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Dokumentenidentifikation DE69928556T2 10.08.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001117767
Titel IMMUNMODULATION MITTELS GENETISCHER MODIFIKATION VON DENDRITISCHEN ZELLEN UND B-ZELLEN
Anmelder The UAB Research Foundation, Birmingham, Ala., US
Erfinder CURIEL, T., David, Birmingham, US;
TILLMAN, Bryan Walter, Columbus, US
Vertreter Vossius & Partner, 81675 München
DE-Aktenzeichen 69928556
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 28.09.1999
EP-Aktenzeichen 999546658
WO-Anmeldetag 28.09.1999
PCT-Aktenzeichen PCT/US99/22367
WO-Veröffentlichungsnummer 2000018888
WO-Veröffentlichungsdatum 06.04.2000
EP-Offenlegungsdatum 25.07.2001
EP date of grant 23.11.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 10.08.2006
IPC-Hauptklasse C12N 7/00(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse C12N 15/63(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   C12N 15/85(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 48/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   A61K 35/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Immunologie und die adenovirale Gentherapie. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung die Immunmodulation durch genetische Veränderung von dendritischen Zellen und B-Zellen.

Beschreibung des verwandten Fachgebiets

Eine wachsende Sammlung von Belegen legt nahe, dass dendritische Zellen (DC) eine herausragende Rolle im Immunsystem spielen (Bancheareau J. und R. M. Steinmman, Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392 (1998): 245). An erster Stelle wird von dendritischen Zellen angenommen, dass sie in einer Schlüsselstellung als Vermittler der auf T-Zellen basierenden Immunität dienen. Ausgehend von ihrer wichtigen Funktion wurden dendritische Zellen zur Verwendung in einer Anzahl klinischer Strategien, insbesondere Impfungen, vorgeschlagen. Es ist klar geworden, dass die genetische Veränderung dieser Zellen die Immunität gegen sowohl infektiöse als auch tumorerzeugende, krankheitserregende Einheiten fördern kann (Reeves M. E. et al., Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor-associated antigen gene. Cancer Res. 56 (1996): 5672–7). Wichtig ist, dass all diese Strategien auf effizienten Vektoren für die Genabgabe an dendritische Zellen beruhen. Zu diesem Zweck wurde ein Anzahl von Ansätzen, jedoch im Allgemeinen mit einer schlechten Effizienz des Gentransfers, verwendet (Arthur J. F. et al., A comparison of gene transfer methods in human dendritic cells. Cancer Gene Ther. 4 (1997), 17–25; Van Tendeloo V. F. I. et al., Nonviral transfection of distinct types of human dendritic cells: high-efficiency gene transfer by electroporation into hematopoetic progenitor- but not monocyte-derived dendritic cells. Gene Ther. 5 (1998), 700–7). Ein Kandidat war ein replikationsdefizienter adenoviraler Vektor. Für diesen Vektor wurde vorgeschlagen, dass er aufgrund seines hohen Titers, der effizienten Genabgabe und hohen Genexpression für klinische Anwendungen gut geeignet sei.

Trotz dieser theoretischen Vorteile hat die relative Resistenz von dendritischen Zellen gegenüber der Infektion durch adenovirale Vektoren den Erhalt des gesamten Vorteils genbasierter Strategien der Immuntherapie vereitelt (Arthur J. F. et al., A comparison of gene transfer methods in human dendritic cells. Cancer Gene Ther. 4 (1997), 17–25; Dietz A. B. und S. Vuk-Pavlovic, High efficiency adenovirus-mediated gene transfer to human dendritic cells. Blood 91 (1998), 392–8). Das Phänomen der Resistenz von dendritischen Zellen gegenüber dem durch Adenoviren vermittelten Gentransfer kann auf der geringen Zahl von adenoviralen Eintrittsrezeptoren beruhen. In permissiven Zellen vermittelt das hervorstehende adenovirale Fiber-Knob-Protein die Bindung an den Coxsackie-Adenovirus-Rezeptor (CAR) auf der Zelloberfläche, gefolgt von der Interaktion mit und Internalisation des Virions durch eines der av-Integrine avb3 oder avb5 (Wickham T. J. et al., Integrins &agr;v&bgr;3 and &agr;v&bgr;5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. 73 (1993), 309–19; Bergelson J. M. et al., Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses and adenoviruses 2 and 5. Science 275 (1997), 1320–3). Die vorliegende Analyse hat ein Fehlen von CAR, jedoch die ausreichende Expression des av-Integrins &agr;v&bgr;5 aufgezeigt. In hohem Maße effizienter, von der Expression von CAR unabhängiger Gentransfer mittels durch bispezifische Einheiten gegen alternative zelluläre Rezeptoren zielausgerichteter Adenoviren wurde früher gezeigt (Douglas J. T. et al., Targeted gene delivery by tropism modified adenoviral vectors. Nature Biotech. 14 (1996), 1574–8). Es wurde postuliert, dass eine ähnliche Strategie, auf den auf dendritischen Zellen exprimierten Marker CD40 zu zielen, den Gentransfer in dendritische Zellen verbessern könnte.

Durch chemische Konjugation eines monoclonalen neutralisierenden Anti-Fiber-Knob-Antikörpers an einen monoclonalen Antikörper mit einer Affinität für den Rezeptor CD40 dendritischer Zellen wurde ein bispezifischer Antikörper hergestellt. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass ein mit dieser bispezifischen Einheit komplexierter Adenovirus dramatische Verbesserungen des Gentransfers in aus Monozyten gewonnen dendritischen Zellen vermittelt. Noch wichtiger ist, dass eine Hochregulierung von mehreren Reifungsmarkern dendritischer Zellen und eine verbesserte Funktion bei Allo-MLR nach Infektion mit auf CD40 zielgerichtetem Vektor beobachtet wurde, was aufzeigt, dass der Vektor selbst ausreifende Eigenschaften aufweist.

Somit mangelt es dem Stand der Technik an Verfahren zur Transduktion von dendritischen Zellen und B-Zellen zu Zwecken der Immunmodulation. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen lange bestehenden Bedarf und Wunsch im Fachgebiet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Durch chemische Konjugation von Antikörpern mit Affinitäten für das Fiber-Knob des Adenovirus und den Rezeptor CD40 dendritischer Zellen wurde ein bispezifischer Antikörper hergestellt. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass auf CD40 zielgerichtetes Adenovirus dramatische Verbesserungen des Gentransfers in aus Monozyten gewonnen dendritischen Zellen vermittelt und dass diese Verbesserungen auf die quantitative Steigerung der Zahl transduzierter Zellen zurückgeführt werden können. Zusätzlich zeigt die vorliegende Erfindung durch erfolgreiche Blockierung mit dem Ausgangsmonoclonalen G28.5 und das Versagen des Konjugates, den Gentransfer in für CD40 negative Linien zu vermitteln, dass diese Verbesserung spezifisch für das durch den G28.5-Antikörper erkannte Epitop ist. Weiterhin wurde eine Hochregulierung von mehreren gut beschriebenen Reifungsmarkern dendritischer Zellen und eine verbesserte Allo-MLR durch diese Zellen nach Infektion mit einem neu zielgerichteten Vektor beobachtet. Die Doppelrolle von CD40 in diesem Szenario sowohl als ein Ersatzrezeptor des Adenovirus als auch als starker Auslöser der Reifung dendritischer Zellen kann sich zufällig als Strategie zur neuen Zielausrichtung für diese kritische Zellart des Immunsystems erweisen.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen adenoviralen Vektor bereitzustellen, der fähig ist, eine Zielfindung auf und Transduktion von Zellen des Immunsystems, wie dendritische Zellen und B-Zellen, durchzuführen, wobei die Transduktion von B-Zellen eine Reifung dieser B-Zellen ergibt.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Genabgabesystem zur Transduktion und Immunmodulation von Immunsystemzellen, die den CD40-Rezeptor aufweisen bereitgestellt, umfassend:

  • a) ein Adenovirus; und
  • b) eine CD40-Antigen-erkennende Komponente, wobei die Komponente umfasst (1) einen ersten Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment von dem ersten Antikörper, der an das Fiber-Knob-Protein auf dem Adenovirus bindet, und (2) einen Anti-CD40-Antikörper G28.5 oder ein Antigen-bindendes Fragment des G28.5-Antikörpers, der/das an CD40 auf der Oberfläche von den Immunsystemzellen bindet, wobei der erste Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon an den Anti-CD40-Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon gebunden ist.

Zusätzlich kann der bispezifische Antiköper das Produkt einer Genfusion sein.

In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der adenovirale Vektor ein therapeutisches Gen ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Gen, das ein Tumorantigen codiert, einem Gen, das ein Antigen gegen einen infektiösen Erreger codiert, einem Gen, das ein zytotoxisches Mittel codiert und einem Gen, das ein immunmodulatorisches Mittel codiert, exprimieren; die Immunsystemzellen sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus dendritischen Zellen und B-Zellen, genauso sind Nicht-Immunzellen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gefäßendothelzellen, Epithelzellen, Zellen, die eine chronische Entzündung aufzeigen, und Zellen und Gefäße von Karposisarkomtumoren; und die Reifung der Immunzellen zeigt die Modulation der Immunzellen an.

In noch einer anderen Ausführungsform wird die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend einen Adenovirus und eine CD40-Antigen-erkennende Komponente, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur genetischen Manipulation von Immunsystemzellen in einem Individuum, das einer solchen Behandlung bedarf, bereitgestellt, wobei die CD40-Antigen-erkennende Komponente umfasst (1) einen ersten Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment des ersten Antikörpers, das/der an das Fiber-Knob-Protein auf dem Adenovirus bindet, und (2) einen Anti-CD40-Antikörper G28.5 oder ein Antigen-bindendes Fragment des G28.5-Antikörpers, das an CD40 auf der Oberfläche der Immunsystemzellen bindet, wobei der erste Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon an den Anti-CD40-Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon gebunden ist. Die Immunsystemzellen werden aus der Gruppe bestehend aus dendritischen Zellen und B-Zellen ausgewählt, genauso wie Nicht-Immunzellen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gefäßendothelzellen, Epithelzellen, chronische Entzündungen anzeigenden Zellen und Zellen und Gefäßen von Karposisarkomtumoren. Im Allgemeinen wird das Verfahren bei der Behandlung eines Individuums nützlich sein, welches eine Erkrankung wie Krebs, Infektionserkrankungen, Allotransplantatabstoßung, Xenotransplantatabstoßung und Autoimmunerkrankungen hat. Zusätzlich wird die Verabreichung des immunmodulatorischen Adenovirus aus der Gruppe bestehend aus systemisch, intradermal und ex vivo ausgewählt. Andere und weitere Aspekte, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung der zur Zeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ersichtlich werden. Diese Ausführungsformen werden zum Zweck der Offenbarung angegeben.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Damit die Art, in welcher die vorstehend genannten Eigenschaften, Vorteile und Gegenstände der Erfindung, sowie andere, welche offensichtlich sein werden, erlangt und im Detail verstanden werden, können genauere Beschreibungen der vorstehend kurz zusammengefassten Erfindung als Bezug auf bestimmte Ausführungsformen davon, welche in den anhängenden Zeichnungen dargestellt werden, verwendet werden. Diese Zeichnungen bilden einen Teil der Beschreibung. Es ist jedoch zu beachten, dass die anhängenden Zeichnungen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung erläutern und deshalb nicht als ihren Umfang beschränkend angesehen werden sollen.

Die 1 zeigt, dass durch Fab-anti-CD40 zielgerichtetes Adenovirus einen verstärkten Umfang von Gentransfer vermittelt, welcher für CD40 spezifisch ist. Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen (1A) oder die Gliomzelllinie D65 (1B) wurden vorab in der Anwesenheit oder Abwesenheit von unkonjugiertem Anti-CD40-mAb inkubiert und entweder mit AdCMVLuc alleine oder komplexiert mit Fab-anti-CD40 infiziert. Nach einer 24-stündigen Inkubation wurden die Zellen auf die Expression von Luziferase untersucht.

Die 2 zeigt, dass die Zielrichtung von Adenoviren auf CD40 die zur Erreichung eines gegebenen Niveaus der Genexpression nötige virale MOI reduziert. Virus wurde entweder in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Fab-anti-CD40-Konjugat kurz inkubiert und anschließend in Reihe verdünnt, um einer Multiplizität von Infektionen (MOIs) von 1000, 100, 10 und 1 zu entsprechen. Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden infiziert und die Zellen wurden nach 24 Stunden auf Luziferasexpression getestet.

Die 3 zeigt, dass auf CD40 zielgerichtetes, auf &bgr;1-Integrin zielgerichtetes und mit Liposomen komplexiertes Adenovirus einen vergleichbaren Gentransfer in aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen vermitteln. Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden mit Adenovirus infiziert, welches Green-Fluorescent-Protein (GFP) codiert, vorab mit einem des folgenden inkubiert: PBS, Fab-anti-CD40, Fab-anti-&bgr;1-Integrin-Konjugat, Fab-anti-EGFR-Konjugat oder Liposomen. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Bedingungen unter Verwendung von Durchflusszytometrie auf die Expression von GFP untersucht und sind als Prozentanteil GFP-positiver Zellen basierend auf der Analyse von 10000 Zellen dargestellt.

Die 4 zeigt, dass die Zielausrichtung auf CD40 die Expression von Reifungsmarkern dendritischer Zellen vermittelt. Zellen wurden mit den angegebenen Bedingungen oder Virus/Konjugaten oder Konjugaten alleine behandelt und über 24 Stunden inkubiert. Die dargestellten Proben zeigen durch Durchflusszytometrie die Expression von CD83, HLA-DR, HLA-DQ, CD86 und CD54.

Die 5 zeigt, dass die Produktion von IL-12 nach der Behandlung mit Anti-CD40-Ab oder dem Fab-anti-CD40 zielausrichtenden Konjugat verstärkt ist. Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden mit den angegebenen neu zielgerichteten Adenoviren oder in der Abwesenheit von Adenoviren mit unkonjugiertem Anti-CD40-Ab oder dem Fab-anti-CD40-Konjugat behandelt. Nach 48 Stunden wurden die Überstände durch ELISA auf Produktion von IL-12, einem Marker für die Reifung dendritischer Zellen, untersucht. Anzumerken ist, dass Werte unter 8 ng unterhalb des linearen Bereichs des Nachweises dieses Tests sind.

Die 6 zeigt, dass die Zielausrichtung auf CD40 eine Verstärkung in der Fähigkeit eine allo-gemischte-Lymphozyten-Reaktion auszubilden vermittelt. Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden mit den angegebenen Bedingungen behandelt und mit nicht-adhärenten Lymphozyten-Responderzellen MLR zu den angegebenen Responder/Stimulator Verhältnissen (R : S) gemischt. Die Zellen wurden anschließend mit 3H markiert und nach drei Tagen auf mit Zellen assoziierte CPM untersucht.

Die 7 zeigt, dass primäre B-Zellen einen Mangel an CAR (7A) und dem &agr;v-Integrin &agr;v&bgr;5 haben (7B). Die adenoviralen Eintrittsrezeptoren. Die Zellen wurden mit FACS unter Verwendung des Anti-CAR-mAb RmcB und des Anti-&agr;v&bgr;5-spezifischen mAb P1F6 analysiert. (Die Analyse von &agr;v&bgr;3 war ähnlich zu &agr;v&bgr;5).

Die 8 zeigt, dass durch Fab-anti-CD40 oder Fab-anti-&bgr;1-Integrin zielausgerichtetes Adenovirus ein verstärktes Ausmaß des Gentransfers auf primäre, normale B-Zellen vermittelt. Gereinigte primäre B-Zellen wurden entweder mit AdCMVLuc alleine oder wie angegeben komplexiert mit dem nachfolgenden: Fab, Fab-anti-CD40 oder Fab-anti-&bgr;1-Integrine infiziert. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Zellen auf Expression von Luziferase untersucht.

Die 9 zeigt, dass in der Natur die Aktivierung von dendritischen Zellen durch auf T-Helferzellen exprimierten CD40-Liganden vermittelt wird, was die Reifung von dendritischen Zellen ermöglicht, so dass diese zytotoxische T-Lymphozyten (CTL's) richtig stimulieren können.

Die 10 zeigt, dass auf CD40 zielgerichtetes Adenovirus die CD4+-T-Helferfunktion durch Aktivierung von CD40 ersetzen kann, was zur Reifung dendritischer Zellen führt. Aus diesem Grund könnte auf CD40 zielgerichtetes Adenovirus die Stimulation einer CTL-Antwort sogar in der Abwesenheit funktionierender T-Helferzellen ermöglichen.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Eine Vielzahl von Studien hat die wichtigen Auswirkungen von genetisch veränderten dendritischen Zellen hervorgehoben. Darin wird ein Vektor zur Erreichung eines effizienten Gentransfers zu dieser Zellart ausschlaggebend für viele immunmodulatorische Strategien und doch haben aktuelle Vektorsysteme das Problem eines Gentransfers geringer Effizienz. Das Adenovirus (Ad) wurde im Zusammenhang der Transduktion dendritischer Zellen verwendet, aber seine Effizienz der Genabgabe erwies sich als suboptimal. Mittels bispezifischer Antikörper zeigt die vorliegende Erfindung durch neue Zielausrichtung des Adenovirus auf CD40, einem Marker, der verbreitet auf dendritischen Zellen exprimiert wird, erfolgreich einen verbesserten Gentransfer in aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen. Auf CD40 zielgerichtetes Virus zeigte verglichen mit nicht zielgerichtetem Virus sowohl dramatische als auch quantitative Verbesserungen im Gentransfer. Für diesen Gentransfer wurde gezeigt, dass er spezifisch für CD40 ist, wie dies sowohl durch die erfolgreiche Blockierung mit dem Ausgangsantikörper als auch durch die Abwesenheit von Gentransfer in für CD40 negative Zellen gezeigt wurde. Von diesen Eigenschaften würde man erwarten, dass sie die benötigte Dosis von Virus für ein gegebenes Niveau der Transduktion reduzieren und man würde deshalb von ihnen erwarten, dass sie die mit dem Vektor zusammenhängende Toxizität reduzieren und eine ektopische Genabgabe reduzieren.

Grundlegend für die Neuheit dieses Systems ist die Fähigkeit des Vektors selbst, den immunologischen Status der aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen zu beeinflussen. Dieser Vektor löst die Reifung von dendritischen Zellen aus, wie dies phänotypisch durch gesteigerte Expression von CD83, MHC und kostimulatorischen Molekülen, ebenso wie funktionell durch eine verstärkte allostimulaorische Fähigkeit in einer gemischten Lymphozytenreaktion (MLR) gezeigt wurde. Durch Vergleich dieses Vektors mit anderen auf Adenovirus basierenden Gentransfer-Vektoren wurde offensichtlich, dass die bei dendritischen Zellen beobachteten grundlegenden Wirkungen spezifisch für CD40 sind. Dieser Ansatz kann nicht nur als hoch-effizienter Gentransfervektor dienen, sondern kann auch die Notwendigkeit für zusätzliche Schritte zur Förderung der Reifung dendritischer Zellen nach der Genabgabe aufheben.

Die vorliegende Erfindung nützt auf das CD40-Zelloberflächenantigen auf dendritischen Zellen und B-Zellen zielgerichtete adenovirale Vektoren. Zielgerichtete adenovirale Vektoren können in Verfahren der Transduktion von dendritischen Zellen und B-Zellen verwendet werden. Die Reifung von dendritischen Zellen und B-Zellen kann der Transduktion mit dem zielgerichteten adenoviralen Vektor folgend ausgelöst werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können übliche Techniken der Molekularbiologie, Mikrobiologie und rekombinanter DNA im Rahmen der Durchschnittsfachkenntnis verwendet werden. Solche Techniken sind vollumfänglich in der Literatur erklärt. Siehe zum Beispiel Sambrook, Fritsch & Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Bände I und II (D. N. Glover Hrsg. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait Hrsg. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. (1985)]; "Transcription and Translation" [B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R. I. Freshney, Hrsg. (1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984). Deshalb sollen, wenn sie hier erscheinen, die folgenden Begriffe die nachstehend ausgeführten Definitionen haben.

Ein „DNA-Molekül" bezieht sich auf die polymere Form von Desoxyribonucleotiden (Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin) in ihrer entweder einzelsträngigen Form oder einer doppelsträngigen Helix. Dieser Begriff bezieht sich nur auf die Primär- und Sekundärstruktur des Moleküls und begrenzt es nicht auf irgend welche bestimmten Tertiärformen. Somit schließt dieser Begriff doppelsträngige DNA, wie sie unter anderem in linearen DNA-Molekülen (zum Beispiel Restriktionsfragmenten), Viren, Plasmiden und Chromosomen gefunden wird, ein. Bei der Diskussion der Struktur wird hier, entsprechend der normalen Konvention, nur die Sequenz in der 5' nach 3'-Richtung entlang des nicht transkribierten Stranges der DNA (das heißt, der Strang der eine zur mRNA homologe Sequenz hat) angegeben.

Ein „Vektor" ist ein Replikon wie ein Plasmid, Phage oder Cosmid, an das ein anderes DNA-Segment gebunden sein kann, so dass die Replikation des gebundenen Segmentes bewerkstelligt wird. Ein „Replikon" ist jedes genetische Element (zum Beispiel ein Plasmid, Chromosom, Virus), das in vivo als autonome DNA-Replikationseinheit wirkt, das heißt zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle fähig ist. Ein „Replikationsursprung" bezieht sich auf jene DNA-Sequenzen, welche an der DNA-Synthese beteiligt sind. Eine „Expressionskontrollsequenz" ist eine DNA-Sequenz, welche die Transkription und Translation einer anderen DNA-Sequenz kontrolliert und reguliert. Eine codierende Sequenz in einer Zelle ist „funktionell verknüpft" und „unter der Kontrolle" von transkriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen, wenn die RNA-Polymerase die codierende Sequenz in mRNA transkribiert, welche dann in das durch die codierende Sequenz codierte Protein translatiert wird.

Im Allgemeinen werden Vektoren, welche Promotorsequenzen enthalten, welche die effiziente Transkription und Translation des eingefügten DNA-Fragmentes ermöglichen, im Zusammenhang mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsursprung, Promotor(en), Terminator(en), genauso wie spezifische Gene, welche fähig sind, eine phänotypische Selektion bei transformierten Zellen bereitzustellen. Die transformierten Wirte können entsprechend den im Fachgebiet bekannten Mitteln fermentiert und gezüchtet werden, um ein optimales Zellwachstum zu erreichen.

Eine „codierende Sequenz" aus DNA ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, welche in vivo in ein Polypeptid transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5'(Amino-)-Terminus und ein Stoppkodon der Translation am 3'(Carboxyl)-Terminus bestimmt. Eine codierende Sequenz kann prokaryontische Sequenzen, cDNA aus eukaryontischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryontischer (zum Beispiel Säuger-) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen einschließen, ist aber nicht auf diese beschränkt. Ein Polyadenylierungssignal und eine Terminationssequenz der Transkription werden sich für gewöhnlich 3' zu der codierenden Sequenz befinden. Eine „cDNA" ist als Kopie-DNA oder komplementäre DNA definiert und ist ein Produkt einer reversen Transkriptionsreaktion aus einem mRNA-Transkript. Ein „Exon" ist eine exprimierte Sequenz, welche von dem Gen-Lokus transkribiert wird, wohingegen ein „Intron" eine nicht-exprimierte Sequenz ist, die von dem Gen-Lokus stammt.

Transkriptionelle und translationelle Kontrollsequenzen sind regulatorische DNA-Sequenzen wie Promotoren, Enhancer, Polyadenylierungssignale, Terminatoren und Ähnliches, welche die Expression einer codierenden Sequenz in einer Wirtszelle ermöglichen. Ein „cis-Element" ist eine Nucleotidsequenz, welche auch als „Konsensussequenz" oder „Motiv" bezeichnet wird, die mit anderen Proteinen wechselwirkt, welche die Expression eines spezifischen Genlokus heraufregulieren oder herunterregulieren können. Eine „Signalsequenz" kann auch in der codierenden Sequenz eingeschlossen sein. Diese Sequenz codiert ein zu dem Polypeptid N-terminales Signalpeptid, welches mit der Wirtszelle kommuniziert und das Polypeptid zu der angemessenen zellulären Position steuert. Signalsequenzen können mit einer Vielfalt von Proteinen, welche Prokaryonten und Eukaryonten arteigen sind, assoziiert gefunden werden.

Eine „Promotorsequenz" ist eine regulatorische DNA-Region, welche fähig ist, die RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts gelegenen (3'-Richtung) codierenden Sequenz einzuleiten. Zum Zweck der Definition der vorliegenden Erfindung wird die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Initiationsstelle der Transkription begrenzt und erstreckt sich stromaufwärts (5'-Richtung), um eine minimale Zahl von Basen oder Elementen einzuschließen, welche nötig sind, um die Transkription auf Niveaus einzuleiten, welche über dem Hintergrund nachweisbar sind. Innerhalb der Promotorsequenz werden sich eine Initiationsstelle der Transkription, genauso wie Proteinbindungsdomänen (Konsensussequenzen), welche für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind, finden. Eukaryontische Promotoren enthalten oft, aber nicht immer, „TATA"-Boxen und „CAT"-Boxen. Prokaryontische Promotoren enthalten zusätzlich zu den -10- und -35-Konsensussequenzen Shine-Dalgarno-Sequenzen.

Der Begriff „Oligonucleotid" ist definiert als ein Molekül, welches aus zwei oder mehr, bevorzugt mehr als drei, Desoxyribonucleotiden besteht. Seine genaue Größe wird von vielen Faktoren abhängen, welche ihrerseits von der endgültigen Funktion und Verwendung des Oligonucleotids abhängen. Der Begriff „Primer", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Oligonucleotid, gleich ob natürlich vorkommend wie in einer aufgereinigten Restriktionsspaltung oder synthetisch hergestellt, welches fähig ist, als Startpunkt der Synthese zu wirken, wenn es unter Bedingungen gesetzt wird, in denen die Synthese eines Primerextensionsproduktes, welches komplementär zu einem Nucleinsäurestrang ist, eingeleitet wird, das heißt, in der Anwesenheit von Nucleotiden und einem einleitenden Mittel wie einer DNA-Polymerase und bei einer geeigneten Temperatur und geeignetem pH-Wert. Der Primer kann entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein und muss ausreichend lang sein, um die Synthese des gewünschten Extensionsproduktes in der Anwesenheit des einleitenden Mittels zu starten. Die genaue Länge des Primers wird von vielen Faktoren, einschließlich Temperatur, Quelle des Primers und Verwendung des Verfahrens, abhängen. Zum Beispiel enthält der Oligonucleotidprimer für diagnostische Anwendungen, abhängig von der Komplexität der Zielsequenz, typischerweise 15–25 oder mehr Nucleotide, obwohl er weniger Nucleotide enthalten kann.

Primer werden ausgewählt, um „im Wesentlichen" komplementär zu verschiedenen Strängen einer bestimmten DNA-Zielsequenz zu sein. Dies bedeutet, dass Primer ausreichend komplementär sein müssen, um mit ihren jeweiligen Strängen zu hybridisieren. Deshalb muss die Primersequenz nicht die genaue Sequenz der Matrize wiederspiegeln. Zum Beispiel kann ein nicht-komplementäres Nucleotidfragment an das 5'-Ende eines Primers gebunden sein, wobei der Rest der Primersequenz komplementär zu dem Strang ist. Alternativ können nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen in den Primer eingestreut sein, vorausgesetzt, dass die Primersequenz eine ausreichende Komplementarität mit der Sequenz hat oder mit ihr hybridisiert und dadurch die Matrize für die Synthese des Verlängerungsprodukts bildet.

Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Restriktionsendonuclease" und „Restriktionsenzym" auf Enzyme, welche doppelsträngige DNA an oder nahe einer spezifischen Nucleotidsequenz schneiden.

„Rekombinante DNA-Technologie" bezieht sich auf Techniken zur Verbindung zweier heterologer DNA-Moleküle, für gewöhnlich als Ergebnis von in vitro-Ligierungen von DNAs aus verschiedenen Organismen. Rekombinante DNA-Moleküle werden üblicher Weise durch Experimente der Genmanipulation hergestellt. Gleichbedeutende Begriffe schließen „Gen-Splicing", „molekulare Klonierung" und „Genmanipulation" ein. Das Produkt dieser Manipulationen ergibt eine „Rekombinante" oder ein „rekombinantes Molekül".

Eine Zelle wurde mit exogener oder heterologer DNA „transformiert", „transfiziert" oder „transduziert", wenn solche DNA in die Zelle eingeführt wurde. Die transformierende DNA kann dabei (kovalent gebunden) in das Genom der Zelle integriert sein oder auch nicht. In Prokaryonten, Hefe und Säugerzellen kann zum Beispiel die transformierende DNA auf einem episomalen Element wie einem Vektor oder Plasmid erhalten werden. Im Hinblick auf eukaryontische Zellen ist eine stabil transformierte Zelle eine, in welcher die transformierende DNA in ein Chromosom integriert wurde, so dass sie von Tochterzellen durch Replikation des Chromosoms geerbt werden kann. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryontischen Zellen demonstriert, Zelllinien oder Klone zu begründen, welche aus einer Population von die transformierende DNA enthaltenden Tochterzellen bestehen. Ein „Klon" ist eine Population von Zellen, welche durch Mitose aus einer einzelnen Zelle oder einem einzelnen Vorfahren abstammen. Eine „Zelllinie" ist ein Klon einer primären Zelle, welcher in vitro über viele Generationen zu stabilem Wachstum fähig ist. Ein Organismus wie eine Pflanze oder ein Tier, welcher mit exogener DNA transformiert worden ist, wird als „transgen" bezeichnet.

Wie hier verwendet, soll der Begriff „Wirt" nicht nur Prokaryonten, sondern auch Eukaryonten wie Hefe-, Pflanzenzellen und tierische Zellen einschließen. Ein rekombinantes DNA-Molekül oder Gen kann unter Verwendung jeglicher dem Durchschnittsfachmann üblicherweise bekannten Techniken verwendet werden, um einen Wirt zu transformieren. Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung eines Vektors zu Zwecken der prokaryontischen Transformation. Prokaryontische Wirte können E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis einschließen. Eukaryontische Wirte schließen Hefen wie Pichia pastoris, Säugerzellen und Insektenzellen und stärker bevorzugt Pflanzenzellen wie Arabidopsis thaliana und Tobaccum nicotiana ein.

Zwei DNA-Sequenzen sind „weitgehend homolog", wenn wenigstens etwa 75% (bevorzugt wenigstens etwa 80% und am stärksten bevorzugt wenigstens etwa 90% oder 95%) der Nucleotide über die bestimmte Länge der DNA-Sequenzen übereinstimmen. Sequenzen, welche weitgehend homolog sind, können durch Vergleich der Sequenzen unter Verwendung von Standardsoftware, welche in Sequenzdatenbanken erhältlich ist, oder in einem Southern-Hybridisierungsexperiment unter zum Beispiel stringenten Bedingungen, wie sie für dieses bestimmte System definiert sind, identifiziert werden. Das Definieren geeigneter Hybridisierungsbedingungen liegt in der Durchschnittsfachkenntnis. Siehe zum Beispiel Maniatis et al., vorstehend; DNA Cloning, Bände I & II, vorstehend; Nucleic Acid Hybridization, vorstehend.

Eine „heterologe" Region des DNA-Konstruktes ist ein identifizierbarer DNA-Abschnitt in einem größeren DNA-Molekül, welcher in der Natur nicht in Assoziation mit dem größeren DNA-Molekül gefunden wird. So wird das Gen, wenn die heterologe Region ein Säugergen codiert, für gewöhnlich von DNA flankiert sein, welche die genomische Säuger-DNA im Genom des Ausgangsorganismus nicht flankiert. In einem anderen Beispiel ist die codierende Sequenz ein Konstrukt, wobei die codierende Sequenz selbst nicht in der Natur vorgefunden wird (zum Beispiel eine cDNA, wobei die genomische codierende Sequenz Introns enthält, oder synthetische Sequenzen, welche von denen des natürlichen Gens verschiedene Codons haben). Allelische Variationen oder natürlich auftretende Mutationsereignisse bedingen keine heterologe Region, wie sie hier definiert ist.

Wie hier verwendet, wird ein „Fragment" angewendet auf einen Antikörper für gewöhnlich wenigstens 10 Reste, typischer wenigstens 20 Reste und bevorzugt wenigstens 30 (zum Beispiel 50) Reste, aber weniger als die gesamte, intakte Sequenz, lang sein. Antikörperfragmente können durch dem Fachmann bekannte Verfahren, zum Beispiel enzymatische Spaltung von natürlich vorkommenden oder rekombinanten Antikörpern, durch rekombinante DNA-Techniken unter Verwendung eines Expressionsvektors, welcher ein definiertes Fragment eines Antikörper codiert, oder durch chemische Synthese hergestellt werden. Die Fähigkeit eines Fragmentkandidaten eines Antikörpers, Bindung an ein Antigen zu zeigen, kann durch hier beschriebene Verfahren untersucht werden.

Ein üblicher Nothern-Blot-Test kann verwendet werden, um die relativen Mengen von mRNA in einer Zelle oder einem Gewebe, welche/welches aus einer Pflanze oder einem transgenen Gewebe gewonnen wurde, in Übereinstimmung mit konventionellen Techniken der Nothern-Hybridisierung, welche dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, zu ermitteln. Alternativ kann ein üblicher Southern-Blot-Test verwendet werden, um die Anwesenheit und die Kopienzahl eines Gens in transgenen Systemen in Übereinstimmung mit konventionellen Techniken der Southern-Hybridisierung, welche dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, zu bestätigen. Sowohl der Nothern-Blot als auch der Southern-Blot verwenden eine Hybridisierungssonde, zum Beispiel radioaktiv markierte cDNA oder ein Fragment dieser DNA-Sequenz mit einer Länge von wenigstens 20 (bevorzugt wenigstens 30, stärker bevorzugt wenigstens 50 und am stärksten bevorzugt wenigstens 100 aufeinanderfolgenden Nucleotiden). Die DNA-Hybridisierungssonde kann durch jegliches der vielen verschiedenen, dem Fachmann bekannten Verfahren markiert werden.

Die am häufigsten für diese Untersuchungen verwendeten Markierungen sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, welche fluoreszieren, wenn sie ultraviolettem Licht ausgesetzt werden, und andere. Eine Anzahl von fluoreszierenden Materialien sind bekannt und können als Markierungen verwendet werden. Diese schließen zum Beispiel Fluorescein, Rhodamin, Auramin, Texas Red, AMCA-Blue und Lucifer-Yellow ein. Ein besonderes Nachweismittel ist ein in Ziegen hergestellter und mit Fluorescein über ein Isothiocyanat konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper. Proteine können auch mit radioaktiven Elementen oder mit einem Enzym markiert werden. Die radioaktive Markierung kann durch jegliches der zur Zeit verfügbaren Zählverfahren nachgewiesen werden. Das bevorzugte Isotop kann aus 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I und 186Re ausgewählt werden.

Enzymmarkierungen sind gleichfalls nützlich und können durch jegliche der zur Zeit verwendeten colorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen, amperometrischen oder gasometrischen Techniken nachgewiesen werden. Das Enzym wird an das ausgewählte Partikel durch Reaktion mit brücken-bildenden Molekülen wie Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und ähnlichen konjugiert. Viele Enzyme, welche in diesen Verfahren verwendet werden können, sind bekannt und können genutzt werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, &bgr;-Glucuronidase, &bgr;-D-Glucosidase, &bgr;-D-Galactosidase, Urease, Glucoseoxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphatase. Auf die U.S. Pat. Nr. 3,654,090, 3,850,752, und 4,016,043 wird wegen ihrer Offenbarung von alternativen Markierungsmaterialien und Verfahren beispielhaft Bezug genommen.

Wie hier verwendet, soll sich der Begriff immunmodulatorisch auf die Fähigkeit beziehen, die Immunität gegen Krebs, infektiöse Erreger, Autoimmunantigene, oder Allo-/Xenotransplantationen zu fördern oder zu unterdrücken.

Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff Reifung, wenn er sich auf Immunsystemzellen bezieht, auf die Expression spezifischer Oberflächenmarker, die Produktion definierter löslicher Faktoren oder die verbesserte Leistung in einer gemischten Lymphozytenreaktion, wobei all dies als für eine Zelle charakteristisch bekannt ist, welche in ihrer Fähigkeit, eine Antwort von Effektorzellen, wie T-Zellen, auszulösen, effizienter geworden ist.

Wie hier verwendet, soll sich der Begriff „CD40-Antigen" auf ein Mitglied der TNF-Rezeptor(TNFR)-Familie beziehen. Es dient als Rezeptor für den CD40-Liganden (gp39). Von diesem Molekül ist bekannt, dass es auf B-Lymphozyten, Monozyten, dendritischen Zellen, Endothel, epithelialen Zellen und Fibroblasten exprimiert wird. Bemerkenswert ist, dass von diesem Molekül bekannt ist, dass es besonders häufig in Gebieten mit aktiviertem Endothel (wie chronischer Entzündung) und auf den Gefäßen des Kaposisarkoms vorkommt.

Es wird spezifisch erwogen, dass Arzneimittel unter Verwendung des neuen, hier beschriebenen adenoviralen Vektors hergestellt werden können. In solch einem Fall umfasst das Arzneimittel den neuen, erfindungsgemäßen adenoviralen Vektor und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Ein Durchschnittsfachmann wäre leicht fähig, ohne unangebrachtes Experimentieren, die geeigneten Dosierungen und Verabreichungswege dieses erfindungsgemäßen adenoviralen Vektors zu bestimmen. Wenn in vivo zur Therapie verwendet, wird der erfindungsgemäße adenovirale Vektor dem Patienten oder einem Tier in therapeutisch wirksamen Mengen, das heißt, in Mengen, welche die Tumorlast aufgrund eines immunmodulatorischen Effektes eliminieren oder verringern, verabreicht. Er wird normalerweise parenteral, bevorzugt intravenös, verabreicht, es werden aber auch, wo angemessen, andere Verabreichungswege verwendet. Die Dosis und das Dosierungsschema wird von der Natur der Krankheit und ihrem Bestand, den Eigenschaften des bestimmten Vektors, zum Beispiel seines therapeutischen Indexes, dem Patienten, der Vorgeschichte des Patienten und anderen Faktoren abhängen. Die verabreichte Menge des erfindungsgemäßen adenoviralen Vektors wird typischerweise im Bereich von 0,001 bis etwa 500 mg/kg des Gewichts des Patienten sein. Der Plan wird fortgesetzt, um die Wirksamkeit zu optimieren, während gegen die negativen Auswirkungen der Behandlung abgewogen wird. Siehe Remington's Pharmaceutical Science, 17. Ausgabe (1990) Mark Publishing Co., Easton, Penn.; und Goodman und Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics 8. Ausgabe (1960) Pergamon Press.

Zur parenteralen Verabreichung wird der adenovirale Vektor am typischsten in Form einer injizierbaren Dosiseinheit (Lösung, Suspension, Emulsion) assoziiert mit einem pharmazeutisch verträglichen parenteralen Träger formuliert sein. Solche Träger sind bevorzugt nicht-toxisch und nicht-therapeutisch. Beispiele für solche Träger sind Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Ringerlösung, Traubenzuckerlösung und 5%iges menschliches Serumalbumin. Nichtwässrige Träger wie fixierte Öle, und Ethyloleat können auch verwendet werden. Liposomen können als Träger verwendet werden. Der Träger kann geringfügige Mengen von Zusätzen wie Substanzen, welche die Isotonizität und chemische Stabilität verbessern, zum Beispiel Puffer und Konservierungsstoffe, enthalten. Der adenovirale Vektor wird typischerweise in solchen Trägern mit Konzentrationen von etwa 0,001 mg/ml bis 500 mg/ml formuliert sein.

Ein Genabgabesystem zur Transduktion und Immunmodulation von Immunsystemzellen, welche den CD40-Rezeptor aufweisen, umfassend:

  • a) ein Adenovirus; und
  • b) eine CD40-Antigen-erkennende Komponente, wobei die Komponente umfasst (1) einen ersten Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment von dem ersten Antikörper, der an das Fiber-Knob-Protein auf dem Adenovirus bindet, und (2) einen Anti-CD40-Antikörper G28.5 oder ein Antigen-bindendes Fragment des G28.5-Antikörpers, der/das an CD40 auf der Oberfläche von den Immunsystemzellen bindet, wobei der erste Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon an den Anti-CD40-Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon gebunden ist.

In einem Aspekt können der erste Antikörper und der zweite Antikörper genetisch miteinander verbunden sein. Weiterhin kann dieses System auch ein therapeutisches Gen umfassen. Beispielhafte therapeutische Gene schließen ein ein Tumorantigen codierendes Gen, ein ein Antigen für einen infektiösen Erreger codierendes Gen, ein ein Autoimmun-Antigen codierendes Gen, ein immunmodulatorisches Gen und ein ein cytotoxisches Mittel codierendes Gen ein. Beispielhafte Immunsystemzellen, welche unter Verwendung dieses Systems transduziert und immunmoduliert werden können, schließen dendritische Zellen und B-Zellen ein. In einem Aspekt werde die B-Zellen dem Kontakt mit diesem System folgend gereift.

Die vorliegende Erfindung ist auch auf die Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend ein Adenovirus und eine CD40-Antigen-erkennende Komponente, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur genetischen Manipulation von Immunsystemzellen in einem Individuum, das einer solchen Behandlung bedarf, gerichtet, wobei die CD40-Antigen-erkennende Komponente umfasst (1) einen ersten Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment des ersten Antikörpers, das/der an das Fiber-Knob-Protein auf dem Adenovirus bindet, und (2) einen Anti-CD40-Antikörper G28.5 oder ein Antigen-bindendes Fragment des G28.5-Antikörpers, der/das an CD40 auf der Oberfläche der Immunsystemzellen bindet, wobei der erste Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon an den Anti-CD40-Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon gebunden ist. Diese Zusammensetzung kann nützlich sein, wenn das Individuum eine Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Krebs, einer Infektionserkrankung, Allotransplantatabstoßung, Xenotransplantatabstoßung und Autoimmunerkrankungen, hat. Beispielhafte Immunsystemzellen, welche unter Verwendung dieses Systems transduziert und immunmoduliert werden können, schließen dendritische Zellen und B-Zellen ein. Gemäß einem Aspekt erfolgt die Reifung der B-Zellen nach dem Kontakt mit diesem System.

Die Zusammensetzung kann weiterhin ein therapeutisches Gen umfassen.

Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Darstellung verschiedener Ausführungsformen der Erfindung gegeben und sind nicht dazu gedacht, die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise zu begrenzen.

BEISPIEL 1 Züchtung von aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen (MoDC)

Mononucleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) wurden durch Dichtegradientenzentrifugation über Lymphoprep (Nycomed AS, Oslo, Norwegen) aus heparinisiertem, peripheren Blut isoliert und in mit 12,5% DMSO und 25% FKS ergänztem RPMI 1640-Medium, was zuvor als das optimale Kryokonservierungsmedium für aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen und ihre Vorläufer beschrieben wurde (Makino und Baba), kryokonserviert. Frische oder kryokonservierte PBMC wurden mit einer Konzentration von 3 bis 5 Millionen Zellen pro ml in Iscoves modifiziertem Dulbeccos Medium, welches 50 U/ml Penicillin-Streptomycin, 1,6 mM L-Glutamin, 0,01 mM &bgr;-Mercaptoethanol (komplettes Medium) und 10% FKS enthielt, suspendiert und ihnen wurde erlaubt, sich an den Boden von Plastikkulturflaschen (NUNC, Intermed, Dänemark) anzuheften. Nach 2 Stunden bei 37°C wurden nicht anhaftende Zellen durch Spülen mit PBS entfernt. Die adhärenten Zellen wurden für weitere 6 Tage in komplettem Medium mit 10% FKS, ergänzt mit 1000 U/ml rIL-4 (CLB, Amsterdam, Niederlande) und 100 ng/ml GM-CSF, gezüchtet. Locker adhärente Zellen mit typischer Morphologie dendritischer Zellen wurden geerntet (adhärente Zellen wurden durch Inkubation mit 0,5 mM EDTA in PBS abgelöst) und für eine FACS-Analyse oder durch Adenovirus vermittelten Gentransfer verwendet.

BEISPIEL 2 Gemischte Lymphozytenreaktion

Für eine allogene oder autologe gemischte Lymphozytenreaktion wurden aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen als Stimulatorzellen zu Rundbodenzellkulturplatten mit 96 Vertiefungen (Nunclon Delta, Intermed, Dänemark) in abgestuften Dosen hinzugefügt. Nicht-adhärente Lymphozytenfraktionen wurden als eine Quelle für Responderzellen verwendet. Pro Vertiefung wurden 1 × 105 Lymphozyten den allogenen oder autologen aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen in dem angegebenen Responder/Stimulator-Verhältnissen (R : S) hinzugefügt. Die Zellen wurden über 3 Tage in komplettem Medium mit 10% gepooltem menschlichem Serum (CLB, Amsterdam, Niederlande) gezüchtet. Während der letzten 18 Stunden wurde [3H]-Thymidin hinzugefügt (0,4 mCi pro Vertiefung) (Amersham, Aylesbury, UK), wonach die Zellen auf Glasfaserfilter geerntet wurden und der Einbau von [3H]-Thymidin unter Verwendung eines Flachbett-Flüssigscintillationszählers (Wallac, Turku, Finnland) bestimmt wurde.

BEISPIEL 3 Phänotypische Untersuchungen

Eine Zellfärbung wurde unter Verwendung von direkt mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) oder mit Phycoerythrin (PE) konjugierten monoclonalen Antikörpern (MoAbs) durchgeführt. Die verwendeten Antikörper waren HB15 (CD83), BL6 (CD1a), BU15 (CD11c), MAB89 (CD40), (Immunotech, Marseille, Frankreich), SK7 (CD3), 4G7 (CD19), B73.1 (CD16), MoP9 (CD14), NCAM 16.2 (CD56), L243 (HLA-DR), 2A3 (CD25) (Becton Dickinson, San Jose, Kalifornien), 2331 (CD86), G46-2.6 (HLA A, B, C), HA58 (CD54), and TU169 (HLA-DQ) (Pharmingen, San Diego, Kalifornien). Die Proben wurden mit einem FACStar unter Verwendung der Cellquest FACS-Analysensoftware (Becton Dickinson) untersucht.

Wenn die Zellen vor der Analyse mit Adenovirus infiziert wurden, wurden alle Werte für Konjugat oder Virus, welche in Kleinstmaßstab-Luciferasetests verwendet wurden, proportional für die größere Zahl von zu infizierenden Zellen erhöht. Zellen wurden in Chargen von 1 Million Zellen unter Verwendung von AdCMVLuc infiziert. Zellen wurden in einer ähnlichen Weise infiziert, wie jener, welche für die Analyse des Luciferasegentransfers verwendet wurde, mit der einzigen Ausnahme, dass die Zellen nach dem Waschen und der Zugabe von komplettem Medium über die gesamte 24-stündige Inkubation in den Mikrozentrifugenröhrchen belassen wurden. Nach 24 Stunden wurden die Zellen durch Durchflusszytometrie auf die Expression von mit Reifung assoziierten Oberflächenmarkern analysiert.

BEISPIEL 4 Viren und Zelllinien

AdCMVLuc, ein für E1 und E3 deletierter Vektor der ersten Generation, welcher Leuchtkäferluciferase vom CMV-Immediate-Early-Promotor exprimiert, wurde von Robert Gerard (Universität von Leuven, Leuven, Belgien) erhalten. Viren wurden auf der permissiven Linie 293 vermehrt und über Plaquebildung titriert und durch doppelte Zentrifugation auf CsCl-Gradienten aufgereinigt. Alle Virusaliquots wurden bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Der monoclonale Antikörper RmcB aus der Maus gegen den menschlichen Coxsackie/Adenovirusrezeptor (von Dr. Robert Finberg, Dana Farber Cancer Institute) wurde zuvor beschrieben. Die monoclonalen Antikörper aus der Maus LM609 gegen avb3 und P1F6 gegen avb5-Integrin wurden jeweils von Chemicon (Temecula, CA) und Gibco BRL (Gaithersburg, MD) erworben. Der neutralisierende monoclonale Antikörper 1D6.14 aus der Maus, spezifisch für die carboxyterminale, rezeptorbindende Domäne des Adenovirus Serotyps 5, wurde beschrieben. Die Hybridome G28.5, welches monoclonale Anti-CD40 Antikörper herstellt (ATCC#: 9110-HB), und TS2/16.2.1 (ATCC#: 243-HB; „TS-2"), welches monoclonale Antikörper gegen das &bgr;1-Integrin herstellt, wurden von ATCC erworben. Beide Hybridome wurden verwendet, um Ascites in SCID-Mäusen herzustellen.

Antikörper wurden auf einem FPLC-Chromatographiesystem unter Verwendung einer HiTrap Protein A-Säule (Pharmacia) und des MAPS-Bindungspuftersystems (Bio-Rad) aufgereinigt. Der Monoclonale 1D6.14 wurde unter Verwendung immobilisierten Papains (Pierce) zu einem Fab-Fragment gespalten und Fragmente wurden durch negative Selektion von Fc-Fragmenten unter Verwendung von HiTrap Protein A-Säulen aufgereinigt.

BEISPIEL 5 Antikörper und Konjugate

Sowohl 1D6.14-Fab als auch die monoclonalen Antikörper G28.5 und TS2 wurden in Boratpuffer auf 10 mg/ml konzentriert. Die chemische Konjugation des Fab zu dem mAb in einem molaren Verhältnis von 1 : 1 wurde wie beschrieben [Segal, D. M. und B. J. E. G. Bast. Production of bispecific antibodies. Herausgeber: Coligan J. E., A. M. Kruisbeek, D. A. Marguiles, E. M. Shevach, W. Strober. Current Protocols in Immunology. John Wiley and Sons, New York. Band 1 (1994). Abschnitte 2.13.1–2.13.16] durchgeführt. Das Konjugat wurde auf einer HR 10/30 Superose 12-Säule unter Verwendung von FPLC (Pharmacia, Piscataway, NJ) in Boratpuffer pH 8,5 aufgereinigt, wobei die Fraktionen, welche einem 1 : 1-Verhältnis des Anti-Rezeptor-Antikörpers zu dem Fab bei einem ungefähren Molekulargewicht von 200 kDa entsprachen, vereinigt wurden.

BEISPIEL 6 Protokoll für die Ad-Infektion und die Luciferaseanalyse

Nicht-adhärente aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden gesammelt und mit der durch 0,5 mM EDTA freigesetzten Fraktion adhärenter Zellen gemischt, gefolgt von Waschen mit 2,5% FKS enthaltendem kompletten RPMI. Vierundzwanzigtausend Zellen wurden in Triplikaten für jede Testbedingung in einem Volumen von 50 &mgr;l auf einzelne Mikrozentrifugenröhrchen verteilt. Die Verwendung von Mikrozentrifugenröhrchen ermöglichte eine vereinfachte Infektion und ein vereinfachtes Waschen von Zellen, welche sowohl die adhärenten als auch die nicht-adhärenten Fraktionen darstellten. Konjugat und Virus wurden über 30 Minuten bei Raumtemperatur in einem minimalen Volumen von weniger als 10 &mgr;l für die Menge von Virus jeder Testbedingung inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Mischung so verdünnt, dass 100 &mgr;l verwendet wurden, um die Zellen eines jeden Mikrozentrifugenröhrchens zu infizieren. Die Menge von Virus in diesem Volumen entsprach einer Multiplizität der Infektion von 100. Mikrozentrifugenröhrchen, welche die Infektionsmischung enthielten, wurden für 1 Stunde bei 37°C gehalten. Nachfolgend wurden die Zellen, um ungebundenen Virus zu entfernen, in den Röhrchen mit PBS gewaschen, zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Sedimentierte Zellen wurden in 1 ml RPMI 10% FKS resuspendiert und für eine Inkubation über Nacht in einzelne Vertiefungen einer mit Polylysin beschichteten Platte mit 24 Vertiefungen gebracht. Die Verwendung von mit Polylysin beschichteten Vertiefungen erlaubte die einfachere Verarbeitung in nachfolgenden Luciferasetests durch Verankerung sowohl von anhaftenden als auch von Suspensionsfraktionen an die Vertiefungsoberfläche. Nach 24 Stunden Inkubation nach der Infektion wurde der Überstand von allen Vertiefungen abgesaugt und die Zellen wurden unter Verwendung des Promega-Luciferase-Assay-Kits verarbeitet. Kurz gesagt wurden die Zellen direkt auf der Platte lysiert und einem Einfrier-Auftau-Zyklus unterzogen. Die Lysate wurden durch Vermischung mit Luciferasesubstrat und unmittelbarer Auswertung auf einem Lumat Luminometer analysiert.

Für Blockierungsexperimente wurden die Zellen vor der Infektion mit dem (unkonjugierten) Ausgangsmonoclonalen G28.5 blockiert. Aufgrund der schnellen Internalisierungskinetiken, welche zuvor für diesen Monoclonalen berichtet wurden, wurden alle Blockierungen bei 4°C durchgeführt, um die Modulation des Rezeptors von der Zelloberfläche zu minimieren. Nach 30 Minuten Inkubation der Zellen mit dem Blockierungsmittel wurde den Zellen direkt mit der optimalen Menge von Fab-G28.5 komplexierter Virus hinzugefügt und vor dem Waschen und Überführen auf die Platte mit 24 Vertiefungen bei 37°C für eine Dauer von 30 min weiter inkubiert. Für die Blockierung mit Fab wurde Virus vorab mit einem Überschuss von vorher bestimmter neutralisierender Konzentration von 1D6.14 Fab inkubiert. In dieser Hinsicht wurde Fab nur als Ersatz anstatt des Konjugates für die angegebenen Bedingungen eingesetzt.

BEISPIEL 7 Ermittlung der optimalen Menge von Konjugat zur neuen Zielausrichtung

Um die Menge des für die optimale Beschichtung eines Adenovirus benötigten Konjugates zur neuen Zielausrichtung zu bestimmen, wurde das Konjugat auf eine vorab bestimmte Zahl viraler Partikel mit einer MOI von 100 titriert, wobei der Gentransfer in Form der Luciferaseexpression als relative Lichteinheiten, RLU, in aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen gemessen wurde. Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden mit AdCMVLuc infiziert, welches vorab mit ansteigenden Konzentrationen von Fab-G28.5 inkubiert worden war. Weitere Zunahmen im Konjugat : Virus-Verhältnis erwiesen sich, vermutlich verursacht durch die Konkurrenz um die Bindung an CD40 durch einen Überschuss von Fab-G28.5-Konjugat, als den Umfang des neu zielausgerichteten Gentransfers reduzierend. Diese Titration testete nach einer Inkubation mit 2,4 × 106 Virionen gegebene Massen von Konjugat, die im Bereich von 0,01 ng bis 2000 ng/Vertiefung mit Abständen über jeden halben Log10 der Masse lagen. Die Masse des Konjugates, welche den höchsten Niveaus der Luciferasegenexpression entsprach, wurde als eine „optimale Dosis" bezeichnet und wurde in allen nachfolgenden Experimenten verwendet.

BEISPIEL 8 GFP-Reportergen zur Demonstration des quantitativen Gentransfers

Um sicherzustellen, dass der mit Luciferase beobachtete Gentransfer mit einer tatsächlich gesteigerten Zahl an transduzierten Zellen korrelierte, wurden Zellen auch mit einem das Gen für GFP tragenden Adenovirus infiziert. Für Zellen die einer auf Durchflusszytometrie basierenden Markeranalyse unterzogen wurden, wurden aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen reihenweise unter Verwendung von mit dem optimalen Verhältnis von Fab-G28.5-Konjugat komplexiertem AdGFP infiziert. 24 Stunden nach der Infektion wurden positive Zellen unter Verwendung der Durchflusszytometrie sichtbar gemacht.

BEISPIEL 9 Analyse der unterschiedlichen MOI zwischen auf CD40 zielgerichtetem und nicht-zielgerichtetem Ad

Zellen wurden reihenweise mit verschiedenen MOIs von auf CD40 zielgerichtetem und nicht-zielgerichtetem Virus infiziert. Fab-G28.5 wurde mit AdCMVLuc in einer 1000 MOI entsprechenden Konzentration komplexiert. Nachfolgend wurde diese Mischung in Serie auf MOIs von 500, 100, 50, 10 und 1 verdünnt. Gleichzeitig wurden Proben von Adenovirus ohne Konjugat zur neuen Zielausrichtung mit den gleichen MOIs zum Vergleich mit den zielgerichteten Proben hergestellt. Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden dann infiziert und auf Luciferase analysiert, wie dies in den Experimenten zum Luciferasegentransfer getan wurde.

BEISPIEL 10 Validierung von aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen

Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden durch die Behandlung von aus peripherem Blut isolierten Monozyten mit IL-4 und GM-CSF erzeugt. Die Identität dieser Zellen wurde auf zwei Arten validiert. Die Reinheit wurde durch Durchflusszytometrie auf das Fehlen der Expression von CD14, CD3 und CD19 gezeigt. Weiter zeigten die Zellen einen Phänotyp dendritischer Zellen mit einigen Schleierzellen und einer Mischung aus adhärenten und nicht-adhärenten Fraktionen, welche in vielzelligen Verbänden assoziiert waren. Diese aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen waren negativ für die Expression von Reifungsmarkern dendritischer Zellen, wie CD83 und waren somit unreif.

BEISPIEL 11 Die beobachtete Verbesserung im Gentransfer ist spezifisch für CD40

Um die Menge des für die optimale Beschichtung eines Adenovirus benötigten Konjugates zur neuen Zielausrichtung zu bestimmen, wurde das Konjugat auf eine vorab bestimmte Zahl viraler Partikel mit einer MOI von 100 titriert, wobei der Gentransfer in Form der Luciferaseexpression in aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen gemessen wurde. Aus Monozyten gewonnene dendritische Zellen wurden mit AdCMVLuc infiziert, welches vorab mit ansteigenden Konzentrationen von Fab-G28.5 inkubiert worden war. Auf CD40 zielgerichteter Gentransfer erreichte ein Maximum mit einem Fab-G28.5-Konjugat-Virus-Verhältnis von 30 ng Fab-G28.5 pro 2,4 × 106 pfu (1,75 × 108 Partikel/ml, wie durch OD260 bestimmt). Weitere Zunahmen im Konjugat : Virus-Verhältnis erwiesen sich, vermutlich verursacht durch die Konkurrenz um die Bindung an CD40 durch einen Überschuss von Fab-G28.5-Konjugat, als den Umfang des neu zielgerichteten Gentransfers reduzierend. Beim optimalen Verhältnis von Konjugat zu Virus zeigte auf CD40 zielgerichteter Adenovirus eine Verstärkung des Gentransfers in aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen von zwei log10, wie dies durch Expression des Luciferasereportergens bestimmt wurde. Diese optimale Dosis wurde in verschiedenen Weisen auf ihre Spezifität für CD40 analysiert.

Um den Anti-CD40 Antikörper als grundlegend mit den beobachteten Verbesserungen im Gentransfer in Zusammenhang zu bringen, wurden Zellen vorab mit dem Anti-CD40-Ausgangsantikörper G28.5 inkubiert. Wenn die Zellen in dieser Art blockiert wurden, wurde eine erwartete Verringerung im neu zielausgerichteten Gentransfer von 95% beobachtet. Um die Möglichkeit, dass der G28.5 mAb selbst einen verbesserten Gentransfer durch Adenovirus, unabhängig von seiner Verbindung mit dem Virion, vermittelte, auszuschließen, wurden Zellen vor der Infektion mit dem nicht-zielgerichteten Adenovirus vorab mit unkonjugiertem G28.5-mAb inkubiert, wobei die Vorbehandlung von Zellen mit dem G28.5-Monoclonalen vernachlässigbare Verbesserungen im Gentransfer ergab.

Um die Möglichkeit auszuschließen, dass das bispezifische Konjugat nichtspezifische Zellbindung vermittelte (oder spezifischer, durch Wechselwirkung von bispezifischem Antikörper mit Fc-Rezeptoren auf dendritischen Zellen), wurde ein irrrelevantes Konjugat mit Affinität für den auf dendritischen Zellen abwesenden Marker (EGFR) getestet. Das irrelevante Konjugat versagte bei der Vermittlung von Verbesserungen im Gentransfer, was weiter die Spezifität der beobachteten neuen Zielausrichtung auf CD40 zeigt. Als stringenter Test der Spezifität des Vektors wurden die vorstehenden Bedingungen auf der für CD40 negativen Gliomzelllinie D65 getestet. Das Versagen des durch Fab-G28.5 zielgerichteten Adenovirus, die Genexpression in D65 zu verbessern, zeigt weiter die Spezifität dieses Vektors für CD40.

BEISPIEL 12 Verbesserungen im Gentransfer sind durch quantitativ erhöhte Zahlen transduzierter Zellen begründet

Während der Luciferasegentransfer eine allgemeine Steigerung der Genexpression durch auf CD40 zielgerichtetes Adenovirus gezeigt hatte, konnte die Art dieses Tests anzeigen, ob tatsächlich eine erhöhte Zahl von Zellen transduziert worden war. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass wenige transduzierte Zellen als Ergebnis der neuen Zielausrichtung bloß eine mehr überschießende Genexpression zeigten, wurde ein einen quantitativen Marker, Green-Fluorescent-Protein, GFP, enthaltendes Adenovirus verwendet. Die Zahl der transduzierten Zellen wurde durch die Verwendung der Durchflusszytometrie überwacht. Es wurde festgestellt, dass verglichen mit mit nicht-zielgerichtetem Adenovirus infizierten Zellen auf CD40 zielgerichtetes Adenovirus quantitativ mehr Zellen transduzierte. Vergleichbare Niveaus von Gentransfer wurden mit zwei anderen Verfahren beobachtet, auf b1-Integrin zielgerichtetes Adenovirus und mit Liposomen komplexiertes Adenovirus. Dieser verbesserte Gentransfer war wiederum abwesend, wenn ein irrelevantes Konjugat mit EGFR verwendet wurde.

BEISPIEL 13 Fab-G28.5 verbessert den durch Adenovirus vermittelten Gentransfer in verschiedenen Spendern und eine solche neue Zielausrichtung kann die Virusdosis verringern, welche benötigt wird, um ein gegebenes Niveau der Transgenexpression zu erreichen

Um die Wirksamkeit dieser Strategie zur neuen Zielausrichtung gleichzeitig in verschiedenen Spendern zu vergleichen, wurde auf CD40 zielgerichtetes Adenovirus mit nicht zielgerichtetem Adenovirus bei mehreren MOIs auf aus Monozyten gewonnenen dendritischen Zellen verglichen. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass bei einer gegebenen MOI, neu zielgerichtetes Adenovirus einen Umfang von Gentransfer liefert, welcher bei nicht zielgerichtetem Adenovirus nur bei einer 100-fach höheren MOI beobachtet wird. Diese Ergebnisse heben einen signifikanten Vorteil von neu zielgerichtetem Adenovirus hervor, insofern als bei einem gegebenen Niveau des Gentransfers signifikant weniger infektiöse Virionen pro Zelle benötigt werden, wenn ein auf CD40 neu zielgerichtetes Adenovirus verwendet wird. Da höhere Virusdosen mit einer größeren durch Virus vermittelten direkten Zytotoxizität, genauso wie mit einer stärkeren Anti-Adenovirus Immunantwort, verbunden sind, hat die Möglichkeit, die verabreichte Virusdosis zu verringern, wichtige Auswirkungen auf die Verringerung der mit der Verwendung von adenoviralen Vektoren assoziierten Toxizitäten.

BEISPIEL 14 Durch auf CD40 zielgerichtetes Ad transduzierte MDCC zeigen phänotypische und funktionelle Eigenschaften von reifen dendritischen Zellen

Nachdem die verbesserte Effizienz des Gentransfers gezeigt wurde, wurde die Auswirkung von Virus auf dendritische Zellen, bezogen auf ihre phänotypischen und funktionellen Fähigkeiten untersucht. Um die Wirkungen von neu zielgerichteten adenoviralen Vektoren oder den Konjugaten zur neuen Zielausrichtung alleine auf die Reifung von dendritischen Zellen zu bestimmen, wurden mehrere Marker unter Verwendung der Durchflusszytometrie analysiert. 24 Stunden zuvor behandelte Zellen wurden auf die Expression von CD86, CD83, CD80, ICAM-1, MHC II (HLA-DR, HLA-DQ) und MHC I analysiert. Während keine Veränderungen im Phänotyp der dendritischen Zellen beobachtet wurden, wenn Adenovirus alleine verwendet wurde, wurden bei allen drei hocheffizienten adenoviralen Genabgabesystemen eindeutige Veränderungen, einschließlich der verstärkten Expression von CD86, HLA-DR und HLA-DQ beobachtet. Durch die Behandlung mit entweder Fab-Anti-CD40-Konjugat oder mit auf CD40 zielgerichtetem Adenovirus verliehene, einzigartige Eigenschaften schlossen jene Veränderungen, nämlich gesteigerte Expression von CD83 und I-CAM-1, ein, die am engsten mit der Reifung von dendritischen Zellen verbunden sind.

Ein strengeres Kriterium für die Reifung von dendritischen Zellen ist die gemischte Lymphozytenreaktion. Unter Verwendung mehrerer Vektoren oder Konjugate behandelte MDDC wurden mit Responderzellen von einem allogenen Spender kombiniert und auf ihre Fähigkeit getestet, eine Vermehrung von Responderzellen auszulösen. Während Adenovirus alleine keine Verstärkung in der MLR vermittelte, waren jegliche Behandlungen in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Adenovirus fähig, die Reaktivität der MDDC in der Allo-MLR dramatisch zu fördern (6). Zudem war die Wirkung von Konjugat alleine vergleichbar zu der, welche mit dem Konjugat mit Virus beobachtet wurde, während die Wirkung von unkonjugiertem mAb signifikant geringer war als jene, welche mit dem Fab-Anti-CD40-Konjugat in der Anwesenheit von Adenovirus beobachtet wurde. Eine mögliche Erklärung für die mit der Zielausrichtung auf CD40 beobachtete Reifungswirkungen könnte eine durch Virus vermittelte Wirkung durch den hocheffizienten Eintritt von adenoviralen Partikeln in dendritische Zellen sein. Aus diesem Grund wurden dendritische Zellen, welche mit den alternativen hocheffizienten adenoviralen Vektoren auf &bgr;1-Integrin zielgerichtetes Adenovirus oder mit Liposomen komplexiertes Adenovirus infiziert wurden, ebenfalls in einer MLR getestet. Das Versagen dieser alternativen Vektoren, bedeutsame Verbesserungen zu vermitteln legt nahe, dass das Reifungsphänomen mit CD40 assoziiert ist.

Als weiterer Beleg für funktionelle Reifung wurden Überstände von MDCC nach 48 Stunden auf die Produktion von IL-12, einem Zytokin, bei welchem die Expression charakteristisch für die Reifung von dendritischen Zellen ist (Cella M et al., Ligation of CD40 on dendritic cells riggers production of high levels of IL-12 and enhances T-cell stimulatory capacity: T-T help via APC activation. J. of Exp. Med. 184 (1996), 747–52) getestet (5). Die Ergebnisse zeigen auf, dass Spiegel von IL-12 in Überständen von Zellen dramatisch mehrfach erhöht waren, welche mit unkonjugiertem G28.5-mAb behandelt wurden, und dies sogar stärker mit neu zielausrichtendem Fab-Anti-CD40-Kojugat alleine oder mit auf CD40 neu zielgerichtetem Adenovirus.

Trotz enormem klinischen Potential wurde die verbreitete Anwendung genetisch veränderter dendritischer Zellen durch mehrere Hindernisse aufgehalten. Unter diese fallen die aufwändige Handhabung, welche für die Transduktion ex vivo benötigt wird, die schlechte Effizienz des Gentransfers durch bestehende Vektoren und die Notwendigkeit, dendritische Zellen in der Folge des Gentransfers zu einem immunologischen wirksamen Zustand zu reifen [Bancheareau J. und R. M Steinman, Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392 (1998), 245]. Im Prozess der Antigenaufnahme aktive periphere dendritische Zellen werden als „unreife dendritische Zellen" bezeichnet. Trotz aktiver Antigenaufnahme exprimieren diese Zellen nicht das geeignete Arsenal kostimulatorischer Moleküle und Zytokine, welche notwendig sind, um Eftektorzellen wie zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) zu aktivieren. Als solche müssen unreife dendritische Zellen durch die Aktivierung von CD40 in einen immunologisch wirksamen „reifen" Zustand differenziert werden (Bennett S. R. M. et al., Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD40 signaling. Nature 393 (1998), 478–480; Ridge J. P. et al., A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4+ T-helper and a T-killer cell. Nature 393 (1998), 474–7; Schoenberger S. P. et al., Nature 393 (1998), 478–80; Ridge J. P. et al., T-cell help for cytotoxic T-lymphocytes is mediated by cd40-cd40L interactions. 393 (1998), 480–3). Aus diesem Grund wurden die Wirkungen untersucht, welche die auf CD40 zielgerichteten Vektoren auf den Reifungszustand dendritischer Zellen haben.

Die Fähigkeit der Anti-CD40-Konjugate, und in einem geringeren Ausmaß des monomeren Antikörpers, die Reifung dendritischer Zellen in der Abwesenheit von Virus zu vermitteln, zeigt klar, dass das Reifungsphänomen vom Adenovirus unabhängig ist. Weiterhin scheint es, basierend auf der Expression von CD83 und ICAM-1, Produktion von IL-12 und der verbesserten MLR, welche fast ausschließlich bei der Behandlung von MDDC mit CD40 mAb, Fab-Anti-CD40-Konjugat und auf CD40 zielgerichtetem Adenovirus, aber nicht mit anderen getesteten adenoviralen Vektoren beobachtet wurde, ziemlich sicher, dass dieses Reifungsphänomen ein direktes und spezifisches Ergebnis der Zielausrichtung auf CD40 ist.

Die vorliegende Erfindung zeigt, dass die neue Zielausrichtung der adenoviralen Genabgabe auf CD40 dramatische Steigerungen im Umfang des Gentransfers und Reifungseffekte, welche spezifisch für CD40 sind, vermittelt. Daraus folgt, dass trotz der vergleichbaren Verbesserungen ex vivo durch durch auf Konjugat zielgerichtetes Adenovirus und mit Liposomen komplexiertes Adenovirus, die stärker zellspezifische Zielausrichtung und das Reifungspotential von auf CD40 zielausgerichtetem Adenovirus sich theoretisch zuverlässiger für in vivo Ansätze eignen würde.

Im scharfen Kontrast zu vorherigen Untersuchungen, welche eine gesteigerte Expression von CD40 bei der Reifung von dendritischen Zellen dokumentiert haben, zeigte die FACS-Analyse in allen Fällen, bei Verwendung eines CD40 mAb oder auf CD40 basierender Konjugate, eine Verminderung in der Oberflächenexpression von CD40 nach 24 Stunden. Da das Konjugat 48 Stunden nach der Behandlung auf der Zelloberfläche nachgewiesen wurde, ist es möglich, dass das zurückgehaltene Konjugat den nachfolgenden Nachweis von CD40 gestört haben könnte.

Die vorliegende Erfindung zeigt, dass das Fab-Anti-CD40-Konjugat dramatischere MLR-Reaktivität in MDDCs vermittelt, als dies mit unkonjugiertem Anti-CD40 mAb gesehen wird. Vorhergehende Berichte implizieren die Vernetzung von CD40 als Mittel, um den CD40-Reaktionsweg zu aktivieren, und hier werden zwei Wege vorgeschlagen, durch welche das vorliegende System die Vernetzungskinetiken dieses Antikörpers geändert hat. Als erstes eignet sich die innewohnende Trimereigenschaft des Fiber-Knob zur Bindung von bis zu drei Konjugatmolekülen an den zwölf Capsidspitzen. Das zweite ist die halbzufällige Natur des chemischen Vernetzungsverfahrens, welches Heterodimere mit Verhältnissen abseits eines einfachen 1 : 1 Fab zu Anti-CD40 mAb ergeben kann.

Zusammenfassend scheint es, dass das Adenovirus geringe Wirkungen auf den Phänotyp dendritischer Zellen vermittelt, diese Wirkungen aber nur gesehen werden, wenn eine ausreichende Zahl von Partikeln in jede Zelle eintreten, so wie bei den hocheffizienten durch Antikörper zielgerichteten oder mit Liposomen komplexierten auf Adenovirus basierenden Gentransfervektoren. Es ist interessant darüber zu spekulieren, ob die verstärkte Expression kostimulatorischer Moleküle, welche mit dem auf &bgr;1-Integrin zielgerichteten oder mit Liposomen komplexierten Adenovirus beobachtet werden, eine Folge des in die Zelle eintretenden Capsids selbst, der Expression des Transgens oder der Hintergrundexpression adenoviraler Gene ist. Die doppelte Rolle von CD40 in diesem Szenario als sowohl ein Ersatzrezeptor für das Adenovirus und auch als ein starker Auslöser der Reifung dendritischer Zellen wird als Strategie für die neue Zielausrichtung auf diesen zentralen Zelltyp des Immunsystems nützlich sein.

Ein Vorteil eines auf CD40 neu zielgerichteten adenoviralen Vektors ist, dass durch Abgabe eines Antigen-codierenden Gens ein größerer Pool von dendritischen Zellen erzeugt werden kann, welcher das Potential hat, Effektorzellen gegen ein interessierendes Antigen zu primen, besonders wichtig im Fall kryptischer Antigene, welche ansonsten für das Immunsystem unzugänglich sein könnten. Gründend auf der wichtigen Rolle von CD40 in der Aktivierung von dendritischen Zellen durch T-Helfer, könnte ein solches System auch Anwendungen durch Umgehung der Notwendigkeit für die Hilfe von CD4+ T-Zellen bei der Aktivierung von CTL haben. Während die Nützlichkeit von auf bispezifischen Antikörpern basierender Zielausrichtung von Adenovirus für klinische Zwecke zuvor vorgeschlagen wurde, wurden die Einschränkungen dieser auf Antikörpern basierenden Strategie für intensive klinische Anwendungen erkannt. Aus diesem Grund ist eine Strategie der genetischen Fusion zwischen der trimeren Fiber des Adenovirus und dem natürlichen Liganden von CD40, trimerem CD40L, nützlich.

BEISPIEL 15 Transduktion von B-Zellen

Es wurde schon vor einiger Zeit erkannt, dass Lymphozyten eine schwierige Zellart sind, in welche Gene abgegeben werden können. Von mehreren Arten von hämatopoetischen Zellen wurde das Versagen der Vermittlung einer Bindung und/oder Internalisierung von adenoviralen Partikeln dokumentiert (Silver L. und C. W. Anderson, Nonpermissivity of human peripheral blood lymphocytes to adenovirus type 2 infection. J. of Virology 62 (1988), 341–5; Mentel R. et al., Adenovirusreceptor interaction with human lymphocytes. J. of Med. Virology 51 (1997), 252– 7; Wattel E. et al., Differential efficacy of adenoviral mediated gene transfer into cells from hematological cell lines and fresh hematological maligancies. Leukemia 10 (1996), 171–4). Ein Versagen von primären B-Zellen, sowohl den primären adenoviralen Rezeptor CAR als auch die sekundären Rezeptoren, die av-Integrine, zu exprimieren wurde erkannt (7A und 7B). Dies würde das Versagen des Adenovirus erklären, diese Zellen effizient zu infizieren.

Um diese Unzulänglichkeit zu überwinden, wurden die Konjugate Fab-Anti-CD40 und Fab-Anti-&bgr;-1-Integrine, welche jeweils gegen die B-Zell-Marker CD40 und &bgr;-1-Integrine gerichtet sind, verwendet. Von beiden Konjugaten wurde erwartet, dass sie die Bindung wiederherstellen, um die Abwesenheit von CAR zu ersetzen und ein alternatives Verfahren für die Internalisierung von Virionen in diese Zellen bereitzustellen. Aufgrund der zuvor beschriebenen internalisierenden Funktion dieser Rezeptoren, wurde von diesen Konjugaten auch erwartet, die internalisierende Funktion der av-Integrine wiederherzustellen. Durch Verwendung einer dieser Strategien zur neuen Zielausrichtung wurde der Gentransfer in primäre B-Zellen um wenigstens das 10-fache gegenüber dem nicht zielgerichteten Adenovirus verbessert (8). Diese Ergebnisse sind besonders interessant, weil es scheint, dass die Zielausrichtung von Adenovirus auf CD40 oder die &bgr;-1-Integrine gleichzeitig die Unzulänglichkeit sowohl des primären Bindungsrezeptors als auch des sekundären internalisierenden Rezeptors überwunden hat.


Anspruch[de]
  1. Genabgabesystem für die Transduktion und Immunmodulation von Immunsystemzellen, die den CD40-Rezeptor aufweisen, umfassend:

    (a) ein Adenovirus, und

    (b) eine CD40-Antigen-erkennende Komponente, wobei die Komponente umfasst (1) einen ersten Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment von dem ersten Antikörper, der an das Fiber-Knob-Protein auf dem Adenovirus bindet, und (2) einen Anti-CD40-Antikörper G28.5 oder ein Antigen-bindendes Fragment des G28.5 Antikörpers, der/das an CD40 auf der Oberfläche von den Immunsystemzellen bindet, wobei der erste Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon an den Anti-CD40-Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon gebunden ist.
  2. Genabgabesystem nach Anspruch 1, wobei der erste Antikörper und der Anti-CD40-Antikörper genetisch miteinander fusioniert sind.
  3. Genabgabesystem nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das System weiterhin ein therapeutisches Gen umfasst.
  4. Genabgabesystem nach Anspruch 3, wobei das therapeutische Gen aus der Gruppe, bestehend aus einem Gen, das ein Tumorantigen codiert, einem Gen, das ein Antigen gegen einen infektiösen Erreger codiert, einem Gen, das ein Autoimmunantigen codiert, einem immunmodulatorischen Gen und einem Gen, das ein zytotoxisches Mittel codiert, ausgewählt ist.
  5. Genabgabesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Immunsystemzellen aus der Gruppe, bestehend aus dendritischen Zellen und B-Zellen, ausgewählt sind.
  6. Genabgabesystem nach Anspruch 5, wobei die B-Zellen nach Kontakt mit dem System gereift sind.
  7. Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend ein Adenovirus und eine CD40-Antigen-erkennende Komponente, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur genetischen Manipulation von Immunsystemzellen in einem Individuum bei Bedarf solcher Behandlung, wobei die CD40-Antigen-erkennende Komponente umfasst (1) einen ersten Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment des ersten Antikörpers, das/der an das Fiber-Knob-Protein auf dem Adenovirus bindet, und (2) einen Anti-CD40-Antikörper G28.5 oder ein Antigen-bindendes Fragment des G28.5 Antikörpers, das an CD40 auf der Oberfläche der Immunsystemzellen bindet, wobei der erste Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon an den Anti-CD40-Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment davon gebunden ist.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei das Individuum eine Krankheit, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Krebs, einer Infektionskrankheit, Allotransplantatabstoßung, Xenotransplantatabstoßung und Autoimmunerkrankungen, aufweist.
  9. Verwendung nach entweder Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei die Immunsystemzellen aus der Gruppe, bestehend aus dendritischen Zellen und B-Zellen, ausgewählt sind.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die B-Zellen während solcher Behandlung gereift sind.
  11. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die Zusammensetzung weiterhin ein therapeutisches Gen umfasst.
Es folgen 9 Blatt Zeichnungen






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