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Dokumentenidentifikation DE69832290T2 13.07.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001011722
Titel SUBSTRATMATERIALIEN MIT GEBUNDENEN CYTOKIN-STIMULIERENDEN POLYSACCHARIDEN ODER BAKTERIELLEN NUKLEINSÄUREN
Anmelder FMC Biopolymer AS, Drammen, NO
Erfinder ESPEVIK, Terje, N-7036 Trondheim, NO;
SKJAK-BRAEK, Gudmund, N-7016 Trondheim, NO
Vertreter v. Füner Ebbinghaus Finck Hano, 81541 München
DE-Aktenzeichen 69832290
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 13.05.1998
EP-Aktenzeichen 989219258
WO-Anmeldetag 13.05.1998
PCT-Aktenzeichen PCT/NO98/00146
WO-Veröffentlichungsnummer 1998051342
WO-Veröffentlichungsdatum 19.11.1998
EP-Offenlegungsdatum 28.06.2000
EP date of grant 09.11.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.07.2006
IPC-Hauptklasse A61K 39/39(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61K 9/14(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Gegenstand der Erfindung sind Polysaccharide und bakterielle Nukleinsäuren, die zur Stimulation einer Immunantwort fähig sind, und insbesondere Substrat-Materialien, die diese Immunantwort potenzieren. In spezifischen und bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen werden Fragmente mit niedrigem Molekulargewicht von längerkettigen immunstimulierenden Polysacchariden und bakteriellen Nukleinsäuren, die nur eine geringe Bioaktivität aufweisen, im Vergleich zur Ausgangssubstanz, von der sie sich herleiten, ausreichend potenziert, um auf diese Weise ihre Verwendung bei der Substitution für die Ausgangsverbindung zu erlauben.

Es ist bekannt, dass unterschiedliche Uronsäure-Polymere mit einer &bgr;1-4-glykosidischen Verknüpfung dazu in der Lage sind, Monozyten zur Bildung des Tumornekrosefaktors (TNF) über eine CD14-abhängige Weise in der Membran zu stimulieren (Espevik et al., Eur. J. Immunol. 23: 255). Mannuronan (Poly-M) stellt das potenteste der &bgr;1-4-verknüpften Uronsäure-Polymere bei der Induktion der Cytokin-Produktion dar. Die Cytokin-stimulatorische Aktivität von Mannuronan hängt jedoch vom Molekulargewicht des Polymers ab, und eine optimale Cytokin-Induktion wird erhalten, wenn das MG bei 50 000 oder höher liegt (Otterlie et al., Infect. Immun. 61: 1993, Seiten 1917–1925. Es besteht jedoch ein scharfer Abfall der Aktivität bei niedrigeren Molekulargewichten und bei einem Molekulargewicht unter 10 000 g/mol geht alle nützliche Aktivität verloren. Obwohl bei der Injektion von Mannuronan mit hohem Molekulargewicht in die Mäuse keine offensichtlichen toxischen Wirkungen auftreten, ist die Verwendung einer so kleinen wie möglichen Polymergröße für therapeutische Zecke dennoch wichtig, um eine vollständigere und rasche Exkretion des injizierten Materials aus dem Körper zu fördern. Diese Anforderung steht deshalb mit dem Wunsch, die TNF-stimulierende Aktivität zu optimieren, in Widerspruch.

Es ist auch bekannt, dass Lipopolysaccharid (LPS) eine TNF-induzierende Fähigkeit besitzt, die von der dreidimensionalen supramolekularen Struktur abhängt (Rietschel et al., „Bacterial endotoxins properties and structure of biologically active domains", Verlag Chemie, 1988, S. 1). Diese supramolekularen Strukturen hängen von der Menge und der Verteilung der Acylketten in der Lipid A-Region von LPS ab, und wenn Lipid A in einer kubischen oder invertierten hexagonalen Struktur auftritt, wird eine erhöhte Cytokin-Induktion beobachtet, wohingegen eine Lamellenstruktur keine Cytokin-Induktion ergibt.

LPS als solches ist hoch toxisch, es kann aber durch alkalische Hydrolyse zur Bildung eines detoxifizierten LPS (D-LPS), aus dem die Lipid A-Region, bei der es sich um die Hauptursache der Toxizität handelt, entfernt wurde, delipidiert werden. D-LPS weist jedoch nur eine geringe Fähigkeit zur Stimulation von Monozyten zur Bildung von TNF auf, obwohl es einen intakten Polysaccharidanteil beibehält.

Von anderen Gliedern der Familie der Uronsäure-Polymere ist auch bekannt, dass sie Monozyten zur Bildung von TNF oder anderen Cytokinen stimulieren. So besitzt zum Beispiel D-Glucuronsäure (D-Glc-A) diese Eigenschaft, obwohl mit einer geringeren Potenz im Vergleich zu Mannuronan.

Polysaccharide aus Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien, wie zum Beispiel Lipoarabinomannan, Lipoteichonsäure und Peptidoglykane sind auch dafür bekannt, dass sie Cytokine induzieren.

Ein anderes weithin bekanntes immunstimulierendes Polysaccharid stellt Chitosan dar.

Es ist jedoch zur Kenntnis zu nehmen, dass nicht alle Polysaccharide die Fähigkeit zur Stimulation von Monozyten besitzen.

Bestimmte bakterielle Nukleinsäuren bilden eine andere Substanzkategorie mit der Fähigkeit zur Stimulation einer Immunantwort.

Wir haben nunmehr erfindungsgemäß gefunden, dass die Cytokin-induzierende Aktivität vieler immunstimulierender Polysaccharide und bakterieller Nukleinsäuren ebenso wie die Fragmente mit dem niedrigeren Molekulargewicht davon, durch Bindung der Polysaccharide an die Oberflächen eines Substrats verbessert werden kann. Diese überraschende Entdeckung hilft nicht nur, den vorstehend besprochenen Problemen unter Verwendung von Mannuronan und D-LPS, zum Beispiel, bei der Therapie, zu begegnen, sondern erschließt allgemeiner neue Therapiemöglichkeiten, die bisher nicht zur Verfügung standen.

Seljelid et al. vom Institut der Medizinischen Biologie, Universität Tromsø, Norwegen, in Scand. J. Immunol. 25, 55–60, (1987) offenbaren, dass Mäuse mit &bgr;-1,3-D-Glucan derivatisierten Mikroperlen aus Kunststoff gegen Infektionen durch Pneumokokken und E. coli geschützt werden. Diese und andere Wissenschaftler am Institut für Medizinische Biologie haben in der Folge gezeigt, dass diese Schutzwirkung zumindest teilweise durch die Stimulation der Cytokin-Freisetzung veranlasst wird (siehe zum Beispiel Rasmussen et al., Journal of Cellular Biochemistry (1991) 46: 60–68).

Nippon Geka Gakkai Zasshi, 92 (1991) 627, offenbart an Polystyren-Perlen immobilisiertes Lipopolysaccharid (LPS) und seine Anwendung für Antitumorzwecke. Es wurde in Erwägung gezogen, dass an Perlen immobilisiertes LPS Killerzellen über Cytokine induzierte.

US-A 5171 738 offenbart LPS aus den Zellwänden Gram-negativer Bakterien, die auf einen festen, unlöslichen Träger immobilisiert sind und ihre Anwendung bei der Behandlung von Tumoren.

WO-A-97/01330 offenbart Polysaccharid-Phospholipid-Konjugate und ihre Verwendung als mit Antigen geeignet formulierte Adjuvanzien zur Bereitstellung von Vakzinen.

EP-A-0 175667 offenbart eine Makrophagen-stimulatorische Zusammensetzung, enthaltend ein wasserunlösliches &bgr;-1,3-gebundenes Glucan und einen wasserlöslichen Träger, an den das Glucan immobilisiert wurde.

EP-A-0 506 326 offenbart die Verwendung von &bgr;-1,4-Polyuronaten und ihre Verwendung zur Cytokin-Stimulation.

US-A-4460575 offenbart einen Vakzin-Komplex, umfassend bakterielle ribosomale RNA oder Fragmente von bakterieller ribosomaler RNA, an die von 1 bis 5 Gew.-% eines spezifischen Antigens des Bakterientyps gekoppelt sind.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein pharmazeutisch verträgliches Substratmaterial an dessen Oberfläche, eine Cytokin-stimulierende bioaktive Substanz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Polysacchariden, enthaltend von 2 bis 100 Zuckereinheiten mit Ausnahme von &bgr;-1,3-D-Glucan, und bakterielle Nukleinsäuren, enthaltend von 2 bis 100 Zuckereinheiten, chemisch gebunden ist, bereitgestellt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Bereitstellung eines Verfahrens zur Potenzierung der Cytokin-stimulierenden Wirkung eines immunstimulierenden Polysacharids mit Ausnahme von &bgr;-1,3-D-Glucan, oder einer immunstimulierenden bakteriellen Nukleinsäure, worin die genannte bioaktive Substanz mit einem Substrat dergestalt kontaktiert wird, dass sie an eine Oberfläche davon gebunden wird.

Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen Ansatz zum Potenzieren der Cytokin-stimulierenden Aktivität von Polysacchariden und bakteriellen Nukleinsäuren bereit. Insbesondere ist unseres Wissens bisher noch nicht offenbart worden, dass Fragmente mit niedrigerem Molekulargewicht von immunstimulierenden Polysacchariden und bakteriellen Nukleinsäuren, die im Vergleich zu ihrer Ausgangsverbindung nur relativ schlechte Cytokin-stimulierende Eigenschaften aufweisen, mittels ihrer Bindung an die Oberfläche eines wie hierin offenbarten Substrats, ihre Aktivität auf einen Grad erhöht haben können, der die Verwendung der Fragmente anstelle der Ausgangsverbindungen erlaubt. Die Größenordnung der Potenzierung der Cytokin-stimulierenden Aktivität, die erfindungsgemäß erreichbar ist, wird in den nachstehenden Beispielen erläutert.

Die Polysaccharide und Nukleinsäuren enthalten bevorzugt von 10–30 Zuckereinheiten. Polysaccharide, die von 2 bis zu ca. 7 Zuckereinheiten enthalten, werden häufig für Oligomere (Oligosaccharide) gehalten und werden so bezeichnet.

Obwohl die Erfindung, wie bereits angegeben, eine besondere Anwendbarkeit zur Potenzierung von Polysaccharid- und Nukleinsäurefragmenten aufweist, kann sie auch zum Potenzieren der Cytokin-stimulierenden Aktivität der immunstimulierenden Polysaccharide und bakteriellen Nukleinsäuren selbst verwendet werden.

Nach unseren Studien hat es den Anschein, dass die Form und Beschaffenheit des Substrats, das als Träger für das aktive Polysaccharid- oder Nukleinsäurematerial verwendet wird, nicht besonders kritisch ist. Für einige Zwecke ist es wünschenswert, dass das Substrat in partikulärer Form vorliegen sollte, zum Beispiel für die intravenöse oder subkutane Injektion, in anderen Fällen könnte das Substrat aber die Form eines Körpers zur Implantation in vivo annehmen. In noch anderen Fällen könnte es sich bei dem Substrat um ein Material handeln, über das zum Beispiel eine Flüssigkeit zur Erlangung einer Reaktion mit dem gebundenen bioaktiven Material in Kontakt gebracht werden könnte.

Auf ähnliche Weise können viele verschiedene natürliche oder synthetische Materialien als das Substrat verwendet werden. Es versteht sich natürlich von selbst, dass das Substratmaterial keine unerwünschten Reaktionen in der Umgebung, in der es verwendet werden soll, auslösen darf.

In den Experimenten, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben sind, verwendeten wir magnetisch monodisperse Polystyren-Partikel, die durch das von Ugelstad et al. in Progress in Polymer Science, 17, Nr. 1, 87–161 (1992), beschriebene aktive Quellungsverfahren hergestellt werden. Epoxygruppen wurden auf die Oberfläche der Partikel eingeführt und unterschiedliche Mengen von Aminolinkern wurden dann nach dem Verfahren von Hermanson et al. in Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, New York 1992, an die Epoxy-Oberfläche gekoppelt.

Für einige Zwecke wird bevorzugt, dass das Substrat durch Materialien, die in vivo absorbiert werden können, konstituiert werden sollte. Ein weiter Bereich von bioerodierbaren und resorbierbaren Polymeren und anderen festen Materialien sind im Stand der Technik bekannt.

Andere natürliche oder synthetische Materialien, die als das erfindungsgemäße Substrat verwendet werden könnten, werden sich dem Fachmann ohne weiteres selbst anbieten.

Die Größe der Substratpartikel kann, abhängig vom beabsichtigten Endgebrauch, sehr weitgehend variieren. Partikel für die subkutane Injektion weisen zum Beispiel eine Größe von bis zu 50 &mgr;m, bevorzugt aber weniger als 20 &mgr;m auf, obwohl für die intravenöse Injektion die Partikelgröße weniger als 5 &mgr;m betragen sollte. Die Gestalt der als Substratmaterial verwendeten Partikel ist nicht kritisch.

Die bioaktive Polysaccharid- oder Nukleinsäurekomponente kann mit dem Substrat auf viele verschiedene Weisen verknüpft werden. So kann ein Polysaccharid zum Beispiel durch Kopplung über Hydroxylgruppen (liegen in Kohlenhydraten immer vor), Carbonylgruppen, Amingruppen (Aminozucker) und Carboxylgruppen (Uronsäuren) oder über Substituenten, wie zum Beispiel gegebenenfalls Sulfat- oder Phosphatgruppen, kovalent verknüpft sein. Linker für die kovalente Kopplung können gegebenenfalls an eine Substratoberfläche, der es an Gruppen zum Eingehen einer kovalenten Bindung mit der bioaktiven Komponente an Gruppen mangelt, aufgebracht werden.

Einige Beispiele der hierin nützlichen kovalenten Kopplungschemie sind wie folgt:

Carbonyl-reaktive Chemie

Carbonylgruppen, entweder Aldehyde oder Keton an reduzierenden Zuckern.

Aldehydgruppen können anhand der Periodat-Oxidation auch leicht eingeführt werden.

Beispiel: Hydrazid-Aktivierung
Beispiel: Reduktive Aminierung unter Verwendung von Cyanoborhydrid
Hydroxyl-reaktive Chemie

Beispiel: Polysaccharide können mit CNBr aktiviert werden, die dann leicht an jedweden Liganden, der primäre Amine enthält, gekoppelt werden können.

Beispiel: Epoxy-aktivierte Oberflächen reagieren mit Hydroxyl- oder Amingruppen bei hohem pH und sind für die Kohlenhydrat-Kopplung gut geeignet.

Carboxyl-reaktive Chemie

In den nachstehenden Beispielen wird ein auf Carbodiimid basierendes Beispiel beschrieben.

Obwohl die kovalente Kopplung des Polysaccharids oder der Nukleinsäure häufig bevorzugt ist, ist es auch möglich, die bioaktive Komponente nicht kovalent an das Substrat zu binden. So kann die Kopplung zum Beispiel durch ionische oder hydrophobe Interaktionen, oder mittels Biospezifität (z. B. Enzym-Substrat, Antigen-Antikörper) erreicht werden.

Die Dichte des bioaktiven Polysaccharid- oder Nukleinsäurematerials, das auf der Oberfläche der Partikel oder von anderem Substratmaterial gebunden ist, wird in Bezug auf die beabsichtigte Verwendung der sich ergebenden Zusammensetzung ausgewählt.

Im Allgemeinen wird die Dichte im Bereich von 0,1 bis 100 ng/&mgr;m2, bevorzugt im Bereich von 0,1 bis 50 ng/&mgr;m2 liegen.

Es liegen einige Hinweise vor, dass für jedwedes) gegebene Polysaccharid oder Nukleinsäure, eine optimale Dichte vorliegen könnte, um die maximale Cytokin-Bildung zu erreichen; weitere Arbeiten werden jedoch zur Bestätigung benötigt, ob dies der Fall ist oder nicht.

Obwohl wir nicht wünschen, durch Theorie gebunden sein zu wollen, deutet unsere Arbeit darauf hin, dass wenn M-Blöcke oder detoxifiziertes LPS, zum Beispiel an eine Substratoberfläche gebunden sind, zahlreiche Membranrezeptoren aggregiert werden könnten, die bei der Induktion von TFN synergistisch wirken können.

Es wird erwartet, dass die erfindungsgemäßen Substratmaterialien in der Medizin viele Verwendungszwecke finden werden. So können zum Beispiel kurze Blöcke aus Mannuronan, die mit biologisch abbaubaren Partikeln kovalent verknüpft sind, als ein Immunstimulator zur Behandlung verschiedener Krankheitstypen, wie zum Beispiel denen, bei denen Patienten von einer verbesserten Zellimmunität profitieren werden, durch eine erhöhte Cytokinbildung erreicht werden.

Die erfindungsgemäßen Substratmaterialien können weiter als ein Immunstimulator zum Schutz eines sich kurz vor einem großen chirurgischen Eingriff befindenden Patienten vor einer Infektion mit Gram-positiven oder Gram-negativen Bakterien verwendet werden. Eine andere potenzielle Verwendung der vorliegenden Materialien ist die als ein Immunstimulator zum Schutz eines Patienten, der sich in Kürze einer die Knochenmarkszellen schädigenden Strahlentherapie unterziehen wird. Die Verabreichung von zum Beispiel erfindungsgemäßen Poly-M-gebundenen Partikeln führt zu einer verbesserten Hämatopoese.

Die erfindungsgemäßen Substratmaterialien können auch als Targeting von Antikrebsmitteln verwendet werden. Es ist bekannt, dass Tumorzellen Inhibitionsfaktoren für Makrophagen bilden, dies kann aber durch die Verabreichung von zum Beispiel Poly-M-gebundenen Partikeln, die eine stimulierende Wirkung auf Makrophagen ausüben, umgekehrt oder gedämpft werden.

Partikel, an die erfindungsgemäß Polysacharide und bakterielle Nukleinsäuren gebunden sind, können zum Beispiel durch intravenöse oder subkutane Injektion verabreicht werden. Für diesen Zweck können die Partikel mit einem pharmazeutisch verträglichen injizierbaren Träger, zum Beispiel einem physiologischen Puffer, formuliert werden.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele erläutert.

Materialien und Verfahren

Poly-M wurde aus Kolonien von Pseudomonas aeruginosa 8830 auf Agar isoliert, die bei 18°C, wie von Gross et al., J. Phytophatol., 1983, 118: 276, beschrieben, gezüchtet wurden. Mit 14C-markierte Fruktose (Amersham, Buckinghamshire, England) wurde dem Medium als Supplement zugefügt, um das Alginat radioaktiv zu machen. Das Material wurde durch eine wiederholte Kombination aus einer Alkalibehandlung mit 0,2 M NaOH bei 45°C, Präzipitation mit Ethanol und Extraktion des Präzipitats durch Ethanol und Chloroform gereinigt. Das Polymer wurde in pyrogenfreiem Wasser aufgelöst, durch Membranfilter (0,22 &mgr;m; Millipore) filtriert und lyophilisiert. Die LPS-Kontamination in Poly-M wurde mittels dem LAL-Assay (Chromogenix AB, Mölndal, Schweden) gemessen. Der Endotoxin-Spiegel im Polymer betrug < 0,25 ng/mg. Anhand der 1H-NMR-Spektroskopie (Grasdalen et al., Carbohydr. Res. 1979, 68: 23 und Grasdalen, Carbohydr. Res. 1979, 68: 23) wurde bestimmt, dass der Gehalt der Mannuronsäure 92% betrug, und es wurde anhand der Viskosimetrie (Scott-Geräte) bestimmt, dass das durchschnittliche Molekulargewicht 350 000 g/mol betrug. M-Blöcke (94% D-ManA) wurden mittels Hydrolyse von Poly-M 1 h bei 100°C bei pH 5,6 und 1 h bei 100°C bei pH 3,8 hergestellt. Dieses Verfahren ergab M-Blöcke mit einem durchschnittlichen MG von 5500 und 94% D-ManA. Für einige Experimente wurden M-Blöcke mit einem durchschnittlichen MG von 3000 durch zusätzliche Hydrolyse hergestellt.

G-Blöcke (94% L-GulA und Polymerisationsgrad, 27) wurden aus Kolonien von Azotobacter vinelandii, der bei 37°C mit 14C-markierter Fruktose (Skjak-Bræk et al., Carbohydr. Res. 1982, 103: 133) gezüchtet wurde, isoliert. Solche G-Blöcke besitzen keine immunstimulierenden Eigenschaften.

C60XY (&bgr;1-4-verknüpfte Glucuronsäure [D-GlcA] wurde durch Oxidation von Cellulose an Position C-6 (Painter, Corb. Res. 55, 95–103, 1977) hergestellt. Es wurde anhand von intrinsischen Viskositätsmessungen bestimmt, dass das durchschnittliche MG 30 000 betrug und der Oxidationsgrad (88% D-Glc-A und 12% D-Glc wurde mittels Titration bestimmt (Nevell, Methods Carbohydr. Chem. 1963, 3: 161 und Yackel et al., JACS 1942, 64: 121).

Die Endotoxin-Kontamination in den verschiedenen Polysacchariden wurde anhand des Limulus-Amöbocyt-Lysat-Assays (LAL-Assays) (Chromogenix AB, Mölndal, Schweden) gemessen. Die bestimmten Endotoxin-Spiegel waren wie folgt: M-Blöcke: 0,24 ng/mg; Poly-M: 0,25 ng/mg; G-Blöcke: 12,4 ng/mg; C60XY: 1,2 ng/mg.

Lipopolysaccharid und detoxifiziertes LPS (D-LPS) aus glatten Salmonella minnesota wurden von Sigma erworben. D-LPS wurde durch alkalische Deacylierung von LPS durch die Entfernung der Ester-verknüpften Fettsäuren hergestellt (Ding et al., J. Med. Microbiol. 1990, 31: 95).

Die Merkmale der Polysaccharide sind in Tabelle 1 nachstehend zusammengefasst.

Tabelle 1. Merkmale der in dieser Studie verwendeten Polyuronsäuren
  • *) P. a. = Pseudomonas aeruginosa
  • **) A. v. = Azotobacter vinelandii

Kovalente Kopplung von Uronsäuren und D-LPS an Partikel

Magnetische monodisperse Polystyren-Partikel (PS-Partikel) mit Epoxygruppen (Ugelstad et al., Progress in Polymer Science, 1992, 17: 87) wurden wie von Hermanson et al. (Immunobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press 1992) beschrieben, aminiert. In einigen Experimenten wurden hydrophile bovine Serumalbumin-Partikel (BSA, Sigma) gemäß dem von Longo et al. (J. Pharm. Sci. 1992, 71: 1323) beschriebenen Verfahren hergestellt. Uronsäuren und D-LPS wurden an magnetische monodisperse oder BSA-Partikel durch Bildung von Amidbindungen zwischen den Carbonsäure-Gruppen an den Uronsäuren und den Gruppen primärer Amine auf den Partikeln gekoppelt. Die Kopplung wurde in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,3, durch Zufügen von Carbodiimid-EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) und Sulfo-NHS (N-Hydroxysulfosuccinimid) wie von Staros et al. (Anal. Biochem. 1986, 156: 200) beschrieben, durchgeführt. Nach der Verknüpfung des Polysaccharids mit den Partikeln, wurden sie gründlich in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 10, zur Entfernung von nicht kovalent gebundenem Polysaccharid gewaschen. Für einige Experimente wurden aus vernetztem bovinen Serumalbumin hergestellte Partikel hergestellt. Die Mengen von M- und G-Blöcken, die kovalent mit den Partikeln verknüpft wurden, wurden durch Messen der Radioaktivität in einem &bgr;-Zähler (Packard) bestimmt. Die Merkmale der verwendeten Partikel und die Menge von an sie gekoppelten M-Blöcken und G-Blöcken sind in der nachstehenden Tabelle 2 ersichtlich.

Tabelle 2. Merkmale der in dieser Studie verwendeten Perlen und die Menge der kovalent verknüpften M-Blöcke und G-Blöcke
N.B.
= Nicht bestimmt

Monozyten-Kultivierung

Monozyten wurden aus dem Buffy-coat von A+-Blut (Blutbank, Universitätsklinik Trondheim, Norwegen), wie von Bøyum (Scand. J. Immunol. 1976, 5: 9) beschrieben, isoliert. Die Monolayers von Monozyten in 24-Well-Kulturplatten (Costar, Cambridge, MA) wurden in serumfreiem AIM-Medium (Gibco) mit 1% Glutamin und 40 &mgr;m/ml Garamycin kultiviert. Den Monozyten wurden verschiedene Partikel- und Polysaccharid-Konzentrationen in Lösung zugefügt und die Überstände wurden 8 Stunden später geerntet und aus der TNF-Aktivität im WHI-Klon-13-Bioassay untersucht (Espevik et al., J. Immunol. Methods, 1986, 95: 99).

SW480/&bgr;-gal-Kultivierung

Zellen von einem humanen Kolonadenokarzinom, SW480/&bgr;-gal (zur Verfügung gestellt von Dr. Gerald Ranges, Miles Inc. West Haven, CT, USA), enthalten ein &bgr;-Galactosidase-Gen (&bgr;-gal-Gen)) unter Kontrolle der unmittelbar frühen Promotor/Enhancer-Region des Cytomegalovirus (CMV) (Galloway et al., Eur. J. Immunol 1992, 22: 305). SW480/&bgr;-gal wurden in RPMI 1640 (Gibco Laboratories, Paisley, Schottland), supplementiert mit 2 mM L-Glutamin, 10% hitzeinaktiviertem FCS (HyClone, Logon, UT, USA) und 40 &mgr;g/ml Garamycin (FCS-Medium), gezüchtet. Die Stimulation mit partikulären und löslichen Formen von M-Blöcken und verschiedenen Formen von LPS wurde in RPMI 1640-Medium, supplementiert mit Glutamin, 20% humanem A+-Serum (Blutbank, Universitätsklinik von Trondheim, Trondheim, Norwegen) und Garamycin (A+-Medium), durchgeführt. Der &bgr;-Galactosidase-Assay wurde im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt (Loegreid et al., J. Biol. Chem. 1995. 270: 25418). Die Substrat-Umwandlung wurde als optische Dichte (OD) bei 570 nm gemessen.

TNF-Assay

Die TNF-Aktivität wurde durch Messen ihrer cytotoxischen Wirkung auf die Fibrosarcoma-Zelllinie WEHI 164 Klon 13, wie von Espevik et al. (J. Immunol. Methods 1986, 95: 99) beschrieben, bestimmt. Verdünnungen von rekombinantem humanem TNF (zur Verfügung gestellt von Dr. Refaat Shalaby, Genentech, South San Francisco, CA) wurden als ein Standard eingeschlossen. Die TNF-Spezifität des Assays wurde unter Verwendung eines neutralisierenden MAk gegen rekombinanten humanen TNF verifiziert (Liabakk et al., J. Immunol. Methods, 1990, 134: 253). Die Ergebnisse werden als pg/ml ± SD für Dreifachbestimmungen vorgelegt.

Beispiel 1

Der Zweck dieses Experiments war das Testen, ob die TNF-induzierende Potenz von Poly-M durch seine Form beeinflusst wurde.

Radiomarkiertes Poly-M mit einem MG von 350 000 wurde mittels Säurehydrolyse durch das vorstehend beschriebene Verfahren abgebaut, um Polysaccharid-Fragmente (M-Blöcke) mit einem MG von 5,5 kD zu erhalten. Die sich ergebenden M-Blöcke wurden durch das vorstehend beschriebene Verfahren mit den beiden Typen von Polystyren-Partikeln, nämlich PS 2 und PS 3 kovalent verknüpft (siehe Tabelle 2 vorstehend).

Die TNF-induzierende Potenz der beiden Partikel-gebundenen M-Blöcke wurde dann durch den vorstehend beschriebenen TNF-Assay bestimmt und mit dem der nicht verknüpften M-Blöcke und auch mit nicht hydrolysiertem Poly-M in phosphatgepufferter Kochsalzlösung verglichen. Die Ergebnisse sind in 1A ersichtlich.

Wie aus 1A hervorgeht, reduzierte die Reduktion der Polymergröße auf 5,5 kD die TNF-induzierende Potenz um einen Faktor von 10–100. Die kovalente Verknüpfung der M-Blöcke von 5,5 kD mit PS 2- oder PS 3-Partikeln führte jedoch im Vergleich zu den löslichen M-Blöcken zu einer 2500- bzw. 60 000fachen Erhöhung der TNF-induzierenden Potenz. Im Vergleich zu Poly-M in Lösung potenzierte auch die Verknüpfung von M-Blöcken mit Partikeln die TNF-Response.

Das Experiment wurde wiederholt, wobei aber die Aminogruppen an den Partikeln durch Carboxylgruppen substituiert wurden. Es wurde festgestellt, dass diese Substitution die TNF-Freisetzung aus Monozyten nicht änderte. Dies deutet folglich darauf hin, dass die stimulatorische Wirkung von mit Partikeln verknüpften M-Blöcken nicht durch eine negative Nettoladung an den Partikeln oder eine nicht spezifische Reaktion aufgrund des Kopplungsverfahrens verursacht wurde.

Vergleichsbeispiel 1

Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei aber die G-Blöcke von 5,5 kD, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurden. Die Ergebnisse sind in 1B ersichtlich.

In 1B ist ersichtlich, dass G-Blöcke in Lösung oder mit PS 2-Partikeln verknüpft, nicht die Monozyten zur Bildung von TNF induzieren.

Dieses Experiment weist darauf hin, dass die Bindung eines inhärent keine Fähigkeit zum Stimulieren einer Immunantwort aufweisenden Polysaccharids an ein Substrat, keine Wirkung auf dieses Merkmal der Substanz besitzt.

Beispiel 2

Der TNF-Assay wurde an LPS und detoxifiziertem LPS (die beide von Sigma bezogen wurden) wiederholt. Die Reagenzien wurden als Lösungen zugefügt. Wie in Beispiel 1 wurden M-Blöcke als Kontrolle verwendet.

Wie in 2A ersichtlich ist, wurde festgestellt, dass das detoxifizierte LPS (D-LPS) bis zu 1 &mgr;g/ml die Monozyten zur Bildung von TNF nicht induzierte, wohingegen das unbehandelte LPS eine starke TNF-Response ergab, wenn auf Monozyten in Lösung unter serumfreier Bedingung getestet wurde.

Wenn das D-LPS erfindungsgemäß jedoch kovalent mit PS 1-Partikeln verknüpft wurde (siehe Tabelle 2 vorstehend) und der TNF-Assay wiederholt wurde, wurde festgestellt, dass im Vergleich mit den Partikeln des M-Blocks von Beispiel 1 (2B) eine starke Bildung von TNF stattfand.

Da die Molekulargewichte von M-Blöcken und dem D-LPS vergleichbar sind, und da das D-LPS auch mit den Partikeln durch Aminbindungen verknüpft war, deutet dies darauf hin, dass die Menge von gebundenem D-LPS gleich oder weniger als die Menge der an die Partikel gebundenen M-Blöcke ist. Die Daten zeigen folglich, dass Fragmente mit niedrigerem MG aus Polysacchariden sehr potente TNF-Induktoren darstellen, wenn sie auf Monozyten auf der Oberfläche von Partikeln gerichtet werden.

Vergleichsbeispiel 2

Die SW480-&bgr;gal-Zellen exprimieren nicht CD14 in der funktionellen Membran, sondern reagieren auf LPS in Gegenwart von Serum. Es war deshalb von Interesse zu untersuchen, ob D-LPS oder M-Blöcke, erfindungsgemäß entweder in Lösung oder mit Partikeln verknüpft, zur Aktivierung dieser Zellen fähig waren. Wie von 3A ersichtlich ist, ergab das komplette LPS eine starke und dosisabhängige Aktivierung des humanen CMV-Promotors in den SW480-&bgr;gal-Zellen, wohingegen D-LPS oder M-Blöcke in Lösung keinen stimulatorischen Effekt aufwiesen. Der M-Block und das D-LPS, die an PS 1-Polystyren-Partikel gebunden waren, wiesen außerdem keine stimulatorische Wirkung auf diesen Zelltyp auf (3B). Diese Daten deuten darauf hin, dass M-Block- und D-LPS-Partikel eine Präferenz bei der Stimulation CD14-positiver Monozyten in der Membran und keine LPS-responsiven Zellen aufweisen, denen CD14 in der Membran mangelt.

Beispiel 3

Der TNF-Assay wurde mit einem anderen Glied der Uronsäure-Familie, D-Glucuronsäure-Polymer (D-GlcA-Polymer) wiederholt. Von solchen Polymeren ist bekannt, dass sie Monozyten zur Bildung von TNF in einer CD14-abhängigen Weise, obwohl mit weniger Potenz im Vergleich zu Poly-M, stimulieren.

Ein aus 88% D-GlcA und 12% D-Glc und mit einem MG von 30 000 bestehendes Polymer wurde durch Oxidation der Cellulose mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens hergestellt.

Der TNF-Assay wurde erfindungsgemäß sowohl am D-GlcA-Polymer in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1–2 ml/mg) als auch am kovalent an PS 2-Partikel gebundenen Polymer durchgeführt. Die Ergebnisse sind grafisch in 4 dargestellt.

Es wird zur Kenntnis genommen werden, dass das D-GlcA-Polymer in Lösung zu einer geringen TNF-Bildung führte. Das an die PS 2-Polystyren-Partikel gebundene D-GlcA zeigte jedoch eine deutliche Zunahme der TNF-Bildung.

In 4 sind die Ergebnisse für die M-Blöcke für Vergleichszwecke gezeigt.

Beispiel 4

Der Zweck dieses Experiments bestand im Testen, ob die TNF-stimulierende Aktivität durch Mannuronan-Fragmente von sehr niedrigem Molekulargewicht gezeigt würde, wenn sie erfindungsgemäß kovalent an bioabsorbierbare Partikel gebunden wären.

Der TNF-Assay wurde deshalb an M-Blöcken mit einem MG von ca. 3 000, die wie hierin vorstehend hergestellt wurden, wiederholt. Das sich ergebende Oligomer mit niedrigem Molekulargewicht wurde mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens an BSA-Partikel (siehe Tabelle 2 vorstehend) kovalent gebunden. Die Ergebnisse des TNF-Assays auf das Partikel-gebundene Oligomer sind in 5 ersichtlich.

Aus 5 wird ersichtlich sein, dass das Zufügen löslicher M-Blöcke zu Monozyten selbst bei einer Konzentration von 100 &mgr;g/ml nicht zur Bildung von TNF führte. Das Zufügen von erfindungsgemäßen M-Block-BSA-Partikeln führte jedoch zu mehr als 1 ng/ml TNF bei einer 0,02 &mgr;g/ml entsprechenden Polymer-Konzentration. Selbst bei einer 0,004 &mgr;g/ml entsprechenden Polymer-Konzentration trat eine signifikante TNF-Bildung auf.


Anspruch[de]
  1. Pharmazeutisch verträgliches Substratmaterial an dessen Oberfläche eine Cytokin-stimulierende bioaktive Substanz chemisch gebunden ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Polysacchariden, die von 2 bis 100 Zuckereinheiten mit Ausnahme von &bgr;-1,3-D-Glucan enthalten, und bakterielle Nukleinsäuren, die von 2 bis 100 Zuckereinheiten enthalten.
  2. Substratmaterial nach Anspruch 1, worin die genannte bioaktive Substanz ein Polysaccharid darstellt, das von 2 bis 100 Zuckereinheiten enthält.
  3. Substratmaterial nach Anspruch 2, worin das genannte Polysaccharid von 10 bis 30 Zuckereinheiten enthält.
  4. Substratmaterial nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die genannte bioaktive Substanz ein 1–4 verknüpftes Uronsäure-Polymer darstellt.
  5. Substanzmaterial nach Anspruch 4, worin die genannte bioaktive Substanz aus mehr als 80% Mannuronsäureresten besteht.
  6. Substratmaterial nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die genannte bioaktive Substanz detoxifiziertes Lipopolysaccharid darstellt.
  7. Substratmaterial nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das genannte Substrat in der Form von Partikeln vorliegt.
  8. Substratmaterial nach Anspruch 7, worin die genannten Partikel eine Größe bis zu 50 &mgr;m aufweisen.
  9. Substratmaterial nach Anspruch 8, worin die genannten Partikel eine Größe bis zu 5 &mgr;m aufweisen.
  10. Substratmaterial nach einem der Ansprüche 7 bis 9, worin die genannten Partikel Oberflächen-modifizierte Polystyren-Partikel oder Albumin-Partikel darstellen.
  11. Substratmaterial nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die genannte bioaktive Substanz kovalent an die genannte Substratoberfläche gekoppelt ist.
  12. Pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Injektion geeignet ist, umfassend eine Substratmaterial nach einem der Ansprüche 7 bis 10 und einen pharmazeutisch verträglichen injizierbaren Träger dafür.
  13. Verfahren zum Potenzieren der Cytokin-stimulierenden Wirkung einer immunstimulierenden bioaktiven Substanz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Polysacchariden, die von 2 bis 100 Zuckereinheiten mit Ausnahme von &bgr;-1,3-D-Glucan enthalten, und bakterielle Nukleinsäuren, die von 2 bis 100 Zuckereinheiten enthalten, worin die genannte bioaktive Substanz mit einem pharmazeutisch verträglichen Substrat kontaktiert wird, um auf diese Weise an eine Oberfläche davon chemisch gebunden zu werden.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die genannte bioaktive Substanz wie nach einem der Ansprüche 2 bis 6 definiert ist.
  15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, worin das genannte Substrat wie nach einem der Ansprüche 7 bis 10 definiert ist.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, worin die genannte bioaktive Substanz mit der genannten Substratoberfläche kovalent verknüpft ist.
Es folgen 8 Blatt Zeichnungen






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