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Dokumentenidentifikation DE69927013T2 29.06.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001073721
Titel EFFIZIENTE REINIGUNG VON ADENOVIRUS
Anmelder GenVec, Inc., Gaithersburg, Md., US
Erfinder CARRION, E., Miguel, New Market, US;
MENGER, Marilyn, Derwood, US;
KOVESDI, Imre, Rockville, US
Vertreter HOEGER, STELLRECHT & PARTNER Patentanwälte, 70182 Stuttgart
DE-Aktenzeichen 69927013
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 22.04.1999
EP-Aktenzeichen 999187883
WO-Anmeldetag 22.04.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/08843
WO-Veröffentlichungsnummer 0099054441
WO-Veröffentlichungsdatum 28.10.1999
EP-Offenlegungsdatum 07.02.2001
EP date of grant 31.08.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 29.06.2006
IPC-Hauptklasse C12N 7/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse G01N 33/569(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
TECHNISCHER BEREICH DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die effiziente Reinigung von Adenovirus.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Traditionell sind adenovirale Partikel bisher durch die Verwendung von Dichtegradienten-Reinigungsprotokollen isoliert worden, so etwa durch die Verwendung von Cäsiumchlorid-(CsCl-)Gradienten. Obschon für Zubereitungen im kleinen Maßstab geeignet, ist die Dichtegradientenreinigung mühsam und zeitaufwändig und lässt sich nicht leicht upscalen. Der Prozess wird daher häufig als kommerziell unerwünscht angesehen.

Eine alternative Methode zur Reinigung von Adenovirus ist die Verwendung von Säulen- oder Batch-Chromatographie. Frühe Versuche, Viruspartikel durch chromatographische Techniken unter Verwendung von Diethylaminoethyl-(DEAE-)-Chromatographieharzen zu isolieren, wurden zum ersten Mal in den Jahren von 1959 bis 1961 berichtet. Haruna et al. (Virology 13: 264–267 (1961)) berichteten die Verwendung von DEAE-Ionenaustauschchromatographie für die Reinigung von Adenoviren vom Typ 1, 3 und 8, während Klemperer & Pereira (Virology 9: 536–545 (1959)) und Philipson (Virology 10: 459–465 (1960)) Schwierigkeiten bei der Verwendung derselben Methode mit anderen Adenovirustypen berichteten. In den Jahren nach etwa 1965 wurden diese Techniken nicht breit angewandt, höchstwahrscheinlich als eine Folge der Neigung der chromatographischen Matrix, während des Gebrauchs zu kollabieren. Ferner machte die Selektivität der Chromatographieharze, die zu der Zeit zur Verfügung standen, die chromatographische Reinigung von Viren den Dichtegradienten-Reinigungstechniken unterlegen. Bigwood et al. (EP 0213719) lehren Chromatographieharze, welche mit Polyaminen funktionalisiert sind, die 2–4 Amingruppen enthalten, welche durch 2–4 Methylengruppen voneinander getrennt sind. Bigwood et al. lehren jedoch nicht die Verwendung derartiger Harze zur Reinigung von Viren oder anderem biologischem Material.

Jüngst ist das Interesse an der Reinigung von Viren mittels Chromatographie wieder neu erwacht. So offenbaren z.B. Guillaume et al. (WO 98/00524), Shabram et al. (Human Gene Therapy 8: 453–65 (1997)), Shabram et al. (WO 96/27677) und Huyghe et al. (Human Gene Therapy 6: 1403–1416 (1995)) Verfahren zur Verwendung von Chromatographieharzen zur Reinigung von Viren. Ferner sind in den letzten eineinhalb Jahrzehnten neuere Packungsmaterialien für die Chromatographie entwickelt worden. Diese Packungsmaterialien lassen sich in vier Gruppen einteilen: (i) homogene vernetzte Polysaccharide, die weiche Gele (z.B. Agarose) mit guter Kapazität, aber schlechter Auflösung und Kompressionsneigung umfassen; (ii) makroporöse Polymere auf Basis von synthetischen Polymeren, die Perfusionschromatographieharze mit großen "Durchgangsporen" umfassen, welche eine bessere Diffusivität erlauben und zu einer verbesserten Säuleneffizienz, Geschwindigkeit und Auflösung führen; (iii) "tentakuläre" Sorbenzien, welche Tentakel aufweisen, die für schnellere Interaktionen mit Proteinen ausgebildet waren (z.B. Fractogel); und (iv) Materialien auf der Basis eines weichen Gels in einer steifen Hülle, welche die hohe Kapazität von weichen Gelen und die Steifigkeit von Composite-Materialien ausnutzen (z.B. Ceramic HyperDTMF) (siehe Boschetti, J. Chromatogr. 658: 207 (1994); Rodriguez, J. Chromatogr. 699: 47–61 (1997)).

Es ist wünschenswert, die Geschwindigkeit, die leichte Verwendbarkeit und die Effizienz der Reinigung, insbesondere der kommerziellen Reinigung im großen Maßstab, dieser Techniken nach dem Stand der Technik zu erhöhen. Die vorliegende Erfindung stellt ein derartiges Verfahren zur Reinigung von Adenovirus bereit. Diese und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung sowie weitere erfindungsgemäße Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Erfindung.

KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Anreicherung einer Lösung an einem Adenovirus. Das Verfahren umfasst: (i) Erhalten einer gemischten Lösung, die Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül umfasst; (ii) Aufbringen der gemischten Lösung auf ein Anionenaustausch-Chromatographieharz, das eine Bindungseinheit enthält, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminobutyl, Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl; und (iii) Eluieren des Adenovirus von dem Reinigungschromatographieharz mit einem Eluenten. Das Verfahren kann ferner umfassen: Aufbringen der gemischten Lösung, die Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül umfasst, auf ein Anionenaustausch-Vorharz vor dem Aufbringen des Adenovirus auf das Anionenaustausch-Chromatographieharz.

Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit zur genauen Quantifizierung der Anzahl an adenoviralen Partikeln in einer Adenovirus-Lösung, z.B. in einer aus einem rohen Lysat von mit Adenovirus infizierten Zellen erhaltenen Lösung, umfassend: (i) Aufbringen einer Probelösung von Adenovirus auf ein Anionenaustausch-Chromatographieharz, das eine Bindungseinheit enthält, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminobutyl, Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl, und Eluieren der Probelösung von demselben, (ii) Bestimmen der Absorption der von dem Chromatographieharz eluierten Probelösung von Adenovirus und der Absorption einer Standardlösung von Adenovirus, (iii) Vergleichen der Absorption der von dem Chromatographieharz eluierten Probelösung von Adenovirus mit der Absorption der Standardlösung von Adenovirus und Quantifizieren der Anzahl an adenoviralen Partikeln in der Probelösung.

Am besten verdeutlicht wird die Erfindung anhand der beigefügten zeichnerischen Darstellung und der folgenden Detailbeschreibung der bevorzugten Ausführungsformen.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

1 ist ein Chromatogramm eines Adenovirus-infizierten Zelllysats, eluiert von einem quartären Amin-Chromatographieharz (Q Ceramic HyperDTMF), worin die y-Achse die Absorption (260 und 280 nm) zeigt, die x-Achse die Elutionszeit (min) angibt und die parallele y-Achse (rechts) das Elutionsmittel in der Säule angibt, wie über die Leitfähigkeit gemessen (unterbrochene Linie; ms).

2 ist ein Chromatogramm eines Adenovirus-infizierten Zelllysats, geklärt durch Tangentialflussfiltration, behandelt mit einer DNase/RNase (Benzonase®) und eluiert von einem quartären Amin-Chromatographieharz (Q Ceramic HyperDTMF), worin die y-Achse die Absorption (260 und 280 nm) zeigt, die x-Achse die Elutionszeit (min) angibt und die parallele y-Achse (rechts) das Elutionsmittel in der Säule angibt, wie über die Leitfähigkeit gemessen (unterbrochene Linie; ms).

3 ist ein Chromatogramm eines Adenovirus-infizierten Zelllysats, eluiert von einem "expanded bed"-Adsorptions-Chromatographieharz (Streamline QXL®), worin die y-Achse die Absorption (260 & 280 nm) zeigt, die x-Achse die Elutionszeit (min) angibt und die parallele y-Achse (rechts) das Elutionsmittel in der Säule angibt, wie über die Leitfähigkeit (unterbrochene Linie) in Millisiemens (ms) gemessen.

4 ist ein Chromatogramm eines Adenovirus-infizierten Zelllysats, gereinigt durch Zentrifugation in einem dreistufigen CsCl-Gradienten und quantifiziert unter Verwendung einer Dimethylaminopropyl-Perfusions-(POROS® 5OD)-Analysensäule, worin die y-Achse die Absorption (260 & 280 nm) zeigt und die x-Achse die Elutionszeit (min) angibt.

5 ist ein Chromatogramm eines Adenovirus-infizierten Zelllysats, eluiert von einem "expanded bed"-Adsorptions-Chromatographieharz (Streamline QXL®) und zweimal von einem Dimethylaminopropyl-Perfusions-Chromatographieharz (POROS® 5OD), worin die y-Achse die Absorption (260 & 280 nm) zeigt und die x-Achse die Elutionszeit (min) angibt.

6 ist ein Chromatogramm eines Adenovirus-infizierten Zelllysats, eluiert von einem Dimethylaminopropyl-Perfusions-Chromatographieharz (POROS® 5OD), worin die y-Achse die Absorption (260 und 280 nm) zeigt und die x-Achse die Elutionszeit (min) angibt.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung einer Lösung, welche ein Adenovirus umfasst. Mit "Adenovirus" ist natürlich vorkommendes Adenovirus und rekombinantes Adenovirus gemeint, wobei das rekombinante Adenovirus infektiös oder nichtinfektiös sein kann. Das Verfahren umfasst das Erhalten einer gemischten Lösung, welche Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül umfasst. Mit "Biomolekül" ist ein beliebiges Makromolekül gemeint, z.B. ein beliebiges Protein, Kohlenhydrat, Lipid oder Nucleinsäure (z.B. DNA und RNA) und dergleichen, sowie Fragmente hiervon. Im Sinne des vorliegenden Textes soll "Lösung" die Bedeutung haben, die ihr normalerweise auf dem Fachgebiet zugeschrieben wird und soll auch ein Zelllysat umfassen. Eine beliebige Lösung, welche Adenovirus umfasst, kann in Einklang mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung angereichert werden. Eine gemischte Adenovirus-Lösung wird gewöhnlich erhalten durch Infizieren eukaryotischer Zellen mit einem Adenovirus wie hierin definiert, Aufrechterhaltung der Zellen für einen ausreichenden Zeitabschnitt, um die Zahl adenoviraler Partikel zu amplifizieren, Sammeln der infizierten Zellen und Lysieren (Aufbrechen) derselben in einer gepufferten Lösung.

"Anreichern" und "Reinigen" sowie "angereichert" und "gereinigt" werden im vorliegenden Text austauschbar verwendet, um anzuzeigen, dass die Adenovirus-Konzentration in einem gegebenen Lösungsvolumen zunimmt bzw. zugenommen hat. Wünschenswerterweise ist die angereicherte oder gereinigte Adenovirus-Lösung im Wesentlichen so rein wie ein in einem Dreistufen-CsCl-Dichtegradienten gereinigtes Adenovirus.

Beim Reinigen des Virus aus infizierten Zellen, d.h. eukaryotischen Zellen, wird es bevorzugt, die Infektion nicht bis zu dem Punkt fortschreiten zu lassen, wo das Virus selbst Lyse der Zellen verursacht, weil unter diesen Bedingungen einzelne Zellen zu sehr unterschiedlichen Zeiten lysieren und durch die lysierten Zellen freigesetzte degradative Enzyme beginnen, das freigesetzte Virus anzugreifen. Ferner können die kurz vor einer adenovirusvermittelten Zelllyse auf den Zellstoffwechsel wirkenden Belastungen eine Verminderung der Genauigkeit der Virusreplikation verursachen. Es ist deshalb bevorzugt, die Zellen zu lysieren, bevor adenovirusvermittelte Lyse eintritt.

Zur Lyse kann ein beliebiges geeignetes Verfahren verwendet werden. Beispielsweise können die Zellen und das Kulturmedium zentrifugiert und das Medium durch eine Lösung starker Detergenzien und anderer Additive (z.B. TritonTMX-100, Tween 20, Tween 80 oder Desoxycholat) ersetzt werden, und nach Inkubation für einen geeigneten Zeitabschnitt kann die Probe zur Weiterverarbeitung gesammelt werden. Alternativ können die Zellen durch sanftes Zentrifugieren gesammelt werden, um ein Zellpellet zu bilden, und durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen lysiert werden. Eine bevorzugte alternative Technik ist die Verwendung einer French-Presse oder – noch mehr bevorzugt – eines Microfluidizers. French-Pressen und Microfluidizer lysieren eukaryotische Zellen effizient durch das Aufbringen von Scherkräften, um die Zellmembranen aufzubrechen. Der Scherkraftprozess ist schneller und reproduzierbarer als andere geeignete Methoden zum Erhalt einer ein Adenovirus umfassenden Lösung aus einer infizierten Population von Zellen, d.h. eukaryotischen Zellen. Somit kann eine gemischte Lösung, umfassend ein Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül, zur Reinigung oder Anreicherung in Einklang mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden durch Mikrofluidisieren einer Population von Adenovirus-infizierten Zellen.

Nachdem die Lösung, aus der das Adenovirus gereinigt werden soll, erhalten worden ist, kann sie optional geklärt werden. Falls gewünscht, kann eine derartige Klärung durchgeführt werden durch einen mäßig sanften Zentrifugationsschritt, um sehr große Stücke von Zelldebris und größere nicht aufgebrochene Organellen (falls vorhanden) zu entfernen. Ferner kann das Zelllysat durch Filtration geklärt werden. Insbesondere kann das Zelllysat durch Tangentialflussfiltration (TFF) geklärt und konzentriert werden nach auf dem Fachgebiet bekannten Methoden. Optional kann die Lösung dann mit einem Enzym behandelt werden, welches zur Verdauung von DNA und RNA befähigt ist (eine "DNase/RNase"), um jegliche DNA oder RNA in dem geklärten Zelllysat, die nicht innerhalb der adenoviralen Partikel enthalten ist, zu entfernen.

Optional kann das Zelllysat nach seiner Klärung an einem Anionenaustausch-Vorharz chromatographiert werden, bevor es gereinigt wird. Für das Vorharz kann ein beliebiges geeignetes Anionenaustausch-Chromatographieharz verwendet werden. Bevorzugt weist das Anionenaustausch-Chromatographieharz, welches für das Vorharz verwendet werden soll, eine mit einem tertiären oder quartären Amin (z.B. Diethylaminoethyl, Trimethylaminoethyl oder Trimethylaminopropyl) derivatisierte Oberflächengruppe auf. Die Oberflächengruppe kann durch eine beliebige geeignete Linker-Gruppe an einen Matrixträger gekoppelt sein, wie auf dem Fachgebiet bekannt. Acrylpolymer-Linker gehören zu den Linkern, welche im Kontext der vorliegenden Erfindung Verwendung finden können. Die Trägermatrix kann aus einem beliebigen geeigneten Material bestehen; bevorzugt ist der Matrixträger aber ein Material, welches auf dem Konzept des "weichen Gels in steifer Hülle" basiert. Dieses "gelgefüllte" Chromatographieharz erlaubt es, dass man sich die hohe Kapazität von weichen Gelen, z.B. Agarose, und die Steifheit von Composite-Materialien für hohe Flussraten und erhöhte Toleranz gegenüber Kompression oder Schrumpfung und Schwellung der Medien, eine allgemeine Charakteristik weicher Gele, zunutze machen kann. Diese "gelgefüllten" Chromatographieharze sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und sind z.B. in den US-Patenten Nr. 5 268 097 und Nr. 5 672 276 beschrieben.

Ein erwünschtes Vorharz-Anionenaustausch-Chromatographieharz im Kontext der vorliegenden Erfindung ist Q Ceramic HyperDTMF, kommerziell erhältlich von BioSepra, Villeneuve-La-Garenne, Frankreich. Q Ceramic HyperDTMF besteht aus einem hochporösen keramisierten Kornmaterial, gefüllt mit einem funktionalisierten flexiblen hydrophilen Hydrogel, mit einer mittleren Korngröße von 50 &mgr;m (mit einem Partikelbereich von 25–75 &mgr;m). Q Ceramic HyperDTMF weist eine dynamische Kapazität von mindestens 85 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) bei 200 cm/h mit 50% Durchbruch und von mindestens 80 mg/ml BSA bei 600 cm/h mit 50% Durchbruch auf. Aufgrund der gelgefüllten Natur von Q Ceramic HyperDTMF steht eine größere äußere Oberfläche für die Bindung zur Verfügung verglichen mit klassischen porösen Medien, bei denen typisch mindestens 50% des Äußeren des Partikels aus dem Poreneintritt gebildet sind, wo keine Bindung stattfindet. Als eine Folge tragen 100% der gesamten äußeren Oberfläche von Q Ceramic HyperDTMF zur Bindung bei. Dieses Merkmal macht dieses Chromatographieharz zu einem bevorzugten Vorharzmaterial.

Alternativ kann das Zelllysat optional an einem "expanded bed"-Adsorptions-Anionenaustausch-Vorharz chromatographiert werden. Beispielsweise kann ein "expanded bed"-Adsorptions-Anionenaustausch-Chromatographieharz mit Bindungseinheiten, welche mit einem quartären Amin (z.B. Trimethylaminomethyl oder DEAE) derivatisiert sind, verwendet werden. "Expanded bed"-Anionenaustausch-Chromatographieharze sind gekennzeichnet durch größere Kornabmessungen, z.B. größer als 30 &mgr;m im Durchmesser, üblicherweise aber nicht mehr als 500 &mgr;m im Durchmesser. Wegen der großen Korngröße können große Fragmente von Zelldebris und ganze (unlysierte) Zellen frei durch das Chromatographieharz (und dessen geeignet bemessene Fritte) strömen. Geeignete "expanded bed"-Adsorptions-Chromatographieharze umfassen, ohne jedoch hierauf begrenzt zu sein, Streamline QXL® (Pharmacia, Uppsala, Schweden) und DEAE Cellthru-Big BeadsTM (Sterogene, Carlsbad, CA, oder das Äquivalent von UpFront Chromatography, Kopenhagen, Dänemark).

Das Zelllysat wird von dem Vorharz-Anionenaustausch-Chromatographieharz mit einem beliebigen geeigneten Eluenten eluiert (z.B. 600 mM NaCl). Die Lösung wird geeignet verdünnt, falls erforderlich, um die Konzentration des Elutionsmittels oder anderer Agenzien in dem Elutionspuffer zu verringern. Die semi-gereinigte und konzentrierte Zelllysatlösung kann dann auf ein geeignetes Anionenaustausch-Chromatographieharz zur Reinigung aufgebracht werden.

Im Hinblick auf das im Vorstehenden Gesagte stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung einer Lösung an einem Adenovirus bereit. Das Verfahren umfasst: (i) Erhalten einer gemischten Lösung, die ein Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül umfasst; (ii) Aufbringen der gemischten Lösung auf ein Anionenaustausch-Chromatographieharz und (iii) Eluieren des Adenovirus von dem Chromatographieharz mit einem Eluenten, so dass eine angereicherte Adenovirus-Lösung erhalten wird. Ferner kann die gemischte Adenovirus-Lösung optional durch Tangentialflussfiltration geklärt werden. Ferner kann die geklärte gemischte Adenovirus-Lösung optional unter Verwendung eines Anionenaustausch-Vorharzes chromatographiert werden.

Ein Adenovirus kann aus mit Adenovirus infizierten Zellen gereinigt werden. Ein Verfahren zum Reinigen eines Adenovirus aus mit Adenovirus infizierten Zellen umfasst das Lysieren von mit Adenovirus infizierten Zellen, Aufbringen des Lysats auf ein einziges Chromatographieharz, so dass das Adenovirus an das Chromatographieharz bindet, Eluieren des Adenovirus von dem Chromatographieharz und Sammeln einer Fraktion, welche das Adenovirus enthält. Das Adenovirus in der Fraktion ist im Wesentlichen so rein wie ein in einem Dreistufen-CsCl-Dichtegradienten gereinigtes Adenovirus.

Es kann ein beliebiges geeignetes einziges Chromatographieharz verwendet werden, um das Adenovirus aus einem Zelllysat zu reinigen. Es kann ein beliebiges geeignetes Anionenaustausch-Chromatographieharz, welches eine Oberflächengruppe aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, welche aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminobutyl, Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl besteht, verwendet werden, um das Adenovirus aus einer gemischten Lösung, welche Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül umfasst, zu reinigen. Die Oberflächengruppe ist bevorzugt Dimethylaminopropyl. Die Oberfläche kann mittels einer beliebigen geeigneten Linker-Gruppe an einen Matrixträger gekoppelt sein, wie auf dem Fachgebiet bekannt. Sulphonamid- und Acrylat-Linker gehören zu den Linkern, welche im Kontext der vorliegenden Erfindung Anwendung finden können. Der Matrixträger kann aus einem beliebigen geeigneten Material bestehen; es ist jedoch bevorzugt, wenn der Matrixträger ein Perfusions-Anionenaustausch-Chromatographieharz ist, derart, dass der Intrapartikel-Massentransport optimiert wird.

Typische Perfusions-Chromatographieharze weisen große Poren (z.B. 6000–8000 Å) auf, welche die Partikel durchschneiden. Ein Netzwerk kleinerer Poren, wodurch die Diffusionsweglängen limitiert werden, vergrößert die Oberfläche der Großporen-Durchmesser. Zum Teil infolge der bimodalen Verteilung der Porengrößen treten die mobile Phase und Adenovirus in die Chromatographieharzpartikel ein und durchströmen sie unter Nutzung von sowohl konvektivem als auch diffusivem Transport. Derartige Perfusions-Chromatoraphieharze sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt; eine ausführlichere Beschreibung findet sich z.B. bei Afeyan et al. (J. Chromatogr. 519: 1–29 (1990)) und in den US-Patenten Nr. 5 384 042; Nr. 5 228 989; Nr. 5 552 041; Nr. 5 605 623 und Nr. 5 019 270).

Ein geeignetes Perfusions-Anionenaustausch-Chromatographieharz im Kontext der vorliegenden Erfindung ist POROS® 5OD, kommerziell erhältlich von PerSeptive Biosystems, Framingham, Massachusetts. POROS® 5OD ist ein makroporöses Styrol-Divinylbenzol-Copolymer-Chromatographieharz, welches eine dynamische Kapazität von mindestens 100 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) bei 100 cm/h mit 50% Durchbruch und von mindestens 80 mg/ml BSA bei 1000 cm/h mit 5% Durchbruch aufweist. POROS® 5OD zeigt einen Druckabfall von weniger als 3 bar bei 1000 cm/h in einem 10 cm-Chromatographieharzbett, und die nominale Partikelgröße des Chromatographieharzes beträgt ca. 50 &mgr;m (d.h. die mittlere Partikelgröße liegt zwischen 25 und 100 &mgr;m).

Anionenaustausch-Chromatographieharze können entweder als "Batch"-Chromatographieharze oder, bevorzugt, als "Durchfluss"-Anordnungen verwendet werden, bevorzugt in Form einer Säule, insbesondere für Perfusions-Chromatographieharze. Ferner stellt die vorliegende Erfindung – im deutlichen Gegensatz zu den Verfahren nach dem Stand der Technik – eine voll skalierbare, einfache und schnelle Reinigung von Adenovirus mittels Chromatographie bereit.

Ein in Einklang mit dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren gereinigtes Adenovirus weist kein wesentlich niedrigeres Partikel-zu-pfu-Verhältnis (pu/pfu) auf als ein in einem CsCl-Dichtegradienten gereinigtes Adenovirus. Das heißt, der pu/pfu-Wert des gereinigten Adenovirus beträgt mindestens 50% desjenigen des in einem CsCl-Dichtegradienten gereinigten Adenovirus, bevorzugt mindestens ca. 85% desjenigen des in einem CsCl-Dichtegradienten gereinigten Adenovirus und mehr bevorzugt mindestens ca. 96% desjenigen des in einem CsCl-Dichtegradienten gereinigten Adenovirus. Weiter: die Reinheit des chromatographierten Adenovirus überschreitet bevorzugt diejenige einer identischen Adenovirus-Lösung, die analytisch nicht unterscheidbar ist von Adenovirus, welches durch eine standardmäßige Dreistufen-CsCl-Dichtegradientenreinigung nach dem Stand der Technik gereinigt wurde (d.h. ist im Wesentlichen so rein wie ein in einem Dreistufen-CsCl-Dichtegradienten gereinigtes Adenovirus, z.B. mindestens 90% so rein, bevorzugt mindestens 97% so rein und mehr bevorzugt mindestens 99% so rein wie ein in einem Dreistufen-CsCl-Gradienten gereinigtes Adenovirus).

Das Adenovirus wird im Wesentlichen und geeignet in einer Lösung angereichert, indem es von dem Anionenaustausch-Chromatographieharz mit einem geeigneten Eluenten eluiert wird. Typische geeignete Eluenten sind ionisch im Charakter, so dass sie mit dem Adenovirus um die Bindung an das Chromatographieharz konkurrieren. Bevorzugt wird der Eluent auf das Chromatographieharz in einem diskontinuierlichen Gradienten aufgebracht, d.h. in zwei oder mehr Schritten, oder in einem kontinuierlichen Gradienten. Derartige Gradienten können linear, konkav oder konvex sein. Ein geeigneter Eluent ist Natriumchlorid in einer gepufferten Lösung. Beispielsweise eluiert Adenovirus von Q Ceramic HyperDTMF-Chromatographieharz bei Konzentrationen zwischen ca. 360 und ca. 475 mM NaCl, insbesondere bei ca. 415 mM NaCl, und von POROS® 5OD-Chromatographieharz bei Konzentrationen zwischen ca. 360 und ca. 450 mM NaCl, insbesondere bei ca. 400 mM NaCl.

Das Anionenaustausch-Chromatographieharz kann vorteilhaft bei hohen Elutionsmittelkonzentrationen beladen werden (z.B. mindestens ca. 75% der Konzentration, die notwendig ist, um das Adenovirus von dem Chromatographieharz zu eluieren, bevorzugt zwischen ca. 85% bis ca. 90% der Konzentration, die notwendig ist, um das Virus von dem Chromatographieharz zu eluieren). Durch Beladung des Anionenaustausch-Chromatographieharzes bei hohen Elutionsmittelkonzentrationen binden gewisse Verunreinigungen nicht an das Harz.

Die Elution des angereicherten Adenovirus kann bei einer beliebigen geeigneten Flussrate erfolgen. Typische Flussraten für in dem Vorharz verwendetes Anionenaustausch-Chromatographieharz liegen im Bereich von ca. 100 cm/h bis ca. 1000 cm/h, bevorzugt ca. 200 cm/h bis ca. 500 cm/h. Beispielhafte Flussraten für Anionenaustausch-Chromatographieharz, welches eine Bindungseinheit enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, welche aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminobutyl, Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl besteht, liegen im Bereich von ca. 100 cm/h bis ca. 1500 cm/h, bevorzugt ca. 500 cm/h bis ca. 1250 cm/h.

Um die Anzahl an adenoviralen Partikeln entweder in einer Probelösung von Adenovirus, z.B. in einer aus einem rohen Lysat von mit Adenovirus infizierten Zellen erhaltenen Lösung, genau zu quantifizieren, kann eine Probelösung von einem Adenovirus hergestellt werden, wie bereits beschrieben. Die Probelösung von Adenovirus kann dann angereichert und gereinigt werden, indem die Probelösung von Adenovirus auf ein Anionenaustausch-Chromatographieharz aufgebracht und eluiert wird, wie bereits beschrieben. Sodann wird die Absorption des von dem Chromatographieharz eluierten Probe-Adenovirus bestimmt. Zum Vergleich wird die Absorption einer Standardlösung von Adenovirus, d.h. einer Adenovirus-Lösung von bekannter Konzentration, bestimmt. Durch einen Vergleich der Absorption der Probelösung und der Absorption der Standardlösung wird die Konzentration adenoviraler Partikel, d.h. die Anzahl an adenoviralen Partikeln in einem gegebenen Volumen, in einer Probelösung bestimmt.

Die Standardabsorption kann eine einzige Standard-Absorption oder eine Serie oder Gruppe von Standard-Absorptionen sein, welche einen Adenovirus-Konzentrationsbereich anzeigen. Die Probe-Absorption und die Standard-Absorption können in ähnlichen oder verschiedenen (doch bevorzugt ähnlichen) Formaten, Messungen oder Einheiten präsentiert werden, solange ein brauchbarer Vergleich durchgeführt werden kann. Beispielsweise kann eine geeignete Standard-Absorption eine Absorption sein, die bestimmt wird aus einer Standardlösung von Adenovirus, welche in der gleichen Weise behandelt worden ist, wie eine Probelösung von Adenovirus gemäß den vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren behandelt worden ist.

Die Quantifizierung der Anzahl an adenoviralen Partikeln wird erzielt, indem die Probe-Absorption mit der Standard-Absorption auf beliebige geeignete Weise verglichen wird. Beispielsweise können Probe-Absorption und Standard-Absorption verglichen werden durch Berechnen einer Standardkurve der Fläche unter dem Peak korrespondierend zu der Viruselution von dem Chromatographieharz auf einem Chromatogramm, in dem die Absorption gegen die Zeit aufgetragen ist. Die Absorption von verschiedenen bekannten Adenovirus-Konzentrationen kann auf einem Graphen aufgetragen werden, so dass eine Standardkurve erzeugt wird. Mittels linearer Regressionsanalyse kann dann die Probenkonzentration bestimmt werden.

Unter Verwendung von Anionenaustausch-Chromatographieharzen in einer Lösung angereichertes oder aus Adenovirus-infizierten Zellen gereinigtes Adenovirus kann in Lösungen erhalten werden, welche hohe Konzentrationen an Elutionsmittel, z.B. NaCl, enthalten können. Die Pufferzusammensetzung kann durch eine beliebige geeignete Technik leicht in einen beliebigen gewünschten Puffer geändert werden, z.B. in einen sterilen, isotonischen Puffer zur Injektion in den Säugetierkörper (z.B. Ringer-Lactatlösung), der geeignete Exzipienten (Stabilisatoren und Kryokonservierungsmittel) für die Langzeitlagerung des gereinigten Adenovirus enthält. Geeignete Techniken zum Ändern der Pufferzusammensetzung umfassen, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein, Dialyse, Diafiltration und Größenausschlusschromatographie. Geeignete Größenausschlusschromatographiematrices umfassen Toyopearl HW-40C und Toyopearl HW40F (TosoHaas, Montgomeryville, PA); UniflowTM, SuperflowTM und UltraflowTM (Sterogene, Carlsbad, CA), ShodexTM (Thomson Instruments, Chantilly, VA) sowie Bio-SilTM und Bio-GelTM (Bio-Rad, Hercules, CA). Jedes dieser Chromatographieharze weist ein geeignet niedriges Proteinbindungspotential auf.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben. Diese Beispiele dienen lediglich der Erläuterung der Erfindung und sollen den Bereich der Erfindung in keiner Weise einschränken.

BEISPIELE Beispiel 1

Dieses Beispiel demonstriert die Reinigung von Adenovinus aus rohem Zelllysat. Die Reinigung wurde erzielt, indem zunächst das Zelllysat geklärt wurde, das Zelllysat auf ein Anionenaustausch-Vorharz aufgebracht und eluiert wurde und schließlich das Zelllysat auf ein Anionenaustauschharz, welches eine Bindungseinheit enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, welche aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminopentyl, Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl besteht, aufgebracht und eluiert wurde.

AdSEAP und AdVEGF121 sind adenovirale Vektoren mit Deletionen in der E1- und E3-Region des adenoviralen Genoms, welche eine Genexpressionskassette enthalten, in diesem Falle einen cytomegaloviralen (CMV-)Promotor, der funktionell gekoppelt ist an ein fremdes Gen (Transgen), z.B. sekretierte alkalische Phosphatase (AdSEAP) oder vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor 121 (AdVEGF121), in der E1-Region des adenovinalen Genoms. AdSEAP und AdVEGF121 wurden in Spinner-Flasks, Rollerflaschen, Schüttelflaschen oder Bioreaktoren, welche ca. 105–106 293-Zellen pro ml enthielten, in Anwesenheit oder Abwesenheit von Serum in dem Wachstumsmedium propagiert.

Die Zellen und Medien wurden nach einer der folgenden beiden Methoden vor einer Chromatographie verarbeitet: (a) die Zellen wurden durch Zentrifugation konzentriert, in einem geeigneten Puffer (25 mM Tris, pH 7,8, 75 mM NaCl, 10 mM MgCl2) resuspendiert zwecks optimaler Aktivität der DNase/RNase, in einem Microfluidizen (Microfluidics, Newton, Massachusetts) nach Angaben des Herstellers lysiert und durch Filtration geklärt; oder: (b) die Zellen wurden direkt in einem Microfluidizer nach Angaben des Herstellers lysiert, durch Filtration geklärt und durch Tangentialflussfiltration (TFF) zu dem oben beschriebenen geeigneten Puffer konzentriert und diafiltriert. Bei beiden Methoden wurde das geklärte Zelllysat dann mit einer DNase/RNase, z.B. Benzonase® (Nycomed Pharma A/S, Dänemark), gemäß den Angaben des Herstellers behandelt und zu einem geeigneten Puffer für das Anionenaustausch-Vorhanz verdünnt.

Das Zelllysat wurde dann auf eine Q Ceramic HyperDTMF-Säule aufgebracht und mit einem Stufengradienten von 360 bis 475 mM NaCl eluiert. 1, die ein Chromatogramm darstellt von einem Adenovirus-infizierten Zelllysat, eluiert von einem quartären Amin-Chromatographieharz (Q Ceramic HyperDTMF-Säule), zeigt die Elution des Adenovirus von der Anionenaustausch-Vorsäule, Q Ceramic HyperDTMF, wenn der DNase/RNase-Schritt nicht durchgeführt wurde. Der konzentrierte und partiell gereinigte Virus-Peak, der bei ca. 415 mM NaCl eluiert, wenn mit Stufengradienten von 360, 450 und 1000 mM NaCl eluiert wird, war in einer Fraktion um 51 Minuten enthalten. 2, die ein Chromatogramm darstellt von einem Adenovirus-infizierten Zelllysat, geklärt durch Tangentialflussfiltration, behandelt mit DNase/RNase und eluiert von einem quartären Amin-Chromatographieharz, zeigt die Elution des Adenovirus von der Anionenaustausch-Vorsäule, Q Ceramic HyperDTMF, wenn eine DNase/RNase (Benzonase®) verwendet wurde. Eine wesentliche Verringerung der Größe des nach dem Virus-Peak eluierenden Nucleinsäure-Peaks wurde beobachtet.

Der Eluent aus der Anionenaustausch-Vorsäule wurde sodann um ca. 30% verdünnt, was notwendig ist, um das Elutionsmittel, in diesem Falle NaCl, auf eine Konzentration zu verdünnen, die unter der Elutionskonzentration für die Dimethylaminopropyl-Perfusionschromatographie-(POROS® 5OD)-Säule liegt, die verwendet wurde, um die Reinigung des Adenovirus aus dem rohen Zelllysat zu vervollständigen. Die POROS® 5OD-Säule wurde bei einer Konzentration von 300 mM NaCl beladen. Die Säule wurde dann mit einem Stufengradienten von Natriumchlorid (360 mM bis 450 mM) eluiert.

Ein Chromatogramm von einem Adenovirus-infizierten Zelllysat, geklärt durch Tangentialflussfiltration, behandelt mit DNase/RNase und eluiert von einer quartären Amin-Chromatographiesäule und einer Dimethylaminopropyl-Perfusionschromatographiesäule zeigt die Elution des Adenovirus von der POROS® 5OD-Säule. Im Wesentlichen wurde nur ein scharfer Peak bei ca. 35 min erhalten. Eine analytische Charakterisierung des gereinigten Adenovirus zeigte an, dass die Reinheit des Adenovirus im Wesentlichen nicht zu unterscheiden war von einem in einem dreistufigen CsCl-Dichtegradienten gereinigten Adenovirus.

Somit wurde Adenovirus aus rohem Zelllysat gereinigt durch Filtern des Zelllysats, Aufbringen des Zelllysats auf eine quartäre Amin-Anionenaustausch-Vorsäule und Eluieren des Zelllysats von derselben und schließlich Aufbringen des Zelllysats auf eine Anionenaustauschsäule, welche eine Dimethylaminopropyl-Bindungseinheit enthielt, und Eluieren des Zelllysats von derselben.

Beispiel 2

Dieses Beispiel demonstriert die Reinigung von Adenovirus aus rohem Zelllysat. Die Reinigung wurde erzielt, indem zunächst das Zelllysat geklärt wurde, das Zelllysat auf eine "expanded bed"-Adsorptions-Anionenaustausch-Vorsäule aufgebracht und von derselben eluiert wurde und schließlich das Zelllysat auf eine Anionenaustauschsäule aufgebracht wurde, welche eine Bindungseinheit enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe, welche aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminopentyl, Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl besteht, und von derselben eluiert wurde.

AdSEAP (der adenovirale Vektor wie in Beispiel 1 beschrieben) wurde in Spinner-Flasks, welche ca. 105–106 293-Zellen pro ml enthielten, propagiert. Die Zellen und Medien wurden in einem Microfluidizer nach Angaben des Herstellers lysiert. Das Zelllysat wurde auf eine Streamline QXL® "expanded bed"-Adsorptions-Anionenaustausch-Vorsäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) aufgebracht (um großstückiges Debris und unlysierte Zellen zu entfernen). Die Streamline QXL®-Säule diente teilweise auch zur Reinigung und Konzentrierung des Adenovirus. 3, die ein Chromatogramm darstellt von einem Adenovirus-infizierten Zelllysat, eluiert von einem "expanded bed"-Adsorptions-Chromatographieharz, zeigt die Elution des Adenovirus von der Streamline QXL®-Säule. Der Virus-Peak war in der Fraktion 14 enthalten (eine Fraktion pro Minute), die bei ca. 600 mM NaCl eluierte. Der Eluent von der Streamline QXL®-Säule wurde ca. 1:2 verdünnt. Die Verdünnung war notwendig, um das Elutionsmittel, in diesem Falle NaCl, auf eine Konzentration zu verdünnen, die unter der Elutionskonzentration für die POROS® 5OD-Säule liegt, die als nächstes verwendet wurde.

Eine POROS® 5OD-Säule wurde verwendet, um die Reinigung des Adenovirus zu vervollständigen. Die POROS® 5OD-Säule wurde bei einer Konzentration von 300 mM NaCl beladen. Die Säule wurde dann mit einem linearen Gradienten von Natriumchlorid (360 mM bis 450 mM) eluiert, wobei das Adenovirus von der POROS® 5OD eluierte. Ein Chromatogramm von einem Adenovirus-infizierten Zelllysat, eluiert von einem "expanded-bed"-Adsorptions-Chromatographieharz und einem Dimethylaminopropyl-Perfusionschromatographieharz zeigt im Wesentlichen nur einen scharfen Peak bei ca. 15 min, wenn mit einem linearen NaCl-Gradienten von 360 bis 450 mM eluiert wurde, so dass das Virus bei ca. 400 mM NaCl eluierte. Eine analytische Charakterisierung des gereinigten Adenovirus zeigte an, dass die Reinheit des Adenovirus im Wesentlichen nicht zu unterscheiden war von einem in einem dreistufigen CsCl-Dichtegradienten gereinigten Adenovirus (siehe 4).

Somit wurde Adenovirus aus rohem Zelllysat gereinigt durch Filtern des Zelllysats, Aufbringen des Zelllysats auf eine "expanded bed"-Anionenaustausch-Vorsäule und Eluieren des Zelllysats von derselben und schließlich Aufbringen des Zelllysats auf eine Anionenaustauschsäule, welche eine Dimethylaminopropyl-Bindungseinheit enthielt, und Eluieren des Zelllysats von derselben.

Beispiel 3

Dieses Beispiel demonstriert – im deutlichen Gegensatz zu Methoden nach dem Stand der Technik – eine Reinigung eines Adenovirus durch eine einzige Chromatographiesäule aus einem rohen Zelllysat, wobei die Reinigung mindestens 95% so rein wie ein in einem dreistufigen CsCl-Dichtegradienten gereinigtes Adenovirus war. Ferner stellt diese Technik eine schnelle und genaue Methode zum Quantifizieren der Gesamtzahl an viralen Partikeln in einem rohen Lysat bereit.

AdSEAP (der adenovirale Vektor gemäß Beispiel 1) wurde wachsen gelassen und lysiert wie in Beispiel 1, Methode (a). Das Ganzzelllysat wurde auf eine POROS® 5OD-Säule in 360 mM NaCl aufgebracht. Die Säule wurde eluiert wie in Beispiel 1 angegeben, was zu dem in 6 gezeigten Chromatogramm führte, in dem die Absorption (260 nm und 280 nm) gegen die Zeit (min) aufgetragen ist. Eine analytische Untersuchung der Peak-Fraktion zeigte, dass die Reinheit nicht zu unterscheiden war von einem in einem dreistufigen CsCl-Dichtegradienten gereinigten Adenovirus (5 & 6), wobei die obere horizontale Linie eine Inline-Messung der Leitfähigkeit ist, welche die tatsächliche NaCl-Konzentration angibt. Die beträchtliche Überlappung und das Verhältnis der Peak-Absorption bei 260 nm (die höhere Spur in dem Chromatogramm) zu 280 nm (die untere Spur in dem Chromatogramm), das 1,27 betrug (1,25 ± 0,08 war das empirisch ermittelte Verhältnis des reinen Virus), zeigten, dass das Virus im Wesentlichen rein war. Ferner zeigte das Fehlen von nicht-überlagerten Peaks (oder sekundären Peaks) an, dass das Virus im Wesentlichen rein war.

Verschiedene Adenovirus-Lösungen von bekannter Konzentration wurden auf eine POROS® 5OD-Säule in 360 mM NaCl aufgebracht. Die Säule wurde eluiert, wie in Beispiel 1 angegeben, und die Absorption (260 & 280 nm) gegenüber der Elutionszeit (min) chromatographiert. Die Fläche unter dem Peak korrespondierend zu der Adenovirus-Elution wurde für jede unterschiedliche Konzentration bestimmt und als ein Graph der Fläche gegen die Adenovirus-Konzentration aufgetragen. Die Fläche unter der Kurve des AdSEAP-Chromatogramms in 5 korrespondierend zu der Adenovirus-Elution wurde berechnet und mit der Standardkurve verglichen unter Verwendung linearer Regression, und es wurde bestimmt, dass das rohe Lysat 4,64 × 1010 pu/mL enthielt.

Die vorliegende Erfindung stellt also eine Ein-Schritt-Methode bereit zum Reinigen von Adenovirus aus einem Ganzzelllysat. Somit wurde Adenovirus, das mindestens 95% so rein wie ein in einem dreistufigen CsCl-Dichtegradienten gereinigtes Adenovirus war, aus rohem Zelllysat durch eine einzige Chromatographiesäule gereinigt. Ferner wurde die Adenovirus-Gesamtzahl in einem rohen Zelllysat schnell und genau quantifiziert.

Beispiel 4

Dieses Beispiel demonstriert, dass die Pufferzusammensetzung von aus Anionenaustauschsäulen isoliertem Adenovirus leicht geändert werden kann (z.B. von einer hohen Salzkonzentration zu einer niedrigen Salzkonzentration).

Etwa 0,1 Säulenvolumina (0,01 Säulenvolumina bis ca. 0,25 Säulenvolumina) der in Beispiel 1 isolierten adenovirushaltigen Lösung wurden auf eine Toyopearl HW-40C-Säule oder eine Uniflow 4-Säule aufgebracht, die mit einem geeigneten sterilen isotonischen Puffer zur Injektion in den Säugetierkörper (z.B. Ringer-Lactatlösung) äquilibriert war, der geeignete Exzipienten (Stabilisatoren und Kryokonservierungsmittel) für die Langzeitlagerung des gereinigten Adenovirus enthielt. Die das Adenovirus enthaltende Säulenfraktion wurde durch Inline-Spektroskopie identifiziert und zurückgehalten. Das gereinigte Virus war in einem Puffer enthalten, der ca. 10 mM Tris, pH 7,8, 75 mM NaCl und verschiedene Stabilisatoren enthielt.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Anreicherung einer Lösung an einem Adenovirus, umfassend:

    (i) Erhalten einer gemischten Lösung, die einen Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül umfasst;

    (ii) Aufbringen der gemischten Lösung auf ein Anionenaustausch-Chromatographieharz, das eine Bindungseinheit umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dimethylaminopropyl, Dimethylaminobutyl, Dimethylaminoisobutyl und Dimethylaminopentyl, sodass der Adenovirus an das Chromatographieharz bindet; und

    (iii) Eluieren des Adenovirus von dem Chromatographieharz mit einem Eluenten, sodass eine angereicherte Adenoviruslösung erhalten wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Bindungseinheit Dimethylaminopropyl ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Eluent ein Eluent mit einem kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Gradienten ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Eluent ein Gradienteneluent ist, der einen Natriumchloridgradienten umfasst.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Anionenaustausch-Chromatographieharz ein Perfusions-Anionenaustausch-Chromatographieharz ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die gemischte Lösung, die Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül umfasst, durch Mikrofluidisieren einer Population von Adenovirus-infizierten Zellen erhalten wird.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Verfahren ferner umfasst: (i') Aufbringen der gemischten Lösung, die Adenovirus und mindestens eine unerwünschte Art von Biomolekül umfasst, auf ein Anionenaustausch-Vorharz und Eluieren des Adenovirus von dem Vorharz, und dann, in Schritt (ii), anstelle des Aufbringens der gemischten Lösung, Aufbringen des von dem Vorharz eluierten Adenovirus auf das Anionenaustausch-Chromatographieharz.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Anionenaustausch-Vorharz ein Flachbett- oder ein "expanded bed"-Adsorptionsharz ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Anionenaustausch-Vorharz ein quartäres Aminharz ist.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das Vorharz einen Acrylpolymer-Linker umfasst, um die Bindungseinheit an das Harz zu koppeln.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei Schritt (ii) in einer Lösung durchgeführt wird, die mindestens ca. 75% derjenigen Konzentration eines Elutionsmittels enthält, die erforderlich ist, um den Adenovirus von dem Anionenaustausch-Chromatographieharz zu eluieren.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und 11, wobei das Aufbringen der gemischten Lösung auf ein Anionenaustausch-Chromatographieharz in einer Lösung durchgeführt wird, die ca. 85% bis ca. 90% derjenigen Konzentration eines Elutionsmittels enthält, die erforderlich ist, um den Adenovirus von dem Anionenaustausch-Chromatographieharz zu eluieren.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei das Aufbringen der gemischten Lösung auf ein Anionenaustausch-Chromatographie-Vorharz in einer Lösung durchgeführt wird, die ca. 85% bis ca. 90% derjenigen Konzentration eines Elutionsmittels enthält, die erforderlich ist, um den Adenovirus von dem Anionenaustausch-Chromatographie-Vorharz zu eluieren.
  14. Verfahren zur genauen Quantifizierung der Anzahl an adenoviralen Partikeln in einer Probelösung, umfassend:

    (i) Anreichern einer Probelösung an Adenovirus gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13;

    (ii) Bestimmen der Absorption der Probelösung, die gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 angereichert wurde, und einer Standard-Adenoviruslösung;

    (iii) Vergleichen der Absorption der Probelösung und der Standardlösung; und

    (iv) Quantifizieren der Anzahl an adenoviralen Partikeln in der Probelösung.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Probelösung aus einem rohen Zelllysat von Adenovirus-infizierten Zellen hergestellt wird.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Anionenaustausch-Chromatographieharz einen mit der Bindungseinheit verbundenen Acrylat- oder Sulfonamid-Linker umfasst:
  17. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das "expanded bed"-Adsorptions-Vorharz dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Korngröße von ca. 30 bis 500 &mgr;m im Durchmesser aufweist.
  18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei das Verfahren umfasst, dass eine Adenovirus enthaltende Lösung einer Tangentialflussfiltration unterworfen wird, um die gemischte Lösung herzustellen.
  19. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11 und 13 bis 18, wobei das Anionenaustausch-Chromatographie-Vorharz eine Bindungseinheit umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Diethylaminoethyl, Trimethylaminomethyl, Trimethylaminoethyl und Trimethylaminopropyl.
Es folgen 6 Blatt Zeichnungen






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