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Dokumentenidentifikation DE60024112T2 24.08.2006
EP-Veröffentlichungsnummer 0001216053
Titel INFLUENZAVIRUS-IMPFSTOFFZUSAMMENSETZUNG
Anmelder GlaxoSmithKline Biologicals S.A., Rixensart, BE;
Sächsisches Serumwerk Dresden Branch of SmithKline Beecham Pharma GmbH, 01069 Dresden, DE
Erfinder D'HONDT, Erik, B-1330 Rixensart, BE;
HEHME, Norbert, 0106 9 Dresden, DE
Vertreter HOFFMANN & EITLE, 81925 München
DE-Aktenzeichen 60024112
Vertragsstaaten AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LI, LU, MC, NL, PT, SE
Sprache des Dokument EN
EP-Anmeldetag 27.09.2000
EP-Aktenzeichen 009660846
WO-Anmeldetag 27.09.2000
PCT-Aktenzeichen PCT/EP00/09509
WO-Veröffentlichungsnummer 2001022992
WO-Veröffentlichungsdatum 05.04.2001
EP-Offenlegungsdatum 26.06.2002
EP date of grant 16.11.2005
Veröffentlichungstag im Patentblatt 24.08.2006
IPC-Hauptklasse A61K 39/145(2006.01)A, F, I, 20051017, B, H, EP
IPC-Nebenklasse A61P 31/12(2006.01)A, L, I, 20051017, B, H, EP   

Beschreibung[de]

Diese Erfindung betrifft neue Impfstofformulierungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Impfstoffstoffe zur Verabreichung während Pandemien.

Das Influenzavirus ist eines der am allgegenwärtigsten Viren, das in der Welt vorhanden ist, und beeinflußt sowohl Menschen als auch Vieh, wobei es ein bislang unvorhersehbares Muster regelmäßiger Epidemien und unregelmäßiger Pandemien verfolgt.

Obwohl sie häufig als eine triviale Erkrankung betrachtet wird, kann Influenza eine verheerende Wirkung haben. Ausbrüche wurden immer wieder in der Geschichte aufgezeichnet. Es ist bekannt, daß seit 1580 über 30 weltweite Epidemien oder Pandemien aufgetreten sind, von denen vier in diesem Jahrhundert waren.

Die gewöhnlichen Symptome von Influenza schließen Huster, Fieber, Kopfschmerz und Muskelschmerzen ein. Viele Leidtragende entwickeln Komplikationen oder sekundäre bakterielle Infektionen, die sehr ernsthaft und sogar fatal sein können.

Während interpandemischer Perioden zirkulieren Influenzaviren, die mit denjenigen aus der vorhergehenden Epidemie verwandt sind. Die Viren verbreiten sich unter Menschen mit unterschiedlichen Immunitätsgraden aus früheren Infektionen im Leben. Eine solche Zirkulation über einen Zeitraum von gewöhnlich 2 bis 3 Jahren fördert die Selektion neuer Stämme, die sich genug verändert haben, um erneut eine Epidemie unter der allgemeinen Bevölkerung zu verursachen; dieser Prozeß wird als "Antigendrift" bezeichnet. "Driftvarianten" können unterschiedliche Einflüsse in unterschiedlichen Gesellschaften, Regionen, Ländern oder Kontinenten in jedem Jahr haben, obwohl ihr Gesamteinfluß über mehrere Jahre hinweg häufig ähnlich ist.

Typische Influenzaepidemien verursachen Zunahmen des Auftretens von Lungenentzündung und Erkrankungen der unteren Atemwege, wie sie durch zunehmende Raten von Krankenhauseinweisungen und Sterblichkeit bezeugt werden. Ältere Menschen oder diejenigen mit grundlegenden chronischen Krankheiten erfahren am wahrscheinlichsten solche Komplikationen, aber junge Kinder können auch eine ernsthafte Erkrankung erleiden.

In unvorhersehbaren Intervallen treten neue Influenzaviren mit einem Schlüsseloberflächenantigen, dem Hämagglutinin, eines völlig unterschiedlichen Untertyps aus Stämmen auf, die in der vorhergehenden Saison zirkulierten. Dieses Phänomen wird als "Antigenshift" bezeichnet. Es wird angenommen, daß zumindest die vergangenen Pandemien auftraten, als ein Influenzavirus aus einer unterschiedlichen Art, wie zum Beispiel ein Vogel- oder Schweineinfluenzavirus, die Artengrenze überquerte. Falls solche Viren das Potential zur Verbreitung von Mensch zu Mensch haben, können sie sich weltweit innerhalb weniger Monate bis zu einem Jahr ausbreiten, was zu einer Pandemie führt.

Die Merkmale eines Influenzavirus-Stammes, die ihm das Potential zur Verursachung eines pandemischen Ausbruchs geben, sind: er enthält ein neues Hämagglutinin im Vergleich mit dem Hämagglutinin in den derzeit zirkulierenden Stämmen; er kann horizontal in der humanen Bevölkerung übertragen werden; und er ist pathogen für Menschen. Ein neues Hämagglutinin kann eines sein, das für einen ausgedehnten Zeitraum, wahrscheinlich für eine Anzahl von Jahrzehnten, nicht in der menschlichen Bevölkerung offenkundig war, wie H2. Oder es kann ein Hämagglutinin sein, das zuvor nicht in der menschlichen Bevölkerung zirkulierte, zum Beispiel H5, H9 oder H6, die in Vögeln gefunden werden. In jedem Fall ist die Mehrheit oder zumindest ein großer Anteil oder sogar die gesamte Bevölkerung nicht zuvor mit dem Antigen in Kontakt gekommen und ist ihm gegenüber immunologisch naiv.

H2N2-Influenzaviren zirkulierten zwischen 1957 und 1968, als sie durch den H3N2-Untertyp ersetzt wurden, der die letzte Pandemie des letzten Jahrhunderts verursachte. Heutzutage sind Menschen, die zuvor mit H2N2 in Kontakt gekommen sind, wahrscheinlich über 30 Jahre alt. Es wurde nahegelegt, daß ein H2-haltiges Virus eine neue Pandemie verursachen könnte, weil erwartet werden muß, daß ein wachsender Anteil der Weltbevölkerung, der nach 1968 geboren wurde, immunologisch naiv ist. Zur Untersuchung, ob diese theoretische Zweispaltung der Bevölkerung in bezug auf H2-Immunität eine wahre Tatsache ist, wurde eine sero-epidemiologische Untersuchung bei 400 Individuen durchgeführt, und Antikörper gegen H2 wurden gemessen.

Diese Untersuchung wurde in Deutschlang durchgeführt, und die Antikörperuntersuchung wurde am Sächsischen Serumwerk (Dresden, Deutschland) unter Verwendung eines Hämagglutinationsinhibitionstests (HIT) durchgeführt, der für das H2-Antigen spezifisch ist. Die Titer sind die reziproken Werte der höchsten Serumverdünnung, die die Hämagglutination inhibiert. Die Ergebnisse bestätigen den immunologisch naiven Status derjenigen mit einem Alter von unter 30 Jahren, da nur 7 von 200 Probanden einen meßbaren Antikörpertiter im niedrigen Bereich von 10 bis 20 hatten.

Die Daten zeigen ferner, daß ein signifikanter Anteil derjenigen mit einem Alter von über 30 Jahren noch seropositiv für H2 ist, 30 oder mehr Jahre nach der Infektion. Die Anzahl von Seropositiven (HIT ≥ 10) beträgt 90 %. In einigen der Serumproben sind die Anti-H2-Titer (HIT) so hoch wie 640, und der geometrische Mittelwerttiter (GMT) für alle seropositiven Studienteilnehmer im Alter von über 30 Jahren betrug 65. Ein HIT ≥ 40 wird als schützend betrachtet.

Diese Beobachtungen bestätigen die Möglichkeit, daß sich ein H2-Virus in der Bevölkerung unter 30 Jahren verbreiten könnte. Unter Berücksichtigung der derzeitigen Demographien und der Tatsache, daß Menschen mit einem Alter von weniger als 30 Jahren einen großen Teil der Weltbevölkerung darstellen, ist es möglich, daß ein H2-Virus erneut eine Pandemie verursachen könnte. Diese Zweiteilung in der Weltbevölkerung wird sich über die kommenden Jahre weiter entwickeln, wobei die Gruppe von anfälligen Menschen zunimmt.

Vor zwei Jahren wurde Influenza mit H5 (H5N1), das ein Vogel-Influenzavirus ist, aus Menschen in Hongkong isoliert. Jedoch wurde das Virus nicht von Mensch zu Mensch übertragen und hatte daher nicht die Fähigkeit, eine Pandemie zu verursachen.

Bestimmte Gruppen sind allgemein unter einem erhöhten Risiko, sich mit Influenza in einer pandemischen Situation zu infizieren. Die älteren Menschen, chronisch Kranken und kleinen Kinder sind besonders anfällig, aber viele junge und scheinbar gesunde Menschen sind ebenfalls gefährdet. Für H2-Influenza unterliegt der Teil der Bevölkerung einem erhöhten Risiko, der nach 1968 geboren wurde. Es ist wichtig für diese Gruppen, sobald wie möglich und in einer einfachen Weise geschützt zu werden.

Eine andere Gruppe von Menschen, die in erhöhter Gefahr sind, sind Reisende. Menschen reisen heutzutage mehr als jemals zuvor, und die Regionen, in denen die meisten neuen Viren auftreten, China und Südostasien, sind besonders populäre Reiseziele in den vergangenen Jahren geworden. Diese Veränderung der Reisemuster ermöglicht neuen Viren, um den Globus im Verlauf von Wochen anstelle von Monaten oder Jahren zu gelangen.

Daher besteht für diese Gruppe von Menschen ein besonderer Bedarf an Impfung zum Schutz gegen Influenza in einer pandemischen Situation oder potentiellen pandemischen Situation.

Viele Anstrengungen werden zur Bildung einer wirksamen internationalen Strategie zum Reagieren auf eine pandemische Situation unternommen, und die Weltgesundheitsorganisation ist behilflich dabei. Eine Schlüsselmaßnahme ist die Entwicklung einer pandemischen Impfstoffstrategie, und bis heute wurde dies nicht im erforderlichen Maßstab erreicht, um auf eine Grippepandemie zu reagieren.

Es wurde jetzt überraschend festgestellt, daß Impfstoffe, die nützlich in einer pandemischen Situation sein werden, schnell und in einer spezifischen Weise formuliert werden können. Insbesondere wurde festgestellt, daß niedrigdosierter Influenzavirus-Impfstoff, der gereinigtes Virus enthält, das mit einer Kombination aus Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat als Hilfsstoff versetzt ist, und der schnell und wirtschaftlich genug hergestellt werden kann, um eine Impfung von Bevölkerungen im großen Maßstab zu ermöglichen, wirksam in Menschen ist.

In der Vergangenheit wurden rohe Zubereitungen von aus Eiern stammendem, inaktiviertem Influenza-Vollimpfstoff kommerziell verwendet, der mit Aluminiumsalzen als Hilfsstoff versetzt war. Jedoch war das Produkt schlecht gereinigt und relativ reaktogen, und der Ansatz wurde am Ende der 1970iger Jahre aufgegeben.

Vor kurzem wurden höher gereinigte, besser charakterisierte Influenza-Spaltimpfstoffe mit Hilfsstoffen in einem Versuch kombiniert, die Immunogenität bei Erwachsenen und älteren Menschen zu verbessern. Trotz signifikant erhöhter Immunreaktionen in Mäusen konnte eine Anzahl von Ansätzen unter Verwendung von Hilfsstoffen der neuen Generation nicht im Menschen bestätigt werden. In all diesen Untersuchungen wurde der reguläre 15 &mgr;g-Gehalt an Hämagglutinin-Antigen zur Herstellung der formulierten Impfstoffe verwendet. WO 00/15251 und WO 00/47222 offenbaren Influenzazusammensetzungen, die mit Aluminium als Hilfsstoff versetzt sind. WO 01/21151 offenbart die Verwendung einer nicht-lebenden Influenzavirus-Antigenzubereitung in der Herstellung eines Impfstoffs zur einmal dosierten intranasalen Impfung gegen Influenza.

Ein neuerer Bericht (Kistner et al. (1999), Inactivated Influenza Vaccines Prepared in Cell Culture, Dev. Biol. Stand., Basel, Karger., Bd. 98, S. 101–110) beschreibt eine Primatenstudie, in der aus Zellkultur stammender Impfstoff, der drei Influenzastämme enthält, vermischt mit Al(OH)3, an Schimpansen verabreicht wurde. Dies induzierte eine systemische Reaktion, die bei einer Dosis von 1,5 &mgr;g Hämagglutinin pro Stamm so gut wie die standardmäßigen 15 &mgr;g Hämagglutinin pro Stamm war. Diese Studie war auf das Ziel der Entwicklung eines aus Verozellen stammenden Influenza-Vollvirus-Impfstoffs gerichtet, der alle herkömmlichen Erfordernisse des Europäischen Arzneibuchs, der WHO und anderer Aufsichtsbehörden für einen Influenzavirus-Impfstoff erfüllt.

Für einen Standard-Influenza-Impfstoff zur routinemäßigen Verwendung können Schwierigkeiten mit der Verwendung von Aluminiumsalzen als Hilfsstoffe verbunden sein. Influenza-Impfstoffe sind für die jährliche Verwendung gedacht, und die wiederholten Injektionen von Al3+ können unerwünscht sein. Aber für eine pandemische Situation, die nur einige Male in einem Jahrhundert auftreten mag, ist die Verwendung von Al3+ nicht ausgeschlossen.

Die vorliegende Erfindung stellt deshalb in einem Aspekt eine Impfstoffzusammensetzung bereit, die eine geringe Dosis an Influenzavirus-Antigen aus einem einzelnen Influenzavirus-Stamm umfaßt, der mit einem pandemischen Ausbruch verbunden ist oder das Potential hat, mit einem pandemischen Ausbruch verbunden zu sein, in Kombination mit einem Hilfsstoff, worin der Hilfsstoff eine Kombination aus Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat ist.

Der erfindungsgemäße Impfstoff wird in einer wirksamen Dosis zur Verhinderung einer Influenzainfektion oder zur Bereitstellung von Schutz gegen Influenza, insbesondere zur Bereitstellung von Schutz gegen Influenzamorbidität oder -mortalität, bereitgestellt.

Die erfindungsgemäßen Impfstofformulierungen werden bevorzugt eine immunschützende Menge des Antigens enthalten. Die erfindungsgemäßen Impfstofformulierungen können durch herkömmliche Techniken hergestellt werden.

Die Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung können in einer Einzeldosis verabreicht werden.

Die Verwendung einer geringen Dosis von Antigen und die Verwendung eines einzelnen Influenza-Stammes (d.h. eines monovalenten Impfstoffs) tragen zur Geschwindigkeit bei, die zur Reaktion auf eine pandemische Situation erforderlich ist.

Eine geringe Dosis an Influenzavirus-Antigen in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ist eine Menge an Antigen, die unterhalb der derzeit akzeptierten Impfstoffdosis für humane Influenza-Impfstoffe ist, die 10–15 &mgr;g Hämagglutinin-Antigen pro Stamm beträgt, normalerweise 15 &mgr;g in Übereinstimmung mit Bestimmungen wie denjenigen, die in Europa von der EMEA erteilt werden.

Alternativ werden die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen in mehr als einer Dosis, insbesondere zwei Dosen, und bevorzugt zwei Dosen verabreicht, die gleichzeitig (zur gleichen Gelegenheit) auf unterschiedlichen Wegen verabreicht werden. So stellt die Erfindung ein Zweidosen-Schema bereit, das die Verabreichung sowohl eines systemischen als auch eines lokalen (mukosalen) Impfstoffs umfaßt, vorzugsweise gleichzeitig (oder während einer einzigen Sitzung). Die Verabreichung eines mukosalen Impfstoffs sowie eines parenteralen Impfstoffs steigert die Immunreaktion, insbesondere die IgA-Antikörperreaktion, die zum Schutz gegen Influenzainfektion beiträgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Impfstoffzusammensetzungen sowohl parenteral, zum Beispiel intramuskulär, als auch über einen mukosalen Weg, insbesondere intranasal, verabreicht. In dieser Ausführungsform werden zwei unterschiedliche Formulierungen normalerweise erforderlich sein, das heißt eine Formulierung zur parenteralen Abgabe und eine Formulierung zur mukosalen Abgabe. Diese Formulierungen können zum Beispiel unterschiedliche Hilfsstoffe und/oder unterschiedliche Mengen an Antigen umfassen. Oder sie können einfach unterschiedliche Volumina an Flüssigkeit umfassen.

So stellt die vorliegende Erfindung auch ein Kit bereit, das wenigstens die folgenden zwei Komponenten umfaßt:

  • (i) eine geringe Dosis von Influenzavirus-Antigen, formuliert mit einem Hilfsstoff, der zur parenteralen Verabreichung geeignet ist; und
  • (ii) eine geringe Dosis von Influenzavirus-Antigen zur mukosalen Verabreichung in einer mukosalen Abgabevorrichtung, wie zum Beispiel in einer intranasalen Sprayvorrichtung.

Intranasale Sprayabgabevorrichtungen sind kommerziell erhältlich, zum Beispiel die Doppeldosisabgabevorrichtung von Pfeiffer GmbH.

Ein solches Zweiwegeverabreichungsschema wird sowohl eine systemische Immunreaktion als auch eine lokale Immunreaktion bereitstellen, wobei letztere bevorzugt am normalen Eintrittsort des Virus während der Infektion (d.h. in der Nasenschleimhaut) ist.

Bevorzugt ist die kombinierte Antigendosis der zwei Komponenten in dieser Ausführungsform der Erfindung weniger als die herkömmlichen 10–15 &mgr;g an Hämagglutinin-Antigen pro Stamm.

So ist die geringe Dosis oder die kombinierte geringe Dosis gemäß der Erfindung allgemein unterhalb 10 &mgr;m Hämagglutinin, bevorzugt unterhalb 8 &mgr;g Hämagglutinin, besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 7,5 &mgr;g Hämagglutinin, am meisten bevorzugt zwischen 1 und 5 &mgr;g Hämagglutinin pro Impfstoffdosis. Bevorzugt ist die Dosis signifikant geringer als in herkömmlichen Influenza-Impfstoffen, um die Herstellung von signifikant größeren Mengen an Influenza-Impfstoff für eine pandemische Situation zu ermöglichen als es unter Verwendung von derzeitigem Influenza-Impfstoff mit derzeitigen Dosismengen möglich wäre. In gleicher Weise muß die Dosis von Antigen hoch genug sein, um ausreichend Schutz zu liefern.

Allgemein wird das Volumen von erfindungsgemäßem Impfstoff, der über einen parenteralen Weg wie intramuskulär verabreicht wird, ca. 0,5 ml sein, und das Volumen von Impfstoff, der über einen mukosalen Weg wie intranasal verabreicht wird, wird ein geringeres Volumen sein, vorzugsweise ca. 0,2 ml, z.B. 0,1 ml, über jedes Nasenloch.

Das Influenzavirus-Antigen in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung muß durch ein schnelles und effizientes Verfahren erhältlich sein, um die Anforderungen an einen pandemischen Impfstoff zu erfüllen. Derzeit ist das bevorzugte Verfahren durch Züchten von Influenzavirus in Eiern und Reinigen der geernteten Allantoisflüssigkeit. Eier können in großer Zahl kurzfristig angehäuft werden. Zellkulturverfahren, wie z.B. das Züchten des Virus auf Hundenieren-Zellinien wie MDCK- oder MDCK-artigen Zellen oder auf Vero-Zellen, können auch geeignet sein, aber sind im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung nicht bevorzugt.

Das Influenzavirus in der Impfstoffzusammensetzung ist bevorzugt in Form von Vollviruspartikeln, aber kann alternativ Spaltvirus sein, das durch herkömmliche Verfahren hergestellt wird.

Spaltvirusimpfstoff kann durch fachbekannte Verfahren hergestellt werden, wie zum Beispiel durch das in DD 300 833 und DD 211 444 beschriebene Verfahren. Traditionell wurde Grippe-Spaltvirus unter Verwendung einer Lösungsmittel/Detergens-Behandlung, wie zum Beispiel tri-n-Butylphosphat oder Diethylether in Kombination TweenTM (bekannt als "Tween-Ether"-Spaltung), hergestellt, und dieses Verfahren wird noch in manchen Produktionseinrichtungen verwendet. Andere heutzutage eingesetzte Spaltmittel schließen Detergentien oder proteolytische Enzyme oder Gallensalze ein, zum Beispiel Natriumdesoxycholat wie in DD 155 875 beschrieben, das hier durch Verweis eingeführt wird. Detergentien, die als Spaltmittel verwendet werden können, schließen kationische Detergentien, zum Beispiel Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), andere ionische Detergentien, z.B. Laurylsulfat, Taurodesoxycholat, oder nichtionische Detergentien wie Triton X-100 (zum Beispiel in einem von Lina et al., 2000, Biological 28, 95–103 beschriebenen Verfahren) und Triton N-101 oder Kombinationen aus zwei oder mehr beliebigen Detergentien ein.

Jedoch besteht ein Vorteil eines Vollvirusimpfstoffs gegenüber einem Spaltvirusimpfstoff für eine pandemische Situation darin, daß er die Unsicherheit darüber vermeidet, ob ein Spaltvirusimpfstoff erfolgreich für einen neuen Stamm von Influenzavirus hergestellt werden kann. Für einige Stämme können die zur Herstellung des Spaltvirus verwendeten herkömmlichen Detergentien das Virus beschädigen und es unbrauchbar machen. Obwohl es immer die Möglichkeit gibt, unterschiedliche Detergentien zu verwenden und/oder ein unterschiedliches Verfahren zur Herstellung eines Spaltimpfstoffs zu entwickeln, würde dies Zeit in Anspruch nehmen, die in einer pandemischen Situation nicht verfügbar sein mag.

Zusätzlich zum größeren Unsicherheitsgrad bei einem Vollvirusansatz gibt es auch eine größere Impfstoffproduktionskapazität als für das Spaltvirus, da beträchtliche Mengen von Antigen während der zusätzlichen Reinigungsschritte verlorengehen, die für die Herstellung eines geeigneten Spaltvirus notwendig sind.

Jedoch kann ein Spaltimpfstoff für einen Kombinationsansatz, in dem ein Impfstoff sowohl intranasal als auch parenteral verabreicht wird, bevorzugt für die intranasale Formulierung sein, während ein inaktivierter Vollvirusimpfstoff bevorzugt für die parenterale Formulierung sein kann.

Besonders bevorzugt für die intranasale Formulierung ist Impfstoff, der inaktiviert oder gespalten wurde und bevorzugt nichtionische Tenside wie Detergentien enthält, die aus den Octyl- oder Nonylphenoxypolyoxyethanolen (zum Beispiel aus der handelsüblichen TritonTM-Reihe) und Polyoxyethylensorbitanestern (TweenTM-Reihe), insbesondere Triton X-100 oder Tween 80 oder einer Kombination aus beiden, ausgewählt sind.

Die Detergentien können aus dem Spalt- oder Reinigungsverfahren zurückgebliebene Reagentien sein, und/oder sie können zur inaktivierten/Spaltvirus-Formulierung hinzugegeben oder ihre Konzentrationen eingestellt werden.

In ähnlicher Weise können Spaltmittel wie Cholinsäure-Derivate und insbesondere Natriumdesoxycholat (NaDOC) in den erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen vorhanden sein, allgemein in Spuren.

Die Verwendung eines Aluminiumhilfsstoffs in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung erlaubt die Verwendung einer geringeren Dosis von Virus-Antigen als in herkömmlichen Impfstoffen.

Der Hilfsstoff für den peranteral verabreichten erfindungsgemäßen Impfstoff ist eine Kombination aus Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat. Bevorzugt ist das Aluminiumphosphat in einer höheren Konzentration pro Impfstoffdosis als das Aluminiumhydroxid vorhanden.

Die Gesamtmenge von Aluminiumsalz pro 0,5 oder 1 ml-Dosis Impfstoff ist normalerweise im Bereich von 0,1–2,0, bevorzugt im Bereich von 0,4–1,0 mg. Bevorzugt ist eine Hilfsstoffzusammensetzung, die Aluminiumphosphat und Aluminiumhydroxid umfaßt, worin die Menge an Aluminiumphosphat gewichtsbezogener Relation zur Menge an Aluminiumhydroxid wenigstens 2:1 ist, besonders bevorzugt 5:1 und am meisten bevorzugt wenigstens 8:1 oder 9:1.

Für einen mukosal verabreichten Impfstoff ist es wichtig sicherzustellen, daß die Größe der viralen Antigene an die mukosale Penetration angepaßt wird. Dafür kann durch die bereits in der Formulierung vorhandenen Detergentien oder Spaltmittel gesorgt werden. Alternativ oder zusätzlich kann ein fachbekannter geeigneter mukosaler Hilfsstoff eingesetzt werden, zum Beispiel ein Absorptionsverstärker wie ein Polyoxyethylenether oder -ester der allgemeinen Formel (I): HO(CH2CH2O)n-A-R(I) worin n 1–50 ist, A eine Bindung oder -C(O)- ist und R C1–50-Alkyl oder Phenyl-C1–50-alkyl ist.

Bevorzugte Tenside, die in Formel (I) fallen, sind Moleküle, in denen n 4–24 ist, besonders bevorzugt 6–12 und am meisten bevorzugt 9; die R-Komponente ist C1–50-, bevorzugt C4–20-Alkyl und am meisten bevorzugt C12-Alkyl ist. Ein besonders bevorzugtes Beispiel ist Polyoxyethylen-9-laurylether (Laureth-9), das im Merck Index beschrieben wird (12. Auflage, Eintrag 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J., USA; ISBN 0911910-12-3). Laureth-9 wird durch Umsetzen von Ethylenoxid mit Dodecylalkohol gebildet und hat durchschnittlich neun Ethylenoxideinheiten.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung einer Vorimpfungsimmunreaktion gegen ein Influenzavirus in einem Individuum oder einer Bevölkerung ohne Vorimpfung bereit, wobei das Verfahren das Verabreichen eines gering dosierten Hämagglutinin-Impfstoffs oder kombinierten Impfstoffs wie hier beschrieben an das Individuum oder die Bevölkerung umfaßt.

In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Influenza-Impfstoffs für eine pandemische Situation bereit, wobei das Verfahren das Vermischen eines Influenzavirus-Antigens aus einem einzelnen Influenzavirus-Stamm, der mit einem pandemischen Ausbruch assoziiert ist oder das Potential hat, mit einem pandemischen Ausbruch assoziiert zu sein, mit einer Kombination aus Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat und das Bereitstellen vom Impfstoffchargen umfaßt, die weniger als 10 &mgr;g Influenza-Hämagglutinin-Antigen pro Dosis oder weniger als 10 &mgr;g pro kombinierte Dosis enthalten.

In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von Influenzavirus-Antigen zur Verwendung in einem Impfstoff bereit, wobei das Verfahren den Schritt der Behandlung einer Mischung, die das Influenzavirus-Antigen enthält, mit einer Protease zur Verdauung von Nicht-Influenzavirus-Proteinen umfaßt.

Die Reinigung wird an einer Zubereitung von Influenzavirus durchgeführt, die aus einer Kultur geerntet wurde. Überraschend sind die Influenzavirus-Partikel gegenüber dem Proteaseverdauungsschritt resistent. Eine bevorzugte Protease zur Verwendung im Verfahren ist Trypsin, das bevorzugt mit einer Konzentration zwischen 0,1 und 10 &mgr;g/ml reinem Trypsin verwendet wird. Alternative Proteaseenzyme, die verwendet werden können, schließen Plasmin und Chymotrypsin ein.

Normalerweise wird der Proteaseverdauungsschritt durchgeführt, nachdem das Influenzavirus-Antigen teilweise durch einen oder mehrere physikalische Trennschritte wie Zentrifugieren und Filtration gereinigt wurde. Wenn das gewünschte Produkt ein Vollvirusimpfstoff ist, wird der Proteaseverdauungsschritt vor einem Virusinaktivierungsschritt durchgeführt.

Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren kann erfolgreich verwendet werden, um gereinigtes Influenzavirus-Antigen in Form von Spalt- oder Vollvirus zu liefern, das im wesentlichen frei von verunreinigenden Wirtszellproteinen ist, geeignet zur Verwendung in einem Impfstoff.

Der Begriff "im wesentlichen frei von verunreinigenden Wirtszellproteinen" bedeutet, daß weniger als 10 %, bevorzugt weniger als 8 % und besonders bevorzugt weniger als 5 % des Gesamtproteins Wirtszellprotein gemäß Nachweis durch Durchmusterung von Coomassie-angefärbten Polyacrylamidgelen ist. Im Falle von in Eiern kultiviertem Influenzavirus ist das vorherrschende Wirtsprotein Ovalbumin, das ca. 60–70 % der Gesamtproteinmasse der Allantoisflüssigkeit ausmacht. Bevorzugt ist Ovalbumin in der gereinigten Influenzavirus-Zubereitung in einer Konzentration von weniger als 1 %, besonders bevorzugt weniger als 0,1 % und am meisten bevorzugt nur ca. 0,05 % des Gesamtproteingehalts gemäß Bewertung durch Durchmusterung von angefärbten Gelen vorhanden.

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer Dosis oder kombinierten Dosis mit unter 10 &mgr;g oder unter 8 &mgr;g, oder 1–7,5 &mgr;g oder 1–5 &mgr;g Influenzavirus-Hämagglutinin-Antigen aus einem einzelnen Stamm von Influenza, der mit einem pandemischen Ausbruch assoziiert ist oder das Potential hat, mit einem pandemischen Ausbruch assoziiert zu sein, und einer Kombination aus Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat in der Herstellung eines Impfstoffs zur Prävention von Influenza bereit.

Zusätzliche Hilfsstoffe, die zur Verwendung im erfindungsgemäßen Impfstoff geeignet sind, schließen eine Reihe von Hilfsstoffen ein, die die Immunreaktion gegen Virus-Antigene steigern können.

3-Des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A (3D-MPL) ist ein solcher Hilfsstoff. Dieser wird zum Beispiel in GB 2220211 (Ribi) beschrieben. Chemisch ist es eine Mischung aus 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A mit 4, 5 oder 6 acylierten Ketten und es wird von Ribi Immunochem Montana hergestellt. Eine bevorzugt Form von 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A wird in EP 0 689 454 offenbart. Die bevorzugte Form von 3D-MPL sind Partikel mit nicht mehr als 120 nm, normalerweise 60–120 nm, bevorzugt ca. oder weniger als 100 nm Durchmesser (wie in EP 0 689 454 beschrieben).

3D-MPL wird gewöhnlich im Bereich von 10–100 &mgr;g, bevorzugt 25–50 &mgr;g pro Dosis vorhanden sein, worin das Antigen typischerweise in einem Bereich von 2–50 &mgr;g pro Dosis vorhanden sein wird.

Ein anderer geeigneter Hilfsstoff ist QS21, das eine HPLC-gereinigte nicht-toxische Fraktion eines Saponins aus der Rinde des südamerikanischen Baums Quillaja Saponaria Molina ist. Gegebenenfalls kann er mit 3D-MPL vermischt werden, optional zusammen mit einem Träger.

Ein Verfahren zur Herstellung von QS21 wird in US-PS 5,057,540 beschrieben.

Nicht-reaktogene Hilfsstofformulierungen, die QS21 enthalten, sind auch zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen geeignet und werden zum Beispiel in WO 96/33739 beschrieben. Es wurde gezeigt, daß solche Formulierungen, die QS21 und Cholesterin umfassen, erfolgreiche Hilfsstoffe sind, wenn sie zusammen mit einem Antigen formuliert werden.

Kombinationen aus unterschiedlichen Hilfsstoffen wie den oben genannten werden auch als Bereitstellung eines Hilfsstoffs erwogen, der zur Verwendung in der Erfindung geeignet ist. Zum Beispiel kann QS21 zusammen mit 3D-MPL formuliert werden. Das Verhältnis QS21:3D-MPL wird typischerweise in der Größenordnung von 1:10 bis 10:1 sein, bevorzugt 1:5 bis 5:1 und häufig im wesentlich 1:1. Der bevorzugte Bereich für eine optimale Synergie ist 2,5:1 bis 1:1 3D-MPL:QS21.

Vorteilhaft können die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen mit einem Träger formuliert werden, gewöhnlich in Kombination mit einem der oben beschriebenen alternativen Hilfsstoffe. Der Träger kann zum Beispiel eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder ein Aluminiumsalz sein.

Eine bevorzugt Öl-in-Wasser-Emulsion umfaßt ein metabolisierbares Öl wie Squalen, alpha-Tocopherol und Tween 80. Zusätzlich kann die Öl-in-Wasser-Emulsion Span 85 und/oder Lecithin enthalten.

Typischerweise werden QS21 und 3D-MPL zur humanen Verabreichung in einem Impfstoff im Bereich von 1–200 &mgr;g, wie zum Beispiel 10–100 &mgr;g, bevorzugt 10–50 &mgr;g, pro Dosis vorhanden sein. Typischerweise wird die Öl-in-Wasser-Emulsion 2 bis 10 % Squalen, 2 bis 10 % alpha-Tocopherol und 0,3 bis 3 % Tween 80 umfassen. Bevorzugt ist das Verhältnis von Squalen zu alpha-Tocopherol gleich oder weniger als 1, da dies eine stabilere Emulsion liefert. Span 85 kann ebenfalls in einer Menge von 1 % vorhanden sein. In manchen Fällen kann es vorteilhaft sein, daß die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung ferner einen Stabilisator enthalten.

Nicht-toxische Öl-in-Wasser-Emulsionen enthalten bevorzugt ein nicht-toxisches Öl, zum Squalan oder Squalen, einen Emulgator, z.B. Tween 80, in einem wäßrigen Träger. Der wäßrige Träger kann zum phosphatgepufferte Kochsalzlösung sein.

Eine besonders wirksame alternative Hilfsstofformulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO 95/17210 beschrieben.

Die Erfindung wird jetzt weiter in den folgenden Beispielen beschrieben.

Beispiele Beispiel 1 – Herstellung von monovalentem Bulk für Vollinfluenzaimpfstoff

Der Impfstoffbulk wurde gemäß dem in 1A gezeigten Flußdiagramm hergestellt. 1B zeigt ein verallgemeinertes Flußdiagramm für das Reinigungsverfahren, das den optionalen Trypsininkubationsschritt einschließt.

Herstellung von rohem monovalentem Vollvirus Herstellung von virusinoculum

Am Tag der Beimpfung von embryonierten Eiern wird ein frisches Inoculum durch Vermischen der Arbeitsimpfcharge mit einem Phosphatpuffer hergestellt, der 0,5 mg/ml Gentamycinsulfat und 25 &mgr;g/ml Hydrocortison enthält (Virusstamm-abhängig). Das Virusinoculum wird auf 2,8°C gehalten.

Beimpfung von embryonierten Eiern

9 bis 11 Tage alte embryonierte Eier werden zur Virusvermehrung verwendet. Die Eier werden auf den Bauernhöfen vor der Ankunft in der Herstellungsanlage inkubiert und in die Herstellungsräume nach Dekontamination der Schalen überführt. Die Eier werden mit 0,2 ml des Virusinoculum auf einer automatischen Eierbeimpfungsvorrichtung beimpft.

Die beimpften Eier werden bei der geeigneten Temperatur (Virusstammabhängig) für 48 bis 96 Stunden inkubiert. Am Ende des Inkubationszeitraums werden die Embryos durch Abkühlen der Eier getötet und für 12–60 Stunden bei 2–8°C gelagert.

Ernte

Die Allantoisflüssigkeit aus den gekühlten embryonierten Eiern wird durch geeignete Eierntemaschinen geerntet. Gewöhnlich können 8 bis 10 ml rohe Allantoisflüssigkeit pro Ei aufgefangen werden. Zum rohen monovalenten Virusbulk werden 0,100 mg/ml Thiomersal gegeben (in einem alternativen Verfahren wird Thiomersal nicht hinzugegeben).

Aufkonzentrieren und Reinigung von Vollvirus aus Allantoisflüssigkeit 1. Klärung

Die geerntete Allantoisflüssigkeit wird durch Zentrifugieren mit moderater Geschwindigkeit (Bereich: 4000–14000 g) geklärt.

2. Adsorptionsschritt

Zum Erhalt eines CaHPO4-Gels in der geklärten Virusansammlung werden Lösungen mit 0,5 mol/l Na2HPO4 und 0,5 mol/l CaCl2 hinzugegeben, um eine Endkonzentration an CaHPO4 von 1,5 bis 3,5 g CaHPO4/l zu erreichen, abhängig vom Virusstamm.

Nach Sedimentation für wenigstens 8 Stunden wird der Überstand entfernt, und das das Influenzavirus enthaltende Sediment wird durch Zugabe einer Lösung mit 0,26 mol/l EDTA-Na2, abhängig von der verwendeten Menge an CaHPO4, resolubilisiert.

3. Filtration

Das resuspendierte Sediment wird an einer 6 &mgr;m-Filtermembran filtriert.

4. Zentrifugieren mit Saccharosegradient

Das Influenzavirus wird durch Isopyknenzentrifugieren in einem linearen Saccharosegradienten (0,55 %) auf konzentriert. Die Fließgeschwindigkeit beträgt 8–15 l/h.

Am Ende des Zentrifugierens wird der Inhalt des Rotors in drei unterschiedlichen Fraktionen gewonnen (die Saccharose wird in einem Refraktometer gemessen):

  • – Fraktion 1: 55 bis ca. 52 % Saccharose
  • – Fraktion 2: ca. 52* Virusstamm-abhängig bis 26 % Saccharose
  • – Fraktion 3: 26 bis 20 % Saccharose*
Virusstamm-abhängig Fraktion 2 wird mit Phosphatpuffer verdünnt.

In diesem Stadium wird das Produkt als "monovalentes Vollviruskonzentrat" bezeichnet.

Sterilfiltration

Das Vollvirusmaterial wird an Filtermembranen filtriert, die mit einer 0,2 &mgr;m-Membran enden. Am Ende der Filtration werden die Filter mit Phosphatpuffer gewaschen. Als Ergebnis ist das Endvolumen der filtrierten Fraktion 2 das 5-fache des ursprünglichen Fraktionsvolumens.

Inaktivierung

Das filtrierte monovalente Material wird mit Phosphatpuffer verdünnt, um den Gesamtproteingehalt auf maximal 250 &mgr;g/ml zu reduzieren. Formaldehyd wird auf eine Endkonzentration von 250 &mgr;g/ml hinzugegeben, und die Inaktivierung erfolgt bei 20 ± 2°C für wenigstens 72 Stunden.

Fertige Sterilfiltration

Die Proteinkonzentration des inaktivierten Materials wird auf ca. 500 &mgr;g/ml Protein eingestellt, an Membranen mit einem Ende von 0,8 &mgr;m vorfiltriert und schließlich an Membranen mit einem Ende von 0,2 &mgr;m fertigfiltriert.

Abhängig vom Virusstamm kann die letzte Filtrationsmembran 0,8 &mgr;m sein. In diesem Stadium wird das Produkt als "monovalenter Fertigbulk" bezeichnet.

Lagerung

Der monovalente Fertigbulk wird bei 2–8°C für maximal 18 Monate gelagert.

Reinheit

Die Reinheit wurde durch O.D.-Abtastung von Coomassie-angefärbten Polyacrylamidgelen bestimmt. Die Peaks wurden manuell bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

Alternatives Verfahren, das einen Trypsinschritt beinhaltet Trypsinverdauung

Nach dem Sterilfiltrationsschritt wird das sterile Material einem Trypsinisierungsschritt unterworfen. Reines Trypsin, das zum Beispiel als reines Schweinetrypsin mit einer spezifischen Aktivität von 10 000 bis 15 000 Einheiten/mg kommerziell erhältlich ist, wird auf eine Endkonzentration von 0,1–10 &mgr;g/ml hinzugegeben. Die Mischung wurde für 2 h bei 37°C unter vorsichtigem Rühren inkubiert. Das Material wird dann zum Abkühlen zur weiteren Verarbeitung in den Kühlschrank gestellt.

Ultrafiltration

Nach der Trypsinverdauung kann das Material einer Ultrafiltration entweder vor oder nach der Inaktivierung (wie oben beschrieben) unterworfen werden. Das Virusmaterial wird an Membranen mit einer mittleren Ausschlußgrenze von 20 000 bis 50 000 D ultrafiltriert. Während der Ultrafiltration wird der Gehalt an Formaldehyd und Saccharose beträchtlich reduziert.

Nach einer ersten 4-fachen Volumenreduktion bleibt das Volumen während der Ultrafiltration (Diafiltration) konstant, indem Phosphatpuffer und phosphatgepufferte Kochsalzlösung hinzugegeben werden.

Ergebnisse

Influenzavollvirus-Impfstoff, der gemäß dem Trypsinverfahren hergestellt wurde, wurde an Coomassie-angefärbten Polyacrylamidgelen analysiert. Die viralen Proteine wanderten an die gleiche Position wie virale Proteine, die keinen Trypsinverdauungsschritt erfahren hatten, was darauf hinweist, daß die viralen Proteine nicht durch Protease verdaut worden waren.

Beispiel 2 – Herstellung von Impfstoffdosen aus Bulk-Impfstoff

Fertiger Impfstoff wird durch Vermischen von fertigem Bulk-Impfstoff, der wie oben im Beispiel beschrieben hergestellt wurde, mit einer Hilfsstoffmischung und fertigem Puffer in einer solchen Weise hergestellt, daß der abgezielte Antigengehalt erhalten wird und eine Konzentration von 0,5 mg Al-Salzen pro Dosis erreicht wird. Der verwendete Puffer enthält mehrere Salze wie nachfolgend aufgeführt. Der Hilfsstoff ist eine Mischung aus AlPO4 und Al(OH)3 und wird in einem Anteil von 3,6 mg AlPO4 und 0,4 mg Al(OH)3 auf 4 mg/ml Vorratslösung verwendet. Pufferzusammensetzung: Destilliertes Wasser 0,800 l NaCl 7,699 g KCl 0,200 g MgCl2·6H2O 0,100 g Na2HPO4·12H2O 2,600 g KH2PO4 0,373 g
aufgefüllt auf ein Endvolumen von 1 l mit destilliertem Wasser.

Das Verfahren ist wie folgt:

  • 1. Verwende Hilfsstoffmischung bei 10–15°C.
  • 2. Gebe fertigen Impfstoffpuffer mit 15–20°C hinzu und vermische vorsichtig mit Magnetrührer.
  • 3. Gebe den geeigneten Bulk-Impfstoff mit 5–10°C unter Vermischen hinzu.
  • 4. Setze das Mischens für 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur fort.
  • 5. Stelle adsorbierten Impfstoff in einen Kühlraum bis zum Abfüllen.
  • 6. Das fertige Impfstoffvolumen beträgt 0,5 ml pro Dosis.

Beispiel 3 – Klinische Daten – niedrigdosierter Spaltinfluenzaimpfstoff, mit Aluminiumsalzen als Hilfsstoff versetzt

Die folgenden Daten stammen aus einem klinischen Versuch, in dem ein trivalenter Grippeimpfstoff gemäß dem allgemeinen Herstellungsentwurf für den handelsüblichen FluarixTM-Impfstoff (der ein Grippe-Spaltimpfstoff ist) hergestellt wurde. In der Praxis wurde fertiges trivalentes Bulk-Material mit Aluminiumhilfsstoff wie in Beispiel 2 beschrieben vermischt. Mehrere unterschiedliche HA-Dosierungen wurden hergestellt.

Die Impfstoffchargen wurden in Populationen mit zwei Altern, 18–60 Jahre und > 60 Jahre, mit 1,8 &mgr;g pro Dosis pro Stamm und 3,75 &mgr;g pro Dosis pro Stamm untersucht. 50 Freiwillige wurden in jeder Gruppe geimpft.

Die den Dosen von 1,8 und 3,75 &mgr;g/Stamm entsprechenden Daten sind in den nachfolgenden Tabellen dargestellt.

Hämagglutinationsinhibitions-(HAI)-Aktivität von grippespezifischen Serum-Antikörpern

Seren (50 &mgr;l) werden mit 200 &mgr;l RDE (Rezeptor-zerstörendes Enzym) für 16 Stunden bei 37°C behandelt. Die Reaktion wird mit 150 &mgr;l von 2,5%igem Na-Citrat beendet, und die Seren werden bei 56°C für 30 min inaktiviert. Eine 1:10-Verdünnung wird durch Zugabe von 100 &mgr;l PBS hergestellt. Dann wird eine 2-fache Verdünnungsreihe in Platten mit 96 Vertiefungen (V-Boden) durch Verdünnen von 25 &mgr;l Serum (1:10) mit 25 &mgr;l PBS hergestellt. 25 &mgr;l der Referenz-Antigene werden zu jeder Vertiefung mit einer Konzentration von 4 hämagglutinierenden Einheiten auf 25 &mgr;l hinzugegeben. Antigen- und Antiserum-Verdünnung werden unter Verwendung einer Mikrotiterplatten-Schüttelvorrichtung vermischt und für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

50 &mgr;l rote Blutkörperchen (RBC) aus Küken (0,5 %) werden dann hinzugegeben, und man läßt die RBCs für 1 Stunde bei RT sedimentieren. Der HAI-Titer entspricht dem Umkehrwert der letzten Serumverdünnung, die die Virusinduzierte Hämagglutination vollständig inhibiert.

Eu-Kriterien für die Gruppe im Alter von 18–70 Jahren sind wie folgt:

  • – Serkonversionsfaktor > 2,5
  • – Serokonversionsrate > 40 %
  • – Schutzrate nach Impfung > 70 %

Aus den Daten in den Tabellen kann gefolgert werden, daß die EU-Kriterien für den Serokonversionsfaktor, die Serokonversionsrate und die Schutzrate in den zwei Alterspopulationen für die zwei unterschiedlichen untersuchten Dosierungen gegen die A-Stämme von Influenza übertroffen werden.

Die Schutzraten gegen das B-Virus waren über 80 bzw. 90 % vor der Impfung in den zwei Studiengruppen. Diese Seropositivität vor der Impfung gegenüber dem B-Stamm beeinträchtigt die Impfstoffreaktion negativ. Dennoch verdoppelten sich die Antikörper gegen den B-Stamm nach der Impfung, was zu annähernd 100 % Schutzrate führte.

Somit hat ein mit weniger als 4 &mgr;g HA pro Stamm und Aluminiumhilfsstoff formulierter Impfstoff ein akzeptables Reaktogenitätsprofil (Daten nicht gezeigt) und kann eine Immunreaktion induzieren, die alle drei EU-Kriterien in den zwei Studienpopulationen vollständig erfüllt. Auf der Basis der in diesem Versuch gemachten Beobachtungen kann gefolgert werden, daß ein niedrigdosierter adsorbierter Impfstoff geeignet zur Verwendung in einer pandemischen Situation ist.

Beispiel 4 – Reaktogenitätsprofil eines niedrigdosierten monovalenten Vollvirusimpfstoffs, gereinigt und adsorbiert an Aluminiumsalz

Monovalenter Vollinfluenza-Bulk wurde gemäß Beispiel 1 und 1 hergestellt (Nicht-Trypsin-Verfahren), und ein monovalenter Influenzaimpfstoff wurde gemäß Beispiel 2 formuliert.

Im Reinigungsstadium zur Reinigung des Vollvirus wurde die ausgewählte virusreiche Fraktion neben dem allgemein eingesetzten Zentrifugieren mit Saccharosegradienten pelletisiert, um aus Ei stammende Verunreinigungen effizienter zu entfernen.

Vollvirus wurde mit Formaldehyd in einer Konzentration von 250 &mgr;g/ml inaktiviert (verglichen mit dem Inaktivierungsprozeß für Spaltimpfstoff, der durch eine Kombination aus Natriumdesoxycholat (NaDOC) und Kontakt mit Formaldehyd mit 50 &mgr;g/ml erreicht wird).

Nach Reinigung und Inaktivierung wurde das Antigen an einer Mischung aus Aluminiumhydroxid und -phosphat in einer Konzentration von 0,05 mg bzw. 0,45 mg pro Dosis adsorbiert.

Die Reinheit war der Reinheit der mit Hilfsstoff versetzten Vollvirus-Impfstoffe der Vergangenheit bei weitem überlegen, in denen einfache oder verdünnte Allantaoisflüssigkeit verwendet wurde.

Der Antigengehalt des Vollvirus betrug 7,5 &mgr;g/Dosis von A/Sydney/5/97. Diese Dosierung wurde als schlimmster anzunehmender Fall ausgewählt (als höchste Antigendosierung, die vielleicht für einen pandemischen monovalenten Impfstoff ausgewählt werden könnte), um die Obergrenze der Reaktogenität zu untersuchen.

Auf der Basis der Beobachtungen in Beispiel 3 und der Tatsache, daß Vollvirus wenigstens so immunogen wie Spaltimpfstoff ist, ist es wahrscheinlich, daß eine niedrigere Antigendosis verwendet werden wird.

Ein statistischer Vergleich der Reaktogenität, hauptsächlich die nach der Impfung beobachteten lokalen Ereignisse, wurde mit Daten zu Fluarix vorgenommen, dem Spaltinfluenza-Impfstoff von SmithKline Beecham Biologicals.

Die lokalen Reaktionen wurden zum Vergleich ausgewählt, weil sie genau gemessen werden können und sie am stärksten indikativ für eine lokale Reaktion nach einem Aluminiumhilfsstoff enthaltenden Impfstoff sind.

Ergebnisse (%)

Der Mann-Whitney-U-Test ist ein statistischer Test zum Vergleich von zwei Populationen und zur Untersuchung der Null-Hypothese, daß zwei Populationen von Ergebnissen identische Verteilungsfunktionen haben, gegen die alternative Hypothese, daß sich die zwei Verteilungsfunktionen nur in bezug auf den Ort (Median), falls überhaupt, unterscheiden.

Das Ergebnis des Vergleichs der Reaktogenität des monovalenten niedrigdosierten und mit Hilfsstoff versetzten Vollvirus-Impfstoffs mit Ergebnissen der klinischen Versuche zu Fluarix (Markenname) in den Jahren 1996, 1997 und 1999 zeigt, daß es keinen signifikanten Unterschied auf der P 0,05-Ebene gibt.

Diese Beobachtung stützt die Verwendung von mit Hilfsstoff versetztem Vollvirusimpfstoff sogar bei einer Antigendosierung, die höher als die Dosierung ist, die ausreichend ist, um hohe Schutzraten gegen Influenza zu induzieren.

Beispiel 5 – immunogenität eines mit Aluminiumsalzen als Hilfsstoff versetzten niedrigdosierten monovalenten Vollvirus-Impfstoffs in einer Population ohne Vorimpfung

Influenzavollvirus-Impfstoff wurde gemäß Beispiel 1 und 1 (Nicht-Trypsinverfahren) hergestellt, und monovalente Influenza-Impfstoffe, die unterschiedliche Mengen von HA enthielten, wurden wie in Beispiel 2 beschrieben formuliert.

Das in der Untersuchung verwendete Antigen wurde aus A/Singapore/1/57 (H2N2) hergestellt. Der H2N2-Untertyp ist seit 1968 nicht in Menschen zirkuliert, und die Studienteilnehmer im Alter von ≤ 30 Jahren waren immunologisch naiv gegenüber dem Antigen. Der Immunzustand und die Immunreaktion wurden als Hämagglutinationsinhibitionstiter in den Serumproben gemessen.

Die Immunreaktion an den Tagen 10 und 21 kann als eine wahre Vorimpfungsreaktion betrachtet werden, wohingegen alle anderen Werte eine Auffrischungsreaktion darstellen. Die Ergebnisse zeigen den geometrischen Mittelwert des Titers (GMT) der jeweiligen Studiengruppe.

Die in der obigen Tabelle dargestellten Ergebnisse zeigen, daß ein monovalenter Vollvirusimpfstoff mit einem HA-Antigengehalt von so wenig wie 1,9 &mgr;g/Dosis eine Immunreaktion hervorruft, die der Kontrollgruppe (15 &mgr;g HA/Dosis, kein Aluminium) in der Studiengruppe ohne Vorimpfung (≤ 30 Jahre, Tag = 10, 21) äquivalent ist.

Obwohl die HI-Titer unterhalb des Schutzniveaus nach einer Immunisierung sind, wird ein schützender Titer (≥ 1:40) in allen Gruppen nach zwei Immunisierungen erreicht. Es ist nicht völlig bekannt, ob die Kriterien, die für Auffrischungsreaktionen entwickelt wurden, vollständig in der Auswertung einer primären Immunreaktion anwendbar sind. Der Wert eines "nicht-schützenden" Titers im Falle einer Infektion mit dem Influenzavirus muß noch bewertet werden.

Diese Ergebnisse stützen die Verwendung eines an Aluminium adsorbierten niedrigdosierten Vollvirus-Influenzaimpfstoffs als erste Immunisierung einer nicht vorgeimpften Bevölkerung in einer pandemischen Situation.


Anspruch[de]
  1. Monovalente Influenza-Impfstoffzusammensetzung, die eine Influenzavirus-Komponente, die eine geringe Dosis von aus Ei stammendem Influenzavirus-Antigen aus einem Influenzavirus-Stamm ist, der mit einem pandemischen Ausbruch assoziiert ist oder das Potential hat, mit einem pandemischen Ausbruch assoziiert zu sein, in Kombination mit einem geeigneten Hilfsstoff umfaßt, worin die geringe Antigendosis weniger als 15 &mgr;g Hämagglutinin pro Dosis oder nicht mehr als 15 &mgr;g pro kombinierte Dosis von Impfstoff ist, und worin der Hilfsstoff eine Kombination aus Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat ist.
  2. Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 1, worin das Influenzavirus-Antigen in Form von gereinigtem Influenzaganzvirus ist.
  3. Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin die Menge an Aluminiumphosphat die Menge an Aluminiumhydroxid übersteigt.
  4. Impfstoffzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Gesamtmenge aus Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat im Bereich von 0,4 bis 1,0 &mgr;g pro Impfstoffdosis ist.
  5. Impfstoffzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die geringe Antigendosis weniger als 10 &mgr;g Hämagglutinin pro Dosis oder pro kombinierte Dosis von Impfstoff ist.
  6. Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 5, worin die Antigendosis zwischen 0,1 und 7,5 &mgr;g oder zwischen 1 und 5 &mgr;g Hämagglutinin pro Dosis oder pro kombinierte Dosis von Impfstoff ist.
  7. Impfstoffzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Influenzavirus-Antigen im wesentlichen frei von Wirtszellkontamination ist.
  8. Impfstoffzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Influenzavirus-Komponente durch ein Verfahren gereinigt ist, das einen Proteaseinkubationsschritt einschließt, um Nicht-Influenzavirus-Proteine zu verdauen.
  9. Kit, das folgendes umfaßt:

    (i) eine geringe Dosis von Influenzavirus-Antigen, formuliert mit einer Kombination aus Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat zur parenteralen Verabreichung; und

    (ii) eine geringe Dosis von Influenzavirus-Antigen zur mukosalen Verabreichung in einer mukosalen Abgabevorrichtung, wie z.B. in einer intranasalen Sprayvorrichtung;

    worin die Influenzavirus-Komponente ein aus Ei stammendes Influenzavirus-Antigen aus einem Influenzavirus-Stamm ist, der mit einem pandemischen Ausbruch assoziiert ist oder das Potential hat, mit einem pandemischen Ausbruch assoziiert zu sein, und worin die geringe Antigendosis weniger als 15 &mgr;g Hämagglutinin pro Dosis oder nicht mehr als 15 &mgr;g pro kombinierte Dosis von Impfstoff ist.
  10. Kit gemäß Anspruch 9, worin die kombinierte Antigendosis aus den parenteralen und mukosalen Formulierungen nicht mehr als 15 &mgr;g Hämagglutinin ist.
  11. Kit gemäß Anspruch 10, worin die kombinierte Antigendosis weniger als 10 &mgr;g Hämagglutinin ist.
  12. Kit gemäß Anspruch 10 oder 11, worin das Influenza-Antigen in (i) inaktiviertes Vollvirus ist und das Influenza-Antigen in (ii) Spaltvirus ist.
  13. Verfahren zur Herstellung eines Influenzaimpfstoffs für eine pandemische Situation, wobei das Verfahren das Vermischen von aus Ei stammendem Influenzavirus-Antigen aus einem einzelnen Influenzavirus-Stamm, der mit einem pandemischen Ausbruch assoziiert ist oder das Potential hat, mit einem pandemischen Ausbruch assoziiert zu sein, mit einer Kombination aus Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat und das Bereitstellen von Impfstoffchargen oder Impfstoffkits umfaßt, die weniger als 10 &mgr;g Influenza-Hämagglutinin-Antigen pro Dosis oder nicht mehr als 15 &mgr;g Hämagglutinin pro kombinierte Dosis enthalten.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 13, worin das Antigen hoch gereinigt ist.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, worin das Influenzavirus-Antigen in Form von ganzen Influenzavirus-Partikeln ist.
  16. Impfstoffzusammensetzung oder Kit oder Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, worin das Antigen aus einem H2-Antigen wie H2N2 und einem H5-Antigen wie H5N1 ausgewählt ist.
  17. Verfahren zur Herstellung von Influenzavirus-Antigen zur Verwendung in einem Impfstoff, wobei das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15 ist und den Schritt des Inkubierens einer Mischung, die Influenzavirus-Partikel enthält, mit einer Protease umfaßt, um Nicht-Influenzavirus-Proteine zu verdauen.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 17, worin der Proteaseverdauungsschritt durchgeführt wird, nachdem das Influenzavirus-Antigen durch einen oder mehrere physikalische Trennschritte partiell gereinigt worden ist.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 18, worin der Proteaseverdauungsschritt vor einem Virusinaktivierungsschritt durchgeführt wird.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 19, worin das Reinigungsverfahren die folgenden Schritte umfaßt:

    (i) Bereitstellen einer geernteten Mischung aus kultiviertem Influenzavirus und Wirtsproteinen aus einer Kultur;

    (ii) partielles Reinigen des Influenzavirus in der Mischung durch einen oder mehrere physikalische Reinigungsschritte;

    (iii) Durchführen eines Proteaseverdauungsschrittes an der partiell gereinigten Mischung zur Verdauung von Wirtsproteinen;

    (iv) Inaktivieren des Influenzavirus;

    (v) weiteres Reinigen des Influenzavirus durch wenigstens einen Filtrationsschritt.
  21. Verwendung von unter 10 &mgr;g oder unter 8 &mgr;g oder 1–7,5 &mgr;g oder 1–5 &mgr;g von aus Ei stammendem Influenzavirus-Hämagglutinin-Antigen aus einem einzelnen Stamm von Influenza, der mit einem pandemischen Ausbruch assoziiert ist oder das Potential hat, mit einem pandemischen Ausbruch assoziiert zu sein, und von einer Kombination aus Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat in der Herstellung einer Impfstoffcharge oder eines Impfstoffkits zum Schutz gegen Influenzavirus-Infektion.
  22. Verwendung gemäß Anspruch 21 zur Herstellung eines Zweidosen-Impfstoffs zur gleichzeitigen parenteralen und mukosalen Verabreichung, worin das Hämagglutinin zur parenteralen Verabreichung mit einer Kombination aus Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat formuliert worden ist.
Es folgen 2 Blatt Zeichnungen






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