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Dokumentenidentifikation DE69927769T2 20.07.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001002054
Titel VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON VIREN AUS ZELLKULTUREN
Anmelder Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), Rio de Janeiro, BR
Erfinder DA SILVA FREIRE, Marcos, Pendotiba, CEP-24320-000 Niteroi, RJ, BR;
YAMAMURA, Maya, Anna, Pendotiba, Niteroi,RJ, BR;
MANN, Fobes, George, CEP-21045-900 R.de Janeiro, BR;
GALLER, Ricardo, Pendotiba, CEP-24320-000 Niteroi, RJ, BR
Vertreter Klunker, Schmitt-Nilson, Hirsch, 80797 München
DE-Aktenzeichen 69927769
Vertragsstaaten BE, CH, DE, FR, GB, LI
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 17.03.1999
EP-Aktenzeichen 999153844
WO-Anmeldetag 17.03.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/BR99/00014
WO-Veröffentlichungsnummer 1999047645
WO-Veröffentlichungsdatum 23.09.1999
EP-Offenlegungsdatum 24.05.2000
EP date of grant 19.10.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 20.07.2006
IPC-Hauptklasse C12N 5/06(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 7/02(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Produktion von Impfviren in Zellkulturen mit hohen Virenausbeuten, besonders auf die Produktion von Flaviviren in Fibroblast-Zellkulturen, und spezifisch auf die Produktion von jeglichen Subkulturen des 17D Gelbfiebervirus in Kulturen von Hühnerembryo-Fibroblasten. Der in einem Impfpräparat vorhandene Virus kann durch Inaktivierung, Abschwächung und genetische Veränderung durch rekombinante DNS Technologie erhalten werden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Herkömmliche Impfstoffe werden normalerweise dadurch hergestellt, dass man große Mengen des Virus in Zellgewebekulturen oder in Labortieren produziert und dann das Virus harmlos macht, ohne seine immunologischen Eigenschaften zu zerstören. Traditionsgemäß wird dieses entweder dadurch erzielt, dass man die Ansteckungsfähigkeit des Virus inaktiviert oder dass man einen avirulenten oder geschwächten Virus zum Gebrauch in den Lebendimpfstoffen auswählt. Eine abgeschwächte Form wird häufig hergestellt, indem man das Virus ungewöhnlichen Wachstumszuständen aussetzt (d.h., unterschiedlichen Tierwirten oder Zellkulturen) und durch häufige Passagen in Zellkulturen großer Viren-Inocula, um Mutationen auszuwählen, die ihre Virulenz verloren haben und dementsprechend abgeschwächte oder keine klinischen Symptome erzeugen.

Durch aufeinanderfolgende Passagen in den Zellkulturen, können abgeschwächte Impfviren potenziell zu virulenten Phänotypen durch Mutation oder Selektion revertieren. Es ist Praxis, eine Subpopulation der ursprünglichen Viruspräparation als ein Keimgruppensystem zu benutzen, indem eine ursprüngliche Viruspräparation, die sich als abgeschwächt für den Menschen gezeigt hat, einmal passiert wird, um mehrfache Aliquoten der Primär (Master) Stammkultur zu erhalten. Eine oder mehrere Aliquoten des Virus dieser Stammkultur wird einmal weiter passiert, um eine Sekundär (arbeitende) Stammkultur zu erhalten. Eine oder mehrere Aliquoten dieser Sekundärstammkulturpräparation werden zur Produktion einer Charge des Impfstoffs verwendet. Auf diese Art kann die Anzahl von Passagen begrenzt werden und die Wahrscheinlichkeit von Selektion oder Mutation vermindert werden. Ein Beispiel dieser Methode, abgeschwächte Impfviren zu erhalten, ist die Produktion von Gelbfieberimpfstammkultur (YF).

1A zeigt eine Darstellung der Durchsatzfolge der originalen YF Asibi Stammkultur und den Derivaten der YF 17D Impfkulturen und seine Subkulturen. Die YF Asibi Virusstammkultur wurde subkultiviert in embryonalem Mausgewebe und zerkleinerten ganzen Hühnerembryonen mit oder ohne Nervengewebe. Diese Passagen ergaben die Stammkultur 17D im Durchgang 180 und 17DD im Durchgang 195 und 17D-204 im Durchgang 204. Die 17DD Kultur wurde bis zum 241. Durchgang weiter subkultiviert und 43 zusätzlichen Durchgängen im Kükenzelleneiern ausgesetzt, bis zum 284. Durchgang, welche der Impfcharge entspricht, die heutzutage für humane Impfungen benutzt wird. Der 17D-204 wurde weiter subkultiviert, um eine Colombia 88 Stammkultur zu produzieren, die durch Passage in Hühnerembryoneneiern verschiedene Impfstammkulturen erzeugte, die in Frankreich verwendet werden (Institut Pasteur 235. Passage) und in den USA (Connaught, 234. Passage). Die 17D-213 Kultur wurde vom 17D-204 abgeleitet, als die ursprüngliche Stammkultur (S1 112-69) aus der Bundesrepublik Deutschland (BRD 83-66) von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) verwendet wurde, um einen vogelleukosevirusfreien 17D Samen (S1 213/77) in der 237. Passage zu produzieren. Neue 17D Subkulturen wurden durch die Verwendung von rekombinanter DNS Technologie entwickelt, die ein besseres Wissen über die Struktur und Expression des Flavivirus-Genoms voraussetzte. Der Gelbfiebervirus ist ein Prototyp Virus für die Flavivirus Gattung innerhalb der Flaviviridae Familie von positiv-Strang RNS Viren. Die Flaviviren sind sphärische Viren mit 40–60 nm Durchmesser mit einem icosahedralen Capsid, das ein einfaches positiv-Strang RNS Molekül enthält, und die virale Replikation findet komplett im Zellzytoplasma statt. Das YF Virus RNS Genom besteht aus 10.862 Nukleotiden in der Länge mit kurzen 5' (118 Nukleotiden) und 3' (511 Nukleotiden) nicht verbundenen Regionen, einer 5' Deckelstruktur und einem 3' nonpolyadenyl Ende. Diese einzige RNS ist auch die virale Nachricht, und seine Übertragung in die infizierten Zellen erzeugt eine Synthese eines Polyprotein Precursors, der eine posttranslational proteolytische Verarbeitung vollzieht, um 10 Virus-spezifische Polypeptide zu erzeugen. Um RNS-Genome an jedem bestimmten Ort zu manipulieren, müssen ergänzende DNS, die dem kompletten Genom entsprechen, vorhanden sein. Die Pionierstudie von Rocaniello und von Baltimore (Rocaniello, V.R. und Baltimore, D. (1981). "Geklonte Poliovirus ergänzende DNA ist in den Säugetier- Zellen ansteckend". Wissenschaft. 214: 916–919) zeigte zuerst die Möglichkeit, Viren von geklonter DNS zu erzeugen. Mit der Entwicklung der in-vitro Übertragungssysteme (s. Melton, D.A.; Krieg, P.A.; Rabagliati, M.R.; Maniatis, T.; Zinn, K. und Grün, M.R. (1984). "Leistungsfähige in-vitro Synthese der biologisch aktiven RNS- und RNS-hybridisierungs Proben von Plasmiden, die einen Promotor des Bakteriophages SP6 enthalten". Nucl. Säuren. Res. 12: 7035–7056) Es wurde möglich, Viren IN-VITRO RNS in voller Länge zu synthetisieren mit einer viel höheren Leistungsfähigkeit verglichen mit cDNS Transkription in der Zelle. Die Entwicklung von leistungsfähigeren Transfektions-Methoden wie kationische Liposome und Elektroporation haben geholfen, die Leistungsfähigkeit der Transfektion der kultivierten Zellen mit RNS zu verbessern. Die grundlegende Methode für das, was heute als infektiöse Klontechnologie bekannt ist, wurde festgelegt. Für einen Teil von positiv-Strang Viren wurde infektiöse DNS erhalten und kann dazu verwendet werden, die molekulare Grundlage einiger biologischer Phänomene einschließlich der Abschwächung zu verstehen. Eine cDNS in voller Länge wurde zuerst für das YF Virus entwickelt und demonstrierte nach Transfektion von kultivierten vertebraten Zellen das Entstehen eines Virus mit in-vitro synthetisierter RNS 1989 (Rice u.a., 1989).

Die Ableitung der YF ansteckenden Klon-Nachkommenviren ist in 1B bildlich dargestellt. Die Viren-RNS der Subkultur 17D, im Schaukasten 1 dargestellt, genannt F-204, C-204, 17D-213, und der Impfstoff 17DD waren das Thema der kompletten Nukleotidreihenfolgeermittlung unterschiedlicher Forschungsgruppen und sind anderweitig veröffentlicht worden. Jede der 17D-204 Subkulturen, F-204 und C-204, wurde in unterschiedlichen Zelllinien Plaque-gereinigt, und das erhaltene Plaque-gereinigte Virus wurde in den Zellen SW13 verstärkt und für cDNS Klon- und Reihenfolgenanalysen benutzt. Für die Viren 17D-213 und 17DD wurde die RNS direkt vom Virus extrahiert, das von der Impfpräparation aufbereitet worden war. Diese Zellkulturen stellen folglich wahrscheinlicher die Reihenfolge dar, die einen abgeschwächten Phänotypus zum Impfvirus liefern sollte. Die einzige YF ansteckende cDNS, die bis jetzt abgeleitet wurde, ist aus der sDNA C-204 Bibliothek entstanden (Reis, C.M.; Grakoui, A.; Galler, R. und Räume, T. (1989). "Übertragung von ansteckenden Gelbfieber RNS aus kompletten cDNA Schablonen produziert durch In-Vitro Verbindung". The New Biologist 1: 285–296). Die Charakterisierung eines Virus nach einer Transfektion in CEF Zellen und einem Durchgang in einem befruchteten Ei unter Verwendung gegenwärtiger Herstellungsmethoden zeigt einen Virus mit einem nichtakzeptierbaren Grad von Neurovirulenz für nichtmenschliche Primaten und sind deswegen nicht geeignet, als Humanimpfung getestet zu werden. (Marchevsky, R.S., Mariano, J., Ferreira, V.S., Almeida, E., Cerqueira, M.J., Carvalho, R., Pissurno, J.W., Travassos da Rosa, A.P.A., Simões, M.C., Santos, C.N.D., Ferreira, I.I., Muylaert, I.R., Mann, G.F., Rice, C.M. and Galler, R., "Phänotypische Analyse von Gelbfieberviren komplementär abgeleitet", DNA Am. J. Trop. Med. Hyg., 52(1), S. 75–80, 1995). Der Vergleich der Nukleotidreihenfolgen für die Subkulturen 17D-213 und 17DD (in 1A bildlich dargestellt) führte zur genetische Änderung der cDNA des Virus C-204, der DD-ähnlich wiedergegeben wird. Diese neue DNA wurde für die in-vitro Synthese von RNS benutzt, die nach der Transfektion der CEF Zellen einen neuen Beimpfungs-Virus erzeugte, der in der 241 Passage YFiv5.2/DD genannt wurde. Dieses Virus wurde dann benutzt, um die Primär- und Sekundärstammkulturen vorzubereiten, beide in CEF, in den Durchgängen 242 und 243, beziehungsweise, wie in der Patentanmeldung BR-PU 9701774 beschrieben, eingetragen im Namen des gleichen Anmelders der vorliegenden Erfindung. Kurz gesagt, angesichts der weithin bekannten Impfeigenschaften des YF 17D Virus hinsichtlich der Sicherheit und der Wirksamkeit, ebnete die Fähigkeit, sein Genom zu manipulieren, den Weg zu seiner Entwicklung als richtungsweisend für die Expression von Antigenen zu anderen Krankheitserregern.

Obwohl das Impfvirus durch Inaktivierung, Abschwächung oder den Gebrauch von rekombinanten DNS Techniken erhalten wird, muss der Virus mit der Wirtszelle kompatibel sein, d.h. fähig zur autonomen Reproduktion in der Wirtszelle. Außerdem muss für die Großproduktion die Wirtszelle eine solche Zelle sein, in der das Virus mit hoher Ausbeute wachsen kann. Zellen für die Produktion der Lebendimpfstoffe für parenteralen Gebrauch am Menschen werden auf diejenigen begrenzt, die frei von Zusatzstoffen sind, nicht-tumorig und karyologisch normal. Solche Zellen schließen die Primär- oder serienmäßig hergestellten Kulturen, abstammend von einer Vielzahl der Säugetier- oder Vogelgewebe wie menschliche diploide Fibroblasten (z.B., MRC-5), Affenniere (MK), Vogelembryofibroblasten (z.B., Hühnerembryo-Fibroblasten) und vielen anderen mit ein. Diese Zellen werden mit dem Virus angesteckt ("Beimpfungsvirus"), das dann in der Zelle repliziert wird und normalerweise in die Kultur eingebracht wird. Die Bedingungen und die Materialien, die im vollständigen Prozess benutzt werden, müssen sorgfältig überwacht werden, um Probleme zu vermeiden, bezüglich genetische Veränderlichkeit, Verlust von Immunisierungsfähigkeit, Virusinaktivierung, Neurovirulenz, niedriges Ergebnis in Bezug auf den Viruseinsatz und Verschmutzung durch Fremdstoffe.

In den Patenten US 5.391.491 und US 5.550.051 wird eine Methode vorgestellt, ein Virus/Virusantigen zu produzieren, insbesondere für das Flavivirus tick-borne-Encephalitis-Virus, indem man eine Lebendmasse von Vogelembryo-Zellaggregaten mit Durchmesser von zwischen 100 &mgr;m und 1.000 &mgr;m mit dem besagten Virus in einem Medium mit einer Sauerstoffkonzentration von mindestens 0.01 mmol/l ansteckt, welches die Zellaggregate, in einer Konzentration von mindestens 10mg pro ml enthält. Der Anmelder erwähnte, dass die Kontrolle der Aggregatgröße und der Sauerstoffkonzentration beide eine Reduzierung der Kontaminierung der Zellproteine in dem Medium bezwecken, verursacht durch stufenweise Zellolyse und eine Erhöhung der Reproduzierbarkeit des Virus/Virusantigens, welches niedrig ist, wenn einzelne Zellen oder kleine Aggregate schwebend vorhanden sind. Ebenso wird beschrieben, dass Messungen zeigten, dass die TBE-Virus/Virusantigenproduktion stark in einem größeren Umfang in einer Kultur verringert wird, die eine Zelldichte von 2 × 107 Zellen pro Milliliter hat und mit der Sauerstoffatmosphäre ausschließlich durch seine Oberfläche verbunden ist.

Es wurden auch verschiedene Versuche unternommen die Immunogenität des Impfviruses zu erhalten. US 5.021.347 beschreibt einen rekombinanten Impfvirus, welcher das E-Protein des japanischen Encephalitisvirus formuliert, das darauf abzielt, den Zerfall der immunisierenden Eigenschaften des Impfvirus zu vermeiden. Die Tierkulturzelle, die in der Infektion mit dem Virus benutzt wird, ist jede mögliche Zelle, sofern der Impfvirus dort wachsen kann. Die spezifischen, im Patent zitierten Beispiele der Kulturzelle schließen mit ein: TK-143 (abgeleitet vom menschlichen Osteosarcoma), FL (abgeleitet vom menschlichen Amnion), Hela (abgeleitet vom Krebsgeschwür des menschlichen uterinen Cervix), KB (abgeleitet vom Krebsgeschwür des menschlichen Rhinopharynx), CV-1 (abgeleitet von der Affenniere), BSC-1 (abgeleitet von der Affenniere), RK13 (abgeleitet von der Kaninchenniere), L929 (abgeleitet vom Mäusebindegewebe), Zelle des CERS (Hühnerembryo), CEF (Hühnerembryofibroblast) Zellen.

Zusätzlich werden in Marchevsky u.a. (Marchevsky u.a., 1995) Primärkulturen der zugelassenen SPF (spezifischer Krankheitserreger frei) Hühner-Embryofibroblasten (CEF) als geeignet zur Herstellung des Masterkeimloses eines rekombinanten YF Impfstoffvirus für menschliche Impfproduktion erwähnt.

Abgesehen von den Vorteilen, zertifizierte SPF-CEF Zellen zur Herstellung von Impfviren zu verwenden, wie YF, Masern, Mumps, Röteln, wird häufig festgestellt, dass der Prozess aufgrund der niedrigen Ausbeuten verhältnismäßig unökonomisches ist. Dies ist besonders zutreffend für den YF Impfstoff, der in CEF mit einer Zelldichte von normalerweise 1 × 106 Zellen/cm2 produziert wird, in der die Ausbeute direkt mit dem Viruseinsatz zusamenhängt. Die Menge und die Kosten der notwendigen Stammviren unter diesen Vorraussetzungen sind zu hoch aufgrund der Notwendigkeit kostenaufwendiger neurovirolenter Tests für jede Stammkultur.

Die Bedingungen für eine optimale Virusproduktion müssen sorgfältig kontrolliert sein bezüglich Inkubationstemperatur und -zeit, Zellansiedlungsdichte und Virus-Inoculum. Zusätzlich begrenzen eine Anzahl von anderen Faktoren die Virusausbeute. So erzeugen einige Viren mit Leichtigkeit defekte behindernde Partikel, die vermieden werden, indem man niedrige Viruseinsätze verwendet. Einige Viren sind gute Induzierer von Interferon und können hilfreich für seine Wirkung sein. Die Stabilität des Virus im Kulturmittel, das verwendet wird, ist auch von lebenswichtigem Wert, da das Ziel eine Balance zwischen Produktion und Verlust von Ansteckungsfähigkeit ist.

Die Rolle von Interferon in Viren/Zellsystemen wird studiert, seit Interferon von Isaacs und Lindemann entdeckt wurde (Isaacs, A. and Lindemann, J. Proc. Roy. Soc. Ser. B., 147: 258. 1957). Interferone sind Materialien mit antiviralen Eigenschaften und werden von bestimmten Zelltypen produziert, die dadurch stimuliert werden, dass sie dem Virus, einigen Nukleinsäuren oder antigen/mitogen Komplexen ausgesetzt wurden.

Säugetier- und Vogelinterferone fallen in drei Hauptkategorien, in Alpha, in Beta- und in gamma. Alphainterferon wird durch die Leukozyten produziert, Betainterferon durch Fibroblasten und Gammainterferon durch T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen, die durch Alloantigens, Tumore und Mitogene angeregt werden. Alle drei werden durch die jeweiligen Zellen abgesondert, nachdem die Zellen durch ein Virus oder anderen Induzierer angeregt wurden. Die Interferone beziehen sich häufig auf die Originalzellen und deswegen ist Gamma-Interferon auch als "Imun"-Interferon bekannt. Die Interferonaktivität wird herkömmlich bestimmt basierend auf seiner Fähigkeit, Resistenz der Zellen anzuregen, die durch einen interferonsensiblen Virus angeregt wurden. Bei der Produktion der Impfviren in den Zellkulturen ist das Interferonsystem für niedrige Virusausbeuten einiger Impfviren verantwortlich, da die Impfviren Interferon anregen und/oder empfindlich auf seine Wirkung reagieren können. Der Impfvirus des Gelbfiebers 17D ist sowohl ein guter Induzierer von Interferon als auch extrem empfindlich für seine Wirkung.

In der Tat ist die Interferontätigkeit die Fähigkeit von Zellen, den Virusherausforderungen zu widerstehen. Diese Interferone sind potenzielle wirksame Medikamente, die sich als vielversprechende antivirale klinische Mittel erweisen.

Wenn die antivirale Tätigkeit der Interferone einen Vorteil bezüglich der Behandlung von Menschen gegen Krankheiten darstellen, die durch einen Virus verursacht werden, dann ist die In-Vitro Produktion ein Nachteil, weil Interferone speziell die Replikation von Viren in Zellen blockieren. Dies ist wahrscheinlich der Hauptgrund der geringen Ausbeute in der Produktion vieler Impfviren.

Dementsprechend schlägt stellt das Patent FR 2 689 519 einen Prozess zur in-vitro Kultivierung von Zellen vor, die mit einem Virus infiziert sind, der mit Sclerose in Verbindung steht, wobei die Primärzelle mit dem Virus des Kulturmeduims infiziert wird, der polyclonale Antikörper Anti-interferon-beta enthält, um die antivirale Aktivität des Beta-Interferon zu unterbinden. Der Nachteil des Prozesses ist die Zugabe von kontaminierten Antikörpern, die schwierig vom gewünschten Produkt zu separieren sind, was die Nützlichkeit der Impfvirusproduktion einschränkt.

Dementsprechend besteht großer Bedarf für einen verbesserten Prozess, um Interferon induzierende/sensitive Impfviren ohne die o.g. Nachteile herzustellen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Der Gegenstand der Erfindung ist ein Prozess zur Herstellung von Flavivirus in Zellkulturen mit hohen Ausbeuten und niedrigem Gehalt an Kontaminierungen durch Zellproteine. Der Flavivirus soll geeignet sein, um in der Bereitung von Stammzellen und Impfstoffen verwendet zu werden. Wie hierbei verwendet, bedeutet der Ausdruck "Virus" inaktivierter Virus, abgeschwächter Virus und rekombinanter Virus, inklusive chimärer Virus. Insbesondere das chimäre Virus kann ein Genom haben, das eine Nukleinsäure-Sequenz enthält, das mindestens ein Struktur-Protein von einem Flavivirus kodiert, und eine Nukleinsäure-Sequenz, die den Rest des Genoms eines anderen Flavivirus kodiert, um es funktionsfähig zu machen. Insbesondere kann das chimäre Virus ein Genom enthalten einschließlich einer Nukleinsäure-Sequenz, das mindestens ein Struktur-Protein eines Falvivirus kodiert, und einer Nukleinsäure-Sequenz, die den Rest des Genoms von YF 17D Virus kodiert, um es funktionsfähig zu machen.

In einer Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Prozess für die Produktion eines Flavivirus in einer Zellkultur, wobei das Verfahren aufweist: (a) Bereiten einer Kultur von Zellen, die für das Virus permissiv sind und als ein Substrat zur Impfstoff-Herstellung annehmbar sind; (b) Suspendieren der Zellen in einem geeigneten Medium, gefolgt von Ansetzen einer Zellkultur mit einer geringeren Dichte als 2 × 10 Zellen/cm2; (c) Inkubieren der Zellkultur bei 30–40°C für eine Zeitdauer zwischen 12 und 72 Stunden; (d) Entfernen des Mediums aus der Zellkultur von Schritt (c) und Inokulieren der Zellen mit Beimpfungsvirus; (e) Inkubieren der Zellkultur von Schritt (d) bei 20–40°C für einer Zeitdauer von 12 bis 144 Stunden; (f) Entfernen des Mediums, einmaliges oder mehrmaliges Waschen der Zellen und Ersetzen des Mediums; (g) Inkubieren der Zellkultur von Schritt (f) bei 30–40°C für eine Zeitdauer zwischen 12 und 144 Stunden; (h) zumindest teilweise Entnehmen des Virus enthaltenden Kultur-Überstands; und (i) Aufbewahren des Virus bei einer Temperatur von –45°C oder niedriger. Die Zellkultur kann altenativ inkubiert werden zwischen 25–40°C in den Inkubationsschritten (e) und (g).

In einer anderen Ausführungsform bezieht sich die dargestellte Erfindung auf die Herstellung eines rekombinanten Gelbfieber (YF) Virus in einer Zellkultur, wobei das Verfahren aufweist: (a) Bereiten einer Kultur von Zellen, die für das Virus permissiv sind und als ein Substrat zur Impfstoff-Herstellung annehmbar sind; (b) Ansetzten einer Zellkultur mit einer geringeren Dichte als 2 × 105 Zellen/cm2; (c) Transfizieren der Zellen mit Nukleinsäuren, die zur Herstellung eines rekombinanten YF-Virus 17D in einer Zellkultur geeignet sind, durch die Behandlung mit syntetischen Lipiden oder Elektroporation; (d) Inkubieren der Zellkultur bei 30–40°C für eine Zeitdauer zwischen 12 und 72 Stunden; (e) Entfernen des Mediums aus der Zellkultur von Schritt (d) und Inokulieren der Zelle mit Beimpfungsvirus; (f) Inkubieren der Zellkultur von Schritt (e) bei 20–40°C für eine Zeitdauer zwischen 12 und 144 Stunden; (g) Entfernen des Mediums, einmaliges oder mehrmaliges Waschen der Zellen und Ersetzen des Mediums; (h) Inkubieren der Zellkultur von Schritt (g) bei 30–40°C für eine Zeitdauer von 12 und 144 Stunden; (i) zumindest teilweise Entnehmen des Virus enthaltenden Kultur-Überstands; und (j) Aufbewahren des Virus bei einer Temperatur von –45°C oder niedriger. Die Zellkultur kann alternativ bei 25 bis 40°C inkubiert werden in den Inkubationsschritten (f) und (h).

Die dargestellte Erfindung stellt einen Durchbruch in der Produktion von Zellkulturen und Impfviren dar und wird durch die gezielte Kontrolle der Konditionen und Ausgangsmaterialien charakterisiert, wie Dichte, Art der Zellen, die vom Virus infiziert werden soll, Viruseinsatz und Bennutzung von Stabilisatoren.

KURZE BESCHREIBUNG DER DARSTELLUNGEN

1 zeigt die Durchgänge der ursprünglichen YF Asibi Stammkultur und Derivate von YF 17D Impfkultur und seine Subkulturen (A); und der YF infizierten klonvermehrten Viren (B).

2 zeigt die YF 17D Virus Stammkultur Ausbeute in Bezug auf die Inkubationszeit (A); das Niveau von induziertem Interferon in Bezug auf die Inkubationszeit (B) und dem Grad der Resistenz der Sinbis Proben mit der Inkubationszeit (C).

3 veranschaulicht die Interferon vermittelte Hemmung des Sindbis Virus in den Kulturen der Hühnerembryo-Fibroblastzellen, die mit dem YF 17D Viruserregerstamm angesteckt wurden. Die Kulturen wurden mit Serienverdünnungen des YF Virus angesteckt und bei 37°C bebrütet. 5 Stunden (A), 24 Stunden (B) und 72 Stunden (C) später wurden die Kulturen der Sindbis Virustätigkeit ausgesetzt.

4 zeigt den Einfluss der Vorbehandlung der Zellen mit Acinomycin D: bezogen auf das induzierte Interferon mit der Inkubationszeit (A) und bezogen auf die YF 17D Virus Stammkultur Ausbeute mit der Inkubations Zeit.

5 zeigt als Diagramm die Prototypstuktur des Flavivirus Genoms und die Struktur des chimären Virus, der durch die Verwendung der vorliegenden Erfindung erhalten wird.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Verschiedene Faktoren können die Ausbeute des Virus beeinflussen. Der hohe Grad an Reinheit, der für potenziell herstellbare Impfstoffe verlangt wird, limitiert die alternativen Methoden, die angewendet werden können, um die Virusausbeute zu verbessern.

Im internationalen Symposium für Gelbfieber und Dengue – 50 Jahre nach der Einführung der 17D Stammkultur in Brasilien, Rio de Janeiro, Brasilien, 15.–19. Mai 1988, wurde die Notwendigkeit einer Verbesserung des Produktionsprozesses von YF Impfviren diskutiert. Lopes, O.S., (Lopes, O.S., "Entwicklung der Gelbfieberimpfung in Zellkulturen". Im internationalen Symposium für Gelbfieber und Dengue – 50 Jahre nach der Einführung der 17D Stammkultur in Brasilien – historischer Bericht) stellt den Gebrauch von CEF Zellen in der Produktion der YF 17D Impfviren vor. Der Anreiz, Zellkulturen anstelle von Hühnerembryonen zu verwenden, war, mehrere wichtige Probleme zu überwinden, die mit dem hohen Eiproteinanteil der Impfung (bis zu 250 &mgr;g Hühnerprotein pro menschlicher Dosis) und Schwierigkeiten in der Scale-up Prodution verbunden sind.

Während O.S. Lopes den Gebrauch von CEF Zellen als potentielle Lösung für die o.g. Probleme zitierte, musste immer noch ein wichtiges Produktionsmerkmal gelöst werden, nämlich die niedrige Produktionsausbeute verglichen mit dem Anteil an eingesetzten Beimpfungsviren. Aus diesem Grund werden die Gelbfieberimpfstoffe immer noch durch virale Inokulation in Hühnerembryonen in Eiern hergestellt.

Studien über die Replizierung des YF 17D Virus in CEF wurden ausgeführt, um zu erfahren, welche Faktoren die Virusausbeute reduzieren. Die untersuchten Faktoren waren: Die Präsenz von defekten interferierenden (DI) Partikeln, die Zuführung von Interferon und die Empfindlichkeit seiner Aktivität und der Effekt auf die Zellansiedlungsrate. Tabelle I und II und 2 und 3 zeigen die Resultate der Versuche unter Benutzung des YF 17-213 Virus in CEF. Diese YF 17D Stammkultur wurde verwendet, weil sie von dem Stammvirus der WHO stammt, der als Vogelleukose freier Viruskomplex bekannt ist und sein abgeschwächter Phänotyp und Immunogenizität sowohl in menschlichen und nichtmenschlichen Primaten gut charakterisiert sind. Zusätzlich hat die WHO empfohlen, diese Stammkultur verwenden, um eine Produktion der YF 17D Impfstoffe in kultivieren Zellen aufzubauen und folglich war es der von O.S. Lopes für die ursprünglichen Studien der Produktion von YF Impfungen in CEF Zellen verwendete Virus, der einen abgeschwächten Virus für nichtmenschliche Primate in 3 aufeinander folgenden Produktionschargen erzielte. Seine Passagenabläufe sind in 1 dargestellt. Vero-Zellen wurden als Kontrolle verwendet (Tab. 1D), weil diese Zellen dafür bekannt sind, verschiedene Replikationszyklen zu ergeben, komplette Zytopathologie und schadhaft in der Interferonherstellung zu sein.

TABELLE I: REPLIZIERUNG DES 17D VIRUS IN KONLFUENTEN CEF UND VERO ZELL KULTUREN

Wie in Tabelle IA und 2A gezeigt, gab die CEF nach 2 Tagen Inkubation die höchste 17D Virus Ausbeute und die log10 Ausbeute war linear abhängig vom Logarithmus des Vireneinsatzes (r = 0.968, p < 0.01). Jede 10fache Verminderung des Vireneinsatzes erzeugte eine 0,53 log Vergrößerung der Virenausbeute. Es wurden keine zytopathischen Effekte während einer 7 Tage dauernden Inkubation beobachtet.

Wie erwartet, erzielten Vero-Zellen ähnliche Ausbeuten, und alle Vireneingaben mit der Zeit zum max. Titer waren umgekehrt proportional abhängig zur log10 Konzentration des Virus Inoculum (Tab 1D). Am 3. Tag z.B. ist die Ausbeute direkt abhängig zum Viruseinsatz (r = + 0.951, p < 0.1), während die Beziehung am 5 Tag invertiert ist (r = –0.974, p < 0.05). Die Virusausbeute aus Vero-Zellen war 200mal größer als die aus CEF, selbst beim niedrigsten Viruseinsatzniveau. Ein nahezu totaler zytopathischer Effekt wurde in allen infizierten Vero-Zellen beobachtet.

Die Virusausbeuten in beiden Zelltypen waren nicht signifikant reduziert, auch nicht beim höchsten Viruseinsatz. In verschiedenen Virus Experimenten an Vero-Zellen, unter Verwendung von hohen Viruskonzentrationen, wurden stets zytopathische Effekte beobachtet, deshalb trat kein Zell "Sparing" auf. Reduzierte Ausbeuten und Zell "Sparing" bei hohen Einsätzen stellen die grundsätzlichen Indikatoren von defekten störenden Partikeln (DI's) dar. Diese Ergebnisse sind daher der absolute Beweis, das DI's keine signifikante Rolle in der Replizierung des 17D Virus spielen

Wie oben bereits erwähnt, ist das Interferonsystem eines der Hauptmechanismen, das die Replizierung der 17D YF Viren limitiert, nachdem es sowohl ein guter Induzierer von IF als auch empfindlich auf seine Wirkung ist.

Im selben Versuch, wie oben diskutiert, wurde Interferon (Tabelle IB, 2B) mit einem gewissen Niveau in alle infizierten Zellen der CEF induziert mit Ausbeuten, die direkt in Bezug zum Viruseinsatz (r = 0.987, p < 0.02) stehen. Die Anregung 17D YF infizierter CEF Kulturen mit Sinbis (bekannt als IF sensibler Virus) zu verschiedenen Post-Infektionszeitpunkten zeigt, dass alle Kulturen komplett resistent gegen Anregung noch nach 3 Tagen waren und bereits am 2. Tag resistent waren, bis auf den niedrigsten getesteten Viruseinsatz. Daher das Fazit, dass die Induzierung von Interferon und seine Sensibilität auf seine Wirkung die prinzipiellen Faktoren sind, die die Ausbeute von 17D Virus in CEF beeinflussen.

Alle getesteten YF 17D Subkulturen (DD, 5.2/VL and 5.2/DD) zeigten dasselbe Verhalten wie der 17D-213 Virus (oben diskutiert) bezüglich der Interferon-Induzierung und seiner Empfindlichkeit.

Diese Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit, die Zellen mit dem Virus unter speziellen Prozessbedingungen zu infizieren, um das Interferonsystem zu umgehen. Dementsprechend wäre die Verwendung von Interferon unterdrückenden Substanzen eine mögliche Lösung, um die Virusausbeuten zu erhöhen. Die erwähnten Substanzen sind jedoch nur schwache Interferon Inhibitoren oder zeigen sich toxisch für die Zellen und sind nicht akzeptierbar als Kontaminierung im Impfstoff. Diesbezüglich haben neueste Studien gezeigt, dass Actinomycin D, ein bekannter irreversibler Inhibitor von DNA-abhängiger RNA-Synthese, die Interferonantwort abblockt, mehrfache Replikationszyklen erlaubt und die YF Virus Ausbeute erhöht. 4 zeigt den Einfluss der Vorbehandlung der Zellen mit Actinomycin D und anschließender Infizierung mit 17D YF Virus. Diese Maßnahme ergab eine beträchtliche Erhöhung der Virensausbeute bezüglich der Kontrolle von Kulturen. Dieses Ergebnis, dass der Inhibition der Interferonproduktion zugeordnet werden kann, bestätigt, dass das Interferonsystem für die geringe Ausbeute verantwortlich ist. Allerdings ist Actinomycin D relativ toxisch für Zellen und nicht akzeptierbar als Kontamination von Impfstoffen.

Folglich war der letzte untersuchte Aspekt, die Interferonsystem-Induzierung zu überwinden, die Zelldichte während der Zeit der viralen Infektion.

Die Ergebnisse eines typischen Versuchs, den Effekt der Zellansiedlungsdichte in der Ausbeute der 17DD YF Viren in CEF zu testen, sind in Tabelle II dargestellt.

TABELLE II: EINFLUSS DER ZELLANSIEDLUNGSDICHT IN DER AUSBEUTE DES 17D VIRUS AUS CEF

Dieses Resultat zeigt eindeutig, dass die log10 Virusausbeute invers und linear in Beziehung zu der log10 Konzentration (r = 0.994, p < 0.001) der Zellansiedlung in einem Bereich von 3 × 104 to 2 × 105 Zellen/cm2 steht. In diesem Bereich wird ein 2.2 log10 Anstieg der Virusausbeute/ml für jede log10 Reduzierung in der Zellkonzentration erhalten. Bei 3 × 104 Zellen/cm2, der Dichte, bei der die maximale Ausbeute pro ml erhalten wurde, war die erhaltene Ausbeute 251 pfu/Zelle oder 418-fach mehr als bei 2 × 105 Zellen/cm2. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass sich der infizierte Virusertrag/ml und Ertrag/Zelle umgekehrt proportional zu der Zellansiedlungsdichte verhält. Somit kann das Interferonsystem umgangen werden und eine effiziente Produktion aufgebaut werden.

Bei hohen Zellansiedlungsdichten wurde keine Zytopathologie beobachtet, während bei niedrigen Dichten ein Absterben aller Zellen ca. einen Tag nach der höchsten Virusausbeute beobachtet wurde. Bei mittleren Dichten konnte eine partielle Zytopathologie beobachtet werden.

Entsprechend der Erfindung war es eines der Hauptziele in der Impfvirusproduktion, eine Zellansiedlung des Virus bei niedrigen Dichten auszuführen, z.B. in Zellansiedlungsdichten niedriger als 2 × 105 Zellen/cm2, bevorzugter Weise in Dichten in einem Bereich von 1 × 104 – 2 × 105 Zellen/cm2 und speziell bei 1 × 104 – 1 × 105 Zellen/cm2.

Ein anderer relevanter Aspekt in der Impfvirusproduktion bezieht sich auf die Materialien, die im Kulturmedium verwendet werden, da Fremdproteine als Komponenten in Human-Impfstoffen nicht akzeptierbar sind. Fetale bovine Serumproteine z.B. sind in einem parenteralen Produkt aufgrund seiner Immunogenizität nicht akzeptierbar. Andererseits haben Tests gezeigt, dass niedrige Virusausbeuten von Zellkulturen, z.B. CEF, durch Abwesenheit von fetalem bovinen Serum (FBS) erhalten werden. In Untersuchungsstudien wurden die Ausbeuten des 17D YF Virus bei Abwesenheit des Serums 100-fach reduziert.

Tabelle III zeigt die Replizierung des YF (17DD Subkultur) Virus und die induzierte Resistenz zur Sindbis Virus Anregung in Anwesenheit und Abwesenheit von Serum.

TABELLE III: REPLIZIERUNG DES YF 17D VIRUS UND INDUZIERTE RESISTENZ ZUR SINDBIS VIRUS ANREGUNG IN ANWESENHEIT UND ABWESENHEIT VON SERUM.

Das Ergebnis zeigt eindeutig, dass der Virus in Abwesenheit des Serums gut repliziert und keine signifikanten Änderungen in der Interferon-Induzierung auftreten. Tatsächlich kann die niedrige YF Virus Ausbeute aus CEF in der Abwesenheit von FBS dem virusstabilisierenden Effekt des Albumin Anteils des FBS zugeordnet werden.

Daher werden erfindungsgemäß Medienzusätze, die als Komponenten in parenteralen Produkten akzeptiert werden, in Zellkulturen verwendet, um das erzeugte Virus zu stabilisieren, um hohe Virusausbeuten zu erzielen, z.B. das Humanserumalbumin (HSA). Andere Substanzen, die als Komponenten in parenteralen Produkten akzeptiert werden, sind Peptide, Aminosäuren, Proteine.

Erfindungsgemäß kann die Zellkultur, die vom Virus infiziert wird, jegliche Zelle sein, sofern das Virus replizieren kann und welche akzeptierbar als Substrat für die Impfproduktion ist, speziell jeglicher Zelltyp, der Interferon produziert, in dem das Flavivirus oder Rekombinaten wachsen können und bei dem dasselben Verfahren für die Reduzierung der Zelldichte angewendet werden kann. Spezielle Beispiele beinhalten Vogleembryozellen und Säugetierzellen, wie Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF), Hühnerembryozellen (CE), humane diploide Fibroblasen (z.B. MRC-5), Affennierenzellen, fetale Rhesus-Lungenzellen (FRhL) etc..

Die Erfindung ist besonders für die Produktion des Flavivirus und die Produktion von rekombinatem Flavivirus geeignet.

Erfindungsgemäß kann rekombinanter YF Virus, wie in der mitangemeldeten Patentanmeldung BR PI 9701774 definiert, produziert werden, indem die Biomasse aus Vogelembryo-Fibroblasten besteht, besonders SPF (Specific Pathogen Free) Hühnerembryo-Fibroblastzellen. Die mitangemeldete Patentanmeldung BR PI 9701774 wird hier als Referenz genannt.

Der Produktionsprozess des hier beschriebenen YF 17D Impfstoffes wurde durch die Verwendung von mehreren Subkulturen des 17D Virus erstellt. Es gibt deswegen generell ein Verfahren für die Vermehrung des 17D Virus, das durch weitere Passagen von jeglichen 17D Subkulturen abstammt oder rekombinanten Viren, die von geklonter komplementärer cDNA durch infektiöse Klontechnologie abstammt.

Andere rekombinate YF 17D Viren können enthalten:

  • 1) chimäres Virus zur Verwendung in der Impfstoffbereitung nach Vermehrung unter Anwendung der Methoden der dargestellten Erfindung, die ein Genom einschließlich einer Nukleinsäuresequenz aufweisen, das mindestens ein Stukturprotein eines Flavivirus (dargestellt durch die hellen Flächen; s. 5) kodiert, und eine Nukleinsäure-Sequenz, die den Rest des Genoms von YF 17D kodiert, damit es funktionsfähig gemacht wird (dargestellt in den schwarzen Flächen; s. 5). Die Quelle der YF 17D Sequenzen können Plasmide pYF5'3'IV/G1/2 und pYFM5.2/T3/27 oder jegliche andere Plasmide, die YF 17D genomische Virensequenzen enthalten, sein.

    Das Schema in 5 zeigt den oberen Teil der Prototypstruktur des Flavivirus Genoms. Von der 5' Endstelle aus ist die Anordnung der kodierten Proteine wie folgt: C-prM/M; E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5. Die ersten 3 Proteine bilden die Strukturproteine, d.h. sie bilden den Virus zusammen mit dem verpackten RNA Molekül und wurden Capsid (C, 12–14 kDa) genannt, Membran (M, und seinen Precursor prM, 18–22 kDa) und Envelope (E,52–54 kDa), alle im ersten Viertel des Genoms kodiert.

    Der Rest des Genoms kodiert für nicht-Strukturproteine (NS) und ist in der Reihenfolge der Synthese von 1 bis 5 nummeriert. Drei große nicht-Strukturproteine haben hochkonservierte Sequenzen unter den Flaviviren, NS1 (38–41 kDa), NS3 (68–70 kDa) und NSS (100–103 kDa). Bisher wurde dem NS1 keine Rolle zugesprochen, aber das NS3 zeigte sich als bifunktional mit der Proteaseaktivität, die für den Prozess von Polyprotein benötigt wird, an Stellen, an denen die zelluläre Protease nicht agiert, und die nukleotide Triphosphatase/Helicasen Aktivität wird deshalb auch mit der viralen RNA Aktiviät in Verbindung gebracht. NS5, das größte und am meisten konservierte Protein, enthält verschiedene Sequenzmotive, die als üblich in der viralen RNA Polymerase angesehen werden. Die 4 kleinen Proteine NS2A, NS2B, NS4A and NS4B sind schwach konserviert in ihren Aminosäure-Sequenzen, aber nicht in ihrem aus vielfältigen hydrophobischen Strecken bestehenden Muster. An NS2A zeigte sich, dass es eine eigene Aufbereitung von NS1 benötigt, wohingegen sich an NS2B zeigte, dass es mit der Proteanen-Aktivität von NS3 assoziiert und sich selbst von NS3 entwickelt und NS4B produziert. Da virale RNA Synthese in Cytosol stattfindet in Verbindung mit RER (Rauhes Endoplasmatisches Retikulum) Membranen, wurde postuliert, dass hydrophobische Proteine in die Membrane eingebettet werden und durch Protein-Protein Interaktionen an den viralen Replikationskomplexen zusammen mit NS3 und NS5 partizipieren. Die kurzen 5'(118 Nucleotiden) und 3'(511 Nucleotiden) nichtverbundenen Regionen beinhalten Nukleotid-Sequenzelemente, von denen einige zwischen den Flaviviren konserviert sind, von denen man glaubt, dass sie an plus- und minus-Strang RNA Replikation und der plus-Strang RNA Packung beteiligt sind. Chimäre Flaviviren können das Capsid C durch das Hüllprotein E, prM-E oder nur E allein aus einem Flavivirus enthalten und den Rest aus einem zweiten Flavivirus enthalten, wie in den unteren zwei Teilen der 5 gezeigt ist. Eine Fusion zwischen den C und prM Proteinen zweier beliebiger Flaviviren, einschließlich YF, kann an dem Carboxi-Ende von C (seinen 20 letzten Aminosäuren) erzeugt werden, an der Spaltseite der viralen Protease oder an der Spaltseite der Signalase. An das erste Nukleotid des viralen Genoms schließt sich als ein geklontes cDNA bakterielles Plasmid eine bakterielle Phage Polymerase Promoter Sequenz (SP6, T7 oder T3) an, die eine effiziente in-vitro Synthese der infiziert verschlossenen RNA Abschriften erlaubt. Diese wiederum erzeugen den Virus nach der RNA Transfektion in der kultivierten Zellen.
  • 2) YF 17D Viren, die definierte Epitope, Proteinbereiche oder gesamte Proteine anderer Pathogene formulieren, die in Bezug auf spezielle Aspekte der humoralen oder zellularen Immunantwort stehen, die als Impfstoff gegen die genannte Krankheit eingesetzt werden, innerhalb der Struktur- oder nicht-Stuktur Proteingene oder den nichtkodierten Regionen des YF 17D Virus Genoms.
  • 3) YF 17D Viren, die aus einer Sub-genomischen RNA definierte Epitope, Proteinbereiche oder gesamte Proteine von anderen Patogenen formulieren, die in Bezug zu speziellen Aspekten der humoralen oder zellularen Immunantwort stehen, die als Impfstoff für die genannte Krankheit verwendet werden kann.

In allen o.g. Fällen (1–3) enthält der rekombinante Virus immer noch einen großen Anteil, wenn nicht sogar das gesamte YF 17D Genom und deswegen sind alle wichtigen Schritte für eine virale Replikation der Wirtszelle gleich dem originalen 17D Virus. Dies beinhaltet die cytoplasmatische Replikation, die Teilnahme des YF 17 viral-Proteins in der viralen RNA Synthese (plus- und minus-Strang), Polyproteinerzeugung, Capsidformung mit RNA Packung, Virusaufbau und Knospung. Nachdem alle wichtigen Aspekte, die zu einer produktiven Infektion führen, unbeachtet von ihren Ausmaßen der genetischen Modifikation auf die oben genannten Fälle erhalten bleiben, wird die hier beschriebene Methode angewendet.

Daher wird gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der YF Impfvirus unter Good Manufacturing Practices (GMP) durch infizieren der Zellen hergestellt, die für Humanimpfstoff-Produktionen zertifiziert sind und den Virus wiederherstellen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden, um die Virusvermehrung in Zellen, die für die Produktion von Humanimpfstoffen zertifiziert sind, zu erreichen, Primärkulturen von Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) in allen Produktionsschritten verwendet. Zellen sind erhältlich und präpariert in Übereinstimmung mit den WHO (World Health Organization) Richtlinien, wie in verschiedenen S.O.P's (Standard Operational Procedures) beschrieben. Besonders im Fall des YF Virus ergab die Produktion von YF 17D Impfstoffen in CEF Kulturen, trotz niedriger Ausbeuten, 3 Chargen eines experimentellen Impfstoffes, der alle Tests, einschließlich des Neurovirulenz für Affen, bestand.

Der Virus wird in Primärkulturen von Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) unter Verwendung von Eiern präpariert, die von SPF (Specific Pathogen Free) Flocken abstammen. Die Kulturen der Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) können auf verschiedene Arten hergestellt werden, z.B. Monoschichten; in Suspension, in einem passenden Bioreaktor; auf Mikroträgern adsorbiert. Die Präparation von CEF Zellen ist den Fachleuten bekannt. Zellkulturen werden in einem passenden Medium angesetzt und später infiziert. Viren werden nach der Inkubation durch Zentrifugieren oder Filtration, um die Zellablagerungen zu entfernen, erhalten. Dem Überstand, der den Virus enthält, wird ein Stabilisator zugesetzt, der, wie Fachleute wissen, dafür bekannt ist, die Stabilität der viralen Infektion während des Frierens, des Auftauens und der folgenden Manipulationen zu steigern. Viren werden bei –45°C und darunter gelagert.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung und repräsentieren bevorzugte Ausführungsformen. Fachleute wissen oder sind fähig, in nicht mehr als Routineversuchen andere geeignete Materialien oder Techniken zu finden, als die o.g. Zell- und Virus-Produktionsmethoden.

BEISPIEL 1

Der Zweck dieses Beispiels ist es, den Flavivirus, speziell den 17D Gelbfieber Virus, in Kulturen von Hühnerembryo-Firbroblastzellen (CEF) in Monoschichten wie folgt zu erhalten:

(1) SPF Hühnerembryogewebe wird in eine Zellsuspension durch enzymatische Behandlung eingebracht (Tag 0). Diese Vorbereitung ist Fachleuten bekannt;

(2) die Zellen werden wieder gewonnen und in einem geeigneten Medium supendiert, gefolgt durch Ansetzten in Monokulturgefäßen (Flakons, Rundflaschen, mehrschichtiger Brüter, Reaktoren etc) bei 0,1 bis 1,2 ml/cm2, um 104 bis 105,3 Zellen/cm2 zu erhalten;

(3) die Kultur wird für 12 bis 72 Stunden inkubiert bei 30–40°C;

(4) das Medium wird von den Monoschichten entfernt und der Virus wird in einem kleinen Volumen eines geeigneten Mediums in einer Rate von 0,2 bis 0,0001 infektiösen Einheiten pro Zelle (CCID50, LD50, pfu) zugegeben;

(5) der Virus wird für 0,5 bis 4 Std. bei 20–40°C adsorbiert (Tag 1);

(6) ein geeignetes Aufbewahrungsmittel wird zugegeben mit 0,1 bis 1,0 ml/cm2 mit oder ohne Entfernung der Stammzellen-Bereitung und Re-Inkubation bei 30–40°C für 15 bis 30Std;

(7) das Aufbewahrungsmittel wird entfernt, und die Monoschichten werden einmal oder mehrmals gewaschen und mit einem serumfreien Aufbewahrungsmittel ersetzt;

(8) die Monoschichten werden bei 30–40°C re-inkubiert (Tag 2); nach einer geeigneten Inkubationszeit (z.B. 36 bis 72 Std. nach Inokulation bei 37°C) wird das Aufbewahrungsmittel, das den Virus enthält, abgeerntet (Tag 3); und

(9) der Virus wird bei –45 bis –196°C gelagert.

Mehrfache Ernten des Virus enthaltenden Mittels können durch totale oder partielle Entfernung des Mittels in jedem gewünschten Intervall durchgeführt werden.

BEISPIEL 2

Der Zweck dieses Beispiels ist es, den Virusstabilisierenden Effekt von Albumin zu zeigen. Der Prozess im Beispiel 1, in dem humanes Albuminserum in ein Aufbewahrungsmittel eingegeben wird mit 0,01 bis 10 &mgr;g/ml in den Schritten 6,7 und 9. Die Tabellen IV und V zeigen die Ergebnisse.

TABELLE IV: STABILITÄT DES GELBFIEBER VIRUS IN EINEM MEDIUM, DAS VERSCHIEDENE KONZENTRATIONEN DES HUMANSERUMS ALBUMIN ENTHÄLT
  • * Zu hoch nummeriert um Zählung durchzuführen

Die Ergebnisse sind eindeutig Annäherungen, aber es gibt starke Anzeichen, dass 0.03125% w/v HSA unzureichend ist, um die Virusinfektionsfähigkeit zu bewahren. Die mittlere Rate des Verlusts in der Anwesenheit von 0,0625 bis 0,2500% w/v Albumin ist äquivalent 0.15 log10/Std der Halbwertszeit von 2 Std.

TABELLE V: EINFLUSS DES HUMANSERUM ALBUMIN (HSA) UND ERNTEZEIT IN DER AUSBEUTE DES YF 17D VIRUS AUS CEF

Wie in Tabelle V gezeigt wurde der höchste Titer nach 48 Std. unter Anwesenheit von 0,06 und 0,2% w/v beobachtet. Die Ausbeute pro Zelle ist höchst befriedigend mit Werten im Bereich von 100pfu/Zelle. Daher ist klar, dass HSA, das eine komplett akzeptierbare Impfkomponente ist, eine exzellente Virusausbeute ergibt. Diese Werte sollten objektiv hoch sein, da die Proben in ½ (0,3 log10) Stabilisator gelöst sind und in einem System geprüft wurden, das 0,2 bis 0,3 log10 weniger empfindlich ist, als das, was verwendet wird, um den Virus zu kontrollieren, welcher das Endprodukt ist, das durch den gegenwärtigen Prozess, z.B. bei Verwendung von ganzen Hühnerembryonen, produziert wird. Darauf basierend ergibt die Korrektur des Titers in Tabelle IV und V gezeigte Werte von 7,0 über log10 pfu/ml und sind gleich denjenigen, die in der gesamten Hühnerembryonen-Impfstoffproduktion erhalten wurden.

BEISPIEL 3

Der Zweck dieses Beispieles ist es, die Produktion des Flavivirus zu veranschaulichen, insbesondere des 17D Gelbfiebervirus, der unter Good Manufacturing Practices (GMP) durch Infizieren der Zellen, die für Humanimpfstoffbereitung zertifiziert sind, infiziert wurde.

Eine Gesamtmenge von 21 Rollflaschen mit einer Oberfläche von jeweils 680 cm2 wurde für jede Charge verwendet. Die WHO (World Health Organization) Richtlinien verlangt, dass 10% der Flaschen oder ein minimales Volumen von 500 ml der Kultur als Kontrolle verwendet werden. Zu diesem Zweck wurden 7 Flaschen, je mit 175 cm2 Oberfläche, jeweils mit stationären Kulturen für jede Charge verwendet.

Die Herstellung eines jeden Loses wurde erzielt, indem der in Beispiel 1 beschriebenen Prozedur gefolgt wurde.

Primäre CEF Zellen, die aus von SPF (Specific Pathogen Free) Flocken abgeleiteten Zellen erhalten wurden, wurden in allen Chargen verwendet. Der Seed-Virus 17DD-LOT 102/84 wurde verwendet, um alle Zellkulturen zu beimpfen.

Der Virus wurde durch die Vereinigung des vorhandenen Mediums in jedem der 3 Roller in einem Zentrifugenröhrchen gewonnen und wurde bei langsamer Geschwindigkeit zentrifugiert, um die zellularen Reste zu entfernen. Der Überschuss wurde in Flakons aspiriert, die den Stabilisator in einem Verhältnis 1:1 enthalten, und langsam durch Rotation in trockenem Ethanol-Eisbad gefroren, nachdem alle Qualitätskontroll-Aliquoten entfernt worden waren. Alle Viren werden wie im Beispiel 1 gezeigt aufbewahrt.

Die Produktionsdaten sind unten in der Tabelle VI dargestellt.

TABELLE VI: PRODUKTION UND QUALITÄTSKONTROLLDATEN VON GELBFIEBER-IMPFSTOFFEN IN HÜHNEREMBRYO-FIBROPLASTEN (CEF) UNTER GMP HERGESTELLT

Jedes Los wurde auf Sterilität, Wirksamkeit und sekundäre Wirkstoffe mit zufrieden stellenden Ergebnissen getestet.

BEISPIEL 4

Der Zweck dieses Beispieles ist es, die Herstellung des rekombinanten YF Virus einschließlich chimäre Viren unter Verwendung des Prozesses der vorliegenden Erfindung zu beschreiben.

Der YF 17D Virus aus der Patentanmeldung BR PI 9701774 wird von Plasmiden pYF5'3'IV/G1/2 und pYFM5.2/T3/27 regeneriert und wird nachstehend erwähnt als YFiv5.2/DD. Die Plasmide pYF5'3'IV/G1/2 and pYFM5.2/T3/27 wurden in der American Type Culture Collection hinterlegt und jeweils mit der ATCC Accession Nr. 97771 und 97772 identifiziert.

a) RNA Transfektion

Die Transfektion von CEF Zellen wurde mit LipofectAMINE® (Life Technologies catalogue # 18324-012) ausgeführt. Es ist eine 3:1 (w/w) Liposom Formulierung des Polykationischen Lipides 2,3-Dioleyloxy-N-[2(Sperminecarboxiamid)Ethyl]-N-N,Dimethyl-2,3-bis(9-Octadecenyloxy)-1-Ropanaminium-Trifluoracetat und dem neutralen Dioleoylphosphatidyl Ethanolamine (DOPE) in membran-gefiltertem Wasser in einer Konzentration von 20 &mgr;g/ml in RNase-freiem PBS. PBS- Phosphat Puffer Saline – wird hergestellt und sterilisiert mittels Autoclav bei 121°C für 20 min. Die LipofectAMINE® wird in ein 5ml Polystyrol-Röhrchen pipetiert, die PBS enthält. Primäre CEF Zellen werden angesetzt und 24 Std. nach Ansatz verwendet.

Die Transkriptions Mischung wird tropfenweise zu der Zellkultur-Monoschicht zugegeben. Die Zellen werden für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird die Mischung durch Aspiration entfernt, mit PBS gewaschen und für 72 Std. in 199 Medium inkubiert.

Die überschüssige Kultur bildet nach der Zugabe des Stabilisators den viralen Bestand. Der virale Bestand wird auf Sterilität, Toxizität, Wirksamkeit und das Vorhandensein von Zusatzwirkstoffen getestet. Der virale Bestand ist das Ursprungsimpfgut.

Die spezielle Infektiösitat der Transkription wird von den Versuchen abgeleitet, in denen serielle Lösungen der RNA in Vero-Zellen eingeimpft werden und diese mit halbfestem Medium überlagert werden. Die Plaque, die zum Zählen mit kristallinem Violett eingefärbt wird, und die Menge an RNA, die durch Messung der OD (optischen Dichte) bei 260 nm bestimmt wird, erlauben die Ermittlung der speziellen Infektiösität der Transkription (PFU/&mgr;g gesamte RNA).

Diese Ermittlung ist relevant für die Erzeugung der Mehrzahl von Infektionsereignissen, die zum Ursprungsbestand führen. Es garantiert eine akzeptable Anzahl von Ereignissen äquivalent zu den Infektionen mit Lebendvirus, um die Möglichkeit von Akkumulation von Mutationen in viralen Genomen zu verringern, angesichts der hohen Anzahl von Replikationszyklen bedingt durch den niedrigen RNA Einsatz.

b) Herstellung der Impfgut-Lose

Alle Lose wurden in Primärkulturen der CEF Zellen unter der Verwendung von Eiern präpariert, die aus SPF (Specific Pathogen Free) Flocken gewonnen wurden. Die Viren werden gewonnen durch Vereinigung des Überschusses in Zentrifugenflaschen, der in jeder Flasche vorhanden ist, und bei einer niedrigen Geschwindigkeit zentrifugiert, um die zellulären Reste zu entfernen. Der Überschuss wird in Flaschen, die den Stabilisator in einem Verhältnis 1:1 enthalten, aspiriert und langsam durch Rotieren in einem Ethanol-Trockeneisbad nach Entfernen aller Qualitätskontroll-Aliquoten gefroren. Alle Viren werden wie oben angegeben aufbewahrt.

b.1) Bereitung der Original-Impfgut-Lose

Das originale Keimlos besteht aus dem Material, das von 3 seperaten Transkriptions/Transfektions Experimenten stammt, durchgeführt an verschiedenen Tagen mit verschiedenen Chargen der Primär CEF Kultur.

Primäre Hühnerembryo-Fibroblasen wurden angesetzt. Im Gesamten wurden 3 Einweg-T-Flaschen von 175 cm2, die in-vitro transkribierte RNA beinhalten, in CEF Zellen unter der Verwendung von LipofectAmine® transfiziert. Jede T-Flasche bildet insgesamt 80ml überschüssiger Kultur. In 3 separaten Transaktionen, die an verschiedenen Tagen und deswegen mit verschiedenen Chargen von CEF Zellen durchgeführt wurden, waren die Titer der orignalen Impfgutchargen: T1, 104,66 (4,66 log10 pfu/ml); T2, 104,87 (4,87 log10 pfu/ml); T3, 105,46 (5,46 log10 pfu/ml). Jede Charge liefert ein Gesamtvolumen von 480 ml des originalen Virus. 80 ml wurden für Qualitätskontrollen verwendet, die restlichen 400 ml für die Bereitung der Primärimpfgutchargen.

b.2) Bereitung der Primärimpfgutchargen

Zwei Primärimpfgutchargen wurden bereitet und LP1 und LP2 genannt. LP1 stammt von dem originalen Keimlos T3 ab, wohingegen LP2 von T2 abstammt. Alle wurden auf Sterililät, Wirksamkeit und Zusatzwirkstoffe mit zufriedenstellenden Ergebnissen getestet.

Die erhaltenen Volumen und Titer sind:

b.3) Sekundäre Impfgut-Chargen

Drei sekundäre Keimchargen wurden bereitet und LS1, LS2, und LS3 genannt. LS1 und LS2 stammen von der primären Impfgut-Chargen LP1 ab, wohingegen LS3 von LP2 abstammt. Alle wurden auf Sterililät, Wirksamkeit und Zusatzwirkstoffe mit zufriedenstellenden Ergebnissen getestet.

Die erhaltenen Volumen und Titer sind

Jede dieser Impfgut-Chargen sollte ausreichend sein für die YF Impfproduktion unter Verwendung der aktuellen Herstellungsmethoden (embryonierte Eier) oder des Zellsystems (CEF Zellen) für ungefähr 50 Jahre bei einer Rate von mindestens 50 Millionen Dosen/Jahr.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Herstellung eines Flavivirus in einer Zellkultur, wobei das Verfahren aufweist:

    (a) Bereiten einer Kultur von Zellen, die für das Virus permissiv sind und als ein Substrat zur Impfstoff-Herstellung annehmbar sind;

    (b) Suspendieren der Zellen in einem geeigneten Medium, gefolgt von Ansetzen einer Zellkultur mit einer geringeren Dichte als 2 × 105 Zellen/cm2;

    (c) Inkubieren der Zellkultur bei 30–40° C für eine Zeitdauer zwischen 12 und 72 Stunden;

    (d) Entfernen des Mediums aus der Zellkultur von Schritt (c) und Inokulieren der Zellen mit Beimpfungsvirus;

    (e) Inkubieren der Zellkultur von Schritt (d) bei 20–40° C für eine Zeitdauer zwischen 12 und 144 Stunden;

    (f) Entfernen des Mediums, einmaliges oder mehrmaliges Waschen der Zellen und Ersetzen des Mediums;

    (g) Inkubieren der Zellkultur von Schritt (f) bei 30–40° C für eine Zeitdauer zwischen 12 und 144 Stunden;

    (h) zumindest teilweise Entnehmen des Virus enthaltenden Kultur-Überstands; und

    (i) Aufbewahren des Virus bei einer Temperatur von –45° C oder niedriger.
  2. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Gelbfieber (YF)-Virus17D in einer Zellkultur, wobei das Verfahren aufweist:

    (a) Bereiten einer Kultur von Zellen, die für das Virus permissiv sind und als ein Substrat zur Impfstoff-Herstellung annehmbar sind;

    (b) Ansetzen einer Zellkultur mit einer geringeren Dichte als 2 × 105 Zellen/cm2;

    (c) Transfizieren der Zellen mit Nucleinsäuren, die zur Herstellung eines rekombinanten YF-Virus 17D in einer Zellkultur geeignet sind, durch Behandlung mit synthetischen Lipiden oder Elektroporation;

    (d) Inkubieren der Zellkultur bei 30–40° C für eine Zeitdauer zwischen 12 und 72 Stunden;

    (e) Entfernen des Mediums aus der Zellkultur von Schritt (d) und Inokulieren der Zellen mit Beimpfungsvirus;

    (f) Inkubieren der Zellkultur von Schritt (e) bei 20–40° C für eine Zeitdauer zwischen 12 und 144 Stunden;

    (g) Entfernen des Mediums, einmaliges oder mehrmaliges Waschen der Zellen und Ersetzen des Mediums;

    (h) Inkubieren der Zellkultur von Schritt (g) bei 30–40° C für eine Zeitdauer zwischen 12 und 144 Stunden;

    (i) zumindest teilweise Entnehmen des Virus enthaltenden Kultur-Überstands; und

    (j) Aufbewahren des Virus bei einer Temperatur von –45° C oder niedriger.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Kultur in den Schritten (e) und (g) von Anspruch 1 oder den Schritten (f) und (h) von Anspruch 2 zwischen 12 und 72 Stunden inkubiert wird.
  4. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem Mehrfachentnahmen von Virus enthaltendem Medium in beliebigen gewünschten Intervallen durchgeführt werden, indem das entfernte Medium ersetzt wird und die Kultur erneut für eine Zeitdauer zwischen 12 und 144 Stunden inkubiert wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Kultur für eine Zeitdauer zwischen 12 und 72 Stunden erneut inkubiert wird.
  6. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem jegliche Zellreste und vollständige Zellen von dem entnommenen Virus entfernt werden.
  7. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem das Virus inaktiviert wird.
  8. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem das Ansetzen der Zellkultur bei Dichten in dem Bereich von 1 × 104 bis 2 × 105 Zellen/cm2 durchgeführt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem das Ansetzen der Zellkultur bei einer Dichte in dem Bereich von 1 × 104 bis 1 × 105 Zellen/cm2 durchgeführt wird.
  10. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem in Schritt (h) von Anspruch 1 oder in Schritt (i) von Anspruch 2 dem Überstand Stabilisator zugesetzt wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem der Stabilisator eine Substanz ist, die als eine Komponente in parenteralen Produkten annehmbar ist, und die Humanserumalbumin (HSA), ein Peptid, eine Aminosäure oder ein Protein und/oder ein Gemisch davon ist.
  12. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 und 3 bis 11, bei dem das Flavivirus Gelbfieber-Virus ist.
  13. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 2 bis 11, bei dem das rekombinante Virus ein chimäres Virus mit einem Genom ist, das eine Nucleinsäure-Sequenz, die mindestens ein Strukturprotein von einem Flavivirus kodiert, und eine Nucleinsäure-Sequenz, die den Rest des Genoms eines YF-Virus 17D kodiert, aufweist, um das rekombinante Virus funktionsfähig zu machen.
  14. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die Zellen Hühnerembryo-Zellen oder Säugetier-Zellen sind, die Interferon erzeugende Zellen sind, wenn sie einer Virusinfektion ausgesetzt werden.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem die Zellen Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF), Hühnerembryo-Zellen (CE), menschliche diploide Fibroblasten, Affen-Nierenzellen oder fetale Rhesus-Lungenzellen (FRhL) sind.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die menschlichen diploiden Fibroblasten MRC-5-Zellen sind.
  17. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem die Zellen primäre Zellen oder Zellen, die weiter subkultiviert wurden, sind.
  18. Verfahren nach irgendeinem der vorangehenden Ansprüche, bei dem das Virus eine Virus-Wildform, ein abgeschwächtes oder rekombinantes Virus ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem das Virus Gelbfieber-Virus ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem das Gelbfieber-Virus abgeschwächt wird.
  21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, bei dem das Gelbfieber-Virus der YF 17D-Virusstamm und Unterstämme davon ist.
Es folgen 11 Blatt Zeichnungen






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