Die vorliegende Erfindung kommt aus dem Bereich der Aquakultur, insbesondere wird ein Verfahren zum aquakulturellen Aufziehen von im Wasser lebenden Arten mit Beuteorganismen bereitgestellt, die mit hochgradig ungesättigten Fettsäuren (HUFAs), insbesondere Docosahexaensäure (DHA) angereichert sind, was hohe Überlebensraten während des Larvenstadiums der Fische bereitstellt.

Der Verzehr von Meeresfrüchtearten, für die eine hohe Verbrauchernachfrage besteht, wie etwa Lachs, Forelle, Heilbutt und Aal, nimmt zu, und aufgrund dieser hohen Nachfrage und begrenzter natürlicher Vorräte wird viel Aufwand zur Entwicklung kostenwirksamer Aquakulturverfahren zur Zucht solcher Arten betrieben. Ein besonders ernstes Problem ist es, eine hohe Überlebensrate der geschlüpften Larven der kultivierten Arten zu gewährleisten.

Die Ausweitung der aquakulturellen Industrie erfordert das Angehen verschiedener Probleme, wobei eines der signifikantesten die Schwierigkeit der Zulieferung lebender Beuteorganismen ist, die ein zur Ernährung der Larven angemessenes Futter bereitstellen. Wilde Fischlarven konsumieren eine Mischpopulation von phytoplanktonischen Beuteorganismen, die eine ausgewogene Ernährung bereitstellen. Das Sammeln von Phytoplankton in ausreichenden Mengen, um den Bedarf in einer Aquakultur zu befriedigen, ist jedoch nicht durchführbar. Alternativ werden derzeit ausgewählte Arten von Beuteorganismen, insbesondere Rotiferen und Artemia-Arten kultiviert und als Futter verwendet.

Im allgemeinen weisen solche künstlich kultivierten Beuteorganismen jedoch, obwohl sie angemessene Mengen an Protein und Energie bereitstellen, eine Lipidzusammensetzung auf, die nicht angemessen ist, um den Bedarf an bestimmten HUFAs, insbesondere DHA und EPA (Eicosapentaensäure) zu decken, die für optimales Überleben Wachstum und Entwicklung der Larven essentiell sind. Es wurde speziell gezeigt, dass ein hoher Gehalt an DHA benötigt wird und dass das Verhältnis von DHA zu EPA in den Beuteorganismen mindestens 1:1 und vorzugsweise mindestens 2:1 sein sollte.

Dieses Problem wird derzeit durch Kultivierung der Beuteorganismen in Gegenwart von Anreicherungszusammensetzungen angegangen, was eine Anreicherung der Organismen hinsichtlich dieser essentiellen Fettsäuren erlaubt. Derzeit zu diesem Zweck im Handel erhältliche Zusammensetzungen, wie etwa Produkte, die unter dem Warennamen Selco^TM verkauft werden, erfüllen die obigen Anforderungen jedoch nicht, da der DHR Gehalt relativ niedrig und/oder das Verhältnis DHA:EPA nicht hoch genug ist. Bei Verwendung solcher Zusammensetzungen wurde von Artemia Anreicherungsgehalten von 3–5 % DHA des Gesamtlipidgehalts berichtet (McEvoy et al. Aquaculture 163 (1998) 237–250) und 12 bis 15 % Überlebensrate von Fischen, die mit solchen Artemia gefüttert wurden (McEvoy et al. supra; Navarro et al. J. Fish Biol. 43 (1993) 503–515). In diesem Zusammenhang werden Überlebensraten definiert als der Überlebensprozentsatz vom ersten Füttern durch die Metamorphose hindurch. Für eine kostenwirksame aquakulturelle Produktion sollte eine larvale Überlebensrate von 50 % und vorzugsweise höher erreicht werden.

WO 99/37166 offenbart ein Verfahren zur Anreicherung von lebendigen Beuteorganismen mit Nährstoffen, die für Fischlarven essentiell sind, welches auf der Verwendung von trockenen Seifenpulvern von HUFAs beruht, die aus dem Abflussstrom der Ölextraktion aus marinen Algen erhalten werden. Es werden Artemia DHA Anreicherungsniveaus von etwa 2,7 % des Trockengewichts offenbart, jedoch werden die Verwendung zur Aquakultur und die Wirksamkeit hinsichtlich des Überlebens von Fischlarven nicht offenbart.

Ein weiteres zur Verwendung bei der Aquakultur beabsichtigtes Material wird in WO 99/06585 beschrieben. Die Beispiele offenbaren einen Gehalt an DHA von 24 Gew.%, der Phospholipidgehalt wird jedoch nicht offenbart. Das Material enthält jedoch einen hohen Anteil freier Fettsäuren (etwa 32–37 Gew.%) und einen hohen Gehalt von Nicht-Lipidmaterial, was die Effizienz der Lipidaufnahme von Beutetieren verringern kann. Ein hoher Gehalt an freien Fettsäuren wird im allgemeinen als schädlich für junge Fische angesehen.

Keines der beiden zuletzt beschriebenen Materialien wird aus Fisch hergestellt und es mangelt ihnen an vielen HUFAs, die in Fisch vorkommen, wie etwa EPA und weitere n-3 Fettsäuren, die für junge Fische wünschenswert sind.

In einem kürzlichen Bericht von Sargent et al. (Aquaculture 179 (1999) 217–229) wir betont, dass Fischlarven zusätzlich zum Bedarf an HUFAs einen Ernährungsbedarf für Phospholipide aufweisen und es wird hervorgehoben, dass die ideale Ernährung für Fischlarven eine Nahrung ist, die eine Zusammensetzung aufweist, welche ähnlich der des Dotters von Eiern ist. Nach diesen Autoren enthält Fischeidotter etwa 10 Gew.% Phospholipide (auf Trockensubstanzbasis), die etwa 17 Gew.% DHA und etwa 9 Gew.% EPA enthalten. Die Autoren schlussfolgern in ihrem Bericht, dass das Problem bestehen bleibt, wie eine solche Ernährung im Handelsmaßstab aus derzeit erhältlichen Materialien zu bilden sei.

Es konnte nunmehr gefunden werden, dass es möglich ist, angereicherte aquakulturelle Beuteorganismen bereitzustellen, die in Hinsicht auf HUFAs und Phospholipide eine Zusammensetzung aufweisen, die der von Fischeidotter sehr nahe kommt. Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Beuteorganismen ist es möglich, optimales Überleben, Wachstum, Pigmentierung und Morphogenese der Larven der im Wasser lebenden Organismen, wie etwa Heilbuttlarven, sicher zu stellen. Wie hierin gezeigt, stellt die Erfindung wesentlich höhere Überlebensraten während des Larvenstadiums und verbesserte Qualitätsparameter bereit, als zuvor für Fische, wie etwa Heilbutt, offenbart, womit eine aquakulturelle Zucht vieler Fischarten, für die eine hohe Nachfrage besteht, wirtschaftlich und gewerblich praktikabler wird.

Die Erfindung wird in Anspruch 1 offenbart.

Die erfindungsgemäße Verwendung zur Zucht von im Wasser lebenden Arten umfasst das Füttern der im Wasser lebenden Arten während mindestens einem Teil des Larven- und/oder des Post-Larven-Stadiums mit Beuteorganismen, die in ihrem Gesamtlipidgehalt einen DHA Gehalt von mindestens 15 Gew.%, vorzugsweise mindestens 17 Gew.%, besonders bevorzugt mindestens 20 Gew.%, wie etwa mindestens 25 Gew.% aufweisen.

Die Beuteorganismen weisen ebenfalls eine signifikante Menge an Phospholipiden auf, wie etwa z. B. im Bereich von 5–35 Gew.% des Gesamtlipidgehalts, wie etwa im Bereich von 5–25 Gew.%, einschlieißlich des Bereiches von 10–20 Gew.% der Gesamtlipide.

Die Beuteorganismen stellen weitere HUFAs bereit, die für Fischlarven und junge Fische wünschenswert sind, wie etwa EPA und weitere für Fische charakteristische n-3 HUFAs, wie etwa 18:3, 18:4, 20:4 und 22:5.

Die Erfinder haben entdeckt, dass solche Beuteorganismen für das erfindungsgemäße Verfahren durch Anreicherung mit DHA angereicherten Lipidmaterialien erhalten werden können, vorzugsweise Materialien, die aus Quellen auf Grundlage von Fisch herrühren.

Die Beuteorganismen sollten vorzugsweise keinen zu hohen Gehalt an freien Fettsäuren aufweisen, da diese im allgemeinen als in größeren Mengen schädlich für Fischlarven und junge Fische angesehen werden. Vorzugsweise stellen freie Fettsäuren weniger als etwa 10 Gew.% der Gesamtlipide der erfindungsgemäßen Beuteorganismen dar.

Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich die Bezeichnung „Beuteorganismen" auf beliebige Meeresorganismen, die als Lebendfutter für Larven von im Wasser lebende Arten, welche in aquakulturellen Einrichtungen hergestellt werden, verwendet werden können. Eine allgemeine Übersicht solcher Beuteorganismen findet sich in Lavens & Sorgeloos (Herausg.) „Manual on the production and use of live food for aquaculture" herausgegeben durch FAO (1995), welche hierin durch Querverweis einbezogen ist. Demgemäß umfassen die am gängigsten verwendeten Beuteorganismen verschiedene Klassen und Gattungen von Mikroalgen, Rotiferen, Artemia, Zooplankton einschließlich Copepoden, Cladoceranen, Nematoden und Trochophoralarven.

Wie hierin verwendet muss die Bezeichnung „im Wasser lebende Arten" im weitesten Sinne aufgefasst werden und umfasst sowohl limnobiotische als auch Meeresarten, einschließlich Fischarten, wie etwa Lachs, Forelle, Karpfen, Wolfsbarsch, Brasse, Steinbutt, Zackenbarsch, Seezunge, Milchfisch, graue Meeräsche, Zackenbarsch, Goldbrasse, Heilbutt, Flunder, japanische Flunder und Mönchsfisch; Krustaceen, wie etwa Shrimps, Hummer, Languste und Krabben; sowie Mollusken, wie etwa zweischalige Weichtiere.

Ein gemeinsames Merkmal dieser im Wasser lebenden Arten ist es, dass der Lebenszyklus ein oder mehrere Larvenstadien umfasst, die einen sehr spezifischen Ernährungsbedarf aufweisen können, und demgemäß ist die Bereitstellung von lebendigen Beuteorganismen, welche diesen Bedarf decken, ein wesentlicher Faktor für eine erfolgreiche aquakulturelle Produktion. Wie im obigen erwähnt ist ein solcher spezifischer Bedarf ein hoher Gehalt an der essentiellen Fettsäure DHA, wobei die Bezeichnung „essentiell" bedeutet, dass die Beuteorganismen nicht zu einer de novo Synthese solcher Verbindungen befähigt sind.

Eine besondere Ausführungsform der Erfindung umfasst die Zucht von Heilbuttarten, jedoch umfasst die Erfindung auch andere im Wasser lebende Arten, wie beispielsweise die im obigen erwähnten.

Ein hauptsächlicher Nutzen der Erfindung ist es, dass wesentlich höhere Überlebensraten für Fischlarven erzielt werden können, als dies bislang durch irgendein anderes Verfahren für die Arten Heilbutt und viele andere unseres Wissens nach erreicht wurde. Wie in den angeführten Beispielen gezeigt, können beständige Überlebensraten für Heilbutt während des Larvenstadiums von 65–80 % und sogar darüberhinaus bei der erfindungsgemäßen Fischzucht im Großmaßstab erzielt werden, und weitere Qualitätsparameter, wie etwa eine korrekte Pigmentierung, sind exzellent.

Bei einer nützlichen Ausführungsform der Erfindung werden die Beuteorganismen den im Wasser lebenden Arten, wie etwa Heilbutt, in einem Larvenstadium gefüttert, vorzugsweise so, dass mindestens 30 % der Larven am Ende des Larvenstadiums lebendig sind, bevorzugt so, dass mindestens 50 % der Larven am Ende des Larvenstadiums lebendig sind, einschließlich mindestens 60 %, insbesondere so, dass mindestens 70 % der Larven am Ende des Larvenstadiums lebendig sind, einschließlich dass mindestens 80 % am Ende des Larvenstadiuns lebendig sind.

Eine korrekte Pigmentierung der gewachsenen Kulturarten ist ein wesentliches Merkmal hinsichtlich des Marktwertes. Ein normal pigmentierter Heilbutt weist eine gefärbte Augenseite und eine weiße, nicht pigmentierte blinde Seite auf. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zeigen mindestens 70 % der jungen Heilbutte (frisch metamorphosierte Larven) eine korrekte Pigmentierung, bevorzugt mindestens 80 %, insbesondere mindestens 90 %, wie etwa 95 %, einschließlich, dass im wesentlichen sämtliche Jungtiere eine korrekte Pigmentierung zeigen.

Bei bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Verfahren zum Aufziehen von im Wasser lebenden Arten bereit, die nicht in erster Linie zum Verzehr gezüchtet werden, wie etwa Zierfischarten und Aquariumfischarten.

Verfahrensgemäß können die zum Füttern der im Wasser lebenden Arten verwendeten Beuteorganismen aus beliebigen Beuteorganismen ausgewählt sein, die gezüchtet und in Aquakultur verwendet werden können, wobei die Beuteorganismen bei nützlichen Ausführungsformen eine Krustazeenart darstellen, wie etwa Artemia, Copepoda, Daphnia, oder Moina Arten; eine Rotifera Art einschließlich Brachionus plicatilis, Brachionus rotundiformis und Brachionus rubens; oder eine Brachiopoda Art.

Die Ausführungsformen, welche Artemia Arten umfassen, sind besonders nützlich. Die Artemia Arten können erfindungsgemäß im Nauplien-, Metanauplien- oder Adultstadium kultiviert und verwendet werden.

Bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung werden die im Wasser lebenden Organismen in einer Meeresumgebung aufgezogen. Eine Meeresumgebung wird hierin zur Beschreibung eines wässrigen Mediums verwendet, das Meerwasser oder simuliertes Meerwasser umfasst, wie etwa ein wässriges Medium, dem Salz, z.B. Natriumchlorid, beigefügt wurde.

Erfindungsgemäß können die Beuteorganismen den im Wasser lebenden Arten in beliebiger Form gefüttert werden, z.B. als eine die Beuteorganismen umfassende Zusammensetzung. Bei einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Organismen dieser Zusammensetzung einen DHA Gehalt von 20 Gew.% des Gesamtlipidgehalts der Organismen auf, insbesondere mindestens 25 Gew.% des Gesamtlipidgehalts der Organismen, wie etwa mindestens 30 Gew.% des Gesamtlipidgehalts der Organismen.

Bei einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Zusammensetzung im Wasser lebende Fischfutterorganismen, die einen Gehalt an DHA von mindestens 15 Gew.% des Gesamtlipidgehalts der Organismen aufweist, wobei die Zusammensetzung eine wässrige Phase von mindestens 50 Gew.% umfasst. Bei einer besonderen Ausführungsform umfasst die wässrige Phase der Zusammensetzung mindestens 0,5 Gew.% Natriumchlorid.

Die Zusammensetzung ist bei anderen Ausführungsformen teilweise trocken, so dass sie einen Wassergehalt von weniger als 50 Gew.%, wie etwa höchstens 40 Gew.%, einschließlich höchstens 25 Gew.%, wie etwa höchstens 10 Gew.%, einschließlich höchstens 5 Gew.% Wasser aufweist. Eine solche Zusammensetzung kann eine beliebige Form annehmen, einschließlich einer pulvrigen Form, Granula und in Form von Flocken.

Wie aus dem obigen zu entnehmen ist, beträgt der Gesamtlipidgehalt der Beuteorganismen mindestens 20 Gew.% auf Trockengewichtsbasis, einschließlich mindestens 25 Gew.% und vorzugsweise mindestens 30 Gew.%, damit die Zusammensetzung eine signifikante Zuteilung an DHA bereitstellen kann.

Durch Kombination und Mischung der folgenden Bestandteile wurde eine Zusammensetzung für Beuteorganismen, wie etwa Artemia Arten, hergestellt:

Der phospholipidreiche Bestandteil wird dementsprechend hergestellt:

Zerhackter Tintenfisch (150 kg) wurde zu 300 L Isopropanol hinzugefügt und die Mischung wurde ziemlich kräftig 4–6 h lang geschüttelt und über Nacht stehen gelassen. Die Mischung wurde anschließend filtriert, und dem Filtrat wurden 300 L Hexan zugefügt und gemischt. Dies führte zu zwei Phasen, welche trennen gelassen wurden. Die obere Phase, die hauptsächlich aus Hexan und Isopropanol bestand, wurde abgetrennt und einer Destillation in mehreren Durchgängen im Vakuum unterworfen, wobei ein 50 L Rotationsverdampfer verwendet wurde, was insgesamt 2,2 kg einer mit Phospholipiden angereicherten Fraktion als braungelblicher Wachs ergab, die einen Phospholidgehalt von etwa 65 Gew.% und einen Gesamtgehalt an DHA von etwa 40 Gew.% aufwies.

Das in der Zusammensetzung als DHA-reicher Bestandteil verwendete TG 4010 Material wird von auf Fischöl basierendem Material abgeleitet, welches DHA angereichert ist, es umfasst 40 Gew.% DHA, etwa 10 Gew.% EPA und etwa 10 Gew.% weitere n-3 HUFAs. Die Fettsäuren liegen vorwiegend in Form von Triglyzeriden vor, und das Material weist einen sehr niedrigen Gehalt freier Fettsäuren auf.

Es wurden weitere Materialien als Quellen eines DHA-reichen Bestandteils getestet, wie etwa TG 5010 (ebenfalls von Croda), das einen DHA Gehalt von etwa 50 Gew.% aufweist, sowie enzymatisch synthetisierte mit DHA hoch angereicherte Triglyzeride.

Artemia Bläschen wurden unter optimalen Bedingungen ausgebrütet (in Meerwasser, 27–29 °C, pH etwa 8, Sauerstoffgehalt über 4 mg/L). Die frisch geschlüpften naupliaren Artemia wurden gespült und in einen 250 L Behälter in einer Dichte von 200000/L überführt. Die Temperatur wurde auf 25–28 °C eingestellt, der Sauerstoffgehalt auf 5–6 mg/L und der pH bei 7,5 mit Natriumbicarbonat (2g/L) gepuffert. Die Behälter wurden dadurch belüftet, dass atmosphärische Luft durch perforierte Schläuche am Boden der Behälter geleitet wurde. Die in Beispiel 1 beschriebene Anreicherungszusammensetzung wurde den Behältern zu einer Konzentration von 0,2 g/L zugefügt, und dieselbe Menge wurde 10 h später zugegeben. 24 h nach der ersten Zugabe der Anreicherungszusammensetzung weist Artemia die folgende Lipidzusammensetzung auf (31 % Gew.Tr. (Trockengewicht) Lipide, die Zahlen in der äusserst linken Spalte beziehen sich auf die Anzahl an Kohlenstoffen und Doppelbindungen in den Fettsäuren der Lipidbestandteile, DHA ist 22:6 und EPA 20:5):

Die so erhaltene Artemia weist eine hochgradig angereicherte Gesamtkonzentration an DHA auf und ist zur Fütterung von Fischlarven, wie etwa erfindungsgemäßen Heilbuttlarven, sehr geeignet.

Frisch geschlüpfte Artemia wurden in 250 L Behälter überführt und unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 2 beschrieben. Den Artemia wurde eine Lipidzusammensetzung mit 2 Gew.% Chremophore A25 Emulgator gemischt gefüttert. Die Lipidzusammensetzung enhielt 50 Gew.% des Phospholipidbestandteils der Zusammensetzung aus Beispiel 1; 25 Gew.% "DHA-80", im wesentlichen Triglyzeride, die 80 Gew.% DHA umfassen, enzymatisch synthetisiert aus Glyzerin und DHA Fettsäure unter Verwendung von Lipase aus Candida antarctica (wie beschrieben in US 5,604,119); sowie 25 Gew.% Lysi-22 (TM) (Lysi hf, Island), ein Fischöl mit 22 Gew.% DHA. Die Futterzusammensetzung wurde den Behältern zu einer Konzentration von 0,2 g/L zugefügt und dieselbe Menge wurde 12 h später zugegeben. 24 h nach der ersten Zugabe der Anreicherungszusammensetzung weist Artemia die folgende Lipidzusammensetzung auf (34 Gew.Tr. Lipide):

Die erhaltene Artemia weist erfindungsgemäß eine sehr hochgradig angereicherte Gesamtkonzentration an DHA (9,5 % Gew.Tr.) auf sowie weitere für Fische charakteristische n-3 HUFAs und eignet sich somit besonders zum Füttern von Fischlarven, wie etwa Heilbuttlarven.

Rotiferen wurden unter ähnlichen Bedingungen wie in Beispiel 2 beschrieben aufgezogen, sie wurden mit Isochrysis-Plankton und Hefe gefüttert und 6 h lang bei 27 °C mit einer wie in Beispiel 2 beschriebenen Anreicherungszusammensetzung angereichert, mit der Ausnahme, dass Croda 50 anstelle von Croda 40 verwendet wurde, wobei Croda 50 etwa 50 Gew.% DHA enthält. Die Rotiferen wiesen die folgende Lipidzusammensetzung auf (22 % Gew.Tr. Lipide):

Die erhaltenen Rotiferen weisen eine sehr hohe Gesamtkonzentration an DHA sowie einen sehr hohen Phospholipidgehalt auf und sind somit zum erfindungsgemäßen aquakulturellen Aufziehen in hohem Maße geeignet.

Heilbuttlarven wurden zum ersten Mal bei 230–250 °d gefüttert ("°d": Multiplikationsfaktor der Temperatur (°C) und den Tagen seit dem Schlüpfen). Es wurden kreisförmige Aufzuchtbehälter verwendet, entweder 3,5 oder 7 m³. Die Larven wurden allmählich an eine Aufzuchttemperatur von 11 °C und eine Lichtintensität von 300–500 Lux gewöhnt. Die Larven wurden zweimal am Tag mit Artemia gefüttert, am Morgen und am späten Nachmittag. Die Artemia wurde mit einer Anreicherungszusammensetzung 24 h vor der Morgenfütterung angereichert, daraufhin bei 13–15 °C weitere 7–8 h für die Nachmittagsfütterung aufbewahrt. Die Futterzuteilungen wurden so angepasst, dass eine gute Verdauung der Artemia gestattet wurde. Dem Aufzuchtwasser wurden Mikroalgen (Isocrysis sp.) hinzugefügt, um Stress zu vermindern und maximale Nahrungsaufnahmeraten zu begünstigen. In der Mitte der Behälter wurde eine leichte Durchlüftung angewandt, um die Wasserqualität und die Futterpartikel zu homogenisieren. Mit dem Einfluss wurde eine leichte kreisförmige Strömung zur Verteilung der Larven erlangt. Der Wasseraustausch wurde von anfangs 1,2-fach pro 24 h auf bis zu 3,3-fach pro 24 h am Ende gesteigert. Die Aufzuchtbehälter der Larven wurden täglich gereinigt.

Es wurden Überlebensraten von über 80 % in einem Behälter von Beginn der Fütterung bis zum Ende des Larvenstadiums beobachtet (90 % ausschließlich "Gaffern": Larven mit einer Kieferdeformierung), und regelmäßig wurden Überlebensraten zwischen 65 und 75 % beobachtet. Im Durchschnitt zeigten etwa 80 % der Jungfische eine korrekte Pigmentierung, es wurden jedoch bis zu 96 % mit korrekter Pigmentierung in einem Behälter beobachtet. Eine korrekte Pigmentierung ist als normale Pigmentierung auf der Augenseite und keine Pigmentierung auf der blinden Seite definiert. Im Durchschnitt ungefähr 65 % der Jungfische, jedoch bis zu 80 % in einem Behälter zeigten eine korrekte Augenwanderung, was bedeutet, dass sich beide Augen auf der Augenseite befinden. Laufende Experimente deuten darauf hin, dass sogar höhere durchschnittliche Überlebens- und Pigmentierungsraten erhältlich sind.

Die Ergebnisse zeigen, dass sich erfindungsgemäße, mit DHA angereicherte Beuteorganismen hinsichtlich hoher Überlebensraten und Qualität besonders zum Auf ziehen von im Wasser lebenden Arten, wie etwa Heilbutt, eignen.