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Dokumentenidentifikation DE69635971T2 17.08.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0000756168
Titel Verfahren zur Messung von Amadori-Verbindungen durch Lichtstreuung
Anmelder ARKRAY, Inc., Kyoto, JP
Erfinder Yamaguchi, Kyoto Dai-ichi Kagaku, Yoshinori, Higashi Kujo, Minami-ku, Kyoto 601, JP;
Dou, Kyoto Dai-ichi Kagaku Co., Xiaoming, Higashi Kujo, Minami-ku, Kyoto 601, JP;
Yagi, Kyoto Dai-ichi Kagaku Co., Masayuki, Higashi Kujo, Minami-ku, Kyoto 601, JP;
Uenoyama, Kyoto Dai-ichi Kagaku Co., Harumi, Higashi Kujo, Minami-ku, Kyoto 601, JP
Vertreter Schoppe, Zimmermann, Stöckeler & Zinkler, 82049 Pullach
DE-Aktenzeichen 69635971
Vertragsstaaten DE, FR, GB, IT
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 19.07.1996
EP-Aktenzeichen 961116977
EP-Offenlegungsdatum 29.01.1997
EP date of grant 29.03.2006
Veröffentlichungstag im Patentblatt 17.08.2006
IPC-Hauptklasse G01N 21/65(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse G01N 21/00(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/66(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   G01N 33/68(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]
Hintergrund der Erfindung Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Durchführen einer quantitativen Messung einer Amadori-Verbindung, wie z. B. von verzuckertem Albumin, verzuckertem Hämoglobin oder verzuckertem Globulin.

Beschreibung der Hintergrundtechnik

Wenn eine Substanz (im Folgenden als Protein oder dergleichen bezeichnet), die eine Aminogruppe aufweist, wie z. B. ein Protein, Peptid oder eine Aminosäure, mit einem reduzierenden Zucker, wie z. B. Aldose, koexistiert, werden Teilamino- und Aldehyd-Gruppen nichtenzymatisch und nichtreziprok aneinander gebunden, um eine Amadori-Umlagerung zu bewirken, wodurch eine Amadori-Verbindung gebildet wird. Die Bildungsrate der Amadori-Verbindung ist in einer Funktion ausgedrückt, wie z. B. der Konzentration der reaktiven Substanz, der Kontraktzeit, der Temperatur oder dergleichen. So ist zu beachten, dass verschiedene Daten, die auf die Substanz bezogen sind, die die reaktive Substanz beinhaltet, aus der Menge einer Bildung derselben erhalten werden können. Substanzen, die Amadori-Verbindungen beinhalten, sind Lebensmittel, wie z. B. Sojasoße, Körperfluide, wie z. B. Blut, und dergleichen.

In einem Organismus z. B. ist Glukose an eine Aminosäure gebunden, um ein Fructosylamin-Derivat zu bilden, das eine Amadori-Verbindung ist. Ein Fructosylamin-Derivat, das durch Verzuckerung von Hämoglobin in dem Blut gebildet wird, wird Glycohämoglobin genannt, ein Fructosylamin-Derivat, das durch Verzuckerung von Albumin gebildet wird, wird Glycoalbumin genannt, und ein Fructosylamin-Derivat, das durch Verzuckerung eines Proteins in dem Blut gebildet wird, wird Fructosamin genannt. Die intravaskuläre Konzentration eines derartigen Fructosylamin-Derivats spiegelt den durchschnittlichen Blutzuckerpegel in einer vergangenen konstanten Periode wider und ihr gemessener Wert kann ein wichtiger Index für eine Diagnose einer Diabeteskrankheit und einer Steuerung der Krankheit sein, und so ist die Einrichtung einer Amadori-Verbindung-Messvorrichtung klinisch extrem nützlich. Ferner ist es möglich, den Zustand und die Periode einer Konservierung von Lebensmitteln nach einer Erzeugung durch das Bestimmen einer Amadori-Verbindung, die in dem Lebensmittel enthalten ist, zu erkennen, und dies ist vorstellbar nützlich für eine Qualitätssteuerung.

So ist eine quantitative Analyse einer Amadori-Verbindung über breite Gebiete, einschließlich derer von Medizinwissenschaft und Lebensmitteln, nützlich.

Allgemein sind ein Verfahren, das eine hochgeschwindigkeitsmäßige Flüssigchromatographie verwendet (Bezug auf Chromatogr. Sci., 10, 659 (1979)), ein Verfahren, das eine Säule verwendet, die mit einem Feststoff gefüllt ist, der an Borsäure gebunden ist (Bezug auf Clin. Chem., 28, 2.088 (1982)), Elektrophorese (Bezug auf Clin. Chem., 26, 1.598 (1980)), ein Verfahren, das eine Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet (Bezug auf JJCLA, 18, 620 (1993) und Kiki-Shiyaku, 16, 33–37 (1993)), ein Fructosamin-Messverfahren (Bezug auf Clin. Chem. Acta., 127, 87–95 (1982)), ein Verfahren zur Durchführung einer colorimetrischen Bestimmung nach einer Oxidation mit Thiobarbitursäure (Bezug auf Clin. Chem. Acta., 112, 179–204 (1981)), ein radioimmunologischer Versuch (RIA) und dergleichen als Verfahren zur Bestimmung von Amadori-Verbindungen bekannt.

Sowohl die Elektrophorese als auch die Chromatographie jedoch benötigen eine lange Zeit zur Messung mit einer komplizierten Funktionsweise, während ein gemessener absoluter Wert eines Proteins so durch eine Substanz, die eine enge Affinität aufweist, die in einer gemischten Substanz enthalten ist, beeinflusst wird, dass eine korrekte quantitative Messung schwer durchzuführen ist.

Während der RIA bei Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit überlegen ist, ist ein Etikettiervorgang kompliziert und mühsam.

Während das Fructoamin-Messverfahren eine Reduktionskraft von Fructosamin in einer alkalischen Lösung nutzt, wird ein Messfehler leicht durch einen Einfluss von einer anderen reduzierenden Substanz bewirkt.

Während es einfach und wirksam ist, wenn eine Amadori-Verbindung, wie z. B. ein verzuckertes Protein, durch Bestrahlen einer Substanz mit Licht unter Verwenden ihres Lichtstreuspektrums bestimmt werden kann, wurde noch kein derartiges Beispiel zum Messen einer Amadori-Verbindung durch ein derartiges Lichtstreuspektrum berichtet.

Chira u. a., „Light Scattering by Blood Components after Supplying Glucose", Biomed Technik, Bd. 35, Nr. 5, 1990, Seiten 102–106, beschreiben eine Verwendung einer Lichtstreuung zum Analysieren von Blutkomponenten. Ein Laserstrahl wird auf eine Probezelle fokussiert und die Intensität einer Laserlichtstreuung wird zwischen Winkeln von 3° und 23° untersucht. Veränderungen des Mittelwerts der Intensität des gestreuten Lichts wurden nach einem Zuführen menschlichen Albumins und von Glukose zum Bestimmen relativer Werte der Veränderung der verschiedenen Blutkomponenten und Amadori-Produkte bestimmt.

Tammic u. a., „The Infrared Spectra and Structure of the Amadori Product Formed from Glucose and Glycine", Applied Spectroscopy, Bd. 39, Nr. 4, 1985, Seiten 591–594, zeigen eine optische IR-Spektroskopie für DFG (Deoxyfructose-Glycin). Spektren werden für drei ionische Formen von DFG aufgezeichnet und mehrere Bänder werden für die unterschiedlichen ionischen Formen beobachtet.

Das Problem der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein einfaches und verbessertes Verfahren zum Messen einer Amadori-Verbindung bereitzustellen.

Die obige Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst.

Die vorliegende Erfindung ist angepasst, um eine Probe, die eine Amadori-Verbindung beinhaltet, mit Anregungslicht einer einzelnen Wellenlänge zum Empfangen von Streulicht von der Probe und Trennen desselben in seine Spektralkomponenten zum Erhalten eines Lichtstreuspektrums zu bestrahlen, und eine quantitative Messung der Amadori-Verbindung durch eine Lichtstreuspitze, die bei 820–840 cm–1, 1.655–1.660 cm–1, 2.000–2.020 cm–1, 2.080–2.100 cm–1, 2.460–2.470 cm–1 oder 2.530–2.600 cm–1 angegeben in einer Versatzwellenzahl in Bezug auf die Anregungswellenlänge in dem Lichtstreuspektrum vorliegt, durchzuführen.

In dem Lichtstreuspektrum, das durch ein Bestrahlen der Probe, die eine Amadori-Verbindung beinhaltet, mit Anregungslicht einer einzelnen Wellenlänge erhalten wird, überlappen Lichtstreuspitzen ein Fluoreszenzspektrum. Wenn eine arithmetische Operation eines Entfernens des Fluoreszenzspektrumteils durchgeführt wird, ist es einfach, eine Spitzenintensität oder einen Integralwert einer der Lichtstreuspitzen zu erhalten. Dann kann eine quantitative Messung der Amadori-Verbindung auf der Basis der Spitzenintensität oder des so erhaltenen Integralwerts ausgeführt werden.

So ist die vorliegende Erfindung einfach angepasst, um eine Probe mit Anregungslicht einer einzelnen Wellenlänge zu bestrahlen, gestreutes Licht von der Probe zu empfangen und dasselbe in seine Spektralkomponenten zu trennen, wodurch eine Amadori-Verbindung quantitativ durch ein einfaches optisches Messverfahren gemessen werden kann.

Die quantitative Messung umfasst sowohl den Fall eines Messens der Menge einer Amadori-Verbindung, die in einer Probe enthalten ist, als auch den Fall eines Messens des Verzuckerungsverhältnis eines Proteins oder dergleichen in der Probe. Das Verzuckerungsverhältnis ist wie folgt definiert:

Jeder gemessene Wert kann durch eine Kalibrierungskurve erhalten werden.

In dem erhaltenen Lichtstreuspektrum spiegelt das Fluoreszenzspektrum die Gesamtsumme von (Amadori-Verbindung + Protein oder dergleichen) wider. Bei einem bevorzugten Verfahren zum Messen des Verzuckerungsverhältnis eines Proteins oder dergleichen kann deshalb eine korrekte Messung durch ein Verwenden des Verhältnis I/S einer Spitzenintensität oder eines Integralwerts I einer beliebigen von Lichtstreuspitzen des Lichtstreuspektrums zu einem Integralwert S einer Wellenzahlregion, die willkürlich gesetzt ist, durch ein Ausschließen von 820–840 cm–1, 1.655–1.660 cm–1, 2.000–2.020 cm–1, 2.080–2.100 cm–1, 2.460–2.470 cm–1 und 2.530–2.600 cm–1 angegeben in einer Versatzwellenzahl in Bezug auf die Anregungswellenlänge in dem Lichtstreuspektrum, durchgeführt werden.

Die vorangegangenen und weitere Aufgaben, Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen besser ersichtlich werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

1A und 1B stellen die Lichtstreuspektren von Humanserum albuminproben mit Verzuckerungsverhältnissen von 24,1 % bzw. 58,2 % dar;

2 stellt das Lichtstreuspektrum einer wässrigen Glukoselösung einer hohen Konzentration dar;

3A und 3B stellen Lichtstreuspektren dar, die durch ein Durchführen einer arithmetischen Operation eines Entfernens von Fluoreszenzspektren aus den Spektren, die in den 1A und 1B gezeigt sind, erhalten werden;

4 stellt eine Kalibrierungskurve dar, die die Beziehung zwischen Spitzenintensitäten einzelner Spitzen von Lichtstreuspektren und Verzuckerungsverhältnissen zeigt;

5 stellt eine Kalibrierungskurve dar, die die Beziehung zwischen Integralwerten der einzelnen Spitzen der Lichtstreuspektren und den Verzuckerungsverhältnissen zeigt;

6 stellt die Beziehung zwischen Albumin-Konzentrationen und Integralwerten von Fluoreszenzspektren dar;

7A und 7B stellen Lichtstreuspektren einer Amadori-Verbin dung vor bzw. nach der Zugabe eines Zersetzungsenzyms dar;

8 stellt die Lichtstreuspektren von N&agr;-Z-Lysin dar;

9 stellt Veränderungen von Lichtstreuspitzen mit der Zeit ab unmittelbar nach einer Zugabe des Zersetzungsenzyms bei der in den 7A und 7B gezeigten Messung dar;

10A stellt ein Lichtstreuspektrum einer Humanblut-Hämoglobinprobe (unbekanntes Verzuckerungsverhältnis) nach einem Entfernen des Fluoreszenzspektrums dar;

10B stellt eine Beziehung zwischen Hämoglobin-Konzentrationen und Integralwerten von Fluoreszenzspektren dar; und

11A und 11B stellen Lichtstreuspektren von Valin bzw. verzu ckertem Valin dar.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsbeispiele

Die 1A und 1B stellen Lichtstreuspektren dar, die durch ein Bestrahlen wässriger Humanserumalbumin-Lösungen mit einer Konzentration von 10 mg/dl, die Verzuckerungsverhältnisse von 24,1 % bzw. 58,2 % aufweisen, mit Laserstrahlen mit einer Wellenlänge von 632,8 nm, die aus einer He-Ne-Lasereinheit mit einer Ausgabe von 7 mW emittiert werden bzw. dieselbe anregen, erhalten werden. Bezug nehmend auf diese Figuren zeigen die Achsen von Abszissen Lichtstreuversätze von den Wellenlängen der He-Ne-Laserstrahlen angegeben in Wellenzahlen und die Achsen von Ordinaten zeigen Streulichtintensitäten.

Bei den in den 1A und 1B gezeigten Lichtstreuspektren erscheinen scharfe Spitzen an den gleichen Lichtstreuversatzpositionen und die Spitzenintensitäten sind in der Probe, die das höhere Verzuckerungsverhältnis aufweist, höher. Als Lichtstreuspektren wässriger Glukose-Lösungen, die ähnliche Konzentrationen wie die Proben aufweisen, die in den 1A und 1B gezeigt sind, gemessen wurden, wurden keine gleichen Spitzen beobachtet. 2 zeigt das Lichtstreuspektrum einer wässrigen Glukose-Lösung mit einer hohen Konzentration von 10.000 mg/dl und einige Spitzen, die in dieser Figur erscheinen, unterscheiden sich in ihrer Position von den scharfen Spitzen, die in den 1A und 1B gezeigt sind. Folglich wird darauf verwiesen, dass die scharfen Lichtstreuspitzen, die in den 1A und 1B erscheinen, nicht aufgrund von Glukose sind, sondern verzuckertem Albumin.

Bezug nehmend auf die 1A und 1B sind gewinkelte hohe und lose Spitzen Fluoreszenz von Albumin und verzuckertem Albumin und die Lichtstreuspitzen durch verzuckertes Albumin überlappen hohe Fluoreszenzspitzen und stehen von denselben vor.

Die Lichtstreuspitzen durch verzuckertes Albumin liegen um 830 cm–1, 1.658 cm–1, 2.009 cm–1, 2.082 cm–1, 2.463 cm–1 und 2.544 cm–1 angegeben in einer Versatzwellenzahl von den Wellenlängen der He-Ne-Laserstrahlen vor.

Die 3A und 3B stellen Lichtstreuspektren dar, die nach einem Entfernen der Fluoreszenzspektrumteile aus den Lichtstreuspektren, die in den 1A bzw. 1B gezeigt sind, als Hintergrundsignale erhalten werden. So können die Spitzenintensitäten und die Spitzenintegralwerte (Bereiche) der Lichtstreuspitzen ohne weiteres durch ein Entfernen der Fluoreszenzspektrumteile erhalten werden.

4 stellt die Beziehung zwischen Verzuckerungsverhältnissen und Spitzenhöhen nach einer Entfernung von Fluoreszenzspektrumteilen in Bezug auf Standardproben wässriger Humanserumalbumin-Lösungen mit unterschiedlichen Verzuckerungsverhältnissen dar. Eine Spitze um 1.658 cm–1 angegeben in einer Versatzwellenzahl von der Wellenlänge eines He-Ne-Laserstrahls wurde gemessen. Standardproben wässriger Humanserumalbumin-Lösungen mit Verzuckerungsverhältnissen von 24,1 % und 58,2 % sind kommerziell erhältlich. Standardproben mit anderen Verzuckerungsverhältnissen wurden durch ein Mischen der kommerziell verfügbaren Standardproben miteinander hergestellt. Die in 4 gezeigten Standardproben weisen Verzuckerungsverhältnisse von 24,1 %, 31,3 %, 38,7 %, 45,5 %, 51,9 % bzw. 58,2 % auf. Die numerischen Werte der Verzuckerungsverhältnisse dieser Standardproben wurden mit einer vollautomatischen Glycoalbumin-Bruchteils-Bestimmungsvorichtung GAA-2000 (Produkt von Kyoto Dai-ichi Kagaku Co., Ltd.) gemessen.

Gemäß 4 besteht eine lineare Beziehung zwischen den Verzuckerungsverhältnissen und den Spitzenintensitäten der Lichtstreuspektren und so können die Ergebnisse als eine Kalibrierungskurve für Verzuckerungsverhältnisse eingesetzt werden. Ferner sind (verzuckertes Albumin + Albumin)-Konzentrationen der Standardproben, die zum Messen der Daten für die Kalibrierungskurve verwendet werden, konstant uns so kann diese Kalibrierungskurve auch zu derjenigen umgeleitet werden, die Konzentrationen verzuckerten Albumins und Spitzenintensitäten von Lichtstreuspektren ausdrückt. Wenn diese Kalibrierungskurve verwendet wird, kann deshalb das Verzuckerungsverhältnis oder die Konzentration des verzuckerten Albumins in Bezug auf eine unbekannte Probe durch ein Messen einer Spitzenintensität eines Lichtstreuspektrums erhalten werden.

5 stellt Ergebnisse dar, die durch ein Messen der Beziehung zwischen den Verzuckerungsverhältnissen und den Lichtstreuspitzenintegralwerten durch die Integralwerte der gleichen Spitzen der Lichtstreuspektren durch die gleichen Standardproben erhalten werden. Außerdem wird in diesem Fall eine lineare Beziehung zwischen den Verzuckerungsverhältnissen und den Spitzenintegralwerten erhalten und diese Beziehung kann auch als eine Kalibrierungskurve eingesetzt werden. Deshalb kann das Verzuckerungsverhältnis oder die Konzentration verzuckerten Albumins in Bezug auf eine unbekannte Probe durch ein Messen eines Spitzenintegralwerts anstelle der Spitzenintensität der Spitze des Lichtstreuspektrums erhalten werden.

Die linearen Beziehungen der 4 und 5 gelten ähnlich auch in Bezug auf die verbleibenden Lichtstreuspitzen, die in den 3A und 3B gezeigt sind.

Um das Verzuckerungsverhältnis einer unbekannten Probe aus der Kalibrierungskurve zu erhalten, die die Beziehung zwischen den Verzuckerungsverhältnissen und den Spitzenintensitäten oder den Spitzenintegralwerten, die in 4 oder 5 gezeigt sind, zeigt, ist es nötig, die Konzentration der unbekannten Probe so einzustellen, dass ihre (verzuckertes Albumin + Albumin)-Konzentration identisch zu denjenigen der Standardproben ist, oder den gemessenen Wert so umzuwandeln, dass die (verzuckertes Albumin + Albumin)-Konzentration identisch ist. Bei den in den 1A und 1B gezeigten Lichtstreuspektren andererseits werden die Fluoreszenzspektren auch gleichzeitig zusätzlich zu den Lichtstreuspitzen erfasst. 6 stellt Ergebnisse dar, die durch ein Messen von Integralwerten (Intensitäten auf der Achse von Ordinaten) in einer Region von 416,508–1.434,74 cm–1 angegeben in einer Versatzwellenzahl von der Wellenlänge des He-Ne-Laserstrahls in den Fluoreszenzspektren in Bezug auf Standardproben, die unterschiedliche (verzuckertes Albumin + Albumin)-Konzentrationen aufweisen, erhalten werden. Eine lineare Beziehung wird zwischen den (verzuckertes Albumin + Albumin)-Konzentrationen und den Integralwerten der Fluoreszenzspektren erhalten und so können die Verzuckerungsverhältnisse, die aus den Spitzenintensitäten oder den Spitzenintegralwerten der Lichtstreuspitzen von verzuckertem Albumin erhalten werden, durch die (verzuckertes Albumin + Albumin)-Konzentrationen auf der Basis der Integralwerte der Fluoreszenzspektren verbessert werden. Die Wellenzahlregion zum Integrieren der Fluoreszenzspektren kann willkürlich ausgewählt werden, solange die Fluoreszenzspektren in der Region erscheinen, und ist nicht auf Obiges eingeschränkt.

Wenn das Verhältnis I/S einer Spitzenintensität oder eines Integralwerts I einer beliebigen der Lichtstreuspitzen zu einem Integralwert S einer willkürlich gesetzten Wellenzahlregion eines Fluoreszenzspektrumteils eines Lichtstreuspektrums als ein Parameter zum Erhalten einer Kalibrierungskurve verwendet wird, die die Beziehung zwischen Verzuckerungsverhältnissen und I/S-Werten in Bezug auf eine Mehrzahl von Standardproben zeigt, die unterschiedliche Verzuckerungsverhältnisse aufweisen, und I/S-Werte der Lichtstreuspektren, die zum Bilden der Kalibrierungskurve verwendet werden, als eine unbekannte Probe gemessen und auf die Kalibrierungskurve angewendet werden, kann ein Verzuckerungsverhältnis, das mit der Albuminkonzentration korrigiert wird, erhalten werden.

Während bei der obigen Beschreibung eine Messung in Bezug auf verzuckertes Albumin unter einem verzuckerten Protein durchgeführt wird, sind diese Lichtstreuspitzen gemeinsam für Amadori-Verbindungen zu beobachten, wie z. B. ein verzuckertes Peptid und eine verzuckerte Aminosäure, zusätzlich zu einem anderen verzuckerten Protein. Während die klinisch wichtigen unter Amadori-Verbindungen verzuckertes Albumin, verzuckertes Hämoglobin und Fructosamin sind, die ein verzuckertes Protein sind, ist die vorliegende Erfindung auch auf andere Amadori-Verbindungen anwendbar.

10A stellt ein Lichtstreuspektrum einer Humanblut-Hämoglobinprobe (unbekanntes Verzuckerungsverhältnis) als ein weiteres Beispiel eines verzuckerten Proteins dar. Das Spektrum wird durch ein Bestrahlen der wässrigen Humanblut-Hämoglobinlösung mit einem Laserstrahl mit einer Wellenlänge von 632,8 nm, der aus einer He-Ne-Lasereinheit mit eine Ausgabe von 7 mW emittiert wird und ein Entfernen eines Fluoreszenzspektrumteils als Hintergrundsignal erhalten. Ebenso erscheinen in dem Spektrum aus 10A scharfe Spitzen an den gleichen Lichtstreuversatzpositionen wie in den Spektren der 3A und 3B.

10B stellt ein Ergebnis dar, das durch ein Messen von Integralwerten (Intensitäten auf der Achse der Ordinate) in einer geeigneten Region angegeben in einer Versatzwellenzahl von der Wellenlänge des He-Ne-Laserstrahls in dem Fluoreszenzspektrum in Bezug auf Standardproben, die unterschiedliche Hämoglobinkonzentrationen aufweisen, erhalten wird. Außerdem wird in dem Fall von Hämoglobin eine lineare Beziehung zwischen den Hämoglobinkonzentrationen (d. h. verzuckertes Hämoglobin + Hämoglobin) und den Integralwerten der Fluoreszenzspektren erhalten und so können die Verzuckerungsverhältnisse, die aus den Spitzenintensitäten oder den Spitzenintegralwerten der Lichtstreuspektren von verzuckertem Hämoglobin erhalten werden, durch die Hämoglobinkonzentrationen auf der Basis der Integralwerte der Fluoreszenzspektren korrigiert werden.

Die 7A und 7B stellen Ergebnisse, die durch ein Zersetzen einer verzuckerten Aminosäure, die eine Amadori-Verbindung ist, mit einer Enzym-Fructosylaminosäure-Oxidase oder dergleichen erhalten werden, die insbesondere mit einem gebundenen Teil (Fructose-Struktur) zwischen der Glukose und Aminosäure reagieren und Veränderungen von Spitzen untersuchen, als ein Beispiel dar das zeigt, dass die sechs Lichtstreuspitzen in jeder der 1A und 1B diejenigen sind, die spezifisch für eine Amadori-Verbindung sind. 7A stellt ein Lichtstreuspektrum durch He-Ne-Laseranregung einer wässrigen N&egr;-Fructosyl-N&agr;-Z-Lysin-(FZL-)Lösung dar, die vor einer Reaktion mit einem derartigen Enzym eine verzuckerte Aminosäure ist. Ein Lichtstreuspektrum, das nach einer Reaktion der Probelösung mit dem Zersetzungsenzym der verzuckerten Aminosäure erhalten wird, ist in 7B gezeigt und Spitzenintensitäten der Spitzen, die spezifisch für die Amadori-Verbindung sind, sind verglichen mit dem in 7A gezeigten Spektrum reduziert. Ein Lichtstreuspektrum, das durch ein Bestrahlen einer Standardprobe N&agr;-Z-Lysin (&agr;ZL), das eine Aminosäure ist, die aus einer Zersetzung von FZL durch das Zersetzungsenzym der verzuckerten Aminosäure resultiert, mit einem He-Ne-Laserstrahl erhalten wird, ist in 8 gezeigt, wobei keine spezifischen Lichtstreuspitzen, die in den 7A und 7B erscheinen, beobachtet werden.

Ergebnisse, die durch ein Messen von Veränderungen der Spitzenintensitäten an den Spitzen von 1.658 cm–1 angegeben in einer Versatzwellenzahl von der He-Ne-Laserwellenlänge in Bezug auf Zeiten ab einer Zugabe des Zersetzungsenzyms der verzuckerten Aminosäure in den 7A und 7B erhalten werden, sind in 9 gezeigt. Die verzuckerte Aminosäure wird durch das Zersetzungsenzym zersetzt und die Spitzenintensitäten werden mit der Zeit reduziert. So wird darauf verwiesen, dass diese charakteristischen Lichtstreuspitzen diejenigen durch ein Binden zwischen Zucker und Aminosäure sind.

Die 11A und 11B stellen Lichtstreuspektren von Valin als einer weiteren Aminosäure bzw. verzuckertem Valin als einer verzuckerten Aminosäure hiervon dar. Das Spektrum von verzuckertem Valin weist außerdem charakteristische Lichtstreuspitzen einer Amadori-Verbindung auf.


Anspruch[de]
  1. Ein Verfahren zum Messen einer Amadori-Verbindung durch Bestrahlen einer Probe, die die Amadori-Verbindung beinhaltet, mit Anregungslicht einer einzelnen Wellenlänge, Empfangen gestreuten Lichts von der Probe und Trennen des gestreuten Lichts in seine Spektralkomponenten zum Erhalten eines Lichtstreuspektrums, dadurch gekennzeichnet, dass eine quantitative Messung der Amadori-Verbindung durch eine von Lichtstreuspitzen, die bei 820–840 cm–1, 1.655–1.660 cm –1, 2.000–2.020 cm–1, 2.080–2.100 cm–1, 2.460–2.470 cm–1 oder 2.530–2.600 cm–1 angegeben in einer Versatzwellenzahl in Bezug auf die Anregungswellenlänge in dem Lichtstreuspektrum vorliegen, durchgeführt wird, wobei die quantitative Messung den Schritt eines Durchführens einer Verzuckerungsverhältnismessung der Amadori-Verbindung auf der Basis des Verhältnis I/S einer Spitzenintensität oder eines Integralwerts I der einen von Lichtstreuspitzen zu einem Integralwert S eines Fluoreszenzspektrums einer willkürlich gesetzten Wellenzahlregion in dem Lichtstreuspektrum aufweist.
  2. Das Verfahren zum Messen einer Amadori-Verbindung gemäß Anspruch 1, bei dem eine arithmetische Operation eines Entfernens eines Fluoreszenzspektrumteils aus dem Lichtstreuspektrum durchgeführt wird und danach die quantitative Messung der Amadori-Verbindung auf der Basis der Spitzenintensität oder des Integralwerts der einen von Lichtstreuspitzen durchgeführt wird.
  3. Das Verfahren zum Messen einer Amadori-Verbindung gemäß Anspruch 1, bei dem eine Konzentration oder ein Verzuckerungsverhältnis der Amadori-Verbindung, die/das auf der Basis der Spitzenintensität oder des Integralwerts der einen von Lichtstreuspitzen erhalten wird, durch einen Integralwert einer willkürlich gesetzten Wellenzahlregion in dem Lichtstreuspektrum korrigiert wird.
  4. Das Verfahren zum Messen einer Amadori-Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem der Integralwert S des Fluoreszenzspektrums derjenige in einer willkürlich gesetzten Wellenzahlregion ausschließlich aller von 820–840 cm–1, 1.655–1.660 cm–1, 2.000–2.020 cm–1, 2.080–2.100 cm–1, 2.460–2.470 cm–1 und 2.530–2.600 cm–1 angegeben in einer Versatzwellenzahl in Bezug auf die Anregungswellenlänge in dem Lichtstreuspektrum ist.
  5. Das Verfahren zum Messen einer Amadori-Verbindung gemäß Anspruch 1, bei dem die gemessene Amadori-Verbindung verzuckertes Albumin, verzuckertes Hämoglobin oder Fructosamin ist.
  6. Das Verfahren zum Messen einer Amadori-Verbindung gemäß Anspruch 1, bei dem eine He-Ne-Lasereinheit als eine Anregungslichtquelle eingesetzt wird.
Es folgen 11 Blatt Zeichnungen






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