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Dokumentenidentifikation DE69928284T2 10.08.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001141245
Titel SOMATISCHE ZELLEN MIT FUNKTIONSUNFÄHIGEM PRP GEN UND VERWENDUNGSVERFAHREN
Anmelder The Regents of the University of California, Oakland, Calif., US
Erfinder PRUNISER, B., Stanley, San Francisco, US
Vertreter Patent- und Rechtsanwälte Bardehle, Pagenberg, Dost, Altenburg, Geissler, 81679 München
DE-Aktenzeichen 69928284
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 13.12.1999
EP-Aktenzeichen 999688799
WO-Anmeldetag 13.12.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/29503
WO-Veröffentlichungsnummer 2000037612
WO-Veröffentlichungsdatum 29.06.2000
EP-Offenlegungsdatum 10.10.2001
EP date of grant 09.11.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 10.08.2006
IPC-Hauptklasse C12N 5/06(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 5/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 5/12(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 39/395(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 48/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 38/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12P 21/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12P 21/08(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12P 19/34(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C07K 16/28(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
GEBIET DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet von Körperzellen und Zelllinien, die in Bezug auf die Expression eines für die frühe Entwicklung schädlichen Gens abgeändert sind, und insbesondere Zellen mit einem abgeänderten PrP-Gen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Bei Prionen handelt es sich um infektiöse Pathogene, die spongiforme Enzephalopathien des zentralen Nervensystems in Menschen und Tieren verursachen. Prionen unterscheiden sich von Bakterien, Viren und Viroiden. Die gegenwärtig vorherrschende Hypothese ist, dass kein Nukleinsäurebestandteil für die Infektiösität eines Prionproteins erforderlich ist. Des Weiteren infiziert ein Prion, das eine Tierspezies (z.B. einen Menschen) infiziert, keine andere (z.B. eine Maus).

Bei einem Hauptschritt bei der Untersuchung von Prionen und der Erkrankungen, die sie verursachen, handelte es sich um die Entdeckung und Reinigung eines als Prionprotein („PrP") bezeichneten Proteins [Bolton et al., Science 218: 1309–11 (1982), Prusiner et al., Biochemistry 21: 6942–50 (1982); McKinley et al., Cell 35: 57–62 (1983)]. Gene, die Prionprotein vollständig kodieren, wurden geklont, sequenziert und in transgenen Tieren exprmiert. PrPc wird durch ein Wirtsgen mit einer einzelnen Kopie kodiert [Basler et al., Cell 46: 417–28 (1986)] und ist gewöhnlich an der Außenfläche von Neuronen zu finden. Eine führende Hypothese ist, dass Prionerkrankungen aus der Umwandlung von PrPc zu einer als PrPSc bezeichneten modifizierten Form resultieren.

Es scheint gegenwärtig, dass die Traberkrankheit-Isoform des Prionproteins (PrPSc) sowohl für die Übertragung als auch für die Pathogenese der übertragbaren neurodegenerativen Erkrankungen von Tieren und Menschen nötig ist. Siehe Prusiner, S. B., „Molecular biology of prion disease", Science 252: 1515–1522 (1991). Bei den üblichsten Prionerkrankungen von Tieren handelt es sich um die Traberkrankheit des Schafes und der Ziege und die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) des Rinds [Wilesmith, J. und Wells, Microbiol. Immununol. 172: 21–38 (1991)]. Vier Prionerkrankungen des Menschen wurden identifiziert. (1) Kuru, (2) Creutzfeld-Jakob-Krankheit (CJD), (3) Gerstmann-Strassler-Scheinker-Krankheit (GSS) und (4) die tödlich verlaufende familiäre Schlaflosigkeit (FFI) [Gajdusek, D. C., Science 197: 943–960 (1977); Medori et al., N. Engl. J. Med. 326: 444–449 (1992)]. Die Darstellung von menschlichen Prionerkrankungen als sporadische, genetische und infektiöse Krankheiten gab anfänglich Rätsel auf, die durch den zellulären genetischen Ursprung von PrP erklärt wurden.

Einige Fälle von menschlicher Prionerkrankung wurden, jedoch scheinbar mit geringerer Regelmäßigkeit als die Übertragung zwischen Tieren derselben Spezies, auf Nager übertragen [Gibbs, Jr. et al., Slow Transmissable Diseases of the Nervous System, Bd. 2, S. B. Prusinder und W. J. Hadlow, Hrsgb. (New York: Academic Press), S. 87–110 (1979); Tateishi et al., Prion Deseases of Humans and Animals, Prusiner et al., Hrsgb. (London: Ellis Horwood), S. 129–134 (1992)]. Die seltene Übertragung von menschlicher Prionerkrankung auf Nager wurde als Beispiel für die „Speziesschranke" genannt, die zuerst von Pattison in seinen Untersuchungen über die Übertragung des Traberkrankheitserregers zwischen Schaf und Nager beschrieben wurde [Pattison, I. H., NINDB Monograph 2, D. C. Gajdusek, C. J. Gibbs Jr. und M. P. Alpers, Hg. (Washington, D. C.: US Government Printing), S. 249–257 (1965)]. In diesen Untersuchungen war die anfängliche Übertragung von Prionen von einer Spezies auf eine andere mit einer längeren Inkubationszeit verbunden, wobei nur wenige Tiere eine Erkrankung entwickelten. Eine anschließende Übertragung innerhalb derselben Spezies wurde dadurch charakterisiert, dass alle Tiere nach stark verkürzten Inkubationszeiten erkrankten.

Es zeigte sich unter Verwendung der transgenen (Tg-) Maus, dass die molekulare Basis für die Speziesschranke zwischen dem Syrischen Hamster (SHa) und der Maus in der Sequenz des PrP-Gens vorlag [Scott et al., Cell 59: 847–857 (1989)]. SHaPrP unterscheidet sich von MoPrP an 16 Positionen außerhalb der 254 Aminosäurereste [Basler et al., Cell 46: 417–428 (1986); Locht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6372–6376 (1986)]. Tg(SHaPrP)-Mäuse, die SHaPrP exprimieren, wiesen verkürzte Inkubationszeiten auf, als sie mit SHa-Prionen beimpft wurden. Als ähnliche Untersuchungen mit die menschlichen oder Schafs-PrP-Transgene exprimierenden Mäusen durchgeführt wurden, war die Speziesschranke nicht aufgehoben, d.h. der Prozentanteil an infizierten Tieren war unakzeptabel gering, und die Inkubationszeiten waren unakzeptabel lang. Folglich war es nicht möglich, z.B. im Fall von menschlichen Prionen transgene Tiere (wie ein PrP-Gen einer anderen Spezies enthaltende Mäuse) zu verwenden, um eine Probe zur Bestimmung dessen, ob die Probe mit Prionen infiziert wurde, zuverlässig zu testen. Ein derartiger Test wurde zuerst in der Anmeldung Seriennummer 08/242,188, eingereicht am 13. Mai 1994, bei welcher es sich nun um US-Patent 5,565,186, erteilt am 15. Oktober 1996 handelt, offenbart.

Die meisten CJD-Fälle sind sporadisch, jedoch werden etwa 10–15% als autosome dominante Störungen vererbt, die durch Mutationen im menschlichen PrP-Gen verursacht werden [Hsiao et al., Neurology 40: 1820–1827 (1990); Goldfarb et al., Science 258: 806–808 (1992), Kitamoto et al., Proc. R. Soc. Lond. 343: 391–398]. Iatrogene CJD wurde durch menschliches Wachstumshormon verursacht, das von Kadaverhypophysen sowie Rückenmarktransplantaten abgeleitet wurde [Brown et al., Lancet 340: 24–27 (1992)]. Trotz zahlreicher Versuche, CJD mit einer infektiösen Quelle wie dem Konsum von mit Traberkrankheit infiziertem Schafsfleisch zu verbinden, wurde dies außer in Fällen von iatrogen induzierter Erkrankung bis heute nicht ermittelt [Harries-Jones et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 51: 1113–1119 (1988)]. Andererseits wird angenommen, dass Kuru, das seit vielen Jahrzehnten das Fore und benachbarte Stämme der Neuguinea-Highlands verwüstete, durch Infektion während rituellem Kannibalismus verbreitet wurde [Alpers, M. P., Slow Transmissible Diseases of the Nervous System, Band 1, S. B. Prusiner and W. J. Hadlow, Hg. (New York: Academic Press) S. 66–90 (1979)].

Mehr als 45 junge Erwachsene, die vorher mit von menschlichen Hypophysen abgeleitetem HGH behandelt wurden, entwickelten CJD [Koch et al., N. Engl. J. Med. 313: 731–733 (1985); Brown et al., Lancet 340: 24–27 (1992); Fradkin et al., JAMA 265: 880–884 (1991); Buchanan et al., Br. Med. J. 302: 824–828 (1991)]. Glücklicherweise wird nun rekombinantes HGH verwendet, obwohl die scheinbar geringe Möglichkeit auftrat, dass eine erhöhte Expression von durch hohes HGH stimuliertem wt PrPc eine Prionenerkrankung induzierte [Lasmezas et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1163–1169 (1993)]. Dass das von Hypophysen hergestellte HGH mit Prionen kontaminiert war, wird durch die Übertragung einer Prionerkrankung auf einen Affen 66 Monate nach der Beimpfung mit einer verdächtigen HGH-Charge gestützt [Gibbs, Jr. et al., N. Engl. J. Med. 328: 358–359 (1993)]. Die mit Prionerkrankungen verbundenen langen Inkubationszeiten zeigten seit Jahrzehnten in Tausenden von weltweit mit HGH behandelten Menschen nicht das volle Ausmaß an iatrogenem CJD. Iatrogenes CJD zeigte sich scheinbar auch in vier unfruchtbaren Frauen, die mit kontaminiertem, vom Menschen abgeleiteten Gonadotrophinhormon behandelt wurden [Healey et al., Br. J. Med. 307: 517–518 (1993); Cochius et al., Aust. N. Z. J. Med. 20: 592–593 (1990); Cochius et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 55: 1094–1095 (1992)], sowie in mindestens 11 Patienten, die Rückenmarktransplantate erhielten [Nisbet et al., J. Am. Med. Assoc. 261: 1118 (1989); Thadani et al., J. Neurosurg. 69: 766–769 (1988); Williamson et al., J. Neurosurg. Psychiatry 54: 940 (1991); Brown et al., Lancet 340: 24–27 (1992)]. Diese Fälle von iatrogenem CJD unterstreichen die Notwendigkeit des Durchmusterns von Arzneimitteln, die möglicherweise mit Prionen infiziert sein könnten.

Vor kurzem wurden zwei Ärzte in Frankreich wegen fahrlässiger Tötung eines Kindes, das mit von Leichen extrahierten Wachstumshormonen behandelt wurde, angeklagt. Das Kind entwickelte Creutzfeld-Jakob-Krankheit. (Siehe New Scientist, 31. Juli 1993, S. 4). Nach dem Pasteur Institut lagen seit 1989 24 berichtete Fälle von CJD in jungen Menschen vor, die zwischen 1983 und Mitte 1985 mit menschlichem Wachstumshormon behandelt wurden. Fünfzehn dieser Kinder starben. Es scheint nun, als ob Hunderte von Kindern in Frankreich mit dem Risiko des Entwickelns von CJD mit aus toten Körpern extrahiertem Wachstumshormon behandelt wurden (siehe New Scientist, 20. November 1993, S. 10). Im Hinblick darauf besteht eine deutliche Notwendigkeit für ein günstiges, kosteneffizientes Verfahren zur Herstellung von Humanprodukten wie Wachstumshormon, die frei von jeglicher möglicherweise ansteckender Prionkontamination sind.

Das Risiko des Übertragens von mit Prionen verbundenen Störungen durch therapeutische Humanprodukte stellt ein schwerwiegendes gesundheitliches Anliegen dar. bei einem Verfahren zum Verhindern der Übertragung von mit Prionen verbundenen Störungen handelt es sich darum, rekombinante Humanprodukte in Organismen wie Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae herzustellen, da diese Organismen kein endogenes PrP-Gen aufweisen und folglich für eine PrPSc-Infektion nicht anfällig sind. Während die Herstellung in Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae für ideal für die Synthese von vielen Humanproteinen im großen Maßstab ideal ist, können Faktoren wie Plasmidstabilität und Unlöslichkeit des gewünschten Proteinprodukts die Nützlichkeit dieser Systeme unter manchen Umständen einschränken. Zudem erfordern bestimmte rekombinant hergestellte Proteine zum Erhalt der Funktion des endogenen Proteins eine post-translationale Modifikation und können folglich die Synthese in Säugerzellen oder sogar speziesspezifischen Zelllinien für das richtige Funktionieren des hergestellten Proteins erfordern. Zum Beispiel ist ein rekombinantes Humanthryotropin (rhTSH), das in Ovarzellen des chinesischen Hamsters hergestellt wurde, höher sialyliert als ein nicht-rekombinantes, von Kadavern abgeleitetes stammendes Hypophysen-hTSH. Das rhTSH weist auch eine um das Zweifache geringere Stoffwechselbeseitigungsrate als Hypophysen-TSH auf, was zu einer um mehr als das Zehnfache höheren Serumkonzentration von rhTSH, verglichen mit Hypophysen-hTSH, führt. (Thotakura et al., Endocrinology 128: 341–348 (1991)) Da es erwünscht ist, therapeutische Mittel mit den richtigen post-translationalen Modifikationen zu verwenden, sind Säugersysteme zur Herstellung derartiger Proteine bevorzugt.

Außerdem werden andere therapeutische Mittel wie Antikörper ausschließlich durch Säugerzellsysteme hergestellt. Die klassischen Zellvereinigungstechniken erlauben eine effiziente Herstellung von monoklonalen Antikörpern durch Vereinigen der den Antikörper herstellenden B-Zelle mit einer immortalisierten Säugerzelllinie. Die erhaltene Zelllinie wird Hybridomzelllinie genannt. Anwendungen von Humanantikörpern, die durch diese Hybridomsysteme hergestellt werden, haben ein viel versprechendes Potenzial auf dem Gebiet von Krebs, Immundefizienzen und anderen Erkrankungen, bei denen eine Immunantwort eine Rolle spielt. Zum Beispiel zeigte es sich, dass der Apoptose-induzierende humane monoklonale Antikörper SC-1 eine deutliche Induktion einer apoptotischen Aktivität bei acht Patienten mit schwach differenziertem Magenadenokarzinom verursachte (Vollmers et al. Oncol Rep 5: 549–552 (1998)). In einem anderen Beispiel zeigte es sich, dass der Antikörper gegen HER2/neu eine viel versprechende Therapie für humanen Brustkrebs darstellt (Valero, (1998) Semin Oncol 5: 549–552). Monoklonale Antikörper, die in Mäuse-Hybridomsystemen hergestellt wurden, erfordern einen zusätzlichen Schritt des „Humanisierens" der Antikörper, um zu verhindern, dass die Antikörper als Fremdepitope erkannt werden (siehe z.B. Sato et al., (1994) Mol. Immunol. 31: 371–381). Diese Systeme sind für eine Prioneninfektion anfällig, und in infizierten Zellen hergestellte Antikörper stellen ein Übertragungsrisiko für jede Person dar, die Antikörper aus infizierten Quellen empfängt.

Prusiner et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10608–10612, 1993) beschreibt Mäuse, die für eine Prionprotein-(PrP)-Genabtragung homozygot sind. Durch eine Immunisierung dieser Mäuse mit gereinigten infektiösen Prionen wurden Antiseren hergestellt, die auf Western-Blots PrP gebunden haben.

Da viele Therapeutika in Säugersystemen hergestellt werden, besteht Bedarf nach der Gewährleistung der Sicherheit der Produkte, die aus derartigen Systemen isoliert werden. Da die Möglichkeit der Übertragung einer Erkrankung gegeben ist, wenn diese Therapeutika aus Gewebe extrahiert werden, besteht Bedarf nach einem Verfahren zum Herstellen von Therapeutika, die von dem Risiko der eine Humanerkrankung verursachenden Kontaminanten, wie Prionen, frei sind.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Verfahren zur Herstellung von Säugertherapeutika, die frei von Prionenkontamination sind, Zellen zur Verwendung in derartigen Verfahren und Prionen-freie therapeutische Formulierungen, die durch die Zellen hergestellt werden, sind offenbart. Die Erfindung umfasst die Herstellung derartiger Therapeutika in Körperzellen mit einem Genom mit einem künstlich abgeänderten PrP-Gen. Das PrP-Gen in diesen Zellen kann abgetragen oder durch eine exogene induzierbare Form des PrP-Gens ersetzt sein. Vorzugsweise stammen die Zellen der Erfindung von der Maus, der Ratte, dem Hamster, dem Rind, dem Schaf, dem Pferd, dem Schwein, dem Hund, der Katze, dem Huhn, stärker bevorzugt von Primaten und besonders bevorzugt vom Menschen. Diese Zellen können von transgenen Tieren mit abgeändertem PrP-Gen abgeleitet sein, oder das PrP kann in der Zelle abgeändert sein. Derartige Zellen sind für eine PrP-Infektion (PrPSC) nicht mehr anfällig, da die Infektion eine Wechselwirkung zwischen dem infektiösen Prionerreger und der endogenen Form des Proteins (PrPC) benötigt. Therapeutika, die durch ein derartiges Verfahren hergestellt werden, schließen Peptide, Proteine, Antikörper, Antisens-RNA-Moleküle, Ribozyme, virale Vektoren und dergleichen ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Jedes beliebige der Therapeutika kann mit einem Träger kombiniert werden, um ein geeignetes Arzneimittel, das Prionen-frei ist, bereitzustellen.

Die Erfindung zeichnet sich durch Zellen und ein Verfahren zur Herstellung von Therapeutika unter Verwendung von Säugerkörperzellen aus, in welchen das endogene PrP-Gen gestört ist und ein exogenes PrP-Gen in das Genom eingebracht wurde. Das endogene PrP-Gen kann gestört, das exogene PrP später in die Zelle eingebracht werden, oder das endogene PrP-Gen kann durch Ersatz des endogenen PrP-Gens mit der exogenen Form des PrP-Gens, z.B. durch stellenspezifische homologe Rekombination gestört werden. Außerdem kann das eingebrachte PrP-Gen in das Genom der Zelle integriert werden oder auch nicht.

In einer Ausführungsform zeichnet sich die Erfindung durch die Herstellung von Therapeutika in Wirtszellen aus, die exogene PrP-Sequenzen von einer Spezies exprimieren, die von den Wirtszellen genetisch verschieden sind. Diese Zellen exprimieren PrPC, sind jedoch durch für die Wirtszellenspezies-spezifisches PrPSc geschützt.

In einer anderen Ausführungsform zeichnet sich die Erfindung durch die Herstellung von Therapeutika in Wirtszellen aus, die exogene PrP-Sequenzen derselben Spezies wie die Wirtszelle exprimieren, wobei die endogene Form von PrP abgetragen wird.

Bei einem anderen Aspekt der Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern in einer Hybridomzelle mit einem gestörten endogenen PrP-Gen. Die Spaltung des PrP-Gens kann der Vereinigung der Antikörper herstellenden B-Zelle mit der immortalisierten Zelllinie folgen und entweder vor der Etablierung des Hybridoms als Zelllinie oder nach der Etablierung stattfinden. In einer anderen Ausführungsform kann die Prionen-freie Hybridomzelllinie durch Transfizieren von B-Zellen von Tieren mit einem gestörten PrP-Gen hergestellt werden, wodurch das endogene PrP-Gen der B-Zelle abgetragen wird. Diese transfizierten B-Zellen können mit einer immortalisierten Zelllinie vereinigt werden, die ebenfalls ein abgetragenes PrP-Gen aufweist, was zu einem Hybridom ohne endogene PrP-Expression führt, das gegen eine Prioneninfektion resistent ist.

Bei einem anderen Aspekt der Erfindung handelt es sich um die Adaptation von monoklonalen Antikörpern zur Verwendung als Therapeutika durch Abänderung und anschließende Herstellung in Säugerzellen, wobei die Zellen ein gestörtes endogenes PrP aufweisen. Wiederum kann das endogene PrP-Gen abgetragen oder durch eine induzierbare Form des PrP-Gens ersetzt werden. Vorzugsweise ist das hergestellte Therapeutikum ein humaner Antikörper und ist der Antikörper in einer PrP-Knock-out-Primatenzelllinie „humanisiert".

Bei einer Aufgabe der Erfindung handelt es sich darum, ein Verfahren zur Herstellung von biologischen Produkten bereitzustellen, die frei von dem Risiko einer Prioneninfektion sind und folglich mit Prionen verbundene Störungen an Personen, die derartige Produkte erhalten, nicht übertragen.

Bei einer anderen Aufgabe der Erfindung handelt es sich darum, ein Verfahren zur Gewährleistung sowohl von Bioaktivität als auch Sicherheit von Säugertherapeutika bereitzustellen.

Bei einem Merkmal der Erfindung handelt es sich darum, dass die in der Erfindung verwendeten Zellen für eine Prioneninfektion nicht anfällig sind.

Bei einem Vorteil der Erfindung handelt es sich darum, dass das Verfahren gewährleistet, dass die durch dieses Verfahren gebildeten biologischen Produkte Prionen-frei sind.

Eine Aufgabe ist es, ein Spektrum an Therapeutika und Formulierungen davon bereitzustellen, die Prionen-frei sind.

Diese und andere Aufgaben, Vorzüge und Merkmale der Erfindung werden dem Fachmann durch Lesen der wie nachstehend vollständiger beschriebenen Details der Erfindung klar.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Bevor die vorliegenden Zelllinien, Verfahren und Prionen-freien Produkte beschrieben werden, sollte es klar sein, dass diese Erfindung nicht auf bestimmte beschriebene Zelllinien, Verfahren oder Produkte beschränkt ist und natürlich variieren kann. Es sollte auch klar sein, dass die hier verwendete Terminologie nur dem Zwecke des Beschreibens von bestimmten Ausführungsformen dient und nicht beschränkend sein soll, da der Umfang der vorliegenden Erfindung einzig durch die anhängigen Ansprüche beschränkt ist.

Wenn nicht anders definiert, weisen alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung auf, wie sie üblicherweise für den Fachmann, dem diese Erfindung gehört, verständlich ist. Obwohl sämtliche Verfahren und Materialien, die denjenigen hier beschriebenen ähneln oder gleich sind; bei der Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden bevorzugte Verfahren und Materialien nun beschrieben.

Es sollte angemerkt werden, dass, wie hier und in den anhängigen Ansprüchen verwendet, die Singularformen „ein", „eine" und „der", „die", „das", wenn nicht im Kontext deutlich anders vorgeschrieben, die Pluralrepräsentanten einschließen. Folglich schließt zum Beispiel eine Bezugnahme auf „ein Konstrukt" eine Mehrzahl derartiger Konstrukte und eine Bezugnahme auf „eine Säugerzelle" die Bezugnahme auf eine oder mehrere Säugerzellen, Zelllinien und dem Fachmann bekannte Äquivalente davon usw. ein.

DEFINITIONEN

Der Begriff „isoliert" soll bedeuten, dass etwas von seiner natürlichen Umgebung abgetrennt ist. Ein isoliertes Protein ist nicht unbedingt von allen Materialien, in welchen es gewöhnlich vorliegt, abgetrennt und kann glykosyliert bleiben.

Die Begriffe „Therapeutikum" oder „therapeutisches Mittel" bedeuten, wie hier verwendet, im Allgemeinen ein beliebiges chemisches oder biologisches Molekül, das zum Erhalt einer gewünschten pharmakologischen, biologischen, physiologischen und/oder psychologischen Wirkung verwendet wird. Die Wirkung kann in Bezug auf das vollständige oder teilweise Verhindern einer Erkrankung oder eines Symptoms davon prophylaktisch oder in Bezug auf eine teilweise oder vollständige Ausheilung einer Erkrankung und/oder einer der Erkrankung zuschreibbaren nachteiligen Wirkung therapeutisch sein. Therapeutika decken, wie hier verwendet, jede beliebige Verbindung ab, die bei der Behandlung einer Erkrankung in einem Säuger, insbesondere einem Menschen verwendet wird, und schließen Zusammnensetzungen für Folgendes ein:

  • (a) Vorbeugen dessen, dass eine Erkrankung oder ein Symptom in einer Person auftritt, die für die Erkrankung oder das Symptom prädisponiert ist, es jedoch noch nicht diagnostiziert wurde, dass sie sie hat;
  • (b) Hemmen eines Erkrankungssymptoms, d.h. Stoppen seiner Entwicklung; oder
  • (c) Abbauen eines Erkrankungssymptoms, d.h. Bewirken einer Rückbildung der Erkrankung.

Der Begriff „Behandlung" bedeutet, wie hier verwendet, das Verabreichen eines „Therapeutikums" zum Erhalt aller oder jeglicher gewünschter Ergebnisse eines „Therapeutikums".

Ein „Knock-out" oder eine „Abtragung" eines Gens, wobei diese Begriffe hier austauschbar verwendet werden, bedeutet eine Abänderung in der Sequenz des Gens oder der mit dem Gen verbundenen Sequenz, die zu einer Verminderung der Funktion des Zielgens, vorzugsweise derart führt, dass eine Zielgenexpression nicht nachweisbar oder unbedeutend ist. Eine Abtragung eines endogenen PrP-Gens bedeutet, dass die Funktion eines beliebigen endogenen PrP-Gens im Wesentlichen derart vermindert wurde, dass die Expression nicht nachweisbar ist oder nur mit unbedeutenden Graden vorhanden ist. „Knock-out"-Transgene können transgene Tiere mit einem heterozygoten Knock-out des PrP-Gens (PrP+/0) oder einem homozygoten Knock-out des PrP-Gens (PrP0/0) sein. „Knock-outs" schließen auch bedingte Knock-outs ein, wobei die Abänderung des Zielgens zum Beispiel durch Aussetzen des Tieres einer eine Zielgen-Abänderung fördernden Substanz, Einbringen eines Enzyms, das die Rekombination an der Zielgen-Stelle fördert (z.B. Cre im Cre-lox-System), oder ein anderes Verfahren zum postnatalen Steuern der Zielgen-Abänderung stattfinden kann.

Der Begriff „Prnp-0/0" oder „Prnp-Ab1" bedeutet ein transgenes Tier, bei welchem sein PrP-Gen mit dem „0/0" abgetragen wurde, was darauf hinweist, dass beide Allele abgetragen wurden, wohingegen 0/+ darauf hinweist, dass nur eines abgetragen wurde. Insbesondere wird sich bei dem Tier im Allgemeinen auf eine transgene Maus, bei welcher ihr PrP-Gen abgetragen wurde, d.h. eine PrP-Knock-out-Maus bezogen. Dadurch, dass das PrP-Gen gestört ist, wird kein Mäuse-PrP-Protein exprimiert.

Der Begriff „Prion" soll ein infektiöses Teilchen bedeutet, von welchem es bekannt ist, dass es Erkrankungen (spongiforme Enzephalopathien) bei Menschen und Tieren verursacht. Der Begriff „Prion" ist eine Verbindung der Wörter „Protein" und „Infektion", und die Teilchen sind größtenteils, wenn nicht ausschließlich, aus PrPSc-Molekülen zusammengesetzt, die durch ein PrP-Gen kodiert werden, das PrP exprimiert, das seine Konformation ändert und zu PrPSc wird. Prionen unterscheiden sich von Bakterien, Viren und Viroiden. Bekannte Prionen schließen diejenigen ein, die Tiere unter Verursachung von Traberkrankheit, einer übertragbaren, degenerativen Erkrankung des Nervensystems von Schaf und Ziege, sowie boviner spongiformer Enzephalopathien (BSE) oder Rinderwahn-Krankheit, und feliner spongiformer Enzephalopathien von Katzen, infizieren. Vier Prionen-Erkrankungen, von welchen es bekannt ist, dass sie Menschen befallen, sind (1) Kuru, (2) die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD), (3) die Gerstmann-Strassler-Scheinker-Krankheit (GSS) und (4) die tödlich verlaufende familiäre Schlaflosigkeit (FFI). Wie hier verwendet, schließt Prion alle Formen von Prionen ein, die alle oder beliebige dieser Erkrankungen oder andere in beliebigen verwendeten Tieren und insbesondere in Menschen und in domestizierten landwirtschaftlichen Tieren verursachen. Prionen schließen alle infektiösen Varianten des PrPSc-Proteins ein.

Die Begriffe „PrP-Gen" und „Prionprotein-Gen" werden hier austauschbar verwendet, um genetisches Material zu beschreiben, das PrP-Proteine exprimiert. Der Begriff „PrP-Gen" bezieht sich im Allgemeinen auf ein beliebiges Gen einer beliebigen Spezies, die eine beliebige Form einer PrP-Aminosäuresequenz, einschließlich jegliches Prionprotein, kodiert. Einige allgemein bekannte PrP-Sequenzen sind in Gabriel et al., Proc. Natr. Acad. Sci. USA 89: 9097–9101 (1992) beschrieben.

Die Begriffe „standardisiertes Prionenpräparat", „Prionenpräparat", „Präparat" und dergleichen werden hier austauschbar verwendet, um Prionen enthaltende Zusammensetzungen zu beschreiben, wobei die Zusammensetzung vom Gehirngewebe von Säugern erhalten wurde, die im Wesentlichen dasselbe genetische Material wie in Verbindung mit PrP-Proteinen enthalten, z.B. Gehirngewebe von einer Gruppe von Säugern, die Anzeichen einer Prionenerkrankung zeigen, wobei die Säuger beliebige (1) eines PrP-chimären Transgens; (2) eines abgetragenen endogenen PrP-Gens; (3) einer hohen Kopiezahl von PrP-Genen von einer genetisch unterschiedlichen Spezies; oder (4) Hybriden mit einem abgetragenen endogenen PrP-Gen und einem PrP-Gen von einer genetisch verschiedenen Spezies umfassen können. Die Säuger, von welchen standardisierte Prionenpräparate erhalten werden, zeigen klinische Anzeichen einer ZNS-Dysfunktion infolge einer Impfung mit Prionen und/oder auf Grund ihrer genetisch modifizierten Beschaffenheit, z.B. eine hohe Kopienanzahl von PrP-Genen.

Die Begriff „abgetragenes PrP-Proteingen", „gestörtes PrP-Gen", „abgetragenes PrP-Gen", „PrP0/0" und dergleichen werden hier abwechselnd verwendet, um ein endogenes PrP-Gen zu bezeichnen, das in einer derartigen Weise abgeändert wurde (z.B. Zufügen und/oder Entfernen von Nukleotiden), dass das Gen unwirksam gemacht wurde. Beispiele für nicht-funktionelle PrP-Gene und Verfahren zu deren Herstellung sind in Büeler, H., et al. „Normal development of mice lackig the neuronal cell-surface PrP protein", Nature 356: 577–582 (1992), hier unter Bezugnahme eingebracht, offenbart. Beide Allele der Gene sind gestört.

Die Begriffe „resistent gegen eine Infektion", „resistent gegen eine Infektion mit Prionen" und dergleichen bedeuten, dass die Zellen ein abgeändertes PrP-Gen einschließen, das die Zelle für eine Prionenerkrankung resistent macht, wenn sie mit einer Prionenmenge und einem Prionentyp geimpft werden, von welchen es zu erwarten wäre, dass sie eine Prionenerkrankung verursachen, sollten die exponierten Zellen oder ein Produkt der exponierten Zellen in ein Tier derselben Spezies eingebracht werden.

Der Begriff „Prionen-frei" bedeutet, dass die Zusammensetzung keine zum Verursachen einer Infektion ausreichende Menge an Prionen (PrPSc) und vorzugsweise keine nachweisbare Menge an Prionen unter Verwendung von gängigen Nachweistechnologien und besonders bevorzugt überhaupt kein Prion enthält.

Die Begriffe „anfällig für eine Infektion" und „anfällig für eine Infektion durch Prionen" und dergleichen werden hier austauschbar verwendet, um Zellen zu beschreiben, die durch Prionen infiziert werden können, wobei die infizierten Zellen bewirken können, dass ein Einzeltier eine Erkrankung entwickelt, wenn es mit diesen infizierten Zellen oder in derartigen Zellen hergestellten Produkten geimpft wurde.

Der Begriff „Inkubationszeit" soll die Zeit von der Inokulation eines Tieres mit einem Prion bis zu der Zeit, wenn das Tier die ersten nachweisbaren Symptome einer aus der Infektion resultierden Erkrankung entwickelt, bedeuten. Eine reduzierte Inkubationszeit beträgt sechs Monate oder weniger, vorzugsweise etwa 75 Tage ± 25 Tage oder weniger, stärker bevorzugt etwa 30 Tage ± 10 Tage oder weniger.

Die Begriffe „genetisch verschiedenes Tier" und „genetisch verschiedener Säuger" werden verwendet, um ein Tier zu beschreiben, das eine native PrP-Kodonsequenz einschließt, die sich von dem genetisch verschiedenen Testtier durch 17 oder mehr Kodone, vorzugsweise 20 oder mehre Kodone, und besonders bevorzugt 28–40 Kodone unterscheidet. Folglich ist ein Mäuse-PrP-Gen in Bezug auf das PrP-Gen eines Menschen, eines Rinds oder eines Schafes genetisch verschieden, jedoch in Bezug auf das PrP-Gen eines Hamsters genetisch nicht verschieden.

Der Begriff „Antikörper" steht für ein Immunglobulinprotein, das ein Antigen binden kann. Antikörper bedeutet, wie hier verwendet, dass er den gesamten Antikörper sowie beliebige Antikörperfragmente (z.B. F(ab', Fab, Fv) einschließt, die das Epitop, Antigen oder antigene Fragment von Interesse binden können. Bevorzugte Antikörper für Tests der Erfindung sind immunreaktiv oder immunspezifisch für und binden deshalb spezifisch und selektiv an ein PrP-Protein. Antikörper, die sowohl für natives PrPC als auch behandeltes PrPSc, jedoch nicht für natives PrPSc immunreaktiv und immunspezifisch sind, sind bevorzugt. Antikörper für PrP sind vorzugsweise immunspezifisch – z.B. im Wesentlichen mit verwandten Materialien nicht kreuzreaktiv. Der Begriff „Antikörper" umfasst alle Typen von Antikörpern, z.B. polyklonale, monoklonale und diejenigen, die durch die Phagen-Display-Methodik hergestellt werden. Besonders bevorzugte Antikörper der Erfindung sind Antikörper, die einen relativ hohen Affinitätsgrad für das Zielantigen aufweisen.

„Gereinigter Antikörper" bezieht sich auf denjenigen, der ausreichend frei von anderen Proteinen, Kohlehydraten und Lipiden ist, mit welchen er auf natürliche Weise verbunden ist. Ein derartiger Antikörper „bindet vorzugsweise" an ein behandeltes oder denaturiertes PrPSc-Protein (oder ein antigenes Fragment davon) und erkennt oder bindet im Wesentlichen nicht antigenisch nicht verwandte Moleküle. Ein gereinigter Antikörper der Erfindung ist vorzugsweise mit einer spezifischen Spezies immunreaktiv und dafür immunospezifisch.

„Antigenes Fragment" eines Proteins (z.B. HER2/neu) bedeutet ein Teil eines derartigen Proteins, der einen Antikörper binden kann.

Der Begriff „bindet spezifisch" bedeutet eine hohe Avidität und/oder hohe Affinitätsbindung eines Antikörpers an ein spezifische Polypeptid, z.B. Epitop eines Proteins wie ein HER2/neu-Protein. Die Antikörperbindung an das Epitop an diesem spezifischen Polypeptid ist vorzugsweise stärker als die Bindung desselben Antikörpers an einem beliebigen anderen Epitop, insbesondere denjenigen, die in Molekülen in Verbindung oder in derselben Probe vorliegen können, da das spezifische Polypeptid von Interesse, z.B. stärker an Epitopfragmente eines Proteins wie HER2/neu, derart bindet, dass durch Einstellen von Bindungskonditionen der Antikörper nahezu ausschließlich an eine Epitopstelle oder Fragmente eines gewünschten Proteins, wie ein Epitopfragment, das durch die Behandlung von HER2/neu exponiert und verwandte Rezeptoren derselben Unterfamilie nicht exponiert ist.

ZELLEN MIT EINEM GESTÖRTEN PrP-GEN

Vorzugsweise ist das Produkt des PrP-Gens in Zellen, die im Verfahren der Erfindung verwendet werden, nicht nachweisbar, unbedeutend oder besonders bevorzugt gar nicht vorhanden. Ein Knock-out eines endogenen PrP-Gens bedeutet, dass die Funktion des PrP-Proteins im Wesentlichen derart vermindert wurde, dass eine PrP-Proteinexpression nicht nachweisbar ist oder nur mit unbedeutenden Graden vorliegt. Dies kann durch eine Vielzahl an Mechanismen, einschließlich der Einbringung einer Störung der Kodierungssequenz, z.B. Einfügen von einem oder mehren Stopp-Kodonen, Einfügen eines DNA-Fragments, Deletion einer Kodierungssequenz, Substitution von Stopp-Kodonen für eine Kodierungssequenz usw. erzielt werden. In manchen Fällen werden die exogenen Transgen-Sequenzen letztendlich aus dem Genom deletiert, wodurch eine Netto-Veränderung für die native Sequenz verbleibt. Verschiedene Vorgehensweisen können verwendet werden, um den „Knock-out" zu erzielen. Siehe die US-Patente 5,464,764, 5,627,059 und verwandte Patente und Veröffentlichungen von Capecchi et al. Eine chromosomale Deletion des gesamten oder eines Teils des nativen Gens, einschließlich Deletionen der nicht-kodierenden Regionen, insbesondere der Promoter-Region, von 3'-Regulationssequenzen, Verstärkern oder Gendeletionen, die eine Expression von PrP-Genen aktivieren, können herbeigeführt werden. Ein funktioneller Knock-out kann auch durch die Einbringung eines Anti-Sense-Konstrukts erzielt werden, das die Expression der nativen Gene blockiert (siehe zum Beispiel Li und Cohen (1996) Cell 85: 319–329). „Knock-outs" schließen auch bedingte Knock-outs ein, wo zum Beispiel die Abänderung des Zielgens durch Aussetzen eines Tieres einer Substanz, die eine Zielgen-Abänderung fördert, Einbringung eines Enzyms, das die Rekombination an der Zielgen-Stelle fördert (z.B. Cre im Cre-lox-System) oder andere Verfahren zum Steuern der Zielgen-Abänderung stattfindet.

Im Allgemeinen umfassen stellenspezifische die Rekombination erleichternde Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, eine beliebige Nukleotidsequenz, die die stellenspezifische Rekombination durch Wechselwirkung eines spezifischen Enzyms mit zwei derartigen stellenspezifischen die Rekombination erleichternden Sequenzen erleichtert. Beispielhafte stellenspezifische die Rekombination erleichternde Sequenzen schließen Folgendes ein, sind aber nicht unbedingt darauf beschränkt: PNS-Vektoren, wie beschrieben in US-Patent Nr. 5,627,059; lox-Sequenzen (durch das Cre-Enzym vermittelte Rekombination); frt-Sequenzen (Golic et al. (1989) Cell 59: 499–509 und O'Gorman et al. (1991) Sience 251: 1351–5); durch die FLP-Rekombinase vermittelte Rekombination; die Erkennungssequenzen für die pSR1-Rekombinase von Zygosaccharomyces rouxii (Matsuzaki et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 610–8); und dergleichen. Jedes davon kann zum Abändern von endogener PrP-Expression durch Stören des endogenen Gens, d.h. Bilden eines PrP-Knock-outs, und/oder durch Ersetzen des endogenen Gens mit einer induzierbaren Form von PrP, d.h. Bilden eines bedingten PrP-Knock-outs, verwendet werden.

Das exogene eingebrachte PrP-Gen kann ein Säuger-PrP-Gen sein, das funktionsfähig an einen induzierbaren Promoter gebunden ist. Der Begriff „funktionsfähig gebunden" bedeutet, dass eine DNA-Sequenz und (eine) Regulationsequenz(en) in derartiger Weise verbunden sind, dass sie eine Genexpression erlauben, wenn die entsprechenden Moleküle, z.B. Transkriptionsaktivator-Proteine, an die Regulationssequenz(en) gebunden sind. Ein derartiges induzierbares PrP-Gen wirkt als bedingter Knock-out, da eine Induktion von PrP umkehrbar gesteuert werden kann.

Spezifische Konstrukte von Interesse schließen Anti-Sense-PrP, das die native PrP-Expression blockiert, Expression von dominanten negativen PrP-Mutationen und Überexpression eines PrP-Gens ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Ein nachweisbarer Marker, wie lacZ, kann in den Locus eingebracht werden, in welchem eine Heraufregulierung der Expression zu einer leicht nachweisbaren Veränderung im Phänotyp führt. Konstrukte unter Verwendung der PrP-Promoterregion, in Kombination mit einem Reportergen oder mit der Kodierungsregion, sind ebenso von Interesse.

DNA-Konstrukte für eine homologe Rekombination umfassen mindestens einen Teil des PrP-Gens mit der gewünschten genetischen Modifikation und schließen Regionen mit Homologie zum Ziellocus ein. DNA-Konstrukte für eine statistische Integration müssen keine Homologieregionen einschließen, um eine Rekombination zu vermitteln. Günstiger Weise sind Marker für eine positive und negative Selektion eingeschlossen. Verfahren zum Bilden von Zellen mit Zielgenmodifikationen durch homologe Rekombination sind auf dem Fachgebiet bekannt. Für verschiedene Techniken zum Transfizieren von Säugerzellen siehe Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 527–537.

PrP-NUKLEINSÄUREZUSAMMENSETZUNGEN

Der Begriff „PrP" wird generisch verwendet, um PrP-Gene z.B. Homologe der Ratte, des Menschen, der Maus, des Meerschweinchens usw. und deren abgeänderte Formen zu bezeichnen. Allgemein verwendet, umfasst dieser Begriff verschiedene Isoformen, Polymorphismen, Variantsequenzen sowie mutierte Formen von PrP. Der Begriff soll auch den offenen Ableserahmen, der spezifische Polypeptide kodiert, Introne und benachbarte 5'- und 3'-nicht-kodierende Nukleotidsequenzen, die bei der Regulation der Expression beteiligt sind, bis zu etwa 1 kb unterhalb der Kodierungsregion, jedoch möglicherweise weiter in jeder der beiden Richtungen, bedeuten. Die PrP kodierenden DNA-Sequenzen können cDNA oder genomische DNA oder ein Fragment davon sein. Das Gen kann in einen geeigneten Vektor zur extrachromosomalen Beibehaltung oder zur Integration in die Wirtszelle eingebracht werden. Die Aminosäuresequenzen und DNA-Sequenzen für eine Anzahl von Tieren sind bekannt, siehe z.B. US-Patente Nr. 5,565,186; 5,763,740; 5,789,655; 5,792,901 und in diesen Patenten zitierte Publikationen für Sequenzen, Isoformen, Polymorphismen, Varianten und Mutationen.

Eine genomische Sequenz von Interesse umfasst die Nukleinsäure, die zwischen dein Initiierungskodon und dem Stoppkodon vorliegt, wie in den hier aufgelisteten Sequenzen und in den zitierten Patenten und Veröffentlichungen definiert, einschließlich aller Introne, die gewöhnlich im nativen Chromosom vorliegen. Sie kann des Weiteren die untranslatierten 3'- und 5'-Regionen einschließen, die in reifer mRNA zu finden sind. Sie kann des Weiteren spezifische Transkriptions- und Translations-Regulationssequenzen, wie Promoteren, Verstärker usw., einschließlich etwa 1 kb, jedoch möglicherweise mehr, an flankierender genomischer DNA entweder am 5'- oder am 3'-Ende der transkribierten Region einschließen. Die genomische DNA kann als Fragment mit 100 kbp oder kleiner isoliert und im Wesentlichen frei von flankierenden Chromosomsequenzen sein.

Die Sequenz dieser 5'-Region und weitere 5'-Stromaufwärtssequenzen und 3'-Stromabwärtssequenzen können für Promoterelemente, einschließlich Verstärkerbindungsstellen, die eine Expression in Geweben, in welchen PrP exprimiert wird, bereitstellen, verwendet werden. Die gewebespezifische Expression ist zum Bestimmen des Expressionsmusters und zum Bereitstellen von Promoteren, die das native Expressionsmuster nachahmen, nützlich. Natürlich vorkommenende Polymorphismen in der Promoterregion sind zum Bestimmen von natürlichen Variationen in der Expression, insbesondere denjenigen, die mit einer Erkrankung verbunden sind, nützlich. In einer anderen Ausführungsform können Mutationen in die Promoterregion eingebracht werden, um die Wirkung des Abänderns der Expression in experimentell definierten Systemen zu bestimmen. Verfahren zur Identifikation von spezifischen DNA-Motiven, die bei der Bindung von Transkriptionsfaktoren beteiligt sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt, z.B. Sequenzähnlichkeit zu bekannten Bindungsmotiven, Gelverzögerungsstudien usw. Siehe zum Beispiel Blackwell et al. (1995) Mol Med 1: 194–205; Mortlock et al. (1996) Genome Res. 6: 327–33; und Joulin und Richard-Foy (1995) Eur J Biochem 232: 620–626.

Die Regulationssequenzen können zum Identifizieren von cis-wirkenden Sequenzen, die für eine Transkriptions- oder Translationsregulation der PrP-Expression, insbesondere in verschiedenen Geweben oder Stufen der Entwicklung, erforderlich sind, und zum Identifizieren von cis-wirkenden Sequenzen und transwirkenden Faktoren, die die Expression regulieren oder vermitteln, verwendet werden. Derartige Transkriptions- oder Translationssteuerregionen können funktionsfähig an ein PrP-Gen gebunden werden, um eine Expression von Wildtyp oder abgeändertem PrP oder anderen Proteinen von Interesse in gezüchteten Zellen zu fördern oder zu verhindern.

Die Nukleinsäurezusammensetzungen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können die gesamten oder einen Teil der PrP-Polypeptide, wie geeignet, kodieren. Fragmente können von der DNA-Sequenz durch chemisches Synthetisieren von Oligonukleotiden gemäß herkömmlichen Verfahren, durch Restriktionsenzymverdau, durch PCR-Amplifikation usw. erhalten werden. Größtenteils bestehen die DNA-Fragmente aus mindestens 15 nt, überlicherweise mindestens 18 nt, noch üblicher mindestens etwa 50 nt. Derartig kleine DNA-Fragmente sind als Primer für PCR, Hybridisierungsdurchmustern usw. nützlich. Größere DNA-Fragmente, d.h. größer als 100 nt, sind zur Herstellung des kodierten Polypeptids nützlich. Zur Verwendung in Amplifikationsreaktionen wie PCR wird ein Primer-Paar verwendet.

Techniken zur Mutagenese in vitro von geklonten Genen sind bekannt. Beispiele für Protokolle zum Scannen von Mutationen sind in Gustin et al., 1993 Biotechniques 14: 22; Barany, 1985 Gene 37: 111–23; Colicelli et al., 1985 Mol Gen Genet 199: 537–9; und Prentki et al., 1984 Gene 29: 303–13 zu finden. Verfahren zur stellenspezifischen Mutagenese sind in Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, S. 15.3–15.108; Weiner et al., 1993 Gene 126: 35–41; Sayers et al., 1992 Biotechniques 13: 592–6; Jones und Winistorfer, 1992 Biotechniques 12: 528–30; Barton et al., 1990 Nucleic Acids Res 18: 7349–55; Marotti und Tomich, 1989 Gene Anal Tech 6: 67–70; und Zhu 1989 Anal Biochem 177: 120–4 zu finden. Zum Beispiel sind ein Hühner-, Rinder-, Schafs-, Ratten- und Mäuse-PrP-Gen in Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9097–9101 (1992) offenbart und veröffentlicht. Die Sequenz des Syrischen Hamsters ist in Basler et al., Cell 46: 417–428 (1986) veröffentlicht. Das PrP-Gen des Schafs ist von Goldmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2476–2480 (1990) veröffentlicht. Die PrP-Gensequenz für das Rind ist in Goldmann et al., J. Gen. Virol. 72: 201–204 (1991) veröffentlicht. Die Sequenz für das Hühner-PrP-Gen ist in Harris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7664–7668 (1991) veröffentlicht. Die PrP-Gensequenz für den Nerz ist in Kretzschmar et al., J. Gen. Virol. 73: 2757–2761 (1992) veröffentlicht. Die menschliche PrP-Gensequenz ist in Kretzschmar et al., DNA 5: 315–324 (1986) veröffentlicht. Die PrP-Gensequenz der Maus ist in Locht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6372–6376 (1986) veröffentlicht. Die PrP-Gensequenz für das Schaf ist in Westaway et al., Genes Dev. 8: 959–969 (1994) veröffentlicht. Diese Veröffentlichungen sind alle hier unter Bezugnahme eingebracht, um die PrP-Gen- und PrP-Aminosäure-Sequenzen zu offenbaren und zu beschreiben.

TETRACYCLIN-INDUZIERBARES SYSTEM

Die Tetracyclin(tet)-regulierten Transaktivierungssysteme zur induzierbaren Genexpression erlauben die zeitliche und quantitative Steuerung von exogenen Genen in Säugerzellen, transgenen Mäusen und Pflanzen. Für eine Übersicht siehe Shockett, PNAS 43: 5173–5176 (1996), hier unter Bezugnahme eingebracht. Das bahnbrechende tet-regulierte Genexpressionssystem umfasste eine konstitutive Expression des tet-Transaktivatorproteins (tTA) mit dem unmittelbarenfrühen(IE) Promoter/Verstärker des Cytomegalovirus (CMV). tTA ist ein Vereinigungsprotein, das aus dem tet-Repressor von Escherichia coli und der Transkriptionsaktivierungsdomäne von dem VP16-Protein des Herpes-simplex-Virus zusammengesetzt ist. In Abwesenheit von Tetracyclin vermittelt der tet-Repressor-Teil des tTA eine hohe Affinitätsbindung an Sequenzen von des tet-Resistenzoperators von Tn10 (tetO). In Gegenwart von Tetracyclin verhindert eine konformationelle Veränderung im tet-Repressor, dass sich tTA an seinen Operator bindet.

Ein modifiziertes System wurde unter Verwendung eines Umkehr-Transaktivators (rtTA), der tetO effizient nur in Gegenwart der tet-Derivate Doxycyclin oder Anhydrotetracyclin bindet, ebenso entwickelt. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass dieses System in Situationen, in welchen Zellen oder Individuen für längere Zeitdauern in einem repressierten Zustand gehalten werden, und in welchen eine lang anhaltende Aussetzung gegenüber tet oder eines seiner Derivate unerwünscht war, oder in Situationen, die eine schnelle Induktion erfordern, besonders nützlich ist.

Obwohl sich die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch ein Tetracyclin-induzierbares System, betrieben durch den CMV-Promoter, auszeichnet, können auch andere Verfahren zur Freisetzung der tet-regulierten Gene und andere resistente Faktoren verwendet werden. Zum Beispiel können virale Vektoren, die entweder durch den SV40-Promoter, durch Glialzell-spezifische Promoteren oder durch das autonome Parvovirus LuIII betrieben werden, zum Exprimieren von tTA verwendet werden. Diese und andere ähnliche Systeme können in der vorliegenden Erfindung ohne Abweichung vom Geist der Offenbarung, wie es dem Fachmann klar ist, verwendet werden. Zum Beispiel können Systeme wie Ecdysom-induzierbare Systeme anstelle der Tetracyclin-induzierbaren Systeme verwendet werden.

HERSTELLUNG VON ANTIKÖRPERN

Antikörper werden gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt, in welchen das exprimierte Polypeptid oder Protein als Immunogen, für sich allein oder konjugiert an bekannte immunogene Träger, z.B. KLH, pre-S HBsAg, andere virale oder eukaryotische Proteine oder dergleichen, verwendet wird. Verschiedene Hilfsstoffe können mit einer Reihe von Injektionen wie geeignet eingesetzt werden. Für monoklonale Antikörper wird nach einer oder mehreren Verstärker-Injektionen die Milz isoliert, die Lymphozyten durch Zellvereinigung immortalisiert und dann auf hohe Affinitäts-Antikörperbindung durchgemustert. Die immortalisierten Zellen, z.B. Hybridome, die die gewünschten Antikörper herstellen, können dann verlängert werden. Für eine weitere Beschreibung siehe Monoclonal Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, 1988.

Nach der Identifizierung eines geeigneten monoklonalen Antikörpers als potenzielles therapeutisches Mittel muss der Antikörper zur Verwendung in dem Einzelorganismus angepasst werden. Eine Abänderung des Antikörpers zur Angleichung der Einzelspezies an das Immunsystem dient zwei grundlegenden Funktionen: Sie vermindert die Möglichkeit einer beträchtlichen Gegenreaktion der Wirtsimmunantwort auf den therapeutischen Antikörper und erhöht die therapeutische Aktivität des Antikörpers, da die Aktivität weniger wahrscheinlich durch das Wirtsimmunsystem neutralisiert wird. Zum Beispiel werden Antikörper, die als Humantherapeutika verwendet werden, routinemäßig „humanisiert", bevor sie zur Behandlung von menschlichen Leiden verwendet werden.

Es gibt viele Vorgehensweisen zum Humanisieren von monoklonalen Antikörpern, wobei jede davon einen umgeformten menschlichen Antikörper aufbaut und konstruiert, der den Mäuse-Antikörper nachahmt. Zum Beispiel basiert eine Vorgehensweise auf dem Aufbau des menschlichen Antikörpers auf der am meisten homologen Konsenssequenz. Eine andere Vorgehensweise basiert auf dem Aufbau auf dem am meisten homologen menschlichen Antikörper. Beide dieser Vorgehensweisen verwenden Primatenzellkulturen und tragen deshalb das Risiko der Kontamination mit PrPSc und einer möglichen Infektion von Menschen, die mit derartigen Therapeutika behandelt wurden. Eine Eliminierung des endogenen PrP-Gens in zum Humanisieren dieser Antikörper verwendeten Zelllinien kann dieses Geschehen verhindern.

BEISPIELE

Die folgenden Beispiele sind dargelegt, um dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung darüber bereitzustellen, wie die vorliegende Erfindung durchzuführen und zu verwenden ist, und soll weder den Umfang dessen, was als die Erfindung betrachtet wird, nicht beschränken, noch soll sie darstellen oder implizieren, dass die dargestellten Versuche alle oder die einzigen durchgeführten Versuche sind. Bemühungen wurden durchgeführt, um in Bezug auf die verwendeten Zahlen (z.B. Mengen, Temperatur, Konzentrationen usw.) Genauigkeit zu gewährleisten, jedoch sollten einige Versuchsfehler und Abweichungen gewährt werden. Wenn nicht anders angegeben, sind Teile Gewichtsteile, ist das Molekulargewicht das mittlere Molekulargewicht, ist Temperatur in Grad Celsius und ist der Druck bei oder in der Nähe von Atmosphärendruck.

BEISPIEL 1 HERSTELLUNG VON HUMANTHYROTROPIN

Es zeigte sich, dass die Gegenwart und spezifische Struktur von Einheiten wie Oligosacchariden auf bestimmten Proteinen sowohl für die Herstellung als auch die Bioaktivität dieser Proteine wichtig ist. Da die Kohlenhydratstruktur eines Proteins teilweise durch die Glycosylierungsapparatur der Zellen bestimmmt wird, in welchen das Protein hergestellt wird, beeinflusst der Typ der dieses Protein herstellenden Wirtszelle direkt die Aktivität in vivo des Proteins. Es ist folglich wünschenswert, dass Proteine, die eine bestimmte Kohlenhydratzusammensetzung erfordern, in Zellen hergestellt werden, die die Apparatur enthalten, die zum Bereitstellen einer richtigen post-translationalen Modifikation nötig ist.

Da die Zellapparatur, die die post-translationale Modifikation steuert, sogar zwischen Zellen von verschiedenen Säugerspezies variiert, werden einige Humanproteine vorzugsweise in Primatenzellen hergestellt. Eine Gruppe von Proteinen, die für derartige Modifikationen empfindlich sind, sind die Hypophysen- und chorionischen Glycoproteinhormone. Zum Gewährleisten der Sicherheit dieser Proteine in Bezug auf eine Prioneninfektiösität, können diese Proteine in Zellen ohne ein funktionsfähiges Humanprionprotein hergestellt werden. Eine Herstellung dieser Proteine unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung wird folglich vorzugsweise in geeigneten Prionen-freien Zellen durchgeführt.

Herstellung einer humanen neuronal abgeleiteten PrP-Knock-out-Zelllinie

Die Neuroblastom-Zelllinie N2a ist ein Zelltyp, der in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um richtig modifizierte Humanproteine herzustellen. Die Aktivität des endogenen PrP-Gens in der N2a-Zelllinie wird unter Verwendung der wie in US-Patent Nr. 5,627,059 beschriebenen homologen Rekombinationstechnologie eliminiert. Das '059-Patent verwendet einen PNS-Vektor, der aus einem Vierkomponenten-Konstrukt zusammengesetzt ist: einer ersten und zweiten Sequenz, die zu Sequenzen im PrP-Gen homolog sind; einer positiven Selektions-DNA-Sequenz, die zwischen der ersten und der zweiten homologen Sequenz eingefügt ist; und eine negative Selektionssequenz, die an eine der beiden Seiten der homologen Sequenzen gebunden, jedoch nicht zwischen den beiden positioniert ist. Unterziehen sich die erste und zweite homologe Sequenz einer homologen Rekombination mit den homologen Zielsequenzen im PrP-Gen, wird die positive Selektionssequenz eingefügt, während die negative Sequenz nicht eingefügt wird. Zellen ohne die positive Selektionssequenz unterziehen sich keiner Rekombination am PrP-Locus, und Zellen mit den negativen Selektionssequenzen weisen eine eingefügte Sequenz im Genom auf, unterziehen sich jedoch keiner homologen Rekombination am PrP-Gen. N2a-Zellen mit einem gestörten PrP werden folglich durch eine homologe Rekombination durch die Gegenwart der positiven Selektionssequenzen und Abwesenheit der negativen Selektionssequenz selektiert.

Die N2a-Zellen mit dem gestörten PrP-Gen werden zur Verwendung zur Herstellung des Humanthyrotropins ausgewählt. Da diese Zellen das endogene PrP-Gen nicht enthalten, besteht für sie kein Risiko einer Infektion durch die PrPSc-Form des Proteins mehr. Diese N2a-Zellen können folglich als „Prionen-freie" Zelllinie klassifiziert werden, und die in dieser Zelllinie hergestellten Produkte können ebenso als „Prionen-frei" charakterisiert werden, was bedeutet, dass die aus derartigen Prionen-freien Zelllinien hergestellten Produkte für Personen, die eine Therapie in vivo unter Verwendung der aus diesen Zelllinien hergestellten Produkte erhielten, kein Risiko darstellen.

Herstellung von Humanthyrotropin in der PrP-Knock-out-Zelllinie

Human-TSH ist ein Vertreter der Hypophysen- und chorionischen Glycoprotein-Hormone und enthält zwei nicht-kovalent gebundene Untereinheiten, &agr; und &bgr;. Zur Herstellung von hTSH werden eine Komplementär-DNA für Human-Choriogonadotropin &agr; und ein hTSH-&bgr;-Minigen, beschrieben in Wondisford et al. (1988) Mol Endocrin 2: 32–39, gemeinsam in die Prionen-freien N2a-Zellen kotransfiziert. Stabile Transfektanten mit hohen TSH-Herstellungsraten werden ausgewählt. Das exprimierte TSH wird chromatografisch auf Blue-Trisacryl M (IBF Biotechnics, Savage, MD), Q-Sepharose-Fast-Flow und S-Sepharose-Fast-Flow (beide von Pharmacia, Piscataway, NJ) aus den Kulturüberständen gereinigt. Die endgültige Reinheit des isolierten TSH beträgt im Allgemeinen mehr als 97%.

BEISPIEL 2 HERSTELLUNG EINES PROTEINS IN EINER MENSCHLICHEN ZELLLINIE MIT INDUZIERBAREM PrP

Bestimmte Zelllinien können für die Gegenwart von PrP empfindlich sein, und es kann folglich wünschenswert sein, eine PrP-Expression zu bestimmten Zeitpunkten der Züchtung der Zelllinie, z.B. während des Etablierens der PrP-Kock-out-Zelllinie oder für Selektionszwecke, vorzuweisen. Dazu erlaubt eine Zelllinie ohne endogenes PrP, jedoch mit einem induzierbaren PrP-Gen die Expression von PrPc während notwendiger Züchtungsperioden der Zelllinie, erlaubt dann jedoch, dass die Zellen zur Herstellung von Therapeutika Prionen-frei sind. Diese Zelllinien können durch Einfügen eines induzierbaren Prion-Transgens in die parentale Zelllinie und anschließendes Stören der endogenen Form des PrP-Gens hergestellt werden.

Ersatz des endogenen PrP-Gens durch ein induzierbares PrP-Gen

Zur Herstellung von HeLa-Zellen mit dem endogenen PrP-Gen, das mit einem induzierbaren Transgen ersetzt ist, werden lox-Stellen kodierende Sequenzen zum Fördern von stellenspezifischer Rekombination verwendet. Eine lox-Stelle ist eine Nukleotidsequenz, an welcher das Genprodukt des cre-Gens, hier als „Cre" bezeichnet, die stellenspezifische Rekombination katalysiert. Eine besonders bevorzugte lox-Stelle ist eine loxP-Stelle. Die Sequenz von loxP, die 34 bp lang ist, ist bekannt und kann synthetisch hergestellt oder aus Bakteriophage P1 durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren isoliert werden (siehe z.B. Hoess et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3398). Die loxP-Stelle ist aus zwei umgekehrten Wiederholungen mit 13 bp, die durch eine Spacerregion mit 8 bp voneinander getrennt sind, zusammengesetzt. Die Nukleotidsequenzen der Einfügungswiederholungen und der Spacerregion von loxP lauten wie folgt:

Andere geeignete lox-Stellen schließen loxB, loxL und loxR ein, die aus E. coli isoliert werden können (Hoess et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 22: 3398). Vorzugsweise ist die verwendete lox-Stelle entweder loxP oder loxC2. Die Nukleotidsequenzen der Einfügungswiederholungen und der Spacerregion von loxC2 lauten wie folgt:

Die stellenspezifischen die Rekombination erleichternde Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können entweder eine natürlich vorkommende Sequenz oder eine modifizierte Sequenz sein. Zum Beispiel beschreibt die veröffentlichte PCT-Anmeldung Nr. WO 93/19172 Phagenvektoren, in welchen die VH10-Gene von zwei loxP-Stellen eingegrenzt sind, von welchen eine eine mutante loxP-Stelle (loxP511) ist, in welchen das G an der siebten Position in der Spacerregion von loxP durch ein A ersetzt ist, wodurch eine Rekombination im Vektor durch bloßes Exzidieren der VH-Gene verhindert wird. Allerdings können sich zwei loxP511-Stellen sich über Cre-vermittelte Rekombination rekombinieren und deshalb in Gegenwart von einer oder mehreren lox-Stellen vom Wildtyp selektiv rekombiniert werden. Die Nukleotidsequenzen der Einfügungswiederholungen und der Spacerregion von loxP511 lauten wie folgt:

Lox-Stellen können auch durch eine Vielzahl von auf dem Fachgebiet bekannten Synthetisetechniken hergestellt werden. Zum Beispiel sind Synthesetechniken zur Herstellung von lox-Stellen von Ogilvie et al. (1981) Science, 21A: 270 offenbart.

Das lox-Ziel wird in das Genom von gezüchteten HeLa-Zellen unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren eingesetzt. Das lox-Neo-Ziel wird in die HeLa-Zellen durch Elektroporieren von 107 Zellen in 0,8 ml mit 1 &mgr;g eines stellenspezifischen Integrationsvektors, pSFI, enthaltend loxP-Sequenzen und eine unmodifizierte Neo-Gen-Sequenz eingesetzt (Fukushige (1992) PNAS 89: 7905–7909). Die Elektroporation verwendet einen einzelnen Puls von 450 V bei 500 &mgr;F von einem BioRad-Gen-Pulsgeber. Einen Tag später werden die Zellen in einem mit 15% dialysiertem fötalem Rinderserum ergänzten &agr;-Medium, welchem Desoxyribonukleoside und Ribonukleoside fehlen, auf Wachstum selektiert.

Die Cre-vermittelte Integration der lox-Zielvektoren verwendete dieselben Elektroporationsbedingungen mit 10 &mgr;g Zielvektor und 20 &mgr;g der Zielkonstrukte. Zielkonstrukte, die den offenen HuPrP-Ableserahmen enthalten, werden durch Klonen eines promoterlosen genomischen Fragments stromabwärts von dem heptamerisierten Tetracyclin-Operator in den pUHD10-3-Vektor erhalten, um tetO-HuPrP zu erhalten. Das tetO-HuPrP-Fragment wird anschließend in den Vektor pBS226 hinter dem hCMV-Promoter geklont. Jede elektroporierte Probe wird in eine Kulturschale mit 10 cm aufgestrichen. Zwei Tage später werden die Zellen in Medium mit G418 (400 &mgr;g/ml) auf ihr Wachstum selektiert. Die Koloniebildung wurde 12 Tage später beurteilt, und einzelne Klone wurden auf Grund der Verlängerung selektiert. Die Antibiotika Doxycyclin oder Minocyclin sind beides wirkungsvolle Repressoren für die tTA-abhängigen LacZ-Aktivität, und jedes der beiden drückt, wenn es auf eine Konzentration von 1 &mgr;g/ml zum Zeitpunkt der Transfektion zugesetzt wird, die PrPc-Gehalte. Zelllinien mit stabiler HuPrP-Bildung werden unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Techniken ausgewählt.

Zur Herstellung von Prionen-freien Proteinen in den PrP-induzierbaren Zelllinien sollten die Zellen für eine vorbestimmte Anzahl an Durchgängen frei von Tetracyclin wachsen, um zu gewährleisten, dass keine nachweisbare PrP-Expression in diesen Zellen vorliegt. Komplementär-DNA von einem Humanprotein kann dann in die HeLa-Zellen transfiziert werden, und stabile Transfektanten können selektiert werden. Das Protein von Interesse kann aus diesen Zellen durch eine Anzahl an allgemein vom Fachmann verwendeten Verfahren isoliert werden.

BEISPIEL 3 HERSTELLUNG VON HER-2/NEU-ANTIKÖRPERN IN PRION- RESISTENTEN HYBRIDOMEN

Zur Herstellung von Antikörpern in Zellen, die gegen eine Prioneninfektion resistent sind, kann das endogene Mäuse-PrP-Gen in der Hybridomreihe gestört werden. Das endogene PrP-Gen wird vorzugsweise nach einer Fusion gestört, jedoch kann dies entweder vor oder nach dem Etablieren der Hybridom-Zelllinien stattfinden. Das endogene PrP-Gen wird unter Verwendung eines Vektors auf der Basis eines Adeno-assoziierten Virus (AAV) gestört, welches homologe humane Chromosom-Zielsequenzen effizient modifizieren kann. Das verwendete Protokoll ist in Russel und Hirata (1998) Nat. Gent 18: 325–330, hier unter Bezugnahme eingebracht, erläutert. Der Vektor enthält zu dem Mäuse-PrP-Gen homologe Sequenzen in ausreichender Menge zur genauen homologen Rekombination, jedoch kodieren diese Sequenzen kein funktionelles PrP-Gen.

Immunisierung von Mäusen mit HER-2/NEU-Antigen

Sechs weibliche BALB/c-Mäuse werden intraperitoneal zur anfänglichen Antikörperherstellung immnunisiert. Für jede Maus enthält die Injektionslösung 250 &mgr;l kompletten Freund-Hilfsstoff, gemischt mit 250 &mgr;l zubereiteter HER-2/NEU-Antigenlösung. Die Injektion kann zwischen 1 und 200 &mgr;g des Antigens enthalten, und das Antigen kann an ein kleines immunogenes Hapten oder ein großes immunogenes Protein, wie Hämocyanin, kovalent gebunden sein oder auch nicht. Nach zwei Wochen wird jedem Tier eine Verstärkungsdosis einer ähnlichen Menge, jedoch unter Verwendung von 250 &mgr;l inkompletter Freund als Hilfsstoff verabreicht.

Am 24. Tag wird das Blut aus dem Schwanz der Mäuse entnommen, um auf eine Immunantwort auf das Antigen zu testen. Das Blut wird 1:5 in PBS verdünnt, und Proben von jeder Maus werden mit ähnlichen Verdünnungen einer nicht-immunisierten Kontrollmaus in einem Test zum Bestimmen einer Immunantwort, wie einem Dot-Blot-Test, verglichen. Am 35. Tag wird jedem Tier 250 &mgr;l inkompletter Freund injiziert, und am 45. Tag wird wiederum Blut aus dem Schwanz entnommen und Serumproben durch Immunpräzipitation gegen ein in vivo radiomarkiertes HER-2/NEU-Antigenpräparat durchgemustert. Den Tieren mit Serum, das stark auf das Antigen antwortet, wird am 56. Tag 100 &mgr;l Antigenlösung intravenös und 100 &mgr;l Antigen-Lösung intraperitoneal injiziert. Am 59. Tag werden die Splenozyten von denjenigen mit starkem Ansprechverhalten mit einer BALB/c-Myelom-Zelllinie vereinigt.

Vereinigung von Myelomen und Splenozyten zur Bildung von Hybridomen

Die Prionen-resistenten Hybridomlinien, die die HER-2/NEU-Antikörper herstellen, werden nach der Vereinigung der Splenozyten, die die HER-2/NEU-Antikörper herstellen, mit der Myelom-Zelllinie gebildet. Die Vereinigung kann durch jedes beliebige dem Fachmann bekannte Vereinigungsmittel und vorzugsweise durch Polyethylenglycol bewirkt werden. Die im Vereinigungsverfahren verwendeten Myelomzellen tragen eine Mutation in dem Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferasegen (HPRT), und folglich werden immortalisierte Zellen, die sich einer Vereinigung mit den Splenocyten unterzogen, durch die Zugabe einer beliebigen Verbindung, die den neuen Nukleotid-Syntheseweg blockiert, wie Methotrexat oder Aminopterin, selektiert. Verbundene Zellen, die eine derartige Durchmusterung überleben, werden verlängert.

Abtragung des PrP-Gens in den HER-2/NEU-Hybridomreihen

Das endogene Gen oder die endogenen Gene der Hybridomzelllinie kann (können) unter Verwendung eines Konstrukts, das ein grün fluoreszierendes Bindungsprotein (GFP) unter der Steuerung eines Säugerpromoters oder -verstärkers, vorzugsweise CMV-IE, kodiert, gestört werden. GFP ist ein Reportergen, das kein Substrat zum Nachweis benötigt, und kann als Marker für die transgenen Zellen verwendet werden. Das das GFP-Transgen tragende Konstrukt kann wie in Takada, et al., „Selective Production of Transgenic Mice Using Green Fluorescent Protein as a Marker", Nature Biotechnology (1997) 15: 458–461, hier unter Bezugnahme eingebracht, veranschaulicht, vorliegen. Die Störung des endogenen PrP-Gens unter Verwendung eines derartigen Verfahrens kann eine leichte Identifizierung von Kandidaten-Zellpopulationen erlauben, in welchen das homologe Rekombinationereignis auftrat, und die Selektion kann unter Verwendung von traditionelleren Verfahren, wie Southern-Blot-Analyse, bestätigt werden.

Die Aktivität des endogenen PrP-Gens in den selektierten Hybridomen, die die monoklonalen HER-2/NEU-Antikörper exprimieren, kann unter Verwendung der wie in US-Pat. Nr. 5,627,059 und vorstehend in Beispiel 1 beschriebenen homologen Rekombinationstechnologie abgetragen werden. Die Hybridomzellen mit dem gestörten PrP-Gen werden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops selektiert. Die Hybridomzellen, die den GFP exprimieren, können klonal verlängert werden, und die klonale Population kann anschließend auf die Gegenwart von endogenem PrPc durchgemustert werden. Hybridomzellen ohne restliche exprimierte PrP-Sequenzen können als „Prionen-frei" klassifiziert werden, und die daraus hergestellten Antikörper sollten kein Infektionsrisiko darstellen.

BEISPIEL 4 HUMANISIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN GEGEN HER-2/NEU

Die cDNA, die für den monoklonalen Mäuse-Antikörper kodiert, der HER-2/neu erkennt (hiernach „ANTI-NEU"), wird durch PCR derart modifiziert, dass sie EcoRI- und Kozak-Sequenzen am 5'-Ende und HindIII-Stellen oder Spalt-Donor-Sequenzen am 3'-Ende aufweist (siehe z.B. Maeda et al. (1991) Hum. Antibod. Hybridomas 2: 124–134; Kettleborough et al., (1991) Protein Engng 4: 773–783). Die V-Regionen werden dann an die Gene, die humane konstante Regionen unter der Kontrolle der 1-&agr;-Promoter-Verstärker-Region (HEF) des humanen Verlängerungsfaktors kodieren, gebunden, wobei VL an die humane kappa-konstante Region und VH an die gamma-1-konstante Region gebunden wird.

Das für die neu gestaltete ANTI-NEU-VL-Region kodierende Gen wird durch CDR-Pfropfverfahren auf PCR-Basis, wie in Sato et al., „Humanization of a Mouse Anti-Human Interleukin-6 Receptor Antibody Comparing Two Methods for Selecting Human Framework Regions", Mol. Immunol. (1994) 31: 371–381, veranschaulicht, konstruiert. Acht PCR-Primer werden aufgebaut. Die externen Primer A und H hybridisieren zu DNA-Sequenzen im pUC19-Vektor, in welchen die cDNA, die den humanisierten ANTI-NEU-Antikörper kodiert, geklont wird, und jeder kodiert eine andere Endonuklease-Restriktionsstelle für Klonzwecke. Die CDR-Pfropf-Primer B, C, D weisen die DNA-Sequenzen auf, die für CDR1, CDR2 bzw. CDR3 der Mäuse-ANTI-NEU-variablen Regionen kodieren. Die Komplementär-Primer E, F und G bestehen aus 15–20 Basen, bei welchen es sich um Komplementär-DNA-Sequenzen an der 5'-Seite der Primer B, C bzw. D handelt. Im ersten PCR-Schritt werden vier Reaktionen, die Reaktionen A–E, B–F, C–G und D–H, unter Verwendung von humanen leichtkettigen Sequenzen, die in pUCl9 als Templat geklont sind, durchgeführt. In einem zweiten Schritt werden die vier PCR-Produkte aus dem ersten PCR-Schritt durch ihre eigene Komplementarität zusammengebaut. Externe Primer werden dann der Reaktion zugesetzt, und das DNA-Produkt mit vollständiger Länge wird amplifiziert. Das PCR-Endprodukt wird mit den geeigneten Restriktionsendonukleasen verdaut und in einen pUC19-Vektor geklont. Nach dem Sequenzieren des PCR-Produkts zur Bestätigung, wird es in den HEF-Expressionsvektor geklont.

Das Gen, das die neu gestaltete ANTI-NEU-VH-Region kodiert, wird ebenso unter Verwendung des vorstehend beschriebenen CDR-Pfropfverfahrens, unter Verwendung einer dementsprechenden Aminosäuresequenz für humane VH-Regionen, die zur Untergruppe I (HSG-I) gehören, konstruiert. Diese Sequenz wird ebenso in den HER-Expressionsvektor geklont.

Die Aktivität des endogenen PrPc-Gens in der COS-Zelllinie wird unter Verwendung der homologen Rekombinationstechnologie, wie in Beispiel 1 beschrieben, eliminiert. COS-Zellen mit einem gestörten PrP-Gen werden folglich für die auf Grund der Störung des PrP-Gens durch homologe Rekombination durch die Gegenwart der positiven Selektionssequenzen und Abwesenheit der negativen Selektionssequenz selektiert. Die COS-Zellen mit dem gestörten PrP-Gen werden dann zur Herstellung der humanisierten Antikörper verwendet. Da diese Zellen das endogene PrP-Gen nicht enthalten, stellen sie kein Infektionsrisiko durch die PrPSc-Form des Proteins mehr dar. Diese COS-Zellen werden folglich als „Prionen-freie" Zelllinie klassifiziert, und die in dieser Zelllinie hergestellten Produkte können ebenso als „Prionen-frei" charakterisiert werden, was bedeutet, dass die aus derartigen Prionen-freien Zelllinien hergestellten Produkte für Personen, die eine in-vivo-Therapie unter Verwendung von aus diesen Zelllinien hergestellten Produkten erhielten, kein Risiko mehr darstellen.

Die leicht- und schwerkettigen Expressionsvektoren werden in die COS-PrP-Knock-out-Reihe durch Elektroporation kotransfiziert. Gleiche Mengen jeder Plasmid-DNA (10 &mgr;g) werden zu 0,8 ml Zellen, suspendiert in PBS mit 1 × 107 ml–1, zugesetzt. Ein Puls wird bei einer Kapazitanz von 1,9 kV, 25 &mgr;F unter Verwendung einer Gen-Pulsgeber-Apparatur (BioRad) abgegeben. Nach einer Erholungsdauer von 10 Minuten bei Raumtemperatur werden die elektroporierten Zellen zu 20 ml DMEM, enthaltend 10% Gammaglobulin-freies fötales Kälberserum (GIBCO), zugesetzt. Nach einer 2-stündigen Inkubation wird das Medium aufgefangen, zentrifugiert, um Zelldebris zu entfernen, und auf eine Protein-A-Agarosesäule (Affi-Gel Protein A MAPSII-Kit, BioRad), äquilibriert mit einem Bindungspuffer, aufgebracht. Das Eluat wird eingeengt und der Puffer unter Verwendung eines Mikrokonzentrators zu PBS gewechselt.

BEISPIEL 5 HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN GEGEN SC-1

Es kann gefunden werden, dass die Hybridomzelllinien effizienter mit eingeschränkter PrP-Expression wachsen, und dazu kann es erwünscht sein, eine modulierte PrP-Expression in den Hybridomzellen vorzuweisen. Dies kann durch Ersetzen des in den Hybridomzellen vorgefundenen endogenen PrP-Gens durch ein Transgen, enthaltend ein induzierbares PrPc-Protein, das für die Herstellung der Antikörper unterdrückt werden kann, erzielt werden: Die endogene Hybridom-PrP-kodierenden Sequenzen werden unter Verwendung von stellenspezifischer Einfügung eines Transgens, kodierend ein induzierbares PrPc-Protein, ersetzt. Diese Vorgehensweise beinhaltet ein Gen-Targeting zum Einbringen einer FRT-Stelle in die genomische Region, enthaltend die endogenen PrP-Sequenzen, zum Bilden einer „transgenen Akzeptorstelle", gefolgt von einer Einzelkopie-Einfügung des Transgens in die Ziel-FRT-Stelle unter Verwendung von FRT-Rekombinase (siehe z.B. Wigley et al., Reprod. Fertil. Dev.).

Eine Kassette wird hergestellt, um das induzierbare PrP-Gen in das Hybridom-Genom einzufügen und in den PrP-Locus der Hybridomzellen einzufügen. Diese Kassette enthält ein voll funktionsfähiges Neomycin-Resistenzgen, das von direkten Wiederholungen der FRT-Stelle eingegrenzt ist. Das Neo-Gen wirkt als positiver Selektionsmarker, und die Zielereignisse können durch Southern-Blot-Analyse überwacht werden, um zu gewährleisten, dass keine endogenen PrP-Sequenzen übrig bleiben. Sobald dies erzielt wurde, werden die Hybridomzellen mit einer Quelle von FLP-Rekombinase transfiziert, um das Neo-Gen zu exzidieren. Dies bildet eine einzelne FRT-Stelle an einem einzelnen PrP-Locus, und der Verlust an Neo-Sequenzen kann durch Southern-Analyse überwacht werden. FLP-Rekombinase wird zum Einfügen einer einzelnen Kopie des induzierbaren PrP-Gens in die neu geschaffene FRT-Stelle verwendet. Dies beinhaltet die Kotransfektion eines Plasmids, das eine FLP-Quelle enthält, und eines Plasmids, das die induzierbaren PrP-Sequenzen, gebunden an ein einzelnes FRT, enthält.

BEISPIEL 6 HUMANISIERUNG VON MONOKLONALEN ANTIKÖRPERN GEGEN SC-1

Das Gen, das für die neu gestaltete SC-1-VL-Region kodiert, wird unter Verwendung des CDR-Pfropfprotokolls von Beispiel 4 konstruiert und in einen HER-Expressionsvektor eingeschlossen.

Die schwerkettige Region wird auf der Basis der Aminosäuresequenz der humanen HAX-VH-Region, wie beschrieben in Dersimoninan et al. (1987) J. Immun. 139: 2496–2501, aufgebaut. Zuerst wird die Mäuse-SC-1-VH-Sequenz mit der humanen HAX-VH-Sequenz verglichen, und ein humanes SC-1-VH aufgebaut, um die Struktur des Mäuse-Antikörpers nachzuahmen. Die aufgebaute humane VH-DNA-Sequenz wird in 6 überlappende Oligonukleotidsequenzen mit einer Länge von etwa 90–94 Basenpaaren mit einer ungefähren Überlappung von 20 Basenpaaren aufgeteilt. Drei der Oligonukleotide weisen Sens-DNA-Sequenzen auf, und die anderen drei weisen Antisens-DNA-Sequenzen auf. Zwei externe Primer werden ebenso aufgebaut. Die sechs Oligonukleotide werden zusammengefügt und die DNA mit voller Länge mit den externen Primern amplifiziert. Das PCR-Produkt wird mit EcoRI und HindIII verdaut und in einen pUC19-Vektor subgeklont. Jedes Oligonukleotid wird durch einen Computer auf mögliche Sekundärstrukturen, die den Zusammenbau stören könnten, analysiert.

Die leicht- und schwerkettigen Expressionsvektoren werden dann gemeinsam in die COS-PRP-tet-induzierbare Knock-out-Reihe durch Elektroporation transfiziert. Gleiche Mengen jeder Plasmid-DNA (10 &mgr;g) werden zu 0,8 ml Zellen, suspendiert in PBS bei 1 × 107 ml–1, zugesetzt. Ein Puls wird mit einer Kapazitanz von 1,9 kV, 25 &mgr;F unter Verwendung einer Gen-Pulsgeber-Apparatur (BioRad) abgegeben. Nach einer Erholungsdauer von 10 Minuten bei Raumtemperatur werden die elektroporierten Zellen zu 20 ml DMEM, enthaltend 10% Gammaglobulin-freies fötales Kälberserum (GIBCO), zugesetzt. Nach einer 2-stündigen Inkubation wird das Medium aufgefangen, zentrifugiert, um Zelldebris zu entfernen, und gereinigt.


Anspruch[de]
  1. Zellkultur, umfassend Wirtszellen, deren Genom derart manipuliert wurde, dass

    – ein in einer therapeutischen Zusammensetzung nützliches chemisches oder biologisches Molekül exprimiert wird und

    – ein PrP-Protein aufgrund der Abänderung von jeglichen PrP-Sequenzen nicht exprimiert wird.
  2. Zellkultur nach Anspruch 1, wobei es sich bei den Wirtszellen um Zellen eines Pferdes, einer Kuh, eines Schafs, eines Hundes oder eines Primaten handelt.
  3. Zelllultur nach Anspruch 1, wobei es sich bei den Wirtszellen um Hybridomzellen handelt.
  4. Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, die frei von infektiöser Prionenkontamination ist, umfassend:

    (i) Herstellen eines therapeutischen Moleküls in Wirtszellen, wobei die Wirtszellen ein künstlich abgeändertes oder gestörtes PrP-Gen umfassen, so dass die Wirtszellen endogenes PrP nicht exprimieren,

    (ii) Isolieren der therapeutischen Zusammensetzung von den Wirtszellen und

    (iii) wobei die isolierte therapeutische Zusammensetzung durch eine Unfähigkeit, eine durch Prionen vermittelte Pathologie auf einen Patienten derselben Spezies wie die Wirtszellen zu übertragen, gekennzeichnet ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die therapeutische Zusammensetzung der therapeutischen Verwendung für ein Rind, ein Pferd, ein Schaf, einen Hund, eine Katze oder einen Menschen dient.
  6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die therapeutische Zusammensetzung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Peptid, einem Protein, einem Antisense-Molekül, einem Ribozym, einem viralen Vektor, einem Expressionsvektor und einem Plasmid.
  7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Herstellung von (i) Folgendes umfasst:

    – Abtragen eines endogenen PrP-Gens in einer Wirtszelle und

    – Manipulieren des Genoms der Zelle zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung aus der Wirtszelle.
  8. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Herstellung von (i) Folgendes umfasst:

    – Unterdrücken der Expression von endogenen PrP-Sequenzen und

    – Manipulieren des Genoms der Zelle zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung aus der Wirtszelle.
  9. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die frei von infektiöser Prionenkontamination sind, umfassend

    – Impfen eines Säugers mit einem Antigen zur Herstellung von für das Antigen spezifischen Antikörpern,

    – Vereinigen von isolierten die Antikörper exprimierenden B-Lymphozyten mit ein künstlich abgeändertes oder gestörtes PrP-Gen umfassenden Säugerwirtszellen derart, dass die Wirtszellen endogenes PrP nicht exprimieren, um eine Hybridomlinie zu bilden, die die Antikörper exprimiert,

    – Herstellen der Antikörper und

    – Isolieren der Antikörper.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Antikörper humanisiert sind.
  11. Zellkultur nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei ein Allel des PrP-Gens des Genoms abgetragen ist.
  12. Zellkultur nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei beide Allele des PrP-Gens des Genoms abgetragen sind.
  13. Verfahren nach Anspruch 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10, wobei ein Allel des PrP-Gens der Wirtszellen abgetragen ist.
  14. Verfahren nach Anspruch 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10, wobei beide Allele des PrP-Gens der Wirtszellen abgetragen sind.
  15. Verfahren zur Herstellung einer therapeutischen Zusammensetzung, die frei von infektiösen Prionen ist, umfassend:

    (i) Herstellen einer Zellkultur nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3 und Herstellen eines therapeutischen Moleküls in der Zellkultur und

    (ii) Isolieren einer therapeutischen Zusammensetzung aus der Zellkultur.
Es folgt kein Blatt Zeichnungen






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