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Dokumentenidentifikation DE69635131T2 06.07.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000869813
Titel VERWENDUNG VON BETA-INTERFERON ZUR BEHANDLUNG DER RESTENOSE
Anmelder Berlex Laboratories, Inc., Richmond, Calif., US
Erfinder JOHNS, Anthony, Hercules, US;
MINTZER, J., Robert, Richmond, US
Vertreter Dörries Frank-Molnia & Pohlman, 80538 München
DE-Aktenzeichen 69635131
Vertragsstaaten AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 28.11.1996
EP-Aktenzeichen 969407048
WO-Anmeldetag 28.11.1996
PCT-Aktenzeichen PCT/IB96/01468
WO-Veröffentlichungsnummer 1997019697
WO-Veröffentlichungsdatum 05.06.1997
EP-Offenlegungsdatum 14.10.1998
EP date of grant 31.08.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 06.07.2006
IPC-Hauptklasse A61K 38/21(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61P 9/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Verwendung von nativem oder rekombinantem menschlichem Interferon-&bgr;, insbesondere Betaseron, bei der Behandlung der Restenose beim Menschen, insbesondere der koronaren Restenose.

TECHNISCHER HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Bei der koronaren Restenose handelt es sich um eine Verengung der Koronararterie am Ort einer Gefäßverletzung nach transluminaler koronarer Ballonangioplastie. Sie kann auch nach Endarteriektomie und Arteriektomie auftreten. Zwar ist man noch dabei, die genauen Wechselwirkungen der zur koronaren Restenose beitragenden Faktoren aufzuklären, doch besteht die identifizierende Charakteristik in der Proliferation normalerweise ruhender koronarer glatter Muskelzellen am Ort der Verletzung der Koronararterienwand nach dem chirurgischen Eingriff. Während dieser Periode proliferieren auch Endothelzellen in der Arterienwand, um eine intakte luminale Endotheloberfläche wiederherzustellen. Demgemäß bestünde ein ideales Profil für eine Verbindung zur Verhinderung der koronaren Restenose in einer Verbindung, die das Wachstum der glatten Muskelzellen entweder ohne Wirkung oder mit einer stimulierenden Wirkung auf die Proliferation der Endothelzellen hemmte.

Interferone sind Teil der natürlichen Abwehrmechanismen des Körpers. Sie sind dafür bekannt, daß sie antivirale, Antitumor- und immunregulatorische Eigenschaften besitzen, und sind hinsichtlich ihres Nutzens und ihrer Funktion speziesspezifisch. Zu den Typ-I-Interferonen gehören Interferon-&agr; und Interferon-&bgr;. Interferon-&ggr; gehört zu den Typ-II-Interferonen. Menschliches Interferon-&bgr; ist als natürlich produziertes Produkt aus menschlichen Fibroblasten sowie als rekombinantes Produkt erhältlich. Von besonderem Interesse ist der Typ von rekombinantem menschlichem Interferon-&bgr;, der in den Vereinigten Staaten kommerziell unter dem Namen Betaseron (Interferon-&bgr;ser17) bekannt ist und der in der US-Patentschrift Nr. 4,588,585 (Cetus Corporation) als nützlich bei der Regulation des Zellwachstums im Menschen, bei der Behandlung von Viruskrankheiten und bei der Stimulierung natürlicher Killerzellaktivität offenbart ist.

Es konnte gezeigt werden, daß menschliches Interferon-&bgr; die (durch Serum induzierte) Proliferation bei menschlichen glatten Muskelzellen der V. saphena reduziert (Palmer et al., Laboratory Investigation (1992), Bd. 66, Nr. 6, S. 715–721) und daß Kaninchen- Interferon-&agr;/&bgr; die Proliferation bei glatten Muskelzellen der Kaninchen-Aorta reduziert (Fukumoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications (1988), Bd. 257, Nr. 1, S. 337–345).

Es konnte gezeigt werden, daß menschliches Interferon-&agr; und menschliches Interferon-&bgr; in vitro antiproliferativ in menschlichen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen sind (Ruszczak et al., J. Invest. Dermatol. (1990), Bd. 95, S. 693–699) und die Ausbildung tubuloretikulärer Strukturen in kultivierten menschlichen Endothelzellen erhöhen (Hammer et al., Ultrastructure Pathol. (1992), Bd. 16, S. 211–218). Es konnte gezeigt werden, daß Ratten-Interferon-&agr;/&bgr; keinen Effekt auf die Proliferation kultivierter pulmonaler Endothelzellen der Ratte hat (Dupont et al., J. Clin. Invest. (1992), Bd. 89, S. 197–202).

Es wurde nun entdeckt, daß menschliches Interferon-&bgr;, insbesondere Betaseron, wirksam bei der Behandlung koronarer Restenose beim Menschen ist, indem es die Proliferation koronarer glatter Muskelzellen am Ort einer Gefäßverletzung nach einem chirurgischen Eingriff hemmt, während es keinen Hemmeffekt auf die normale Proliferation koronarer Endothelzellen nach dem Eingriff aufweist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Verwendung von menschlichem Interferon-&bgr; zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen zur Behandlung oder Verhinderung der Restenose, wobei es sich bei der Restenose insbesondere um koronare Restenose handeln kann. Bei den erfindungsgemäßen Verwendungen kann das menschliche Interferon-&bgr; die Proliferation koronarer glatter Muskelzellen hemmen oder verhindern, während es keinen Hemmeffekt auf die Proliferation koronarer Endothelzellen aufweist. Beispielsweise kann das menschliche Interferon-&bgr; die Proliferation koronarer glatter Muskelzellen an einem Ort einer Gefäßverletzung nach (transluminaler koronarer Ballon-)Angioplastie, Endarteriektomie oder Arteriektomie hemmen. Vorzugsweise handelt es sich bei dem erfindungsgemäß verwendeten Interferon-&bgr; um Betaseron, d.h. Interferon-&bgr;ser17, das mit rekombinanten Mitteln produziert wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Bei 1 handelt es sich um einen Graphen, der den Effekt von Betaseron (1000 IU/ml) auf das Wachstum koronarer Endothelzellen demonstriert.

Bei 2 handelt es sich um einen Graphen, der den Effekt von Betaseron (1000 IU/ml) auf das Wachstum koronarer glatter Muskelzellen demonstriert.

Bei 3 handelt es sich um einen Graphen, der den Effekt von Betaseron auf den Einbau von Thymidin in menschliche koronare glatte Muskelzellen sowie menschliche koronare Endothelzellen demonstriert.

Bei 4 handelt es sich um eine Tabelle, die den Effekt von Betaseron (1000 IU/ml) auf den Einbau von Thymidin in unterschiedliche menschliche Zellarten und -stämme (jeder Stamm ist ein Individuum) demonstriert.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Definitionen

Die folgenden Begriffe, wie sie in der Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet werden, weisen, falls nicht anders angegeben, jeweils die im folgenden angegebene Bedeutung auf:

„Interferon-&bgr;" oder „&bgr;-Interferone" umfaßt native und rekombinante Typ-I-Interferone, die die gleichen oder ähnliche pharmazeutische Charakteristika wie die allgemein als Interferon-&bgr;-1a und Interferon-&bgr;-1b bekannten Typ-I-Interferone aufweisen.

„Interferon-&agr;/&bgr;" bezieht sich auf ein nicht definiertes Gemisch aus Typ-I-Interferon-&agr; und Typ-I-Interferon-&bgr;, beispielsweise Ratten-Interferon-&agr;/&bgr;.

„Betaseron" bezieht sich auf das rekombinant produzierte menschliche Interferon-&bgr;, bei dem der Cysteinrest in Position 17 durch Serin ersetzt wurde, d.h. Interferon-&bgr;ser17, wie in der US-Patentschrift Nr. 4,588,585 offenbart und beansprucht.

„Therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich auf diejenige Menge an menschlichem Interferon-&bgr;, insbesondere Betaseron, die bei Verabreichung an einen diese benötigenden Menschen ausreicht, um die wie unten definierte Behandlung für Restenose, insbesondere koronare Restenose, zu bewirken. Die Menge an menschlichem Interferon-&bgr;, welche eine „therapeutisch wirksame Menge" bildet, variiert je nach dem verwendeten menschlichen Interferon-&bgr;, der Schwere der Restenose sowie dem Alter und Körpergewicht des zu behandelnden Menschen, läßt sich jedoch routinemäßig vom Durchschnittsfachmann unter Berücksichtigung seines eigenen Wissens sowie der vorliegenden Offenbarung bestimmen.

„Behandeln" oder „Behandlung", wie hier verwendet, umfaßt die Behandlung der Restenose, insbesondere der koronaren Restenose, in einem Menschen, wobei die Restenose durch die Verhinderung oder Hemmung der Proliferation koronarer glatter Muskelzellen am Ort einer Gefäßverletzung nach Angioplastie, Endarteriektomie oder Arteriektomie gelindert wird.

Demonstration des Nutzens und Verabreichung A. Demonstration des Nutzens

Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Verwendung von Interferon-&bgr; zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhinderung der Restenose, insbesondere der koronaren Restenose. Insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Betaseron zur Behandlung oder Verhinderung der koronaren Restenose. Dieser Nutzen wurde mittels In-vitro-Tests demonstriert, bei denen a) der Einbau von Thymidin (einer notwendigen Komponente der Zellproliferation) in die entsprechenden Zellen, beispielsweise koronare glatte Muskelzellen und koronare Endothelzellen, durch Bestimmung des in den Zellen nach Stimulierung mit Serum in Gegenwart oder Abwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen an Betaseron vorhandenen säureunlöslichen 3H-Thymidins und b) das Wachstum der entsprechenden Zellen als Reaktion auf das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer bestimmten Menge an Betaseron beispielsweise unter Verwendung des Methylenblau-Verfahrens oder des Coulter-Zähler-Verfahrens im zeitlichen Verlauf gemessen wurde. Die Ergebnisse der Tests, wie sie in den 1 bis 4 dargestellt sind, demonstrieren die Fähigkeit des Betaserons, die Proliferation menschlicher koronarer glatter Muskelzellen zu hemmen, während es keinen Hemmeffekt auf die Proliferation koronararterieller Endothelzellen aufweist.

B. Verabreichung

Die Verabreichung von menschlichem Interferon-&bgr;, entweder in reiner Form oder in einer entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzung, läßt sich über einen beliebigen akzeptierten Verabreichungsmodus oder mit einem ähnlichen Nutzen dienenden Mittel durchführen. So kann die Verabreichung beispielsweise oral, nasal, parenteral, topisch, transdermal oder rektal, in Form eines festen, halbfesten, lyophilisierten Pulvers oder flüssigen Dosierungsformen, wie zum Beispiel Tabletten, Zäpfchen, Pillen, weichen elastischen und harten Gelatinekapseln, Pulvern, Lösungen, Suspensionen oder Aerosolen oder dergleichen, vorzugsweise in zur einfachen Verabreichung exakter Dosierungen geeigneten Dosiseinheitsformen, erfolgen. Die Zusammensetzungen enthalten einen herkömmlichen pharmazeutischen Träger- oder Hilfsstoff sowie als den/einen Wirkstoff das menschliche Interferon-&bgr; und können zusätzlich andere medizinische Agentien, Pharmazeutika, Trägerstoffe, Adjuvantien usw. enthalten.

Je nach dem vorgesehenen Verabreichungsmodus enthalten die pharmazeutisch unbedenklichen Zusammensetzungen im allgemeinen etwa 1 Gew.-% bis etwa 99 Gew.-% eines menschlichen Interferon-&bgr; sowie 99 Gew.-% bis 1 Gew.-% eines geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoffs. Vorzugsweise handelt es sich bei der Zusammensetzung um etwa 5 Gew.-% bis 75 Gew.-% eines menschlichen Interferon-&bgr;, wobei der Rest aus geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoffen besteht.

Als Verabreichungsweg ist der parenterale Weg bevorzugt, wobei ein zweckmäßiger Tagesdosierungsplan verwendet wird, der entsprechend des Schweregrads der zu behandelnden Restenose angepaßt werden kann. Für eine derartige parenterale Verabreichung kann eine ein menschliches Interferon-&bgr; enthaltende pharmazeutisch unbedenkliche Zusammensetzung mittels der in den US-Patentschriften Nr. 4,462,940, 4,588,585 und 4,992,271 offenbarten Verfahren gebildet werden.

Als therapeutisch wirksame Tagesdosis zur Behandlung der Restenose eignet sich im allgemeinen eine alle zwei Tage subkutan injizierte Menge von 0,25 mg (8 Millionen IU) Interferon-&bgr;.

Die folgenden spezifischen Beispiele werden als Richtlinie zur Unterstützung bei der praktischen Durchführung der Erfindung bereitgestellt und sollen keine Beschränkung des Umfangs der Erfindung darstellen. Bei den in den folgenden Beispielen verwendeten Zellen handelte es sich um von der Firma Clonetics, Inc. in San Diego, Kalifornien, USA, erhaltene menschliche koronare glatte Muskelzellen und menschliche koronare Endothelzellen.

Beispiel 1

Der folgende In-vitro-Test wurde ausgeführt, um den Effekt des Betaserons auf den Einbau von Thymidin in bestimmten Zellen zu veranschaulichen (siehe z.B. „Cell Culture for Biochemists", R. L. P. Adams, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, Niederlande, 1985).

  • 1) Zellen wurden in 24-Loch-Platten mit einer Dichte von 25000 Zellen/Loch in ihrem normalen Wachstumsmedium (1 ml/Loch) ausgesät. Man ließ die Zellen bis zu einer Konfluenz von 75% in einem Inkubator mit 37°C und 5% CO2 wachsen (dies dauerte ungefähr 72 Stunden).
  • 2) Das Wachstumsmedium wurde dann durch Basalmedium (ohne Serum- oder Wachstumsfaktorzusätze), 1 ml/Loch, ersetzt. Anschließend wurden die Zellen unter diesen Bedingungen 48 Stunden inkubiert.
  • 3) Das Basalmedium wurde dann durch frisches Basalmedium (1 ml/Loch), das mit 5% fötalem Kälberserum (FBS [fetal bovine serum]), 2 mCi/ml 3H-Thymidin (Amersham, Kat.-Nr. TRA61) und nichtradioaktivem Thymidin unter Erhalt einer Thymidin-Gesamtkonzentration von 2 mM ergänzt worden war, ersetzt.
  • 4) Unmittelbar nach dem vorhergehenden Schritt wurde Betaseron in dem entsprechenden Vehikel eingeführt, wobei nicht mehr als 10 ml pro Loch zugegeben wurden.
  • 5) Die Zellen wurden danach 48 Stunden inkubiert.
  • 6) Anschließend wurden die Zellen zweimal (1 ml pro Waschschritt) mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS [phosphate buffered saline]) und danach in zwei Waschschritten (1 ml pro Waschschritt) mit eiskalter 10%iger Trichloressigsäure (TCA [tri-chloroacetic acid]) gewaschen. Dabei beließ man die TCA-Waschlösung jeweils 5 Minuten lang auf den Zellen. Anschließend erfolgte ein Waschschritt (1 ml/Loch) in eiskaltem 100%igem Ethanol. Das Ethanol wurde dann entfernt, und man ließ die Zellen 10 Minuten trocknen.
  • 7) In jedes Loch wurden jeweils 500 ml 1 N KOH gegeben. Anschließend wurden die Platten ca. 2 Stunden bei Umgebungstemperatur bewegt. Die Zellen wurden dann zur Bestätigung, daß sie sich aufgelöst hatten, mikroskopisch untersucht.
  • 8) Anschließend wurden die KOH-Zellextrakte in Szintillationsfläschchen, die jeweils 4,5 ml Szintillationsflüssigkeit Aquasol-2 (Dupont) enthielten, überführt.
  • 9) In jedes Loch wurden jeweils 500 ml 1 N CH3COOH gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde in das entsprechende Szintillationsfläschchen überführt.
  • 10) Die Szintillationsfläschchen wurden verdeckelt, bis zur Klärung geschüttelt, und die Menge an vorhandenem 3H-Thymidin wurde mittels Flüssigkeitsszintillationsspektrometrie bestimmt.

In diesem Test wurden menschliche koronare glatte Muskelzellen und menschliche koronare Endothelzellen aus verschiedenen Individuen (wobei die Individuen jeweils als „Stamm" bezeichnet wurden) getestet, wobei die Ergebnisse dieses Tests in den 3 und 4 dargestellt sind. Wie durch die Ergebnisse demonstriert wurde, hemmte Betaseron die Proliferation koronarer glatter Muskelzellen eines Stamms (d.h. eines Individuums) und wies keinen Effekt oder einen stimulierenden Effekt auf die Proliferation koronarer Endothelzellen aus dem gleichen Stamm auf.

Beispiel 2
  • 1) Der folgende In-vitro-Test wurde ausgeführt, um den Effekt des Betaserons auf das Wachstum bestimmter Zellinien zu veranschaulichen (siehe z.B. „A Rapid and Convenient Assay for Counting Cells Cultured in Microwell Plates: Application for Assessment of Growth Factors", Journal of Cell Science (1989), Bd. 92, S. 513–518).
  • 2) Zellen des zu testenden Gewebes wurden in 24-Loch-Platten mit einer Dichte von 10000 Zellen/Loch in ihrem normalen Wachstumsmedium (1 ml/Loch) ausgesät. Die Zellen wurden dann in einem Inkubator mit 37°C und 5% CO2 24 Stunden inkubiert.
  • 3) Das Wachstumsmedium wurde dann durch Basalmedium (ohne Serum- oder Wachstumsfaktorzusätze), (1 ml/Loch) ersetzt. Anschließend wurden die Zellen unter diesen Bedingungen 48 Stunden inkubiert.
  • 4) Das Basalmedium wurde dann durch frisches Basalmedium (1 ml/Loch), das mit 5% fötalem Kälberserum (FBS) ergänzt worden war, ersetzt.
  • 5) Unmittelbar nach dem vorhergehenden Schritt wurde Betaseron (in dem entsprechenden Lösungsmittel) in jedes Loch gegeben, und zwar nicht mehr als 10 ml pro Loch.
  • 6) Die Zellen wurden dann 1 bis 5 Tage inkubiert, wobei jeden Tag das Wachstum eines kompletten Satzes behandelter Zellen und Kontrollzellen terminiert wurde. Die Termination wurde durch einmaliges Waschen der Zellen mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und anschließender Zugabe von gepuffertem 10%igem Formalin (1 ml/Loch) erreicht. Man ließ das Formalin in den Löchern, und die Platten wurden bis zum Ende des Tests bei 0°C bis 5°C gelagert.
  • 7) Nachdem die letzte Platte fixiert worden war, wurde das Formalin aus allen Platten entfernt, die dann einmal in 10 mM Boratpuffer, pH 8,5 (1 ml/Loch), gewaschen wurden.
  • 8) In jedes Loch wurde Methylenblau (250 ml, 1%) in 10 mM Boratpuffer, pH 8,5, gegeben und 30 Minuten bei Umgebungstemperatur stehengelassen.
  • 9) Das Methylenblau wurde dann entfernt, und die Zellen wurden dreimal in 10 mM Boratpuffer, pH 8,5 (1 ml/Loch), gewaschen.
  • 10) Das von den Zellen zurückgehaltene Methylenblau wurde durch Zugabe von jeweils 500 ml 50% Ethanol/50% 0,1 N HCl in jedes Loch eluiert. Die Platten wurden anschließend 5 Minuten bei Umgebungstemperatur bewegt.
  • 11) Jedem Loch wurde Methylenblau-Zellextrakt (200 ml) entnommen und in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte überführt.
  • 12) Die Absorption (650 nm) wurde in einem Plattenablesegerät abgelesen.

In diesem Test wurden menschliche koronare glatte Muskelzellen und menschliche koronare Endothelzellen getestet, wobei die Ergebnisse dieses Tests in den 1 und 2 dargestellt sind. Wie durch die Ergebnisse demonstriert wurde, wies Betaseron keinen Effekt oder einen stimulierenden Effekt auf das Wachstum menschlicher koronarer Endothelzellen aus einem Stamm sowie einen Hemmeffekt auf das Wachstum koronarer glatter Muskelzellen aus dem gleichen Stamm auf.


Anspruch[de]
  1. Verwendung von menschlichem Interferon-&bgr; zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Verhinderung der Restenose.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Restenose in der Koronararterie vorliegt.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das menschliche Interferon-&bgr; die Proliferation koronarer glatter Muskelzellen hemmt oder verhindert, während es keinen Hemmeffekt auf die Proliferation koronarer Endothelzellen aufweist.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das menschliche Interferon-&bgr; selektiv die Proliferation koronarer glatter Muskelzellen am Ort einer Gefäßverletzung nach einer Angioplastie, Endarteriektomie oder Arteriektomie hemmt.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei dem menschlichen Interferon-&bgr; um Interferon-&bgr;ser17 handelt.
Es folgen 4 Blatt Zeichnungen






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