurden in Minimalmedium kultiviert, und es wurden die transformierte Zellen ausgewählt, die ihre Eigenschaft, Histidin zu benötigen, verloren hatten.

MD-Platten [1,34 % (Masse/Volumen) YNB wo AA (Hefe-Stickstoff-Trägermaterial ohne Aminosäure), 0,00004 % (Masse/Volumen) Biotin und 2 % (Masse/Volumen) Glucose] und MM-Platten [1,34 % (Masse/Volumen) YNB wo AA, 0,00004 % (Masse/Volumen) Biotin und 0,5 (Volumen/Volumen) Methanol] wurden mit den gewonnenen Transformanten beimpft. Mit diesen Platten wurden die einzelnen Transformanten auf mut+ und muts untersucht.

Tabelle 1 gibt die Anzahl der gewonnenen Transformanten und die Anzahl der gewonnenen muts-Stämme für die einzelnen Derivate an. Für die einzelnen Derivate wurden im Durchschnitt 9,4 muts-Stämme, die von den Expressionsplasmiden transformiert wurden, erhalten (niedrigste Anzahl: 4, höchste Anzahl: 17, Gesamtanzahl: 216).

Tabelle 1
Beispiel 4: Kultivierung von Transformanten

Die muts-Stämme (insgesamt 216 Arten) und die muts-Stämme, die ein Fusionsprotein exprimieren, das durch Verbinden des N-terminalen Leucinrests an Position 344 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker SSELV gebildet werden (in der japanischen Patentanmeldung 10-2921 beschrieben), wurden jeweils 120 Stunden bei 30 °C in Reagenzgläsern kultiviert, die jeweils 3 ml Kulturmedium enthielten, das aus einem BMGY-Kulturmedium [1 % (Masse/Volumen Hefe-Extrakt, 2 % (Masse/Volumen) Pepton, 1,34 % (Masse/Volumen) YNB wo AA (Hefe-Stickstoff-Trägermaterial ohne Aminosäure), 0,4 mg/l Biotin, 100 mM Kaliumphosphat (pH 6,0) und 1 % (Masse/Volumen) Glycerol] bestand. Nach 120-stündiger Kultivierung wurde von den einzelnen flüssigen Kulturmedien eine Probe genommen. Die Proben wurden jeweils zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten.

Beispiel 5: Messung der biologischen Aktivität

Die biologische Aktivität der IL-6R/IL-6-Fusionsproteine in den im Beispiel 4 gewonnenen Kultur-Überständen wurde nach einem Verfahren gemessen, das BAF130-Zellen verwendet. BAF130 ist eine Zelle, die durch Transformieren einer Mauszelle BAF, die gp130 nicht von Natur aus exprimiert (Hatakeyama et al.: Cell, 63, S. 154, 1989), durch Einbringen eines Gens zur Codierung für humanes gp130-Protein hergestellt, um dieses Protein zu exprimieren. Daher zeigt diese Zelle eine Wachstumsaktivität in Gegenwart eines physiologisch aktiven IL-6R und IL-6.

Eine Suspension von BAF130 wurde auf 96-Well-Platten in einer Menge von 2 × 104 Zellen je Well gegeben. Die 216 Arten von Kultur-Überständen wurden auf 1 %, 0,25 %, 0,061 % und 0,015 % verdünnt, und die Fraktionen der verdünnten Stoffe wurden jeweils in die Wells gegeben. Nach zwei Tagen wurde die Lichtabsorption bei 405 nm mit einer Bezugswellenlänge von 600 nm unter Verwendung eines Zellenzähl-Kits „Cell Counting Kit" (hergestellt von Wako Junyaku Co., Ltd.) gemessen. Für die Standardlösung wurde 1 &mgr;g/ml IL-6 auf verschiedene Konzentrationen verdünnt und diese wurden mit 100 ng/ml lösliches IL-6R in den Kultur-Überstand gegeben. Die Aktivität des Kultur-Überstands zeigt die gleiche Abhängigkeit der Absorption von der Konzentration, da diese als 1 Einheit/ml definiert ist. 7 zeigt die mittlere biologische Aktivität der Kultur-Überstände von 4–17 Arten von muts-Stämmen, die jeweils mit dem gleichen Fusionsprotein-Expressionsvektor transformiert worden sind, für jedes Fusionsprotein.

7 zeigt, dass bei allen zwölf Fusionsprotein-Arten, die keine Linker-Sequenz haben, mindestens ein Kultur-Überstand des mit demselben Fusionsprotein-Expressionsvektor transformierten muts die Aktivität zeigte. Das heißt, dass das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein, bei dem das C-Terminal eines der 39 Aminosäurereste vom N-terminalen Alaninrest an Position 323 bis zum N-terminalen Serinrest an Position 361 mit dem N-terminalen Aminosäurerest des IL-6 verbunden ist, Signale übertragen kann.

7 zeigt außerdem, dass die Fusionsproteine 323A&Dgr;A, 333A&Dgr;A, 334L&Dgr;V, 335T&Dgr;A, 338K&Dgr;P, 338K&Dgr;A, 343I&Dgr;P und 343I&Dgr;A, die jeweils ein IL-6R/IL-6-Fusionsprotein sind, bei dem der Aminosäurerest des N-Terminals des IL-6 mit dem C-Terminal des Alaninrests an Position 323, des Alaninrests an Position 333, des Leucinrests an Position 334, des Threoninrests an Position 335, des Lysinrests an Position 338 bzw. des Isoleucinrests an Position 343 verbunden ist, aktiver als das bekannte (in der japanischen Patentanmeldung Nr. 10-2921 beschriebene) Fusionsprotein 334LSSELVA ist, das durch Verbinden des N-terminalen Leucinrests an Position 344 des IL-6R und des N-terminalen Alaninrests an Position 28 des IL-6 durch einen Linker SSELV gebildet wird.

7 zeigt weiterhin, dass die Fusionsproteine 323A&Dgr;A, 333A&Dgr;A, 334L&Dgr;V, 335T&Dgr;A, 338K&Dgr;P, 338K&Dgr;A, 343I&Dgr;P und 343I&Dgr;A, die jeweils ein IL-6R/IL-6-Fusionsprotein sind, bei dem der Aminosäurerest des N-Terminals des IL-6 mit dem C-Terminal des Alaninrests an Position 323, des Alaninrests an Position 333, des Leucinrests an Position 334, des Threoninrests an Position 335, des Lysinrests an Position 338 bzw. des Isoleucinrests an Position 343 verbunden ist, fast genauso aktiv wie oder etwas weniger aktiv als die Fusionsproteine 323AG4SA, 333AG4SA, 323AG4S2A, 333AG4S2A, 3431G4S2A und 333AG4S3A sind, die jeweils ein IL-6R/IL-6-Fusionsprotein sind, das durch Verbinden durch einen Peptid-Linker gebildet wird, der aus 5–15 Aminosäureresten mit einem hohen Freiheitsgrad, wie etwa Glycinresten oder Serinresten, besteht, oder fast genauso aktiv wie oder etwas weniger aktiv als die Fusionsproteine 334LPA, 333AG2A, 333AG4A, 3431G2A und 3431G4A sind, die jeweils ein IL-6R/IL-6-Fusionsprotein sind, das durch Verbinden durch einen Peptid-Linker gebildet wird, der aus 1–4 Aminosäuren besteht. Daher werden unter den IL-6R/IL-6-Fusionsproteinen diejenigen besonders bevorzugt, bei denen der N-terminale Aminosäurerest des IL-6 mit einem der sechs Aminosäurereste Alaninrest an Position 323, Alaninrest an Position 333, Leucinrest an Position 334, Threoninrest an Position 335, Lysinrest an Position 338 und Isoleucinrest an Position 343 verbunden ist.

Beispiel 6: Massenkultivierung von muts-Stämmen zum Exprimieren des Fusionsproteins

Von den elf im Beispiel 3 beschriebenen muts-Stämmen, die 33A&Dgr;A exprimieren, wurde der Stamm III–108, der bei der Expression in dem Verfahren der Beispiele 4 und 5 am aktivsten war, unter Verwendung eines 16-I-Gefäßes kultiviert. 100 ml Kulturmedium BMGY [10 g/l Bacto Yeast Extract, 20 g/l Bacto Peptone, 1,34 g/l Hefe-Stickstoff-Trägermaterial ohne Aminosäure, 100 mM Kaliumphosphat (pH 6,0), 10 g/l Glycerol und 0,4 mg/l Biotin] wurden mit einem Glycerol-Stamm des Stamms III–108 beimpft, und dies wurde 24 Stunden bei 30 °C mit einem Schüttelkultivator G-20 (hergestellt von NBS Co.) bei 200 U/min kultiviert. 8 l BMGY (10 g/l Bacto Yeast Extract, 20 g/l Bacto Peptone, 1,34 g/l Hefe-Stickstoff-Trägermaterial ohne Aminosäure, 100 mM Kaliumphosphat (pH 6,0), 10 g/l Glycerol und 0,4 mg/l Biotin] wurden mit der gesamten Kulturflüssigkeit beimpft, und dies wurde bei 28 °C mit einem 10-l-Gefäß SF-116 (hergestellt von NBS Co.) mit einer Rührgeschwindigkeit von 350 U/min und einer Belüftung von 1 vvm kultiviert. 16 Stunden nach Kultivierungsbeginn wurden 1,6 l flüssiges Gemisch mit 240 ml Methanol, 50 g/L Bacto Yeast Extract und 100 g/l Bacto Peptone zugegeben, um die Expression des Fusionsproteins einzuleiten. 8 zeigt den Ablauf der Kultivierung.

Die Methanol-Konzentration in der flüssigen Kultur wurde mittels Gaschromatographie überwacht. Der pH der flüssigen Kultur wurde mit einem pH-Messgerät gemessen. Der OD600-Wert (Index der Biomasse) wurde bei einer 100-fachen Verdünnung der Kulturflüssigkeit mit physiologischer Kochsalzlösung mittels eines Spektralphotometers gemessen. Die Konzentration des Fusionsproteins wurde mit dem Sandwich-Test unter Verwendung des antihumanen monoclonalen IL-6R-Antikörpers MT-18 (Hirato et al.: J. Immunol., 143, S. 2900, 1989) als festem Antikörper, des antihumanen polyclonalen IL-6-Antikörpers (hergestellt von Dienzyme Co.) als Nachweis-Antikörper und des im Beispiel 7 erhaltenen Fusionsproteins als Standardsubstanz gemessen. Die biologische Aktivität des Fusionsproteins wurde unter Verwendung von BAF130-Zellen gemessen, wie im Beispiel 5 dargelegt.

Beispiel 7: Reinigung des Fusionsproteins

Die im Beispiel 6 aufgenommene flüssige Kultur wurde zentrifugiert, um die Biomasse und den Überstand zu trennen. Der Überstand (11,6 l) wurde mit destilliertem Wasser verdünnt, um eine elektrische Leitfähigkeit zu erhalten, die einer NaCl-Konzentration von etwa 50 mM entspricht (66,05 l). Dann wurde der pH der Lösung mit Essigsäure auf 4,5 eingestellt.

Die vorgenannte verdünnte Lösung wurde in eine mit einer 20 mM Acetatpufferlösung äquilibrierten (pH 4,5) Fließbettsäule Streamline SP C-50 (Innendurchmesser 50 mm × 100 cm, Gelmenge 300 ml; hergestellt von Amasham Pharmacia Co.) vom Säulenboden aufwärts (lineare Geschwindigkeit: 300 cm/Stunde) eingeleitet. Nach Beendigung der Einleitung wurde die Säule mit aufwärts eingeleiteter Äquilibrierpufferlösung gereinigt. Dann wurde die Richtung der Flüssigkeitseinleitung umgekehrt und eine Elutionspufferlösung [500 mM NaCl, 5 Glycerol, 20 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,5)] wurde vom Säulenkopf abwärts eingeleitet (lineare Geschwindigkeit: 150 cm/Stunde), um eine Elutionsfraktion (Streamline-Elutionsfraktion: 300 ml) zu erhalten. Der Nachweis der Elutionsfraktion erfolgte durch Messen der Lichtabsorption bei 280 nm.

In der Streamline-Elutionsfraktion wurde eine auf –20 °C abgekühlte Ammoniumsulfatlösung auf eine Konzentration von 2 M gelöst. Die Lösung wurde in eine TSKgel-Phenyl-5PW-Säule (Innendurchmesser 21,5 mm × 15 cm; hergestellt von Tosoh Corp.) eingeleitet, die mit 2 M Ammoniumsulfatlösung und 20 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,5) äqulibriert worden war (Flussgeschwindigkeit: 5 ml/min). Nach der Einleitung wurde die Äquilibrierpufferlösung eingeleitet, um Proteine zu eluieren, die eine schwache hydrophobe Wechselwirkung mit der Adsorptionsgruppe zeigen. Dann wurde die Ammoniumsulfat-Konzentration in der Elutionspufferlösung schrittweise verringert, und die Fraktion, die mit einer Ammoniumsulfat-Konzentration von 0,4 M eluiert worden war, wurde als Elutionsfraktion (Phenyl-5PW-Elutionsfraktion, 67 ml) des Fusionsproteins gewonnen. Der Nachweis des Fusionsproteins erfolgte durch die Vermehrungsaktivität der BAF130-Zellen als Index, wie im Beispiel 5 angegeben.

Die Phenyl-5PW-Elutionsfraktion wurde durch Dialyse mit einer 20 mM Acetatpufferlösung (pH 4,5), die 5 % Glycerol enthielt, entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde in eine mit der gleichen Pufferlösung äqulibrierte TSKgel-SP-5PW-Säule (Innendurchmesser 7,5 mm × 7,5 cm; hergestellt von Tosoh Corp.) eingeleitet (Flussgeschwindigkeit: 2 ml/min). Nach der Einleitung wurde die Äquilibrierpufferlösung fließen gelassen, um Proteine zu eluieren, die eine geringere Wechselwirkung mit der Adsorptionsgruppe hatten. Dann wurde eine 20 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,5), die 500 mM NaCl enthielt, fließen gelassen (1 ml/min), um eine Fraktion zu erhalten, die das Fusionsprotein in einer hohen Konzentration enthält (SP-5PW-Elutionsfraktion, 10 ml). Der Nachweis des Fusionsproteins erfolgte durch Absorptionsmessung bei 280 nm.

Die SP-5PW-Elutionsfraktion wurde portionsweise (5 ml pro Minute) in eine TSKgel-G3000SW-Säule (Innendurchmesser 21,5 mm × 30 cm) gegeben, die mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung, die 100 mM NaCl (pH 6,5) enthielt, äqulibriert worden war. Auf diese Weise wurde das Fusionsprotein gewonnen, das dann durch Messen der Absorption bei 280 nm nachgewiesen wurde.

Beispiel 8: Messung der Aktivität des Fusionsproteins

In dem nachstehenden Versuch wurde das Fusionsprotein 333 A&Dgr;A verwendet, das im Beispiel 5 beschrieben wird und nach dem im Beispiel 7 beschriebenen Verfahren gereinigt wird (nachstehend als FP6 bezeichnet).

Die biologische Aktivität von FP6 wurde bei verschiedenen Konzentrationen (0,625 bis 40 ng/ml) nach dem im Beispiel 5 beschriebenen Messverfahren für die biologische Aktivität unter Verwendung von BAF130-Zellen gemessen. 9 zeigt die Konzentrationsabhängigkeit von FP6 deutlich.

In dem Diagramm ist nicht dargestellt, dass die Konzentrationsabhängigkeitskurve des FP6, das durch Verdünnen der 1-&mgr;g/ml-FP6-Lösung auf verschiedene Konzentrationen (1- bis 1024-fache Verdünnung) gewonnen wurde, mit der Konzentrationsabhängigkeitskurve des IL-6, das durch Verdünnen der 5-&mgr;g/ml-Lösung auf verschiedene Konzentrationen (1- bis 1024-fache Verdünnung) gewonnen wurde, nahezu übereinstimmt. Wie im Beispiel 5 gezeigt, ist die Aktivität des Kultur-Überstands, die die gleiche Konzentrationsabhängigkeitskurve wie die verdünnte IL-6-Lösung bei verschiedenen Konzentrationen zusammen mit 100 ng/ml löslicher IL-6R ergibt, als eine Einheit/ml definiert. Daher wurde nachgewiesen, dass 1 &mgr;g FP6 5 Einheiten entspricht.

Beispiel 9: Analyse der Aminosäuresequenz des Fusionsproteins

In dem nachstehenden Versuch wurde das Fusionsprotein 333A&Dgr;A verwendet, das im Beispiel 5 beschrieben worden ist und nach dem im Beispiel 7 beschriebenen Verfahren gereinigt worden ist (nachstehend als FP6 bezeichnet).

FP6 wurde mittels Umkehrphasenchromatographie mit einer Phenyl-5PW-RP-Säule weiter gereinigt. Die Elution wurde mit einem Gradienten von einer wässrigen Lösung mit 20 Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure bis zu einer Lösung mit 60 % Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure durchgeführt. Die erhaltene Fraktion wurde unter reduziertem Druck getrocknet. Der Feststoff wurde in einer wässrigen Lösung mit 20 % Acetonitril und 0,1 Trifluoressigsäure wiederaufgelöst und wurde mit dem Protein-Sequenzierungsautomaten 477A (hergestellt von Applied Biosystem Co.) analysiert.

Dadurch wurden Leucin, Alanin, Prolin und Arginin in der genannten Reihenfolge vom N-Terminal aus nachgewiesen, was mit der von dem Gen codierten N-Terminal-Sequenz übereinstimmt.

Beispiel 10: Messung der relativen Molekülmasse des Zuckerkettenteils des Fusionsproteins

In dem nachstehenden Versuch wurde das Fusionsprotein 333A&Dgr;A verwendet, das im Beispiel 5 beschrieben worden ist und nach dem im Beispiel 7 beschriebenen Verfahren gereinigt worden ist (nachstehend als FP6 bezeichnet).

Eine 150-&mgr;l-Menge einer Lösung mit 0,1 % SDS und 100 mM Natriumchlorid in einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH 6,0), die 0,1 ng/ml FP6 enthielt, wurde fünf Minuten gekocht und anschließend mit Wasser abgekühlt. Eine Menge von 10 &mgr;l der Lösung wurde mit einer Menge von 1 &mgr;l Endoglycosidase H mit 1 Einheit/ml (hergestellt von Sigma Co.) gemischt. Die so hergestellten Gemische wurden 30 Sekunden bis 3 Stunden bei 25 °C reagieren gelassen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10 &mgr;l 500 mM Glycin-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 2,5) abgebrochen. Gesondert wurde eine Vergleichsprobe der Endoglycosidase H mit einer Reaktionszeit von 0 Minuten hergestellt, indem nacheinander 10 &mgr;l einer 500 mM Glycin-Chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 2,5), 10 &mgr;l vorher abgekühlte FP6-Lösung und 1 &mgr;l Endoglycosidase H gemischt wurden.

In die Lösung, in der die Reaktion abgebrochen worden war, wurden 3 &mgr;l Lösung mit 72 Glycerol und 10 % 2-Mercaptoethanol, das mit Bromphenolblau gefärbt worden war, gegeben. Diese Lösung wurde einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurde das Protein in dem Gel durch Färben mit Coomassie Brilliant Blue R250 nachgewiesen.

Wie aus 10 klar ersichtlich ist, wurde das FP6, das nicht mit der Endoglycosidase H reagiert hatte, als eine Bindung an Position 76 bis 93 kDa nachgewiesen. Das bedeutet, dass die relative Molekülmasse einen Uneinheitlichkeitsbereich von 17 kDa hatte. Das FP6, das vollständig von der Endoglycosidase H digeriert worden war, wurde an Position 57 kDa nachgewiesen. In 9 ist nicht dargestellt, dass das FP6, das mit SDS denaturiert worden war und mit einer zehnfachen Menge Triton X-100 und N-Glycosidase 18 Stunden reagieren gelassen worden war, an Position 57 kDa nachgewiesen wurde. Das zeigt, dass die relative Molekülmasse der Zuckerkette, die durch die N-Glycosid-Bindung des FP6 verbunden ist, von 19 bis 36 kDa reicht.

Beispiel 11: Einfluss des Fusionsproteins auf die Vermehrung von Stammzellen

In dem nachstehenden Versuch wurde das Fusionsprotein 333A&Dgr;A verwendet, das im Beispiel 5 beschrieben worden ist und nach dem im Beispiel 7 beschriebenen Verfahren gereinigt worden ist (nachstehend als FP6 bezeichnet).

CD34-positive Zellen wurden nach dem in der japanischen Patentanmeldung Nr. 9–325847 beschriebenen Verfahren aus 20 ml humanem Nabelschnurblut isoliert und gereinigt. Die erhaltenen 500 Zellen wurden mit einer Lösung mit 1,2 % Methylcellulose (Shin-Etsu Kagaku K. K.), 30 % bovines Serumalbumin (Hyclone Laboratories Inc.), 1 % bovines Serumalbumin (nachstehend mit BSA bezeichnet; Sigma Co.), 0,05 mM 2-Mercaptoethanol (Sigma Co.) und SCF (Stammzellenfaktor, 100 ng/ml) unter den Bedingungen (1) Kombination aus IL-6 (100 ng/ml) und IL-6R (100 ng/ml), (2) Kombination aus IL-6 (100 ng/ml) und IL-6R (200 ng/ml), (3) FP6 (300 ng/ml) und (4) FP6 (600 ng/ml) mit Dispensation von 1-ml-Fraktionen von &agr;-MEM (Flow Co.) auf einer 35-mm-Kunststoff-Kulturplatte zur Suspensionskultivierung (Nunc Co.) bei 37 °C mit 5 % CO2 und einer Feuchte von 100 % kultiviert.

Nach zwei Wochen wurden die Kolonien durch Beobachtung mit einem umgekehrten Mikroskop identifiziert. 11 zeigt die Ergebnisse. Die Kolonien wurden in sechs Arten eingeteilt: Granulozytenkolonie (G), Makrophagenkolonie (M), Granulozyten/Makrophagen-Mischkolonie (GM), Blastenkolonie (Blast), Granulozyten/Makrophagen/Erythroblasten-Mischkolonie (Mix) und Erythroblastenkolonie (BFU-E).

Wie aus 11 hervorgeht, war die Koloniebildungsaktivität unter den bekannten Bedingungen (1) und (2) fast genau so hoch wie die berichtete Koloniebildungsaktivität (Sui et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, S. 2589, 1995). Unter Bedingung (3) (FP6 300 ng/ml) war die Koloniebildungsaktivität jedoch viel höher als die der Kombination aus IL-6 (100 ng/ml) und IL-6R (200 ng/ml) bei der gleichen Konzentration. In dem Diagramm ist nicht dargestellt, dass die Größe der unter Bedingung (3) oder (4) gebildeten Kolonie wesentlich größer als die unter der bekannten Bedingung (1) oder (2) war. Das zeigt, dass das Fusionsprotein eine stärkere ex-vivo-Vermehrungswirkung für blutbildende Stammzellen als die bekannte Kombination aus IL-6 und IL-6R hat.

Beispiel 12: Thrombozytenvermehrungswirkung des Fusionsproteins bei der Maus

In dem nachstehenden Versuch wurde das Fusionsprotein 333A&Dgr;A verwendet, das im Beispiel 5 beschrieben worden ist und nach dem im Beispiel 7 beschriebenen Verfahren gereinigt worden ist (nachstehend als FP6 bezeichnet).

Es wurden fünf Gruppen mit jeweils fünf C57BL6-Mäusen (männlich, 8 Wochen alt) verwendet. Die erste Mäusegruppe, die kein FP6 erhielt (Kontrollgruppe), erhielt 300 &mgr;l PBS und 1 % bovines Serumalbumin (BSA); die zweite Mäusegruppe erhielt 300 &mgr;l PBS, das 0,5 &mgr;g FP6 enthielt, und 1 % bovines Serumalbumin (BSA); die dritte Mäusegruppe erhielt 300 &mgr;l PBS, das 1 &mgr;g FP6 enthielt, und 1 % bovines Serumalbumin (BSA); die vierte Mäusegruppe erhielt 300 &mgr;l PBS, das 2 &mgr;g FP6 enthielt, und 1 % bovines Serumalbumin (BSA); und die fünfte Mäusegruppe erhielt 300 &mgr;l PBS, das 5 &mgr;g FP6 enthielt, und 1 % bovines Serumalbumin (BSA). Die Dosis wurde fünf Tage alle zwölf Stunden, also zweimal täglich, intraperitoneal an jede Maus verabreicht. Am sechsten Tag wurden die Mäuse aus der absteigenden Vene ausgeblutet. Die Anzahl der Thrombozyten wurde mit einem Hämozytometer CC-180A (hergestellt von Toa Iyou Densi K. K.) bestimmt.

Wie aus 12 hervorgeht, zeigten die Gruppen, die 1 &mgr;g oder mehr FP6 erhielten (dritte bis fünfte Gruppe), eine signifikantere Vermehrung von Thrombozyten als die Gruppe, die kein FP6 erhielt (erste Gruppe). Es wird jedoch berichtet, dass eine Dosis von 0,5 &mgr;g IL-6 (relative Molekülmasse: etwa 21 kDa), das die doppelte Anzahl von Molekülen wie 1 &mgr;g FP6 (relative Molekülmasse: etwa 84 kDa) hat, unter den gleichen Bedingungen keine signifikante Vermehrung von Thrombozyten bewirkte (Ishibashi et al.: Blood, 74, S. 1241, 1989). Das bedeutet, dass das Fusionsprotein eine größere in-vivo-Thrombozytenvermehrungswirkung als IL-6 hat.

Beispiel 13: Thrombozytenwiederherstellungswirkung des Fusionsproteins bei Mäusen, die 5FU erhielten

In dem nachstehenden Versuch wurde das Fusionsprotein 333A&Dgr;A verwendet, das im Beispiel 5 beschrieben worden ist und nach dem im Beispiel 7 beschriebenen Verfahren gereinigt worden ist (nachstehend als FP6 bezeichnet).

Es wurden zwei Gruppen mit jeweils 15 C57BL6-Mäusen (männlich, 8 Wochen alt) verwendet. Die erste Mäusegruppe, die kein FP6 erhielt (Kontrollgruppe), erhielt 300 &mgr;l PBS und 1 % bovines Serumalbumin (BSA); und die zweite Mäusegruppe erhielt 300 &mgr;l PBS, das 5 &mgr;g FP6 enthielt, und 1 % bovines Serumalbumin (BSA). Allen Mäusen wurde 5FU in einer Menge von 150 mg/kg in die Schwanzvene verabreicht. Das Arzneimittel wurde fünf Tage vom zweiten bis zum sechsten Tag alle zwölf Stunden, also zweimal täglich, intraperitoneal an jede Maus verabreicht. Vom siebenten bis zum neunten Tag wurden täglich fünf Mäuse aus der absteigenden Arterie ausgeblutet. Die Anzahl der Thrombozyten wurde mit einem Hämozytometer CC-180A (hergestellt von Toa Iyou Densi K. K.) bestimmt.

Aus 13 geht klar hervor, dass die Gruppe, die FP6 erhielt (zweite Gruppe), eine signifikantere Thrombozytenwiederherstellung am achten und neunten Tag als die Gruppe zeigte, die kein FP6 erhielt (erste Gruppe). Das bedeutet, dass das Fusionsprotein die Wirkung hat, die Thrombozytenproduktionsfunktion, die durch Gabe von 5FU verringert worden ist, in vivo wiederherzustellen.

Beispiel 14: Expression eines Fusionsproteins mit unzureichender Immunglobulin-ähnlicher Domäne

Ein Expressionsplasmid zur Codierung für ein IL-6-Derivat 112VL (233 Aminosäurereste vom N-terminalen Valinrest an Position 112 bis zum N-terminalen Leucinrest an Position 344) und ein weiteres Expressionsplasmid zur Codierung für ein IL-6-Derivat 116EL (229 Aminosäurereste vom N-terminalen Glutaminsäurerest an Position 116 bis zum N-terminalen Leucinrest an Position 344) waren wie nachstehend aufgebaut.

Ein IL-6R-Gen (cDNA) wurde mit einem Primer p6RAB112V (Sequenz Nr. 51) und einem Primer p344F (Sequenz Nr. 52) amplifiziert und mit XhoI und Xbal geteilt. Das geteilte Produkt wurde in pPIC9 inseriert, das zuvor mit XhoI und Avr II geteilt worden war, um pPIC9-112VL zu erhalten.

Ein IL-6R-Gen (cDNA) wurde mit einem Primer p6RAB116E (Sequenz Nr. 53) und einem Primer p344F (Sequenz Nr. 54) amplifiziert und mit XhoI und Xbal geteilt. Das geteilte Produkt wurde in pPIC9 inseriert, das zuvor mit XhoI und Avr II geteilt worden war, um pPIC9-116EL zu erhalten.

Ein Expressionsplasmid pPIC9-112VAA zur Codierung für ein Fusionsprotein mit unzureichender Immunglobulin-ähnlicher Domäne (ein Fusionsprotein mit einem Valinrest an Position 112 des IL-6R als N-Terminal, wobei der N-terminale Alaninrest an Position 333 des IL-6R und der N-terminale Alaninrest an Position 28 des IL-6 direkt ohne einen Linker verbunden sind) und ein Expressionsplasmid pPIC9-116EEA zur Codierung für das Fusionsprotein 116EAA (ein Fusionsprotein mit einem Glutaminsäurerest an Position 116 des IL-6R als N-Terminal, wobei der N-terminate Alaninrest an Position 333 des IL-6R und der N-terminate Alaninrest an Position 28 des IL-6 direkt ohne einen Linker verbunden sind) waren wie nachstehend aufgebaut.

Ein Fragment, das durch Teilen von pPIC9-112VL mit XhoI und PmaCl erhalten worden war, wurde in ein 333A&Dgr;A-Expressionsplasmid pPIC9-333A&Dgr;A, das vorher mit XhoI und PmaCl geteilt worden war, inseriert, um pPIC9-112VAA zu erhalten.

Ein Fragment, das durch Teilen von pPIC9-116EL mit XhoI und PmaCl erhalten worden war, wurde in ein 333A&Dgr;A-Expressionsplasmid pPIC9-333A&Dgr;A, das vorher mit XhoI und PmaCl geteilt worden war, inseriert, um pPIC9-116EAA zu erhalten.

Transformanten wurden mit den vorgenannten pPIC9-112VAA und pPIC9-116EAA nach dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren hergestellt. Dadurch wurden der 9-muts-Stamm zum Exprimieren von 112VAA und der 11-muts-Stamm zum Exprimieren von 116EAA etabliert. Diese wurden nach dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren kultiviert, und die biologische Aktivität des flüssigen Überstands wurde nach dem im Beispiel 5 beschriebenen Verfahren gemessen.

Die Fusionsproteine 112VAA und 116EAA mit unzureichender Immunglobulin-ähnlicher Domäne hatten eine Aktivität, die fast gleich der Aktivität des Fusionsproteins 333A&Dgr;A mit der Immunglobulin-ähnlichen Domäne war, wie in 14 klar zu erkennen ist.

Beispiel 15: Bestimmung der Protease-Trennstelle

In 1,9 ml Streamline-Elutionsfraktion, die im Beispiel 7 gewonnen worden war, wurden 0,1 ml Lösung mit 2 % SDS, 64 % Glycerol und 0,25 % Bromphenolblau gegeben. Das Gemisch wurde gekocht, anschließend einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen und in einer Pufferlösung (pH 11) mit 10 % Methanol und 10 mM CAPS auf eine Polyvinylidendifluorid(PVDF)-Folie elektrisch geblottet. Die Blots wurden durch Färben mit Coomassie Brilliant Blue G-250 nachgewiesen. Die nachgewiesenen Proteinteile wurden geteilt und einzeln zurückgewonnen und wurden dann mit dem Protein-Sequenzierungsautomaten 477A (hergestellt von Applied Biosystem Co.) geprüft. Es wurde festgestellt, dass das Protein mit einer relativen Molekülmasse von 18 kD ein Teil des Fusionsproteins mit einem Asparaginsäurerest/Valinrest/Alaninrest/Alaninrest/Prolinrest/Histidinrest ist, das durch Teilen der Peptidbindung mittels einer Protease des Pichia-Hefepilzes zwischen dem N-terminalen Lysinrest an Position 37 und dem N-terminalen Asparaginsäurerest an Position 38 des IL-6 entstanden ist.

Beispiel 16: Expression des Protease-beständigen Fusionsproteins (1)

Von dem im Beispiel 1 erhaltenen Plasmid pBS6R6L wurde das IL-6-Gen (cDNA) unter Verwendung eines Primers pKN6B38D (Sequenz Nr. 55) und eines Primers plL6F2 (Sequenz Nr. 56) amplifiziert und mit NruI und NotI geteilt. Dies wurde in pBS6R6L, das vorher mit Eco47IIII und NotI geteilt worden war, inseriert, um ein Plasmid pBS6R6L-38D zu erhalten.

Das Plasmid pBS6R6L-38D wurde mit XhoI und NotI geteilt, um ein Gen zur Codierung für das IL-6R/IL-6-Fusionsprotein zu erhalten, und dies wurde in pPIC9, das vorher mit XhoI und NotI geteilt worden war, inseriert, um ein Expressionsplasmid pPIC9-20LAD zur Codierung für ein Protease-beständiges Fusionsprotein 20LAD zu erhalten.

Das IL-6R-Gen wurde unter Verwendung eines Primers p6RAB112V (Sequenz Nr. 57) und eines Primers p344F (Sequenz Nr. 58) amplifiziert und mit XhoI und Xbal geteilt. Dies wurde in pPIC9, das vorher mit XhoI und AvrII geteilt worden war, inseriert, um ein Plasmid pPIC9-112VL zu erhalten. Das Plasmid pPIC9-112VL wurde mit XhoI und PmaCl geteilt. Die erhaltene Fraktion wurde in pPIC9-20LAA, das vorher mit XhoI und PmaCl geteilt worden war, inseriert. Dadurch wurde ein Expressionsplasmid pPIC9-112VAA erhalten, das für das Fusionsprotein 112VAA mit unzureichender Immunglobulin-ähnlicher Domäne (Fusionsprotein, das den N-terminalen Valinrest an Position 112 des IL-6R als N-Terminal hat und das direkt zwischen dem N-terminalen Alaninrest an Position 333 des IL-6R und dem N-terminalen Alaninrest an Position 28 des IL-6 ohne Zwischenschaltung eines Linkers verbunden ist) codiert.

Getrennt wurde das IL-6R-Gen unter Verwendung eines Primers p6RAB116E (Sequenz Nr. 59) und eines Primers p344F (Sequenz Nr. 58) amplifiziert und mit XhoI und Xbal geteilt. Dies wurde in pPIC9, das vorher mit XhoI und AvrII geteilt worden war, inseriert, um ein Plasmid pPIC9-116EL zu erhalten. Das Plasmid pPIC9-116EL wurde mit XhoI und PmaCl geteilt. Die erhaltene Fraktion wurde in pPIC9-20LAA, das vorher mit XhoI und PmaCl geteilt worden war, inseriert. Dadurch wurde ein Expressionsplasmid pPIC9-116EAA erhalten, das für das Fusionsprotein 116EAA mit unzureichender Immunglobulin-ähnlicher Domäne (Fusionsprotein, das den N-terminalen Glutaminsäurerest an Position 116 des IL-6R als N-Terminal hat und das direkt zwischen dem N-terminalen Alaninrest an Position 333 des IL-6R und dem N-terminalen Alaninrest an Position 28 des IL-6 ohne Zwischenschaltung eines Linkers verbunden ist) codiert.

Das pPIC9-20LAD wurde mit XhoI und PmaCl geteilt, um ein Gen zur Codierung für IL-6R zu erhalten. Dies wurde in pPIC9, das vorher mit XhoI und PmaCl geteilt worden war, inseriert, um ein Protease-beständiges Fusionsprotein 112VAD (Fusionsprotein, das den N-terminalen Valinrest an Position 112 des IL-6R als N-Terminal hat und das direkt zwischen dem N-terminalen Alaninrest an Position 333 des IL-6R und dem N-terminalen Asparaginsäurerest an Position 38 des IL-6 ohne Zwischenschaltung eines Linkers verbunden ist) zu erhalten. Getrennt wurde das vorgenannte geteilte pPIC9-20LAD in pPIC9-116EAA, das vorher mit XhoI und PmaCl geteilt worden war, inseriert, um ein Protease-beständiges Fusionsprotein 116EAD (Fusionsprotein, das den N-terminalen Glutaminsäurerest an Position 116 des IL-6R als N-Terminal hat und das direkt zwischen dem N-terminalen Alaninrest an Position 333 des IL-6R und dem N-terminalen Asparaginsäurerest an Position 38 des IL-6 ohne Zwischenschaltung eines Linkers verbunden ist) zu erhalten.

Beispiel 17: Expression des Protease-beständigen Fusionsproteins (2)

Die im Beispiel 16 beschriebenen fünf Expressionsplasmide (pPIC9-20LAD, pPIC9-112VAA, pPIC9-116EAA, pPIC9-112VAD und pPIC9-116EAD) wurden nach dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren einzeln in den Pichia-Hefepilz eingebracht. Dadurch wurden 10 mit pPIC9-20LAD transformierte muts-Stämme, 7 mit pPIC9-112VAA transformierte muts-Stämme, 10 mit pPIC9-116EAA transformierte muts-Stämme, 1 mit pPIC9-112VAD transformierter muts-Stamm und 6 mit pPIC9-116EAD transformierte muts-Stämme erhalten. Diese Stämme wurden nach dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren kultiviert, und die Überstände wurden gesammelt. Ihre biologische Aktivität wurde nach dem im Beispiel 5 beschriebenen Verfahren gemessen. Es wurde festgestellt, dass von den 10 mit pPIC9-20LAD transformierten muts-Stämmen 10 biologisch aktiv waren, von den 7 mit pPIC9-112VAA transformierten muts-Stämmen 7 biologisch aktiv waren, von den 10 mit pPIC9-116EAA transformierten muts-Stämmen 7 biologisch aktiv waren, von dem 1 mit pPIC9-112VAD transformierten muts-Stamm 1 biologisch aktiv war, und von den 6 mit pPIC9-116EAD transformierten muts-Stämmen 6 biologisch aktiv waren. Das bedeutet, dass die Deletion der Sequenz vom N-terminalen Alaninrest an Position 28 bis zum N-terminalen Lysinrest an Position 37 des IL-6 die biologische Aktivität nicht beeinflusst.

Beispiel 18: Beurteilung der Protease-Beständigkeit

Die im Beispiel 3 beschriebenen Transformantenstämme, die jeweils 333A&Dgr;A exprimieren (nachstehend mit „20LAA" bezeichnet), sowie das Protease-beständige Fusionsprotein 20LAD, das Fusionsprotein 112VAA, das erfindungsgemäße Proteasebeständige Fusionsprotein 112VAD, das Fusionsprotein 16EAA und das Protease-beständige Fusionsprotein 116EAD, die im Beispiel 17 aufgeführt sind, wurden nach dem nachstehenden Verfahren kultiviert. Die Kultivierung erfolgte in Reagenzgläsern mit jeweils 3 ml BMGY-Kulturmedium [1 % (Masse/Volumen Hefe-Extrakt, 2 % (Masse/Volumen) Pepton, 1,34 % (Masse/Volumen) YNB wo AA, 0,00004 % (Masse/Volumen) Biotin, 100 mM Kaliumphosphat (pH 6,0) und 1 % (Masse/Volumen) Glycerol] bei 30 °C über 48 Stunden. Die Kultur wurde zentrifugiert, um die Biomasse zu erhalten. Die Biomasse-Pellets wurden in 2 ml BMMY-Kulturmedium [1 % (Masse/Volumen Hefe-Extrakt, 2 % (Masse/Volumen) Pepton, 1,34 (Masse/Volumen) YNB wo AA, 0,00004 % (Masse/Volumen) Biotin, 100 mM Kaliumphosphat (pH 6,0) und 0,5 % (Masse/Volumen) Methanol] suspendiert und 24 Stunden bei 30 °C kultiviert. Bei der 24-stündigigen Kultivierung wurde von jeder flüssigen Kultur eine Probe genommen. Die Probe wurde zentrifugiert, um den Kultur-Überstand zurückzugewinnen, und der Überstand wurde einer SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen. Nach der Elektrophorese wurden die Proteine in dem Gel auf eine PVDF-Folie übertragen und durch Western-Blotting mit polyclonalen Kaninchen-IL-6-Antikörpern (hergestellt von Dienzyme Co.) geprüft. 15 zeigt die Ergebnisse.

Wie aus 15 hervorgeht, wurde das Band für die relative Molekülmasse 18 kD, das vermutlich durch Spaltung am C-Terminal des N-terminalen Lysinrests an Position 37 des IL-6-Bereichs entstanden ist, für 20LAA, 116EAA und 112VAA eindeutig nachgewiesen, während das Band für die erfindungsgemäßen Protease-beständigen Fusionsproteine 20LAD, 116EAD und 112VAD nicht oder kaum nachgewiesen wurde. Das heißt, dass die Modifikation durch Deletion der Sequenz aus 10 Aminosäuren vom Alaninrest an Position 28 bis zum Lysinrest an Position 37 die Protease-Beständigkeit bewirkte.

Anwendungsmöglichkeiten in der Industrie

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene IL-6RlIL-6-Fusionsprotein, das keine Linker-Sequenz hat, ist dahingehend vielversprechend, dass es die medizinische Wirksamkeit erhöht und die Antigenität wesentlich verringert. Daher ist dieses Fusionsprotein als neues Arzneimittel auf dem Gebiet der Blutbildung von Bedeutung, und es wird erwartet, dass es eine Rolle bei der Entwicklung eines ex-vivo-Verstärkers für blutbildende Stammzellen und eines Mittels zur Vermehrung von Thrombozyten spielt.

Das Fusionsprotein, das gegen die von den Wirtszellen abgesonderte Protease beständig gemacht ist, kann problemlos effizienter in Massen produziert werden, da unter anderem die Fusionsproteinmenge in einem Produktionsprozess durch Übertragung genetischer Informationen von Wirtszellen nicht durch die Protease geteilt wird. Die endgültige Produktionsausbeute kann erhöht werden, da das Fusionsprotein nicht in einem Reinigungsprozess in Gegenwart der Protease gespalten wird. Der Reinigungsprozess kann vereinfacht werden, da die Inaktivierung der Protease vor der Reinigung zweckmäßigerweise weggelassen werden kann. Außerdem kann das gereinigte Produkt in höherem Maße gleichbleibend sein, da es nicht zu einer Verunreinigung des gereinigten Endprodukts durch abgespaltene Moleküle kommt.

Außer den vorgenannten Wirkungen ist zu erwarten, dass die Protease-beständige Substanz ihre biologische Aktivität auch in einer Umgebung behält, in der Protease vorkommen kann.

SEQUENZLISTE

Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Herstellung eines IL-6 Rezeptor·IL-6 Fusionsproteins, indem man das IL-6 Rezeptor·IL-6 Fusionsprotein dadurch gewinnt, dass man eine Lösung, die IL-6 Rezeptor·IL-6 Fusionsprotein enthält, in der ein Aminosäurerest des IL-6 Rezeptors und ein Aminosäurerest von IL-6 direkt verbunden sind, durch drei Arten von Chromatographie behandelt, einschliesslich Ionen-Austausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie und Gel-Filtrations-Chromatographie, um das IL-6 Rezeptor·IL-6 Fusionsprotein zu gewinnen.
  2. Verfahren zur Herstellung eines IL-6 Rezeptor·IL-6 Fusionsproteins nach Anspruch 1, in welchem C-terminal zu einem beliebigen von 39 Aminosäureresten aus dem Bereich N-terminaler Alanin-Rest an Position 323 bis zum N-terminalen Serin Rest an Position 361 des IL-6 Rezeptors eine Verbindung zu einem N-terminalen Aminosäurerest von IL-6 besteht ist.
Es folgen 13 Blatt Zeichnungen






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