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Dokumentenidentifikation DE102005004324A1 10.08.2006
Titel Ionenfragmentierung durch Elektronentransfer in Ionenfallen
Anmelder Bruker Daltonik GmbH, 28359 Bremen, DE
Erfinder Hartmer, Ralf, 22589 Hamburg, DE;
Brekenfeld, Andreas, 28355 Bremen, DE
DE-Anmeldedatum 31.01.2005
DE-Aktenzeichen 102005004324
Offenlegungstag 10.08.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 10.08.2006
IPC-Hauptklasse G01N 27/62(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, DE
IPC-Nebenklasse H01J 49/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   H01J 49/42(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, DE   
Zusammenfassung Die Erfindung betrifft Verfahren und Gerät für die Fragmentierung von großen Molekülen, vorzugsweise Biopolymeren, durch Reaktionen zwischen mehrfach positiv und negativ geladenen Ionen in Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen nach Wolfgang Paul. Es finden in diesen Reaktionen teilweise Elektronentransfer-Reaktionen mit anschließender Dissoziation der Biopolymere statt und teilweise Reaktionen mit Verlust eines Protons, die zu stabilen Produktionen führen. Aus Untersuchungen in linearen Hochfrequenz-Ionenfallen (2-D-Ionenfallen) ist bekannt, dass die Reaktionen durch Elektronentransfer (ETD) zu einer Fragmentierung führen, die für Zwecke der Sequenzierung der Biopolymere besonders günstige Bruchstückionen bildet.
Die Erfindung besteht darin, dreidimensionale Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen (3-D-Ionenfallen) für die Reaktionen zwischen positiven und negativen Ionen zu verwenden. Entgegen Aussagen in bisherigen Veröffentlichungen finden Reaktionen mit Elektronentransfer auch in 3-D-Ionenfallen mit genügender Ausbeute statt. Insbesondere kann die Fragmentierungsausbeute dadurch erhöht werden, dass solche Ionen, die in den Reaktionen nach Transfer eines Elektrons als Radikal-Kationen stabil bleiben, durch Stoßfragmentierung weiter fragmentiert werden. Dabei werden ebenfalls die für Elektronentransfer typischen Fragmentionen und nicht die für Stoßfragmentierung typischen gebildet. Die Erfindung besteht des Weiteren darin, die positiven Ionen und die negativen Ionen ...

Beschreibung[de]

Die Erfindung betrifft Verfahren und Gerät für die Fragmentierung von großen Molekülen, vorzugsweise Biopolymeren, durch Reaktionen zwischen mehrfach positiv und negativ geladenen Ionen in Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen nach Wolfgang Paul. Es finden in diesen Reaktionen teilweise Elektronentransfer-Reaktionen mit anschließender Dissoziation der Biopolymere statt, und teilweise Reaktionen mit Verlust eines Protons, die zu stabilen Produktionen führen. Aus Untersuchungen in linearen Hochfrequenz-Ionenfallen (2D-Ionenfallen) ist bekannt, dass die Reaktionen durch Elektronentransfer (ETD) zu einer Fragmentierung führen, die für Zwecke der Sequenzierung der Biopolymere besonders günstige Bruchstückionen bildet.

Die Erfindung besteht darin, dreidimensionale Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfallen (3D-Ionenfallen) für die Reaktionen zwischen positiven und negativen Ionen zu verwenden. Entgegen Aussagen in bisherigen Veröffentlichungen, finden Reaktionen mit Elektronentransfer auch in 3D-Ionenfallen mit genügender Ausbeute statt. Insbesondere kann die Fragmentierungsausbeute dadurch erhöht werden, dass solche Ionen, die in den Reaktionen nach Transfer eines Elektrons als Radikal-Kationen stabil bleiben, durch Stoßfragmentierung weiter fragmentiert werden. Dabei werden ebenfalls die für Elektronentransfer typischen Fragmentionen und nicht die für Stoßfragmentierung typischen gebildet. Die Erfindung besteht des Weiteren darin, die positiven Ionen und die negativen Ionen sequentiell durch die gleiche Öffnung in eine Ionenfalle einzuführen.

In der jüngst erschienen Arbeit „Anion dependence in the partitioning between proton and electron transfer in ion/ion reactions" von J. J. Coon et al., Int. J. Mass Spectrom. 236, 33-42, (2004) werden die Reaktionen von mehrfach positiv geladenen Ionen (Kationen) mit bestimmten Klassen von negativen Ionen (Anionen) in linearen Ionenfallen untersucht. Lineare Ionenfallen (auch 2D-Ionenfallen genannt, weil sich die elektrischen Felder im Inneren nur in zwei Dimensionen ändern) bestehen aus vier Stäben unter Hochfrequenzspannung mit Endelektroden, die die Ionen zurückweisen. Die Autoren beschreiben, welche Sorten von Anionen nur zu einer einfachen Deprotonierung („charge stripping") von organischen Biopolymeren führen, und welche Sorten bevorzugt einen Elektronentransfer bewirken, wobei der Elektronentransfer mit großer Ausbeute zu nachfolgenden Brüchen des Rückgrats dieser Biopolymere führt (ETD = electron transfer dissociation). Die Bruchstückionen gehören dabei den so genannten C- und Z-Reihen an, und sind somit sehr verschieden von den Bruchstückionen der B- und Y-Reihen, die durch Stoßfragmentierung gewonnen werden. Die Bruchstücke der C- und Z-Reihen haben Vorteile für die Identifizierung und für die Bestimmung der Aminosäuresequenz aus den massenspektrometrischen Daten.

Die lineare Ionenfalle der Autoren war in besonderer Weise für die gleichzeitige Speicherung von positiven und negativen Ionen ausgerüstet worden: Sie hatte Gitter an beiden Enden, die mit Hochfrequenzspannungen betrieben wurden und so Ionen beider Polaritäten zurückweisen konnten. Außerdem wurden die positiven Ionen von einem Ende, die negativen Ionen vom anderen Ende her zugeführt und konnten in der linearen Ionenfalle durch besondere Maßnahmen, die ein axiales Gleichspannungspotentialgefälle erzeugten, zunächst auseinander gehalten werden, bevor die Reaktion durch Ausschalten des Gleichspannungspotentialgefälles eingeleitet wurde. Die lineare Ionenfalle war also weit komplexer ausgerüstet als die kommerzieller Geräte.

Die Autoren berichten ferner, dass es ihnen bekannten Arbeitsgruppen nicht gelungen sei, den Elektronentransfer und die damit verbundenen Fragmentierungen in 3D-Ionenfallen nachzuweisen, selbst in Reaktionen mit gleichen Kombinationen aus Kationen und Anionen, die in linearen Ionenfallen zu Elektronentransfer geführt hätten. Die positiven Ionen waren dabei in üblicher Weise durch ein Loch in einer der beiden Endkappen, die negativen Ionen dagegen durch eine Öffnung in der Ringelektrode in die 3D-Ionenfalle eingeführt worden. Die Autoren spekulieren in einem eigenen Abschnitt 3.7 des zitierten Artikels (3D versus 2D traps for ETD) über die Gründe, warum Elektronentransfer in 3D-Ionenfallen nicht eintreten könne: eine der Erklärungen ist, dass die Ionen in einer 3D-Ionenfalle von allen Seiten durch Pseudopotentialfelder eingesperrt seien, während sie in 2D-Ionenfallen in einer Richtung Bewegungsfreiheit hätten. Es ist also nicht nur die Elektronentransfer-Dissoziation (ETD) in 3D-Ionenfallen trotz Suchens nicht bekannt, es wird auch von ernstzunehmenden und auf diesem Gebiet sehr erfahrenen Autoren darüber diskutiert, dass und warum Elektronentransfer dort nicht eintreten könne.

Dreidimensionale Ionenfallen (3D-Ionenfallen) nach Wolfgang Paul bestehen aus einer Ringelektrode und zwei Endkappenelektroden, wobei in der Regel die Ringelektrode mit der Hochfrequenzspannung versorgt wird, es sind jedoch auch andere Betriebsarten möglich. Im Inneren der Ionenfalle können Ionen im quadrupolaren Hochfrequenzfeld gespeichert werden. Die Ionenfallen können als Massenspektrometer verwendet werden, indem die gespeicherten Ionen massenselektiv ausgeworfen und durch Sekundärelektronenvervielfacher gemessen werden. Es sind mehrere verschiedene Methoden für den Ionenauswurf bekannt geworden, auf die hier nicht näher eingegangen werden soll.

Die Hochfrequenzspannung an der Ringelektrode ist sehr hoch, sie beträgt bei handelsüblichen Ionenfallenmassenspektrometern zwischen 15 und 30 Kilovolt (Spitze-Spitze). Die Frequenz beträgt etwa ein Megahertz. Im Inneren wird ein hauptsächlich quadrupolares Feld aufgespannt, das mit der Hochfrequenzspannung schwingt und die Ionen oberhalb einer Schwellenmasse zum Zentrum treibt, wodurch diese Ionen so genannte sekulare Oszillationen in diesem Feld ausführen. Die rücktreibenden Kräfte in der Ionenfalle werden in der Regel durch ein so genanntes Pseudopotential beschrieben, das über eine zeitliche Mittelung der Kräfte des realen Potentials bestimmt wird. Das Pseudopotential steigt Kräfte des realen Potentials bestimmt wird. Das Pseudopotential steigt gleichmäßig in allen Richtungen quadratisch an. In diesem „Topf" des Pseudopotentials oszillieren die Ionen.

Die Ionen können im Inneren erzeugt, aber auch von außen eingeführt werden. Ein Stoßgas in der Ionenfalle sorgt dafür, dass die ursprünglich vorhandenen Bewegungsschwingungen (Oszillationen) der Ionen im Topf des Pseudopotentials abgebremst werden; die Ionen versammeln sich dann als kleine Wolke im Zentrum der Ionenfalle. Der Durchmesser der Wolke beträgt in üblichen Ionenfallen bei üblichen Ionenfüllungen mit einigen Tausend Ionen etwa ein Millimeter; er bestimmt sich durch ein Gleichgewicht zwischen der rücktreibenden Kraft des Pseudopotentials und den abstoßenden Coulombschen Kräften zwischen den Ionen. Die inneren Abmessungen der Ionenfallen sind meist durch einen Abstand von etwa 14 Millimeter der Endkappen voneinander charakterisiert, der Ringdurchmesser beträgt etwa 14 bis 20 Millimeter.

Ionenfallenmassenspektrometer haben Eigenschaften, die ihren Einsatz für viele Arten von Analysen interessant macht. So können insbesondere ausgewählte Ionensorten (so genannte „Elternionen") in der Ionenfalle isoliert und fragmentiert werden. Unter der Isolierung einer Ionensorten versteht man, dass alle nicht interessierenden Ionensorten durch starke resonante Anregungen oder anderen Maßnahmen aus der Ionenfalle entfernt werden, so dass nur die Elternionen übrig bleiben. Die Fragmentierung erfolgt durch eine schwache resonante Anregung der Ionenoszillationen mit einer dipolaren Wechselspannung, die zu vielen Stößen mit dem Stoßgas führt, ohne die Ionen aus der Ionenfalle zu entfernen. Die Ionen können in den Stößen Energie aufsammeln, die schließlich zum Zerfall der Ionen führt. In der Regel geht man für die Fragmentierung von doppelt geladenen Elternionen aus. In Ionenfallen wurden die Ionen nach bisheriger Technik nur durch solche Stöße mit Stoßgas fragmentiert (CID = collision induced dissociation). Die Spektren dieser Fragmentionen werden "Tochterionenspektren" oder "Fragmentionenspektren" der betreffenden ausgewählten Elternionen genannt. Es können auch „Enkelionenspektren" als Fragmentionenspektren ausgewählter Tochterionen gemessen werden. Aus diesen Tochterionenspektren lassen sich Strukturen der fragmentierten Ionen ablesen; so ist es möglich (wenn auch schwierig), aus diesen Spektren die Sequenz der Aminosäuren eines Peptids zu bestimmen.

Eine gängige Art der Ionisierung großer Biomoleküle ist die Elektrosprüh-Methode (ESI = electro spray ionization), die Ionen bei Atmosphärendruck außerhalb des Massenspektrometers ionisiert. Diese Ionen werden dann über Einlasssysteme bekannter Art in das Vakuum des Massenspektrometers und von dort in die Ionenfalle eingebracht. Für die Überführung der Ionen innerhalb des Vakuumsystems werden gewöhnlich Hochfrequenz-Ionenleitsysteme eingesetzt, die meist als Hexapol- oder Oktopol-Stabsysteme ausgeführt sind.

Diese Ionisierung durch Elektrosprühen erzeugt praktisch keine Fragmentionen, die Ionen sind im wesentlichen die des protonierten Moleküls. Wohl aber treten bei Elektrosprühen in der Regel auch mehrfach geladene Ionen der Moleküle auf (doppelt und dreifach geladene Ionen). Durch das Fehlen fast jeder Fragmentierung während des Ionisierungsprozesses beschränkt sich die Information aus dem Massenspektrum auf das Molekulargewicht; es fehlen Informationen über interne Molekularstrukturen, die zur weiteren Identifizierung der vorliegenden Substanz benutzt werden können. Diese Informationen können erst über die Aufnahme von Fragmentionenspektren erhalten werden.

Aus der Ionencyclotronresonanz- oder Fourier-Transform-Massenspektrometrie ist vor einigen Jahren ein Verfahren zur Fragmentierung von Biomolekülen, hauptsächlich von Peptiden und Proteinen, bekannt geworden. Es besteht darin, Elektronen von meist doppelt geladenen Ionen einfangen zu lassen, wobei die dabei freiwerdende Ionisierungsenergie zum Bruch der in der Regel kettenförmigen Moleküle führt. Das Verfahren wird ECD genannt (electron capture dissociation). Waren die Moleküle doppelt geladen, so bleibt eines der beiden entstehenden Fragmente als Ion zurück. Die Fragmentierung folgt dabei sehr einfachen Regeln (für Fachleute: es gibt im Wesentlichen nur herausragend viele C-Brüche, einige Z-Brüche und ganz wenige Y-Brüche zwischen den Aminosäuren eines Peptids), so dass aus dem Fragmentierungsmuster sehr einfach auf den Aufbau des Moleküls geschlossen werden kann. An den herausragend großen C-Bruckstückionen kann die Sequenz von Peptiden oder Proteinen häufig sehr einfach abgelesen werden; die Sequenz ist damit in der Regel in einfacherer Weise aus dem Fragmentierungsspektrum sichtbar als bei Stoßfragmentierungen. Die Interpretation dieser ECD-Fragmentspektren ist bedeutend einfacher als die Interpretation von stoßerzeugten Fragmentspektren.

Es ist auch möglich, dreifach geladene Ionen in dieser Weise zu fragmentieren, doch zeigt die Methode ihren Glanz besonders an den zweifach geladenen Ionen. Wird eine Elektrosprüh-Ionisierung auf Peptide angewandt, so sind die zweifach geladenen Ionen in der Regel auch die häufigsten Ionen. Elektrosprüh-Ionisierung ist eine Methode der Ionisierung, die für Biomoleküle zum Zwecke der massenspektrometrischen Untersuchung in Ionenfallen besonders häufig verwendet wird.

Die oben angesprochene Fragmentierung durch Elektronentransfer in Reaktionen zwischen mehrfach geladenen Kationen und geeigneten Anionen wäre eine geeignete Alternative zur Elektronen-Einfang-Fragmentierung (ECD), die in Ionenfallen nur sehr schwer durchzuführen ist, da die Hochfrequenzfelder kaum den Zutritt von niederenergetischen Elektronen erlauben. Die Fragmentierung durch Elektronentransfer führt zu sehr ähnlichen Bruchstücken wie die Fragmentierung durch Elektroneneinfang.

Aufgabe der Erfindung

Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Fragmentierung nach dem Typus der Elektronen-Einfang-Dissoziation bereitzustellen, das einerseits auch in einer 3D-Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle arbeitet und andererseits eine hohe Ausbeute an Fragmentionen insbesondere der C-Reihe liefert.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung wird durch ein Verfahren gelöst, das die Fragmentierung von Ionen durch Elektronentransfer in Reaktionen zwischen mehrfach geladenen positiven Ionen und geeigneten negativen Ionen in einer 3D-Hochfrequenz-Ionenfalle erzeugt, ohne besondere Maßnahmen, die über den üblichen Betrieb einer Ionenfalle hinausgehen. Geeignete negative Ionen sind beispielsweise solche von Fluoranthen, Fluorenon, Anthracen oder anderen polyaromatischen Verbindungen. Die positiven und die negativen Ionen wurden in unseren Versuchen sequentiell durch die gleiche Einführungsöffnung in einer der beiden Endkappen eingebracht. Diese Art der Einführung stellt ein bevorzugtes Verfahren dar, da es den herkömmlichen Betrieb eines Ionenfallenmassenspektrometers nicht stört. Es ist jedoch zu erwarten, dass auch eine Einführung über verschiedene Einführungsöffnungen in die 3D-Hochfrequenz-Ionenfalle, beispielsweise eine Einführung durch zwei Öffnungen in gegenüberliegenden Endkappen, zum Erfolg führen kann; das wird jedoch möglicherweise nicht für alle Arten von Einführungen von Ionen und alle Arten von Einführungsöffnungen gelten.

Es erscheint daher gut möglich, dass die in der obig zitierten Arbeit berichteten Misserfolge mit 3D-Ionenfallen auf die Art der Ioneneinführung zurückzuführen ist. Es scheint daher eine besonders günstige Ausführungsform zu sein, einer Ionenfalle (möglicherweise auch einer 2D-Ionenfalle) die positiven und die negativen Ionen durch die gleiche Einführungsöffnung zuzuführen.

Die Reaktionen zwischen den eingespeicherten positiven und negativen Ionen laufen in der 3D-Ionenfalle automatisch und ohne besondere Maßnahmen ab, wobei – im Gegensatz zu obig zitierten Literaturangaben – nicht nur Deprotonierungs-Reaktionen, sondern auch – abhängig von der Art der negativen Ionen – sehr hohe Anteile an Elektronentransfer-Reaktionen zu beobachten ist. Die Elektronentransfer-Reaktionen führen dabei wiederum entweder zu der gewünschten sofortigen Fragmentierung oder zur Bildung von Radikal-Kationen, deren Protonenzahl nicht verringert ist, die aber ein Elektron aufgenommen haben. Diese Radikal-Kationen verbleiben über längere Zeit stabil in der Ionenfalle. Die 3D-Ionenfalle ist dabei wie üblich mit einem Stoßgas (auch Dämpfungsgas genannt) gefüllt, um die Ionenoszillationen zu dämpfen. Insbesondere kann die 3D-Hochfrequenz-Ionenfalle auch als Massenspektrometer zur Analyse der Fragmentionen betrieben werden.

Werden bei den Reaktionen zwischen mehrfach geladenen positiven Ionen und negativen Ionen in der Hochfrequenz-Ionenfalle größere Mengen an stabilen Radikal-Kationen gebildet, so können diese Radikal-Kationen durch Stöße mit Stoßgas zusätzlich fragmentiert werden. Es entstehen dabei Typen von Fragmentionen, die den Fragmentionen durch Elektronentransfer gleichen; nicht solche Typen, wie sie durch Stoßfragmentierung nicht-radikaler Ionen erhalten werden. Die Stoßfragmentierung der Radikal-Kationen kann durch eine gezielte Anregung mit einer resonanten dipolaren Wechselspannung bewirkt werden, wie sie üblicherweise für ein Stoßfragmentierung angewendet wird. Diese Anregungswechselspannung kann bereits während der Einspeicherung der negativen Ionen eingestrahlt werden, aber auch erst später, also nach Ablauf der Reaktionen.

Die Radikal-Kationen haben die gleiche Anzahl von Ladungen wie die deprotonierten Ionen, unterscheiden sich von den deprotonierten Ionen um die Masse eines Protons und eines Elektrons. Die Fragmentierung dieser Radikal-Kationen durch Stöße mit Dämpfungsgas braucht gegenüber üblicher Stoßfragmentierung anscheinend sehr viel weniger Energie. Ist eine Mischung aus deprotonierten Ionen und Radikal-Kationen der Untersuchungssubstanz vorhanden, so genügt eine sehr schwache resonante Anregung zur Erzeugung der Elektronentransfer-Fragmentionen, ohne dass wesentliche Anteile der deprotonierten Ionen fragmentiert werden.

Eine besondere Ausführungsform bringt zunächst die positiven Ionen in die Hochfrequenz-Ionenfalle ein, isoliert danach die zu fragmentierenden Ionen einer ausgewählten höheren Ladungsstufe (beispielsweise dreifach geladenen Ionen der Untersuchungssubstanz) in der Ionenfalle, und führt erst dann die negativen Ionen zu.

Werden die positiven und negativen Ionen durch die gleiche Einführungsöffnung in die Ionenfalle eingeführt, ist es vorteilhaft, dass vor der Einführungsöffnung ein Hochfrequenz-Ionenleitsystem vorhanden ist, in dem sich Ionen beider Polaritäten führen lassen. In diesem Ionenleitsystem kann sich dann insbesondere auch ein übliches Quadrupol-Ionenfilter befinden, mit dem bereits vor Einführung der Ionen in die Ionenfalle die geeigneten positiven und später die geeigneten negativen Ionen ausgefiltert werden können

Es ist vorteilhaft, wenn die positiven Ionen in einer Elektrosprüh-Ionenquelle erzeugt werden, da dann besonders viele zweifach und dreifach geladene Ionen entstehen. Besonders die dreifach geladenen Ionen führen zu hohen Anteilen an Elektronentransfer-Reaktionen mit anschließender Fragmentierung der dann im Übergang gebildeten doppelt geladenen Radikal-Kationen, die meist selbständig weiter zerfallen. Die Elektrosprüh-Ionenquelle befindet sich regelmäßig außerhalb des Vakuumsystems an Atmosphärendruck, und die Ionen werden durch Kapillaren ins Vakuum geführt. Die negativen Ionen können günstig in einer chemischen Ionisierungsquelle für negative Ionen erzeugt werden; diese Ionenquelle kann sich bevorzugt im Vakuumsystem des Massenspektrometers befinden.

Die positiven und die negativen Ionen können bevorzugt, aus ihren entsprechenden Ionenquellen kommend, durch eine Ionenweiche sequenziell in den gemeinsam benutzten Teil des Hochfrequenz-Ionenleitsystems eingeführt werden.

Beschreibung der Abbildungen

1 stellt ein Schema eines Ionenfallenmassenspektrometers für die Durchführung eines Verfahrens nach dieser Erfindung dar, mit einer Elektrosprüh-Ionenquelle (1, 2), einer Ionenquelle für negative Ionen (8) und einer 3D-Ionenfalle mit Endkappenelektroden (11, 13) und Ringelektrode (12). Das Ionenleitsystem (9), hier als Oktopol-Stabsystem ausgeführt, kann sowohl positive wie auch negative Ionen zur Ionenfalle leiten.

2 zeigt ein Tochterionenspektrum der dreifach geladenen Ionen der Substanz P, das nach dieser Erfindung durch Reaktion mit negativen Ionen von Fluoranthen gewonnen wurde. Die Fragmentionen sind durch Sternchen gekennzeichnet.

Günstige Ausführungsformen

Eine günstige Ausführungsform eines Ionenfallenmassenspektrometers nach dieser Erfindung und zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist in 1 schematisch wiedergegeben. Es wird hier eine Elektrosprüh-Ionenquelle (1) mit einer Sprühkapillare (2) außerhalb des Massenspektrometers zur Ionisierung von Biomolekülen verwendet. Es werde hier angenommen, dass eine Mischung von Verdaupeptiden eines größeren Proteins untersucht werden soll. Die Ionen werden in üblicher Weise durch eine Einlasskapillare (3) und einen Abstreifer (4) mit den Ionenleitsystemen (5) und (9) durch die Druckstufen (15), (16), (17) in zur 3D-Ionenfalle mit Endkappenelektroden (11 und 13) und Ringelektrode (12) geführt und dort in üblicher Weise eingefangen. Die Ionenleitsysteme (5) und (9) bestehen aus parallelen Stabpaaren, an denen alternierend die Phasen einer Hochfrequenzspannung liegen. Sie können als Quadrupol-, als Hexapol- oder als Oktopol-Stabsystem ausgeführt sein.

Ein erstes Massenspektrum, das durch resonante Anregung der Ionen mit massenselektivem Auswurf mit Messung im Ionendetektor (14) gewonnen wird, gibt eine Übersicht über die Verdaupeptide. Sollen jetzt ein oder mehrere Peptide auf ihre Sequenz aus Aminosäuren hin untersucht werden, so isoliert man mit üblichen Mitteln die dreifach geladenen Ionen dieses Peptids; das heißt, man überfüllt zunächst die Ionenfalle und wirft dann alle Ionen aus der Ionenfalle aus, die nicht dreifach geladene Ionen dieses Peptids sind. Die dreifache Ladung erkennt man am Abstand der Isotopenlinien voneinander, die für dreifach geladene Ionen genau 1/3 atomare Masseneinheit beträgt. Stehen dreifach geladene Ionen nicht in ausreichendem Maße zur Verfügung, so können auch die doppelt geladenen Ionen verwendet werden.

Diese mehrfach geladenen Ionen werden durch eine kurze Wartezeit von einigen Millisekunden durch das immer vorhandene Stoßgas in das Zentrum der Falle hinein abgebremst. Sie bilden dort eine kleine Wolke von etwa einem Millimeter Durchmesser.

Sodann werden die negativ geladenen Ionen hinzugefügt. Diese Ionen werden hier in einer gesonderten Ionenquelle (8) für negative chemische Ionisierung erzeugt und über ein kleines Ionenleitsystem (7) zu einer Ionenweiche geführt, wo sie in das Ionenleitsystem (9) zur Ionenfalle (11, 12, 13) eingefädelt werden. Die Ionenweiche besteht in der hier gezeigten Ausführung einfach aus einer geteilten Lochblende (6), an deren beide Hälften zwei geeignete Gleichspannungspotentiale angelegt werden können, und aus einer Verkürzung zweier Stäbe des stabförmigen Ionenleitsystems (9). Besonders günstig für diese sehr einfache Art einer Ionenweiche ist es, wenn das Ionenleitsystem als Oktopolsystem ausgeführt ist. Diese Ionenweiche kann die Ionen der Elektrosprüh-Ionenquelle (1, 2) bei geeigneten Spannungen an den Halbblenden ungehindert durchlassen, mit anderen Spannungen werden die negativen Ionen aus der Ionenquelle (8) in das Ionenleitsystem (9) hinein reflektiert. Über dieses Ionenleitsystem (9) gelangen sie zur Ionenfalle und werden dort in üblicher Weise durch eine Einschussoptik (10) eingespeichert. Sie reagieren dabei sofort (innerhalb weniger Millisekunden) mit den positiven Ionen.

Diese Art der Ionenweiche ist sehr einfach und kann (einschließlich einer Ionenquelle für negative Ionen) häufig in existierende Geräte nachträglich eingebaut werden. Selbstredend können aber auch andere Arten von Ionenweichen verwendet werden. So ist im Patent US 6,737,641 B2 (Y. Kato) eine Ionenweiche dargestellt, die aber gegenüber der oben geschilderten Ionenweiche sehr kompliziert und teuer erscheint und den Typus des Gerätes grundlegend ändert.

Da sich durch Transfer eines Elektrons in der Regel auch stabile Radikal-Kationen bilden, die nicht sofort zerfallen, wird eine schwache dipolare Anregungswechselspannung für eine resonante Anregung dieser Radikal-Kationen an die beiden Endkappen (11, 13) der Ionenfalle gelegt. Die Frequenz für diese Anregungswechselspannung kann aus der bekannten Masse dieser Radikal-Kationen und ihrer bekannten Ladung berechnet werden. Diese Anregungsspannung bewirkt, dass die Ausbeute der gewünschten Fragmentionensorte erhöht wird.

Die Einfädelung der positiven wie der negativen Ionen durch die gleiche Eingangsöffnung der Ionenfalle bewirkt, dass der übliche Betrieb der Ionenfalle mit Befüllung und massenselektiven Ejektion der Ionen zum Detektor (14) hin nicht gestört wird. Die Einfädelung durch die gleiche Eingangsöffnung kann aber auch, wie indirekt aus den obig beschriebenen fehlgeschlagenen Versuchen anderer Arbeitsgruppen zu schließen ist, fördernde Eigenschaften für den Ablauf der Reaktionen zwischen positiven und negativen Ionen haben. Eine solche Einfädelung kann daher auch für lineare Ionenfallen verwendet werden und dort eine Verbesserung der Ausbeute bewirken.

Für die Berechnung der Zeiten einer optimalen Befüllung der Ionenfalle gibt es verschiedene bekannte Verfahren, auf die hier nicht näher eingegangen werden soll. Die Füllzeiten bewirken eine optimale Füllung, bei der die Raumladung gerade noch nicht die Spektrenaufnahme durch die massenselektive Ejektion der Ionen stört. Dabei wird im Wesentlichen die Zahl der Ladungen innerhalb der Ionenfalle gesteuert; für ein optimales Verhalten bei der Spektrennahme spielen auch noch andere Parameter eine Rolle, doch soll hier auf Einzelheiten nicht eingegangen werden. Für die Befüllung mit negativen Ionen ist dagegen nur ein einziges Mal eine optimale Befüllungszeit zu ermitteln, da immer etwa die gleiche Menge an negativen Ionen gebraucht wird, um mit der feststehenden Anzahl von positiven Ionen optimal zu reagieren.

Die Massenspektren, die so gewonnen werden, gleichen weitgehend den Massenspektren aus Fragmentierungen durch Einfang niederenergetischer Ionen (Elektroneneinfang-Dissoziation). Sie zeigen für Proteine und Peptide ganz bevorzugt die C-Reihe von Fragmentionen und eignen sich dadurch sehr gut für eine Bestimmung der Aminosäuresequenz.

Dieses Verfahren kann dann für andere Peptide aus dem Gemisch wiederholt werden. Es ergibt sich so eine sehr sichere Identifizierung des Eiweißes. Es können sogar Unterschiede des untersuchten Eiweißes zu solchen aus Proteinsequenzdatenbanken festgestellt werden, diese Unterschiede durch posttranslationale Modifikationen der Proteine sind in der Regel von besonderem Interesse.

Es lassen sich durch den Fachmann in Kenntnis dieser Erfindung auch weitere Verfahren erstellen, die die Kenntnis über Strukturen der untersuchten Substanzen vergrößern und vervollständigen. Beispielsweise können von den so hergestellten Fragmentionen auch wieder Enkelionen durch Stoßfragmentierung erzeugt werden. Alle diese Lösungen sollen vom Erfindungsgedanken mit umfasst sein.


Anspruch[de]
  1. Verfahren zur Fragmentierung von Ionen durch Elektronentransfer in Reaktionen zwischen mehrfach geladenen positiven Ionen und negativen Ionen, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionen in einer 3D-Hochfrequenz-Ionenfalle ablaufen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die 3D-Hochfrequenz-Ionenfalle auch als Massenspektrometer zur Analyse der Fragmentionen betrieben wird.
  3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die positiven und negativen Ionen über verschiedene Einführungsöffnungen in die 3D-Hochfrequenz-Ionenfalle eingebracht werden.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die positiven und negativen Ionen sequentiell durch die gleiche Einführungsöffnung in die 3D-Hochfrequenz-Ionenfalle eingebracht werden.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst die positiven Ionen in die 3D-Hochfrequenz-Ionenfalle eingebracht werden, dass danach die zu fragmentierenden Ionen einer ausgewählten höheren Ladungsstufe in der Ionenfalle isoliert werden, und dass erst dann die negativen Ionen eingebracht werden.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionen beider Polaritäten über ein Hochfrequenz-Ionenleitsystem vor der Einführungsöffnung in die 3D-Ionenfalle eingeführt werden.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass im Ionenleitsystem ein Quadrupol-Ionenfilter die geeigneten positiven und danach die geeigneten negativen Ionen ausfiltert, bevor die jeweiligen Ionen in die 3D-Hochfrequenz-Ionenfalle eingebracht werden.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die positiven Ionen einer Elektrosprüh-Ionenquelle entstammen, während die negativen Ionen in einer chemischen Ionisierungsquelle für negative Ionen erzeugt werden.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die positiven und die negativen Ionen aus ihren entsprechenden Ionenquellen kommend durch eine Ionenweiche am Anfang des gemeinsam benutzten Teils des Hochfrequenz-Ionenleitsystems zusammengeführt werden.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die aus positiven Ionen durch Übertragung eines Elektrons entstehenden Radikal-Kationen durch Stöße mit Stoßgas fragmentiert werden, um die Ausbeute an typischen Elektronentransfer-Fragmentionen zu erhöhen.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Stoßfragmentierung der Radikal-Kationen durch eine Anregung mit einer dipolar eingestrahlten Wechselspannung bewirkt wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregung mit der dipolar eingestrahlten Wechselspannung schwächer gewählt wird, als es für die Fragmentierung von Ionen in der 3D-Ionenfalle üblich ist.
  13. Ionenfallenmassenspektrometer zur Fragmentierung von Ionen durch Elektronentransfer in Reaktionen zwischen mehrfach geladenen positiven Ionen und negativen Ionen, mit einer Hochfrequenz-Quadrupol-Ionenfalle, einer Ionenquelle zur Erzeugung mehrfach positiv geladener Ionen, einer Ionenquelle zur Erzeugung negativ geladener Ionen, einem Ionenleitsystem zur Überführung der positiven Ionen von der Ionenquelle zur Ionenfalle, und einem Ionenleitsystem zur Überführung der negativen Ionen zur Ionenfalle, dadurch gekennzeichnet, dass ein Teil des Ionenleitsystems vor der Ionenfalle von beiden Ionensorten gemeinsam, jedoch sequentiell, durchlaufen wird.
  14. Ionenfallenmassenspektrometer nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das gemein genutzte Teilstück des Ionenleitsystems als Hochfrequenz-Ionenleitsystem ausgebildet ist.
  15. Ionenfallenmassenspektrometer nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass am Anfang des gemeinsam benutzten Teilstücks des Ionenleitsystems eine Ionenweiche vorhanden ist, die die Ionen verschiedener Herkunft in das gemeinsam benutzte Teilstück des Ionenleitsystems einfädelt.
  16. Ionenfallenmassenspektrometer nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenweiche eine geteilte Lochblende am Anfang des gemeinsam benutzten Teilstücks des Ionenleitsystems enthält, dass das Ionenleitsystem aus Stäben besteht und dass zur Einfädelung der Ionen zwei benachbarte Stäbe des Ionenleitsystems zur geteilten Lochblende hin gekürzt sind.
  17. Ionenfallenmassenspektrometer nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass sich im gemeinsam genutzten Teilstück des Ionenleitsystems ein Quadrupol-Ionenfilter befindet.
Es folgt ein Blatt Zeichnungen






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