Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tierfutter. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Tierfutter aus tierischen Nebenprodukten, wobei durch Behandlung mit Alkali und Wärme übertragbare degenerative Enzephalopathien wie bovine spongiforme Enzephalophatie, Creuzfeldt-Jacob und Scrapie eliminiert oder verringert werden.

Übertragbare degenerative Enzephalopathien schließen (TDE Transmittable Degenerative Encephalopathies) bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE oder „Rinderwahn"), Scrapie bei Schafen, Creuzfeldt-Jacob (CJD), Gerstman-Straussler Schemker (GSS) und Kuru bei Menschen mit ein. Diese Krankheiten haben in den letzen Jahren beträchtliche Bekanntheit erreicht teilweise aufgrund der Annahme, dass es Autoritäten versäumt haben den Zusatz von mit BSE kontamierten Rindfleisch zu Nahrungsmitteln für Menschen und Tierfuttermitteln zu überwachen, was zum Ausbruch von CJD, hauptsächlich in Großbritannien, führte (vgl. Editorial in Nature, 1997, 389, 423).

Es ist allgemein anerkannt, dass das für TDE-Übertragung verantwortliche Mittel ein Protein ist, das allgemein als ein „Prion"-Protein bezeichnet wird, und das sowohl BSE als auch CJD zu Grunde liegt (Hill et al., Nature 1997, 389, 448).

Es wurde allgemein angenommen, dass die Zerstörung von TDE in Fleisch eine Behandlung bei 132°C über 20 Minuten unter 3 bar Druck erfordert. Alternativ können die Temperatur und der Druck auf 121°C beziehungsweise 2 bar reduziert werden, wenn Alkali eingesetzt wird.

Alkali ist bekannt für seinen hydrolytischen Effekt bei Biomolekülen wie Proteinen und Maßnahmen zur Sterilisation von Tiergewebe, das mit TDE kontaminiert ist, umfassten Behandlung mit Alkali, Wärme und Druck als Mittel zur Beseitigung der Pathogenität von Prionen.

Beispielsweise schlagen Taguchi et al., 1991, Arch. Virol. 119, 297, eine Behandlung von einer Stunde mit 1 n NaOH mit anschließendem Autoklavieren bei 121°C über 30 Minuten vor, um mit CJD-infizierte Gehirnhomogenate zu inaktivieren. Ernst & Race, 1993, J. Virol. Methods 41, 193 setzten Autoklavieren zusammen mit NaOH und Behandlung bei LpH zum Inaktivieren von mit Scrapie infizierten Gehirnhomogenaten ein.

Eine ausführlichere Testserie wurde von Taylor et al., 1994, Arch. Virol. 139, 131, durchgeführt um mit BSE infiziertes Rindsgehirn oder mit Scrapie infizierte Proben von Gehirn von Nagetieren zu dekontaminieren. Die Behandlungen umfassten den Einsatz von 1 M oder 2 M NaOH bis zu einer Stunde, Autoklavieren bei Temperaturen zwischen 134°C und 138°C bis zu einer Stunde oder von Natriumhypochlorit oder Natriumdichlorisocyanurat für bis zu zwei Stunden. Diese Autoren folgerten, dass keine der getesteten Verfahren eine vollständige Inaktivierung von TDE bewirkte.

In US Patent 5,780,288 wird ein Verfahren zur Zerstörung der ansteckenden Aktivität von infektiösen Vektoren in einer Proteinmischung beschrieben, ohne dass die Primärstruktur des Proteins zerstört wird.

Das Problem bei der Herstellung von Tierfutter aus möglicherweise mit TDE infizierten Tiergewebe ist, dass die hohen Temperatur- und Druckbedingungen mit den Standardaufbereitungs- oder Tierabfallrecyclingeinrichtungen nicht ohne Weiteres erreicht werden können. Auch besteht die Gefahr, dass bei Behandlung mit hohen Temperaturen während der Herstellung von Tierfutter minderwertiges Futter mit unerwünschten Nebenprodukten wie Carzinogenen, Diaminosäuren und flüchtigen Geruchsstoffen erhalten wird.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Tierfutter bereit zu stellen, wobei die Gefahr der Kontamination mit TDE zumindest verringert wenn nicht beseitigt ist.

Gemäß einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Tierfutter umfassend die folgenden Schritte:

• (i) Zugabe von Alkali zu tierischem Material zur Einstellung eines pH von wenigstens 8,5;
• (ii) Erhitzen des Materials gemäß Schritt (i) auf eine Temperatur in einem Bereich von 60°C bis 99°C; und
• (iii) Dehydratisierung des in Schritt (ii) erzeugten Materials.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von TDE-dekontaminierten Tierfutter umfassend die folgenden Schritte:

• (i) Zugabe von Alkali zu tierischem Material, das mit TDE-kontaminiert ist, um einen pH von wenigstens 8,5 einzustellen;
• (ii) Erhitzen des Materials gemäß Schritt (i) auf eine Temperatur in dem Bereich von 60°C bis 99°C; und
• (iii) Dehydratisierung des in Schritt (ii) erzeugten Materials.

Geeignetenweise wird das erfindungsgemäße Verfahren bei etwa Atmosphärendruck durchgeführt.

Vorzugsweise wird ausreichend Alkali zugesetzt, so dass ein pH von wenigstens 9,5 erhalten wird.

Insbesondere wird soviel Alkali zugesetzt, dass ein pH in einem Bereich von 10,5 bis 13,0 erhalten wird.

Insbesondere bevorzugt wird soviel Alkali zugesetzt, dass ein pH in dem Bereich von 11,0 bis 11,5 erhalten wird.

Vorzugsweise wird als Alkali Calciumhydoxid in Form von gelöschtem Kalk eingesetzt.

Vorzugsweise wird das Material in Schritt (ii) auf eine Temperatur in einem Bereich von 60°C bis 90°C erhitzt.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform beträgt die Temperatur etwa 60°C.

Gemäß einer weiteren besonderen Ausführungsform beträgt die Temperatur 80°C bis 85°C.

Die Zeitdauer der Schritte (i) und (ii), die als „hydrolytische Phase" bezeichnet werden, beträgt vorzugsweise 1 bis 4 Stunden oder insbesondere ein bis zwei Stunden.

Im Anschluss an diese hydrolytische Phase kann das behandelte Tiermaterial von der Dehydratisierung gelagert werden oder sofort dehydratisiert werden.

Im Hinblick auf die Dehydratisierung beträgt der Feuchtigkeitsgehalt des Tierfutters vorzugsweise nicht mehr als 10 bis 15 Gewichtsprozent. Üblicherweise kann der Feuchtigkeitsgehalt im Verlauf der Zeit auf etwa 7 bis 8 Gewichtsprozent sinken, was für Tierfutter optimal ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von TDE-dekontaminierten Tiermaterial gemäß den Schritten (i) und (ii) des zuvor genannten zweiten Aspekts der Erfindung.

In der vorliegenden Beschreibung, sofern nicht anders angegeben, werden die Begriffe „enthalten" und „enthaltend" im Sinne von „einschließlich" anstatt im Sinne von „ausschließlich" verwendet, so dass eine angegebene Zahl oder Gruppe von Zahlen eine oder mehrere nicht genannte andere Zahlen oder Gruppen von Zahlen einschließt.

Endgültiger pH von unterschiedlich behandelten Fleischproben.

Zusammenfassung der Prionenproteinclearanceraten von Fleischproben, die mit TDE beimpft wurden, nach der Behandlung mit Alkali und Wärme.

1:

Beispiel einer Vorrichtung zur Herstellung von Tierfutter.

2:

Titration der 263K Impfkultur SP0172200. Spur 1: Mit Proteinase K verdaute 263K Hs-Impfkultur, 10^–2,1. Spur 2: Unverdaute 263K Hs-Impfkultur, 10^–2,1. Spur 3: Regenbogenmarker mit niedriger molarer Masse. Spuren 4 bis 10: 5fache Verdünnungsreihe von mit Proteinase K verdauten 263K Impfkulturen mit einer Verdünnung von 10^–1,4 bis 10^–5,6.

3:

Analyse der Verfahrensproben nach Verdauung mit Proteinase K. Spur 1: Mit Proteinase K verdaute 263K Hs-Impfkultur, 10^–2,1. Spur 2: Regenbogenmarker mit niedrigem molaren Massenverhältnis. Spur 3: Mit Proteinase K verdaute 287.1 A. Spur 4: Mit Proteinase K verdaute 287.1-1. Spur 5: Siedemischung 1×. Spur 6: Siedemischung 1×. Spur 7: Proteinase K verdaute 287.1-2. Spur 8: Proteinase K verdaute 287.1-3. Spur 9: Proteinase K verdaute 387.1-4. Spur 10: Siedemischung 1×.

4:

Analyse von unverdauten Verfahrensproben. Spur 1: Unverdaute 263K Hs-Impfkultur, 10^–2,1. Spur 2: Proteinase K verdaute 263K Hs-Impfkultur 10^–2,1. Spur 3: Unverdaute 287.1A. Spur 4: Unverdaute 287.1-1. Spur 5: Regenbogenmarker mit niedrigem molaren Massenverhältnis. Spur 6: Siedemischung 1×. Spur 7: Unverdaute 287.1-2. Spur 8: Unverdaute 287.1-3. Spur 9: Unverdaute 287.1-4. Spur 10: Siedemischung 1×.

5:

Titration der 263K Impfkultur SP0172200. Spur 1: Proteinase K verdaute 263K Hs-Impfkultur, 10^–2,1. Spur 2: Unverdaute 263K Hs-Impfkultur, 10^–2,1. Spur 3: Regenbogenmarker mit niedrigem molaren Massenverhältnis. Spuren 4 bis 10: fünffache Verdünnungsreihe von mit Proteinase K verdauter 263K Impfkultur mit Verdünnung von 10^–1,4 bis 10^–5,6.

6:

Westernblotanalyse von mit Proteinase K verdauten Proben. Spur 1: Positivkontrolle mit 10^–2,8 Verdünnung. Spur 2: Molekulargewichtmarker. Spur 3: Probe 309.1A. Spur 4: Leerversuch. Spuren 5–10: Proben 309.1-1.3, 309.1-1.6, 309.1-2.3, 309.1-3,3, 309.1-4.3, beziehungsweise 309.1-4.3.

7:

Westernblotanalyse von nicht mit Proteinase K verdauten Proben. Spur 1: Positivkontrolle mit 10^–2,8 Verdünnung. Spur 2: Molekulargewichtmarker. Spur 3: Probe 309.1A. Spur 4: Leerversuch. Spuren 5-10: Proben 309.1-1.3, 309.1-1.6, 309.1-2.3, 309.1-3.3, 309.1-4.3 beziehungsweise 309.1-4.3.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung der vorliegenden Erfinder, dass TDE in mit Alkali behandeltem tierischem Material, das einer milden Wärmebehandlung bei Atmosphärendruck unterzogen wird, wirksam beseitigt wird.

Die Herabsetzung der Wärmebehandlung ist auch im Bezug auf den Umstand relevant, dass das Tierfutter gut verdaubar sein muss, insbesondere bezüglich des Proteingehaltes, sowie frei von TDE sein muss. Zudem bewirkt eine übermäßige Hitze die Bildung unverwünschter Produkte wie vernetzte Aminosäuren, Racemisierung von L-Aminosäuren zu ihren D-Isomeren und Bildung von Mutagenen wie 2-Amino-3,8-diethylimidazol-[4,5 f]-quinolin. Auch ist es wesentlich, dass während der Herstellung nur geringfügig flüchtige Stoffe gebildet werden, so dass die Erzeugung von schädlichen Gerüchen verringert wird. Hierzu wird erfindungsgemäß die Wärmebehandlung während der Herstellung bei Atmosphärendruck reduziert, während Alkali und Deydrationsschritte eingesetzt werden, so dass das Tierfutter wirksam von TDE sterilisiert wird. Die Herstellungsbedingungen gemäß der vorliegenden Erfindung können ohne Weiteres in vielen kommerziellen Standardproduktionsanlagen für Tierfutter eingehalten oder mit nur geringen Abänderungen dieser Anlagen erhalten werden.

Die tierischen Materialien, die verwendet werden können, umfassen zum Beispiel tierische Abfallprodukte, Innereinen aus Schlachtereien, Haustiere von geringem kommerziellen Wert wie altersschwache oder beeinträchtigte Zugtiere, wie Schafe oder Rinder, überzählige Schafe aus reduzierten Herden, verworfene oder entsorgte Wildtierkadaver oder Teile davon, Geflügelinnereinen, altersschwaches Geflügel, Fisch- und Krebsabfälle oder nicht verwertbare Fänge.

Das tierische Material wird vorzugsweise mit einem trockenen dehydratisierenden Material vermischt, das (entweder chemisch oder physikalisch) Feuchtigkeit aus dem tierischen Material absorbieren kann und damit den prozentualen Wassergehalt bis zu einem trockenen stabilen Produkt zu reduzieren vermag.

Die dehydratisierenden Materialen umfassen wenigstens eine oder mehrere Kombinationen unter: Bentoniten, Zeolithen, Kaolinen oder anderen Tonen in einem Anteil, der 35 Gewichtsprozent nicht übersteigt;

Calciumoxid, Magnesiumoxid oder Aluminiumoxid in einem Anteil, der 35 Gewichtsprozent nicht übersteigt;

Diatomeen oder andere Diatomeenerden in einem Anteil, der 35 Gewichtsprozent nicht übersteigt;

Gips, Dolomit, Kalkstein, Natriumdicarbonat oder Salz in einem Anteil, der 35 Gewichtsprozent nicht übersteigt;

Calciumphosphate und/oder Phosphorsäure in einem Anteil, der 35 Gewichtsprozent nicht übersteigt;

Eisen(II)-Sulfat und/oder Eisen(III)-Sulfat in einem Anteil, der 35 Gewichtsprozent nicht übersteigt;

Getreide, Stärken, gelatineartige Materialen und Getreidenebenprodukte (zum Beispiel Kleie, Kleiemehl und so weiter) einschließlich in extrudierten Formen in einem Anteil, der 80 Gewichtsprozent nicht übersteigt;

Proteinhaltige Körner und Ölsamen und deren Beiprodukte einschließlich verarbeitete und extrudierte Formen von proteinhaltigen Mehlen in einem Anteil, der 80 Gewichtsprozent nicht übersteigt;

pflanzliche Produkte und Beiprodukte wie Copramehl und Palmkernmehl, Wacholderabfall und gehäckseltes Heu und Stroh in einem Anteil, der 75 Gewichtsprozent nicht übersteigt; und tierische Beiprodukte wie Fleischmehle, Knochenmehle und Blutmehle und gelatineartige Materialien in einem Anteil, der 75 Gewichtsprozent nicht übersteigt.

Die bevorzugten dehydratisierenden Materialien, die eingesetzt werden können, sind verschieden und hängen von verschiedenen Faktoren ab wie:

• 1. Verfügbarkeit und Kosten des dehydratisierenden Materials für die Trockeneinheit;
• 2. das Maß, bis zu dem die Dehydratisierung durchgeführt werden muss;
• 3. der beabsichtigte Verwendungszweck des erhaltenen getrockneten Produkts.

Die Trocknung erfolgt vorzugsweise in einem Trommeltrockner.

Das Alkali, das in Schritt (i) eingesetzt wird, kann Oxide, Hydroxide und Salze von Metallen umfassen. Beispiele sind Calciumoxid, Calciumhydroxid, Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumsulfit, Kaliumhydroxid, Kaliumcarbonat, Magnesiumhydroxid, Magnesiumcarbonat, Magnesiumsulfat oder eine Kombination aus zwei oder mehreren davon.

Vorzugsweise wird Calciumhydroxid (gelöschter Kalk) eingesetzt.

Die Konzentration an Alkali, die in Schritt (i) eingesetzt wird, hängt von dem gewünschten pH, der Art des eingesetzten Alkalis und der Pufferkapazität der tierischen und weiteren Materialien ab, die während der Herstellung eingesetzt werden.

Beispielsweise beträgt ein typisches Verhältnis 25 kg gelöschter Kalk auf 1200 kg feuchtes Tiermaterial. In Abhängigkeit von dem Material mit dem das Produkt vermischt werden soll, kann der pH durch Zugabe von Säure eingestellt werden.

Während der Herstellung können optional Zusätze zugesetzt werden, die den Nährwert oder ökonomischen Wert des Endprodukts erhöhen. Diese Zusätze (ohne jedoch darauf beschränkt zu sein) können zum Beispiel umfassen Modifiziermittel für Pansen wie Monensen oder Avoparcin, Enzyme oder Bakterienkulturen, zusätzliche Vitamine oder Mineralien, Nichtprotein Stickstoffquellen wie Harnstoff, Antioxidanzien, Stabilisatoren, Antibiotika, Pilzinhibitoren, Konservierungsmittel (einschließlich Salz) und so weiter; Protein- und Lipidmodifiziermittel, um deren Pansen-Verdaubarkeit zu modifizieren, Geschmacksverstärker wie Molassen und Nebenprodukte der Molassefermentation.

Vorzugsweise wird das Tierfutter nach der Trocknung 24 Stunden stehen gelassen bevor es dem Vieh sowohl als Korn oder in Blockform oder als vermahlenes feines Pulver direkt verfüttert wird (Wiederkäuern als auch monogastrietischen Tieren). Das Tierfutter kann mit Futterergänzungsstoffen, Spurenelementen, Eiweißmehlen, Cerialieneiweiß und Ölsamenkörner, Molassen oder Nebenprodukten der Molassefermentation, Heu und so weiter in beliebiger Kombination für Viehfutter (sowohl für Wiederkäuer als auch für monogastrietische Tiere) vermischt werden; es kann als Futter für Haustiere als solches wie es hergestellt worden ist oder vermischt mit anderen Materialien eingesetzt werden; und/oder es kann unmittelbar oder als Zusatz zu einem Nahrungsmittel für den menschlichen Verbrauch eingesetzt werden.

Üblicherweise wird das getrocknete Material mit einem Anteil von höchstens 10 bis 15 Gewichtsprozent bezogen auf das Endprodukt zugemischt.

Einige Beispiele für das hergestellte Tierfutter sind:

• 1. Fettarme Feststofffraktionen aus Schlachthöfen (üblicherweise < 10% Fett auf Trockenanteilbasis) plus Stickwater werden mit Calciumhydroxid vermischt um den gewünschten pH von 11 zu erhalten (annährend 1:30 Gewichtsanteil bezogen auf den Trockengehalt) und eine Stunde lang in einem Zwischenspeicher stehen gelassen. Das Produkt wird anschließend bei 80°C für eine Stunde in einem Trommeltrockner getrocknet, wobei im Ergebnis ein Produkt erhalten wird mit < 10% freier Feuchtigkeit, das dann zu einem feinen Mehl vermahlen wird.
• 2. Fettarme Feststofffraktionen aus Schlachthöfen (üblicherweise < 10% Fett auf Trockenanteilbasis) werden mit Calciumhydroxid vermischt um den gewünschten pH von 10 einzustellen (ungefähr 1:50 Gewichtsanteil bezogen auf den Trockengehalt) und in einem Zwischenspeicher 30 Minuten stehen gelassen und dann in einem Trommeltrockner unter Einfluss von Sonnenwärme 3 Stunden lang bei 60°C getrocknet, wobei im Ergebnis ein Produkt mit < 10% Feuchtigkeit erhalten wird. Dieses Produkt wird dann zu einem feinen Mehl vermahlen.
• 3. Roher Fischabfall wird mit Alikali bestehend aus 80% Calciumhydroxid und 20% Natriumhydroxid vermischt, so dass ein pH von 10,5 erhalten wird (ungefähr 1:40 Gewichtsanteil bezogen auf den Trockengehalt) und in einem Trommeltrockner bei 70°C 4 Stunden lang getrocknet, wobei im Ergebnis ein Produkt mit < 11% Feuchtigkeit erhalten wird, das dann zu einem feinen Mehl vermahlen wird.

Obwohl bisher noch keine infektiöse TDE bei anderen Haustieren als Wiederkäuern (zum Beispiel Fisch und Geflügel) festgestellt werden konnte, gibt es in einigen Ländern Verbote, die das Verfüttern von Proteinmehlen breiten tierischen Ursprungs betreffen. So besteht zum Beispiel in Australien und den USA ein Verbot beliebiges Proteinmehl tierischen Ursprungs an Wiederkäuer zu verfüttern. In vielen europäischen Ländern besteht ein generelles Verbot ein Proteinmehl tierischen Ursprungs an Tiere zu verfüttern. Diese Verbote beruhen auf der Angst, dass infektiöse TDE bei anderen Tieren als Wiederkäuern entdeckt werden könnte.

Es ist festzuhalten, dass das Tierfutter auch als TDE dekontaminiertes Düngemittel eingesetzt werden kann.

Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend bevorzugte Ausführungsformen unter Verweis auf die anliegende Zeichnung (1) erläutert, die ein schematisches Diagramm einer Vorrichtung darstellt, die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das dehydratisierende Material mit einem tierischen Rohmaterial vermischt und dann erhitzt und getrocknet. Üblicherweise werden alle Materialien zu Beginn vermischt, dies ist jedoch nicht zwingend, da jeder Bestandteil zu jeder Zeit während des Verfahrens zugesetzt werden kann. Sobald alles vermischt ist, wird das Material anschließend getrocknet. Es kann eine beliebige Trockeneinrichtung eingesetzt werden, üblicherweise werden jedoch aus praktischen Gründen Warmlufttrockeneinrichtungen verwendet.

Bezugnehmend auf 1 werden Tierabfälle 10 (zum Beispiel Rindkadaver) durch eine Faschiermaschine oder Zerkleinerungsvorrichtung 11 geleitet bevor Alkali 12 (vorzugsweise Calciumhydroxid) zugesetzt wird und in einem Mixer 13 vermischt wird.

Nach der Zerkleinerung und vor der Zugabe von Alkali 12 kann der Tierabfall 10 erwärmt werden, um den Talkbestandteil zu verflüssigen. Der erwärmte Tierabfall wird dann dekantiert oder gepresst zur Auftrennung in einen Feststoffanteil und einen flüssigen Anteil.

Der flüssige Anteil wird angesäuert und in eine Talkfraktion, andere Flüssigkeiten (überwiegend Wasser) und verbleibende Feststoffe („Stickwater" bezeichnet) aufgetrennt. Dieses Stickwater kann als solches verarbeitet werden oder mit der Feststofffraktion für die Alkali- und Wärmebehandlung kombiniert werden.

In diesem Beispiel wird durch den Zusatz von Alkali 12 (vorzugsweise Calciumhydroxid) der pH der Mischung auf etwa 11,0 bis 11,5 erhöht. Während dieser „hydrolytischen Phase" sollte der pH mindestens bei 8,5 oder vorzugsweise 9,5 über 1 bis 4 Stunden gehalten werden. Da der pH während der Proteinhydrolyse sinken kann, sollte vorzugsweise mit einem pH von mindestens 11,0 angefangen werden, so dass der pH nie unter 8,5 oder vorzugsweise 9,5 fällt.

Während der hydrolytischen Phase kann die Temperatur über einen längeren Zeitraum (zum Beispiel 3 Stunden) bei 60°C gehalten werden, so dass der Energieverbrauch verringert wird, oder sie kann über einen kürzeren Zeitraum (zum Beispiel 1 Stunde) bei 80°C bis 85°C gehalten werden.

Die Mischung wird dann (zum Beispiel mit einem Schneckenförderer) zu einem Trommeltrockner 14 befördert, der mit einem Gegenstrom-Luftstrom mit einem Luftgebläse oder einem Gebläse 16, der mittels Heizung 15 erwärmt wird, ausgerüstet ist. Es ist vorzugsweise an diesem Punkt, dass optionales dehydratisierndes Material (zum Beispiel Bentonit, Zeolith, Kalkstein, zermahlende Getreidekörner) dem Trockner zugesetzt werden, um den Dehydratisierungsprozess zu unterstützen.

Das Tierfutter verlässt üblicherweise den Trockner 14 mit einem Feuchtigkeitsgehalt von etwa 10 bis 14 Gewichtsprozent. Es hat sich herausgestellt, das dieser Feuchtigkeitsgehalt während einer 24 bis 48 stündigen Nachtrocknung aufgrund anhaltender Proteinhydrolyse auf etwa 7 bis 8 Gewichtsprozent abnimmt.

Das getrocknete Tierfutter wird dann zu einer Hammermühle 17 zur Vermahlung auf eine gewünschte Körnchen-/Pulvergröße befördert und das granulierte/pulverförmige Futtermaterial wird zu einem Verpackungs-/Transportbereich 18 befördert.

Soll das Produkt zur direkten Verfütterung, zum Beispiel in Fischfutter, eingesetzt werden, kann Säure 19 dem Mixer 13 (nach der Vermischung zu Beginn) oder der Hammermühle 17 zugesetzt werden, um den pH des Endprodukts auf zum Beispiel 6,5 bis 7,5 zu verringern.

Wird das Produkt mit säurehaltigem Material wie zum Beispiel Korn vermischt, ist der Zusatz von Säure nicht erforderlich, da der Alkaligehalt des Produkts durch den Säuregehalt des Korns ausgeglichen wird.

Es erschließt sich einem Fachmann ohne Weiteres, dass ein wertvolles Nahrungsmittel, vorzugsweise für Tiere aber ebenso für den menschlichen Verbrauch geeignet, aus Tiergewebe hergestellt werden kann, das im wesentlichen nicht mit TDE-kontaminiert oder dessen Wahrscheinlichkeit mit TDE kontaminiert zu sein, verringert ist, und dass das sich ergebende Nahrungsmittel für einen breiten potentiellen Anwendungsbereich einschließlich der Verwendung als Düngemittel geeignet ist.

Zum besseren Verständnis der Erfindung und leichteren Umsetzung in die Praxis wird der Fachmann auf die folgenden Beispiele verwiesen.

Es wurde ein geschnittenes Schwanzstück von einem lokalen Metzger gekauft und es wurden vier Aliquote mit je 10 g ausgewogen. Zwei Aliquote wurden in einen Metallbecher gegeben, mit 1 ml 263K Hamster Scrapie Rohhirnhomogenat (cHs) beimpft und sorgfältig vermischt. Zu beiden Bechern wurden 20 ml 5% Calciumhydroxidlösung zugesetzt, verrührt, mit Folie abgedeckt und dann für 12 Stunden in ein 60°C warmes Wasserbad gegeben. Die Lösung wurde über die zwölfstündige Inkubation ungefähr alle dreißig Minuten gerührt.

Dem dritten 10 g Aliquot des Fleisches wurde 1 ml cHs zugesetzt, sorgfältig vermischt und dann 20 ml 1% SDS-Lösung zugegeben. Diese Mischung wurde 10 Minuten in einen „End over end"-Mixer gegeben. Die Mischung wurde dann 5 Minuten gekocht, geklärt, in Aliquote aufgeteilt und bei –80°C eingefroren. Dies ergab die 287.1A cHs Probe.

Das letzte 10 g Aliquot wurde in einen Metallbecher gegeben, mit 1 ml cHs beimpft, sorgfältig vermischt und dann zur Lufttrocknung bei 60°C in den Ofen gegeben. Die Probe wurde wiederum annährend alle 30 Minuten gerührt. Nach der Trocknung wurde das dehydratisierte Fleisch aus dem Ofen entfernt und in einem Mörser mit einem Stößel verrieben. Das verriebene Fleisch wurde mit 20 ml 1× Siedemischung vermischt, in einen End over end-Mixer gegeben und 12 Stunden bei Raumtemperatur vermischt, anschließend geklärt und in Aliquote aufgeteilt. Dies ergab die 287.1-1 cHs Probe.

Nach 12 Stunden in dem 60°C warmen Wasserbad wurden die 2 Metallbecher herausgenommen. Ein Becher wurde in dem 60°C warmen Ofen gegeben und wie vorstehend unter periodischen Rühren luftgetrocknet. Das Material aus dem zweiten Becher wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und der pH auf 7,5 eingestellt. Es wurden 22 ml 1× Siedemischung zugesetzt, in einen End over End-Mixer gegeben und die Mischung wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Diese wurde dann geklärt, in Aliquote aufgeteilt und bei –80°C eingefroren. Dies ergab die 287.1-2 cHs Probe.

Nach Deydratisierung bei 60°C wurde das hydrolysierte Fleisch aus dem Ofen genommen und mit einem Mörser und Stößel zerrieben. Es wurden 20 ml 50 mm Natriumacetat dem zerriebenen Fleisch zugesetzt und der pH auf 7,5 eingestellt. Es wurden 23 ml 2× Siedemischung zugesetzt und das Röhrchen in einem End over End-Mixer 12 Stunden bei Raumtemperatur vermischt. Es wurde dann geklärt, in Aliquote aufgeteilt und bei –80°C eingefroren. Dies ergab die 287.1-3 cHs Probe.

Das Pellet aus der 287.1-3 cHs Probe wurde wieder suspendiert und mit 10 ml 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 6,0) inkubiert, in einen End over End-Mixer für 60 Minuten bei Raumtemperatur gegeben. Dies wurde dann geklärt, in Aliqoute aufgeteilt und bei –80°C eingefroren. Dies ergab die 287.1-4 cHs Probe.

Die Proben wurden dann einem Westernblot unterzogen. Die Westernblotanalyse von 263K Hamster Scrapie beinhaltet den Einsatz des spezifischen monoclonalen Antikörpers 3F4. 3F4 erkennt sowohl die normale Zellform des Prionenproteins PrP^Sc als auch die mit der Krankheit einhergehende Form PrP^Sc. Anders als die normale Zellform ist PrP^Sc vergleichsweise resistent gegen Protease und der Proteinase K-Abbau der Proben kann zur Unterscheidung von PrP^Sc und PrP^Sc eingesetzt werden. Abbau der Verfahrensproben durch Proteinase K ist auch für die Entfernung von Proteinen einsetzbar, die in den Verfahrensproben vorhanden sind, und unspezifische oder kreuzreaktive Hintergrundfärbung des Westernblots verursachen können.

2 zeigt eine Titration der 263K Hamster adaptierten Scrapie Impfkultur, die für diese Studien eingesetzt wurde (SP0172200). Diese zeigt das typische Färbemuster, das für 263K mit 3F4 beobachtet wird. Es wird angenommen, dass das reife PrP-Protein voller Länge ein scheinbares molares Verhältnis (M_r) von ~33.000 Dalton (33K, oberste Bandenspur 2) hat. Nach Abbau durch Proteinase K werden üblicherweise eine breite Hauptbande in dem Bereich von 28K, eine schwächere breite Bande ~23K und eine scharfe aber schwache Bande ~19K beobachtet (siehe Spur 1).

Es ist anzumerken, dass in Impfkulturen von 263K Hs ebenfalls diese Spezien mit geringeren Mr beobachtet werden können (Spur 2), dies ist vermutlich auf das Vorhandensein von endogenen Proteasen in oder während der Herstellung der Impfkulturen zurückzuführen.

Spuren 5 bis 10 zeigen eine fünffache Verdünnungsserie der 263K Impfkultur mit einer Verdünnung von 1:25 (10^–1,4) bis 1:390625 (10^–5,6). Die 28K PrP^Sc-Spezies kann in Spuren 4 bis 7 festgestellt werden, das heißt bis zu einer Verdünnung von 10^–3,5. Nach langem Laufenlassen des Blots (nicht gezeigt) wird die 28K Spezies auch bei einer Verdünnung von 10^–4,2 beobachtet. Der Endpunkt oder Titer der Impfkultur wird als die Verdünnung definiert, bei der die 28K PrP-Spezies erstmals nicht mehr beobachtet wird. Der Titer dieser Impfkultur beträgt daher 10^–4,9 oder 7,8 × 10⁴ willkürlich gewählte Einheiten (arbitrary units)/ml.

Die Westernblotanalyse von mit Proteinase K abgebauten Verfahrensproben ist in 3 gezeigt. Mit Proteinase K abgebaute 263K Hs Impfkultur SP0172200 dient als eine interne Positivkontrolle (Spur 1, Verdünnung 10^–2,1).

Die 28K PrP-Spezies kann eindeutig in Proben 287.1A und 287.1-1 (Spuren 3 beziehungsweise 4) erkannt werden. Es wird auch eine ~33K Proteinspezies beobachtet, was darauf hindeutet, dass der Abbau durch Proteinase K dieser Proben unvollständig ist.

Keine Proteinbanden werden in den Proben 287.1-2, 287.1-3 oder 287.1-4 (Spuren 7 bis 9) beobachtet, was darauf hindeutet, das die PrP^Sc Proteine durch den alkalischen Hydrolyseprozess entfernt worden sind. Da keine PrP^Sc Spezien für diese Proben beobachtet wurden, können für diese ein Endpunkt oder Titer von 10⁰ oder 1 × 10⁰ arbitrary units/mL angenommen werden. Es ist darauf hinzuweisen, dass für die 287.1A oder 287.1-1 Proben keine Abschätzung des Titers gegeben werden kann.

Zur Bestätigung, dass die PrP^Sc-Proteine nicht einfach durch den Abbauschritt mit Proteinase K abgebaut worden sind, wurden unverdaute Verfahrensproben mit dem Westernblot analysiert (4). Sowohl unverdaute als auch mit Proteinase K abgebaute 263K Hs-Impfkulturen SP0172200 dienten als interne Positivkontrollen (Spuren 1 bzw. 2). Wiederum wurden in Proben 287.1A und 287.1-1 (Spuren 3 bzw. 4) PrP Proteinspezien beobachtet.

Keine Proteinbanden konnten in Proben 287.1-2, 287.1-3 oder 287.1-4 (Spuren 7 bis 9) nachgewiesen werden, wodurch die Ergebnisse in 3 bestätigt wurden.

Es wurden vorläufige Untersuchungen durchgeführt, um die Stabilität des pHs nach der Behandlung des Fleischmaterials zu untersuchen. Eine 5% Lösung Calciumhydroxid wurde auf pH 12,0 mit Chlorwasserstoffsäure eingestellt. 20 ml dieser Lösung wurden dann zu 10 g zerkleinertem magerem Rindfleisch gegeben und die Probe sorgfältig vermischt. Der pH wurde gemessen und 85 Minuten lang beobachtet, wobei während dieser Zeit der pH bei 12,0 verblieb.

Auf ähnliche Weise wurde 5% Calciumhydroxid auf pH 10,5 eingestellt und 20 ml wurden sorgfältig mit 10 g zerkleinertem magerem Rindfleisch vermischt. Der pH betrug 5,4 zu Anfang und wurde durch weitere Zugabe von Calciumhydroxid auf 10,5 eingestellt. Der pH fiel über die nächsten 25 Minuten auf 10,3.

Zwei 10 g Aliquote an zerkleinertem Schwanzstück wurden in einzelne Metallbecher gegeben und jedes Aliquot wurde mit 1 ml 263K Hamster Scrapie Rohhirnhomogenat (cHs) beimpft. Jedem Becher wurden dann 20 ml Calciumhydroxid mit pH 12,0 zugesetzt, die Proben wurden sorgfältig vermischt und für beide Proben wurde ein pH von 12,0 gemessen. Die Becher wurden dann mit Folie abgedeckt und bei 75°C insgesamt 3 oder 6 Stunden (2 beziehungsweise 5 Stunden in einem Wasserbad und die letzte Stunde in einem Ofen) inkubiert.

Vier 10 g Aliquote an geschnittenem Schwanzstück wurden jeweils in einen Metallbecher gegeben und jedes Aliquot wurde mit 1 ml 263K Hamster Scrapie Rohhirnhomogenat (cHs) beimpft. Zu jedem Becher wurde dann 18 ml Calciumhydroxid mit pH 10,5 gegeben, die Proben wurden sorgfältig vermischt und der pH jeder Probe wurde auf 10,5 (mit Calciumhydroxid) eingestellt. Die Becher wurden dann mit Folie abgedeckt und bei 60°C für insgesamt 3 Stunden, bei 75°C für insgesamt 3 oder 6 Stunden oder bei 90°C für drei Stunden inkubiert (zu Beginn in einem Wasserbad und die letzte Stunde in einem Ofen).

Alle Proben wurden nach Entnahme auf einen pH 6,5 bis 7,5 neutralisiert und dann auf eine Endkonzentration von 1% SDS eingestellt. Die Proben wurden in einem End over End-Mischer ungefähr 10 Minuten bei Raumtemperatur vermischt, 5 Minuten gekocht und durch Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit geklärt. Der Überstand wurde gesammelt, in Aliquote aufgeteilt und bei –70°C gelagert.

Die Einzelheiten der Proben sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Die Proben wurden mittels Westernblot analysiert.

Als Kontrolle wurde ein 10 g Aligout an zerkleinertem Schwanzstück mit 1 ml 263K cHs beimpft, sorgfältig vermischt und 20 ml 1% SDS zugesetzt. Diese Probe wurde mit einem End over End-Mischer ungefähr 10 Minuten bei Raumtemperatur vermischt, 5 Minuten gekocht und mittels Zentrifugation mit geringer Geschwindigkeit geklärt. Der Überstand wurde gesammelt, in Aliquote aufgeteilt und bei –70°C gelagert.

5 zeigt eine Titration der Hamster adaptierten Scrapie 263K Impfkultur (SP0172200), die für diese Untersuchungen verwendet wurde. Diese zeigte das typische Färbungsmuster, das für 263K mit mAb 3F4 beobachtet wird. Es wird angenommen, dass das reife PrP-Protein voller Länge ein scheinbares molares Verhältnis (M_r) von ~33.000 Dalton (33K, oberste Bandenspur 2) hat. Nach Abbau mit Proteinase K werden gewöhnlicherweise eine beherrschende breite Bande in dem Bereich von 28K, eine schwächere breite Band ~23K und eine scharfe, jedoch schwache Bande ~19K beobachtet (siehe Spur 1).

Es ist darauf hinzuweisen, dass in Impfkulturen von 263K Hs gleichfalls diese Spezies mit niederer molarer Masse beobachtet werden können (Spur 2), vermutlich aufgrund enthaltender endogener Proteasen, die darin oder während der Aufbereitung der Impfkultur vorliegen.

Die verarbeiteten Proben wurden lediglich in reiner Verdünnung entweder ohne Abbau oder nach Abbau mit Proteinase K mit einer Endkonzentration von 10 &mgr;g/ml (bezogen auf die vorhergehenden Ergebnisse) getestet. Die Ergebnisse sind in 6 und 7 gezeigt.

Mit Proteinase K abgebaute 263K cHs Impfkultur SP0172200 diente als interne positive Kontrolle (Spur 1 in 6). Die 28K PrP-Spezies kann in Probe 309.1A eindeutig gesehen werden (sowohl mit als auch ohne Abbau durch Proteinase K; vergleiche Spur 3 von 6 und 7). Eine Anzahl von zusätzlichen Proteinspezies werden in der nicht abgebauten Probe beobachtet. Die 33K PrP-Spezies ist auch noch nach Abbau mit Proteinase K sichtbar (Spur 3 6), was darauf hindeutet, dass der Abbau durch Proteinase K unvollständig war.

In keiner der mit Calciumhydroxid und Wärme behandelten Proben (Spuren 5 bis 10), weder nach noch ohne Abbau durch Proteinase K, wurde selbst bei langer Durchführung des Westernblots (bis zu 30 Minuten) Proteinbanden beobachtet.

Das heißt, durch alle getesteten Behandlungen mit Calciumhydroxid und Wärme wurden die PrP^Sc-Proteine beseitigt. Da keine PrP^Sc-Spezies in diesen Proben beobachtet werden, kann als deren Endpunkttiter 10⁰ oder 1 × 10⁰ arbitrary units pro ml angenommen werden. Es ist anzumerken, dass für die 309.1A-Probe keine Abschätzung des Titers gemacht werden kann.

Der Gehalt an PrP-Proteinen in den verarbeiteten Proben wurde nicht durch Titration im Westernblot quantifiziert. Obwohl in keiner der mit Calciumhydroxid und Wärme behandelten Proben PrP festgestellt werden konnte, kann eine Clearance-Abschätzung im Vergleich zu der geschätzten 263K-Impfung erfolgen.

Der log₁₀ Clearancefaktor ist das Verhältnis der Gesamtmenge an 263K, mit der das Ausgangsfleischmaterial beimpft wurde, zu der Gesamtmenge 263K, die aus der behandelten Endprobe rückgewonnen wird, ausgedrückt als log¹⁰-Wert:

Für alle behandelten Proben wurde ein Clearance-Faktor von ≥ 3,4 logs erhalten. Die Berechnungen sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Zusammenfassend wurden Proben an zerkleinertem Rindfleisch mit 263K Hs beimpft und der Einfluss der Behandlung mit Calciumhydroxid und Wärme nach der vorliegenden Erfindung wurde ausgedrückt als PrP^Sc-Proteineliminierung gemessen. Die hier gezeigten positiven Ergebnisse deuten darauf hin, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine robuste Vorgehensweise zur Entfernung oder Inaktivierung von TDE in Fleischproben, die für die Herstellung von Tierfutter verwendet werden, darstellt.

Fachleute werden erkennen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hier im einzelnen beschriebenen Ausführungsformen beschränkt ist und das eine Vielzahl weiterer Ausführungsformen denkbar sind, die nichtsdestotrotz mit dem breiten Geist und Umfang der Erfindung konsistent sind.

Sämtliche wissenschaftliche Literatur und Patentliteratur, auf die in dieser Beschreibung verwiesen worden ist, gilt als durch die Bezugnahme von dieser Beschreibung mit umfasst.