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Dokumentenidentifikation DE69927021T2 13.07.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001084250
Titel ENZYM
Anmelder Rothamsted Research Ltd., Harpenden, Hertfordshire, GB
Erfinder THOMAS, Gregory, Stephen, Bristol BS8 1TH, GB;
HEDDEN, Peter, Bristol BS8 1TH, GB;
PHILLIPS, Leonard, Andrew, Bristol BS8 1TH, GB
Vertreter Zenz, Helber, Hosbach & Partner GbR, 45128 Essen
DE-Aktenzeichen 69927021
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 11.06.1999
EP-Aktenzeichen 999570708
WO-Anmeldetag 11.06.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/GB99/01857
WO-Veröffentlichungsnummer 1999066029
WO-Veröffentlichungsdatum 23.12.1999
EP-Offenlegungsdatum 21.03.2001
EP date of grant 31.08.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 13.07.2006
IPC-Hauptklasse C12N 15/29(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 15/82(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 9/02(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 5/10(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Enzym, das an der Kontrolle von Pflanzenwachstum beteiligt ist, die DNA-Sequenzen die das Enzym codiert und Verwendungen der Nucleotidsequenz die das Enzym codiert bei der Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbesserten oder veränderten Wachstumseigenschaften.

Gibberelline (GAs) sind eine große Gruppe von Diterpenoidcarbonsäuren, die in allen höheren Pflanzen und einigen Pilzen vorkommen. Bestimmte Mitglieder der Gruppe fungieren als Pflanzenhormone und sind an vielen Entwicklungsprozessen, einschließlich Samenauskeimung, Stängelverlängerung, Blattverlängerung, Blütenbeginn und -entwicklung und dem Wachstum der Samen und der Frucht beteiligt. Die biologisch aktiven GAs sind für gewöhnlich C19-Verbindungen, welche ein 19-10-Lacton, eine C-7-Carbonsäure und eine 3&bgr;-Hydroxylgruppe enthalten. Die späteren Phasen ihrer Biosynthese schließen das oxidative Entfernen von C-20 und die Hydroxylierung am C-3 ein. Die Hydroxylierung an der 2&bgr;-Position führt zur Produktion von biologisch inaktiven Produkten. Diese Reaktion ist die wichtigste Route für den GA-Stoffwechsel in Pflanzen und stellt sicher, dass sich die aktiven Hormone nicht in Pflanzengeweben ansammeln. Die GA biosynthetischen Enzyme 7-Oxidase, 20-Oxidase, 3&bgr;-Hydroxylase und 2&bgr;-Hydroxylase sind alles 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen. Diese stellen eine große Gruppe von Enzymen dar, für welche 2-Oxoglutarat ein Co-Substrat ist, das als Teil der Reaktion zu Succinat decarboxyliert wird (siehe Review durch Hedden, P. und Kamiya, Y., in Annu. Rev. Plant Physio. Plant Mol. Biol. 48 431–460 (1997)).

Chemische Regulatoren des Pflanzenwachstums werden im Gartenbau und der Landwirtschaft seit vielen Jahren verwendet. Viele dieser Verbindungen funktionieren, indem sie die GA-Konzentration in Pflanzengeweben ändern. Zum Beispiel hemmen Wachstumsverzögerer die Aktivität von Enzymen, die an der GA-Biosynthese beteiligt sind und reduzieren dadurch den GA-Gehalt. Diese Chemikalien werden häufig verwendet, um beispielsweise das Umlegen bei Getreide zu verhindern und das Wachstum von Zier- und Gartenpflanzen zu kontrollieren. Umgekehrt können GAs bei Pflanzen angewendet werden – wie bei der Anwendung von GA3 auf samenlose Trauben – um die Größe und die Form der Beere zu verbessern und auf Gerstenkorn, um die Malzproduktion zu verbessern. Mischungen aus GA4 und GA7 werden auf Äpfel angewendet, um die Fruchtqualität zu verbessern und auf bestimmte Nadelbäume, um die Zapfenproduktion zu stimulieren. Es gibt mehrere Probleme in Zusammenhang mit der Verwendung von Wachstumsregulatoren. Einige der Wachstumsverzögerer sind sehr langlebig im Boden, wodurch es schwierig wird, nach einer behandelten Anbauplanze andere Anbaupflanzen anzubauen. Andere wiederum erfordern wiederholte Anwendungen, um den erwünschten Effekt aufrechtzuerhalten. Es ist schwierig, die Anwendung auf die Zielpflanzenorgane zu beschränken, ohne dass es zu einer Ausbreitung auf andere Organe oder Pflanzen kommt, wodurch unerwünschte Effekte auftreten können. Eine genaue Zielbestimmung bei der Anwendung von Wachstumsregulatoren kann sehr arbeitsintensiv sein. Eine nicht-chemische Option für die Kontrolle der Pflanzenmorphologie ist daher äußerst wünschenswert.

In Entwicklung befindliche Samen enthalten oft hohe Konzentrationen an GAs und relativ große Mengen an GA-biosynthetischen Enzymen. Reife Samen der Stangenbohne (Phaseolus coccineus) enthalten extrem hohe Konzentrationen des 2&bgr;-Hydroxy-GA, GA8, als ihr Glucosid, wodurch angezeigt wird, dass ein hohes Mass an 2&bgr;-Hydroxylaseaktivität vorhanden sein müssen. Dies wurde für die verwandte Spezies Phaseolus vulgaris bestätigt, bei der ein schneller Anstieg an GA-2&bgr;-Hydroxylaseaktivität kurz bevor die Samen volle Reife erlangen, verzeichnet wird (Albone et al., Planta 177 108–115 (1989)). 2&bgr;-Hydroxylasen wurden teilweise aus den Kotyledonen (Keimblätter) von Pisum sativum (Smith, V. A. und MacMillan, J., Planta 167 9–18 (1983)) und Phaseolus vulgaris (Griggs et al., Phytochemistry 30 2507–2512 (1991) und Smith, V. A. und MacMillan, J., J. Plant Growth Regul. 2 251–264 (1984)) gereinigt. Diese Studien zeigten, dass es Beweise dafür gab, dass für beide Quellen mindestens zwei Enzyme mit unterschiedlichen Substratspezifizitäten vorhanden sind. Zwei Aktivitäten aus Kotyledonen von imbibiertem P. vulgaris waren durch Kationenaustauschchromatographie und Gelfiltration trennbar. Die Hauptaktivität, die einem Enzym mit Mr 26.000 durch Größenausschluss-HPLC entspricht, hydroxylierte GA1 und GA4 vorzugsweise zu GA9 und GA20, während GA9 das bevorzugte Substrat für das zweite Enzym war (Mr 42.000). Versuche, die Enzymaktivität zu reinigen, um N-terminale Informationen für die Aminosäuresequenzierung zu erhalten, erwiesen sich jedoch aufgrund der geringen Abundanz des Enzyms in den Pflanzengeweben in Bezug zu anderen Proteinen und der Co-Reinigung eines kontaminierenden Lectins mit der Enzymaktivität als nicht machbar, wodurch eine N-terminale Aminosäuresequenzierung unmöglich gemacht wurde.

Die Regulierung von Gibberellin-Deaktivierung wurde bei Pisum sativum (Gartenerbse) unter Anwendung von sln(Slender)-Mutation untersucht, wie bei Ross et al. (The Plant Journal 7 (3) 513–523 (1995)) berichtet. Die sln-Mutation blockiert die Deaktivierung von GA20, welches der Vorläufer des bioaktiven GA1 ist. Die Ergebnisse dieser Studien wiesen darauf hin, dass das sln-Gen ein regulatorisches Gen sein könnte, welches die Expression von zwei getrennten strukturellen Genen kontrolliert, die an der GA-Deaktivierung beteiligt sind, nämlich der Oxidierung von GA20 zu GA29, durch 2&bgr;-Hydroxylierung am C-2, gefolgt von weiterer Oxidierung der Hydroxylgruppe zu einem Keton (GA29 zu einem GA29-Kataboliten). Die Umwandlung von GA29 zu einem GA29-Kataboliten in Erbsensamen wurde durch Prohexadioncalcium, einem Inhibitor von 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen (Nakayama et al. Plant Cell Physiol. 31 1183–1190 (1990)), gehemmt, was darauf hinwies, dass die Reaktion durch ein Enzym dieser Art katalysiert wurde. Obwohl sich erwies, dass die Slender-(sln)-Mutation bei Erbsen sowohl die Umwandlung von GA20 zu GA29 und von GA29 zu einem GA29-Kataboliten in Samen blockiert, wies die Unfähigkeit von unmarkiertem GA20, die Oxidierung von radioaktiv markiertem GA29 zu hemmen und umgekehrt, darauf hin, dass die Schritte durch getrennte Enzyme katalysiert wurden. Ferner hemmt die Slender-Mutation in Sprossgeweben die 2&bgr;-Hydroxylierung von GA20, aber nicht die Bildung von GA29-Katabolit. Diese Beobachtungen führen zu der Theorie, dass zwei getrennte Enzyme an diesem Stoffwechselweg beteiligt waren, der die Deaktivierung von GA in Pflanzen kontrolliert (Hedden, P. und Kamiya, A., in Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48 431–460 (1997)).

Es wurde nun jedoch überraschenderweise festgestellt, dass ein einzelnes Enzym, in der Tat, diese unterschiedlichen Reaktionen katabolisieren kann. Die vorliegende Erfindung stellt die erste berichtete Klonierung einer cDNA dar, welche eine GA-2&bgr;-Hydroxylse codiert, die auf C19-GAs wirkt und bei der die 2&bgr;-Hydroxylierung ihre einzige Hydroxylaseaktivität ist. Ein cDNA-Klon aus Kürbissamen codiert ein Enzym, das sowohl 2&bgr;- als auch 3&bgr;-Hydroxylaseaktivitäten (Lange et al. Plant Cell 9 1459–1467 (1997)) aufweist, aber dessen Hauptaktivität die 3&bgr;-Hydroxylierung ist und wobei es als eine 2&bgr;-Hydroxylase nur mit Tricarbonsäure(C20)-Substraten agiert; es führt keine 2&bgr;-Hydroxylierung von C19-GAs durch. Da das neue Enzym der vorliegenden Erfindung sowohl die &bgr;-Hydroxylierung als auch eine weitere Oxidierung der substituierten Hydroxylgruppe zu einer Ketongruppe am C-2 katalysiert, wurde das Enzym als eine „GA-2-Oxidase" benannt.

Gemäß eines ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung wird eine isolierte, gereinigte oder rekombinante Nucleinsäuresequenz bereitgestellt, die ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym codiert, das eine Nucleinsäuresequenz, wie sie in 1 gezeigt wird, oder ein funktionelles Derivat davon oder ihren Komplementärstrang oder eine homologe Sequenz dazu aufweist.

Ein Nomenklatursystem für die GA-Biosynthese-Gene wurde nun eingeführt (Coles et al. The Plant Journal 17(5) 547–556 (1999). Bezugnahmen in der vorliegenden Anmeldung auf das Gibberellin-2-Oxidase-Gen von Phaseolus coccineus sind auch als Bezug auf PcGA2ox1 zu verstehen. Bezugnahmen in der vorliegenden Anmeldung auf die Gibberellin-2-Oxidase-Gene von Arabidopsis thaliana als at-2bt3, at-2bt24 und T31E10.11 sind auch als Bezug auf AtGA2ox1, AtGA2ox2 bzw. AtGA2ox3 zu verstehen.

Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung, welche eine Gibberellin-2-Oxidase (GA-2-Oxidase) codieren, sind 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen, welche eine Hydroxylgruppe am C-2&bgr; in GAs einführen, insbesondere C19-GAs, einschließlich der bioaktiven GAs wie GA1 und GA4. Sie können auch die 2&bgr;-hydroxylierten GAs weiter oxidieren, um GA-Kataboliten hervorzubringen, welche eine Ketonfunktion am C-2 aufweisen. Die Lactonbrücke dieser Kataboliten können auch geöffnet werden, um eine C-19-Carbonsäure und eine Doppelbindung am C-10 zu erzeugen. Die Aktivität der 2-Oxidasen führt zu einer Deaktivierung von bioaktiven GAs oder zur Umwandlung von biosynthetischen Vorläufern aktiver GAs zu Produkten, die nicht in bioaktive Formen umgewandelt werden können. Eine bevorzugte Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung codiert daher ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym, das in der Lage ist, C19-Gibberellinverbindungen durch die Einführung einer Hydroxylgruppe am C-2&bgr; zu oxidieren. Das Enzym kann auch die 2&bgr;-Hydroxylgruppe zu einer Ketongruppe oxidieren. Bevorzugte Substrate von Gibberellin-2-Oxidasen der vorliegenden Erfindung sind GA9, GA4, GA20 und GA1.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann der Identitätsgrad zwischen Aminosäuresequenzen mindestens 40%, geeigneter Weise 50% oder höher sein, z.B. 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95%. Auf der Nukleotidebene kann der Identitätsgrad mindestens 50%, geeigneter Weise 60% oder höher, z.B. 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% oder 95% sein. Eine homologe Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung kann daher eine Sequenzidentität wie oben beschrieben aufweisen. Die Sequenzhomologie kann unter Verwendung jeglichen passenden verfügbaren Protokolls bestimmt werden, zum Beispiel mit Hilfe von Clustal XTM von der Universität Straßburg und den Identitätstabellen, die mit GenedocTM (Karl B. Nicholas) erzeugt wurden.

Im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung sind auch Nucleinsäuresequenzen enthalten, welche zu einer Sequenz gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung unter stringenten Bedingungen hybridisieren, oder eine Nukleinsäuresequenz, welche zu einer solchen Sequenz homolog ist oder unter stringenten Bedingungen zu einer solchen hybridisieren würde, wäre da nicht die Entartung des genetischen Codes, oder eine Olignucleotidsequenz, die für jegliche solche Sequenz spezifisch ist.

Stringente Hybridisierungsbedingungen können durch geringe Salzkonzentrationen oder Bedingungen mit hoher Temperatur gekennzeichnet sein. Zum Beispiel können hoch stringente Bedingungen definiert werden, als eine Hybridisierung zu DNA, die an einen festen Träger gebunden ist in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C, und als Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C (Ausubel et al Hrsg. „Current Protocols in Molecular Biology" 1, Seite 2.10.3, veröffentlicht von Green Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., New York (1989)). Unter gewissen Umständen können weniger stringente Bedingungen erforderlich sein. So wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, können moderat stringente Bedingungen als Bedingungen definiert werden, die Waschen in 0,2 × SSC/0,1% SDS bei 42°C aufweisen (Ausubel et al (1989) supra). Die Hybridisierung kann auch durch die Zugabe von zunehmenden Mengen an Formamid stringenter gemacht werden, um den Hybridnucleinsäureduplex zu destabilisieren. Somit können bestimmte Hybridisierungsbedingungen leicht manipuliert werden und werden im Allgemeinen gemäß den gewünschten Ergebnissen ausgewählt. Im Allgemeinen liegen passende Hybridisierungstemperaturen bei der Anwesenheit von 50% Formamid bei 42°C für eine Sonde, die zu 95 bis 100% mit der Ziel-DNA homolog ist, bei 37°C für eine 90 bis 95% Homologie und bei 32°C für eine 70 bis 90% Homologie.

Ein Beispiel einer bevorzugten Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung ist eine Sequenz, welche ein Enzym codiert, das die Aktivität eines Gibberellin-2-Oxidase-Enzyms von Phaseolus coccineus (zum Beispiel PcGA2ox1) oder eines gleichwertigen Proteins eines anderen Mitglieds der Fabaceae-Familie aufweist. Eine Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann auch ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym aus Phaseolus vulgaris oder aus Arabidopsis thaliana codieren (zum Beispiel AtGA2ox1, AtGA2ox2 oder AtGAox3).

Andere Nucleinsäuresequenzen gemäß dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung können auch eine Nucleinsäuresequenz wie zuvor definiert aufweisen, bei der die Codiersequenz wirksam mit einem Promotor verbunden ist. Der Promotor kann für die Expression in einer bestimmten Pflanzenzelle oder einem bestimmten Pflanzengewebe konstitutiv und/oder spezifisch sein, zum Beispiel in Wurzeln unter Verwendung von Tabak-RB7 (Yamamoto et al. Plant Cell 3 371–382 (1991)); in grünen Geweben unter Verwendung von Tomaten-rbcS-3A (Ueda et al. Plant Cell 1 217–227 (1989)); in teilenden Zellen unter Verwendung von Mais-Histon H3 (Brignon et al. Plant Mol. Biol. 22 1007–1015 (1993)) oder Arabidopsis CYC07 (Ito et al. Plant Mol. Biol. 24 863–878 (1994)); in Pflanzenmeristem unter Verwendung von Arabidopsis KNAT1 (Lincoln et al. Plant Cell 6 1859–1876 (1994)); in Gefäßgewebe unter Verwendung von Bohnen GRP1.8 (Keller, B. & Heierli, D., Plant Mol. Biol. 26 747–756 (1994)); in Blüten unter Verwendung von Arabidopsis ACT11 (Huang et al. Plant Mol. Biol. 33 125–139 (1997)) oder Petunia-Chalconsynthase (Vandermeer et al. Plant Mol. Biol. 15 95–109 (1990)); im Stempel unter Verwendung von Kartoffel-SK2 (Ficker et al. Plant Mol. Biol. 35 425–431 (1997)); im Staubbeutel unter Verwendung von Brassica TA29 (Deblock, M. & Debrouwer, D., Planta 189 218–225 (1993)); in Obst unter Verwendung von Tomaten-Polygalacturonase (Bird et al. Plant Mol. Biol. 11 651–662 (1988)). Alternative Promotoren können aus Pflanzenviren gewonnen werden, zum Beispiel dem Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotor (CaMV). Geeignete Promotorensequenzen können Promotorensequenzen aus Pflanzenspezies einschließen, zum Beispiel aus der Familie Brassicaceae.

Die vorliegende Erfindung erstreckt sich daher auch auf eine isolierte, gereinigte oder rekombinante Nucleinsäuresequenz, welche einen Promotor aufweist, der auf natürliche Weise die Expression eines Gens antreibt, welches ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym codiert, das eine Nucleinsäuresequenz, wie in 1 gezeigt, oder ein funktionelles Derivat davon oder ihren Komplementärstrang oder eine dazu homologe Sequenz aufweist. Das Gibberellin-2-Oxidase-Enzym kann ein Phaseolus coccineus (zum Beispiel PcGA2ox1) oder ein gleichwertiges Protein eines anderen Mitglieds der Fabaceae-Familie sein. Solche Nucleinsäuresequenzen können auch ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym aus P. vulgaris oder A. thaliana (zum Beispiel AtGA2ox1, AtGa2ox2 oder AtGa2ox3) codieren. Vorzugsweise weist die Nucleinsäuresequenz einen Promotor auf, der die Expression eines Gibberellin-2-Oxidase-Enzyms aus P. coccineus, P. vulgaris oder A. thaliana steuert. Solche Promotorensequenzen schließen Promotoren ein, die natürlicher Weise 5' zur Codiersequenz der in 1 gezeigten Sequenz vorkommen. Promotoren können auch so ausgewählt werden, dass sie die Nucleinsäure, die das Gibberellin-2-Oxidase-Gen codiert, konstitutiv überexprimieren. Promotoren, die durch interne oder externe Faktoren induziert werden, wie beispielsweise Chemikalien, Pflanzenhormone, Licht oder Stress, könnten verwendet werden. Beispiele sind die pathogeneseverwandten Gene, die durch Salicylsäure, kupferkontrollierbare Expression (Mett et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90 4567–4571 (1993)) und tetracyclinregulierte Genexpression (Gatz et al. Plant Journal 2 397–404 (1992)) induziert werden können. Beispiele für Gibberellin-induzierbare Gene sind &ggr;-TIP (Phillips, A. L. & Huttly, A. K., Plant Mol. Biol. 24 603–15 (1994)) und GAST (Jacobsen, S. E. & Olszewski, N. E., Planta 198 78–86 (1996)). Gibberellin 20-Oxidase-Gene werden durch GA herunter reguliert (Phillips et al. Plant Physiol. 108 1049–1057 (1995)), wobei ihr Promotor, der an die GA-2-Oxidase-ORF gekoppelt ist, auch in diesem Aspekt der Erfindung Anwendung finden kann.

Gibberellin-2-Oxidase-Enzyme, die durch Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung codiert werden, können geeigneter Weise dazu dienen, die 2&bgr;-Oxidierung eines C19-Gibberellinmoleküls zu katalysieren, um eine Hydroxylgruppe am C-2 einzuführen, gefolgt von weiterer Oxidierung, um das Ketonderivat zu ergeben.

Die Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung kann auch für RNA codieren, die zu der normalerweise in einer Pflanzenzelle vorhandenen RNA in Gegensinn ist, oder kann für RNA codieren, die in der Lage ist, RNA, die normalerweise in einer Pflanzenzelle vorhanden ist, zu spalten. Infolgedessen stellt die vorliegende Erfindung auch eine Nucleinsäuresequenz bereit, die ein Ribozym codiert, das zu einer spezifischen Spaltung von RNA in der Lage ist, die durch ein Gibberellin-2-Oxidase-Gen codiert wird. Eine solche ribozymcodierende DNA würde im Allgemeinen bei der Hemmung der Deaktivierung von Gibberellinen, insbesondere C19-GAs, nützlich sein.

Nucleinsäuresequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung können ferner 5' Signalsequenzen aufweisen, um die Expression des exprimierten Proteinproduktes zu lenken. Solche Signalsequenzen können auch zielgerichtete Protein-Sequenzen enthalten, die ein exprimiertes Protein zu einer bestimmten Stelle innerhalb oder außerhalb einer Wirtszelle lenken, welche eine solche Nucleinsäuresequenz exprimiert. Alternativ dazu kann die Nucleinsäuresequenz auch ein 3' Signal, wie ein Polyadenylierungssignal oder ein anderes regulatorisches Signal, aufweisen.

Die vorliegende Erfindung bietet somit deutliche Vorteile für die Landwirtschaft in der Bereitstellung von Nucleinsäuresequenzen, um den Stoffwechsel der Gibberellinpflanzenhormone zu regulieren. Die Regulierung könnte entweder darin bestehen, das Pflanzenwachstum zu hemmen, indem die Wirkung der Gibberellin-2-Oxidase gefördert wird, oder das Pflanzenwachstum zu fördern, indem die Deaktivierung von Gibberellin durch Gibberellin-2-Oxidase verhindert wird. Zum Beispiel kam es im Jahr 1997 bei ungefähr 15% des angebauten Weizens und 30% der Gerstenernte im Vereinigten Königreich zu einem Umlegen, wodurch den Landwirten Kosten in der Höhe von ungefähr 100 Millionen Pfund entstanden. Die Verfügbarkeit von umlegeresistenten Getreidesorten mit kürzeren, stärkeren Stielen infolge von reduziertem GA-Gehalt kann von beträchtlichem finanziellem Nutzen sein.

Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Gegensinn-Nucleinsäuresequenz bereitgestellt, die einen transkribierbaren DNA-Strang enthält, der zu mindestens einem Teil des DNA-Strangs komplementär ist, der natürlich in einem Gen transkribiert ist, das ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym codiert, wie z.B. Gibberellin-2-Oxidase-Enzyme aus P. coccineus, P. vulgaris oder A. thaliana. Zu Bevorzugte Gene gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten PcGA2ox1, AtGA2ox1, AtGA2ox2 und AtGA2ox3.

Die Gegensinn-Nucleinsäure und die ribozymcodierende Nucleinsäure, die oben beschrieben wurden, sind Beispiel eines allgemeineren Prinzips: Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird eine DNA bereitgestellt, die (zum Beispiel durch ihre Expression) eine selektive Unterbrechung der geeigneten Expression der Gibberellin-2-Oxidase-Gene – oder in bevorzugten Ausführungsformen des P. coccineus-Gens PcGA2ox1, hervorruft.

Gemäß eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes, gereinigtes oder rekombinantes Polypeptid bereitgestellt, das ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym mit einer Aminosäuresequenz, wie in 2 gezeigt, aufweist.

Rekombinante DNA gemäß der Erfindung kann die Form eines Vektors aufweisen. Der Vektor kann zum Beispiel ein Plasmid, Cosmid, Phage oder ein künstliches Chromosom sein. Die Vektoren werden häufig einen oder mehrere selektierbare Marker aufweisen, um die Auswahl von Zellen zu ermöglichen, die mit ihnen transfiziert (oder transformiert: Die beiden Begriffe werden in dieser Anmeldung austauschbar verwendet) sind, und vorzugsweise, um die Auswahl von Zellen zu ermöglichen, die Vektoren mit heterologer DNA enthalten. Geeignete „Start"- und „Stopp"-Signale werden im Allgemeinen vorhanden sein. Zusätzlich – falls der Vektor zur Expression gedacht ist – werden ausreichende regulatorische Sequenzen vorhanden sein, um die Expression zu lenken; die DNA gemäß der Erfindung wird jedoch im Allgemeinen in Pflanzenzellen exprimiert werden und so wäre die mikrobielle Wirtsexpression nicht unter den primären Zielen der Erfindung, obwohl dies nicht ausgeschlossen wird (wie zum Beispiel bei bakteriellen oder Hefewirtszellen). Vektoren, die keine regulatorischen Sequenzen enthalten, sind als Klonierungsvektoren nützlich.

Klonierungsvektoren können in E. coli oder in einen anderen geeigneten Wirt eingeführt werden, der ihre Manipulation erleichtert. Gemäß eines anderen Aspektes der Erfindung wird eine mit einer Nukleinsäuresequenz transfizierte oder transformierte Wirtszelle bereitgestellt, wie oben beschrieben. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Bereitstellung von Enzymen durch Expression von GA-2-Oxidase-cDNAs in heterologen Wirten, wie Escherichia coli, Hefen, die Stämme von Saccharomyces cerevisiae enthalten oder Insektenzellen, die mit einem Baculovirus infiziert wurden, welcher rekombinante DNA enthält. Die Enzyme könnten für die Erzeugung von 2&bgr;-hydroxylierten GAs und GA-Kataboliten oder für die Herstellung von Antikörpern verwendet werden, die gegen GA-2-Oxidasen gezüchtet werden. Die Wirtszelle kann auch eine geeignete Pflanzenzelle in einer Pflanzenzellenkultur oder ein Teil eines Kallus sein.

Nucleinsäuresequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung können durch jedes geeignete Verfahren hergestellt werden, bei dem aufeinanderfolgende Nucleotide miteinander gekoppelt und/oder Oligo- und/oder Polynucleotide ligiert werden, einschließlich zellfreier In-Vitro-Verfahren, wobei jedoch die rekombinante DNA-Technologie das Verfahren der Wahl darstellt.

Schließlich werden Nucleinsäuresequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung in Pflanzenzellen mit Hilfe eines beliebigen geeigneten Mittels eingeführt. Gemäß eines abermals anderen Aspektes der Erfindung wird eine Pflanzenzelle bereitgestellt, die eine Nucleinsäuresequenz gemäß der Erfindung wie oben beschrieben enthält.

Vorzugsweise werden Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung in Pflanzenzellen durch Transformation unter Verwendung des binären Vektors pLARS120, einer modifizierten Version von pGPTV-Kan (Becker et al. Plant Mol. Biol. 20 1195–1197 (1992)), bei der das &bgr;-Glucuronidase-Reportergen durch den Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotor von pBI220 ersetzt wird (Jefferson, R. A., Plant Mol. Biol. Rep. 5 387–405 (1987)), eingeführt. Diese Plasmide können dann in Agrobacterium tumefaciens durch Elektroporation eingeführt und danach in die Wirtszelle über ein Vakuumfiltrationsverfahren übertragen werden. Alternativ dazu kann die Transformation durch Verwendung eines unschädlich gemachten Ti-Plasmidvektors erzielt und von Agrobacterium durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren getragen werden, zum Beispiel wie in EP-A-0116718 und EP-A-0270822 beschrieben. Wo Agrobacterium unwirksam ist, könnte die fremde DNA direkt in die Pflanzenzellen unter alleiniger Verwendung eines elektrischen Entladegerätes eingeführt werden, wie zum Beispiel bei der Transformation von monokotyledonen Pflanzen. Jedes andere Verfahren, das eine stabile Aufnahme der Nucleinsäuresequenz innerhalb der nuklearen DNA oder mitochondrialen DNA irgendeiner Pflanzenzelle gewährleistet, wäre auch geeignet. Dazu gehören Pflanzenspezies, die noch nicht zu genetischer Transformation fähig sind.

Vorzugsweise enthalten Nucleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung zum Einführen in Wirtszellen auch ein zweites chimäres Gen (oder „Markergen"), das ermöglicht, dass eine transformierte Pflanze, welche die fremde DNA enthält, leicht von anderen Pflanzen unterschieden werden kann, welche die fremde DNA nicht enthalten. Beispiele eines solchen Markergens schließen antibiotische Resistenz (Herrera-Estrella et al EMBO J. 2 987–995 (1983)), Herbizidresistenz (EP-A-0242246) und Glucuronidase(GUS)-Expression (EP-A-0344029) ein. Die Expression des Markergens wird vorzugsweise durch einen zweiten Promotor kontrolliert, der die Expression in Zellen in allen Entwicklungsphasen ermöglicht, so dass die Gegenwart des Markergens in allen Regenerationsphasen der Pflanze bestimmt werden kann.

Eine vollständige Pflanze kann von einer einzelnen transformierten Pflanzenzelle ausgehend regeneriert werden, so dass die Erfindung daher transgene Pflanzen (oder Teile von diesen, wie z.B. Vermehrungsmaterial, d.h. Protoplasten, Zellen, Kalli, Gewebe, Organe, Samen, Embryos, Eizellen, Zygoten, Knollen, Wurzeln usw.) bereitstellt, die Nucleinsäuresequenzen gemäß der Erfindung wie oben beschrieben enthalten. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sollte beachtet werden, dass der Begriff „transgen" nicht so auszulegen ist, dass er sich nur auf einen wie oben definierten Organismus bezieht, der in seiner Keimlinie eines oder mehrere Gene von einer anderen Spezies enthält, obwohl viele dieser Organismen ein solches Gen oder solche Gene enthalten werden. Vielmehr bezieht sich der Begriff in einem weiteren Sinne auf jeglichen Organismus, dessen Keimlinie einem technischen Eingriff durch rekombinante DNA-Technologie unterzogen wurde. So ist zum Beispiel ein Organismus, in dessen Keimlinie ein endogenes Gen gelöscht, dupliziert, aktiviert oder modifiziert wurde, ein transgener Organismus im Sinne der vorliegenden Erfindung, genauso wie ein Organismus, zu dessen Keimlinie eine exogene DNA-Sequenz hinzugefügt worden ist.

Bevorzugte Pflanzenspezies schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – monokotyledone Pflanzen ein, einschließlich Samen und Nachkommenschaften oder Propagule davon, zum Beispiel Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Triticale, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale und Setaria. Besonders nützliche transgene Pflanzen sind Mais, Weizen, Gerstenpflanzen und Samen davon. Dikotylodene Pflanzen liegen ebenfalls im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, wobei bevorzugte transgene Pflanzen – ohne darauf beschränkt zu sein – die Spezies Fabaceae, Solanum, Brassicaceae, insbesondere Kartoffeln, Bohnen, Kohl, Waldbäume, Rosen, Klematis, Ölsamenraps, Sonnenblumen, Chrysantheme, Weihnachtsstern und Antirrhinum (Löwenmaul) einschließen.

Das Durchsuchen von Pflanzenzellen, Gewebe und Pflanzen auf die Anwesenheit von spezifischen DNA-Sequenzen kann durch eine Southern-Analyse durchgeführt werden, wie in Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Ausgabe (1989)) beschrieben. Diese Durchsuchung kann auch mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) durch auf dem Fachgebiet wohl bekannte Techniken durchgeführt werden.

Die Transformation von Pflanzenzellen schließt das Trennen von transformierten Zellen von jenen Zellen ein, welche nicht transformiert worden sind. Ein praktisches Verfahren für eine solche Trennung oder Auswahl besteht darin, in das Material, das in die transformierte Zelle eingeführt werden soll, ein Gen für einen Auswahlmarker aufzunehmen. Als Folge werden nur jene Zellen, die erfolgreich transformiert wurden, das Markergen enthalten. Das Translationsprodukt des Markergens wird dann ein phänotypisches Merkmal übertragen, welches die Auswahl ermöglicht. Für gewöhnlich hat das phänotypische Merkmal die Fähigkeit, in der Gegenwart eines chemischen Wirkstoffes, wie eines Antibiotikums, z.B. Kanamycin, G418, Paromomycin usw., zu überleben, welcher einem Selektionsmedium beigemengt ist. Einige Beispiele für Gene, welche eine Antibiotikaresistenz übertragen, schließen zum Beispiel jene ein, die für Neomycin-Phosphotransferase-Kanamycinresistenz (Velten et al. EMBO J. 3 2723–2730 (1984)), Hygromycinresistenz (van den Elzen et al. Plant Mol. Biol. 5 299–392 (1985)), das Kanamycinresistenz(NPT II)-Gen, das von Tn5 abgeleitet wird (Bevan et al Nature 304 184–187 (1983); Mc Bride et al. Plant Mol. Biol. 14 (1990)), und Chloramphenicol-Acetyltransferase codieren. Das PAT-Gen, das in Thompson et al. (EMBO J. 6 2519–2523 (1987)) beschrieben wird, kann zur Übertragung von Herbizidresistenz verwendet werden.

Ein Beispiel eines Genes, das vorrangig als selektionierbaren Marker in einer Gewebekultur zur Identifizierung von Pflanzenzellen nützlich ist, welche genetisch konstruierte Vektoren enthalten, ist ein Gen, das ein Enzym codiert, das ein chromogenes Produkt erzeugt. Ein Beispiel ist das Gen, das für die Erzeugung von &bgr;-Glucuronidase (GUS) codiert. Die Verwendung dieses Enzyms ist weit verbreitet, und seine Herstellung und Verwendung werden bei Jefferson (Plant Mol. Biol. Reporter 5 387–405 (1987)) beschrieben.

Sobald die transformierten Pflanzenzellen auf dem Auswahlmedium kultiviert wurden, werden überlebende Zellen für eine weitere Untersuchung und Manipulation ausgewählt. Die Auswahlverfahren und Materialien sind Fachleuten wohl bekannt, wodurch es möglich ist, überlebende Zellen auszuwählen, mit einer hohen Vorhersehbarkeit, dass die ausgewählten Zellen erfolgreich mit exogener DNA transformiert worden sind.

Nach der Transformation der Pflanzenzelle oder Pflanze unter Verwendung von beispielsweise dem Agrobacterium Ti-Plasmid, können diese Pflanzenzellen oder Pflanzen, die durch das Ti-Plasmid transformiert wurden, so dass das Enzym exprimiert ist, durch einen geeigneten phänotypischen Marker ausgewählt werden. Diese phänotypischen Marker schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – Antibiotikaresistenz ein. Andere phänotypische Marker sind auf dem Fachgebiet bekannt und können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Positive Klone werden unter Befolgen von auf dem Fachgebiet wohl bekannten Verfahren regeneriert. Danach werden transformierte Pflanzen auf die Anwesenheit der erwünschten Eigenschaften und/oder das Ausmaß, in dem die gewünschten Eigenschaften exprimiert sind, hin evaluiert. Eine erste Evaluierung kann zum Beispiel den Grad der bakteriellen Resistenz/Pilzresistenz der transformierten Pflanzen, die stabile Vererbbarkeit der gewünschten Eigenschaften, Feldversuche und dergleichen einschließen.

Zu Illustrationszwecken und in zusammenfassender Weise zeigt die nachstehende Aufstellung ein typisches Verfahren, durch welches transgenes Pflanzenmaterial, einschließlich vollständiger Pflanzen, hergestellt werden kann. Das Verfahren kann als ein fünf stufiges Verfahren betrachtet werden:

  • (1) Zuerst wird aus einer geeigneten Quelle eine DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das eine GA-2-Oxidase-Aktivität aufweist, isoliert oder mit Hilfe von bekannten Verfahren synthetisiert.
  • (2) Die DNA-Sequenz wird in einer 5' nach 3'-Richtung mit Pflanzenexpressionssequenzen, wie zuvor definiert, wirksam verbunden.
  • (3) Das Konstrukt von Schritt (2) wird mit Hilfe von bekannten Verfahren in Pflanzenmaterial transformiert und darin exprimiert.
  • (4) Durchsuchen des gemäß Schritt (3) behandelten Pflanzenmaterials auf Anwesenheit einer DNA-Sequenz, welche ein Protein codiert, das Gibberellin-2-Oxidaseaktivität aufweist; und
  • (5) wahlweises Regenerieren des gemäß Schritt (3) transformierten Pflanzenmaterials zu einer vollständigen Pflanze.

Die vorliegende Erfindung umfasst somit auch transgene Pflanzen und die geschlechtliche und/oder ungeschlechtlichte Nachkommenschaft davon, welche mit einer rekombinanten DNA-Sequenz gemäß der Erfindung transformiert wurden. Die Regeneration der Pflanze kann durch ein beliebiges bekanntes praktisches Verfahren aus einem geeigneten Vermehrungsmaterial erfolgen, das entweder wie oben beschrieben hergestellt oder aus einem solchen Material gewonnen wurde.

Der Ausdruck „ungeschlechtliche oder geschlechtliche Nachkommenschaft von transgenen Pflanzen" schließt per Definition gemäß der Erfindung alle Mutanten und Varianten, die durch bekannte Verfahren erhalten werden können, zum Beispiel durch Zellfusion oder Mutantenauswahl, und welche noch immer die charakteristischen Eigenschaften der ursprünglichen transformierten Pflanze aufweisen, zusammen mit allen Kreuz- und Fusionsprodukte des transformierten Pflanzenmaterials ein.

Eine weiteres Ziel der Erfindung betrifft das Vermehrungsmaterial von transgenen Pflanzen. Das Vermehrungsmaterial von transgenen Pflanzen wird in Bezug auf die Erfindung als jegliches Pflanzenmaterial definiert, das geschlechtlich in vivo oder in vitro vermehrt werden kann. Insbesondere bevorzugt werden innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung Protoplasten, Zellen, Kalli, Gewebe, Organe, Samen, Embryos, Eizellen, Zygoten, zusammen mit allen anderen Vermehrungsmaterial, das aus transgenen Pflanzen erhalten wird.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung eines Antikörpers, der gegen mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz von Gibberellin-2-Oxidase gezüchtet wird.

Ein solcher Antikörper ist bei der Durchsuchung einer cDNA-Bibliothek in geeigneten Vektoren nützlich, die aus der Pflanzengewebe-RNA gewonnen wurden.

Das Gibberellin-2-Oxidase-Gen gemäß der Erfindung ist bei der Modifikation von Wachstums- und Entwicklungsprozessen in transgenen Pflanzen nützlich. Ein weiterer wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist daher ihre Verwendung bei der Herstellung von transgenen Pflanzen oder Samen, in denen die Gibberellin-2-Oxidase konstitutiv überexprimiert wird, um die Konzentration von bioaktiven Gibberellinen (GAs) in den Pflanzen oder Samen zu reduzieren. Bevorzugte Gibberellin-2-Oxidase-Gene schließen PcGA2ox1, AtGA2ox1, AtGA2ox2 und AtGA2ox3 ein. Solche transgenen Pflanzen, welche die GA-2-oxidase überexprimieren, würden Pflanzen ähneln, die mit Wachstumsverzögerern behandelt wurden. Die Erfindung könnte daher verwendet werden, um das vegetative Wachstum zu reduzieren, zum Beispiel bei der Vermeidung von Umlegen bei Getreidearten, einschließlich Reis, und bei der Verbesserung des Kornertrags, die Vermeidung von Umlegen bei Ölsamenraps und bei der Verbesserung der Hüllenstruktur, der Verbesserung der Sämlingsqualität für die Transplantation, der Reduktion des Wachstums von Nutzgräsern, der Reduktion von Sprossenwachstum in Obstgärten und Zierbäumen, der Herstellung von Zierpflanzen mit kompakteren Wachstumseigenschaften, der Verbesserung von Kälte-, Dürre- und Infektionstoleranz, der Ertragssteigerung durch Diversion von Assimilaten von vegetativen zu reproduktiven Organen, der Vermeidung von Schossen in Rosettenpflanzen wie Zuckerrübe, Kopfsalat, Kohlgewächse und Spinat. Die Erfindung kann auch verwendet werden, um männliche und/oder weibliche Sterilität durch Expression in floralen Organen herbeizuführen, um ein Sprießen vor der Ernte in Getreide zu vermeiden, um das Sprossenwachstum bei Heckenpflanzen zu reduzieren, um die Entwicklung oder Keimung von Samen reversibel zu hemmen und das Sprossenwachstum von kommerziellen Holzarten zu reduzieren.

Die Überexpression der Nucleinsäuresequenzen, welche Gibberellin-2-Oxidase codieren, kann erreicht werden, indem DNA-Konstrukte, die konstitutive Promotoren und nucleinsäurecodierende Sequenzen enthalten, in transgenen Pflanzen verwendet werden, die durch rekombinante DNA-Technologie erzeugt wurden. Alternativ dazu kann die Überexpression mit Hilfe der Technik homologer Rekombination erzielt werden, um in den Nucleus einer Zelle einen konstitutiven Promotor stromaufwärts von einer normalerweise stummen Kopie der Nucleinsäuresequenz der vorliegenden Erfindung einzufügen.

Die vorliegende Erfindung stellt in einem zusätzlichen Aspekt auch die Verwendung einer zuvor definierten Nucleinsäuresequenz bei der Herstellung von transgenen Pflanzen und/oder Samen bereit, in denen die Expression von endogenen GA-2-Oxidase-Genen in transgenen Pflanzen reduziert (d.h. zum Verstummen gebracht) wird, beispielsweise durch die Expression von Gegensinn-Kopien der endogenen GA-2-Oxidase-DNA-Sequenzen, die Expression von gestutzten Kopien -sense- des endogenen Gens (Co-Suppression) oder die Verwendung von synthetischen Ribozymen, die auf die endogenen Transkripte abzielen. Bevorzugte Gibberellin-2-Oxidase-Gene gemäß dieses Aspektes der Erfindung schließen PcGA2ox1, AtGA2ox1, AtGA2ox2 und AtGA2ox3 ein.

Dies würde zu Pflanzen mit reduziertem Umsatz und somit erhöhten Konzentrationen von bioaktiven GAs führen. In dieser Form könnte die Erfindung zum Beispiel verwendet werden, um den Fruchtsatz und das Wachstum in kernlosen Trauben, Zitrusfrüchten und Birnen zu verbessern, die Hauttextur und die Fruchtform bei Äpfeln zu verbessern, die Stiellänge und somit den Ertrag beim Zuckerrohr zu erhöhen, den Ertrag und die Frühzeitigkeit bei Sellerie und Rhabarber zu erhöhen, die Malzerträge und die Qualität bei Getreide, insbesondere Gerste, zu verbessern. Sie könnte auch verwendet werden, um das Wachstum bei Holzarten zu erhöhen.

Bevorzugte Merkmale des zweiten und der folgenden Aspekte der Erfindung sind mutatis mutandis wie für den ersten Aspekt.

Die Erfindung wird nun ferner unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Zeichnungen beschrieben, die lediglich zu erläuternden Zwecken bereitgestellt werden und sollten nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung ausgelegt werden. In diesen Beispielen wird auf etliche Zeichnungen Bezug genommen, wobei:

1 die Nucleotidsequenz des P. coccineus 2-Oxidase-cDNA-Klons pc-2boh.dna (PcGA2ox1) mit der Codierungsregion bei den Resten 68–1063nt (332 Aminosäuren) zeigt;

2 die deduzierte Aminosäuresequenz für die P. coccineus Nucleotidsequenz (PcGA2ox1), die in 1 dargestellt ist, zeigt;

3 die DNA-Sondensequenzen für A. thaliana Sonde T3 (3a) und Sonde T24 (3b) zeigt;

4 die zwei Hauptwege der Gibberellin(GA)-Biosynthese zeigt;

5 die partielle-Nucleotidsequenz für A. thaliana Klon at-2bt3 (AtGA2ox1) mit der Codierungsregion bei den Resten 41–1027nt (329 Aminosäuren) zeigt;

6 die deduzierte Aminosäuresequenz für A. thaliana Klon at-2bt3 (AtGA2ox1) zeigt;

7 die partielle-Nucleotidsequenz für A. thaliana Klon at-2bt24 (AtGA2ox2) mit der Codierungsregion bei den Resten 109–1131nt (341 Aminosäuren) zeigt;

8 die deduzierte Aminosäuresequenz für A. thaliana Klon at-2bt24 (AtGA2ox2) zeigt;

9 die Nucleotidsequenz für den A. thaliana genomischen Klon T31E10.11 (AtGA2ox3) zeigt;

10 die deduzierte Aminosäuresequenz für den genomischen Klon T31E10.11 (AtGA2ox3) zeigt;

11 ein Foto von transformierten Arabidopsis-Pflanzen zeigt (Ökotyp Columbia), die P. coccineus GA-2-Oxidase-cDNA unter Kontrolle eines CaMV-35S-Promotors exprimieren, einschließlich einer transformierten Pflanze, die keinen Phänotypen aufweist (ganz rechts).

Beispiel 1. Isolierung eines cDNA-Klons, der GA-2&bgr;-Hydroxylase aus Phaseolus coccineus codiert

Ein cDNA-Klon, der eine GA-2&bgr;-Hydroxylase codiert, wurde aus Phaseolus-Coccineus-Embryos isoliert, indem eine cDNA-Bibliothek auf die Expression von funktionellen Enzymen so wie nachstehend angeführt durchsucht wurde. Die RNA wurde aus den Kotyledonen von reifen Phaseolus-Coccineus-Samen gemäß Dekker et al. (1989) extrahiert. Poly(A)+ mRNA wurde durch Chromatographie auf Oligo(dT)-Zellulose gereinigt. Die cDNA wurde aus 5 &mgr;g Poly(A)+ mRNA unter Verwendung eines direktionalen cDNA-Synthesekits (&lgr;-ZAP II cDNA-Synthesekit, Stratagene) synthetisiert. Die cDNA wurde in &lgr;-ZAP-II-Arme ligiert, unter Verwendung von Gigapack Gold III (Stratagene) verpackt, und 1 × 106 rekombinante Klone wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers vervielfältigt.

Ein Phagemid-Stock wurde aus einer Phaseolus-Coccineus-cDNA-Bibliothek (1 × 109 pfu) gemäß des In-Vivo-Exzisionsprotokolls des Herstellers (Stratagene) hergestellt. Für die primäre Durchsuchung wurden E. coli SOLR mit dem Phagemid-Stock gemäß den Anweisungen des Herstellers (Stratagene) infiziert, was zu ungefähr 11.000 koloniebildenden Einheiten (cfu) führte. Diese wurden in 48 Vertiefungen (6 × 8 Feld) einer Mikrotiterplatte (Vertiefungsvolumen = 3,5 ml) aufgeteilt und durch Wachstum über Nacht bei 37°C, bei Schütteln in 0,5 ml 2 × YT-Brühe, ergänzt mit 50 &mgr;g/ml Kanamycin und 100 &mgr;g/ml Carbenicillin vervielfältigt.

Aliquote Anteile (20 &mgr;l) aus den sechs Vertiefungen in jeder Reihe und von den acht Vertiefungen in jeder Spalte wurden kombiniert, um 14 Pools zu ergeben und jeweils zu 10 ml 2YT-Brühe hinzugegeben, ergänzt um 50 &mgr;g/ml Kanamycin und 100 &mgr;g/ml Carbenicillin und bei 37°C unter Schütteln bis zu einer OD 600 nm von 0,2 bis 0,5 gezüchtet. Die Kulturen wurden danach auf einen 30°C Schüttelinkubator übertragen, und es wurde die rekombinante Fusionsprotein-Produktion durch die Zugabe von IPTG zu 1 mM induziert. Die Kulturen wurden 16 Stunden lang induziert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation (3000 g × 10 Min) pelletiert und in 750 &mgr;l Lysepuffer (100 mM Tris HCl pH-Wert 7,5, 5 mM DTT) resuspendiert. Die Bakterien wurden durch Sonifikation (3 × 10 s) lysiert, und die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation 10 Minuten lang in einer Microfuge pelletiert. Die Überstände wurden auf GA-2&bgr;-Hydroxylaseaktivitäten, so wie unten beschrieben, untersucht. Die Zelllysate aus den gepoolten Bakterien von Reihe 6 (R6) und Spalte 1 (C1) waren in der Lage, die Freisetzung von 3H2O aus [1,2-3H2]GA4 und [2,3-3H2]GA9 zu katalysieren. Für die sekundäre Durchsuchung wurden Bakterien aus der Vertiefung R6C1 auf 2YT Agarplatten aufgetragen, mit 100 &mgr;g/ml Carbenicillin und 50 &mgr;g/ml Kanamycin ergänzt wurden und 16 Stunden lang bei 37°C gezüchtet. Einhundert Einzelkolonien wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und in 5 ml 2 × YT-Brühe übertragen, die 100 mg/ml Carbenicillin und 50 mg/ml Kanamycin enthielt, und unter Schütteln 16 Stunden lang bei 37°C gezüchtet. Die Kulturen wurden in einem 10 × 10 Raster angeordnet, und Pools wurden aus jeder Reihe und jeder Spalte induziert und auf GA-2&bgr;-Hydroxylaseaktivität überprüft, wie oben beschrieben. Die Reihen 2 und 9 und die Spalten 7 und 10 waren in der Lage, die Freisetzung von 3H2O aus [1,2-3H2]GA4 und [2,3-3H2]GA9 zu katalysieren. Die Kulturen 27 und 90 erwiesen sich als für diese Aktivität verantwortlich. Der putative GA-2&bgr;-Hydroxylase-Klon wurde als 2B27 bezeichnet.

Plasmid-DNA, die aus dem Klon 2B27 unter Verwendung des Promega-SV-Miniprep-Kit isoliert wurde, wurde unter Verwendung des Amersham-Taq-Zyklus-Sequenzierkits mit den M13-Universal(-20) und Umkehrsequenzierungsprimern sequenziert. Die Kettenendprodukte, die aus den Sequenzierreaktionen hergestellt wurden, wurden unter Verwendung eines automatisierten Applied Biosystems 373A-Sequenzierers analysiert. Die Sequenzanalyse erfolgte unter Verwendung des Programms Sequencer 3.0 von der Gene Codes Corporation. Weitere Nucleotid- und Proteinsequenzanalysen wurden unter Verwendung der University of Wisconsin Genetics Computer Group Programmreihe durchgeführt.

Beispiel 2. Untersuchungen der GA-2-Oxidaseaktivität

GA-2&bgr;-Hydroxylaseaktivität wurde, durch Messung der Freisetzung von 3H2O aus einem 2&bgr;-tritierten GA-Substrat bestimmt, wie von Smith und MacMillan (Smith, V. A. und MacMillan, J. in J. Plant Growth Regulation 2 251–264 (1984)) beschrieben. Das bakterielle Lysat (90 &mgr;l) wurde mit [1,2-3H2]GA4 oder [2,3-3H2]GA9 (ca. 50000 dpm) in der Gegenwart von 4 mM 2-Oxoglutarat, 0,5 mM Fe(II)SO4, 4 mM Ascorbat, 4 mM DTT, 1 mg/ml Catalase, 2 mg/ml BSA in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 100 &mgr;l inkubiert. Die Mischung wurde 60 Minuten lang bei 30°C inkubiert. Die tritierten GAs wurden durch Zugabe von 1 ml aktivierter Holzkohle (5 w/v) und anschließendes 5 Minuten langes Zentrifugieren in einer Mikrofuge entfernt. Aliquote Anteile (0,5 ml) des Überstandes wurden mit 2 ml Szintillationsflüssigkeit gemischt, und die Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung bestimmt.

Um die Funktion der cDNA-Expressionsprodukte zu bestätigen, wurde das bakterielle Lysat mit [17-14C]GAs in der Gegenwart von Cofaktoren, wie oben beschrieben, inkubiert. Nach dem Inkubieren wurden Essigsäure (10 &mgr;l) und Wasser bei einem pH-Wert von 3 (140 &mgr;l) hinzugefügt, und die Mischung wurde 10 Minuten lang bei 3000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert. Der Überstand wurde durch HPLC mit On-Line-Strahlungsüberwachung analysiert und die Produkte durch GC-MS identifiziert, wie zuvor beschrieben (MacMillan et al. Plant Physiol. 113 1369–1377 (1997)).

Beispiel 3. Klonierung von cDNAs, die GA-2-Oxidase codieren, aus Arabidopsis thaliana

Die vorhergesehene Proteinsequenz des Klons 2B27 wurde verwendet, um die Genomic Survey Sequences Datenbank beim National Centre for Biological Information (ncbi.nlm.nih.gov) unter Zuhilfenahme des TblastN-Programms zu durchsuchen. Zwei genomische Arabidopsis-Sequenzen, T3M9-Sp6 und T24E24TF, zeigten eine hohe Aminosäuresequenzidentität mit der 2B27-Sequenz. Oligonucleotidprimer wurden auf der Grundlage der T3M9-Sp6 genomischen Sequenzen konstruiert:

T24E24TF-Sequenzen:
und in PCR-Reaktionen mit genomischer Arabidopsis-DNA als Matritze verwendet. Die PCR-Reaktionen bestanden aus 200 ng genomischer DNA, 1 × PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl2, 200 &mgr;M Deoxynucleosidtriphosphaten, 1 &mgr;M jedes Primers und 2 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Promega). Die Reaktionen wurden drei Minuten lang auf 94°C erhitzt, danach wurden Vervielfältigungszyklen durchgeführt (94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 30 Sekunden), gefolgt von einer abschließenden 10 Minuten langen Inkubation bei 72°C. Die resultierenden PCR-Produkte wurden direkt in den pCR2.1-Vektor unter Verwendung des TA-Klonierungssatz (Invitrogen) kloniert und wie oben beschrieben sequenziert. Die Klone wurden als AtT3 und AtT24 bezeichnet. Schoten, Blumen, obere Stiele (die obersten zwei Zentimeter des Stiels), untere Stiel, Blätter (Stängelblätter und Rosette) und Wurzeln des Ökotyps Columbia wurden gesammelt und in flüssigem N2 gefroren. Poly(A)+ mRNA wurde, wie oben beschrieben, extrahiert. Northern Blots wurden durch Elektrophorese von 5 &mgr;g Proben der Poly(A)+ mRNA durch Agarose-Gels hergestellt, die Formaldehyd enthalten, und nachfolgenden Transfer auf Nitrozellulose (Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989)). Random-primed 32P-markierte Sonden wurden für AtT3 und AtT24 unter Verwendung von gebrauchsfertigen Markierungsperlen (Pharmacia) erzeugt. 3 zeigt die DNA-Sondensquenzen für A. thaliana Sonde T3 (Figur a) und Sonde T24 (3b). Hybridisierungen wurden in der Gegenwart von 50% Formamid 16 Stunden lang bei 42°C durchgeführt (Hybridisierungspuffer: 5 × SSPE, 2 × Denhardts, 0,5% (w/v) SDS, 100 &mgr;g/ml denaturierte sonifizierte Lachsspermien-DNA, 10% Dextransulfat). Blots wurden zwei Mal 10 Minuten lang in 1 × SSC/0,5% SDS bei 20°C gewaschen. Es wurden weitere 2 × 10 Minuten lange Waschvorgänge in 0,1 × SSC/0,5% SDS bei 60°C durchgeführt. Blots wurden einem Kodak-MS-Film bei –80°C mit MS-intensivierenden Schirmen ausgesetzt: Die höchste Expression beider Gene wurde in der Infloreszenz erfasst. Eine cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von 5 &mgr;g Infloreszenz-Poly(A)+ mRNA wie oben beschrieben konstruiert. Insgesamt 5 × 105 rekombinante Phage in E. coli XL1-Blue MRF' wurden auf fünf 24 cm 24 cm quadratischen Platten ausplattiert. Es wurden Plaquen bis zur Konfluenz (8 bis 10 h) gezüchtet, danach wurden Duplikat-Abhebungen auf 20 × 22 cm gestützten Nitrozellulosefiltern (Nitropure, MSI) genommen und so verarbeitet wie von Sambrook et al beschrieben (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York (1989)). Die Hybridisierung von 32P-markierten AtT3- und AtT24-Sonden wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Positive Plaquen wurden durch Autoradiographie identifiziert und von den Platten in 750 &mgr;l SM-Puffer übertragen (50 mM Tris HCl pH-Wert 7,5, 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 0,5% Gelatine) und erneut durchsucht, bis plaquenreine Klone isoliert wurden. Die Plasmid-Gewinnung erfolgte unter Verwendung des Stratagene Rapid Excision Kits. Die cDNA-Klone wurden sequenziert, und rekombinantes Protein in E. coli exprimiert und auf GA-2-Oxidaseaktivität untersucht, wie oben beschrieben. Die partiellen Nucleotid- und deduzierten Aminosäuresequenzen für die Klone sind in den 5, 6, 7 und 8 gezeigt.

Eine dritte Arabidopsis genomische Sequenz T31E10.11 (AtGA2Ox3) mit einer hohen Aminosäureidentität mit der P. coccineus GA-2-Oxidase (PcGA2ox1) wurde auch in der GenBank-Datenbank entdeckt. Ihre abgeleitete Aminosäuresequenz weist 53%, 49% und 67% Identität (67%, 67% und 84% Ähnlichkeit) mit der P. coccineus GA-2-Oxidase (PcGA2ox1), T3 (AtGA2ox1) bzw. T24 (AtGA2ox2) auf. Die Nucleotidsequenz von T31 wird in 9 dargestellt und die deduzierte Aminosäuresequenz in 10.

Beispiel 4. Transformation von Arabidopsis mit Sinn- und Gegensinn-GA-2-Oxidase-cDNA-Konstrukten

Die vorhergesagte Codierungsregion von 2B27 wurde durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotidprimern vervielfältigt:

von denen jeder eine SacI-Restriktionsstelle an seinem 5'-Ende aufwies. Das PCR-Produkt wurde in pCR2.1 subkloniert, um die DNA-Sequenzierung wie zuvor beschrieben zu erleichtern. Die 2B27-Codierungsregion wurde mit SacI verdaut und in die SacI-Stelle des binären Vektors pLARS120, einer modifizierten Version von pGPTV-Kan (Becker et al. Plant Mol. Biol 20 1195–1197 (1992)), subkloniert, bei der das &bgr;-Glucuronidase-Reportergen durch den Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor von pBI220 ersetzt wird (Jefferson, R. A., Plant Mol. Biol. Rep. 5 387–405 (1987)). Die DNA wurde in der Sinn-Ausrichtung unter der Kontrolle des 35S-Promotors eingefügt. Das Plasmid wurde in Agrobacterium tumefaciens durch Electroporation eingeführt und danach in Arabidopsis cv. Columbia über ein Vakuuminfiltrationsverfahren (Bechtold et al., Compt. Rend. Acad. Sci. Serie iii-Sciences de la Vie-Life Science 316 1194–1199 (1993)) transferiert. Ähnlich wurden SacI-Fragmente von AtT3 und AtT24 in pLARS120 subkloniert, nur dass in diesen zwei Fällen die DNA in der Gegensinn-Ausrichtung unter der Kontrolle des 35S-Promotors eingefügt wurde. Arabidopsis wurde mit diesen zwei Gegensinn-Konstrukten wie oben beschrieben transformiert.

Beispiel 5(a). Geänderte Expression von GA-2-Oxidase in transgenen Pflanzen

Die P. coccineus 2-Oxidase cDNA in Sinn-Ausrichtung (PcGA2ox1) und die A. thaliana 2-Oxidase cDNA in Gegensinnausrichtung wurden zwischen dem CaMV-35S-Promotor und dem nos-Terminator im Vektor pLARS120 eingefügt. Der Vektor pLARS120 ist ein binärer Vektor für Abgrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation: die T-DNA enthält, zusätzlich zu dem CaMV-35S-Promotor und dem nos-Terminator, einen nptII selektierbaren Marker unter dem nos-Promotor. Der Vektor wird aus pGPTV-Kan (Becker et al. Plant Mol. Biol. 20 1195–1197 (1992)) abgeleitet, wobei das uidA-Reportergen in pGPTV-Kan durch den 35S-Promotor ersetzt wird. Die binären Expressionskonstrukte wurden in den Agrobacterium-tumefaciens-Stamm GV3101 eingeführt, der das pAD1289-Plasmid trägt, welches die Überexpression von VirG durch Elektroporation überträgt. Diese wurden in Arabidopsis durch das Vakuumfiltrationsverfahren (Bechtold et al. Compt. Rend. Acad. Sci. Serie iii-Sciences de la Vie-Life Science 316 1194–1199 (1993)) eingeführt. Um transgene Pflanzen zu identifizieren, wurden Samen von infiltrierten Pflanzen auf MS-Platten gezüchtet, ergänzt mit Kanaymycin (50 &mgr;g/ml) über einen Zeitraum von ungefähr 14 Tagen, und die resistenten Pflanzen wurden auf Kompost transferiert. Die T-DNA, welche das P.-Coccineus-2-Oxidase-Konstrukt enthielt, wurde ebenfalls in Nicotiana sylvestris durch die Infektion von Blattscheiben mit transformiertem Agrobacterium tumefaciens eingeführt.

Die Transformation von Arabidopsis-Pflanzen mit P.-Coccineus-GA-2-Oxidase-cDNA unter der Kontrolle des CaMV-35S-Promotors ergab folgende Ergebnisse. Mehr als die Hälfte aller Transformanten, die überprüft wurden, zeigten einen bestimmten Grad an Zwergwuchs, viele waren stark zwergwüchsig und manche schossen nicht. 11 zeigt ein Foto einer Auswahl von zwergwüchsigen transformierten Pflanzen im Vergleich zu einer transformierten Pflanze, die keinen Phänotypen (Ökotyp Columbia) aufweist. Die Transformanten reagierten auf die Behandlung mit GA3 mit verstärkter Stielverlängerung und normaler Blütenentwicklung, so dass es möglich war, Samen zu erhalten. Überexprimierung der P.-Coccineus-GA-2-Oxidase-cDNA in Nicotiana sylvestris führte zu Pflanzen mit reduzierter Stielhöhe. Ein Transformant hat nicht geschossen oder Blüten produziert, während nicht-transformierte Pflanzen desselben Alters bereits blühten.

Beispiel 5(b). Geänderte Expression von GA-2-Oxidase in transgenen Pflanzen

Fünf Arabidopsis-Linien, die für das 35S-PcGA2ox1-Transgen homozygen sind, wurden erhalten. Eine Linie schoss zur selben Zeit wie Wildtyp(Columbia)-Pflanzen, aber wies eine verringerte Stielhöhe auf, während die anderen vier Linien als Rosetten blieben und nicht schossen, wenn sie in langen (16 Stunden) oder kurzen (10 Stunden) Photoperioden gezüchtet wurden. Eine stark zwergwüchsige Linie hat keine homozygenen Pflanzen erzeugt, selbst als Samen in der Gegenwart von GA3 gekeimt wurden, was darauf hinweist, dass die Samenentwicklung in dieser Linie beeinträchtigt war, wenn zwei Kopien des Gens anwesend waren. Die stark zwergwüchsigen Linien wiesen kleine, dunkle Blätter auf, die nahe bei der Wicklungsstufe blieben. Sie erzeugten Blütenknospen, wenn sie in langen Photoperioden gezüchtet wurden, wobei sich jedoch die Blüten nicht normal entwickelten und unfruchtbar waren. Es wurden keine Blütenknospen erhalten, wenn die Pflanzen in kurzen Photoperioden gezüchtet wurden. Die Behandlung der transgenen Linien mit 10 &mgr;M GA3 ermöglichte ihnen das Schießen und das Erzeugen von normalen Blüten, die überlebensfähige Samen setzten.

Der Stoffwechsel von C19-GAs wurde in einer stark zwergwüchsigen 35A-PcGA2ox1-Linie mit jener in Wildtyp-Pflanzen verglichen. Auf der Grundlage von HPLC wandelte die zwergwüchsige Linie GA1, GA4, GA9 und GA20 in einem viel größeren Ausmaß zu 2-oxidierten Produkten um als der Wildtyp. Die zwergwüchsige Linie hat GA3 nicht metabolisiert, was Ergebnisse mit rekombinantem Enzym bestätigt, die darauf hinweisen, dass GA3 kein Substrat für die GA-2-Oxidasen ist. Daher kann dieses GA erforderlichenfalls dazu verwendet werden, die GA-Defizienz umzukehren, die aus dem Überexprimieren der GA-2-Oxidase-Gene resultiert.

Eine Northern-Blot-Analyse der 35S-PcGA2ox1-Linien bestätigte die hohen Expressionsniveau des Transgens. Die Transkriptabundanz für GA-20-Oxidase-(AtGA2ox1) und 3&bgr;-Hydroxylase(AtGA3ox1)-Gene war in Rosetten der 35S-PcGA2ox1-Linien im Vergleich zu den Wildtyp-Pflanzen erhöht, wobei das native GA-2-Oxidase(AtGa2ox2)-Transkriptniveau infolge der Kontrollmechanismen für GA-Homeostase reduziert wurde.

Beispiel 6. Expressionsmuster von Arabidopsis-GA-2-Oxidase-Genen T3 und T24 (AtGA2ox1 bzw. AtGA2ox2)

Die Expressionsmuster von Arabidopsis GA-2-Oxidase-Genen T3 und T24 wurde durch Sondieren von Northern-Blots der RNA, die aus verschiedenen Geweben extrahiert wurden, mit cDNAs voller Länge überprüft. Die Gene zeigten ähnliche Expressionsmuster, wobei Transkripte für beide Gene in Blättern, unteren Stielen, oberen Stielen, Blüten und Schoten vorhanden waren. Die höchsten Expressionsniveaus wurden bei Blüten, Schoten und oberen Stielen in absteigender Reihenfolge der Transkriptabundanz festgestellt. T24, jedoch nicht T3, wurde auch in Wurzeln exprimiert. Die Transkriptabundanz sowohl für T3 als auch für T24 in unreifen Blütenknospen und Blütenstengeln des GA-defizienten Arabidopsis-Mutanten, gal-2, ist nach der Behandlung mit GA3 erhöht, was darauf hinweist, dass die Expression dieser 2-Oxidase-Gene durch GA nach oben reguliert wird. Dies kontrastiert mit der Expression der GA-20-Oxidase- und 3&bgr;-Hydroxylase-Gene, die durch GA nach unten reguliert werden. Die Transkriptabundanz für T31 war in allen Geweben viel geringer als für T3 oder T24. Das T31-Transkript wurde durch RT-PCR in Blüten, oberen Stielen und Blättern delektiert, nicht aber in Wurzeln oder Schoten.

Beispiel 7. Funktion der rekombinanten GA-2-Oxidasen aus Phaseolus coccineus und Arabidopsis thaliana

Die katalytischen Eigenschaften der rekombinanten Proteine, die durch Exprimieren der cDNAs aus P. coccineus (PcGA2ox1) und A. thaliana (AtGA2ox1, AtGA2ox2 und AtGA2ox3) in E. coli erhalten wurden, wurden durch Inkubieren in Gegenwart von Dioxygenase-Cofaktoren mit einer Reihe von 14C-markierten GA-Substraten überprüft, die aus den C19-GAs, GA1, GA4, GA9 und GA20 und den C20-GAs, GA12 und GA15 bestehen. Die zuletzt genannte Verbindung wurde sowohl in ihren geschlossenen als auch offenen Lactonformen inkubiert. Mit keinem der Enzyme wurde eine Umwandlung von GA12 erzielt, wobei GA15 zu einem Einzelprodukt durch PcGA2ox1 und AtGA2ox2 umgewandelt wurde. Die offene Lactonform von GA15 (20-HydroxyGA12) wurde zum selben Produkt durch AtGAox2 umgewandelt, aber weniger effizient als die Lactonform, wohingegen es keine Umwandlung von GA15 offenem Lacton durch PcGA2ox1 gab. Das Massespektrum des Produktes von GA15 entspricht seiner Identifizierung als 2&bgr;-HydroxyGA15, obwohl aufgrund der Tatsache, dass die authentische Verbindung nicht zum Vergleich zur Verfügung steht, die Identität dieses Produktes vorläufig ist.

Ein Vergleich der Substratspezifizitäten der rekombinanten Enzyme für die C19-GAs (Tabelle 1) zeigte, dass GA9 das bevorzugte Substrat für PcGA2ox1, AtGA2ox1 und AtGA2ox2 war. Die rekombinanten Enzyme unterschieden sich ein wenig in ihren Substratspezifizitäten, wobei GA4 genauso effektiv wie GA9 durch PcGA2ox1 und AtGA2ox3 umgewandelt wird, aber für AtGA2ox1 und AtGA2ox2 ein relativ schlechtes Substrat ist. Obwohl GA20 effizienter 2&bgr;-hydroxyliert wurde als GA4 durch AtGA2ox1 und AtGA2ox2, wurde kein GA29 Katabolit nach Inkubationen mit GA20 entdeckt, während geringe Erträge von GA34 Katabolit erzielt wurden, wenn GA4 mit PcGA2ox1, AtGA2ox2 und AtGA2ox3 inkubiert wurde. Die Aktivitäten von rekombinantem PcGA2ox1, AtGA2ox2 und AtGA2ox3 für 2&bgr;-Hydroxylierung von GA9 schwankte wenig zwischen einem pH-Wert von 6,5 und 8, und jene von AtGA2ox1 erreichte ihre Spitze bei einem pH-Wert von 7, wobei keine Aktivität bei einem pH-Wert von ≤ 5,9 und ≥ 8,1 detektiert werden konnte.

Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die nicht-3&bgr;-Hydroxy C19-GAs, die unmittelbare Vorläufer der biologisch aktiven Verbindungen sind, bessere Substrate für die GA-2-Oxidasen sind als die aktiven GAs selbst. Daher würde die Überexpression von GA-2-Oxidase-Genen zur Produktion von nur sehr wenig aktivem GA führen.

Tabelle 1 Spezifizität von rekombinanter GA-2-Oxidase für C19-GA-Substrate

Die Werte entsprechen dem prozentiellen Ertrag durch HPLC-Strahlungsüberwachung von Produkten nach der Inkubation von Zelllysaten aus E. coli, welche die cDNA exprimieren, mit 14C-markiertem GA-Substrat und Cofaktoren für 2,5 h. Die Produkte und das Substrat wurden durch HPLC getrennt und die Produkte durch GC-MS identifiziert. In den Fällen, in denen der kombinierte Ertrag der Produkte < 100% ist, entspricht der Rest dem nicht umgewandelten Substrat.

Gibberellin(GA)-Biosynthese

4 zeigt die zwei wichtigsten Wege der Gibberellin(GA)-Biosynthese von GA12 zu GA4 und von GA53 zu GA1. GA1 und GA4 sind die biologisch aktiven GAs. Die Umwandlung von GA12 zu GA9 und von GA53 zu GA20 wird durch GA-20-Oxidase katalysiert. Die Umwandlung von GA9 zu GA4 und von GA20 zu GA1 wird durch GA-3&bgr;-Hydroxylase katalysiert. GA9, GA4, GA20 und GA1 sind alles Substrate für die 2&bgr;-Hydroxylaseaktivität von GA-2-Oxidase, die umgewandelt werden zu GA51, GA34, GA29 bzw. GA8. Diese 2&bgr;-hydroxylierten GAs können weiter zu den entsprechenden Kataboliten oxidiert werden. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass das Enzym aus P. coccineus und die zwei Enzyme aus Arabidopsis thaliana die 2&bgr;-Hydroxylierung jedes Substrats katalysieren. Zusätzlich zeigt die vorliegende Erfindung, dass das P.-Coccineus-Enzym und eines der A.-thaliana-Enzyme GA51-Katabolit und GA34-Katabolit bilden, wenn sie mit GA9 bzw. GA4 inkubiert werden.


Anspruch[de]
  1. Isolierte, gereinigte oder rekombinante Nucleinsäuresequenz, die ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym codiert, das eine Nucleinsäuresequenz, wie sie in 1, 5 oder 7 gezeigt ist, oder ihren Komplementärstrang umfasst.
  2. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1, die ein Enzym codiert, das die Aktivität eines Gibberellin-2-Oxidase-Enzyms von Phaseolus coccineus hat.
  3. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 1, die ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym von P. coccineus oder Arabidopsis thaliana codiert.
  4. Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die codierende Sequenz wirksam an einen Promotor gekoppelt ist.
  5. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 4, wobei der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
  6. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 4, wobei der Promotor spezifisch für die Expression in einer bestimmten Pflanzenzelle ist.
  7. Isolierte, gereinigte oder rekombinante Nucleinsäuresequenz, die ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym codiert, das eine Nucleinsäuresequenz, wie sie in 1, 5 oder 7 gezeigt ist, oder ihren Komplementärstrang umfasst, wobei die codierende Sequenz wirksam an einen Promotor gekoppelt ist, der spezifisch für die Expression in einer bestimmten Pflanzenzelle ist.
  8. Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Gibberellin-2-Oxidase die 2&bgr;-Oxidation eines C19-Gibberellin-Moleküls katalysiert, um bei C-2 eine Hydroxyl-Gruppe einzuführen.
  9. Isolierte, gereinigte oder rekombinante Nucleinsäuresequenz, die ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym codiert, das eine Nucleinsäuresequenz, wie sie in 1, 5 oder 7 gezeigt ist, oder ihren Komplementärstrang umfasst, wobei die Gibberellin-2-Oxidase die 2&bgr;-Oxidation eines C19-Gibberellin-Moleküls katalysiert, um bei C-2 eine Hydroxyl-Gruppe einzuführen.
  10. Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei die Gibberellin-2-Oxidase ferner die Oxidation der bei C-2 eingebauten Hydroxyl-Gruppe katalysiert, um das Keto-Derivat zu ergeben.
  11. Isoliertes, gereinigtes oder rekombinantes Polypeptid, das ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym umfasst, wobei das Polypeptid a) die in 2 gezeigte Aminosäuresequenz hat oder b) wenigstens 75% Aminosäure-Identität mit der Aminosäuresequenz, die in 2 gezeigt ist, besitzt.
  12. Polypeptid nach Anspruch 11, das wenigstens 80%, 85%, 90% oder 95% Aminosäuresequenz-Identität mit der in 2 gezeigten Aminosäuresequenz besitzt.
  13. Vektor, der eine Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 10 aufweist.
  14. Wirtszelle, die mit einem Vektor nach Anspruch 13 transfiziert oder transformiert ist.
  15. Pflanzenzelle wie in Anspruch 14 beansprucht.
  16. Pflanze oder Teil einer Pflanze deren Zellen in Anspruch 15 beansprucht sind.
  17. Vermehrungsmaterial von einer Pflanze nach Anspruch 16, wobei das Material wenigstens eine Zelle nach Anspruch 14 aufweist.
  18. Verwendung einer isolierten, gereinigten oder rekombinanten Nucleinsäuresequenz, die ein Gibberellin-2-Oxidase-Enzym codiert, zur Herstellung einer Pflanze.
  19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Gibberellin-2-Oxidase eine in der Pflanze konstitutiv überexprimiert ist, um die Konzentration bioaktiver Gibberelline (GAs) zu verringern.
  20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Expression endogener GA-2-Oxidase-Gene in transgenen Pflanzen reduziert ist.
  21. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die Aminosäuresequenz wie in 1, 5, 7 oder 9 gezeigt oder ihr komplementärer Strang ist.
Es folgen 7 Blatt Zeichnungen






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