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Dokumentenidentifikation DE60024259T2 27.07.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001185628
Titel TRENNUNG EINES HUMANEN RETROVIRUS
Anmelder The Government of the United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services, Atlanta, Ga., US
Erfinder SWITZER, M., William, Stone Mountain, US;
HENEINE, Walid, Atlanta, US;
SANDSTROM, A., Paul, Decatur, US;
FOLKS, M., Thomas, Lithonia, US
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 60024259
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 14.06.2000
EP-Aktenzeichen 009398835
WO-Anmeldetag 14.06.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/US00/16433
WO-Veröffentlichungsnummer 2000077177
WO-Veröffentlichungsdatum 21.12.2000
EP-Offenlegungsdatum 13.03.2002
EP date of grant 23.11.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 27.07.2006
IPC-Hauptklasse C12N 7/02(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 7/01(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 5/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 35/76(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12Q 1/70(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61P 35/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 7/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/867(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 48/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung wurde durch die Centers for Disease Control and Prevention, einer Institution der Regierung der Vereinigten Staaten, gemacht.

Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Retrovirus, ein Spumavirus, das aus einem Menschen isoliert worden ist. Genauer gesagt, das neue Spumavirus kann als ein Vektor zur Gentherapie oder als ein Impfstoff zur Impfung mit rekombinantem Virus verwendet werden. Die Erfindung kann auch als ein Reagenz bei Studien zur Pathogenität verwandter Viren dienen, und sie kann verwendet werden, um Menschen auf eine Spumavirus-Infektion hin zu untersuchen.

Hintergrund der Erfindung

Das Spumavirus, auch bekannt als „Foamy-Virus" aufgrund der charakteristischen Vakuolisierung, die das Virus in Zellkultur induziert, gehört zu einer abgegrenzten Gruppe von Retroviren. Die Affen-Foamy-Viren (simian foamy viruses, SFVs) schließen auch Isolate von Altwelt- und Neuwelt-Affen ein und werden auf der Grundlage von serologischen Kreuzreaktivitäten in 10 verschiedene Serotypen eingeteilt. Das Virus scheint in dem Wirt langfristig in einer latenten Form zu persistieren, und es kann in Gegenwart eines neutralisierenden Antikörpers existieren.

Gegenwärtig wird von dem am Besten untersuchten Retrovirus, dem menschlichen Immundefizienzvirus (human immunodeficiency virus, HIV) angenommen, dass es aus einer Übertragung von nicht-menschliche Primaten auf Menschen hervorgegangen ist, die sich vor einiger Zeit ereignet hat. Bedenken hinsichtlich des Risikos einer Übertragung von Retroviren von nicht-menschlichen Primaten (non-human primates, NHP) auf Menschen, die in Forschungslaboratorien arbeiten, wuchsen in den frühen 1990ern, als zwei Personen nach einer arbeitsbedingten Exponierung Antikörper gegen das Affen-Immundefizienzvirus (simian immunodificiency virus, SIV) entwickelten, von denen eine Person eindeutige Anzeichen einer persistierenden viralen Infektion aufwies. (Siehe CDC Anonymous survey for simian immunodeficiency virus (SIV) seropositivity in SIV laboratory researchers –– United -States, 1992. MMWR Morb. Mort. Wkly. Rep. 1992; 41: 814–5; Khabbaz R. F. et al. Brief report: infection of a laboratory worker with simian immunodeficiency virus. New Eng. J. Med. 1994, 330: 172–7; Khabbaz R. F. et al. Simian immunodeficiency virus needlestick accident in a laboratory worker. Lancet 1992; 340: 271–3: und CDC. Guideline to prevent simian immunodeficiency virus infection in laboratory workers an animal handlers. MMWR 1988; 37: 693–704.) Zusätzlich zu dem SIV werden Arten von nicht-menschlichen Primaten, die in der biomedizinischen Forschung eingesetzt werden, üblicherweise mit dem Affen-Foamy-Virus (simian foamy virus, SFV), dem Affen-T-Zell-lymphotropen Virus (simian T-cell lymphotropic virus, STLV) und/oder Retroviren vom Typ D infiziert. Alle diese Retroviren verursachen lebenslange Infektionen in den NHP, und von einigen ist bekannt, dass sie durch Sexualkontakt, Blut oder durch Stillen übertragen werden. Es ist kein eindeutiger Zusammenhang zwischen natürlichen SFV-Infektionen in nicht-menschlichen Primaten und einer Erkrankung hergestellt worden. Bei den NHP kann eine Infektion mit den anderen Retroviren zu einem klinischen Spektrum führen, das von einer asymptomatischen Infektion bis hin zu lebensbedrohlichen Immundefizienzsyndromen oder lyphoproliferativen Störungen reicht. Die Übertragungswege von SFVs zwischen nicht-menschlichen Primaten bleiben unbestimmt, doch die Prävalenz der Serumreaktivität ist unter in Gefangenschaft gehaltenen erwachsenen nicht-menschlichen Primaten hoch.

Studien zur Prävalenz einer Spumavirus-Infektion bei Menschen sind begrenzt, und die Befunde sind nicht eindeutig. Allerdings gibt es einige Hinwiese auf eine menschliche Infektion mit SFV (Antikörper und positive PCR-Ergebnisse). Von einem solchen Auftreten ist nur bei zwei Personen berichtet worden, von denen beide beruflichen Risiken einer Infektion ausgesetzt waren. Von einer damit verbundenen Erkrankung wurde in keinem der Fälle berichtet (siehe Schweizer M. et al. Absence of foamy virus DNA in Graves' disease. AIDS Res. & Human Retrov. 1994; 10: 601–5; Neumann-Haefelin D. et al., Foamy viruses. Intervirology 1993; 35: 196–207; und Schweizer M. et al., Markers of foamy virus infections in monkeys, apes, and accidentally infected humans: appropriate testing fails to confirm suspected foamy virus prevalence in humans. AIDY Res. & Human Retrov. 1995; 11: 161–70).

Ein weiterer nicht schlüssiger Hinweis wurde in frühen Studien beobachtet, die eine relativ hohe Rate an Serumreaktivität gegenüber Antikörpern gegen Spumaviren unter menschlichen Populationen beschrieb, von denen nicht bekannt war, dass sie Kontakt mit nicht-menschlichen Primaten gehabt hätten. Bei einigen Beispielen war die Serumreaktivität andeutungsweise mit einer menschlichen Erkrankung, einschließlich Störungen des Zentralnervensystems, Schilddrüsenerkrankungen und dem chronischen Erschöpfungssyndrom, gekoppelt. Bei den meisten Beispielen fehlte diesen Studien ein eindeutiger Hinweis auf eine menschliche Infektion, und sie wurden anschließend nicht bestätigt. (Siehe Heneine, W. et al., Absence of evidence for human spumaretrovirus sequences in patients with Graves' disease [Letter]. J. Acq. Immune Defic. Synd. & Human Retrov. 1995; 9: 99–101; Simonsen, L. et al., Absence of evidence for infection with the human spumaretrovirus in an outbreak of Meniere-like vertiginous illness in Wyoming, USA [Letter]. Acta Oto-Laryngologica 1994; 114: 223–4; und Heneine, W. et al., Lack of evidence for infection with known human and animal retroviruses in patients with chronic fatigue syndrome. Clin. Infect. Dis. 1994; 18: S121–5)

Neue Publikationen zeigen, dass frühere serologische Tests, die menschliche Spumavirus-Antikörper in der menschlichen Population zeigen, falsch waren. Eine immunologischen Untersuchung eines vorher beschriebenen menschlichen Spumavirus zeigt in Komplementfixierungs-, Immunfluoreszenz- und Neutralisierungstests, dass das Virus gemeinsame Antikörper mit dem Schimpansen-Foamy-Virus SFV-6 teilte. Das Virus, das als menschliches Foamy-Virus, HFV, bekannt ist, wurde aus einem Nasenkarzinom abgeleitet, und vom ihm wird jetzt angenommen, dass es sich nicht um ein menschliches Foamy-Virus, sondern um ein Schimpansenvirus handelt. Das Scheitern, einen serologischen Hinweis auf eine HFV-Infektion in Personen aus einem weitreichenden geografischen Bereich zu erhalten, legte nahe, dass dieses Virusisolat eine Variante von SFV-6 war, insbesondere da Seren von Schimpansen, die auf natürliche Weise mit SFV-6 infiziert waren, beide Viren neutralisierten. Bei einer Untersuchung zur Prävalenz von HFV in mehr als 5000 menschlichen Seren, die von geographisch verschiedenen Populationen gesammelt wurden, wurde keines der Serumproben als positiv bestätigt. Nimmt man die Sequenzanalyse, welche die phylogenetischen Nähe des vorgeblichen menschlichen Spumavirus zu SFV-6 bestätigt, hinzu, legen diese Daten stark nahe, dass HFV in der menschlichen Population natürlicherweise nicht gefunden wird. (Siehe Ali, M. et al., „ No evidence of antibody to Human Foamy Virus in widespread human populations," AIDS Research and Human Retroviruses, Vol. 12, No. 15, 1996).

Neue menschliche Spumaviren sind bei Menschen gefunden worden, die mit nicht-menschlichen Primaten Kontakt hatten. Diese neuen Viren sind einzigartige Viren, die sich in Menschen reproduzieren und dennoch keine Erkrankung verursachen. Diese Viren werden in dem US-Patent Nr. 5,882,912 und der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 60/105,811 offenbart. Die Existenz neuer menschlicher Retroviren in Menschen, die ursprünglich aus Affenquellen stammen, zeigt einen Bedarf an Zusammensetzungen und Verfahren zur immunologischen Untersuchung der menschlichen Population auf die Prävalenz einer Spumavirus-Infektion ebenso wie zum Untersuchen des menschlichen Blutvorrats.

Neue Bedenken, dass eine Xenotransplantation, d.h. die Verwendung lebender Gewebe aus nicht-menschlichen Spezies bei Menschen zu medizinischen Zwecken, neue Infektionen in die menschliche Gemeinschaft einführen könnte, hat die Bedeutung gesteigert, die Fähigkeit von Affen-Retroviren, Menschen zu infizieren und/oder bei diesen eine Erkrankung zu verursachen, zu definieren. (Siehe Chapmanm L. E. et al. Xenotransplantation and xenogeneic infections. New Engl. J. Med. 1995; 333: 1498–1501; DHHS. Docket No. 96M-0311. Draft Public Health Service (PHS) Guideline on Infectious Disease Issues in Xenotransplantation. Federal Register Vol. 61, No. 185. September 23, 1996). Gegenwärtig sind die wichtigsten Tierspezies, die als Spender für Xenotransplantate in Betracht gezogen werden, Affen und Schweine, obwohl andere Spezies in Zukunft in Betracht gezogen werden können. Folglich sind das, was benötigt wird, Zusammensetzungen und Verfahren zum Nachweisen von Viren, die von den nicht-menschlichen Organspendern auf den menschlichen Empfänger übertragen werden. Zusätzlich kann Information, welche diese übertragbaren Agenzien betrifft, wertvolle Information über die zellulären Rezeptoren des Organspenders verfügbar machen, die für den Transplantationserfolg wichtig ist.

Gentherapien haben lange nach einem guten Vektor gesucht, der das gewählte fremde Gen in menschliche Zelle transportieren kann. Das Fehlen jeglicher Kenntnis über eine Erkrankung, die mit dem Virus der vorliegenden Erfindung im Zusammenhang steht, macht die vorliegende Erfindung zu einem idealen Kandidaten für Gentherapie-Behandlungen. Folglich werden Zusammensetzungen und Verfahren zur Gentherapie benötigt, die einen Vektor verwenden, der in der Lage ist, eine wesentliche Menge an Fremd-DNA zu befördern, die in den Wirtsorganismus eindringen wird, ohne eine Erkrankung zu verursachen.

Zusammensetzungen und Verfahren zur Impfung unter Verwendung rekombinanter lebender Retroviren werden ebenfalls benötigt. Ein lebendes Virus, das keine Krankheit bei Menschen verursacht, und das Gene von gewählten Antigenen in sein Genom aufgenommen hat, würde ein hervorragendes Werkzeug zur Impfung verfügbar machen. Das Retrovirus würde sich in dem menschlichen Wirt reproduzieren und das Immunsystem Antigenen aussetzen, so dass eine Immunantwort ausgelöst werden kann.

Ein zielgerichteter Angriff auf sich fortpflanzende Zellen ist ein Ziel der Krebsbehandlung. Was benötigt wird, sind Zusammensetzungen und Verfahren zur Krebsbehandlung, die für sich teilende Zellen spezifisch sind, die keine systemische Schädigung des Krebspatienten verursachen. Ein Virus, das sich teilende Zellen infizieren und abtöten könnte, ohne andere Zellen des Wirts abzutöten, würde eine Lösung zur Krebsbehandlung verfügbar machen.

Kurzfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren und Zusammensetzungen gerichtet, die ein neues Spumavirus oder ein Foamy-Virus, taxonomisch als SFVHu-6 bezeichnet, umfasst. Das Virus wurde bei der American Type Culture Collection (ATTC) am 2. Dezember 1998 hinterlegt. Die vorliegende Erfindung umfasst eine isoliertes menschliches Spumavirus, das nachweislich aus einem Menschen ohne Erkrankung abgeleitet wurde. Das neue Spumavirus der vorliegenden Erfindung ist durch Gewebekulturzellen erhalten worden, wo es die Vakuolisierung der Zellen verursacht, die für Foamy-Viren charakteristisch ist.

Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung eines sich replizierenden Virussystems, um lebende, sich teilende Zellen in einem Wirt oder in vitro abzutöten. Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren und Zusammensetzungen, die Impfstoffe zur Impfung mit rekombinantem lebendem Virus umfassen, wobei SFVHu-6 als der virale Vektor verwendet wird. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweis von Spumavirus oder von Antikörpern gegen das Spumavirus in biologischen Flüssigkeiten, Geweben oder Organen.

Dementsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen verfügbar zu machen, die ein neues Spumavirus umfassen.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Nachweisen eines Spumavirus verfügbar zu machen.

Es ist noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweisen des Vorhandenseins und der Menge von Spumavirus in einer Köperflüssigkeit oder einem Organ verfügbar zu machen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Zusammensetzungen und Verfahren zum Behandeln genetischer und physiologischer Störungen unter Verwendung von Gentherapietechniken verfügbar zu machen, welche das neue Spumavirus der vorliegenden Erfindung als einen Vektor für Nukleinsäuresequenzen und Antisense-Sequenzen umfassen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Zusammensetzungen und Verfahren verfügbar zu machen, die zur Manipulation der Expression von Genen nützlich sind.

Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Impfstoffe verfügbar zu machen.

Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Zusammensetzungen und Verfahren zum Behandeln viraler Infektionen bei Menschen oder Tieren verfügbar zu machen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Zusammensetzungen und Verfahren verfügbar zu machen, die beim Behandeln genetischer Erkrankungen wirksam sind.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verfahren zum Behandeln mikrobieller Infektionen bei Menschen oder Tieren verfügbar zu machen.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Behandlungen von Zuständen verfügbar zu machen, die teilweise durch ein rasches Wachstum sich teilender Zellen verursacht werden.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Impfstoffe mit lebendem rekombinantem Virus verfügbar zu machen.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, diagnostischen Werkzeuge, wie etwa Antikörper oder Antigene, zum Überwachen des Blutvorrats oder von Spenderorganen und – gewebe in Bezug auf das Vorhandensein des Spumavirus verfügbar zu machen.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Reagenzien für Pathogenitätsstudien verfügbar zu machen.

Diese und andere Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden nach einer Durchsicht der nachfolgenden genauen Beschreibung der offenbarten Ausführungen und der beigefügten Ansprüche offensichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1a ist ein DNA-Sequenzvergleich zwischen SFVHu-6 und verschiedenen Affenviren, die aus Schimpansen-Subspezies isoliert wurden. Die Zahlen geben die prozentuale Identität zwischen SFVHu-6 und den Viren, die aus einzelnen Schimpansen, Quelle „Chimp B1", und anderen Schimpansen, mit denen die exponierte Person gearbeitet hat, A055, A101, A136 und A182, isoliert wurden, in den Integrase-, gag- und ORF2-Genregionen an.

2(a und b) sind phylogenetische Stammbäume, welche die Beziehungen zwischen der Integrase-Gensequenz des neuen Spumavirus der vorliegenden Erfindung und bekannten Spumaviren von anderen nicht-menschlichen Primaten und verschiedenen Schimpansen-Subspezies, einschließlich der Quelle Chimp B1, zeigen.

3 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme des Spumavirus SFVHu-6, das aus dem Patienten, der als „Fall 6" bezeichnet wird, isoliert wurde.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren und Zusammensetzungen gerichtet, die ein neues Spumavirus, SFVHu-6, umfassen. Das neue Spumavirus der vorliegenden Erfindung hat eine Vielzahl von Anwendungen, die teilweise auf seiner charakteristischen Unfähigkeit beruhen, eine Erkrankung bei dem infizieren Menschen zu verursachen, und auf seiner Unfähigkeit, zwischen einem infizierten Menschen und nahen Kontaktpersonen des Menschen übertragen zu werden. Einige dieser Nutzen schließen die Verwendung von Zusammensetzungen ein, die sich von dem menschlichen Spumavirus ableiten, als einem Reagenz zur immunologischen Untersuchung eines Menschen auf Spumaviren, insbesondere solchen Menschen, die mit nicht-menschlichen Primaten (NHP) arbeiten, ebenso wie auf eine Spumavirus-Infektion im Allgemeinen. Das neue Spumavirus der vorliegenden Erfindung kann auch als ein Vektor in der Gentherapie dienen, da das Virus keine Erkrankung bei Menschen zu verursachen scheint und nicht auf andere Menschen übertragen wird. Das neue Spumavirus ist ein nützlicher Kandidat als ein Gentherapie-Vektor. Zusätzlich kann das neue Spumavirus der vorliegenden Erfindung als ein Reagenz bei Pathogenitätsstudien an diesen und anderen verwandten Viren verwendet werden. Darüber hinaus können die Sequenzen von SFVHu-6 der vorliegenden Erfindung als Sonden verwendet werden, um das Virus oder Antikörper gegen das Virus in biologischen Proben nachzuweisen. Vektoren schließen prokaryotische, eukaryotische und virale Vektoren ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Das Spumavirus der vorliegenden Erfindung kann auch als ein Impfstoff mit lebendem rekombinantem Virus verwendet werden. Zusätzlich kann das Spumavirus der vorliegenden Erfindung als ein sich sich replizierende Virussystem verwendet werden, um lebende, sich teilende Zellen entweder in vitro oder in vivo abzutöten.

Die Spumaviren oder Foamy-Viren sind die am Wenigsten gut charakterisierten Retroviren. Sie sind als Agenzien isoliert worden, die eine Vakuolisierung (ein „Schäumen" oder „foaming") bei Zellen in Kultur, die sich von einer Reihe von Säugetierarten ableiten, einschließlich Affen, Rindern, Katzen und angeblich Menschen, verursachen. Eine persistierende Infektion mit diesen Viren steht mit keiner bekannten Erkrankung im Zusammenhang.

Neue Studien, welche verbesserte diagnostische Tests verwenden, haben keinen Hinweis auf eine Infektion von Menschen mit dem menschlichen Foamy-Virus bei Studien an umfangreichen Populationen (annähernd 8000 Personen) gezeigt. Angesichts dieser Ergebnisse ist die Identifizierung einer Serumreaktivität bei 6 Personen, die berufsbedingt einem Kontakt mit nicht-menschlichen Primaten ausgesetzt waren, nicht auffällig, und es sind mehrere verschiedene neue Spumaviren aus solchen Arbeitern isoliert worden.

Zwei dieser menschlichen Spumaviren, SFVHu-1 und SFVHu-3, die in dem US-Patent Nr. 5,882,912 und im Dokument PCT/US99/25171 offenbart werden, wurden aus zwei berufsbedingt exponierten Arbeitern isoliert. SFVHu-1 weist strukturelle und funktionelle Ähnlichkeiten mit einem Ursprung des Affen-Spumavirus der afrikanischen grünen Meerkatze auf, während das SFVHu-3 Ähnlichkeiten mit einem Pavian-artigen Affen-Spumavirus aufweist.

Die vorliegende Erfindung umfasst die Isolierung und Charakterisierung eines Spumavirus, SFVHu-6, für das gezeigt worden ist, dass es von einem nicht-menschlichen Primaten auf einen Menschen zu einem Zeitpunkt in der Vergangenheit übertragen worden ist. Das Retrovirus der vorliegenden Erfindung wird, anders als ein anderes Retrovirus von stärker virulenter Natur, dem HIV-1 (menschliches Immundefizienz-Virus vom Typ 1), nicht leicht von Mensch zu Mensch übertragen. Das Spumavirus der vorliegenden Erfindung kann zum Diagnostizieren von Spumavirus-Infektionen verwendet werden, und es kann als ein Vektor bei Gentherapie-Verfahren verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung schließt auch Verfahren und Zusammensetzungen zum Nachweisen von Spumavirus in biologischen Flüssigkeiten ein. Die Verfahren und Zusammensetzungen, einschließlich Kits, können in jeder Gestaltung, die denjenigen, die sich auf dem Fachgebiet auskennen, bekannt sind, vorliegen. Die vorliegende Erfindung schließt auch Antikörper ein, die für das Spumavirus spezifisch sind, und Antikörper, welche die Bindung von Antikörpern, die für das Spumavirus spezifisch sind, hemmen. Diese Antikörper können polyklonale Antikörper oder monoklonale Antikörper oder Fragmente davon sein. Die Antikörper, die für das Spumvirus spezifisch sind, können in diagnostischen Kits verwendet werden, um das Vorhandensein und die Menge an Spumavirus in biologischen Flüssigkeiten oder in Organen von nicht-menschlichen Primaten zur Xenotransplantation nachzuweisen. Antikörper, die für das Spumavirus spezifisch sind, können an einen Menschen oder ein Tier verabreicht werden, um den Menschen oder das Tier gegen das Spumavirus passiv zu immunisieren, wodurch eine Infektion durch eine unbeabsichtigte Exposition gegenüber Flüssigkeiten von nicht-menschlichen Primaten reduziert wird.

Die vorliegende Erfindung schließt auch Zusammensetzungen und Verfahren, einschließlich Kits, zum Nachweis des Vorhandenseins und der Menge von Antikörpern ein, die das Spumavirus in Körperflüssigkeiten binden. Die Verfahren, einschließlich Kits, können in jeder Gestaltung vorliegen, die denjenigen, die sich auf dem Fachgebiet auskennen, gut bekannt sind. Derartige Kits zum Nachweis des Spumavirus selbst oder zum Nachweis von Antikörpern gegen das Spumavirus können verwendet werden, um den Blutvorrat im Bezug auf das Vorhandensein des Spumavirus in dem Blutvorrat zu überwachen.

Die vorliegende Erfindung schließt auch Verfahren und Zusammensetzungen ein, welche Impfstoffe mit rekombinantem lebendem Virus umfassen. Exogene Gene können in das Genom des Virus der vorliegenden Erfindung eingefügt werden. Die Gene können jedes Protein oder Proteine kodieren, gegen die eine Impfung oder eine Gentherapie gewünscht ist. SFVHu-6 kann dem Wirt eine große Menge an Antigen zur Verfügung stellen, indem das Virus befördert wird. Als ein Beispiel einer solchen Anwendung wird SFVHu-6, das exogene Gene befördert, an einen Menschen verabreicht, wobei das Virus die Zellen infizieren und sich replizieren würde. Die exogenen Gene würden translatiert werden, und sie würden dem Immunsystem des Menschen die ausgewählten Antigene zur Verfügung stellen. Ein neuer Aspekt von derartigen rekombinanten lebenden Viren ist, dass SFVHu-6 keine Erkrankung im Menschen verursacht. Zusätzlich findet keine Übertragung von einem Menschen auf einen anderen nicht-infizierten Menschen statt, selbst bei engem Kontakt mit Austausch von Körperflüssigkeiten. Die Impfstoffe mit rekombinantem lebendem Virus der vorliegenden Erfindung machen eine oder mehrere Antigene in einem optimalen Verfahren für das Immunsystem des ausgewählten Menschen verfügbar.

Die vorliegende Erfindung schließt weiterhin Verfahren und Zusammensetzungen zur Verwendung eines sich replizierenden viralen Systems ein, um lebende, sich teilende Zellen in einem Wirt oder in vitro abzutöten. Bei in vitro-Anwendungen kann SFVHu-6 verwendet werden, um sich rasch teilende Zellen zu entdecken und abzutöten. Foamy-Viren, einschließlich SFVHu-6, können eine breite Vielfalt von Zellarten infizieren, und sie können in vielen in vitro-Zellsystemen verwendet werden. Wenn beispielsweise der Test des in vitro-Zellsystems die Identifizierung ruhender Zellen erfordert, würde die Verabreichung von SFVHu-6 an das Gewebekultursystem zur Selektion der sich rasch teilenden Zellen durch SFVHu-6 führen. Von den Gewebekulturzellen würden alle infiziert werden, doch nur die sich teilenden Zellen würden zerstört werden, da SFVHu-6 eine produktive Infektion verursacht und seine zytopathische Zerstörung sich nur auf sich teilende Zellen auswirkt. Die restlichen sich nicht teilenden Zellen würden am Leben bleiben.

In einem Wirt macht die Fähigkeit von SFVHu-6, sich teilende Zellen zu infizieren, eine hervorragende Behandlung für Zustände verfügbar, die auf das Vorhandensein von sich rasch teilenden Zellen zurückzuführen sind. Beispielsweise könnte eine Person mit einer Erkrankung, die auf sich rasch teilende Zellen zurückzuführen ist, wie etwa Krebs oder jeder bekannte angiogene Zustand, wie etwa Angiogenese-abhängige Erkrankungen, mit SFVHu-6 infiziert werden. Ein derartiges Virus könnte andere exogene Gene für anderen Wirkungen in dem Wirt befördern oder dies nicht tun. Weil SFVHu-6 keine Erkrankung bei Menschen verursacht und da keine Übertragung des Virus bei engen Kontakten mit Menschen stattfindet, wird nur die Person mit der Erkrankung, die auf sich rasch teilende Zellen zurückzuführen ist, behandelt werden. Das Virus wird die sich rasch teilenden Zellen infizieren und sie abtöten. Beispielsweise würde eine Person mit einem rasch wachsendem Tumor mit SFVHu-6 infiziert werden, und die Zellen des Tumors würden durch das Virus zerstört werden. Das SFVHu-6 kann rekombinant modifiziert werden, beispielsweise um für zelluläre Rezeptoren auf dem Tumor selektiv zu sein, um zu erreichen, dass das Virus sogar noch spezifischer genau jene Zellen anzielt.

Eine derartige Behandlung mit SFVHu-6 könnte bei jedem Zustand verwendet werden, bei dem sich rasch teilende Zellen einen Aspekt der Pathologie des Zustands darstellen. Ein solcher Zustand ist das Vorhandensein einer unkontrollierten Angiogenese im Körper. Angiogenese-abhängige Erkrankungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden teilweise durch das rasche Wachstum von Blutgefäßen verursacht.

Als Antwort auf die Identifizierung einer Infektion durch das Affen-Immundefizienzvirus (SIV) bei Personen, die mit Affen arbeiten oder bei arbeitsbedingt exponierten Arbeitern arbeiteten die Centres for Disease Control and National Institutes for Health in einer anonymen Serumstudie an Personen mit ähnlichen Exponierungen bei der Arbeit zusammen. Eine Serumreaktivität des Affen-Immundefizienzvirus war in 3/427 (0,7%) der Serumproben vorhanden, die von diesen anonymen Arbeitern gelagert wurden (siehe CDC, Anonymous survey for simian immunodeficiency virus (SIV) seropositivity in SIV laboratory researchers –– Unites States, 1992. MMWR, Morb. Mort. Wkly. Rep. 1992; 41: 814–5; Khabbaz, R. F. et al., Brief report: infection of laboratory worker with simian immunodeficiency virus. New Eng. J. Med. 1994; 330: 172–7). Folglich wurde ein Programm zum Testen und Beraten von Freiwilligen entwickelt, das eine Verbindung zwischen spezifischen Exponierungen oder gesundheitlichen Ergebnissen und dem Serumstatus von Personen erlaubte, die berufsbedingt dem Affen-Immundefizienzvirus ausgesetzt waren. Die Arbeiter, die an dieser freiwilligen, eine Verbindung herstellenden, prospektiven Studie zum Affen-Immundefizienzvirus beteiligt waren, wiesen auch ein arbeitsbedingtes Risiko für eine Exponierung gegenüber anderen Retroviren auf, die bei NHP häufig sind.

1995 wurde die verbundene Untersuchung ausgeweitet, um ein Testen und Beraten von Freiwilligen bei einer Exponierung gegenüber Affen-Spumaviren (häufiger als Affen-Foamy-Viren oder SFV bezeichnet), Affen-T-lymphtropen Viren (STLV) und Affen-Retroviren vom Typ D (STRV) einzuschließen. 1823 Proben aus 13 Instituten der Vereinigten Staaten sind auf das Affen-Immundefizienzvirus getestet worden; Proben von 231 der teilnehmenden freiwilligen Arbeitern wurden auch auf andere Retroviren aus nicht-menschlichen Primaten getestet. Bei vier dieser 231 Arbeiter (1,7%) wurde durch Serologie und PCR festgestellt, dass sie mit einem SFV-artigen Virus infiziert waren.

Eine Prävalenz im Serum von 3% (4/133) wurde durch Western blot-Analyse bei Zooarbeitern festgestellt, die Kontakten mit Säugetieren, einschließlich NHP, ausgesetzt waren. Keiner der 189 nicht exponierten Zooarbeiter war SFV-positiv. Arbeiter, die arbeitsbedingt Kontakten mit NHP in Zoos oder bei der Primatenforschung ausgesetzt sind, tragen ein Risiko für SFV-Zoonosen, vor allem durch Schimpansen, und stellen deshalb eine einzigartige Population dar, um das pathogene Potential und die Übertragbarkeit von zoonotischen SFV-Infektionen zu untersuchen.

Ein Immunfluoreszenztest, der unter Verwendung von Zellen entwickelt wurde, die mit einem Schimpansen-Foamy-Virus, SFV-6cpz, infiziert waren, identifizierte Antikörper gegen ein SFV-artiges Virus in kürzlich gesammelten Serumproben eines Arbeiters (als „Fall 6" bezeichnet). Die Proben erwiesen sich auch im Western blot als positiv, wobei sich eine Reaktivität gegen Banden von sowohl dem p70- als auch dem p74-gag-Vorläufer des SFV-6cpz-Antigens zeigte. Ein wiederholtes Testen zusätzlicher Seren, die von diesem Arbeiter zu späteren Zeitpunkten erhalten wurden, waren ebenfalls in beiden Tests positiv.

Zusätzliche Blutproben von Fall 6 wurden auf provirale SFV-DNA-Sequenzen unter Verwendung von Polymerasekettenreaktions (PCR)-Tests getestet, bei denen Sets von Primern von zwei Regionen des Polymerase-Gens eingesetzt wurden, die unter bekannten Primaten-Foamy-Viren konserviert sind. Bei allen Proben erwiesen sich beide Regionen als positiv in der PCR. Die PCR-Produkte von drei Regionen (dem gag-, Integrase- und ORF2-Gen) wurden sequenziert. Es ergab sich eine 93–100% Identität zwischen den Virussequenzen, die für die SFV-infizierte Schimpansenquelle (SEQ ID 2, 4, 6) bestimmt wurden und für die Virussequenzen, die für das menschliche SFCHu-6 (SEQ ID 1, 3, 5) von Fall 6 bestimmt wurden. Diese enge Sequenzidentität bestätigt, dass das Virus ursprünglich aus dem Schimpansen B1 stammt und auf den Fall 6 übertragen wurde. Die korrespondierenden RNA-Sequenzen und die resultierenden Proteine können von diesen Sequenzen abgeleitet werden und sind in den Umfang der vorliegende Erfindung eingeschlossen.

Die SEQ ID 1 umfasst 613 Nukleotide des gag-Gens von SFVHu-6, die SEQ ID 3 umfasst 425 Nukleotide des int(Integrase)-Gens von SFVHu-6 und die SEQ ID 5 umfasst 240 Nukleotide des ORF2 von SFVHu-6. Die SEQ ID 7 umfasst den 3'-Teil des env(Envelope)-Gens, das vollständige ORF1- und ORF2-Gen und das 5'-Ende des 3'-LTR von SFVHu-6. Die SEQ ID 2 umfasst 616 Nukleotide des gag-Gens des Virusisolats von B1. Die SEQ ID 4 umfasst 425 Nukleotide des Integrase-Gens des Virusisolats von B1, und die SEQ ID 6 umfasst 240 Nukleotide des ORF2 des Virusisolats von B1.

Die als Fall 6 bezeichnete Person wurde 1977 durch den Schimpansen B1 heftig gebissen. Der Schimpanse B1 ist gegenwärtig in gutem gesundheitlichem Zustand. Es stellte sich heraus, dass eine Serumprobe, die von dem Schimpansen B1 erhalten wurde, positiv in Bezug auf SFV-Antikörper war. Die SFV-Sequenzen aus peripheren Blutlymphozyten (peripheral blood lymphocytes, PBL) von B1 und von vier anderen, mit SFV infizierten Schimpansen aus derselben Einrichtung wurden amplifiziert und mit Fall 6 verglichen. Sowohl die Integrase- als auch gag-Regionen der Sequenzen von Fall 6 und dem Schimpansen B1 waren nicht zu unterscheiden (100% Identität). Im Gegensatz dazu waren die SFV-Integrase- und gag-Sequenzen der vier Kontroll-Schimpansen zu 92,7–93,6% und 84,4 bzw. 84,7% zu denen von Fall 6 homolog. Siehe 1, die ein Vergleichsdiagramm zeigt. Die beobachtete Identität der SFV-Sequenzen spiegelt die hohe genetische Stabilität von SFV wider, ein Kennzeichen, dass bei Infektionen mit menschlichen/Affen-T-lymphotropen Viren eher beobachtet wird als bei HIV/SIV-Infektionen. Diese genetische Stabilität macht die vorliegende Erfindung einzigartig gut geeignet für gentherapeutische Anwendungen.

Die Entdeckung der Subspezies-spezifischen Diversität von SIV bei Schimpansen (SIVcpz) eröffnete die Möglichkeit, dass eine ähnliche Evolution von SFV bei Schimpansen-Subspezies den Sequenzunterschied zwischen Fall 6 und den Kontroll-Schimpansen erklären könnte. Deshalb wurde die Subspezies von allen fünf Schimpansen durch Analyse von Mitochondrien-DNA bestimmt. Es wurde festgestellt, dass B1 Pan troglodytes troglodytes (P. t. troglodytes) war, während die anderen vier Schimpansen, die mit dem nahe verwandten SFV infiziert waren, zu Pan troglodytes verus (P. t. verus) gehörten. Die Beziehung zwischen dem SFVHu-6-Isolat und anderen bekannten Spumaviren wird in 2 (a und b) gezeigt, die einen phylogenetischen Stammbaum auf der Grundlage der Homologie der Nukleotidsequenzen dieser Viren zeigt. Die phylogenetische Analyse unter Verwendung der Integrasesequenz zeigt deutlich, dass das Sequenzpaar von Fall 6 und vom Schimpansen B1 in den Stamm von Schimpansensequenzen fällt, jedoch keine Gruppen (cluster) mit irgendwelchen anderen Sequenzen bildet, einschließlich jenen aus den vier Kontroll-Schimpansen. Folglich ist die Quelle von SFV im Fall 6 der Schimpanse B1. Die Identifizierung dieser primären zoonotischen SFV-Infektion macht eine einzigartige Möglichkeit verfügbar, um die frühen Ereignisse einer Retrovirus-Adaptation an den menschlichen Wirt zu untersuchen.

Der Fall 6 macht eine seltene Möglichkeit verfügbar, um die SFV-Genomstabilität sowohl während einer zoonotischen Übertragung als auch bei einer persistierenden menschlichen Infektion zu untersuchen.

Das SFV, das bei verschiedenen Spezies von nicht-menschlichen Primaten endemisch ist, zeigte das größte Ausmaß einer genomischen Sequenzdiversität in der U3-Region der langen terminalen Wiederholungssequenz (long terminal repeat, LTR) und der akzessorischen offenen Leseraster (open-reading frames, ORF) am 3'-Ende, was nahe legt, dass adaptive Änderungen während einer Zoonose auftreten können. Bei den Foamy-Viren hilft die LTR bei der Replikation des Virus. Die LTR wird durch ein virusspezifisches Protein transaktiviert und, anders als bei einem verwandten Retrovirus, dem HIV, aktivieren keine menschlichen zellulären Transkriptionsfaktoren das Virus. Die LTRs in Retroviren, wie etwa dem HIV, weisen konservierte Konsensussequenzen für zelluläre Transkriptionsfaktoren auf.

Es ist bekannt, dass ein anderes Spumavirus, das aus dem Menschen stammt, stabile, konservierte LTRs und interne Promotoren aufweist, wodurch konservierte, transkriptionell wichtige Regionen in derartigen Viren verfügbar gemacht werden. Die in 1 gezeigte Sequenzanalyse zeigt, das es wenig genetische Variation gibt, die bei einer zwischenartlichen Übertragung von SFV auf Menschen auftritt. Folglich zeigt diese Stabilität in Bezug auf gentherapeutische Verwendungen, dass das Virus keine menschlichen Sequenzen erwirbt, die es veranlassen würden, möglicherweise virulent zu werden oder mindestens eine Erkrankung bei Menschen aufgrund von eingeführten Mutationen zu verursachen. Mit solchen konservierten Regionen ist SFVHu-6 ein hervorragender Vektor, ein Impfstoff oder ein gentherapeutisches Mittel für Menschen. Die Stabilität ist überraschend angesichts der hohen Instabilität der LTR des Virus, das als HFV(human foamy virus) bekannt ist. Das HFV wurde aus einem Nasenkarzinom abgeleitet, und es wird jetzt angenommen, dass es sich nicht um ein menschliches Foamy-Virus, sondern um ein Schimpansenvirus handelt. Die HFV-LTR ist instabil und weist viele Deletionen auf, was sie zu einem unerwünschten Vektor macht.

Bis heute ist eine zoonotische Übertragung von NHP-Retroviren auf Menschen nur durch einen indirekten Nachweis untermauert worden, wie etwa einer phylogenetischen Beziehung zwischen NHP und menschlichen Retroviren. Die vorliegende Erfindung ist der erste direkte Nachweis einer vom Schimpansen auf den Menschen übertragenen retroviralen Zoonose. Um den Speziesursprung von SFVHu-6 zu bestimmen, wurden zwei PBL-abgeleitete FV-Sequenzen mit SFV-Prototypsequenzen aus verschiedenen nicht-menschlichen Primatenspezies verglichen. Diese Sequenzen stellen konservierte (Integrase) oder variable (gag) genomische Regionen unter den Sequenzen von SFV dar. Die Ergebnisse zeigten, dass beide Sequenzen die höchste Homologie zu SFV von Schimpansen aufwiesen (ungefähr 93% und 85% bei den Integrase- bzw. gag-Sequenzen). Folglich ist der Ursprung der Foamy-Virus-Infektion bei Fall 6 ein Schimpanse.

SFVHu-6 wird in den PBL des Wirts gefunden und wird aus solchen Zellen in Gewebekultursystemen kultiviert. Eine Aktivität der reversen Transkriptase ist in den PBL und im Plasma des infizierten Wirts gefunden worden. Eine Isolierung des Virus SFVHu-6 wurde durch gemeinsames Kultivieren (Co-Kultivierung) der PBL der Person, die als Fall 6 identifiziert wurde, mit Thymozytenzellen vom Hund (Cf2th) erreicht. Wichtig ist, dass diese Isolierung eine Zelllinie identifiziert hat, die eine empfängliche Wirtszelllinie zum Isolieren von SFVHu-6 und anderen Schimpansen-artigen Spumaviren ist. Eine Aktivität der reversen Transkriptase wurde in gemeinsamen Kulturen von Zellen, die PBLs ausgesetzt waren, nachgewiesen, nicht jedoch bei Kontrollen. Eine Übertragung von Überstand von den oben bezeichneten Zellen, die den PBL von Fall 6 ausgesetzt waren, übertrug diese reverse Transkriptase-Aktivität auf nicht-infizierte Zellen, die anschließend eine zytopathische Wirkung (cytopathic effect, CE) zeigten. Dieser Befund zeigte, dass das infektiöse Agens in den PBL von Fall 6 auf Gewebekulturzellen übertragen wurde, die verwendet wurden, um das infektiöse Agens auf andere Gewebekulturzellen zu übertragen. Zusätzlich zeigte dies, dass das infektiöse Agens sich in den Hundethymozyten (Cf2th)-Zellen reproduzierte. Eine DNA-PCR-Untersuchung von infizierten Zellen erwies sich als positiv für ein SFV-artiges Virus. Infizierte Zellen zeigten sowohl in einem Immunfluoreszenztest als auch im Western blot eine ausgeprägte Reaktivität mit Seren vom Fall 6, und sie zeigten keine Reaktivität mit normalen Kontrollseren. Durch Elektronenmikroskopie wurde gezeigt, dass infizierte Hundethymozyten (Cf2th)-Zellen, die aus zellfreien Überständen von Zellen stammten, die durch Exposition gegenüber infizierten PBL infiziert wurden, eine Morphologie zeigten, die für eine Foamy-Virus-Infektion charakteristisch ist (siehe 3).

Die vorliegende Erfindung ist auf Zusammensetzungen und Verfahren gerichtet, die ein neues Spumavirus, SFVHu-6, umfassen. Das Virus wurde aus einem Menschen isoliert, der eine schwere Verletzung aus einem Kontakt mit einem Schimpansen davongetragen hatte, und der außerdem Kontakten mit vielen anderen nicht-menschlichen Primaten ausgesetzt war. Das neue Spumavirus oder Foamy-Virus scheint keinerlei Erkrankung in menschlichen Wirten zu verursachen. Das neue Virus der vorliegenden Erfindung ist ein hervorragender Vektor zu Gentherapie und zu Impfzwecken. Zusätzlich können die Antikörper oder andere Nachweisverfahren zum Nachweisen des neuen Virus verwendet werden, um das Vorhandensein dieses Virus oder verwandter Viren nachzuweisen. Zusätzlich kann das neue Spumavirus der vorliegenden Erfindung als ein Reagenz bei Pathogenitätsstudien an diesen und verwandten Viren verwendet werden. Darüber hinaus können die Sequenzen des neuen Spumavirus der vorliegenden Erfindung als Sonden verwendet werden, um das Virus in biologischen Proben nachzuweisen. Vektoren schließen prokaryotische, eukaryotische und virale Vektoren ein, ohne darauf beschränkt zu sein.

Die Sequenzen in SEQ ID 1 bis 6 können für alle die molekularbiologischen Techniken verwendet werden, die denjenigen, die sich auf dem Fachgebiet auskennen, bekannt sind. Derartige Verwendungen schließen die Erzeugung von Sonden und Vektoren ein, welche die Sequenzen, Antisense-Sequenzen, die von derartigen Sequenzen abgeleitet werden, RNA-Sequenzen, wie etwa Antisense-RNA, Ribozym-RNA, Köder-RNA und Proteine, die unter Verwendung dieser Sequenzen synthetisiert werden, ein, ohne darauf beschränkt zu sein. RNA und andere Nukleinsäurederivate werden durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen. Spumaviren können umfangreiche Deletionen tolerieren und noch infektiös bleiben. Derartige Deletionsorte können als Orte eines Einfügens von exogenen Sequenzen verwendet werden, was durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen wird. Zusätzlich können exogene Sequenzen ohne Deletionen eingefügt werden.

Viele neue und potentiell nützliche Technologien sind entwickelt worden, welche virale Vektoren verwenden und die Grundlage für zukünftige medizinische Behandlungen und Therapien bilden können. Beispiele derartiger Technologien schließen eine Genersatztherapie, Antisense-Gentherapie, in situ-Heilmittelabgabe, Behandlung von Krebs- oder infektiösen Agenzien sowie eine Impftherapie ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Allerdings erfordern diese Technologien ein wirksames Mittel zur Abgabe der genetischen Information über zelluläre Membranen, um erfolgreich zu sein. SFVHu-6 kann als ein Vektor wirken, um derartige Gene beim Infizieren von Zellen zu befördern.

Die neue Technologieeinführung und Fortschritte beim Verständnis der Struktur und Funktion vieler Gene machen es möglich, die Aktivität eines vorgegebenen Gens abzustellen oder zu modifizieren. Eine Änderung der Genaktivität kann auf vielen Wegen erreicht werden. Beispielsweise ist für Oligonukleotide, die zu bestimmten Gen-Botschaften (messages) oder viralen Sequenzen komplementär sind, bekannt als „Antisense"-Verbindungen, gezeigt worden, dass sie eine inhibitorische Wirkung gegen Viren aufweisen. Beim Schaffen einer Antisense-Verbindung, die mit der angezielten RNA-Botschaft von Zellen oder Viren hybridisiert, kann die Translation des Botschaftmoleküls zu einem Protein unterbrochen oder verhütet werden. Auf diese Art und Weise kann die Genaktivität moduliert werden.

Die Fähigkeit, spezifische Gene zu deaktivieren, macht große therapeutische Vorteile verfügbar. Beispielsweise ist es theoretisch möglich, virale Erkrankungen mit Antisense-Molekülen zu bekämpfen, die virale Genprodukte ausfindig machen und diese zerstören. In Gewebekultur haben Antisense-Oligonukleotide Infektionen durch Herpesviren, Influenzaviren und dem menschlichen Immundefizienzvirus, das AIDS verursacht, gehemmt. Es kann auch möglich sein, Antisense-Oligonukleotide gegen mutierte Onkogene gezielt anzuzielen. Die Antisense-Technologie besitzt auch das Potential zum Regulieren von Wachstum und Entwicklung. Damit allerdings die Gentherapie funktioniert, müssen Antisense-Sequenzen über zelluläre Plasmamembranen an das Zytosol abgegeben werden.

Die Genaktivität wird auch unter Verwendung von Sense-DNA mit einer Technik, die als Gentherapie bekannt ist, modifiziert. Fehlerhafte Gene werden ersetzt oder unterstützt durch die Verabreichung von „guten" oder normalen Genen, die nicht Gegenstand des Defekts sind. Anstatt fehlerhaft zu sein, sind die Gene deletiert worden, wodurch eine Ersatztherapie eine Kopie des Gens zur Verwendung durch die Zelle verfügbar machen würde. Die verabreichten normalen Gene können sich entweder in ein Chromosom einfügen, oder sie können als extrazelluläre DNA vorhanden sein, und sie können verwendet werden, um normale RNA herzustellen, was zur Produktion des normalen Genprodukts führt. Auf diese Art und Weise können Defekte und Mängel in der Produktion eines Genprodukts korrigiert werden.

Noch eine weitere Gentherapie weist das Potential auf, die normale genetische Ausstattung einer Zelle zu erhöhen. Beispielsweise ist vorgeschlagen worden, dass ein Weg, HIV zu bekämpfen, darin besteht, in die T-Zellen einer infizierten Person ein Gen einzuführen, das die Zellen gegenüber einer HIV-Infektion resistent macht. Diese Form von Gentherapie wird manchmal als „intrazelluläre Immunisierung" bezeichnet. Genetisches Material, wie etwa eine Polynukleotidsequenz, kann an ein Säugetier in einem viralen Vektor verabreicht werden, um eine Immunantwort gegen das Genprodukt der verabreichten Nukleotidsequenz auszulösen. Derartige Gen-Impfstoffe lösen eine Immunantwort auf die folgende Weise aus. Zunächst wird der virale Vektor, der die Nukleinsäuresequenz enthält, an einen Menschen oder ein Tier verabreicht. Als nächstes wird die verabreichte Sequenz exprimiert, um ein Genprodukt in dem Menschen oder Tier zu bilden. Das Genprodukt in dem Menschen oder Tier wird als fremdes Material erkannt, und das Immunsystem des Menschen oder Tiers veranlasst eine immunologische Antwort gegen das Genprodukt. Das Virus der vorliegenden Erfindung kann auch als ein viraler Vektor verwendet werden, um die fremden Nukleinsäuresequenzen für die intrazellulären metabolischen Prozesse verfügbar zu machen.

Zusätzlich kann eine Gentherapie als ein Verfahren zum Abgeben von Heilmitteln in vivo verwendet werden. Wenn beispielsweise Gene, die therapeutische Verbindungen kodieren, an Endothelzellen abgegeben werden können, würden die Genprodukte einen erleichterten Zugang zum Blutstrom haben. Zusätzlich könnten Zellen mit einem retroviralen Vektor infiziert werden, wie etwa durch die vorliegende Erfindung, der Nukleinsäuresequenzen befördert, die pharmazeutische Mittel kodieren, welche das Auftreten einer Infektion in den retroviral infizierten Zellen verhüten.

Das neue Spumavirus der vorliegenden Erfindung kann auch als ein sicheres und wirksames Impfmittel verwendet werden. Exogene genetische Sequenzen für immunogene Proteine oder Polypeptide oder Antigenfragmente aus einer Vielfalt von infektiösen Mitteln können in die Foamy-Virus-RNA (dem Genom des Virus) aufgenommen werden. Wenn es sich erst einmal im Inneren einer Zelle befindet, wird das Genprodukt exprimiert, und das immunisierende Peptid wird in das Immunsystem des Körpers freigesetzt. Bei einem anderen Verfahren kann das Virus der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um den Körper gegen Zellmarker zu immunisieren, die auf Krebs- oder Tumorzellen gefunden werden. Die genetische Sequenz des Krebszellmarkers wird in die Nukleinsäuren des Foamy-Virus aufgenommen, und nach Infektion mit dem Virus stimuliert das exprimierte Genprodukt das Immunsystem. Das Immunsystem des Patienten wird verwendet, um die Krebszellen zu entfernen, wodurch die Notwendigkeit chemotherapeutischer Verfahren umgangen wird.

Die Nukleinsäuresequenzen des Virus der vorliegenden Erfindung, SEQ ID 1, 3, 5 und 7, können bei einer Vielfalt von Verfahren, einschließlich PCR-Tests, verwendet werden, ohne darauf beschränkt zu sein. Zusätzlich können die Sequenzen verwendet werden, um das Vorhandensein von Schimpansen-artigen Spumaviren, ähnlich wie SFVHu-6, in Organen, Geweben oder Zellen nachzuweisen. Die Sequenzen können auch verwendet werden, um auf eine Übertragung von Spumaviren bei Tieren zu testen, die mit nicht-menschlichen Primaten in Kontakt sind. Beispielsweise zeigen Zooarbeiter die größte Reaktivität gegenüber Antigenen vom Schimpansen-Foamy-Virus (3). Folglich können diese Zooarbeiter und andere in der Tierpflege tätigen Arbeiter in Zentren für nicht-menschliche Primaten routinemäßig auf eine Exposition gegenüber Spumaviren von verschiedenen nicht-menschlichen Primaten getestet werden. Dieses erleichtert umfassende Pathogenitätsstudien, bei denen die Arbeiter auf die Übertragung von Viren aus den Tieren, die von den Wärtern gepflegt werden, zu testen. Folglich kann die Erfindung sowohl als ein Reagenz bei Pathogenitätsstudien dienen, als auch zum Untersuchen auf eine Spumavirus-Infektion beim Menschen verwendet werden.

Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um das Vorhandensein des Virus oder von viralen Partikeln der vorliegenden Erfindung in Köperflüssigkeiten oder Geweben nachzuweisen. Diese Antikörper können auf den klassischen Wegen erzeugt werden, wie etwa Immunisierung von Tieren mit Virusproteinen, um Antikörper zu erzeugen, oder durch Entwicklung monoklonaler Antikörper unter Verwendung immunologischer oder molekularbiologischer Techniken. Diese Antiköper oder Antikörperfragmente können in diagnostischen Kits oder Untersuchungskits verwendet werden, um das Vorhandensein des Virus, beispielsweise in klinischen Proben, zu beurteilen. Zusätzlich können die Antikörper verwendet werden, um Organe von nicht-menschlichen Primaten, die beim Menschen verwendet werden können, zu untersuchen. Der Nachweis des Vorhandenseins eines Virus, das von nicht-menschlichen Primaten auf Menschen übertragen worden ist, wäre zum Verfügbarmachen von virusfreien Organen zur Transplantation äußerst wichtig.

Zusätzlich wird die Möglichkeit, auf das Vorhandensein von Virus oder einem Antikörper gegen das Virus bei den in der Tierpflege tätigen Arbeitern zu untersuchen, Verfahren zum Überwachen des Virusstatus solcher Arbeiter verfügbar machen. Wenn ein in der Tierpflege tätiger Arbeiter den Körperflüssigkeiten eines Tieres ausgesetzt ist und eine virale Übertragung möglich ist, dann können die Antikörper der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um solche Arbeiter passiv zu immunisieren.

Das Virus der vorliegenden Erfindung kann zur Behandlung von Zuständen verwendet werden, die auf das Vorhandensein von sich rasch teilenden Zellen zurückzuführen sind. In einem Wirt macht die Fähigkeit von SFVHu-6, sich teilende Zellen produktiv zu infizieren, eine hervorragende Behandlung von Zuständen verfügbar, die auf das Vorhandensein von sich rasch teilenden Zellen zurückzuführen sind. Beispielsweise könnte eine Person mit einer Erkrankung, die auf sich rasch teilende Zellen zurückzuführen ist, einschließlich Krebs oder jedem bekannten angiogenen Zustand, ohne darauf beschränkt zu sein, mit SFVHu-6 infiziert werden. Derartige Viren könnten andere exogene Gene für andere Wirkungen in dem Wirt befördern, oder sie könnten dies nicht tun. Da SFVHu-6 keine Erkrankung in dem Wirt verursacht, und da keine Übertragung des Virus bei Kontakten mit dem Wirt erfolgt, wird nur die Person mit dem Zustand, der auf sich rasch teilende Zellen zurückzuführen ist, behandelt werden. Zusätzlich werden nur die sich rasch teilenden Zellen dieser Wirtsperson durch SFVHu-6 produktiv infiziert werden. Andere Zellen im Körper können infiziert werden, werden jedoch nicht abgetötet werden, da die Infektion in sich nicht teilenden Zellen nicht produktiv ist. Das Virus wird produktiv die sich rasch teilenden Zellen infizieren und diese abtöten. Beispielsweise würde eine Person mit einem schnell wachsenden Tumor mit SFVHu-6 infiziert werden, und die Zellen des Tumors würden durch das Virus zerstört werden. Zusätzlich kann das Virus einer Person gegeben werden, bevor die Person einen Zustand entwickelt, der durch sich teilende Zellen verursacht wird, und wenn die Zellen beginnen, sich zu teilen, würde das Virus dann eine produktive Infektion durchmachen und die Zellen abtöten. Diese Therapie könnte derartige Zustände wie Leukämie oder Angiogenese-abhängige Erkrankungen, wie etwa die Makuladegeneration, anhalten oder hemmen.

Eine derartige Behandlung mit SFVHu-6 könnte bei jedem Zustand verwendet werden, bei dem sich rasch teilende Zellen einen Aspekt der Pathologie des Zustands darstellen. Ein derartiger Zustand ist das Vorhandensein einer unkontrollierten Angiogenese im Körper. Angiogenese-abhängige Erkrankungen sind im Stand der Technik gut bekannt und werden teilweise durch das rasche Wachstum von Blutzellen verursacht. Ein weiterer derartiger Zustand ist Krebs oder Tumorwachstum. Krebs oder Tumoren schließen sowohl solide Tumoren als auch andere Arten ein. Eine Infektion mit dem Virus der vorliegenden Erfindung, das keine Erkrankung verursacht und den Wirt nicht systemisch beeinflusst, ist eine Verbesserung gegenüber den derzeit bekannten Behandlungen, die systemisch verabreichte Mittel beinhalten. Derartige chemotherapeutische Mittel töten sich rasch teilende Zellen, verursachen jedoch auch ein Trauma der ganzen Person.

Im Gegensatz dazu sind Behandlungen von Krebs mit der vorliegenden Erfindung nicht so schädlich für den Patienten. Anders als HFV wurde die vorliegende Erfindung nicht von einem Patienten abgeleitet, der an einem Karzinom leidet, und stellt deshalb keine Gefahr für den Patienten dar. Das Virus kann entweder systemisch verabreicht oder in situ in den Tumor injiziert werden. Das Virus wird sich nur in sich rasch teilenden Zellen replizieren, und es wird Zellen, die sich nicht teilen, nicht beeinflussen. Die infizierten Zellen werden abgetötet und das Tumorwachstum wird gestoppt. Das Virus kann bei einer Behandlung oder bei einer Serie von Behandlungen verabreicht werden.

Das SFVHu-6 der vorliegenden Erfindung kann rekombinant modifiziert werden, um für zelluläre Rezeptoren auf dem Tumor selektiv zu sein, um zu erreichen, dass das Virus sogar noch spezifischer genau jene Zellen anzielt. Zusätzlich kann das Virus veränderte Promotorregionen aufweisen, die selektiv aktiviert werden können, um eine produktive Infektion zu verursachen. Die Kombination von unterschiedlichen Stärken einer Kontrolle des Virus, sowohl des natürlichen als auch des rekombinant hergestellten, werden von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen. Ein Virus könnte für das Anheften an nur bestimmte Arten von zellulären Rezeptoren spezifisch gemacht werden, für solche Zellen, die sich teilen, und es wird eine Replikation nur dann durchlaufen, falls ein weiterer exogener Promotorfaktor vorhanden ist. Eine virale Infektion durch zwei oder mehrere individuell beschädigte Viren, die Faktoren oder Promotoren erfordert, die durch andere Foamy-Viren oder jede Art von Virus geliefert werden, könnten unterschiedliche Stärken einer Kontrolle der Infektion oder Behandlung spezifischer Zustände verfügbar machen.

Das Virus kann dem Wirt zur Krebsbehandlung, Gentherapie oder Impfung durch jede Verfahren, die denjenigen, die sich auf dem Fachgebiet auskennen, bekannt sind, verabreicht werden. Derartige Verfahren schließen eine Injektion, Inhalation, Aufnahme durch Verzehr, eine topische Verabreichung und Implantation ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Das Virus kann abgetötet oder lebend sein, was von der berücksichtigten Behandlung abhängt. In vitro-Verwendungen des Virus, der Sequenzen, Vektoren oder Sonden werden durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen.

Das Virus der vorliegenden Erfindung verursacht keine Erkrankung und scheint durch enge häusliche Kontakte oder Sexualkontakte nicht übertragen zu werden. Diese Annahme wird durch die epidemiologischen Daten, die PCR- und Sequenz-Daten und die Serologiedaten unterstützt. Das Isolat vom Fall 6, SFVHu-6, wurde bei der ATCC unter dem Budapester Vertrag am 2. Dezember 1998 hinterlegt und erhielt die ATCC-Nr. VR-2635.

Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele, die folgen, weiter beschrieben. In den Beispielen werden alle Teile in Gewichtsteilen angegeben, sofern nicht anders angegeben.

BEISPIELE Beispiel 1

Periphere Blutlymphozyten (PBLs) wurden aus dem Fall 6 isoliert und wurden 48 Stunden mit IL-2 in RPMI-Medium mit 10% fötalem Kälberserum und Pen-Strep-Antibiotika kultiviert. Nach 48 Stunden wurden die PBLs zu den Hundethymozyten (Cf2th)-Zellen gegeben und 2 bis 4 Wochen mit diesen gemeinsam kultiviert (co-kultiviert). Die Zellen wurden in DMEM, supplementiert mit 2% nicht-essentiellen Aminosäuren, 20% fötalem Kälberserum und Pen-Strep-Antibiotika, gehalten. Überstände von 1 ml wurden von den Zellkulturen alle 3 bis 4 Tage gesammelt und auf Amp-reverse-Transkriptase getestet. Verfahren zur PBL-Behandlung, zum Kultivieren von Hundethymozyten (Cf2th)-Zellen und zur Messung der AMP-reversen-Transkriptase waren Verfahren, die denjenigen, die sich auf dem Fachgebiet auskennen, bekannt sind. Siehe beispielsweise Heneine, W. et al. „Detection of reverse transcriptase by a highly sensitive assay in sera from persons infected with HIV-1." (1995). J. Infectious Diseases, 171: 1201–6.

Beispiel 2

Aufgrund der positiven Amp-reversen-Transkriptase-Aktivität von Zellen von Fall 6 wurden periphere Blutlymphozyten von Fall 6 vor der Zugabe zu Hundethymozyten (Cf2th)-Zellen 48 Stunden mit IL-2 kultiviert. Alle 3 bis 4 Tage wurden Überstände gesammelt und auf Amp-reverse-Transkriptase-Aktivität getestet. Die Kulturen wurden auch auf eine Infektion der Hundethymozyten (Cf2th) durch PCR-Amplifikation und Sondieren von SFV-artigen DNA-Sequenzen untersucht. Jedes Mal wurde die 1 ml-Probe des Überstands zum Testen der Amp-reversen-Transkriptase-Aktivität genommen, eine 5 ml-Probe des Überstands wurde genommen und bei –80°C eingefroren, um eine Probe des Virus zu konservieren, das die Amp-reverse-Transkriptase-Aktivität produziert.

Am Tag 7 zeigte der Amp-reverse-Transkriptase-Test ein schwach positives Signal bei der Hundethymozyten (Cflth)-Zellkultur. Die Hundethymozyten (Cflth)-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. Die Amp-reverse-Transkriptase-Aktivität nahm über die Zeit zu. Auf dem Gipfel der Amp-reversen-Transkriptase-Aktivität wurden zellfreie Überstände auf frische Hundethymozyten (Cf2th)-Zellen, die zu einer Dichte von 2 × 105 Zellen/ml gewachsen waren, übertragen. Am Tag 4 der neuen Kultur wurden zytopathische Wirkungen und Synzytien beobachtet. Das Transmissionselektronenmikroskop zeigte virale Partikel in und um die Zellen (siehe 3). Virale Partikel wurden aus diesen Kulturen isoliert und wurden an den Centers for Disease and Control gelagert und wurden bei der ATCC hinterlegt.

Die Aktivität in Cf2th-Kontrollzellen, die wie oben beschrieben behandelt wurden, abgesehen davon, dass sie normalen PBL anstelle von infizierten PBL ausgesetzt wurden, wurde ebenfalls bestimmt. Es zeigt sich keine inhärente Amp-reverse-Transkriptase-Aktivität in diesen Hundethymozyten(Cflth)-Zellen, was einen Hinweis darauf liefert, dass keine Kontamination durch einen Retrovirus oder Spumavirus durch die Gewebekulturzellen stattgefunden hat.

Beispiel 3

Der Fall 6 hat mit nicht-menschlichen Primaten über mehr als 25 Jahre gearbeitet. 1977 zog sich der Fall 6 einen schweren Biß von einem Schimpansen (B1) zu, der eine Operation und einen Krankenhausaufenthalt erforderte. Eine retrospektive Analyse von 20 Proben von Seren, die von Fall 6 zwischen 1984 und 1988 archiviert worden waren, zeigten, dass die Seren Antikörper gegen SFVHu-6 aufwiesen. Selbst nach 14 Jahren einer dokumentierten SFVHu-6-Infektion ist Fall 6 bei guter Gesundheit. Eine Serumprobe, die kürzlich von Fall 6 erhalten wurde, lieferte ein positives Testergebnis für SFVHu-6-Antikörper durch einen Western blot-Test. Eine PCR-Analyse von PBL-DNA war positiv im Hinblick auf zwei SFVHu-6-Sequenzen von den viralen gag- und Integrase-Regionen. Der Ehepartner von Fall 6 wurde in Bezug auf eine SFV-artige Infektion sowohl durch eine serologische als auch eine PCR-Analyse als negativ getestet, obwohl langjähriger Kontakt zu dem mit SFVHu-6 infizierten Partner bestand. Das Fehlen einer sexuellen Übertragung oder einer beobachteten Erkrankung legt heute einen gutartigen Endpunkt der SFVHu-6-Infektion nahe.

SEQUENCE LISTING

Anspruch[de]
  1. Isoliertes menschliches Spumavirus, das eine der Sequenzen mit der SEQ ID Nr. 1, 3, 5 oder 7 umfasst.
  2. Spumavirus nach Anspruch 1, das die ATCC-Hinterlegungsnummer ATCC VR-2635 aufweist.
  3. Spumavirus nach Anspruch 1, das weiterhin exogene Sequenzen umfasst.
  4. Spumavirus nach Anspruch 3, wobei die exogenen Sequenzen Sequenzen umfassen, die Polypeptide kodieren.
  5. Spumavirus nach Anspruch 4, wobei das Polypeptid ein Antigen ist.
  6. Spumavirus nach Anspruch 3, wobei die exogenen Sequenzen Sequenzen umfassen, die als Antisense-RNA, Ribozym-RNA oder Köder-RNA transkribiert werden.
  7. Verfahren zum Abtöten sich teilender Zellen in vitro, das ein Infizieren der sich teilenden Zellen mit dem Spumavirus, das die ATCC-Hinterlegungsnummer ATCC VR-2635 aufweist, umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die sich teilenden Zellen Tumorzellen sind.
  9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Zellen menschlichen oder tierischen Ursprungs sind.
  10. Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit eines Spumavirus in einer biologischen Probe, das Folgendes umfasßt:

    a) In-Kontaktbringen der biologischen Probe mit Antigenen, die für das Spumavirus nach Anspruch 1 spezifisch sind;

    b) Nachweisen der Bindung von Antikörpern in der biologischen Probe mit den Antigenen.
  11. Verwendung eines Spumavirus nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die auf die Anwesenheit von sich rasch teilenden Zellen zurückzuführen ist.
  12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Erkrankung Krebs ist.
Es folgen 4 Blatt Zeichnungen






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