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Dokumentenidentifikation DE60207428T2 03.08.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001423478
Titel NATÜRLICHER FLUORESZENZFARBSTOFF AUS EINEM MARINEN ORGANISMUS
Anmelder Council of Scientific and Industrial Research, New Delhi, IN
Erfinder GOSWAMI, Usha, 403 004 Goa, IN;
GANGULY, A., 403 004 Goa, IN
Vertreter derzeit kein Vertreter bestellt
DE-Aktenzeichen 60207428
Vertragsstaaten CH, DE, GB, LI
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 06.09.2002
EP-Aktenzeichen 027605518
WO-Anmeldetag 06.09.2002
PCT-Aktenzeichen PCT/IN02/00184
WO-Veröffentlichungsnummer 2003020832
WO-Veröffentlichungsdatum 13.03.2003
EP-Offenlegungsdatum 02.06.2004
EP date of grant 16.11.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 03.08.2006
IPC-Hauptklasse C09B 61/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP

Beschreibung[de]

Diese Erfindung betrifft einen neuen Organosilicium-Si-O-R-Typ von Verbindung, welcher ein multipler natürlicher Fluoreszenzfarbstoff ist, gereinigt aus dem Körperwandextrakt eines marinen Wirbellosen, Holothuria scabra, gehörend zu dem Phylum: Echinodermata, Klasse: Holothuroidea, Ordnung: Aspidochirota, Familie: Holothuroidae. Die Verbindung ist ein Polysaccharid-Fluorochrom mit einem phenolischen Fluorophorteil und ist durch Sulfatbindungen mit einer Siliciummatrix darum herum verbunden. Dieser Siliciumteil ist ein integraler Teil des Kernmoleküls und nimmt an dem Metabolismus des Lebewesens teil. Die Verbindung ist reich an Schwefel.

Die Erfindung stellt auch ein Verfahren für die Extraktion, Reinigung und Charakterisierung der neuen Verbindung und des multiplen Fluoreszenzfarbstoffs aus einem lebenden marinen Organismus, insbesondere der Seegurke, bereit.

Die Erfindung offenbart außerdem zum ersten Mal die chemische Struktur einer neuen Fluoreszenzverbindung, wo Silicium der integrale Teil des organischen Moleküls geworden ist, und die von ihrem phenolischen Typ ihres Fluorophors. Sie stellt weiterhin die ungewöhnlichen Eigenschaften der Verbindung und die charakteristischen Eigenschaften des Farbstoffs bereit und offenbart deren Vorteile. Sie beschreibt auch industrielle Nutzungen der neuen Fluoreszenzverbindung als multipler natürlicher Fluoreszenzfarbstoff für nicht radioaktive Markierung für fluoreszente in-situ-Hybridisierung, Fließzytometrie, Immunoassays und Fluoreszenzmikroskopie. Die Verbindung hat eine weitere Verwendbarkeit für Gesellschaften, die sich mit dem Vermarkten von Fluoreszenzmolekularsonden befassen, indem diese mit einer Fluoreszenzverbindung von hohem Molekulargewicht ausgestattet werden, nach der für einige spezielle Anforderungen ziemlich gesucht wurde und die nicht verfügbar war, und stattet sie außerdem durch Verwendung von nur deren Fluorophorteil mit einer Alternative von Fluoreszenzfarbstoffen mit niedrigem Molekulargewicht aus. Mehrere Derivatfarbstoffe mit hohem und niedrigem Molekulargewicht und wünschenswerten Eigenschaften für Fluoreszenzsonden für einfache und multiple Farbanwendungen können hergestellt werden. Weiterhin kann die Verbindung ein leicht mischbarer Bestandteil in Zusammensetzungen der kosmetischen Industrie besonders zum Sonnenschutz und als Arzneimittel in insektiziden und veterinären Heilmitteln sein.

BEZUGNAHMEN AUF DEN STAND DER TECHNIK

Es wird beschrieben, daß Silicium eine aktive Rolle in der Entwicklung von Pflanzen und Tieren spielt. Nach Lanning, F. C. (The encyclopaedia of the chemical elements (Die Enzyklopädie der chemischen Elemente), herausgegeben von C. A. Hampel, Reinhold Book Corporation als Tochtergesellschaft von Chapman-Reinhold Inc., New York, Seite 647, 1968) kann Silicium eine wichtige und notwendige Rolle beim Ursprung des Lebens auf der Erde gespielt haben. Niedere Formen von Leben, wie beispielsweise Diatomeen, verwenden oftmals Kieselsäure in ihrer Skelettstruktur. Er hat die Überlegung vorgetragen, daß der Si-O-R-Typ von Bindungen in den lebenden Organismen vorkommen kann. Jedoch gibt bisher keinen in der früheren Literatur verfügbaren derartigen Bericht, wo Kieselsäure ein integraler Teil der organischen Einheit geworden sein könnte und als Matrix zur Herstellung der Fluoreszenzverbindung gewirkt haben könnte. Wannagat hat beschrieben, daß der Siliciumgehalt des lebenden Organismus abnimmt, wenn die Komplexität der Organismen ansteigt. Das Verhältnis von Silicium zu Kohlenstoff beträgt 250:1 in der Erdkruste, 15:1 in Humusboden, 1:1 in Plankton, 1:100 in Farnen und 1:5000 bei Säugetieren. (Quote von wysiwyg://34/http://www.pbs.org/wgbh/pages/frontline/implants/corp/history.html). Der gleiche Autor berichtete, daß Silicium eine Schlüssel-, aber nicht vollständig verstandene Rolle beim Wachstum von Haar, Nägeln, Knochen und Federn spielt. An der Stelle eines Knochenbruchs vergrößert sich der Siliciumgehalt in dem Collagengewebe um das 50-fache.

Organosiliciumtypen von Verbindungen auf dem Markt sind meist synthetisch. Silicon ist die generelle Beschreibung für ein gänzlich synthetisches Polymer, das ein sich wiederholendes Si-O-Grundgerüst enthält. Die organischen Gruppen, die an das Siliciumatom über Silicium-Kohlenstoff-Bindungen gebunden sind, definieren eine Klasse des Silicons. Sie werden auf dem Markt als Fluide, Emulsionen, Verbindungen, Schmiermittel, Harze und Elastomere oder Kautschuke verkauft und werden auch in der kosmetischen plastischen Chirurgie verwendet. (Quote von wysiwyg://34/http://www.pbs.org/wgbh/pages/frontline/implants/corp/history.html). Jedoch ist in der Literatur keine Information über die Siliciumverbindung in lebenden Organismen verfügbar, wo Kieselsäure ein integraler Teil des organischen Moleküls sein kann und auch charakteristische Eigenschaften eines einzelnen oder multiplen Fluoreszenzfarbstoffs haben kann. Die meisten der gegenwärtig verfügbaren Farbstoffe auf dem Markt sind synthetisch. Stainfile-Dyes A hat einen Farbstoffindex von 264 Farbstoffen angegeben. Von diesen sind 258 synthetisch und nur sechs sind natürliche Farbstoffe (http://members.pgonline.com/~bryand/dyes/dyes.htm). Die Herstellung synthetischer Farbstoffe erfordert oft die Verwendung von starken Säuren, Alkalien und Schwermetallen als Katalysatoren bei hohen Temperaturen. Dies macht die Verfahren und die auszutragenden Abfälle zu einem Problem der Umweltschädigung. Die Farbstoffindustrie sucht kontinuierlich nach billigeren und umweltfreundlicheren Wegen zu existierenden Farbstoffen. (Hobson und Wales, 1998, Green Dyes (Grüne Farbstoffe), Journal of the Society of Dyers and colorists (JSDC), 1998, 114, 42–44). Alle verfügbaren Farbstoffe sind nicht fluoreszent. Bitplane products haben eine Liste der 123 Fluorochrome auf dem Markt und deren Anregungs- und Emissionsspektren (http://www.bitplane.ch/public/support/standard/fluorochrome.htm) ausgestellt. Fluoreszenzfarbstoffe werden beim Markieren von Molekularsonden in weitem Umfang zum Lokalisieren biologischer Strukturen durch Fluoreszenzmikroskopie verwendet, z.B. in Immunoassays, beim Markieren von Nucleotiden und Oligonucleotiden für Untersuchungen zur in-situ-Hybridisierung, Binden an polymere Mikrokügelchen und Anfärben von Zellen zur Verwendung in bilderzeugenden Untersuchungen. Die Farbstoffe werden auch zur selektiven Zerstörung von Zellen verwendet, wie beispielsweise in der Technik der photodynamischen Therapie. (Haughland, R. P. und Kang, H. C., US-Patentschrift 4774339, erteilt am 27. September 1988; Haughland, R. P. und Kang, H. C. US-Patentschrift 5248782, erteilt am 28. September 1993).

Fluoreszenz ist ein Phänomen, bei welchem ein Atom oder Molekül im Verlauf seines Übergangs von einem höheren zu einem niedrigeren Elektronenzustand Strahlung emittiert. Sie folgt dem Stokes-Gesetz, wonach die Wellenlänge der Fluoreszenzstrahlung immer länger als die der Anregungsstrahlung ist. Der Vorgang der Fluoreszenz ist ganz anders als der der Phosphoreszenz und Biolumineszenz. Der Begriff Fluoreszenz wird verwendet, wenn das Intervall zwischen dem Akt der Anregung und der Emission von Strahlung sehr klein ist (10–8–10–3 Sekunden). Bei Phosphoreszenz kann das Zeitintervall zwischen Absorption und Emission von 10–3 Sekunden bis zu mehreren Stunden variieren (R. Norman Jones, 1966 in: The encyclopaedia of chemistry (Die Enzyklopädie der Chemie), 2. Auflage, 1966, Seiten 43536).

Biolumineszenz ist der Begriff, der für das Licht verwendet wird, das als Ergebnis einer chemischen Reaktion, abgelaufen zu einer speziellen Zeit in einer speziellen Zelle innerhalb des Körpers eines lebenden Organismus, erzeugt wird.

Über eine große Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen wird in dem Handbook of Fluorescent probes and Research Chemicals (Handbuch über Fluoreszenzsonden und Forschungschemikalien) von Richard P. Haughland, 6. Auflage, gedruckt in den Vereinigten Staaten von Amerika, 1996, berichtet. In dem gleichen Buch hat auf den Seiten 1–6 Ian D. Johnson (1996) ausführlich den Vorgang der Fluoreszenz & seine Methoden zum Nachweis in bestimmten Molekülen, von ihm Fluorophore oder Fluoreszenzfarbstoffe genannt (im allgemeinen polyaromatische Kohlenwasserstoffe oder Heterocyclen), beschrieben. Die vielseitigsten Fluoreszenzfarbstoffe, die gegenwärtig in Gebrauch sind, sind Fluorescein und auf Fluorescein basierende sowie BODIPY-Farbstoffe und deren Derivate.

Die Autoren haben sich mit den Unzulänglichkeiten aller dieser Farbstoffe beschäftigt und ihre Präferenzen für charakteristische Eigenschaften von Farbstoffen beschrieben. Viele Derivate der Fluoreszenzfarbstoffe und deren Synthese sind in US-Patentschriften offenbart (Haughland, R. P. und Kang, H. C. US-Patentschrift 4774339, erteilt am 27. September 1988; Haughland, R. P. und Kang, H. C. US-Patentschrift 5248782 vom 28. September 1993; Kang, H. C. und Haughland, R. P., US-Patentschrift 5187288, veröffentlicht am 16. Februar 1993; Kang, H. C. und Haughland, R. P. in der US-Patentschrift 5274113 vom 28. Dezember 1993; und Kang, H. C. und Haughland, R. P. US-Patentschrift 5433896, 18. Juli 1995; Kang, H. C. und Haughland, R. P. US-Patentschrift 5451663, veröffentlicht am 19. September 1995). Rosenblum Barnett B, Spurgeon S, Lee Linda G, Benson Scott C und Graham Ronald J berichteten in der internationalen Patentschrift W00058406, Veröffentlichungsdatum 5. Oktober 2000, über 4,7-Dichlorrhodaminfarbstoffe, die als Molekularsonden verwendbar sind. R. Norman Jones hat in The encyclopaedia of chemistry (Die Enzyklopädie der Chemie), 2. Auflage, 1966, Seiten 435–436 die Besonderheit eines guten Fluorophors beschrieben. Laut ihm muß ein Fluoreszenzmolekül ein gutes chromophores System zur Absorption von Anregungsenergie und einen schützenden Mechanismus haben, um vor zu schneller Dissipation der Anregungsenergie in Vibrationsbewegung zu bewahren, bevor der Akt der Fluoreszenzverzögerung erfolgen kann. Er hat auch kommentiert, daß, obwohl die Beziehung der Molekularstruktur und der Fluoreszenz von Verbindungen nicht gut verständlich ist, es bestimmte Gruppen gibt, deren Anwesenheit mit Fluoreszenz verbunden ist. Zum Beispiel sind in den organischen Molekülen die Anwesenheit von Phthalein- und aromatischen Strukturen wie beispielsweise Anthracen und Naphthacen besonders mit heller Fluoreszenz verbunden. Einige anorganische Verbindungen fluoreszieren in flüssigem Zustand und in Feststoffen stark, Fluoreszenz wird oft durch die Anwesenheit von Spurenverunreinigungen modifiziert.

Die Erfinder der vorliegenden Patentanmeldung, Goswami, Usha und Ganguly, Anutosh, haben bereits eine Patentanmeldung über einen natürlichen Fluoreszenzfarbstoffextrakt aus einem marinen Wirbellosen eingereicht (US-Patentanmeldung 09/820654). Diese betrifft den rohen Extrakt aus Holothuria scabra, welcher die Fluoreszenzqualitäten bei drei verschiedenen Wellenlängen hat, wenn er bei verschiedenen UV- und sichtbaren Bereichen der Lichtspektren angeregt wird. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren der Extraktion, Reinigung und Charakterisierung dieses neuen Farbstoffes bereit, welcher ein teilweise gereinigter natürlicher Farbstoff aus einer Seegurke ist. Die Verwendbarkeiten des Farbstoffs als Epifluoreszenzfärbemittel und nicht radioaktiver Fluoreszenzfarbstoff, verwendbar zum Markieren von Molekularsonden für Untersuchungen zur in-situ-Hybridisierung, wird neben verschiedenen anderen Qualitäten des Farbstoffes als Arzneimittel beschrieben. In dieser Anmeldung wurden Einzelheiten des Standes der Technik über die Pigmente, synthetischen Farbstoffe und natürlichen Farbstoffe von terrestrischen Pflanzen und Mikroben beschrieben. (US-Patentschrift 4452822, veröffentlicht am 5. Juni 1984; Erfinder Shrikhande, Anil J; US-Patentschrift 5321268 vom 14. Juni 1994 von Crosby David A and Ekstrom Philip A; US-Patentschrift 5405416, veröffentlicht am 11. April 1995, Autoren Swinton; Robert J, US-Patentschrift 5858761, veröffentlicht am 12. Januar 1999, Erfinder Tsubokura et al., US-Patentschrift 5902749 vom 11. Mai 1999, Erfinder Lichtwardt et al., US-Patentschrift 5908650, veröffentlicht am 1. Juni 1999, Erfinder Lenoble et al., US-Patentschrift 5920429, veröffentlicht am 6. Juli 1999, Burns et al., US-Patentschrift 5935808 am 10. August 1999 von Hirschberg et al.; US-Patentschrift 5989135 vom 23. November 1999, Erfinder Welch; David Emanuel; US-Patentschrift 6055936, erteilt am 2. Mai 2000; Collin; Peter Donald; US-Patentschrift 6056162, 2. Mai 2000; Leighley; Kenneth C.; US-Patentschrift 6103006 15. August 2000 DiPietro; Thomas C.; 6110566 29. August 2000; White et al.; 6140041 31. Oktober 2000 LaClair; James J., US-Patentschrift 6165384 26. Dezember 2000 Cooper et al.; 6180154 30. Januar 2001 Wrolstad et al. EP0206718, veröffentlicht am 30. Dezember 1986, Erfinder Cramer Randall J; IE901379 vom 30 Januar 1991 Lee Linda G; Mize Patrick D; WO9010044 vom 7. Juli 1990. Swinton; Robert J; AU704112, veröffentlicht am 7. Oktober 1997, Erfinder Burns David M; Pavelka Lee A; DE19755642 vom 24. Juni 1999 von Weimer Thomas D R.; WO9938919 28. September 1999 Laclair James J; WO0058406 vom 5. Oktober 2000 von Rosenblum Barnett B et al.; WO9938916 15. August 2000 Erfinder DiPietro; Thomas C; WO9920688 vom 29. August 2000 Erfinder Pavelka Lee et al.; WO9920688 vom 29. August 2000 Erfinder White et al.

Die multiplen Verwendungen von Fluoreszenzfarbstoffen in der Molekularbiologieforschung, in industriellen Anwendungen und in Lebensrettungsvorrichtungen usw. werden ebenfalls beschrieben. Collin, P. D hat in seinen US-Patentschriften vom 23. Juni 1998, 2. März 1999 und 16. November 1999 mit den entsprechenden US-Patentschriften-Nummern 5770205, 5876762 und 5985330 therapeutische Eigenschaften verschiedener Körperteile der Seegurke beschrieben. Alle diese Referenzen betreffen auch die vorliegende Patentschrift. In der vorliegenden Patentschrift haben die Anmelder eine andersartige Herangehensweise angenommen. In dieser Erfindung haben die Anmelder zum ersten Mal eine chemische Verbindung und einen Fluoreszenzfarbstoff gereinigt, welcher in seiner Struktur und beim Zeigen von acht farbigen Emissionen besonders ist. Die chemische Struktur der Verbindung wird zum ersten Mal aus der Seegurke offenbart. Sowohl das Produkt als auch der Ausgangsstoff sind neu. Der Fluorophorteil der Verbindung ist phenolisch und sowohl die vollständige Verbindung als auch nur das Fluorophor haben die Eigenschaften von natürlichen Fluoreszenzfarbstoffen. Unähnlich den gegenwärtig verfügbaren Farbstoffen ist diese Verbindung kein synthetisches Derivat von irgendwelchen gegenwärtig auf dem Markt verkauften Farbstoffen. Sie ist ein absolut neuer Organosilicium-Si-O-R-Typ von Verbindung, gereinigt und offenbart zum ersten Mal in dieser Erfindung. Das Verfahren für die Extraktion, Reinigung und Charakterisierung dieses neuen fluoreszenten Polysaccharids aus dem Körperwandextrakt der Seegurke ist ebenfalls neu und wird zum ersten Mal offenbart. Die offenbarte fluoreszente Natur eines Polysaccharids ist ebenfalls neu und seine Verwendungen als natürlicher multipler Fluoreszenzfarbstoff für Molekularsonden ist ebenfalls neu. Die Offenbarung, daß die Verbindung vom Si-O-R-Typ ist und das organische Kernmolekül mit einer Siliciummatrix darum herum durch die Sulfatbindungen verbunden ist, wird hier zum ersten Mal gemacht. Die Siliciummatrix bildet einen integralen Teil der Verbindung, und die Offenbarung, daß sie an den metabolischen Aktivitäten der Seegurke teilnimmt, ist ebenfalls neu.

In noch einem anderen Aspekt stattet die Erfindung die interessierten Gesellschaften für Molekularsonden und molekularchemische Reagenzien mit einer neuen natürlichen Verbindung aus, welche sie mit einem Fluoreszenzfarbstoff mit hohem Molekular- und auch mit niedrigem Molekulargewicht, abhängig von den Anforderungen, ausstatten kann.

Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist, daß die Verbindung reich an Schwefel ist, und ihre verschiedenartigen Zusammensetzungen Verwendbarkeit als Insektizid, Pestizid und veterinäres Arzneimittel zeigen.

Unähnlich den meisten anderen bekannten synthetischen Fluoreszenzfarbstoffen braucht unser Farbstoff nicht mit einem anderen Farbstoff gemischt zu werden, um in der Epifluoreszenzmikroskopie unterschiedliche Fluoreszenzfarbtöne bei unterschiedlichen Wellenlängen zu erlangen. Nach Inkontaktkommen mit den Biomolekülen emittiert er acht unterschiedliche gefärbte Fluoreszenzen bei acht unterschiedlichen Anregungswellenlängen, was multiple Verwendungen haben kann. Er färbt die Zellmembran und emittiert unter unterschiedlichen Emissionwellenlängen des Fluoreszenzmikroskops blaue, gelbe und orangerote Farbtöne. Weiterhin ist unser Farbstoff in der Beschaffenheit nicht proteinartig und ist bei Raumtemperatur für Monate in hohem Maße stabil und wird nicht durch Mikroben verunreinigt. Seine Fluoreszenzqualität wird unähnlich Extrakten einiger Algen und lumineszenter Organismen bei hohen und niedrigen Temperaturen nicht verschlechtert. Der Farbstoff zeigt keinen schnellen Löscheffekt, wenn Zellzubereitungen unter dem Mikroskop dem Licht ausgesetzt werden.

Ein wichtiger Aspekt dieses Fluoreszenzfarbstoffs ist sein Aufbau zu Zusammensetzungen und Kits zur nicht radioaktiven Markierung von Molekularsonden und zur Kontrastfärbung. Seine chemische Struktur wird offenbart, so kann die Farbstoffindustrie in großem Maßstab synthetisieren. Bei Anregungen mit unterschiedlichen Wellenlängen ergibt er die Wirkung äquivalent zu Farben des Wellenlängespektrums von mindestens 123 Fluorochromen, die gegenwärtig auf dem Markt bekannt sind (siehe Bitplane products (Fluorochrome), im Internet (http://www.bitplane.ch/public/support/standard/Fluorochrome.htm).

In noch einem anderen Aspekt zeigt der Farbstoff, wenn mit Röntgenstrahlen hoher Energie angeregt, Emissionen in den längeren Bereichen. Er emittiert gelblich grüne Fluoreszenz.

Noch ein anderer Aspekt ist seine Verwendung als Fluorochromfärbung in der Epifluoreszenzmikroskopie, welche hier zum ersten Mal für einen marinen natürlichen Farbstoff berichtet wird. Der Farbstoff ergibt eine Kontrastfärbungswirkung unterschiedlicher Zellkomponenten. Diese Anmeldung stellt eine einfache und schnelle Methode zum Prüfen zytogenetischer Zubereitungen für multiple Verwendungen wie molekulare Diagnostik unter Verwendung fluoreszenter in-situ-Hybridisierungstechniken, schnelle Diagnose von Biokontamination in Gewebekulturen, industriellen Zubereitungen, Wasserqualitätsprüfung bei Laboratoriums- und Feldbedingungen bereit.

Noch ein anderer Aspekt des Farbstoffs ist seine Verwendung als Komponente der Kits zur nicht radioaktiven Markierung für Anwendungen fortgeschrittener Molekularbiologie und als Arzneimittel in ärztlichen und tierärztlichen Zubereitungen.

AUFGABEN DER ERFINDUNG

Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zur Extraktion, Reinigung und Charakterisierung der Verbindung und des multiplen natürlichen Fluoreszenzfarbstoffs aus der Seegurke Holothuria scabra bereitzustellen.

Eine andere Aufgabe der Erfindung ist, die chemische Formel der gereinigten Verbindung, das Molekulargewicht und die Struktur für ihre industriellen Anwendungen in großem Maßstab bereitzustellen.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, Zusammensetzungen bereitzustellen, die die reine Verbindung und den aus dem Körperwandextrakt der Seegurke erhaltenen Fluoreszenzfarbstoff anwenden.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Analyse der Siliciummatrix auf ihre Beschaffenheit.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, daß die Siliciummatrix ein integraler Teil des organischen Kernmoleküls ist.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, daß die Siliciummatrix Stabilität für die Verbindung bereitstellt und das Fluorophor der Verbindung fluoresziert.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, daß die gereinigte Fluoreszenzverbindung ein Polysaccharid ist. Das organische Kernmolekül des Si-O-R-Typs von Verbindung ist durch die Sulfatbindungen mit einer Siliciummatrix darum herum verbunden.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, daß der Farbstoff ohne die Anforderungen irgendwelcher zusätzlicher Spacer mit Strukturen direkt konjugieren kann. Sulfatgruppen wirken als Spacer.

Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist, daß der Farbstoff nach Konjugation mit Proteinbiomolekülen andersartige Farben emittiert.

In noch einem anderen Aspekt stattet die Erfindung die interessierten Gesellschaften für Molekularsonden und molekularchemische Reagenzien mit einer neuen natürlichen Verbindung aus, welche sie mit einem Fluoreszenzfarbstoff mit hohem Molekulargewicht ausstatten kann, welcher auch, abhängig von den Anforderungen, durch Verwendung nur seines Fluorophorteiles als einer mit niedrigem Molekulargewicht benutzt werden kann.

Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Aufklärung sowohl der phenolischen als auch der chinoiden Struktur der Verbindung, die für Fluoreszenz verantwortlich ist.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, daß die Kieselsäurematrix an den metabolischen Aktivitäten der Seegurke teilnimmt.

Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist, daß die Verbindung reich an Schwefel ist und ihre verschiedenartigen Zusammensetzungen Verwendbarkeit als Insektizid und Pestizid zeigen.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, den chemischen taxonomischen Namen für die Verbindung als phenolisches sulfatiertes silicatiertes Polysaccharid (PSSP-1) bereitzustellen.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, den chemischen taxonomischen Namen für das Fluorophor als 1-Hydroxy-2,5-di-methylaminobenzol (HDAB-1) bereitzustellen.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist ihre Anwendung als Arzneimittel, um Bindegewebswachstum beim Restrukturieren von kartilaginösen Skeletteilen bei Säugern zu hemmen.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendbarkeit der Verbindung in Sonnenschutzkosmetika.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, daß der Farbstoff acht unterschiedliche Farben der Fluoreszenz emittiert, wenn mikroskopische Objektträger von Zellen/Larven von marinen Lebewesen angefärbt werden, der reine Farbstoff hat unterschiedliche Farbtöne und konjugierte Zellbestandteile haben unterschiedliche Farben.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, daß der Farbstoff grüne Fluoreszenz emittiert, auch wenn er mit energiereichen Strahlen wie Röntgenstrahlen angeregt wird.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, die Fluoreszenz und sichtbare spektroskopische Analyse und den Bereich der Emissionwellenlängen zu beobachten.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, daß der Farbstoff als nicht radioaktive Markierung von Fluoreszenzmolekularsonden verwendbar ist.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, daß der Farbstoff in dem angeregten Licht nicht schnell gelöscht wird und während des Prüfens der Objektträger kein Bleichen durch Licht erfolgt.

Eine andere Aufgabe der Erfindung ist, daß der Farbstoff in der Beschaffenheit nicht proteinartig ist und bei Raumtemperatur über ein Jahr in hohem Maße stabil ist.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, daß sich ihre Fluoreszenzqualität sogar bei extrem hohen und niedrigen Temperaturen nicht verschlechtert.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist, Kits zur nicht radioaktiven Markierung von Molekularsonden und Kontrastfärbung zu entwickeln.

Noch eine andere Aufgabe der Erfindung ist die industrielle Verwendung der Verbindung zum Synthetisieren von Derivaten des Fluoreszenzfarbstoffs für Fließzytometrie, Mikroarrays, Immunoassays und verschiedene andere molekulare Anwendungen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Dementsprechend stellt die Erfindung einen neuen natürlichen Organosiliciumtyp von Verbindung und einen multiplen Fluoreszenzfarbstoff erhalten aus der Seegurke Holothuria scabra, bereit. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Extraktion, Reinigung und Charakterisierung der Verbindung und des natürlichen multiplen Fluoreszenzfarbstoffs für Fluoreszenzmolekularsonden, Kosmetik-, Arzneimittel- und andere Industriezweige bereit. Weiterhin stellt die Erfindung die vollständige chemische Struktur der gereinigten Verbindung einschließlich ihres Fluorophor- und Fluorochromteils bereit. Sie stellt ebenfalls sowohl die phenolische als auch die chinoide Form der Verbindung bereit, welche für ihre Fluoreszenz verantwortlich ist. Basierend auf der chemischen Struktur stellt die Erfindung auch einen Namen für die Identität der Verbindung und den vermarktbaren Fluoreszenzfarbstoff als PSSP-1 bereit, was für „phenolisches sulfatiertes silicatiertes Polysaccharid" steht und „1" für die erste Verbindung steht, da dieser Patentschrift verschiedene Abkömmlinge folgen werden. Weiterhin stellt sie die Struktur des Fluorophors bereit, dessen Nomenklatur, wie 1-Hydroxy-2,5-di-methylaminobenzol, und benannten den Farbstoff von diesem als HDAB-1, wobei HDAB die angegebene Nomenklatur betrifft und „1", daß dieses das erste ist und, basierend auf diesem Fluorophor, verschiedene Konjugate und Farbstoffe folgen werden.

Weiterhin stellt sie noch Zusammensetzungen der Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff zum Testen als Molekularsonde auf Zellen eines marinen Lebewesens, seiner antimikrobiellen, insektiziden und pestiziden Aktivitäten bereit. Der Farbstoff hat Eigenschaften eines Arzneimittels für die veterinären und kosmetischen Anwendungen.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Nach viel Forschung haben die Anmelder jetzt einen neuen Organosiliciumtyp von Verbindung und einen neuen multiplen natürlichen Fluoreszenzfarbstoff identifiziert, gereinigt, strukturell aufgeklärt und charakterisiert. Die Fluoreszenzfarbstoff wird aus marinen Lebewesen, insbesondere aus Wirbellosen und genauer gesagt aus der Seegurke Holothuria scabra, erhalten. Die Seegurke hat die folgende taxonomische Position. Seegurken sind Echnoderme, Mitglieder der Gruppe von stachligen häutigen Tieren, die auch Sternfische und Seeigel einschließt.

Unterreich: Metazoa

Phylum: Echinodermata

Subphylum: Eleutherozoa

Klasse: Holothwoidea

Unterklasse: Aspidochirotacea

Ordnung: Aspidochirota

Familie: Holothuroidae

Gattung: Holothuria

Spezies: scabra

Die Verbindung ist von fluoreszenter Natur und ist ein Polysaccharid. Die gereinigte Verbindung ist ein multipler Fluoreszenzfarbstoff mit einem phenolischen Fluorophorteil. Es ist durch die Sulfatbindungen mit einer Siliciummatrix darum herum verbunden. Diese Siliciumteil ist ein integraler Teil des Kernmoleküls und nimmt an dem Metabolismus des Tieres teil. Die Verbindung ist reich an Schwefel. Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren für die Extraktion, Reinigung und Charakterisierung dieser neuen Fluoreszenzverbindung aus einem lebenden Organismus, insbesondere der Seegurke, bereit. Die Patentschrift offenbart ebenfalls zum ersten Mal die chemische Struktur einer neuen Verbindung, wo Silicium der integrale Teil des organischen Moleküls geworden ist. Sie enthüllt ebenfalls sowohl die phenolische als auch die chinoide Struktur der Verbindung, die für Fluoreszenz verantwortlich ist. Sie stellt weiterhin die ungewöhnlichen Eigenschaften der Verbindung und ihre Vorteile bereit. Die Erfindung befaßt sich ebenfalls mit den industriellen Verwendbarkeiten der neuen Fluoreszenzverbindung als Farbstoff zur nicht radioaktiven Markierung von Molekularsonden in verschiedenartigen Anwendungen von Molekularbiologie, Molekularsonde und einem Arzneimittel. Verschiedene chemische Derivate der Verbindung können für eine Vielfalt von Molekularsonden für unterschiedliche Anwendungen hergestellt werden. Weiterhin stellt die Erfindung den Farbstoff enthaltende Zusammensetzungen für insektizide, pestizide und therapeutische Verwendungen bereit.

Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine neue multiple Fluoreszenzfarbstoffverbindung mit der empirischen Formel C22H48O66N2S10Si7 und mit einem Molekulargewicht 1915; Strukturformeln wie durch die 18 oder 19 der begleitenden Zeichnungen dargestellt bereit.

In einer Ausführungsform der Erfindung hat die neue Verbindung die folgenden charakteristischen Eigenschaften:

  • i. die organische Zusammensetzung der reinen Verbindung durch Elementaranalyse gibt Kohlenstoff 8,3572, Wasserstoff 1,739%, Stickstoff 0,9449% und Schwefel 9,457% an;
  • ii. das Atomverhältnis für die Elemente in der Verbindung war in dem Verhältnis von Kohlenstoff:Wasserstoff:Stickstoff:Schwefel = 22:48:2:10, angegeben durch die Mikroanalyse;
  • iii. die anorganische Zusammensetzung der Verbindung, indem sie der Atomabsorptionsspektrophotometrie unterworfen wird, um Kieselsäure und den Prozentgehalt des Siliciumdioxids abzuschätzen, 12,58%;
  • iv. Kieselsäure ist ein integraler Teil der Verbindung;
  • v. der Atomanteil von Silicium beträgt 7 für jeweils 22 Kohlenstoffatome;
  • vi. Reinigung der Verbindung weiterhin durch Ionenaustauschchromatographie, und es wird gefunden, daß das Peak-zu-Peak-Verhältnis der Extinktion bei 291 und 451 stabil ist;
  • vii. die Verbindung umfaßt Zuckereinheiten;
  • viii. HPLC der reinen ionischen Form der Verbindung durch Umkehrphasen-C18-Typ von analytischer Säule und einen Gradienten von 0 bis 50% Acetonitril, um den reinen Farbstoff aus der Säule zu eluieren, ergab den Wert der Retentionszeit von 1,909 und einen sehr scharfen Peak;
  • ix. die FT-IR-Signale von Sulfaten, vorkommend in dem Bereich von 1210–1150 und 1060–1030 und 650, ließen darauf schließen, daß Schwefel in der Verbindung in dem O-SO2-Typ von Verknüpfung vorhanden ist;
  • x. die starke Absorptionsbande für Silicat, gefunden zwischen 1090–1020 (bei 1068), ließ darauf schließen, daß Silicium in der Verbindung als -Si-O-Si- vorhanden ist; das CH3-Strecksignal wird zwischen 2950–2850 gefunden; es gibt keine Amidsignale und die Verbindung ist kein Protein;
  • xi. das Hydroxystrecksignal ist stark aber breit, was auf die phenolische Gruppe schließen läßt;
  • xii. die Verbindung enthält eine phenolische Gruppe in dem Fluorophorteil der Verbindung;
  • xiii. die Verbindung umfaßt auch den chinoiden Ring, welcher sterisch geschützt ist;
  • xiv. der Fluorophorteil ist mit der Si-O-Gruppe durch die sulfatierte Zuckereinheit verbunden;
  • xv. die phenolische Gruppe der Verbindung ergibt nur Keto-Enol-Tautomerie und ruft so beide Strukturtypen von Chinon und die phenolische Struktur hervor; und
  • xvi. die Verbindung wird als multipler Fluoreszenzfarbstoff verwendet.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung, die Verbindung besitzt die folgenden charakteristischen Eigenschaften:

  • i. wird nicht durch ein Reduktionsmittel entfärbt,
  • ii. die Verbindung ist keine synthetische Verbindung,
  • iii. der rohe Extrakt des Farbstoffs ist gelblichgrün in der Farbe;
  • iv. der flüssige Farbstoff der gereinigten Verbindung ist bräunlich mit Farbtönen von grün, gelb und rot,
  • v. die gereinigte getrocknete Verbindung ist, wenn mit dem bloßen Auge im Tageslicht gesehen, ein rötlichbraun gefärbtes Pulver,
  • vi. unter Röhrenlicht werden einige Farbtöne von Grün emittiert,
  • vii. unter Quecksilberlicht ergibt sie bläuliches Grün,
  • viii. unter Röntgenstrahlen fluoresziert sie in grüner Farbe,
  • ix. die Verbindung ist in der Beschaffenheit amorph,
  • x. die Verbindung ist in Wasser löslich, in den organischen Lösungsmitteln einschließlich Ethanol, Methanol und Aceton unlöslich,
  • xi. die Verbindung ist negativ geladen,
  • xii. die Verbindung hat einen pH von 2,8,
  • xiii. die Verbindung umfaßt einen chinoiden Ring,
  • xiv. die Verbindung ist in der Beschaffenheit nicht proteinartig,
  • xv. die Verbindung weist einen reduzierenden Zucker auf,
  • xvi. die Verbindung wirkt als Biosurfactant,
  • xvii. die Verbindung hat antimikrobielle Eigenschaften und zeigt, wenn ein antimikrobieller Assay durchgeführt wird, eine Zone der Hemmung, xviii. die Verbindung emittiert Fluoreszenz, wenn sie mit unterschiedlichen Wellenlängen von Röntgenstrahlen, UV- und sichtbaren Spektralbereichen auf einem Spektrophotometer angeregt wird,
  • xix. UV-, sichtbare Spektroskopie ist von 250 nm–700 nm und die Peaks sind für die Verbindung bei den Wellenlängen 291 nm und 451 nm markiert,
  • xx. das Scannen der fluoreszenzspektroskopischen Emission wird ausgeführt, indem die Verbindung bei 270 nm angeregt wird, der Peak der Fluoreszenz kam bei 550 nm,
  • xvii. wenn die Verbindung bei 340 nm angeregt wird, ist der Fluoreszenzpeak bei 460 nm,
  • xviii. wenn die Anregungswellenlänge bei 361 nm fixiert ist, ist die Fluoreszenzemission bei 490 nm in maximaler Quantität,
  • xix. wenn die Anregungswellenlänge bei 400 nm fixiert ist, ist die Fluoreszenzemission bei 470 nm in maximaler Quantität,
  • xx. wenn die Verbindung bei 523 nm angeregt wird, ist die Emission bei 600 nm maximal,
  • xxi. physikalische Überprüfung des Farbstoffs in der Konzentration von 1:2000000-facher Verdünnung, d.h. mit der Konzentration 5 × 10–6 der Verbindung, unter UV-Kolben des Bereichs von 260 nm–280 nm emittiert bläulichgrüne Farbe der Fluoreszenz,
  • xxii. epifluoreszenzmikroskopische Überprüfung des Farbstoffs in der Konzentration von mindestens 1:200000000-facher Verdünnung, d.h. mit der Konzentration 5 × 10–8 der Verbindung, emittiert unter unterschiedlichen Fluoreszenzwürfeln Fluoreszenz,
  • xxiii. die Verbindung emittiert acht unterschiedliche gefärbte Fluoreszenzen bei vier unterschiedlichen Wellenlängen des UV- und sichtbaren Bereichs der Fluoreszenzwürfel eines Epifluoreszenzmikroskops,
  • xxiv. Fluoreszenzblau mit Farbtönen von Indigo-Farbemission erfolgt in dem Bereich von 380 nm–400 nm von UVA, wenn die reine Verbindung unter dem Anregungsbereich des ultravioletten Würfels WU von 330 nm–385 nm angeregt wird,
  • xxv. Fluoreszenzgrün-Farbemission erfolgt in dem Bereich von 500 nm–570 nm, wenn die reine Verbindung unter dem Anregungsbereich des WB-Würfels von 450 nm–480 nm angeregt wird,
  • xxvi. die Emission von Fluoreszenzrot mit orange Farbtönen erfolgt in dem Bereich von 570 nm–650 nm, wenn die reine Verbindung unter dem Anregungsbereich des WG-Würfels von 510 nm–550 nm angeregt wird,
  • xxvii. die Verbindung emittiert Farbtöne von bläulichen Grautönen unter dem gewöhnlichen Durchlichtkolben des Epifluoreszenzmikroskops, wenn sie unter 10×-, 40×-, 100×-Objektiven gesehen wird,
  • xxviii. epifluoreszenzmikroskopische Untersuchung von Eizellen von marinen Lebewesen, konjugiert mit der Fluoreszenzverbindung in Konzentrationen von mindestens 1:200000000-facher Verdünnung d.h. mit der Konzentration 5 × 10–8 der Verbindung, emittiert unter den unterschiedlichen Fluoreszenzwürfeln Fluoreszenz in Farben, die unterschiedlich zu denen der reinen Verbindung sind,
  • xxix. die Zellen, markiert mit der Verbindung, emittieren vier unterschiedlich gefärbte Fluoreszenzen bei vier unterschiedlichen Wellenlängen der UV- und sichtbaren Bereiche der Fluoreszenzwürfel und des Durchlichtkolbens des Epifluoreszenzmikroskops,
  • xxx. die mit der Verbindung markierten Zellen emittieren Fluoreszenz blauer Farbe, wenn sie in dem Bereich von 330 nm–385 nm durch den WU-Fluoreszenzwürfel des Epifluoreszenzmikroskops angeregt werden,
  • xxxi. die mit der Verbindung markierten Zellen emittieren hellgelbe Fluoreszenz, wenn sie unter dem Anregungsbereich des WB-Würfel von 450 nm–480 nm angeregt werden,
  • xxxii. die Zellen emittieren Fluoreszenz roter Farbe, wenn sie unter dem WG-Würfel mit dem Anregungsbereich von 510 nm–550 nm angeregt werden,
  • xxxiii. die Fluoreszenzfarben der Verbindung bleiben bei Raumtemperatur auch nach einem Jahr bestehen,
  • xxxiv. die Fluoreszenz der Verbindung ist in hohem Maße lichtbeständig und verschlechtert sich bei langen Einwirkungen von direktem Licht nicht,
  • xxxv. die Verbindung wird nicht durch Licht gebleicht,
  • xxxvi. die Verbindung wird nicht gelöscht, während der Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop geprüft wird; und
  • xxxvii. die Fluoreszenz der Verbindung ändert sich nicht, wenn sie bei Temperaturen unter Null gefroren wird, sogar nachdem sie in flüssigem Stickstoff gefroren worden ist, eine Temperatur, bei welcher die Moleküle nicht imstande sind, die Energie zu erreichen, die für die Aktivierung, wie in Extrakten aus lumineszenten Organismen, notwendig ist.

Noch eine andere Ausführungsform, die Verbindung ist nicht radioaktiv und ist die erste natürliche organometallische Verbindung mit Siliciummatrix.

Noch eine andere Ausführungsform, die Anwesenheit von Kieselsäure in einer Verbindung wird zum ersten Mal als integraler Teil eines lebenden Organismus identifiziert.

Noch eine andere Ausführungsform, die Verbindung ist Phenolisches Sulfatiertes Silicatiertes Polysaccharid (PSSP), und die Verbindung stellt ein natürliches in-vivo-System zum Untersuchen assoziierter physiologischer Aspekte der Organosiliciumverbindung in kosmetischer Chirurgie bereit.

Eine andere Ausführungsform, die Verbindung umfaßt eine längere Wellenlänge, schmale Bandbreite und kleine Stokes-Verschiebung, wie in Tabelle 3 und Tabelle 4 bereitgestellt, und die Emissionsspektren der Verbindung sind gegen Lösungsmittelpolarität und pH unempfindlich.

Die Verbindung hat größere Lichtbeständigkeit mit einer längeren Wellenlänge und hat mehr als einen Emissionsbereich im sichtbaren Spektrum und Spacer bilden einen integralen Teil der natürlichen Verbindung.

Noch eine andere Ausführungsform, die Verbindung hat hohe Mischbarkeit mit Wasser, was das leichte Mischen geeigneter Zusatzstoffe, wie erforderlich für kosmetische und Arzneimittelzusammensetzungen, erleichtert.

Noch eine andere Ausführungsform, die Verbindung umfaßt acht Anregungs-(ex)/acht Emissions-(em)nm-Bereiche die die Spektren rechts von Röntgenstrahlen und 270–745 nm vom UV- und sichtbaren Bereich mit hohen und scharfen Peaks abdecken.

Sogar noch eine andere Ausführungsform stellt eine multiple Fluoreszenzverbindung mit Anregungs- und Emissionsspektren des Farbstoffs in dem Fluoreszenzfilterwürfel in dem Bereich von 450–480 nm bereit, was zu der Spektrallinie des Argonionenlasers (~488 nm) paßt.

Sogar noch eine andere Ausführungsform stellt eine multiple Fluoreszenzverbindung mit Anregungs- und Emissionsspektren des Farbstoffs in dem Fluoreszenzfilterwürfel in dem Bereich von 450–480 nm bereit, was zu der Spektrallinie des Argonionenlasers (~488 nm) paßt, wie das Fluorescein, aber die Zellkonjugate emittieren Fluoreszenz mit hellgelber Farbe, was den Farbstoff in Multicoloranwendungen verwendbar macht.

Noch eine andere Ausführungsform, die Verbindung ist resistent gegenüber dem Löschen und die Fluoreszenzintensität vergrößert sich nach Konjugation mit Proteinen ungeachtet von Verdünnung und Konzentration des Farbstoffs.

Noch eine andere Ausführungsform, die Verbindung ist bei Raumtemperatur stabil und hat eine lange Lagerbeständigkeit.

Noch eine andere Ausführungsform, die molekularen und radioaktiven Kits der Verbindung könnten bei Raumtemperaturen exportiert werden.

Noch eine andere Ausführungsform, Mikrophotographie von Fluoreszenzemissionen der Verbindung unter dem Fluoreszenzmikroskop wird durch Verwendung von Kodak-400-Film ohne eine andere spezielle Filmanforderung mit einer Belichtungszeit im Bereich zwischen 45–60 Sekunden ausgeführt.

Noch eine andere Ausführungsform, die Verbindung erzeugt auf den zytogenetischen Objektträgern, wo kein Prüfkörper vorhanden ist, Kontrastfärbungswirkung von Zellen und Zellkomponenten unter aller Fluoreszenz.

Noch eine andere Ausführungsform, die Verbindung emittiert acht Farben von Fluoreszenz, wenn sie bei acht Wellenlängenbereichen von Röntgenstrahlen, UV-Strahlen und sichtbaren Spektralbereichen sogar in den Verdünnungen von dem 1:2000000-fachen in ultrareinem Wasser in der Konzentration 5 × 10–8 bis 10–6 angeregt wird.

In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine neue Verbindung mit einer Molekülformel C10H16N2O, welche ein Fluorophor mit einer Strukturformel, wie sie in 20 von den begleitenden Zeichnungen gezeigt wird, ist.

Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung, wobei die Nomenklatur des Fluorophors 1-Hydroxy-2,5-di-methylaminobenzol (HDAB) ist und es ein Molekulargewicht von 180 hat.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge von bioaktiver multipler Fluoreszenzfarbstoffverbindung, wobei die Verbindung aus der marinen Seegurke Holothuria scabra erhalten wird, zusammen mit geeigneten Zusatzstoffen für die folgenden nützlichen Anwendungen:

  • i. Herstellung einer flexiblen Polyvinylchloridfolie, die Fluoreszenzfarben zeigt;
  • ii. Verwendung von Fluoreszenzfarben in Anstrichstoffen, Tinten, Textilien;
  • iii. eine Zusammensetzung von Fluoreszenzfarbstoff zum Bleichen und Aufhellen eines Polymers;
  • iv. Lecknachweise mit einem vollen Spektrum von Fluoreszenzfarbstoff;
  • v. Verwendung in einem automatisierten chemischen Dosiersystem;
  • vi. zur Markierung des Standorts eines zertrümmerten Transportbehälters; wobei der Behälter aus der Gruppe, bestehend aus einem Flugzeug, Rettungsbooten und Raketen, ausgewählt ist;
  • vii. Unterwassersonden:
  • viii. UVA wird in der Photochemotherapie von Hautkrebs verwendet;
  • ix. Chromatophor-Sonnenschutzkomponente von kosmetischen Cremes und Lotionen;
  • x. die wassermischbare Eigenschaft des Farbstoffes kann ihn in Feuchthaltemitteln leicht mischbar machen;
  • xi. Komponente des Kits zur Anwendung bei fluoreszenter in-situ-Hybridisierung für molekulare Diagnostik;
  • xii. Komponente der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis, wobei die Kits für einen Zweck, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie, zum Markieren von DNA, RNA, Proteinen und Enzymen verwendet werden;
  • xiii. Immunofluoreszenznachweis;
  • xiv. Kontrastfärbung von DIG-markierten Oligonucleotidsonden und Anti-DIG-Fab-Fragmenten;
  • xv. Zytometrieanwendungen mit einfachem und mehrfachem Fluß;
  • xvi. Fluorochromfärbungen für Epifluoreszenzmikroskopie;
  • xvii. für eine schnelle Überprüfung der Biokontamination in der Reformkostindustrie, kosmetischen Industrie, Arzneimittel-, Pestizidindustrie und in chemischen Industriezweigen;
  • xviii. für schnelle Abschätzungen von Biokontaminanten in Laborkulturen;
  • xix. für eine schnelle Überprüfung von biologischen Schmutzstoffen unter Feldbedingungen;
  • xx. ein kompetitiver Inhibitor von Cholinesterasen;
  • xxi. in antimikrobiellen Zusammensetzungen;
  • xxii. als Biosurfactant in Toilettenartikelzusammensetzungen;
  • xxiii. ein natürliches Färbemittel;
  • xxiv. eine bioaktive Zusammensetzung des Farbstoffs in dem Verhältnis von 1:20000000 in ultrareinem Wasser, um Fluoreszenz mit acht Farben bei acht unterschiedlichen Wellenlängen und eine Phasenkontrastwirkung unter Durchlicht zu erhalten;
  • xxv. ein Farbstoff für verschiedene Fluoreszenzanwendungen, die in Bereichen mit Temperaturen unter Null durchgeführt werden sollen;
  • xxvi. eine Verbindung zur Verwendung als Basis zur Herstellung von Derivaten des Farbstoffs für neue Fluoreszenzsonden;
  • xxvii. eine Verbindung für molekulare Reagenzien;
  • xxviii. eine Verbindung zur Herstellung von Konjugaten für molekulare Anwendungen; und
  • xxix. zum Erhalt einer Phasenkontrast- und histochemischen Kontrastfärbungswirkung für verschiedene biochemische Bestandteile von Zellen unter Durchlicht.

Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion einer neuen Verbindung und eines multiplen Fluoreszenzfarbstoffes aus der Seegurke Holothuria scabra, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

  • a. Sammeln der Tiere von den Stränden während einer Ebbe und Halten in Seewasser enthaltenden Glastanks im Laboratorium für taxonomische Identifizierung und weitere Verwendung;
  • b. sorgfältiges Waschen der Tiere mit Milli-Q-Wasser und Anästhesieren durch Chloroform/Menthol in einem geschlossenen Gefäß;
  • c. Entfernen der Eingeweide und des Hautanteils der Tiere durch Ablösen, indem mit einem Skalpell geschabt wird, zum Lyophilisieren;
  • d. Nehmen der lyophilisierten Haut von Schritt (c) mit der erforderlichen Quantität von ultrareinem Wasser und Halten auf einem Schüttler für 4 Stunden und nachfolgende Filtration durch Whatmannn-Papier 1 und Sinterglasfilter;
  • e. Verdampfen des Filtrats von Schritt (d) und Ausfällen der Verbindung unter Verwendung organischer Lösungsmittel;
  • f. Lösen des Niederschlags in einem minimalen Volumen von Wasser und Wiederausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, um die Salze zu entfernen;
  • g. Zentrifugieren, um den Rückstand zu sammeln, und Verwerfen des Filtrats;
  • h. Trocknen des Rückstands von Schritt (g), um ein trockenes Pulver zu erhalten;
  • i. Lösen des trockenen Pulvers von Schritt (h) in Wasser, Ausbringen auf eine Ionenaustauschsäule;
  • j. Eluieren der Säule von Schritt (i) mit Wasser;
  • k. Lyophilisieren der mit Wasser eluierten Fraktionen von Schritt (j);
  • l. Ausbringen des lyophilisierten Materials von Schritt (k) auf eine DEAE-Cellulose-Säule, Eluieren mit Phosphatpuffer;
  • m. wiederholtes Entsalzen der mit Phosphatpuffer eluierten Fraktion von Schritt (1) unter Verwendung einer PD10-Säule und
  • n. Erhalten der geforderten bioaktiven Verbindung der Formel G22H48O66N2S10Si7, dargestellt durch die 18 oder 19.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung, der marine Organismus Holothuria scabra wird aus intertidalen, submersen, flachen und tiefen Gewässern erhalten, gewöhnlich in beschatteten Bereichen wie beispielsweise Bergschluchten, Felsspalten, Felsbänken, Lagunen, Überhängen, felsigen und sandigen Habitaten reichlich vorhanden; dunkel bis hell gefärbte, festgewachsene, seßhafte Drifter mit oder ohne Exo- und Endoskelett, nektonisch mit veränderter Schwimmkraft, gewöhnlich nächtlich in der Lebensweise, neigend zu aktivem Räubertum, mit und ohne lumineszente und fluoreszente Pigmente, die Emissionen in einigen bis allen Wellenlängenbereichen von Röntgenstrahlen, UVB, UVA, sichtbaren farbigen Spektren und Infrarotspektrum ergeben.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung, die empirische Formel der Verbindung ist C22H48O66N2S10Si7 und sie hat das Molekulargewicht 1915.

Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung, wobei die Verbindung ein Fluorophor enthält, welches die empirische Formel C10H16N2O und ein Molekulargewicht von 180 hat.

Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung, wobei gefunden wird, daß die HPLC-Retentionszeit der multiplen Fluoreszenzfarbstoffverbindung 1,909 Minuten beträgt.

Eine andere Ausführungsform, die Verbindung wird mit Wasser in dem Verhältnis von dem 1:2000000-fachen verdünnt, welche Fluoreszenz mit acht Farben bei acht unterschiedlichen Wellenlängen emittiert.

Eine andere Ausführungsform, die Verbindung ist bei unterschiedlichen Temperaturen im Bereich zwischen Temperaturen unter Null bis 300°C stabil.

Eine andere Ausführungsform, die Verbindung zeigt bei der FT-IR-Analyse Signale von Sulfaten, die in dem Bereich von 1210–1150 und 1060–1030 und 650 vorkommen, was darauf schließen läßt, daß Schwefel in der Verbindung in dem O-SO2-Typ von Verknüpfung vorhanden ist.

Eine andere Ausführungsform, die Verbindung zeigt bei der FT-IR-Analyse die starke Absorptionsbande für Silicat zwischen 1090–1020 (bei 1068), die das Vorhandensein von -Si-O-Si-Verknüpfung bestätigt.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt eine Methode zum Färben von Substanzen und/oder Komponenten in verschiedenartigen industriellen, biologischen und anderen Anwendungen bereit, wobei die Methode Aufbringen oder Hinzufügen einer erforderlichen Menge der multiplen Fluoreszenzverbindung nach Anspruch 1 zu den Substanzen und/oder Komponenten umfaßt.

Eine andere Ausführungsform, die Verbindung wird zum Markieren von Molekularsonden in fluoreszenter in-situ-Hybridisierung (F.I.S.H.) verwendet.

Eine andere Ausführungsform, die blau gefärbte Fluoreszenz des Farbstoffs ist vergleichbar mit der Emission der gleichen Farbe durch das DAPI-Fluorochrom bei Anregung mit der gleichen Wellenlänge, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.

Eine andere Ausführungsform, die gelb gefärbte Fluoreszenz des Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist vergleichbar mit den gleichen farbigen Emissionen von Auramin, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.

Noch eine andere Ausführungsform, die gelb gefärbte Fluoreszenz des Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist vergleichbar mit den gleichen farbigen Emissionen von FITC, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.

Noch eine andere Ausführungsform, die orange gefärbte Fluoreszenzemission ist vergleichbar mit der orangen Fluoreszenzfarbe des Propidiumiodid-Fluorochroms, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.

Noch eine andere Ausführungsform, die orange gefärbte Fluoreszenzemission ist vergleichbar mit der orangen Fluoreszenzfarbe des Rhodamin-Fluorochroms, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.

Noch eine andere Ausführungsform, die orange gefärbte Fluoreszenzemission ist vergleichbar mit der orangen Fluoreszenzfarbe des TRITC-Fluorochroms, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.

Noch eine andere Ausführungsform, der vorliegende Farbstoff ist ebenfalls vergleichbar mit der Emission von Farbe durch Hoechst 33258, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.

Noch eine andere Ausführungsform, der vorliegende Farbstoff ist ebenfalls vergleichbar mit der Emission von Farbe durch das Hoechst-33342-Fluorochrom bei Anregung mit der gleichen Wellenlänge, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.

Noch eine andere Ausführungsform, die Verbindung kann in allen Anwendungen verwendet werden, wo gegenwärtig Phycobiliproteine verwendet werden, da ihnen unähnlich der Farbstoff beim Einfrieren nicht Verlust an Fluoreszenz erleidet.

Noch eine andere Ausführungsform, unter dem Hellfeld des Fluoreszenzmikroskops, wenn unter einem 10×-Objektiv gesehen, erzeugen die Farbtöne von bläulichen Grautönen eine Phasenkontrastwirkung, welche beim schnellen Prüfen von zytogenetischen, zytologischen und histochemischen Objektträgern verwendbar ist und Ausgaben für die extra Phasenkontrastzugangskomponente des Mikroskops spart.

Noch eine andere Ausführungsform, in der Verbindung unter dem 100×-Ölimmersionsobjektiv eines gewöhnlichen Durchlichtmikroskops zeigen die Proteine von Eidotter, Nucleoplasma und Chromatin von aktiv teilenden Spaltungszellen unterschiedliche Farben der Anfärbung in den Farbtönen von bräunlichem Gelb für frühere, gelb für die spätere und dunkelblau für die letzte Zellkomponente, was in schnellen Bioassays der Wirkung verwendbar ist, die bei den verschiedenen histochemischen Komponenten der Zellen gesehen werden kann.

Die Erfindung stellt weiterhin einen neuer Fluoreszenzfarbstoff bereit, welcher aus der Haut des Tieres erhalten wird. Sie beschreibt ebenfalls die physikalische und chemische Natur des Farbstoffes und seine Stabilität in direktem Licht, bei extrem hohen und niedrigen Temperaturen. Der Farbstoff emittiert acht gefärbte Fluoreszenzen, wenn mit acht unterschiedlichen Wellenlängen des Fluoreszenzspektrophotometers und des Epifluoreszenzmikroskops in den Bereichen von ultraviolettem Licht und dem sichtbaren Spektrum und den Röntgenstrahlen angeregt wird. Der Anregungs- und Emissionsbereich des grünen Spektrums ist der größte. Die Erfindung betrifft ebenfalls das Prüfen von Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop für eine schnelle Überprüfung von Kontamination und zytogenetisches Prüfen. Die Erfindung ist ebenfalls befaßt mit den Verwendungen des Farbstoffs als nicht radioaktive Markierung von Protein-, DNA- und RNA-Molekularsonden für fortgeschrittene molekulare Diagnostik, Epifluoreszenzmikroskopie für einfaches und doppeltes Anfärben von Chromosomen, Zellen und Geweben, Anwendungen von fluoreszenter in-situ-Hybridisierung, Biosurfactant, veterinäre Heilmittel, Biokontamination und Lecküberprüfung, Photochemotherapie, neue Fernmeßgeräte, Unterwassersonden, Lebensrettungsvorrichtungen, Markierung des Standorts eines zertrümmerten Flugzeugs, von Rettungsbooten und Verteidigungsausrüstung, zum Beispiel Raketen, verschiedenartige Fluoreszenzanwendungen bei extrem hohen Temperaturbedingungen und solchen unter Null und viele mehr.

Die Erfindung beschreibt einen Fluoreszenzfarbstoff, erhalten von marinen Lebewesen, welche entweder Sonnenlicht für ihre physiologischen Funktionen absorbieren oder einer längeren Dauer von Sonnenlicht ausgesetzt sind und Mechanismen von Fluoreszenz bei unterschiedlichen Wellenlängen entwickelt zu haben scheinen. Wie das Phytoplankton absorbieren Picoplankton und Photosynthesebakterien Sonnenlicht für ihre photosynthetischen Funktionen, werden die erforderlichen Wellenlängen der Lichtspektren auf den chemischen Wegen verwendet und wird extra Licht folgend dem Stokes-Gesetz emittiert.

Die wirbellosen Lebewesen, die keinen extra äußeren Panzer wie eine Schale und auffallende Verteidigungsorgane haben, die bioorganische Ablagerungen und harte und stachlige Haut haben, die ein starkes Endoskelett, gebildet aus Knöchelchen und Skelettnadeln, haben, sind seßhaft oder von langsamer Mobilität, planktonisch, benthisch und nektonisch, haben lange Stunden der Einwirkung von direktem Sonnenlicht, leben im Sand oder in Felsspalten, können Fluoreszenz zeigen.

Die vorliegende Erfindung sucht die im Stand der Technik inhärenten Nachteile zu überwinden, indem in hohem Maße wirksame und selektive Verfahren zur Extraktion, Reinigung und Charakterisierung einer Verbindung, welche ein Fluoreszenzfarbstoff von einem marinen Wirbellosen ist, und deren multiple Verwendungen beim Aufbau von Kits für molekulare Diagnostik unter Verwendung von nicht radioaktiven Markierungen, Molekularmarkern, Epifluoreszenzmikroskopie, Photochemotherapeutika, einer Komponente von neuen Instrumentierungsvorrichtungen für Land- und Unterwassersonden, Kosmetikindustrie, Lebensmittelindustriezweige usw. bereitgestellt werden.

Das marine Wirbellose ist ein Echinoderm, das taxonomisch Holothuria scabra genannt wird und zu der Klasse Holothuroidea gehört. Die Produkt der Erfindung ist eine neue Organosiliciumverbindung, deren Struktur sie mit einer Möglichkeit der Fluoreszenz als Fluoreszenzfarbstoff mit sowohl hohem als auch niedrigem Molekulargewicht ausstattet. Über den multiplen natürlichen Fluoreszenzfarbstoff wird zum ersten Mal berichtet. Die Tiere wurden von den Stränden zentraler Westküsten von Indien während der Ebbe gesammelt, in das Laboratorium gebracht und in Seewasser enthaltenden Glastanks mit einem Salzgehalt von 30–32% pro Nennwert gehalten. Die Tiere waren ausgewachsen und sexuell reif. Die taxonomische Position wurde wie vorstehend gesagt identifiziert. In der Tat sind die meisten der verfügbaren Farbstoffe in der Beschaffenheit synthetisch. Es gibt auf dem Markt nur 6 Typen von natürlichen Farbstoffen. Diese schließen Farbstoffe ein, die von allen lebenden Organismen erhalten werden. Der in der vorliegenden Erfindung berichtete Fluoreszenzfarbstoff ist der einzige seiner Art aus marinen Organismen.

Wie hier verwendet wird der Begriff Organosiliciumverbindung für einen Si-O-R-Typ von chemischer Verbindung verwendet, wo „R" die organische Einheit ist. Der Begriff phenolische und chinoide Form der Verbindung wird für die chemischen Strukturen des Fluorophorteils der Verbindung verwendet, welche infolge des unterschiedlichen Elektronenzustands und Verteilungsmusters der Kohlenstoffbindung sich zwischen der phenolischen und chinoiden Form verschieben und Fluoreszenz und Farbe emittieren.

Der Begriff Farbstoff wird für ein Pigment verwendet, welches durch ein Reduktionsmittel nicht entfärbt wird. Der Farbstoff vermittelt Fluoreszenzfarben an die Faser, Cellulose, Zellmembranen und an andere Zellbestandteile usw. Er wird ein natürlicher Farbstoff genannt, da der Ausgangsstoff von einem marinen Lebewesen ist, gewöhnlich in der Natur entlang Stränden, flachen und tiefen Gewässern der Welt gefunden wird und kein synthetisches Pigment ist. Ein Fluoreszenzfarbstoff ist einer, der bei Anregung mit einer speziellen Wellenlänge während des Übergangs von einem höheren zu dem niedrigeren Elektronenzustand innerhalb einer sehr kurzen Zeitdauer Licht emittiert.

Farbstoff mit multipler gefärbter Fluoreszenz bedeutet die Emission von unterschiedlichem farbigen Licht, wenn er in unterschiedlichen Bereichen von Wellenlängen angeregt wird. Er emittiert bei Anregungen mit Spektren unterschiedlicher Wellenlänge von Röntgen-, UV- und sichtbarem Licht Indigo, blaue, bläulichgrüne, grüne, gelblichgrüne, gelbe, orange und rot gefärbte Farbtöne von Fluoreszenz. Die mit dem Farbstoff angefärbte Zelle emittiert blaue, gelbe und orange Fluoreszenz. Biosurfactant bedeutet eine Farbstofflösung, welche, wenn geschüttelt, wie Seife Schaum bereitstellt und antimikrobielle Qualität zeigt. Die molekulare Diagnostik bedeutet wie hier verwendet die Verwendung des Farbstoffs als nicht radioaktive Markierung von Molekularsonden für Anwendungen fluoreszenter in-situ-Hybridisierung in Molekularzytogenetik und als Marker in Mikroarrays und molekularbiologischen Untersuchungen. Die Epifluoreszenzmikroskopie betrifft hier die mikroskopischen Untersuchungen zytogenetischer Zubereitungen von Objektträgern durch Verwendung des vorliegenden Farbstoffs als Färbemittel, und Aufzeichnung unterschiedlicher gefärbter Fluoreszenz, wobei, wenn unter unterschiedlichen Würfelkonfigurationen beobachtet, bei Anregung mit bekannten Fluorochromen eine spezielle gefärbte Emission emittiert wird. Die Fluorochrom-Würfel WUB, WB, WG sind die vorgegebenen Filterwürfelkonfigurationen des Fluoreszenzaufsatzes für reflektiertes Licht von Olympus BX-FLA für unterschiedliche Wellenlängen.

Die folgenden Schritte können die chemische Struktur und andere chemische und physikalische charakteristische Eigenschaften der Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff bewerten:

  • 01. Strukturanalyse der Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff
  • 02. Chemische Eigenschaften und empirische Formel
  • 03. Identifizierung des Fluorophors
  • 04. Physikalische charakteristische Eigenschaften
  • 05. Stabilität
  • 06. Elektrische Ladung
  • 07. Biosurfactantanalyse,
  • 08. FT-IR-Analyse,
  • 09. Fluoreszenzspektrophotometrie
  • 10. Physikalisches Überprüfen der Emission unter UV-Kolben in dem Bereich von 260–280 nm,
  • 11. Vorbereitung der zytogenetischen Objektträger durch das Lufttrocknungsverfahren,
  • 12. Epifluoreszenzmikroskopie des reinen Farbstoffs unter den Fluorochrom-Würfeln WU, WB, WG und dem Hellfeld,
  • 13. Epifluoreszenzmikroskopie der Zellen unter den Fluorochrom-Würfeln WU, WB, WG und dem Hellfeld,
  • 14. Anfärben der zytogenetischen Objektträger mit dem Farbstoff, und Prüfen unter
  • 15. den Fluorochrom-Würfeln WU, WB, WG des Mikroskops BX-60 Olympus und dem Hellfeld,
  • 16. Mikrophotographie der emittierten Fluoreszenz des reinen Farbstoffs unter den Fluorochrom-Würfeln WU, WB, WG und dem Hellfeld, und
  • 17. Mikrophotographie der emittierten Fluoreszenz der Zellen unter den Fluorochrom-Würfeln WU, WB, WG und dem Hellfeld, und
  • 18. Prüfen der Wellenlängenbereiche der Fluoreszenzfarbtöne der Emission und denen der Anregungsbereiche der Fluorochrom-Würfel.
  • 19. Pestizide Wirkung
  • 20. Veterinäres Heilmittel
  • 21. Antimikrobieller Test
  • 22. Anti-proliferate Bioaktivität

Somit stellt die Erfindung eine natürliche fluoreszente gereinigte Verbindung und einen multiplen natürlichen Fluoreszenzfarbstoff mit dem Ursprung eines marinen Lebewesens bereit, welcher acht unterschiedliche gefärbte Fluoreszenzen in den Farbtönen von Indigo, blau, bläulichgrün, grün, gelblichgrün, gelb, orange und rot emittiert, wenn er mit acht unterschiedlichen Bereichen von Wellenlängen in den spektralen Wellenlängen von Röntgenstrahlen, UV und sichtbarem Licht angeregt wird.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Peaks der Emission verschiedenartiger Bereiche von Anregungswellenlängen, indem die Ablesungen eines Fluoreszenzspektrophotometers bzw. Spektrophotometers für das sichtbare Licht aufgezeichnet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin die Epifluoreszenzmikroskopie von zytogenetischem Material auf luftgetrockneten Zubereitungen durch Verwendung dieses Farbstoffs als epifluoreszenzmikroskopisches Färbemittel. Dieser Farbstoff könnte beim Aufbau von Kits zur nicht radioaktiven Markierung für molekulare Diagnostik durch fluoreszente in-situ-Hybridisierung in verschiedenartigen molekularen, biomedizinischen und Ingenieurswissenschaften verwendet werden.

In einer Ausführungsform ist der Ausgangsstoff des Farbstoffs ein wirbelloses marines Lebewesen, gehörend zu dem Unterreich: Metazoa, Phylum Echinodermata; Subphylum: Eleutherozoa, Klasse Holothwoidea. Name: Holothuria scabra.

In noch einer anderen Ausführungsform ist die Holothuria scabra aus der Gruppe, bestehend aus Seegurken, ausgewählt und ist an der Stränden, in flachen Gewässern, tiefen Gewässern überall auf der Welt besonders im Indopazifik weit verbreitet. Die nächsten bekannten Verwandten der Seegurke sind die Seeigel und Sternfische usw.

In noch einer anderen Ausführungsform wurden die Tiere vor der Zerschneidung des Hautgewebes von Holothuria scabra sorgfältig mit Milli-Q-Wasser gewaschen und mit Chloroform/Menthol in einem geschlossenen Gefäß anästhesiert. Die Tiere wurden dann zerschnitten, der Hautanteil wurde dann abgelöst, indem mit einem Skalpell ausgekratzt wurde.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die Haut in einem kommerziellen Lyophilisierer lyophilisiert und in an der Öffnung mit Gummibändern zusammengebundenen Plastiktüten bei Raumtemperatur aufbewahrt.

In noch einer anderen Ausführungsform wird Extraktion und teilweise Reinigung des Pigments ausgeführt. Ungefähr 20 g der Hautprobe (lyophilisiert) werden abgewogen und 200 ml Milli-Q-Wasser werden dazugegeben. Es wird dann auf einem Schüttler gehalten, um das Pigment vollständig aus dem Tier zu extrahieren (für 4 Stunden).

In noch einer anderen Ausführungsform wird der extrahierte Farbstoff dann durch Dekantieren aus der Haut gesammelt und dann wird er der Filtration mittels eines Whatmann-Filterpapiers Nr. 1, nachfolgend eines an eine Vakuumeinheit angefügten Sinterglasfilters unterworfen.

In noch einer anderen Ausführungsform wird nach der Filtration das Filtrat gesammelt und auf einem Wasserbad mit 60 Grad Celsius erwärmt. Es wird in einen Scheidetrichter von 250 ml Fassungsvermögen überführt und dazu werden 100–150 ml absoluter Alkohol gegeben.

In noch einer anderen Ausführungsform wird ebenfalls beobachtet, daß Methanol-Aceton ebenfalls den Farbstoff ausfällen kann. Das ist auf die Änderung der Polarität des Lösungsmittels nach dem Hinzufügen von Alkohol, Methanol oder Aceton zurückzuführen. Es wird dann sanft geschüttelt und für eine Stunde gehalten, um vollständige Ausfällung des Farbstoffs zu erlauben.

In noch einer anderen Ausführungsform wird der ausgefällte Farbstoff durch Öffnen des Absperrhahns des Scheidetrichters in einem Becherglas gesammelt.

In noch einer anderen Ausführungsform wird er dann mit einer Geschwindigkeit von 2000 Umdrehungen pro Minute mittels eines Rotors mit fixiertem Winkel und einer Glaszentrifuge zentrifugiert.

In noch einer anderen Ausführungsform wird der ausgefällte Farbstoff nach der Zentrifugation gesammelt.

In noch einer anderen Ausführungsform wird weitere Reinigung des Farbstoffs durch wiederholtes Auflösen in Wasser und wiederholte Ausfällung ausgeführt, um die Meersalze zu entfernen.

In noch einer anderen Ausführungsform wird der ausgefällte Farbstoff in einem minimalen Volumen von Wasser (ungefähr 10 ml) gelöst und absoluter Ethanol wird dazu gegeben (50 ml). Wieder wird Zentrifugation ausgeführt und der Niederschlag wird gesammelt. Dieser Vorgang wird 5 mal wiederholt, um den Farbstoff ausreichend zu reinigen.

In noch einer anderen Ausführungsform wird nach Ausführung dieser Schritte der Farbstoff an der Luft getrocknet, gewogen und gefunden, dem Gewicht nach 2,57 g zu betragen.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die organische Zusammensetzung der Verbindung ermittelt. Die Mikroanalyse für Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Schwefel wird aus dem getrocknetem Pulver von 0,25 g des gereinigten Pigments durchgeführt.

In noch einer anderen Ausführungsform sind die Ergebnisse der Mikroanalyse und Atomabsorption als Punkt der Elementaranalyse wie folgt zusammengenommen: Kohlenstoff 8,3572%, Wasserstoff 1,739%, Stickstoff 0,9449% und Schwefel 9,457%, Siliciumdioxid 12,58% (Tabelle 1).

In noch einer anderen Ausführungsform wird zum Ermitteln der anorganischen Zusammensetzung der Verbindung das getrocknete Pulver der Atomabsorptionsspektrophotometrie und Kieselsäureabschätzung unterworfen (Siliciumdioxid 12,58%).

In noch einer anderen Ausführungsform beträgt der Atomanteil von Silicium 7 für jeweils 22 Kohlenstoffatome. Es wird vermerkt, daß die Ergebnisse der Mikroanalyse und Schwefelabschätzung fast gleich sind.

In noch einer anderen Ausführungsform wird das Atomverhältnis für die Elemente in der Verbindung in dem Verhältnis Kohlenstoff:Wasserstoff:Stickstoff:Schwefel:Kieselsäure:: 22:48:210:7 gefunden.

In einer anderen Ausführungsform wird weitere Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie ausgeführt. Kationenaustauschchromatographie wird unter Verwendung einer Dowex-(Bio-rad)-Säule, Sieböffnungsgröße 100, ausgeführt. Das Harz wird mit 1 N Chlorwasserstoffsäure gewaschen und in derselben über Nacht getränkt. Am nächsten Tag wird es dekantiert und mehrere Male mit Milli-Q-Wasser gewaschen. Es wird dann in eine Glassäule von 12 Zoll Länge und 0,5 Zoll im Durchmesser gegossen. Die Säule wird dann wieder mit Milli-Q-Wasser gewaschen, bis der pH des aus ihr eluierten Wassers auf 6,5–7 kommt. Auf diesem Wege wird die Säule mit Wasser äquilibriert. Die Verbindung in Wasserlösung wird auf die Säule aufgebracht, 2,07 g in 10 ml Milli-Q-Wasser. Dann wird die Verbindung durch Milli-Q-Wasser in fünf Fraktionen von 25 ml durch die Säule eluiert und für jede einzelne Fraktion wird die Extinktion bei 291 und 451 geprüft, das Peak-zu-Peak-Verhältnis wurde ausgeführt, um die Reinheit zu prüfen (Tabelle 2). Es wird aus der Tabelle gesehen, daß das Peak-zu-Peak-Verhältnis der Verbindung fast das gleiche blieb.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die Reinigung durch Anionenaustauschchromatographie ausgeführt, um die negativ geladenen Verbindungen zu trennen (3a).

In noch einer anderen Ausführungsform wird nach Entfernung der Metallionen der Farbstoff durch Eindampfen getrocknet und dann lyophilisiert.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die Atomabsorptionsspektrophotometrie der Kieselsäureabschätzung ausgeführt. Es wird daraus gesehen, daß keine Metallionen da sind, aber die Quantität von Kieselsäure, ermittelt durch Kieselsäureabschätzung, die gleiche blieb, das sind 12,59%. Das vorstehende bestätigt, daß Kieselsäure ein integrierter Teil der Verbindung ist und nicht als Verunreinigung vorhanden ist.

In noch einem anderen Aspekt wird die Strukturaufklärung der Verbindung ausgeführt. Die Verbindung wird nach Reinigung durch Säulenchromatographie der Säurehydrolyse unterworfen. Die Einzelheiten des Experiments sind wie folgt: etwa 50 ml der eluierten Probe werden genommen und mit 25 ml 1 N Chlorwasserstoffsäure gemischt. Es wird dann mit einem Rückflußkühler ausgestattet und mittels eines Bunsenbrenners für 1 Stunde erwärmt. Wasser wird kontinuierlich im Kreislauf durch den Kühler geführt, nach einer Stunde wird die Lösung entnommen und in einem Exsikkator über Kaliumhydroxidplätzchen zur Trockene eingedampft. Die Probe wird nach der Nacht aus der Exsikkator entnommen, zu der Fehlingschen Lösung hinzugegeben und Ausfällung wird beobachtet. Dieses Experiment bestätigt die Anwesenheit von Zuckereinheiten in dem Farbstoff

In noch einer anderen Ausführungsform werden empirische Formel und Molekulargewicht aufgeklärt. Entsprechend den Atomverhältnissen ist die Formel der Verbindung: C22H48O66N2S10Si7.

Molekulargewicht = 1915.

In noch einer anderen Ausführungsform ist die Verbindung in hohem Maße negativ geladen und die Bindung zwischen den Atomen ist ionischer Natur.

In noch einer anderen Ausführungsform sind keine Metalle durch Koordination an die Verbindung gebunden, alle Bindungen sind vom ionischen Typ.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die durch Säulenchromatographie gereinigte Verbindung für die Identifizierung des Fluorophors der chemischen Analyse unterworfen.

In noch einer anderen Ausführungsform wird zu den 5 ml der gereinigten Fraktion eine Prise von Zinkstaub hinzugegeben und dazu wird verdünnte HCl (Chlorwasserstoffsäure) gegeben, eine Entfärbung der Lösung wird beobachtet. Dies läßt auf die Anwesenheit eines chinoiden Rings schließen.

In noch einer anderen Ausführungsform wurde zu den 5 ml der gereinigten Fraktion der Verbindung Mercaptoethanol hinzugegeben. Die Verbindung wird nicht entfärbt. Das bedeutet, daß nur starke Reduktionsmittel die Verbindung entfärben können und der chinoide Ring sterisch geschützt ist und es nur die phenolischen Gruppe ist, welche imstande sein kann, Keto-Enol-Tautomerie zu ergeben, so sowohl den Chinon- Strukturtyp als auch phenolische Struktur hervorrufen kann.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die Reinheit der Verbindung durch HPLC-Analyse der reinen ionischen Form geprüft. Umkehrphasen-C18-Typ von analytischer Säule ergab, indem 50% Acetonitril (Isocratic) verwendet wurde, um den reinen Farbstoff aus der Säule zu eluieren, einen symmetrischen Peak.

In noch einer anderen Ausführungsform ist die Verbindung mit dem bloßen Auge in wässeriger Lösung in einer sehr verdünnten Form (Konzentration 5 × 10–6) blaßgelb in der Farbe.

In noch einer anderen Ausführungsform ist die konzentrierte Lösung rötlichbraun in der Farbe und die Verbindung samt Farbstoff ist bei Raumtemperatur stabil und bleibt aktiv.

In noch einer anderen Ausführungsform ändert der Farbstoff seine fluoreszenten spektralen Eigenschaften sogar nach Erhitzen bis zu 300 Grad Celsius nicht, behält seine Stabilität für über ein Jahr ohne irgendeine Kontamination oder chemischen Zerfall und erleidet nach Einwirkung von Licht keine Photolyse.

In noch einer anderen Ausführungsform erfordert der marine Farbstoff nicht, daß für längere Lagerbeständigkeit Stabilisierungsmittel hinzugegeben werden.

In noch einer anderen Ausführungsform zeigt Prüfen der elektrischen Ladung des Farbstoffs durch Gelelektrophorese an, daß der Farbstoff selbst eine negativ geladene Verbindung ist und er in Richtung zu der positiv geladenen Elektrode angezogen wurde.

In noch einer anderen Ausführungsform bewertet Schütteln von 0,001 mg–0,01 mg pro ml Lösungen die Biosurfactantnatur und Schaumbildung wird gesehen.

In noch einer anderen Ausführungsform wird FT-IR-Analyse ausgeführt. Da die Verbindung extrem hygroskopisch ist, ist IR eine schwierige Aufgabe. Die Verbindung wird nach der Säulenchromatographie im Lyophilisierer getrocknet und mit Kaliumbromid gemischt und ein Preßling wird hergestellt und FT-IR wird vorgenommen.

In noch einer anderen Ausführungsform werden in der IR die Signale von Sulfaten gefunden, welche in dem Bereich von 1210–1150 und 1060–1030 und 650 vorkommen, dies läßt darauf schließen, daß Schwefel in der Verbindung in dem O-SO2-Typ von Verknüpfung vorhanden ist.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die starke Absorptionsbande für Silicat zwischen 1090–1020 (bei 1068) gefunden. Dies läßt darauf schließen, daß Silicium in der Verbindung als -Si-O-Si-vorhanden ist.

In noch einer anderen Ausführungsform wird das CH3-Strecksignal zwischen 2950–2850 gefunden.

In noch einer anderen Ausführungsform ist es, da es keine Amidsignale gibt, eindeutig, daß die Verbindung kein Protein ist.

In noch einer anderen Ausführungsform ist das Hydroxystrecksignal ebenfalls stark, aber breit, kann auf die phenolische Gruppe schließen lassen.

Die Anmelder haben die Beschaffenheit des Farbstoffs untersucht und haben gefunden, daß er mehrfarbige Emissionen bei unterschiedlichen Wellenlängen von Anregungen ergab, welche mit den mikroskopischen Fluorochrom-Färbungen vergleichbar sind, die bereits auf dem Markt sind. Die blau gefärbte Fluoreszenz der vorliegenden Farbstoffs ist mit der Emission der gleichen Farbe durch das DAPI-Fluorochrom bei Anregung mit der gleichen Wellenlänge vergleichbar, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie. Die gelb gefärbte Fluoreszenz des Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist mit den gleichen farbigen Emissionen von Auramin, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie, vergleichbar.

Die gelb gefärbte Fluoreszenz des Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist mit den gleichfarbigen Emissionen von FITC, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie, vergleichbar.

Die orange gefärbte Fluoreszenzemission ist mit der orangen Fluoreszenzfarbe des Propidiumiodid-Fluorochroms, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie, vergleichbar.

Die orange gefärbte Fluoreszenzemission ist mit der orangen Fluoreszenzfarbe des TRITC-Fluorochroms, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie, vergleichbar.

Der Farbstoff ist bei Raumtemperatur stabil und hat eine lange Lagerbeständigkeit. Die molekularen und radioaktiven Kits des Farbstoffs können bei Raumtemperaturen exportiert werden. Der Farbstoff hat charakteristische Eigenschaften von mindestens einhundertunddreiundzwanzig unterschiedlichen Fluorochromen, nämlich DAPI, Hoechst 33258, Hoechst 33342, FITC, Acridinorange, Auramin, Rhodamin, TRITC und Propidiumiodid usw., welche jetzt auf dem Markt sind (Bitplane products). Der Farbstoff, unter gewöhnlichem Licht des Mikroskops erzeugen die Farbtöne von grau eine Phasenkontrastwirkung, welche beim schnellen Prüfen von zytogenetischen, zytologischen und histochemischen Objektträgern verwendbar ist und Ausgaben für die extra Phasenkontrastzugangskomponente des Mikroskops spart. Die Emissionen der Fluoreszenzfarbe folgen dem Stokes-Gesetz der Fluoreszenz.

In noch einer anderen Ausführungsform wird Fluoreszenz der reinen Verbindung durch Fluoreszenzspektrophotometrie gesehen. Die Verbindung (lyophilisiert nach Gelfiltration) wird in Wasser gelöst (Konzentration 0,001 g/ml) und der Fluoreszenzspektrophotometrie unterworfen. Sie wird zuerst einem Anregungsscannen unterworfen und es wird gesehen, daß die Verbindung bei den Wellenlängen 361 nm und 523 nm in maximaler Quantität angeregt wird.

In noch einer anderen Ausführungsform wird, wenn die Verbindung bei 270 nm angeregt wird, der Peak der Fluoreszenz bei 550 nm gesehen.

In noch einer anderen Ausführungsform ist, wenn die Verbindung bei 340 nm angeregt wird, der Fluoreszenz-Peak bei 460 nm.

In noch einer anderen Ausführungsform ist, wenn die Verbindung bei 361 nm angeregt wird, der Fluoreszenz-Peak bei 490 nm.

In noch einer anderen Ausführungsform ist, wenn die Verbindung bei 400 nm angeregt wird, der Fluoreszenz-Peak bei 470 nm.

In noch einer anderen Ausführungsform war, wenn die Verbindung bei 523 nm angeregt wird, die Emission bei 600 nm maximal.

In noch einer anderen Ausführungsform war Epifluoreszenzmikroskopie der reinen Verbindung samt Farbstoff in den Verdünnungen von 5 × 10–8 und Aufzeichnung der Emissionen von Licht, wenn angeregt durch unterschiedliche Fluoreszenzfilterwürfel für das Mikroskop BX 60-Olympus, und die Farbtöne wurden mit den bekannten Fluorochromen verglichen. Der reine verdünnte Farbstoff wird auf den Objektträger gegeben und mit einem Deckglas bedeckt. Das Prüfen wird unter Verwendung der Anregungen von Spektren von UV-Licht und sichtbarem Licht durch die WU-, WB- und WG-Würfel des Olympus-reflektierten Lichts der folgenden Wellenlängenbereiche ausgeführt.

In noch einer anderen Ausführungsform ist der Wellenlängenbereich des WU-Würfels 330 nm–385 nm, ist der Wellenlängenbereich des WB-Würfels 450 nm–480 nm und ist der Wellenlängenbereich des WG-Würfels 510 nm–550 nm.

In noch einer anderen Ausführungsform werden die Emissionsbereiche bei unterschiedlichen Anregungsbereichen ermittelt. Es wird gesehen, daß Anregung mit dem WU-Bereich von 330 nm–385 nm Fluoreszenz in dem Bereich von 460 nm–490 nm emittierte.

In noch einer anderen Ausführungsform emittierte Anregung mit dem WB-Filter mit dem Spektralbereich von 450 nm–480 nm Fluoreszenz in dem Bereich von 510 nm–550 nm.

In noch einer anderen Ausführungsform emittierte die Anregung mit dem WG-Filter mit dem Spektralbereich von 510 nm–550 nm Fluoreszenz in dem Bereich von 610 nm–700 nm. Die Ergebnisse folgten dem „Stokes-Gesetz".

In noch einer anderen Ausführungsform wird zur Epifluoreszenzmikroskopie Eizellensuspension in Seewasser eines im Laboratorium aufgezogenen marinen Lebewesens auf einen Objektträger gegeben und zu diesem wird 1 &mgr;l des Farbstoffs mit 5 × 10–8 hinzugegeben und ein Deckgläschen plaziert.

In noch einer anderen Ausführungsform wird das Prüfen der Objekttäger unter dem Epifluoreszenzmikroskop ausgeführt und die Emissionen von Licht, wenn mit unterschiedlichem Fluoreszenzfilterwürfeln für das Mikroskop BX 60-Olympus angeregt, aufgezeichnet und die Farbtöne mit den bekannten Fluorochromen verglichen. Das Prüfen wird unter Durchlicht und Fluoreszenzfilterwürfeln der Spektren von UV und sichtbarem Licht, von der Olympus Company als WU-, WB- und WG-Würfel benannt, ausgeführt.

In noch einer anderen Ausführungsform werden die Emissionsbereiche bei unterschiedlichen Anregungsbereichen ermittelt. Es wird gesehen, daß bei Anregung mit dem WU-Bereich von 330 nm–385 nm die Zellen Fluoreszenz in dem Bereich von 460 nm–490 nm emittierten.

In noch einer anderen Ausführungsform ist die Anregung mit dem WB-Filter mit dem Bereich von 450–480 nm, ist der Spektralbereich der Emission in dem Bereich von 570–610 nm.

In noch einer anderen Ausführungsform ist die Anregung mit dem WG-Filter mit dem Spektralbereich von 510 nm–550 nm, ist die Fluoreszenzemission in dem Bereich von 610 nm–700 nm.

In noch einer anderen Ausführungsform emittierte das epifluoreszenzmikroskopische Prüfen der zytogenetischen Objektträger unter dem Hellfeld durch Verwendung von Durchlicht Licht im vollen weißen Bereich der sichtbaren Spektren und ergab abhängig von der Dichte der Zellbestandteile Farbtöne von bläulichen Grautönen und eine phasenkontrastähnliche Wirkung.

In noch einer anderen Ausführungsform werden Fluoreszenzfarbemissionen des Farbstoffs unter unterschiedlichen Anregungsbereichen gesehen und Farbtöne von emittierten Farben werden aufgezeichnet und die Farbtöne mit den bekannten Fluorochromen verglichen.

Unterschiedliche Färbemittel werden für unterschiedliche Anregungswürfel des Fluoreszenzmikroskops verwendet. Zum Beispiel werden DAPI (DNA-Färbung, emittiert blaue Farbe), Fluorescein-dUTP; Hoechst 33258, 33342 unter der Anregung mit den Anregungswürfeln von 330 nm–385 nm; FITC, Acridinorange (für DNA, RNA emittiert grünlich/gelbliche Farbtöne), Auramin unter dem Anregungswürfel von 450 nm–480 nm und Rhodamin, TRITC und Propidiumiodid (DNA, emittiert orange Farbtöne) unter dem Anregungswürfel von 510 nm–550 nm gesehen.

In noch einer anderen Ausführungsform werden die Spektralbereiche der Anregung und die Farben der emittierten Fluoreszenz in der Epifluoreszenzmikroskopie in Tabelle 4 dargeboten.

In noch einer anderen Ausführungsform gibt es eine Verschiebung der emittierten Wellenlängen, bemerkt zwischen dem gereinigten Extrakt des Tieres, der gereinigten Verbindung, welche ein Fluoreszenzfarbstoff ist, und den mit dem Farbstoff markierten Zellen.

In noch einer anderen Ausführungsform zeigte die Bindung des Farbstoffs an die Zellbestandteile klar seine Verwendbarkeit als Fluoreszenzsonde.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die Mikrophotographie der Objektträger mit dem Farbstoff, verwendet als Epifluoreszenzmikroskopie-Färbemittel, ausgeführt.

In noch einer anderen Ausführungsform wurde die Mikrophotographie von emittierter Fluoreszenz in den Gebieten von Objektträgern mit Farbstoff unter dem WU-Bereich von 330 nm–385 nm, dem WB-Bereich von 450 nm–480 nm, dem WG-Bereich von 510 nm–550 nm und dem Hellfeld durch Kodak-Farbfilm mit 400 ASA Empfindlichkeit gemacht, wobei eine Belichtung, variierend von 50 bis 60 Sekunden, ausgeführt wird.

In einer anderen Ausführungsform wird die Mikrophotographie der emittierten Fluoreszenz in den Gebieten von Objektträgern mit Farbstoff unter dem WU-Bereich von 330 nm–385 nm durch Kodak-Farbfilm mit 400 ASA Empfindlichkeit mit einer Belichtung, variierend von 50 Sekunden bis 60 Sekunden, gemacht. Der Farbton von Indigo in blauer Fluoreszenz wird emittiert.

In einer anderen Ausführungsform wird die Mikrophotographie der emittierten Fluoreszenz in den Gebieten von Objektträgern mit Farbstoff unter dem WB-Bereich von 450 nm–480 nm durch Kodak Farbfilm mit 400 ASA Empfindlichkeit mit einer Belichtung, variierend von 50 Sekunden bis 60 Sekunden, gemacht. Der Farbton von grüner Fluoreszenz wird emittiert.

In einer anderen Ausführungsform wird die Mikrophotographie der emittierten Fluoreszenz in den Gebieten von Objektträgern mit Farbstoff unter dem WG-Bereich von 510 nm–550 nm durch Kodak Farbfilm mit 400 ASA Empfindlichkeit mit einer Belichtung, variierend von 50 Sekunden bis 60 Sekunden, gemacht. Der Farbton von dunkelroter Fluoreszenz wird emittiert.

In einer anderen Ausführungsform wird die Mikrophotographie der emittierten Fluoreszenz in den Gebieten von Objektträgern mit Zellen unter dem WB-Bereich von 450 nm–480 nm durch Kodak Farbfilm mit 400 ASA Empfindlichkeit mit einer Belichtung, variierend von 50 Sekunden bis 60 Sekunden, gemacht. Der Farbton von hellgelber Fluoreszenz wird emittiert.

In einer anderen Ausführungsform wird die Mikrophotographie der emittierten Fluoreszenz in den Gebieten von Objektträgern mit Zellen unter dem WG-Bereich von 510 nm–550 nm durch Kodak-Farbfilm mit 400 ASA Empfindlichkeit mit einer Belichtung, variierend von 50 Sekunden bis 60 Sekunden, gemacht. Die Farbton von oranger Fluoreszenz wird emittiert.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die pestizide Wirkung der Verbindung samt Farbstoff beobachtet. Die Verbindung ist toxisch für Insekten. Sie zeigte Toxizität für die Insekten wie Ameisen. Das in dem Farbstoff getränkte Filterpapier wurde unbeaufsichtigt auf dem Arbeitstisch gelassen. Am nächsten Tag wurde beobachtet, daß es voll von toten Ameisen war.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die Verwendung des Farbstoffs für zytogenetische Färbung ausgeführt. Das fixierte Gewebe mit Eisessig und Methanol aus unterschiedlichen Ausgangsstoffen wird auf den Objektträger gegeben und die Farbstofflösung wird ohne Vorbehandlung dazu gegeben. Es wird beobachtet.

Diese unterschiedlichen Teile der Zelle nehmen die Farbstofflösung unterschiedlich an. Zytoplasma, Nucleus und Chromosomen zeigten unterschiedliche Färbung. Da der marine Farbstoff die Proteine des Chromosoms färbt, hat er zusätzlichen Wert beim Untersuchen des Karyotyps der Zellen.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die Stabilität der Verbindung samt Farbstoff bei den Temperaturen unter Null gesehen. Die Verbindung in ihrer verdünnten Form 5 × 10–6 wurde in einem Mikrofugenröhrchen genommen und bei –20 Grad Celsius gehalten und im gefrorenen Zustand unter UV-Licht gesehen. Die Fluoreszenz bestand ohne irgendeine Verschlechterung fort. In noch einem anderen Experiment wurde der Farbstoff in dem flüssigen Stickstoff gefroren und die Fluoreszenz blieb unbeeinflußt.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die Verwendbarkeit des Farbstoffs als veterinäres Heilmittel für Zecken und Flöhe von Haustieren gesehen. Der Extrakt wird als veterinäres Heilmittel zum Töten von Zecken/Flöhen von Hunden verwendet. Die Konzentration 5 × 10–6 von Farbstoff in 1:200-Verdünnungen tötete Zecken und Flöhe in weniger als 20 Sekunden.

In noch einer anderen Ausführungsform sind diese Farbstoffzusammensetzungen für Zecken/Flöhe Heilmittel für Haustiere und ebenfalls ist die Zusammensetzung als Bestandteil von veterinären Seifen & Kosmetika usw. verwendbar.

In noch einer anderen Ausführungsform wird ein antimikrobieller Test der Verbindung samt Farbstoff ausgeführt. Da der marine Farbstoff eine phenolische Verbindung ist und phenolische Verbindungen im allgemeinen antimikrobielle Aktivität aufweisen, wird mit dieser Verbindung ein antimikrobieller Assay durchgeführt und die Zone der Hemmung wird beobachtet.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine bioaktive Zusammensetzung, enthaltend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, in dem Verhältnis von 1:2000000 in ultrareinem Wasser bereit, um Fluoreszenz mit acht Farben bei acht unterschiedlichen Wellenlängen und eine Phasenkontrastwirkung unter Durchlicht zu erhalten.

Die Erfindung stellt ebenfalls eine Zusammensetzung bereit, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen, und verwendbar für die Herstellung von flexibler Polyvinylchloridfolie, die Fluoreszenzfarben zeigt.

In einer Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar bei der Herstellung von Beschichtungszusammensetzungen und Tinten.

In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar beim Nachweis von Lecks, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar in Unterwassersonden, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoffextrakt, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar in der Photochemotherapie von Hautkrebs, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine kosmetische Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar als Fluoreszenzsonde in in-situ-Hybridisierungs-Kits für molekulare Diagnostik, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar als Komponente von Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar in Immunofluoreszenznachweisen, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar als Kontrastfärbung von DIG-markierten Oligonucleotidsonden und Anti-DIG-Fab-Fragmenten, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar in quantitativer Fluoreszenz mit einfachen und multiplen Zellen in der Fließzytometrie, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung und den multiplen Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar als Fluorochromfärbemittel für die Epifluoreszenzmikroskopie, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar für eine schnelle Prüfung von Biokontamination in der Reformkostindustrie, kosmetischen Industrie, pharmazeutischen und chemischen Industrie, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar für schnelle Abschätzungen von Biokontaminanten in Laborkulturen, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar für eine schnelle Überprüfung von biologischen Schmutzstoffen unter Feldbedingungen, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar in antimikrobiellen Zusammensetzungen, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar als Biosurfactant in Toilettenartikelzusammensetzungen, bereit.

In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Zusammensetzung, umfassend eine gereinigte Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, erhalten aus der marinen Seegurke Holothuria scabra, zusammen mit herkömmlichen Zusatzstoffen und verwendbar als natürliches Färbemittel, bereit.

BESCHREIBUNG DER TABELLEN
  • TABELLE 1: Ergebnisse der Elementaranalyse der reinen Verbindung.
  • TABELLE 2: Spektrophotometrische Werte der reinen Verbindung.
  • TABELLE 3: Fluoreszenzspektrophotometrie der reinen Verbindung, die Anregungsemissionswellenlängen und entsprechende Farben des Spektrums zeigt
  • TABELLE 4: Die Emissionen der unterschiedlichen gefärbten Fluoreszenz der reinen Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff, wenn angeregt mit Fluoreszenzfilterwürfeln unterschiedlicher Wellenlänge des Olympus-Epifluoreszenzmikroskops mit und ohne die Konjugate
BESCHREIBUNG DER BEGLEITENDEN ZEICHNUNGEN

1 stellt ein Fließschema für Extraktion und Reinigung der Verbindung/des multiplen Fluoreszenzfarbstoffs dar.

2 stellt ein Fließschema für die weitere Reinigung und Charakterisierung der Verbindung/des multiplen Fluoreszenzfarbstoffs dar.

3a stellt die Trennung der Verbindungen durch DEAE-Cellulose-Chromatographie dar.

3b Umkehrphasenchromatographie der reinen Verbindung.

3c Scannen der reinen Verbindung.

4 IR-Analyse der reinen Verbindung

5 Fluoreszenzspektrophotometrie mit Anregung bei 270 nm

6 Fluoreszenzspektrophotometrie mit Anregung bei 340 nm

7 Fluoreszenzspektrophotometrie mit Anregung bei 361 nm

8 Fluoreszenzspektrophotometrie mit Anregung bei 400 nm

9 Fluoreszenzspektrophotometrie mit Anregung bei 523 nm

10 Schwarzweißzeichnung von epifluoreszenzmikroskopischen blauen Fluoreszenzemissionen mit WU-Würfel mit dem Anregungsbereich von 330–385 nm.

11 Farbphoto der epifluoreszenzmikroskopischen blauen Fluoreszenzemissionen mit WU-Würfel mit dem Anregungsbereich von 330–385 nm. Wo der Farbstoff ohne Zellen ist, wie im Hintergrund, ist die Farbe der Fluoreszenz mit Farbtönen von Indigo, während die Fluoreszenz an den mit Farbstoff konjugierten Zellen blau ist.

12 Schwarzweißzeichnung von epifluoreszenzmikroskopischen grünen & gelben Fluoreszenzemissionen mit dem WB-Würfel mit dem Anregungsbereich von 45080 nm.

13 Farbphoto der epifluoreszenzmikroskopischen blauen Fluoreszenzemissionen mit dem WB-Würfel mit dem Anregungsbereich von 450–480 nm. Wo der Farbstoff ohne Zellen ist, wie in dem Hintergrund, ist die Farbe der Fluoreszenz grün, während die Fluoreszenz an den mit Farbstoff konjugierten Zellen gelb ist.

14 Schwarzweißzeichnung von epifluoreszenzmikroskopischen roten & orangen Fluoreszenzemissionen mit dem WG-Würfel mit dem Anregungsbereich von 500–550 nm.

15 Farbphoto der epifluoreszenzmikroskopischen roten Fluoreszenzemissionen mit dem WG-Würfel mit dem Anregungsbereich von 500–550 nm.

16 Schwarzweißzeichnung von epifluoreszenzmikroskopischen Zellen unter Durchlicht bei 100×, die eine Phasenkontrastwirkung zeigt.

17 Farbphoto von epifluoreszenzmikroskopischen Zellen unter Durchlicht bei 100×, die Farbstoff in den Farbtönen von bläulichem Grau zeigten, und wobei die Zellen und ihre Bestandteile in den Farbtönen von Grau eine Kontrastfärbung und Phasenkontrastwirkung ergeben.

18 Chemische Struktur der phenolischen Form der reinen Verbindung

19 Chemische Struktur der chinoiden Form der reinen Verbindung

20 Struktur des Fluorophors.

Diese Erfindung betrifft das Verfahren für Extraktion, teilweise Reinigung und Charakterisierung eines neuen Pigments, welches ein natürlicher Farbstoff aus einem Echinoderm (Holothwoidea: Holothuria scabra) ist, das entlang der zentralen westlichen Küstenregion von Indien und der indopazifischen Regionen der Welt weit verbreitet ist.

Die Erfindung stellt weiterhin einen neuen fluoreszenten reinen Farbstoff aus dem Hautpigment des Tieres bereit, welcher 3–4 Mal wiederholt aus dem selben Prüfkörper extrahiert werden kann, indem unter –20 Grad Celsius aufbewahrt wird, wobei so die übermäßige Ausbeutung natürlicher Ressourcen gespart wird.

Die vorliegende Erfindung überlegt außerdem, daß der Farbstoff acht farbige Fluoreszenzemissionen bei 8 unterschiedlichen Anregungswellenlängen des Lichtspektrums (Röntgenstrahlen, Spektren von UV und sichtbarem Licht) hat. Somit kann die Fluoreszenzverbindung samt Farbstoff als acht-in-einem-Fluorochromfarbstoff der Epifluoreszenzmikroskopie für einfachen Protokollen folgende einfache und doppelte Anfärbung von Chromosomen, Zellen und Geweben kommerzialisiert werden. Der Farbstoff emittiert in den Wellenlängenspektren, äquivalent Emissionen durch mindestens zweiundzwanzig unterschiedliche Fluorophore von gegenwärtiger praktischer Bedeutung (R-Phycoerythrin, Texas-Rot, BODIPY FL, Oregon-Grün, Fluorescein, Rhodamin-Rot-X, Tetramethylrhodamin, BODIPY TMR, BODIPY TR, YOYO-1, DAPI, Indo-1, Kaskadenblau, Fura-2, Aminomethylcumarin, FM 1-43, DilC18, NBD, Carboxy-SNARF-1, Lucifer-Gelb, Dansyl + R + NH2, Propidiumiodid usw.) und die Phycobiliproteine, die gegenwärtig für Multicolorfluoreszenznachweis verwendet werden. Der Farbstoff deckt tatsächlich die Wellenlängenemissionsspektren von einhundertunddreiundzwanzig Fluorochromen ab, die gegenwärtig auf dem Markt für Fluoreszenzsonden verkauft werden.

Die vorliegende Erfindung überlegt ebenfalls die Verwendung des Farbstoffs bei der nicht radioaktiven Markierung von Protein-, DNA- und RNA-Sonden für fluoreszente in-situ-Hybridisierungs-Anwendungen in der Molekularbiologie.

Somit kann in einer bevorzugten Art der Verwendung der Farbstoff eine Komponente von Kits zur molekularen Markierung und zum Nachweis sein, von denen die meisten importiert und mit hohen Raten verkauft werden.

Diese Markierungskits werden im weiten Umfang für molekulare Diagnostik unter Verwendung schnelle molekularer zytogenetischer und Mikroarray-Techniken gesucht.

In noch einer anderen bevorzugten Art der Verwendbarkeit kann die Eigenschaft der Fluoreszenz mit Röntgenstrahlen in verschiedenen medizinischen Anwendungen verwendet werden.

Diese Eigenschaft kann in Lebensrettungsvorrichtungen als Komponente von Schwimmwesten und zur Markierung des Standorts eines zertrümmerten Flugzeugs, von Rettungsbooten und Verteidigungsausrüstung, zum Beispiel Raketen, beim Lecksuchen in der Industrie ausgenutzt werden.

Die Erfindung würde für quantitative Messung von Fluoreszenz im Fließzytometer für einfache und multiple Zellen verwendbar sein.

Die Erfindung würde ebenfalls in schnellen Abschätzungen von Biokontaminationen in natürlichen und kontrollierten Umgebungen wie Gewebekulturen, Verschmutzungen, industriellen Kontaminationen in der Gesundheits-, Nahrungsmittel- und Kosmetikindustrie vorteilhaft sein.

Die Fähigkeit des Farbstoffs, Fluoreszenz in dem UVA-Bereich zu emittieren, wenn er mit niedrigeren Wellenlängen von UV-Bestrahlung angeregt wird, ist für selektive Photochemotherapie von Hautkrebs verwendbar.

Noch eine andere Verwendbarkeit ist, daß der Farbstoff ein Biosurfactant ist und in antimikrobiellen Toilettenartikeln und Zusammensetzungen verwendet werden kann.

In einer anderen bevorzugten Art der Verwendung hat der Farbstoff eine lange Lagerbeständigkeit bei Raumtemperatur, wie durch fluoreszenzspektrophotometrische Analyse geprüft ist.

In einer noch anderen bevorzugten Art der Verwendung ergeben die vorhandenen Fluorochrome natürliche Farbe für die Kosmetika und sparen Ausgaben bei Farbzusatzstoffen.

Eine andere Verwendbarkeit des Fluoreszenzfarbstoffs ist als Komponente von neuen Fernmeßgeräten und Unterwassersonden, wo auf Empfindlichkeit für die Wellenlänge des Lichts basierende Werte erforderlich sind.

In einer noch anderen bevorzugten Art der Verwendbarkeit kann der Farbstoff in allen Typen moderner Untersuchungen, wo Multicolormarkierungexperimente eine Vorbedingung sind, wie in der DNA-Sequenzierung, Fließzytometrie, fluoreszenten in-situ-Hybridisierung und Fluoreszenzmikroskopie, vorteilhaft sein.

In noch einer anderen bevorzugten Art der Verwendbarkeit kann der Farbstoff in den Multicolorexperimenten an dem geographischen Standort, wo die umgebende Temperatur unter Null ist, wie an den Polen und Standorten darum herum, vorteilhaft sein.

Eine andere Verwendbarkeit des multiplen Fluoreszenzfarbstoffs mit hohem Molekulargewicht ist, daß, obwohl er ein Farbstoff mit hohem Molekulargewicht ist, der Fluorophorteil von niedrigem Molekulargewicht ist und daher der Farbstoff in beiden Optionen verwendbar sein kann.

Eine andere Verwendbarkeit des Fluoreszenzfarbstoffs, er kann als Basis verwendet werden und verschiedene Derivate und Konjugate können für industrielle Anwendungen hergestellt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche nicht in irgendeiner Weise als Begrenzungen für den erfinderischen Bereich der Erfindung aufgefaßt werden sollten.

BEISPIELE

Die Methoden von Extraktion, Reinigung, Charakterisierung der reinen Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff die Aufklärung der chemischen Struktur der Verbindung, sowohl phenolische als auch chinoide Form, die Struktur des Fluorophors werden offenbart. Die Einzelheiten der Experimente, durchgeführt auf Fluoreszenzspektrophotometer und Epifluoreszenzmikroskop, um die Emissionswellenlängen und die Farben der Fluoreszenz nach Anregung mit Röntgenstrahlen, UV- und sichtbare Spektralbereichen von Wellenlängen nachzuweisen, werden ebenfalls offenbart.

BEISPIEL 1:
  • Sammlung des Materials
  • Unterreich: Metazoa
  • Phylum: Echinodermata
  • Subphylum: Eleutherozoa
  • Klasse: Holothwoidea
  • Unterklasse: Aspidochirotacea
  • Ordnung: Aspidochirota
  • Gattung: Holothuria
  • Spezies: scabra

Die zu diesen gehörenden Tiere wurden von der Stränden der zentralen Westküstenregion von Indien während einer Ebbe gesammelt. Diese Tiere wurden in das Laboratorium gebracht und in Glastanks, enthaltend Seewasser mit einem Salzgehalt von 30 32 pro Nennwert (30 Promille), für taxonomische Identifizierung und weitere Verwendung gehalten. Die Tiere waren ausgewachsen und sexuell reif.

BEISPIEL 2: Zerschneidung des Gewebes des Tieres

Die Tiere wurden sorgfältig mit Milli-Q-Wasser gewaschen und durch Chloroform/Menthol in einem geschlossenen Gefäß anästhesiert. Die Tiere wurden dann zerschnitten, der Hautanteil wurde durch Reiben mit einem Skalpell ausgelöst, und die Haut wurde in dem Lyophilisierer (HETO-Gefriertrockner samt zentrifugalem Flüssigkeitseinengungssystem) bei einer Kühltemperatur von etwa –110 Grad Celsius lyophilisiert.

BEISPIEL 3: Extraktion und teilweise Reinigung des Pigments:

Ungefähr 20 g der Hautprobe (lyophilisiert) wurden dann abgewogen und 200 ml Milli-Q-Wasser wurden dazu gegeben. Es wurde dann auf einem Schüttler gehalten, um das Pigment vollständig aus dem Tier zu extrahieren (für 4 Stunden). Der extrahierte Farbstoff wurde dann durch Dekantieren von der Haut gesammelt, und dann wird er mittels eines Whattman-Filterpapiers Nr. 1, dann durch ein Sinterglasfilter, angefügt an eine Vakuumeinheit, der Filtration unterworfen. Nach der Filtration wurde das Filtrat gesammelt und auf einem Wasserbad mit 60°C erwärmt. Er wurde in einen Scheidetrichter von 250 ml Fassungsvermögen überführt und dazu werden 100–150 ml absoluter Alkohol gegeben. Es wurde ebenfalls beobachtet, daß Methanol und Aceton ebenfalls den Farbstoff ausfällen. Das ist auf die Änderung der Polarität des Lösungsmittels nach dem Hinzufügen von Alkohol, Methanol oder Aceton zurückzuführen. Es wurde dann sanft geschüttelt und für eine Stunde gehalten, um vollständige Ausfällung des Farbstoffs zu erlauben. Der ausgefällte Farbstoff wurde durch Öffnen des Absperrhahns des Scheidetrichters in einem Becherglas abgetrennt. Er wurde dann mit einer Geschwindigkeit von 2000 Umdrehungen pro Minute mittels eines Rotors mit fixiertem Winkel und einer Glaszentrifuge zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der ausgefällte Farbstoff gesammelt.

BEISPIEL 4: Reinigung des Pigments, um Seesalze zu entfernen:

Weitere Reinigung des Farbstoffs wurde durch wiederholtes Auflösen in Wasser und wiederholte Ausfällung ausgeführt, um die Seesalze zu entfernen. Der ausgefällte Farbstoff wurde in minimalem Volumen von Wasser (ungefähr 10 ml) gelöst und absoluter Ethanol wurde dazu gegeben (50 ml). Wieder wurde Zentrifugation ausgeführt und der Niederschlag wurde gesammelt. Dieses Verfahren wurde 5 Mal wiederholt, um den Farbstoff ausreichend zu reinigen. Nach Ausführen der folgenden Schritte wurde der Farbstoff an der Luft getrocknet und er wurde dann gewogen, 2,57 g.

BEISPIEL 5: Reinigung des Pigments, um Gegenionen zu entfernen:

Kationenaustauschchromatographie wurde mit Hilfe einer Dowex-(Bio-rad)-Säule, Sieböffnungsgröße 100, ausgeführt. Das Harz wurde mit Chlorwasserstoffsäure (HCl) 1 Normal gewaschen und über Nacht in derselben getränkt. Am nächsten Tag wurde es dekantiert und mehrere Male mit Milli-Q-Wasser gewaschen. Es wurde dann in eine Glassäule von 12 Zoll Länge und 0,5 Zoll im Durchmesser gegossen. Die Säule wurde dann wieder mit Milli-Q-Wasser gewaschen, bis der pH des von ihr eluierten Wassers auf 6,5–7 kommt. Auf diesem Wege wurde die Säule mit Wasser äquilibriert. Die Verbindung in Wasserlösung wurde auf die Säule aufgebracht, 2,07 g in 10 ml Milli-Q-Wasser. Dann wurde die Verbindung durch Milli-Q-Wasser durch die Säule in fünf Fraktionen von 25 ml eluiert und für jede einzelne Fraktion wurde die Extinktion bei 291 und 451 geprüft, das Peak-zu-Peak-Verhältnis wurde ausgeführt, um die Reinheit zu prüfen. Es wurde aus der Tabelle gesehen, daß das Peak-zu-Peak-Verhältnis der Verbindung fast das gleiche blieb. Nach Entfernung der Metallionen wurde der Farbstoff durch Eindampfen und dann Lyophilisation getrocknet.

BEISPIEL 6: Abtrennung der reinen Verbindungen aus dem teilweise gereinigten Pigment:

Die negativen Komponenten der Verbindungen wurden durch DEAE-Celluose-Chromatographie abgetrennt. Eine Säule mit 110 ml Bettvolumen wurde durch vorgequollene DEAE-Cellulose mit Phosphatpuffer bei pH 7,5 hergestellt. Die Säule wurde mit Phosphatpuffer 0,05 (M) äquilibriert. Lyophilisiertes Pulver wurde in Phosphatpuffer gelöst und in die Säule (5 ml) eingebracht. Ein Gradient von 2 M NaCl wird durch die Säule hindurchgeleitet. Die Fraktion wird in Aliquots von 5 ml gesammelt. Bis zu 200 ml Gradiententkommen werden ausgeführt. Danach wurde die Säule mit 2 M NaCl in Phosphatpuffer 0,05 M gewaschen und die Fraktionen wurden in den Aliquots von 5 ml gesammelt. DEAE-Cellulose-gereinigte Peaks wurden durch Verwendung einer Entsalzungssäule (PD10) entsalzen, es wurde beobachtet, daß unsere Verbindung in das Bettvolumen, nicht in das Hohlraumvolumen kommt. Die Verbindung wurde wiederholt entsalzen, bis keine Spur von Salz vorhanden ist. Nach jedem Durchlauf wird lyophilisiert. (3a)

BEISPIEL 7: Identifizierung von bioaktivem Peak:

Die Bioaktivitäts- und Fluoreszenzanalyse wurde mit allen durch Chromatographie gereinigten Peaks ausgeführt. Es wurde gefunden, daß der letzte Peak, der herausgekommen war, wenn mit 2 M NaCl gewaschen wurde, der bioaktive ist. Die Abschätzung von Kieselsäure wird durch Atomabsorptionsspektrophotometrie und die aller anderen Komponenten durch den CHNS-Analysator gemacht. Die Elementaranalyse dieses Peaks hat das C:H:N:S:Si in dem Verhältnis von Kohlenstoff 8,3572%, Wasserstoff 1,739%, Stickstoff 9,449%, Schwefel 9,457% und Siliciumdioxid 12,58% angegeben. Bei Umwandlung in das Elementarverhältnis ist es C:H:N:S:Si = 22:48:2:10:7. (Tabelle 1).

BEISPIEL 8: Reinheitsprüfung der Verbindung:

Der entsalzene und DEAE-Cellulose-gereinigte Peak wurde in 50% Acetonitril in Wasser gelöst und tert-Butylammoniumphosphat 1 mM wurde als Ionenpaarungsreagenz hinzugegeben. Es wurde dann einem analytischen Durchlauf unter Verwendung von 50% Acetonitril, enthaltend 1 mM tert-Butylammoniumphosphat, unterworfen. Ein symmetrischer Peak wurde beobachtet, welcher die Reinheit der Verbindung bestätigt. (3b).

Das UV-sichtbare-Scannen der reinen Verbindung wurde vorgenommen und ist in 3c angegeben.

BEISPIEL 9: Strukturaufklärung der Verbindung:

Die Verbindung wurde nach Reinigung durch Säulenchromatographie der Säurehydrolyse unterworfen. Die Einzelheiten des Experiments sind wie folgt: etwa 50 ml der eluierten Probe wurden genommen und mit 25 ml 1 Normal Chlorwasserstoffsäure gemischt. Es wurde dann mit einem Rückflußkühler ausgestattet und mittels eines Bunsenbrenners für 1 Stunde erwärmt, Wasser wurde kontinuierlich im Kreislauf durch den Kühler geführt. Nach einer Stunde wurde die Lösung entnommen und in einem Exsikkator über Kaliumhydroxidplätzchen zur Trockene eingedunstet.

Die Probe wurde aus dem Exsikkator entnommen, nach der Nacht oben auf die Fehlingsche Lösung gegeben und Ausfällung wurde beobachtet. Dieses Experiment bestätigt die Anwesenheit von Zuckereinheiten in dem Farbstoff

BEISPIEL 10: Chemische Eigenschaften und Empirische Formel:

Entsprechend den Atomverhältnissen ist die Formel der Verbindung: C22H48O66N2S10Si7, das Molekulargewicht = 1915. Die Verbindung ist in hohem Maße negativ geladen und zum Ausgleich war sie in Salzform. Es sind keine Metalle durch Koordination an die Verbindung gebunden, alle sind Bindungen vom ionischen Typ.

BEISPIEL 11: Identifizierung des Fluorophors:

Die durch Säulenchromatographie gereinigte Verbindung wurde für die Identifizierung des Fluorophors der chemischen Analyse unterworfen.

(A) Etwa 5 ml der gereinigten Fraktion wurden genommen und dazu wurde neutrales Eisen(III)chlorid gegeben. Und eine purpurne Färbung wurde beobachtet. Diese läßt darauf schließen, daß eine phenolische Gruppe in der Verbindung vorhanden ist.

Zu den 5 ml der gereinigten Fraktion wurde eine Prise von Zinkstaub hinzugegeben und dazu wurde verdünnte HCl (Chlorwasserstoffsäure) gegeben, eine Entfärbung wurde beobachtet. Diese läßt auf die Anwesenheit eines chinoiden Rings schließen.

Zu den 5 ml der gereinigten Fraktion der Verbindung wurde Mercaptoethanol hinzugegeben. Die Verbindung wird nicht entfärbt. Das bedeutet, daß nur starke Reduktionsmittel die Verbindung entfärben können und der chinoide Ring sterisch geschützt ist und es nur die phenolische Gruppe ist, welche imstande sein kann, Keto-Enol-Tautomerie zu ergeben, so sowohl den Chinonstrukturtyp als auch phenolische Struktur hervorrufen kann.

BEISPIEL 12: Physikalische charakteristische Eigenschaften der Verbindung:

Die reine Wasserstoff Form der Verbindung hat den pH von 2,8. Die Salzform der Verbindung ist ohne die Änderung des physikalischen und chemischen Charakters bis zu 300°C stabil. Die Verbindung ist in wässeriger Lösung in einer sehr verdünnten Form (Konzentration 5 × 10–6) mit dem bloßen Auge blaßgelb in der Farbe und die konzentrierte Lösung ist rötlichbraun in der Farbe.

BEISPIEL 13: Stabilitätsprüfung des Farbstoffs:

Die Farbstoff ist stabil und bleibt bei Raumtemperatur aktiv und er bleibt so bis zu 300 Grad Celsius, und das wurde durch keine Änderung der spektralen Eigenschaft nach einer derartigen Behandlung bewiesen. Die Verbindung behielt ihre Stabilität für etwa ein Jahr ohne irgendeine Kontamination oder chemischen Zerfall. Der marine Farbstoff unterlag nach der Lichtbehandlung nicht der Photolyse. So erfordert der marine Farbstoff keine Stabilisierungsmittel.

BEISPIEL 14: Prüfen der elektrischen Ladung des Farbstoffs durch Gelelektrophorese.

Farbstoffproben (10 ml) werden in 1% Agarosegel, hergestellt mit 0,5 × TBE, eingebracht. Das Gel wurde für eine Stunde bei 65 Volt laufen gelassen. Es wurde aus dem Gelgießsystem entnommen und mit den Augen ebenso wie unter einem UV-Transilluminator beobachtet. Es wurde gefunden, daß der Farbstoff sich in Richtung zu der positiv geladenen Elektrode bewegte, so ist der Farbstoff selbst eine negativ geladene Verbindung. Daher wurde er in Richtung zu der positiv geladenen Elektrode angezogen.

BEISPIEL 15: Biosurfactant:

Schütteln von 0,001 mg–0,01 mg pro ml Lösungen bewertete die Biosurfactantnatur der Verbindung und Schaumbildung wurde gesehen.

BEISPIEL 16: FT-IR Analyse:

Da die Verbindung in der Beschaffenheit extrem hygroskopisch ist, waren die IR-Spektren eine schwierige Aufgabe. Die Verbindung wurde nach der Säulenchromatographie im Lyophilisierer getrocknet, mit Kaliumbromid gemischt und ein Preßling wurde hergestellt, nachfolgend für die FT-IR-Analyse verwendet. Im IR wurden die Signale von Sulfaten gefunden, welche in dem Bereich von 1210-1150 und 1060–1030 und 650 vorkommen, dies läßt darauf schließen, daß Schwefel in der Verbindung in dem O-SO2-Typ von Verknüpfung vorhanden ist. Die starke Absorptionsbande für Silicat wurde zwischen 1090–1020 (bei 1068) gefunden. Diese läßt darauf schließen, daß Silicium in der Verbindung als -Si-O-Si-vorhanden ist. Das CH3-Strecksignal wurde zwischen 2950–2850 gefunden. Aber da es dort keine Amidsignale gab, ist es eindeutig kein Protein. Das Hydroxystrecksignal ist ebenfalls stark, aber breit, kann auf die phenolische Gruppe schließen lassen.

BEISPIEL 17: Fluoreszenzeigenschaft der reinen Verbindung durch Fluoreszenzspektrophotometrie:

Die Verbindung (lyophilisiert nach Gelfiltration) wurde in Wasser (Konzentration 0,001 g/ml) gelöst und der Fluoreszenzspektrophotometrie unterworfen.

Sie wurde zuerst einem Anregungsscannen unterworfen und es wurde gesehen, daß die Verbindung bei diesen Wellenlängen in maximaler Quantität bei 361 nm und bei 523 nm angeregt wurde.

Wenn die Verbindung, welche ein Fluoreszenzfarbstoff ist, bei 270 angeregt wurde, wurde der Peak der Fluoreszenz bei 550 gesehen.

Wenn die Anregung bei 340 nm ausgeführt wurde, war der Fluoreszenz-Peak bei 460.

Wenn die Anregung bei 361 nm ausgeführt wurde, war der Fluoreszenz-Peak bei 490.

Wenn die Anregung bei 400 nm ausgeführt wurde, war der Fluoreszenz-Peak bei 470.

Wenn die Anregung bei 523 nm ausgeführt wurde, war die Emission bei 600 nm maximal.

BEISPIEL 18: Epifluoreszenzmikroskopie des reinen Farbstoffs:

Die epifluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen des Farbstoffs in den Verdünnungen von 5 × 10–8 und die Aufzeichnung der Emissionen von Licht, wenn angeregt durch unterschiedlichen Fluoreszenzfilterwürfel für das Mikroskop BX 60-Olympus, und die Farbtöne wurden mit den bekannten Fluorochromen verglichen. Der reine verdünnte Farbstoff wurde auf den Objektträger gegeben und mit einem Deckgläschen bedeckt. Die Überprüfung wurde unter Verwendung der Anregungen der Spektren von UV-Licht und sichtbarem Licht durch WU-, WB- und WG-Würfel des reflektierten Lichts von Olympus der folgenden Wellenlängenbereiche ausgeführt.

Wellenlängenbereich des WU-Würfels war 330 nm–385 nm.

Wellenlängenbereich des WB-Würfels war 450 nm–480 nm.

Wellenlängenbereich des WG-Würfels war 510 nm–550 nm.

Die Emissionsbereiche bei unterschiedlichen Anregungsbereichen wurden ermittelt. Es wurde gesehen, daß Anregung mit dem WU-Bereich von 330 nm–385 nm Fluoreszenz in dem Bereich von 460 nm–490 nm emittierte. Anregung mit dem WB-Filter mit dem Spektralbereich von 450 nm–480 nm emittierte Fluoreszenz in dem Bereich von 510 nm–550 nm. Die Anregung mit dem WG-Filter mit dem Spektralbereich von 510 nm–550 nm emittierte Fluoreszenz in dem Bereich von 610 nm–700 nm. Die Ergebnisse folgten dem „Stokes-Gesetz".

BEISPIEL 19: Epifluoreszenzmikroskopie von Zellen:

Eine Eizellensuspension in Seewasser eines im Laboratorium aufgezogenen marinen Lebewesens wurde auf einen Objektträger gegeben und zu dieser wurde 1 &mgr;l des 5 × 10–8-Farbstoffs hinzugegeben und ein Deckgläschen plaziert. Das Prüfen der Objektträger wurde unter dem Epifluoreszenzmikroskop ausgeführt und die Emissionen von Licht, wenn durch unterschiedlichen Fluoreszenzfilterwürfel für das Mikroskop BX 60-Olympus angeregt, aufgezeichnet und die Farbtöne mit den bekannten Fluorochromen verglichen. Das Prüfen wurde unter Durchlicht und den Fluoreszenzfilterwürfeln der Spektren von UV und sichtbarem Licht, von der Olympus Company als WU-, WB- und WG-Würfel bezeichnet, ausgeführt. Die Wellenlängen der Emission, basierend auf den durch die Zellen emittierten Farben, wurden festgestellt.

Die Emissionsbereiche bei unterschiedlichen Anregungsbereichen wurden ermittelt. Es wurde gesehen, daß bei Anregung mit dem WU-Bereich von 330 nm–385 nm die Zellen Fluoreszenz in den Bereichen von 460 nm–490 nm emittierten.

Bei Anregung mit dem WB-Filter mit dem Bereich von 450–480 nm war die Emission in dem Spektralbereich im Bereich von 570–610 nm.

Bei der Anregung mit den WG-Filter mit dem Spektralbereich von 510 nm–550 nm war die Fluoreszenzemission in dem Bereich von 610 nm–700 nm.

Die epifluoreszenzmikroskopische Prüfung der zytogenetischen Objektträger unter dem Hellfeld durch Verwendung von Durchlicht emittierte Licht im vollen weißen Bereich der sichtbaren Spektren und ergab abhängig von der Dichte der Zellbestandteile mit Farbtönen von bläulichen Grautönen eine phasenkontrastähnliche Wirkung.

BEISPIEL 20: Fluoreszenzfarbemissionen des Farbstoffs unter unterschiedlichen Anregungsbereichen:

Die Farbtöne der emittierten Farben wurden notiert. Die Spektralbereiche der Anregung und die emittierten Fluoreszenzfarben sind in Tabelle 5 dargestellt. Es gibt eine Verschiebung der emittierten Wellenlängen, beobachtet zwischen dem gereinigten Extrakt des Tieres und der gereinigten Verbindung, welche ein Farbstoff ist, und den mit dem Farbstoff angefärbten Zellen. Wenn der Farbstoff mit der Zellsuspension angeregt wird, kann dies auf die Bindung des Farbstoffs an die Zellbestandteile zurückzuführen sein. Es zeigte klar dessen Verwendbarkeit als Fluoreszenzsonde.

BEISPIEL 21 Mikrophotographie der Objektträger mit dem als Färbemittel der Epifluoreszenzmikroskopie verwendeten Farbstoff

Die Mikrophotographie der emittierten Fluoreszenz in den Gebieten der Objektträger ohne Zellen und mit Prüfkörperzellen unter dem WU-Bereich von 330 nm–385 nm, dem WB-Bereich von 450 nm–480 nm, dem WG-Bereich von 510 nm–550 nm und dem Hellfeld wurde mit Kodak-Farbfilm mit 400 ASA Empfindlichkeit mit einer Belichtung, variierend von 50 bis 60 Sekunden, ausgeführt. Die vollständige oder ein Anteil derselben wird in Schwarzweißzeichnungen umgewandelt.

BEISPIEL 22 sPestizide Wirkung

Die Verbindung war toxisch für Insekten. Sie zeigte Toxizität für die Insekten wie Ameisen. Das in dem Farbstoff getränkte Filterpapier wurde unbeaufsichtigt auf dem Arbeitstisch gelassen. Am nächsten Tag wurde bemerkt, daß es voll von toten Ameisen war.

BEISPIEL 23 Zytogenetische Anfärbung mit dem Farbstoff

Das fixierte Gewebe mit Eisessig und Methanol aus unterschiedlichen Quellen wurde auf den Objektträger gegeben, und die Farbstofflösung wurde ohne Vorbehandlung dazu gegeben. Es wurde beobachtet, daß unterschiedliche Teile der Zelle die Farbstofflösung unterschiedlich annahmen. Zytoplasma, Nucleus und Chromosomen zeigten unterschiedliche Färbung. Da der marine Farbstoff die Proteine des Chromosoms färbt, hat er zusätzlichen Wert beim Untersuchen des Karyotyps der Zellen.

BEISPIEL 24 Stabilität der Verbindung samt Farbstoff bei den Temperaturen unter Null

Die Verbindung wurde in ihrer verdünnten 5 × 10–6-Form in einem Mikrofugenröhrchen genommen und bei –20 Grad Celsius gehalten und im gefrorenen Zustand unter UV-Licht gesehen. Die Fluoreszenz bestand ohne irgendeine Verschlechterung fort. In noch einem anderen Experiment wurde der Farbstoff in dem flüssigen Stickstoff gefroren und die Fluoreszenz blieb unbeeinflußt.

BEISPIEL 25 Veterinäres Heilmittel

Der Extrakt wurde als veterinäres Heilmittel zum Töten von Zecken/Flöhen von Hunden verwendet. Die 5 × 10–8-Konzentration der gereinigten Verbindung samt Farbstoff tötete Zecken und Flöhe in weniger als 20 Sekunden.

BEISPIEL 26 Antimikrobieller Test

Da der marine Farbstoff eine phenolische Verbindung ist und phenolische Verbindungen im allgemeinen antimikrobielle Aktivität haben, wurde der antimikrobielle Assay mit dieser Verbindung durchgeführt und die Zone der Hemmung wurde beobachtet. Eine Kultur von E. coli (Wildtyp) wurde über Nacht in 50 ml von MacConkey's Nährbrühe in einem konischen Kolben (100 ml) gezüchtet. Agarmedium für antibiotischen Assay wurde hergestellt und sterilisiert. Es wurde dann auf eine Temperatur von 50 Grad Celsius gebracht und 1 ml der Kultur von E. coli (Wildtyp) wurde dazu gegeben. Die Kultur wurde mit Agarmedium für antibiotischen Assay gemischt und wurde sich verfestigen gelassen. 10 mg/ml der Probe wurden hergestellt und in Filterpapierscheiben eingesickert. Es wurde dann auf dem Agarmedium für den antibiotischen Assay, beimpft mit E. coli, plaziert. Es wurde dann bei 37°C in einem Inkubator für 24 Stunden inkubiert. Die die Filterscheibe umgebende Zone der Hemmung wurde beobachtet. Diese bewies, daß der Farbstoff antimikrobielle Aktivität gegen Gram-negative Organismen wie E. coli hatte.

VORTEILE GEGENÜBER EXISTIERENDEN FLUOROPHOREN/FLUOROCHROMEN/FLUORESZENZFARBSTOFFEN AUF DEM MARKT.
  • 1. Die Verbindung ist ein Farbstoff, nicht radioaktiv und sie ist ein Fluoreszenzfarbstoff aus einem natürlichen Ausgangsstoff und nicht synthetisch.
  • 2. Die Verbindung ist die erste offenbarte natürliche Organosiliciumverbindung mit Siliciummatrix, wo Kieselsäure der integrale Teil der Verbindung geworden ist. Dies stellt ein natürliches in-vivo-System zum Untersuchen assoziierter physiologischer Aspekte von Organosiliciumverbindungen bereit, welche in der kosmetischen Chirurgie in weitem Umfang verwendet werden.
  • 3. Die meisten der gegenwärtig vermarkteten Fluoreszenzfarbstoffe haben niedriges Molekulargewicht. Molecular probes INC. (S. 109) berichteten über Einschränkungen von Fluoreszenzfarbstoffen mit niedrigem Molekulargewicht.
  • 4. Der Fluoreszenzfarbstoff hat den Vorteil gegenüber allen diesen Farbstoffen, weil er in seiner natürlichen Form ein hohes Molekulargewicht hat.
  • 5. Die Fluorophorteil der Verbindung hat ein niedriges Molekulargewicht. Somit hat der Farbstoff das Potential von Fluoreszenzfarbstoffen sowohl mit hohem als auch mit niedrigem Molekulargewicht.
  • 6. Die Verbindung ist negativ geladen, daher für molekulare Markierung von positiv geladenen Biopolymeren verwendbar.
  • 7. Der Fluorophorteil hat neutrale Ladung, hat daher die Potentiale zum Konjugieren mit jedem Typ von Molekülen.
  • 8. Die Verbindung ist für Zellbestandteile durchdringbar.
  • 9. HPLC der Verbindung zur Identifizierung der konjugierten Gruppen ist möglich.
  • 10. Die Emissionsspektren passen zu den in der Fluoreszenzmikroskopie verwendeten gebräuchlichen optischen Filtern, es sind keine speziellen Filter erforderlich.
  • 11. Unähnlich BODIPY-Farbstoffen hat der Farbstoff einen Spektralbereich mit zwei Emissionen, passend zu dem Spektrum von Argonlaserstrahlen.
  • 12. Der Farbstoff hat eine längere Wellenlänge, schmale Bandbreite und kleine Stokes-Verschiebung.
  • 13. Spektren des Farbstoffs sind unempfindlich gegen Lösungsmittelpolarität und pH.
  • 14. Die größere Lichtbeständigkeit des Farbstoffs.
  • 15. Der Farbstoff hat eine längere Wellenlänge und hat mehr als einen Emissionsbereich im sichtbaren Spektrum.
  • 16. Die Synthesen von Farbstoffen benötigen Zusätze von Spacern, während der vorliegende Farbstoff inhärenten Spacer in seiner Struktur hat.
  • 17. Der Farbstoff ist wassermischbar und kann ein leicht gemischter Bestandteil für kosmetische und Arzneimittelzusammensetzungen sein.
  • 18. Diese Fluoreszenzverbindung samt Farbstoff in ihrer vorliegenden einfachen Form deckt die Spektralbereiche der Anregung und Emission von 123 Fluorophoren/Fluorochromen, die gegenwärtig von Bitplane auf dem Markt verkauft werden (wie pro Liste http://www.bitplane.ch/public/support/standard/Fluorochrome.htm) und etwa 96 Fluorophoren von Molecular Probes, INC. (Seiten 61214 im Handbook of Fluorescent probes and Research chemicals (Handbuch von Fluoreszenzsonden und Forschungschemikalien) von Richard P. Haughland) ab.
  • 19. Wenn auch der Farbstoff alle die guten Eigenschaften von BODIPY FL und auf Fluorescein basierenden Farbstoffen hat, hat er nicht ihre Mängel, wie sie in dem Handbook of Fluorescent Probes und research chemicals (Handbuch von Fluoreszenzsonden und Forschungschemikalien) von Molecular probes INC (Seiten 14, 15, 109) angegeben sind.
  • 20. Der Farbstoff hat hohes Absorptionsvermögen wie Fluorescein und auf Fluorescein basierende Farbstoffe, welches die vorwiegenden grünen Fluorophore auf dem Markt sind.
  • 21. Die Wasserlöslichkeit des vorliegenden Farbstoffs ist größer als die Löslichkeitsmerkmale von Fluorescein.
  • 22. Der Farbstoff hat acht Anregungs-(ex)/acht Emissions-(em)nm-Bereiche, die Spektren rechts von Röntgenstrahlen und 270–745 nm vom UV- und sichtbaren Bereich mit hohen und scharfen Peaks abdecken, wohingegen Fluorescein nur einen Anregungs- und Emissionsbereich ~494 ex/em 520 nm hat und der Peak breit ist.
  • 23. Die Anregungs- und Emissionsspektren des Farbstoffs in dem Fluoreszenzfilterwürfel in dem Bereich von ~450–480 nm passen zu der Spektrallinie des Argonionenlasers (~488 nm) wie das Fluorescein und in beiden Fällen ist die Farbemission von grüner Fluoreszenz, was den vorliegenden Farbstoff zu einem engen Konkurenten für das Fluorescein macht, welches das gegenwärtig vorwiegende grüne Fluorophor für konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie- und Fließzytometrie-Anwendungen ist.
  • 24. Die Anregungs- und Emissionsspektren des Farbstoffs in dem Fluoreszenzfilterwürfel in dem Bereich von ~450–480 nm passen zu der Spektrallinie des Argonionenlasers (~488 nm) wie das Fluorescein, aber die Zellkonjugate emittieren Fluoreszenz mit hellgelber Farbe, was den Farbstoff in Multicoloranwendungen verwendbar macht.
  • 25. Der Farbstoff zeigt kein Bleichen durch Licht, wobei er so einen Vorteil gegenüber der Randzone von Fluorescein hat.
  • 26. Die vorliegende Farbstoff ist unähnlich den gegenwärtig vermarktbaren Fluoreszenzfarbstoffen pH-unempfindlich. Dies ergibt seine Vorteile beim Herstellen von Zusammensetzungen für verschiedenartige Anwendungen von Fluoreszenz.
  • 27. Der Farbstoff ist resistent gegenüber dem Löschen. Die Fluoreszenzintensität vergrößert sich nach Konjugation mit Proteinen ungeachtet der Verdünnung und Konzentration des Farbstoffs.
  • 28. Das Fluoreszenzemissionsspektrum ist nicht breit, es hat eine schmale spektrale Bandbreite, aber ein Emissionsspektrum mit breitem Bereich. Der Peak ist scharf, was in Multicoloranwendungen einen Vorteil gegenüber anderen Farbstoffen hat.
  • 29. Der Farbstoff kann zum Markieren von Molekularsonden für Anwendungen in fluoreszenter in-situ-Hybridisierung (F.I.S.H.) verwendet werden.
  • 30. Die Farbstoffe mit hohem und niedrigem Molekulargewicht sind für verschiedenartige Anwendungen ratsam. Jedoch sind die meisten der gegenwärtig verfügbaren Farbstoffe Farbstoffe mit niedrigem Molekulargewicht. Unser Farbstoff ist ein Farbstoff mit hohem Molekulargewicht. Er weist außerdem einen Teil der Verbindung auf, welcher das Fluorophor ist und verwendbar ist, wenn Ersetzung durch einen Farbstoff mit niedrigem Molekulargewicht erforderlich ist.
  • 31. Der Farbstoff kann als schnelles mikroskopisches Färbemittel verwendet werden, wobei sich ohne irgendwelche extra Ausgaben für ein Phasenkontrastzubehörteil eines Mikroskops und ohne irgendwelche langandauernden Protokolle von Fixierungen und Konservierungen von Prüfkörpern insbesondere bei der Tüpfelqualitätsprüfung von lebenden Proben eine Phasenkontrastwirkung ergibt.
  • 32. Da er für längere Zeitdauer bei Raumtemperatur nicht zersetzlich ist, erfordert er während des Exportierens keine Kühlung. Die gegenwärtig vermarkteten Fluoreszenzfarbstoffe werden unter Kühlung äquivalent –20 Grad Celsius exportiert.
  • 33. Da er für längere Zeitdauer von dem natürlichen Licht nicht zersetzlich ist, erfordert er keine Dunkelheit zum Aufbewahren.
  • 34. Unähnlich grün fluoreszentem Protein (GFP) von einer marinen Qualle ist die vorliegende Verbindung samt Farbstoff kein Reportergen. Ihre Fluoreszenzemissionsergebnisse sind direkt. Der Farbstoff emittiert in seiner reinen und konjugierten Form mit den Zellen Farbtöne von 8 Fluoreszenzfarben bei acht unterschiedlichen Wellenlängen der Fluoreszenzanregung von Röntgenstrahlen, Spektren von UV und sichtbarem Licht.
  • 35. Der Farbstoff, der in hohem Maße wasserlöslich ist, kann leicht in Zusammensetzungen gemischt werden, wo wasserlösliche Fluoreszenzfarbstoffe benötigt werden. Der Farbstoff ist in den organischen Lösungsmitteln wie Ethanol, Methanol und Aceton unlöslich.
  • 36. Der Farbstoff ist negativ geladen und kann mit allen Zellbestandteilen mit positiver Ladung konjugieren.
  • 37. Der Farbstoff hat einen pH von 2,8 und seine spektralen Emissionen werden bei unterschiedlichem pH-Bereich, d.h. von pH 2,8–8,0, nicht beeinflußt.
  • 38. Der Farbstoff ist in der Beschaffenheit nicht proteinartig und er ist unter natürlichen Bedingungen nicht abbaubar.
  • 39. Der Farbstoff hat die Natur eines Biosurfactanten, was ihn in Seifen und Toilettenartikelzusammensetzungen verwendbar macht.
  • 40. Der Farbstoff hat antimikrobielle Eigenschaften.
  • 41. Der Farbstoff emittierte diese Fluoreszenzfarben sogar in einem Verdünnungsbereich von dem 1:2000000-fachen. Die Fluoreszenz des Extrakts bestand sogar nach mindestens 1 Jahr bei Raumtemperatur fort.
  • 42. Mehrfarbige Emissionen des Farbstoffs bei unterschiedlichen Wellenlängen der Anregungen sind den mikroskopischen Fluorochromfärbungen vergleichbar, die bereits auf dem Markt sind.
  • 43. Die blau gefärbte Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffs ist bei Anregung mit der gleichen Wellenlänge vergleichbar mit der Emission der gleichen Farbe durch das DAPI-Fluorochrom, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  • 44. Die blau gefärbte Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffs ist ebenfalls vergleichbar mit der Emission von Farbe durch Hoechest 33258, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  • 45. Die blau gefärbte Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffs ist bei Anregung mit der gleichen Wellenlänge ebenfalls vergleichbar mit der Emission von Farbe durch das Hoechest-33342-Fluorochrom, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  • 46. Die orange gefärbte Fluoreszenz des Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist vergleichbar mit den gleichfarbigen Emissionen von Acridinorange, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  • 47. Die gelb gefärbte Fluoreszenz des Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist vergleichbar mit den gleichen farbigen Emissionen von Auramin, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  • 48. Die gelbe gefärbte Fluoreszenz des Farbstoffs im sichtbaren Bereich ist vergleichbar mit den gleichen farbigen Emissionen von FITC, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  • 49. Die orange gefärbte Fluoreszenzemission ist vergleichbar mit der orangen Fluoreszenzfarbe des Propidiumiodid-Fluorochroms, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  • 50. Die orange gefärbte Fluoreszenzemission ist vergleichbar mit der orangen Fluoreszenzfarbe des Rhodamin-Fluorochroms, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  • 51. Die orange gefärbte Fluoreszenzemission ist vergleichbar mit der orangen Fluoreszenzfarbe des TRITC-Fluorochroms, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  • 52. Die blau gefärbte Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffs ist ebenfalls vergleichbar mit der Emission von Farbe von Hoechest 33258, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  • 53. Die blau gefärbte Fluoreszenz des vorliegenden Farbstoffs ist bei Anregung mit der gleichen Wellenlänge ebenfalls vergleichbar mit der Emission von Farbe durch das Fluorochrom Hoechest 33342, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  • 54. Unähnlich den synthetischen kommerziellen Farbstoffen, verwendet für die gleichen Zwecke, ist der vorliegende Farbstoff bei Raumtemperatur stabil und hat eine lange Lagerbeständigkeit. Molekulare nicht radioaktive Kits des Farbstoffs können bei den Raumtemperaturen exportiert werden.
  • 55. Der einfache Farbstoff hat charakteristische Eigenschaften von fast einhundertunddreiundzwanzig unterschiedlichen Fluorochromen (DAPI Hoechst 33258, Hoechst 33342, FITC, Acridinorange, Auramin, Rhodamin, TRITC und Propidiumiodid usw.), die jetzt auf dem Markt sind.
  • 56. Die vorliegende multiple Fluoreszenzfarbstoff kann in allen Anwendungen verwendet werden, wo gegenwärtig Phycobiliproteine verwendet werden, da ihnen unähnlich der Farbstoff beim Einfrieren keinen Verlust an Fluoreszenz erleidet.
  • 57. Die Verbindung ebenso wie der multiple Fluoreszenzfarbstoff ergeben acht Farben der Fluoreszenz, wenn in acht Wellenlängenbereichen von Röntgenstrahlen, UV-Strahlen und sichtbaren Spektralbereichen sogar in den Verdünnungen von dem 1:2000000-fachen in ultrareinem Wasser (Konzentration 5 × 10–6) angeregt wird.
  • 58. Die Verbindung und der multiple Fluoreszenzfarbstoff ergeben acht Farben der Fluoreszenz, wenn in acht Wellenlängenbereichen von Röntgenstrahlen, UV-Strahlen und sichtbaren Spektralbereichen sogar in den Verdünnungen von dem 1:200000000-fachen in ultrareinem Wasser (Konzentration 5 × 10–8) angeregt wird, unter gewöhnlichem Licht des Mikroskops erzeugen die Farbtöne von grau eine Phasenkontrastwirkung, welche beim schnellem Prüfen von zytogenetischen, zytologischen und histochemischen Objektträgern verwendbar ist und Ausgaben für die extra Phasenkontrastzubehörkomponente des Mikroskops spart. Die Fluoreszenzfarbemissionen folgen dem Stokes-Gesetz der Fluoreszenz.
  • 59. Die Verbindung und unser multipler Fluoreszenzfarbstoff haben die Potentiale von Fluoreszenzfarbstoffen mit sowohl hohem als auch niedrigem Molekulargewicht.
  • 60. Mikrophotographie der Fluoreszenz kann mit Kodak-400-Film ausgeführt werden, der gegenwärtig auf dem Markt leicht verfügbar ist, und es ist keine Abhängigkeit von irgendwelchen neuen Filmen erforderlich.
  • 61. Die zytogenetischen Objektträger, gesehen unter aller Fluoreszenz, ergeben eine Kontrastfärbungswirkung der Zellen mit dem Hintergrund, wo kein Prüfkörper, sondern nur Farbstoff vorhanden ist.
  • 62. Der Farbstoff kann für die Herstellung von Polyvinylchloridfolie verwendet werden, die Fluoreszenzfarben zeigt. Er kann ebenfalls in Fluoreszenzfarben in einer Vielfalt von Anstrichfarben, Tinten und Textilien verwendet werden.
  • 63. Der Farbstoff kann in Zusammensetzungen mit Fluoreszenzfarbstoff zum Bleichen und Aufhellen von Polymer verwendet werden. Der Farbstoff kann im Lecknachweis mit einem Fluoreszenzfarbstoff mit vollem Spektrum verwendet werden. Er kann ebenfalls in einem automatisierten chemischen Dosiersystem verwendet werden. Er kann ebenfalls zur Markierung des Standorts eines zertrümmerten Flugzeugs, von Rettungsbooten und Ausrüstung, zum Beispiel Raketen, verwendet werden. Weiterhin kann er in Unterwassersonden verwendet werden. Der Farbstoff kann in der Photochemotherapie von Hautkrebs verwendet werden.
  • 64. Der Farbstoff kann als Chromatophor-Sonnenschutzkomponente von kosmetischen Cremes und Lotionen verwendet werden.
  • 65. Die wassermischbare Eigenschaft des Farbstoffs kann ihn leicht mischbar in Feuchthaltemitteln machen. Er kann als fluoreszente Komponente eines Kits zur Anwendung von in-situ-Hybridisierung für molekulare Diagnostik verwendet werden. Er kann ebenfalls als Komponente der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie zur Markierung von DNA, RNA, Proteinen und Enzymen, Immunofluoreszenznachweise, Kontrastfärbung von DIG-markierten Oligonucleotidsonden und Anti-DIG-Fab-Fragmenten, quantitative Fluoreszenz von einfachen und multiplen Zellen in der Fließzytometrie, Fluorochromfärbemittel für Epifluoreszenzmikroskopie verwendet werden.
  • 66. Der Farbstoff kann für eine schnelle Überprüfung der Biokontamination in der Reformkostindustrie, kosmetischen Industrie, pharmazeutischen und chemischen Industrie, für schnelle Abschätzungen von Biokontaminanten in Laboratoriumskulturen, für eine schnelle Überprüfung von biologischen Schmutzstoffen unter Feldbedingungen verwendet werden. Er kann auch ein kompetitiver Inhibitor von Cholinesterasen sein.
  • 67. Der Farbstoff kann in antimikrobiellen Zusammensetzungen verwendet werden. Der Farbstoff kann als Biosurfactant in Toilettenartikelzusammensetzungen verwendet werden.
  • 68. Der Farbstoff kann als natürliches Färbemittel einer bioaktiven Zusammensetzung des marinen Farbstoffs in dem Verhältnis von 1:2000000 in ultrareinem Wasser verwendet werden, um Fluoreszenz mit acht Farben bei acht unterschiedlichen Wellenlängen und eine Phasenkontrastwirkung unter Durchlicht zu erhalten.
  • 69. Eine bioaktive Zusammensetzung des Farbstoffs in dem Verhältnis von 1:200000000-fachen Verdünnungen mit Wasser als Bindemittel ergibt Fluoreszenz mit acht Farben bei acht unterschiedlichen Wellenlängen.
TABELLE 1 Ergebnisse der Elementaranalyse der Verbindung:
TABELLE 2 Spektrophotometrische Werte nach Kationenaustauschchromatographie, erhalten durch Scannen durch UV/Sichtbar-Spektrophotometer, die die Werte der Extinktionsmaxima und entsprechenden optische Dichte und die Verhältnisse zwischen den optischen Dichten zeigen:
TABELLE 3 Fluoreszenzspektrophotometrie der gereinigten Verbindung, die Anregungs-Emissions-Wellenlängen und entsprechende Farben des Spektrum zeigt.
TABELLE 4 Die Emissionen der unterschiedlichen farbigen Fluoreszenz der gereinigten Verbindung samt Fluoreszenzfarbstoff wenn mit Fluoreszenzfilterwürfeln unterschiedlicher Wellenlänge des Olympus-Epifluoreszenzmikroskops angeregt, mit und ohne die Konjugate.

Anspruch[de]
  1. Neue multiple Fluoreszenzfarbstoffverbindung mit der empirischen Formel C22H48O66N2S10Si7 und mit einem Molekulargewicht von 1915; wobei die Strukturformeln wie durch die 18 oder 19 der begleitenden Zeichnungen dargestellt sind.
  2. Neue Verbindung nach Anspruch 1, umfassend ein Fluorophor mit der Molekülformel C10H16N2O mit der wie in 20 angezeigten Struktur.
  3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Nomenklatur des Fluorophors 1-Hydroxy-2,5-di-methylaminobenzol (HDAB) ist, welches ein Molekulargewicht von 180 hat.
  4. Neue Verbindung nach Anspruch 1 mit den folgenden charakteristischen Eigenschaften:

    i. die organische Zusammensetzung der reinen Verbindung durch Elementaranalyse gibt Kohlenstoff 8,3572, Wasserstoff 1,739%, Stickstoff 0,9449% und Schwefel 9,457% an;

    ii. das Atomverhältnis für die Elemente in der Verbindung war in dem Verhältnis von Kohlenstoff Wasserstoff Stickstoff: Schwefel = 22: 48: 2: 10, angegeben durch die Mikroanalyse;

    iii. die anorganische Zusammensetzung der Verbindung, indem sie der Atomabsorptionsspektrophotometrie unterworfen wird, um Kieselsäure und den Prozentsatz des Siliciumdioxids abzuschätzen, 12,58%;

    iv. Kieselsäure ist ein integraler Teil der Verbindung;

    v. der Atomanteil von Silicium beträgt 7 für jeweils 22 Kohlenstoffatome;

    vi. Reinigung der Verbindung weiterhin durch Ionenaustauschchromatographie und es wird gefunden, daß das Peak-zu-Peak-Verhältnis der Extinktion bei 291 und 451 stabil ist;

    vii. die Verbindung umfaßt Zuckereinheiten;

    viii. HPLC der reinen ionischen Form der Verbindung durch einen Umkehrphasen-C18-Typ von analytischer Säule und einen Gradienten von 0 bis 50% Acetonitril, um den reinen Farbstoff aus der Säule zu eluieren, ergab den Wert der Retentionszeit von 1,909 und einen sehr scharfen Peak;

    ix. die FT-IR-Signale von Sulfaten, vorkommend in dem Bereich von 1210–1150 und 1060–1030 und 650, ließen darauf schließen, daß Schwefel in der Verbindung in dem O-SO2-Typ von Verknüpfung vorhanden ist;

    x. die starke Absorptionsbande für Silicat, gefunden zwischen 1090–1020 (bei 1068), ließ darauf schließen, daß Silicium in der Verbindung als -Si-O-Si vorhanden ist; das CH3-Strecksignal wird zwischen 2950–2850 gefunden; es gibt keine Amidsignale und die Verbindung ist kein Protein;

    xi. das Hydroxystrecksignal ist stark aber breit, was auf die phenolische Gruppe schließen läßt;

    xii. die Verbindung enthält eine phenolische Gruppe in dem Fluorophorteil der Verbindung;

    xiii. die Verbindung umfaßt auch den chinoiden Ring, welcher sterisch geschützt ist;

    xiv. der Fluorophorteil ist mit der Si-O-Gruppe durch die sulfatierte Zuckereinheit verbunden;

    xv. die phenolische Gruppe der Verbindung ergibt nur Keto-Enol-Tautomerie und ruft so beide Strukturtypen von Chinon und die phenolische Struktur hervor; und

    xvi. die besagte Verbindung wird als multipler Fluoreszenzfarbstoff verwendet.
  5. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die folgenden charakteristischen Eigenschaften besitzt:

    i. wird durch ein Reduktionsmittel nicht entfärbt,

    ii. die Verbindung ist keine synthetische Verbindung,

    iii. der rohe Extrakt des Farbstoffs ist gelblichgrün in der Farbe;

    iv. der flüssige Farbstoff der gereinigten Verbindung ist bräunlich mit Farbtönen von grün, gelb und rot,

    v. die gereinigte getrocknete Verbindung ist ein rötlichbraun gefärbtes Pulver, wenn sie mit dem bloßen Auge im Tageslicht gesehen wird,

    vi. unter Röhrenlicht werden einige Farbtöne von grün emittiert,

    vii. unter Quecksilberlicht ergibt sie ein bläuliches Grün,

    viii. unter Röntgenstrahlen fluoresziert sie in grüner Farbe,

    ix die Verbindung ist in der Beschaffenheit amorph,

    x. die Verbindung ist in Wasser löslich, in den organischen Lösungsmitteln einschließlich Ethanol, Methanol und Aceton unlöslich,

    xi. die Verbindung ist negativ geladen,

    xii. die Verbindung hat einen pH von 2,8,

    xiii. die Verbindung umfaßt einen chinoiden Ring,

    xiv. die Verbindung ist in der Beschaffenheit nicht proteinartig,

    xv. die Verbindung weist einen reduzierenden Zucker auf,

    xvi. die Verbindung wirkt als Biosurfactant,

    xvii. die Verbindung hat antimikrobielle Eigenschaften und zeigt, wenn ein antimikrobieller Assay durchgeführt wird, eine Zone der Hemmung,

    xviii. die Verbindung emittiert Fluoreszenz, wenn sie mit unterschiedlichen Wellenlängen von Röntgenstrahlen, UV- und sichtbaren Spektralbereichen auf einem Spektrophotometer angeregt wird,

    xix. UV-, sichtbare Spektroskopie ist von 250 nm–700 nm und die Peaks sind für die Verbindung bei den Wellenlängen 291 nm und 451 nm markiert,

    xx. das Scannen der fluoreszenzspektroskopischen Emission wird ausgeführt, indem die Verbindung bei 270 nm angeregt wird, der Peak der Fluoreszenz kam bei 550 nm,

    xxi. wenn die Verbindung bei 340 nm angeregt wird, ist der Fluoreszenzpeak bei 460 nm,

    xxii. wenn die Anregungswellenlänge bei 361 nm fixiert ist, ist die Fluoreszenzemission in maximaler Quantität bei 490 nm,

    xxiii. wenn die Anregungswellenlänge bei 400 nm fixiert ist, ist die Fluoreszenzemission in maximaler Quantität bei 470 nm,

    xxiv. wenn die Verbindung bei 523 nm angeregt wird, ist die Emission bei 600 nm maximal,

    xxv. physikalische Überprüfung des Farbstoffs in der Konzentration von 1:2000000-facher Verdünnung, d.h. mit der Konzentration 5 × 10–6 der Verbindung, unter UV-Kolben des Bereichs von 260 nm–280 nm emittiert bläulichgrüne Farbe der Fluoreszenz,

    xxvi. epifluoreszenzmikroskopische Überprüfung des Farbstoffs in der Konzentration von mindestens 1:200000000-facher Verdünnung, d.h. mit der Konzentration 5 × 10–8 der Verbindung, emittiert unter unterschiedlichen Fluoreszenzwürfeln Fluoreszenz,

    xxvii. die Verbindung emittiert acht unterschiedliche gefärbte Fluoreszenzen bei vier unterschiedlichen Wellenlängen der UV- und sichtbaren Bereiche der Fluoreszenzwürfel eines Epifluoreszenzmikroskops,

    xxviii. Fluoreszenzblau mit Farbtönen von Indigo-Farbemission erfolgt in dem Bereich von 380 nm–400 nm von UVA, wenn die reine Verbindung unter dem Anregungsbereich des ultravioletten Würfels WU von 330 nm–385 nm angeregt wird,

    xxix. Fluoreszenzgrün-Farbemission erfolgt in dem Bereich von 500 nm–570 nm, wenn die reine Verbindung unter dem Anregungsbereich des WB-Würfels von 450 nm–480 nm angeregt wird,

    xxx. die Emission von Fluoreszenzrot mit orange Farbtönen erfolgt in dem Bereich von 570 nm–650 nm, wenn die reine Verbindung unter dem Anregungsbereich des WG-Würfels von 510 nm–550 nm angeregt wird,

    xxxi. die Verbindung emittiert Farbtöne von bläulichen Grautönen unter dem gewöhnlichen Durchlichtkolben des Epifluoreszenzmikroskops, wenn sie unter 10×-, 40×-, 100×-Objektiven gesehen wird,

    xxxii. Epifluoreszenzmikroskopische Untersuchung von Eizellen von marinen Lebewesen, konjugiert mit der Fluoreszenzverbindung in Konzentrationen von mindestens 1:200000000-facher Verdünnung, d.h. mit der Konzentration 5 × 10–8 der Verbindung, emittiert unter den unterschiedlichen Fluoreszenzwürfeln Fluoreszenz in Farben, die unterschiedlich zu denen der reinen Verbindung sind,

    xxxiii. die Zellen, markiert mit der Verbindung, emittieren vier unterschiedlich gefärbte Fluoreszenzen bei vier unterschiedlichen Wellenlängen der UV- und sichtbaren Bereiche der Fluoreszenzwürfel und des Durchlichtkolbens des Epifluoreszenzmikroskops,

    xxxiv. die mit der Verbindung markierten Zellen emittieren Fluoreszenz blauer Farbe, wenn sie in dem Bereich von 330 nm–385 nm durch den WU-Fluoreszenzwürfel des Epifluoreszenzmikroskops angeregt werden,

    xxxv. die mit der Verbindung markierten Zellen emittieren hellgelbe Fluoreszenz, wenn sie unter dem WB-Würfel des Anregungsbereichs von 450 nm–480 nm angeregt werden,

    xxxvi. die Zellen emittieren Fluoreszenz roter Farbe, wenn sie unter dem WG-Würfel mit dem Anregungsbereich von 510 nm–550 nm angeregt werden,

    xxxvii. die Fluoreszenzfarben der Verbindung bleiben bei Raumtemperatur sogar nach einem Jahr bestehen,

    xxxviii. die Fluoreszenz der Verbindung ist in hohem Maße liehtbeständig und verschlechtert sich bei langen Einwirkungen von direktem Licht nicht,

    xxxix. die Verbindung wird nicht durch Licht gebleicht,

    xl. die Verbindung wird nicht gelöscht, während der Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop geprüft wird; und

    xli. die Fluoreszenz der Verbindung ändert sich nicht, wenn sie bei Temperaturen unter Null gefroren wird, sogar nachdem sie in flüssigem Stickstoff gefroren worden ist, eine Temperatur, bei welcher die Moleküle nicht imstande sind, die Energie zu erreichen, die für die Aktivierung, wie in Extrakten aus lumineszenten Organismen, notwendig ist.
  6. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung nicht radioaktiv ist.
  7. Verbindung nach Anspruch 1, wobei sie die erste natürliche organometallische Verbindung mit Siliciummatrix ist.
  8. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Anwesenheit von Kieselsäure in der Verbindung zum ersten Mal als integraler Teil eines lebenden Organismus identifiziert wird.
  9. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung Phenolisches Sulfatiertes Silicatiertes Polysaccharid (PSSP) ist.
  10. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung ein natürliches in-vivo-System zum Untersuchen assoziierter physiologischer Aspekte der Organosiliciumverbindung in kosmetischer Chirurgie bereitstellt.
  11. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung eine längere Wellenlänge, schmale Bandbreite und kleine Stokes-Verschiebung umfaßt, wie in Tabelle 3 und Tabelle 4 bereitgestellt wird.
  12. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Emissionsspektren der Verbindung unempfindlich gegen Lösungsmittelpolarität und pH sind.
  13. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung größere Lichtbeständigkeit hat.
  14. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung eine längere Wellenlänge hat und mehr als einen Emissionsbereich im sichtbaren Spektrum hat.
  15. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Spacer einen integralen Teil der natürlichen Verbindung bilden.
  16. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung hohe Mischbarkeit mit Wasser hat, was leichtes Mischen geeigneter Zusatzstoffe, wie erforderlich für kosmetische und Arzneimittelzusammensetzungen, erleichtert.
  17. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung acht Anregungs-(ex)/acht Emissions-(em)nm-Bereiche umfaßt, die die Spektren rechts von Röntgenstrahlen und 270–745 nm vom UV- und sichtbaren Bereich mit hohen und scharfen Peaks abdecken.
  18. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die multiple Fluoreszenzverbindung Anregungs- und Emissionsspektren des Farbstoffs in dem Fluoreszenzfilterwürfel in dem Bereich von ~450–480 nm hat, was zu der Spektrallinie des Argonionenlasers (~488 nm) paßt.
  19. Verbindung nach Anspruch 1, wobei der multiple Fluoreszenzfarbstoff mit Anregungs- und Emissionsspektren des Farbstoffs in dem Fluoreszenzfilterwürfel in dem Bereich von ~450–480 nm zu der Spektrallinie des Argonionenlasers (~488 nm) paßt, wie das Fluorescein, aber die Zellkonjugate Fluoreszenz mit hellgelber Farbe emittieren, was den Farbstoff in Multicoloranwendungen verwendbar macht.
  20. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung resistent gegenüber dem Löschen ist und die Fluoreszenzintensität sich nach Konjugation mit Proteinen ungeachtet von Verdünnung und Konzentration des Farbstoffs vergrößert.
  21. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung bei Raumtemperatur stabil ist und eine lange Lagerbeständigkeit hat.
  22. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die molekularen und radioaktiven Kits der Verbindung bei Raumtemperatur exportiert werden könnten.
  23. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Mikrophotographie von Fluoreszenzemissionen der Verbindung unter dem Fluoreszenzmikroskop durch Verwendung von Kodak-400-Film ohne eine andere spezielle Filmanforderung mit einer Belichtungszeit im Bereich zwischen 450 Sekunden ausgeführt wird.
  24. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung auf den zytogenetischen Objektträgern, wo kein Prüfkörper vorhanden ist, Kontrastfärbungswirkung von Zellen und Zellkomponenten unter aller Fluoreszenz erzeugt.
  25. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung acht Farben von Fluoreszenz emittiert, wenn sie bei acht Wellenlängenbereichen von Röntgenstrahlen, UV-Strahlen und sichtbaren Spektralbereichen sogar in den Verdünnungen von dem 1:2000000-fachen in ultrareinem Wasser in der Konzentration 5 × 10–8 bis 10–6 angeregt wird.
  26. Zusammensetzung, umfassend eine wirksame Menge der bioaktiven multiplen Fluoreszenzfarbstoffverbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung aus der marinen Seegurke Holothuria scabra erhalten wird, zusammen mit geeigneten Zusatzstoffen für die folgenden nützlichen Anwendungen:

    i. Herstellung einer flexiblen Polyvinylchloridfolie, die Fluoreszenzfarben zeigt;

    ii. Verwendung von Fluoreszenzfarben in Anstrichstoffen, Tinten, Textilien;

    iii. eine Zusammensetzung von Fluoreszenzfarbstoff zum Bleichen und Aufhellen eines Polymers;

    iv. Lecknachweise mit einem vollen Spektrum von Fluoreszenzfarbstoff;

    v. Verwendung in einem automatisierten chemischen Dosiersystem;

    vi. zur Markierung des Standorts eines zertrümmerten Transportbehälters; wobei der Behälter aus der Gruppe, bestehend aus einem Flugzeug, Rettungsbooten und Raketen, ausgewählt ist;

    vii. Unterwassersonden:

    viii. UVA wird in der Photochemotherapie von Hautkrebs verwendet;

    ix. Chromatophor-Sonnenschutzkomponente von kosmetischen Cremes und Lotionen;

    x. die wassermischbare Eigenschaft des Farbstoffes kann ihn in Feuchthaltemitteln leicht mischbar machen;

    xi. Komponente des Kits zur Anwendung bei der fluoreszenten in-situ-Hybridisierung für molekulare Diagnostik;

    xii. Komponente der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis, wobei die Kits für einen Zweck, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie, zum Markieren von DNA, RNA, Proteinen und Enzymen verwendet werden;

    xiii. Immunofluoreszenznachweis;

    xiv. Kontrastfärbung von DIG-markierten Oligonucleotidsonden und Anti-DIG-Fab-Fragmenten;

    xv. Zytometrieanwendungen mit einfachem und mehrfachem Fluß;

    xvi. Fluorochromfärbungen für Epifluoreszenzmikroskopie;

    xvii. für eine schnelle Überprüfung der Biokontamination in der Reformkostindustrie, kosmetischen Industrie, Arzneimittel-, Pestizidindustrie und in chemischen Industriezweigen,

    xviii. für schnelle Abschätzungen von Biokontaminanten in Laborkulturen;

    xix. für eine schnelle Überprüfung von biologischen Schmutzstoffen unter Feldbedingungen;

    xx. einen kompetitiven Inhibitor von Cholinesterasen;

    xxi. in antimikrobiellen Zusammensetzungen;

    xxii. als Biosurfactant in Toilettenartikelzusammensetzungen;

    xxiii. ein natürliches Färbemittel;

    xxiv. eine bioaktive Zusammensetzung des Farbstoffs in dem Verhältnis von 1:20000000 in ultrareinem Wasser, um Fluoreszenz mit acht Farben bei acht unterschiedlichen Wellenlängen und eine Phasenkontrastwirkung unter Durchlicht zu erhalten;

    xxv. einen Farbstoff für verschiedene Fluoreszenzanwendungen, die in Bereichen mit Temperaturen unter Null durchgeführt werden sollen;

    xxvi. eine Verbindung zur Verwendung als Basis zur Herstellung von Derivaten des Farbstoffs für neue Fluoreszenzsonden;

    xxvii. Verbindung für molekulare Reagenzien;

    xxviii. eine Verbindung zur Herstellung von Konjugaten für molekulare Anwendungen; und

    xxix. zum Erhalt einer Phasenkontrast- und histochemischen Kontrastfärbungswirkung für verschiedene biochemische Bestandteile von Zellen unter Durchlicht.
  27. Verfahren zur Extraktion einer neuen Verbindung und eines multiplen Fluoreszenzfarbstoffes aus der Seegurke Holothuria scabra, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

    a. Sammeln der Tiere von den Stränden während einer Ebbe und Halten in Seewasser enthaltenden Glastanks im Laboratorium für taxonomische Identifizierung und weitere Verwendung;

    b. sorgfältiges Waschen der Tiere mit Milli-Q-Wasser und Anästhesieren durch Chloroform/Menthol in einem geschlossenen Gefäß;

    c. Entfernen der Eingeweide und des Hautanteils der Tiere durch Ablösen, indem mit einem Skalpell geschabt wird, zum Lyophilisieren;

    d. Nehmen der lyophilisierten Haut von Schritt (c) mit der erforderlichen Quantität von ultrareinem Wasser und Halten auf einem Schüttler für 4 Stunden und nachfolgende Filtration durch Whatmann-Papier 1 und Sinterglasfilter;

    e. Verdampfen des Filtrats von Schritt (d) und Ausfällen der Verbindung unter Verwendung organischer Lösungsmittel;

    f. Lösen des Niederschlags in einem minimalen Volumen von Wasser und Wiederausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, um die Salze zu entfernen;

    g. Zentrifugieren, um den Rückstand zu sammeln, und Verwerfen des Filtrats;

    h. Trocknen des Rückstands von Schritt (g), um ein trockenes Pulver zu erhalten;

    i. Lösen des trockenen Pulvers von Schritt (h) in Wasser, Aufbringen auf eine Ionenaustauschsäule;

    j. Eluieren der Säule von Schritt (i) mit Wasser;

    k. Lyophilisieren der mit Wasser eluierten Fraktionen von Schritt (j);

    l. Aufbringen des lyophilisierten Materials von Schritt (k) auf eine DEAE-Cellulose-Säule, Eluieren mit Phosphatpuffer;

    m. wiederholtes Entsalzen der mit Phosphatpuffer eluierten Fraktion von Schritt (1) unter Verwendung einer PD10-Säule und

    n. Erhalten der geforderten bioaktiven Verbindung der Formel C22H48O66N2S10Si7, dargestellt durch die 18 oder 19.
  28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei der marine Organismus Holothuria scabra aus intertidalen, submersen, flachen und tiefen Gewässern erhalten wird, gewöhnlich in beschatteten Bereichen wie beispielsweise Bergschluchten, Felsspalten, Felsbänken, Lagunen, Überhängen, felsigen und sandigen Habitaten reichlich vorhanden; dunkel bis hell gefärbte, festgewachsene, seßhafte Drifter mit oder ohne Exo- und Endoskelett, nektonisch mit veränderter Schwimmkraft gewöhnlich nächtlich in der Lebensweise, neigend zu aktivem Räubertum, mit und ohne lumineszente und fluoreszente Pigmente, die Emissionen in einigen bis allen Wellenlängenbereichen von Röntgenstrahlen, UVB, UVA, sichtbaren farbigen Spektren und Infrarotspektrum ergeben.
  29. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die empirische Formel der Verbindung C22H48O66N2S10Si7 ist und sie das Molekulargewicht 1915 hat.
  30. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Verbindung ein Fluorophor enthält, welches die empirische Formel C10H16N2O und ein Molekulargewicht von 180 hat.
  31. Verfahren nach Anspruch 27, wobei gefunden wird, daß die HPLC-Retentionszeit 1,909 Minuten beträgt.
  32. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Verbindung mit Wasser in dem Verhältnis von dem 1:2000000-fachen verdünnt wird, welche Fluoreszenz mit acht Farben bei acht unterschiedlichen Wellenlängen emittiert.
  33. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Verbindung bei unterschiedlichen Temperaturen im Bereich zwischen Temperaturen unter Null bis 300 Grad Celsius stabil ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Verbindung bei der FT-IR-Analyse Signale von Sulfaten zeigte, die in dem Bereich von 1210–1150 und 1060–1030 und 650 vorkommen, was darauf schließen läßt, daß Schwefel in der Verbindung in dem O-SO2-Typ von Verknüpfung vorhanden ist.
  35. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Verbindung bei der FT-IR-Analyse die starke Absorptionsbande für Silicat zwischen 1090–1020 (bei 1068) zeigte, die das Vorhandensein von -Si-O-Si-Verknüpfung bestätigt.
  36. Methode zum Färben von Substanzen und/oder Komponenten in verschiedenen industriellen, biologischen. und anderen Anwendungen, wobei die Methode Aufbringen oder Hinzufügen einer erforderlichen Menge der multiplen Fluoreszenzverbindung nach Anspruch 1 zu den Substanzen und/oder Komponenten umfaßt.
  37. Methode nach Anspruch 36 zum Markieren von Molekularsonden in fluoreszenter in-situ-Hybridisierung (F.I.S.H.).
  38. Methode nach Anspruch 36, wobei die blau gefärbte Fluoreszenz des Farbstoffs vergleichbar ist mit der Emission der gleichen Farbe durch das DAPI-Fluorochrom bei Anregung mit der gleichen Wellenlänge. verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  39. Methode nach Anspruch 36, wobei die gelb gefärbte Fluoreszenz des Farbstoffs im sichtbaren Bereich vergleichbar ist mit den gleichen farbigen Emissionen von Auramin, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  40. Methode nach Anspruch 36, wobei die gelb gefärbte Fluoreszenz des Farbstoffs im sichtbaren Bereich vergleichbar ist mit den gleichen farbigen Emissionen von FITC, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht: radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  41. Methode nach Anspruch 36, wobei die orange gefärbte Fluoreszenzemission vergleichbar ist mit der orangen Fluoreszenzfarbe des Propidiumiodid-Fluorochroms, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  42. Methode nach Anspruch 36, wobei die orange gefärbte Fluoreszenzemission vergleichbar ist mit der orangen Fluoreszenzfarbe des Rhodamin-Fluorochroms, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  43. Methode nach Anspruch 36, wobei die orange gefärbte Fluoreszenzemission vergleichbar ist mit der orangen Fluoreszenzfarbe des TRITC-Fluorochroms, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  44. Methode nach Anspruch 36, wobei der vorliegende Farbstoff ebenfalls vergleichbar ist mit der Emission von Farbe durch Hoechst 33258, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  45. Methode nach Anspruch 36, wobei der vorliegende Farbstoff ebenfalls vergleichbar ist mit der Emission von Farbe durch das Hoechst-33342-Fluorochrom bei Anregung mit der gleichen Wellenlänge, verwendet als Komponenten der Kits zur nicht radioaktiven Markierung und zum Nachweis für Biochemie, Zellbiologie, Immunchemie und Molekularbiologie.
  46. Methode nach Anspruch 36, wobei die Verbindung in allen Anwendungen verwendet werden kann, wo gegenwärtig Phycobiliproteine verwendet werden, da ihnen unähnlich der Farbstoff beim Einfrieren nicht Verlust an Fluoreszenz erleidet.
  47. Methode nach Anspruch 36, wobei unter dem Hellfeld des Fluoreszenzmikroskops, wenn unter einem 10×-Objektiv gesehen, die Farbtöne von bläulichen Grautönen eine Phasenkontrastwirkung erzeugen, welche beim schnellen Prüfen von zytogenetischen, zytologischen und histochemischen Objektträgern verwendbar ist und Ausgaben für die extra Phasenkontrastzugangskomponente des Mikroskops spart.
  48. Methode nach Anspruch 36, wobei die Verbindung unter dem 100×-Ölimmersionsobjektiv eines gewöhnlichen Durchlichtmikroskops die Proteine von Eidotter, Nucleoplasma und Chromatin von aktiv teilenden Spaltungszellen unterschiedliche Farben der Anfärbung in den Farbtönen von bräunlichem Gelb für frühere, gelb für die spätere und dunkelblau für die letzte Zellkomponente zeigen, welche in schnellen Bioassays der Wirkung verwendbar ist, die bei den verschiedenen histochemischen Komponenten der Zellen gesehen werden kann.
Es folgen 22 Blatt Zeichnungen






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